JP2017051162A - 検体表面の生菌数推定方法及び装置、その装置に搭載されるプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】検体表面の生菌数を迅速且つ高精度で求める。【解決手段】検体表面に付着した菌を溶媒に移して検体液を生成する検体液生成工程と、検体液の蛍光指紋情報を取得する蛍光指紋情報取得工程と、蛍光指紋情報から検体表面の生菌数を推定する生菌数推定工程とを有する。【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光指紋計測による検体表面の生菌数推定方法などに関するものである。

生菌数（一般生菌数）は、食品などの計測対象物の微生物汚染の程度を表す指標として広く用いられている。特に、計測対象物が食品の場合には、生菌数は、衛生学的品質を評価する指標となり、食中毒の予防や腐敗の防止対策、製品の賞味期限の設定などを検討するうえで重要な指標になっている。

生菌数とは、食品などに存在する微生物のうち、一定条件、即ち３５℃前後の中温度帯において酸素の存在下で増殖し、標準寒天培地で生育する微生物（中温性好気性細菌）の菌数を指す。このため、生菌数の計測では、嫌気性菌や高温性菌、低温細菌など、中温性好気性細菌の発育条件に適さない細菌は計測されないが、多くの食中毒菌や腐敗菌が中温性好気性菌に含まれるため、生菌数の計測が食品などにおける代表的な微生物汚染の指標になっている。

生菌数計測の一例を示すと、検体（原液）に減菌した希釈水を加えて混合し、検体の１０倍希釈液を調製し、この希釈液に更に減菌した希釈水を加えて混合して、検体の１００倍希釈液を調製する。この操作を繰り返して、検体の１，０００倍、１０，０００倍…の希釈液を調製する。そして、各段階の希釈液をシャーレに添加して、減菌済みの標準寒天培地を加えて混合し、寒天が固化した後、３５℃で４８時間培養し、出現した微生物のコロニー数を計測（コロニーカウント）する。その平均値にそれぞれの希釈倍率を掛けて、検体１ｇ当たりの生菌数を求める。

検体表面の生菌数を計測することは、食品の衛生学的品質を評価するだけでなく、人手が触れる物の表面の微生物汚染程度を知る上で重要である。検体表面の生菌数を計測するには、検体表面を拭き取る綿棒が用いられ、表面を拭き取った綿棒を溶媒中に浸漬して、前述した検体の原液を得ている。その後は、前述した計測例と同様に、原液を所定倍率で希釈して、菌培養を行った後、コロニーカウントを行って生菌数を求める。この計測方法は、拭き取り法と呼ばれている。

これに対して、検体表面の生菌数を非接触で計測する方法又は装置が提案されている。この従来技術は、付着している微生物中に存在するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の量に応じた分光特性を利用して、計測したＡＴＰの量から生菌数を推定している。この従来技術によると、食品などの表面に付着する微生物によるＡＴＰ量とＫＭ吸光度スペクトルとの間に正の相関が認められることから、２７０±５ｎｍの光を検体表面に照射し、そのＫＭ吸光度スペクトルを用いた演算処理で付着生菌数を推定している（下記特許文献１参照）。

特開２０１０−２６８７９２号公報

検体表面の生菌数を計測するに際して、表面を拭き取った綿棒を溶媒中に浸漬して、検体原液を作り、それを希釈して、菌培養する方法（拭き取り法）では、希釈液の調製や菌培養の時間に多大な労力と時間を要する問題があり、検体表面の生菌数を迅速に計測したいという要求には合致しない。

また、前述した従来技術によると、検体表面に直接光を照射するので、受光した光の分光特性（ＫＭ吸光スペクトル）には検体自体のバックグランドに由来する分光特性が含まれることになり、それを除去する処理を施したとしても、計測精度に悪影響を及ぼすことは避けられない。

本発明は、このような課題を解決するために提案されたものであり、検体表面に付着した菌を溶媒に移した検体液の蛍光指紋情報を取得し、取得した蛍光指紋情報から検体表面の生菌数を推定することを特徴としている。

このような特徴を有する本発明は、希釈液を調製する労力を省き、菌培養の時間を省いて、簡易且つ短時間で検体表面の生菌数を得ることができる。

検体表面に付着した菌を溶媒に移した検体液を用いることで、検体自体のバックグランドに由来する情報を微生物の情報から分離することができる。これによって、精度の高い生菌数の推定が可能になる。

また、蛍光指紋情報に基づいて生菌数を推定するので、様々な波長の光に励起された微生物の自家蛍光スペクトルに基づいて生菌数を推定することができ、多くの情報量に基づく精度の高い生菌数の推定が可能になる。

本発明の概略構成を示した説明図である。 蛍光指紋を説明する（計測対象物に照射した励起光と蛍光スペクトルとの関係を示す）説明図である。 蛍光指紋を説明する説明図（励起波長／蛍光波長／蛍光強度の３次元グラフ）である。 蛍光指紋を説明する説明図（２次元グラフである俯瞰図）である。 データ前処理の例の説明図（（Ａ）〜（Ｃ）はノイズデータ削除の例、（Ｄ）は３次元から２次元に展開した例）である。 データ前処理の例の説明図（図５（Ｄ）の蛍光指紋データを中心化した例）である。 データ前処理の例の説明図（図５（Ｄ）の蛍光指紋データを規格化した例）である。 データ前処理の例の説明図（図５（Ｄ）の蛍光指紋データを標準化したした例）である。 本発明の実施形態に係る検体表面の生菌数推定方法を説明する工程フローである。 本発明の実施形態に係る検体表面の生菌数推定方法を実行するための装置（生菌数推定装置）の構成例を示した説明図である。 本発明の実施例（検体として牛肉スライス）の説明図である。 本発明の実施例（検体として大腸菌寒天培地）の説明図である。

以下、図面を参照して本発明の実施形態を説明する。本発明の実施形態を図１〜図１２を参照して説明するが、本発明の実施形態は図示した例に限定されるものではない。

図１には、本発明の概略構成を示している。本発明の実施形態に係る検体表面の生菌数推定方法は、検体表面に付着した菌を溶媒に移して検体液を生成し、その検体液の蛍光指紋情報を取得することで、検体表面の生菌数（一般生菌数）を推定するものである。ここでの検体は、食品だけでなく、人手が触れる物など、各種の検体を対象にすることができる。

検体液の生成は、従来の拭き取り法と同様に、検体表面を拭き取った拭き取り体（綿棒など）を溶媒に浸漬して検体液を生成することができる。また、検体表面を洗浄した洗浄液を回収して検体液を生成することもできる。以下の説明では、検体表面を拭き取った拭き取り体（綿棒など）を溶媒に浸漬して検体液を生成する例を示して説明するが、特にこれに限定されるものではない。

本発明の実施形態に係る検体表面の生菌数推定方法は、推定モデル作成段階（Ｓ１：推定モデル作成工程）と、蛍光指紋を用いた簡易計測段階（Ｓ２）とに分けることができ、本発明の実施形態に係る方法には、推定モデル作成段階を含めた全工程と、予め推定モデル作成段階で得た推定モデルをデータベースとして備え、推定モデル作成段階を行うことなく簡易計測を行う工程とが含まれる。

推定モデル作成段階（Ｓ１：推定モデル作成工程）は、検体表面を拭き取った拭き取り体を溶媒に浸漬して検体液を生成し、一方で、この検体液を菌培養してコロニーカウントを行うことで生菌数（一般生菌数）の実測値を得る。また、他方で、この検体液の蛍光指紋情報（蛍光指紋計測値或いは蛍光指紋計測値に対して各種前処理を施した情報）を取得する。そして、生菌数の実測値と取得した蛍光指紋情報との統計的な因果関係によって、蛍光指紋情報から生菌数を推定する推定モデルを作成する。ここでの統計的な因果関係は、Partial Least Squares (PLS) 回帰分析、主成分回帰分析、重回帰分析、判別分析、Parallel Factor Analysis (PARAFAC)といった多変量解析や、Support Vector Machine (SVM) 回帰、ランダムフォレスト、ニユーラルネットワークといった機械学習などの統計処理によって求められる。

簡易計測段階（Ｓ２）は、検体表面を拭き取った拭き取り体を溶媒に浸漬して検体液を生成し、生成した検体液の蛍光指紋情報を取得する。ここでの蛍光指紋情報は、推定モデル作成段階で蛍光指紋計測値に対して前処理を行った場合には、同様の前処理を行った情報とする。そして、予め推定モデル作成段階で作成された推定モデルをデータベースとして備え、取得した蛍光指紋計測値を推定モデルに適用して、菌培養によって生菌数の実測値を求めること無く、簡易に検体表面の生菌数を推定する。

このような検体表面の生菌数推定方法によると、予め推定モデル作成段階で検体表面の生菌数を推定する推定モデルを作成しておけば、その後は、同種の検体表面を拭き取った拭き取り体を溶媒に浸漬して検体液を作成し、その検体液の蛍光指紋情報を取得するだけで、労力を要する希釈液の調製や長時間を要する菌培養を行うこと無く、簡易に検体表面の生菌数を推定することができる。

ここで用いる拭き取り体とそれを浸漬する溶媒は、従来から拭き取り法で生菌数を実測する際に用いられている綿棒と緩衝液をそのまま用いることができる。拭き取り体を溶媒に浸漬した検体液は、蛍光指紋情報を取得する前に、遠心分離器にかけて菌を含む液だけを取り出すようにしてもよい。拭き取り体を溶媒に浸漬して検体液を生成するので、検体表面から直接蛍光指紋情報を得る場合と比較すると、検体自体のバックグランドに由来する蛍光指紋情報を含まない菌由来の蛍光指紋情報を得ることができ、精度の高い生菌数の推定が可能になる。

図２〜図４を参照して、蛍光指紋について説明する。図２に示すように、蛍光物質を含む計測対象物に異なる波長の励起光を照射すると、計測対象物から発せられる光（蛍光）は、励起光の波長に対応した蛍光スペクトル（蛍光波長に対する蛍光強度）を示す。これを利用して、励起光を特定の励起波長範囲で段階的に波長を変えて計測対象物に照射して、発せられた光の蛍光スペクトルを励起波長に関連付けて可視化したものが蛍光指紋である。蛍光指紋は、励起波長毎の蛍光スペクトルを、図３に示すような３次元グラフで表すことができる。図３においては、励起波長と蛍光波長を直交する平面軸に設定して、蛍光強度を平面軸に直交する軸に設定することで、励起波長毎の蛍光スペクトルを３次元の等高線状グラフにしている。また、蛍光指紋は、図４に示すように２次元のグラフで可視化することもできる。図４に示す例では、蛍光波長と励起波長を直交する平面軸に設定し、蛍光強度を等高線或いは色分布で示した図（俯瞰図）で蛍光指紋を可視化している。

計測対象物から得られる蛍光指紋は、計測対象物に対して蛍光染色などの前処理を施すこと無く、計測対象物のキャラクタリゼーションが可能であり、計測時の操作が容易で短時間で計測できること、さらに吸光法に比べて感度が高いこと、非破壊での計測が可能であること、などの長所を有する。また、蛍光指紋は、３次元の膨大な情報を有する成分固有の蛍光情報であるため、これを利用することで蛍光情報に由来する様々な特性を分析することが可能になる。

検体液の蛍光指紋情報を取得する際には、蛍光指紋の計測値（励起波長毎の蛍光スペクトル）をそのまま用いることができるが、求めた蛍光指紋計測値に対して、様々なデータ前処理を行うことで、生菌数を推定するためにより有効な蛍光指紋情報を得ることができる。

図５〜図８は、有効な蛍光指紋情報を得るためのデータ前処理の例を示している。図５は、蛍光指紋計測値に対して行われるデータ前処理の第１段階を説明しており、図６〜図８は、蛍光指紋計測値に対して行われるデータ前処理の第２段階を示している。ここでいう第１段階のデータ前処理とは、例えば、散乱光によって現れる蛍光指紋のノイズ除去と２次元データへの展開であり、第２段階のデータ前処理とは、２次元展開された蛍光指紋に対して行われる信号処理演算（例えば、中心化、標準化、規格化、２次微分、ベースライン補正、平滑化、対数変換など）である。

図５の（Ａ）に示すように、計測された蛍光指紋は、励起波長をｍ段階に設定し、蛍光波長をｎ段階に設定した場合には、合計ｍ×ｎの波長条件（＝励起波長と蛍光波長の組み合わせ）のパラメータからなる高次元の蛍光強度データを含んでおり、更に、蛍光の定義から外れる光学的なデータ（例えば、励起光の散乱光、その２次光、３次光など、以下これらをノイズ情報とする）を含んでいる。散乱光は、蛍光波長と励起波長が一致する波長条件で、また散乱光の２次光，３次光はそれぞれ蛍光波長が励起波長の２倍，３倍となる波長条件で現れる。有効な蛍光指紋情報を得るためには、ノイズ情報を除去すると共に、計測した高次元の蛍光強度データから、目的とする蛍光指紋以外の情報を除去した低次元の蛍光強度データにするのが望ましい。

そこで、図５（Ｂ）に示すように、ノイズ情報となる励起光の散乱光及びその２次光，３次光のデータ（例えば、図５（Ｂ）の（ｉ）が示すデータ）を削除する。ここで、散乱光・２次光・３次光はともにある程度の幅をもって現れるため、例えば、前後３０〜４０ｎｍの範囲のデータを除くようにしてもよい。

さらに、蛍光波長が励起波長よりも短い範囲のデータ（例えば、図５（Ｂ）の（ｉｉ）が示すデータ）を除去する。これは、計測対象物が発する蛍光波長は励起波長より長波長であるので、励起波長より長波長の蛍光波長の蛍光強度データのみを解析するための処理である。このように、散乱光及び蛍光波長が励起波長よりも短い範囲のデータ（（ｉ）及び（ｉｉ）のデータ）を除去して、図５（Ｃ）に示すように、生菌数を推定するために有効な蛍光指紋計測値を抽出する。

蛍光指紋は、励起波長、蛍光波長、蛍光強度からなる３次元データであるが、多くの解析手法は、２次元データを対象に開発されているため、それらを用いるためには３次元データを２次元データに展開することが必要になる。励起波長と蛍光波長を共に２００〜７００ｎｍの範囲で５ｎｍ間隔に設定した蛍光指紋の場合には、前述した展開は、例えば図５（Ｃ）に示すように、励起波長２００ｎｍの蛍光スペクトルの後に励起波長２０５ｎｍの蛍光スペクトル、その後に励起波長２１０ｎｍの蛍光スペクトル…というように、蛍光スペクトルを一列に繋げていくことで２次元に展開することができる。このようにして展開した２次元データの一例を図５（Ｄ）に示す。図５（Ｄ）は、３つの蛍光スペクトルを示しており、Ｘ軸は波長条件（励起波長と蛍光波長の組み合わせ）、Ｙ軸は蛍光強度となる。なお、このような第１段階のデータ前処理は省くこともできる。

第２段階のデータ前処理は、図５（Ｄ）に示した２次元の蛍光指紋情報に対して、中心化（mean centering）、規格化（normalization）、標準化（autoscale）、２次微分（2nd derivative）、ベースライン補正（baseline correction）、平滑化（smoothing）、対数変換を１つ又は複数組み合わせて、信号処理演算を行う。このような第２段階のデータ前処理を行うことにより、蛍光スペクトルに含まれている情報の強調、異なるサンプルの蛍光スペクトルの尺度を合わせるなどの効果が得られる。

図６は、図５（Ｄ）の蛍光指紋データを中心化した例を示している。中心化では、波長条件毎に、全サンプルの蛍光強度の平均を求め、平均が「０」となるように蛍光強度から差し引く処理を行う。図７は、図５（Ｄ）の蛍光指紋データを規格化した例を示している。規格化では、サンプル毎に蛍光強度の積分（スペクトルの下の面積）を求め、全てのサンプルで積分が「１」となるようにサンプル毎に係数を掛ける処理を行う。図８は、図５（Ｄ）の蛍光指紋データを標準化したした例を示している。標準化では、波長条件毎に、平均が「０」、標準偏差が「１」となるよう、平均を差し引いた後に標準偏差で割る処理を行う。なお、このような第２段階のデータ前処理も省くことができる。

図９は、本発明の実施形態に係る検体表面の生菌数推定方法を説明する工程フローである。前述した推定モデル作成段階（Ｓ１）では、先ず、工程Ｓ１１として、検体表面を拭き取った拭き取り体を溶媒に浸漬して検体液を生成する。この工程では、拭き取り体として綿棒などを用い、食品などの検体表面を一定面積拭き取り、綿棒などの拭き取り体の検体表面を拭き取った部分を切り落とし、緩衝溶液などの溶媒に浸す。その後、溶媒から拭き取り体を除去して検体液を得る。この際、拭き取り体の浮遊物（主に綿棒の繊維）を取り除くために、検体液を遠心分離器に掛けてもよい。

工程Ｓ１２では、工程Ｓ１１で生成した検体液の一部を菌培養して、コロニーカウントすることで、生菌数の実測値を取得する。この際には、従来の拭き取り法が採用されることになり、検体液を設定倍率に希釈し、菌培養の時間を経て、一般生菌数の実測値が得られる。

一方、工程Ｓ１３では、工程Ｓ１１で生成された検体液の蛍光指紋情報を取得する。ここでは、例えば、既存の分光蛍光光度計（例えば、日立ハイテクノロジーズ製のＦ−７０００型蛍光分光光度計、日本分光製のＦＰ−８５００蛍光分光光度計など）により、好ましくは２１〜２２℃の温度条件で、励起波長（例えば、２００〜７００ｎｍの計測波長範囲内で５ｎｍのデータ取得間隔毎のｍ個の波長）と、蛍光波長（例えば、２００〜７００ｎｍの計測波長範囲で５ｎｍのデータ取得間隔毎のｎ個の波長）の組み合わせを変えながら、合計ｍ×ｎ通りの波長条件で、計測対象物の蛍光強度を取得する。そして、得られた蛍光指紋の計測値に対して、必要に応じて前述したデータ前処理を行う（工程Ｓ１４）。前述したようにデータ前処理は省くことができる。データ前処理を省いた場合には、蛍光指紋の計測値が蛍光指紋情報になる。

工程Ｓ１５では、工程Ｓ１３で取得された（更に必要に応じて、工程Ｓ１４でデータ前処理された）蛍光指紋情報と工程Ｓ１２で取得された生菌数の実測値との統計的な因果関係から、蛍光指紋情報から生菌数を推定する推定モデルを作成する。統計的な因果関係を求めるには、多変量解析または機械学習を採用することができる。

多変量解析または機械学習には、例えば、ＭＡＴＬＡＢ（Mathworks Inc, USA）、Ｕｎｓｃｒａｍｂｌｅｒ（CAMO Software AS,Norway）、ＪＭＰ（SAS Institute Inc,USA）、Ｅｘｃｅｌ（Microsoft Corporation,USA）などの汎用ソフトウエアを用いることができる（これに限らず、独自開発のソフトウエアを使用しても良い。）。多変量解析として回帰分析を行う場合には、例えば、蛍光指紋情報から検体表面の生菌数を推定する検量線（回帰式）を、推定モデルとして作成する。

これに対して、前述した簡易計測段階（Ｓ２）は、工程Ｓ２１において、前述した工程Ｓ１１と同様に、検体表面を拭き取った拭き取り体を溶媒に浸漬して検体液を生成する。ここでは、生菌数が未知の検体が計測対象になる。工程Ｓ２２では、工程Ｓ２１で生成した検体液の蛍光指紋情報を取得する。蛍光指紋情報の取得は、前述した工程Ｓ１３と同様であるので、詳細説明を省略する。ここでも、必要に応じて蛍光指紋の計測値に対してデータ前処理を施すことができる（Ｓ２３）。工程Ｓ１４におけるデータ前処理と工程Ｓ２３におけるデータ前処理は同じ処理が行われる。

工程Ｓ２４では、工程Ｓ２２で取得した蛍光指紋情報を工程Ｓ１５で作成した推定モデルに適用して、検体表面の生菌数を推定する。この際、工程Ｓ１５で作成された推定モデルをデータベースとして演算処理装置のメモリに記憶しておき、簡易計測段階（Ｓ２）では、生菌数の実測を行うこと無く、検体表面の生菌数を推定する。

図１０は、本発明の実施形態に係る検体表面の生菌数推定方法を実行するための装置（生菌数推定装置）の構成例を示している。ここでは、本発明に関係する部分のみの概念図を示している。

図１０に示すように、生菌数推定装置１は、検体液の蛍光指紋情報を取得する蛍光指紋情報取得手段１０を備える。また、生菌数推定装置１は、検体液に対して予め求めた生菌数の実測値と検体液に対して予め取得した蛍光指紋情報との統計的な因果関係から求められる推定モデルを記憶する推定モデル記憶手段（メモリ２１）と、蛍光指紋情報取得手段１０によって取得された蛍光指紋情報を推定モデルに適用して、検体表面の生菌数を推定する生菌数推定手段（演算処理部２２）とを具備するコンピュータ２０を備えている。

蛍光指紋情報取得手段１０は、前述した分光蛍光光度計によって一部を構成することができ、励起光照射部１１と蛍光受光部１２とを備えている。励起光照射部１１は、設定された励起波長範囲で段階的に波長を変化させた励起光を検体液Ｗに照射する機能を有し、励起光を発生する光源と励起波長範囲の特定波長を出射するための分光装置を備えている。蛍光受光部１２は、励起光が照射された検体液Ｗから発せられた蛍光を受光する機能を有し、蛍光スペクトルを得るための分光装置と光検出装置を備えている。蛍光指紋情報取得手段１０は、蛍光受光部１２が出力する蛍光強度を励起波長と蛍光波長に関連付けて蛍光指紋情報（蛍光指紋計測値）として出力する。

コンピュータ２０は、メモリ２１と演算処理部２２を備えると共に、制御部２０Ａを備えている。制御部２０Ａには、データの入出力を行うための入力インターフェース２０Ｂと出力インターフェース２０Ｃが接続されている。コンピュータ２０には、データ出力手段の一つであるディスプレイ２０Ｄが接続されている。

演算処理部２２は、生菌数推定装置１を動作するためのプログラムが搭載されている。このプログラムは、蛍光指紋情報取得手段１０が出力する蛍光指紋情報に対して前述したデータ前処理を施す工程を実行するための蛍光指紋情報取得部２２Ａ、検体液に対して予め求めた生菌数の実測値と検体液に対して予め取得した蛍光指紋情報との統計的な因果関係から推定モデルを作成する工程を実行するための推定モデル作成部２２Ｂ、取得された蛍光指紋情報を、メモリ２１に格納されている推定モデル２３に適用して、検体表面の生菌数を推定する生菌数推定工程を実行するための生菌数推定部２２Ｃなどを備えている。

メモリ２１には、蛍光指紋情報取得手段１０からコンピュータ２０に送信された蛍光指紋情報、或いは、光指紋情報取得手段１０からコンピュータ２０に送信されて、演算処理部２２の蛍光指紋情報取得部２２Ａでデータ前処理された蛍光指紋情報が格納される。また、メモリ２１には、演算処理部２２の推定モデル作成部２２Ｂで作成された推定モデル２３や、推定モデル２３を作成する際に使用する生菌数の実測値などが格納される。推定モデル２３を作成する際に使用する生菌数の実測値は、入力インターフェース２０Ｂを介してキーボードやマウスなどのデータ入力手段で入力される。

制御部２０Ａは、オペレータが入力インターフェース２０Ｂを介して入力した蛍光指紋計測の設定条件（励起波長範囲，蛍光波長範囲，波長間隔）に応じて、蛍光指紋情報取得手段１０の励起光照射部１１と蛍光受光部１２を制御する。また、制御部２０Ａは、入力インターフェース２０Ｂを介して入力される動作開始信号に応じて演算処理部２２の各ブログラムに実行指令を出力して、生菌数推定装置１の動作を制御する。

制御部２０Ａによって制御される生菌数推定装置１の動作例を説明する。前述した推定モデル作成段階（Ｓ１）における工程Ｓ１１で生成された検体液Ｗに対して、工程Ｓ１２を実行して得た生菌数の実測値が、入力インターフェース２０Ｂを介してコンピュータ２０に入力されると、実測値データはメモリ２１に記憶される。これに対して、工程Ｓ１１で生成された検体液Ｗに対して蛍光指紋情報取得手段１０を動作させて計測した蛍光指紋情報が、蛍光指紋情報取得手段１０からコンピュータ２０に送信されてメモリ２１に記憶される。

その後、制御部２０Ａが演算処理部２２を動作させると、先ず、蛍光指紋情報取得部２２Ａがメモリ２１に記憶されている蛍光指紋情報を抽出して必要なデータ前処理を行い、推定モデル作成部２２Ｂがデータ前処理された蛍光指紋情報とメモリ２１に記憶されている生菌数の実測値とを統計処理して、統計処理の結果得られた推定モデル２３をメモリ２１に記憶させる。統計処理としては、例えば、多変量解析としてのＰＬＳ回帰分析を行い、その結果得られた検量線（回帰式）を推定モデル２３としてメモリ２１に記憶させる。

簡易計測工程（Ｓ２）においては、制御部２０Ａは、工程Ｓ２１で生成された検体液Ｗ’に対して蛍光指紋情報取得手段１０を動作させ、計測した蛍光指紋情報を蛍光指紋情報取得手段１０からコンピュータ２０に送信させて、メモリ２１に記憶させる。そして、演算処理部２２の生菌数推定部２２Ｃを動作させ、メモリ２１に記憶されている蛍光指紋情報を抽出し、メモリ２１に記憶されている推定モデル２３に適用することで、生菌数の推定値を出力する。推定モデル２３の作成結果、生菌数の推定値出力などは、必要に応じてディスプレイ２０Ｄに出力される。

以下、図１１によって、本発明の第１実施例を説明する。この実施例では、検体（計測対象物）として、牛肉スライスを用いた。牛肉スライスを１５℃の恒温庫で保管し、０，５，１４，２３，２８，３７，４７，５２，６４時間でサンプリングを行い、生菌数の異なるサンプルを得た。１回のサンプリングにつき、スライス４枚に対して２箇所を綿棒（拭き取り体）で拭き取り、拭き取った綿棒を緩衝液に投入して検体液を生成した。

生成した検体液を２分して、一方（Ａ）を前述した工程Ｓ１３による蛍光指紋情報取得に供し、他方（Ｂ）を前述した工程Ｓ１２の菌培養による生菌数実測値取得に供した。工程Ｓ１３の計測条件は、以下の通りである。
温度：２１〜２２℃
励起波長：２００〜７００ｎｍ、波長間隔５ｎｍ
蛍光波長：２００〜７００ｎｍ、波長間隔５ｎｍ
スキャンスピード：３００００ｎｍ／ｍｉｎ
励起側スリット：５ｎｍ
蛍光側スリット：５ｎｍ
ホトマル電圧：４６０Ｖ
レスポンス：自動
スペクトル補正：ＯＮ

推定モデルの作成は、ＰＬＳ回帰分析により、前記（Ａ）によって取得される蛍光指紋情報から前記（Ｂ）の生菌数を推定する検量線を作成した。得られた検量線によって、工程Ｓ２４の生菌数推定を行い生菌数推定値を得た。図１１においては、横軸が前記（Ｂ）によって得られた生菌数実測値［log10CFU／ml］であり、縦軸が前記（Ａ）によって得られた蛍光指紋情報から工程Ｓ２４で推定された生菌数推定値［log10CFU／ml］である。この例での推定精度は、決定係数Ｒ²＝０．９６２８１であり、良好な推定精度であることが確認された。

図１２によって、本発明の第２実施例を説明する。大腸菌E.coli ATCC25922を一晩培養し、０〜４回希釈の希釈系列を作成し、各希釈倍率の溶液を標準寒天培地に５０μｌ塗布することで、各サンプルを２枚作った。そして、４回希釈溶液の生菌数を培養法で実測し、その値を元に各サンプルの培地上の「総菌数」を計算した。その後、拭き取り綿棒で寒天培地全面を拭き取り、拭き取った綿棒の先端を９ｍｌの緩衝溶液に投入して検体液を生成した。

生成した検体液を前述した工程Ｓ１３による蛍光指紋情報取得に供し（計測条件は実施例１と同じ）、取得される蛍光指紋情報から培地上の総菌数を推定する検量線をＰＬＳ回帰分析で作成した。得られた検量線によって、工程Ｓ２４の生菌数推定を行い生菌数推定値を得た。図１２においては、横軸が生菌数実測値［個／平板］であり、縦軸が得られた蛍光指紋情報から工程Ｓ２４で推定された生菌数推定値［個／平板］である。この例での推定精度は、決定係数Ｒ²＝０．９３９であり、良好な推定精度であることが確認された。

以上説明したように、本発明の実施形態は、検体表面に付着した菌を溶媒に移した検体液の蛍光指紋情報を計測することにより、検体表面の生菌数（一般生菌数）を推定するものである。検体液には微生物の代謝物などが含まれているので、これらの自家蛍光から生菌数を推定することが可能になる。

このような本発明の実施形態によると、一度推定モデル（検量線）ができれば、一点に付き数分の計測で、生菌数の推定が可能になり、従来の拭き取り法と比較すると、時間及び労力を大幅に削減することが可能になる。また、拭き取り法と同様にして検体液を得る場合には、継続的な実施で必要になるのは、検体液を生成するための拭き取り体（綿棒など）と溶媒（緩衝液）だけであるから、多量の希釈液などを必要とする従来の拭き取り法と比べてランニングコストを削減することが可能になる。

更には、検体液は、一般的な蛍光分光光度計を用いることで蛍光指紋情報の取得が可能であり、直接検体に光を当てて蛍光指紋情報を得ることがないので、検体自体の情報と微生物の情報を分離することができ、精度の高い生菌数の推定が可能になる。

１：生菌数推定装置，
１０：蛍光指紋情報取得手段，
１１：励起光照射部，１２：蛍光受光部，
２０：コンピュータ，２０Ａ：制御部，
２０Ｂ：入力インターフェース，２０Ｃ：出力インターフェース，
２０Ｄ：ディスプレイ，
２１：メモリ，２２：演算処理部，２２Ａ：蛍光指紋情報取得部，
２２Ｂ：推定モデル作成部，２２Ｃ：生菌数推定部，２３：推定モデル，
Ｗ（Ｗ’）：検体液

Claims (13)

1. 検体表面に付着した菌を溶媒に移して検体液を生成する検体液生成工程と、
   前記検体液の蛍光指紋情報を取得する蛍光指紋情報取得工程と、
   前記蛍光指紋情報から検体表面の生菌数を推定する生菌数推定工程とを有することを特徴とする検体表面の生菌数推定方法。
2. 前記蛍光指紋情報取得工程は、設定された励起波長範囲で段階的に波長を変化させた励起光を前記検体液に照射し、発せられた蛍光の蛍光強度を励起波長と蛍光波長に関連付けて前記蛍光指紋情報を得ることを特徴とする請求項１に記載された検体表面の生菌数推定方法。
3. 前記生菌数推定工程は、生菌数を推定するための推定モデルに前記蛍光指紋情報取得工程で取得した前記蛍光指紋情報を適用して生菌数を推定することを特徴とする請求項１又は２に記載された検体表面の生菌数推定方法。
4. 前記生菌数推定工程に先立って、前記検体液を菌培養して生菌数を実測すると共に、当該検体液の蛍光指紋情報を取得して、生菌数の実測値と前記蛍光指紋情報との統計的な因果関係から前記推定モデルを作成する推定モデル作成工程を有することを特徴とする請求項３に記載された検体表面の生菌数推定方法。
5. 前記推定モデル作成工程は、前記実測値と前記蛍光指紋情報との多変量解析または機械学習で求めた検量線を前記推定モデルとすることを特徴とする請求項４に記載された検体表面の生菌数推定方法。
6. 前記蛍光指紋情報は、蛍光指紋計測値に対して、中心化、標準化、規格化、微分、ベースライン補正、平滑化及び対数変換のうち、１つ又は複数の前処理を行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載された検体表面の生菌数推定方法。
7. 検体表面に付着した菌を溶媒に移した検体液の蛍光指紋情報を取得する蛍光指紋情報取得手段と、
   前記検体液に対して予め求めた生菌数の実測値と当該検体液に対して予め取得した蛍光指紋情報との統計的な因果関係から作成される推定モデルを記憶する推定モデル記憶手段と、
   前記蛍光指紋情報取得手段によって取得された蛍光指紋情報を前記推定モデルに適用して、検体表面の生菌数を推定する生菌数推定手段とを備えることを特徴とする検体表面の生菌数推定装置。
8. 前記蛍光指紋情報取得手段は、設定された励起波長範囲で段階的に波長を変化させた励起光を前記検体液に照射する励起光照射部と、発せられた蛍光を受光する蛍光受光部とを備え、前記蛍光受光部が出力する蛍光強度を励起波長と蛍光波長に関連付けて前記蛍光指紋情報を得ることを特徴とする請求項７に記載された検体表面の生菌数推定装置。
9. 前記蛍光指紋情報は、蛍光指紋計測値に対して、中心化、標準化、規格化、微分、ベースライン補正、平滑化、及び対数変換のうち、１つ又は複数の前処理を行って求められることを特徴とする請求項７又は８に記載された検体表面の生菌数推定装置。
10. 検体表面に付着した菌を溶媒に移した検体液の蛍光指紋情報を取得し、該蛍光指紋情報から検体表面の生菌数を推定する生菌数推定装置に搭載されるプログラムであって、
    前記検体液の蛍光指紋情報を取得する蛍光指紋情報取得工程と、
    前記蛍光指紋情報取得工程によって取得された蛍光指紋情報を推定モデルに適用して、検体表面の生菌数を推定する生菌数推定工程とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータが実行可能なプログラム。
11. 前記推定モデルを前記検体液に対して予め求めた生菌数の実測値と当該検体液に対して予め取得した蛍光指紋情報との統計的な因果関係から作成する推定モデル作成工程をコンピュータに実行させることを特徴とする請求項１０に記載されたコンピュータが実行可能なプログラム。
12. 前記推定モデルは、前記実測値と前記蛍光指紋情報との多変量解析または機械学習で求めた検量線であることを特徴とする請求項１１記載のコンピュータが実行可能なプログラム。
13. 前記蛍光指紋情報は、蛍光指紋計測値に対して、中心化、標準化、規格化、微分、ベースライン補正、平滑化、及び対数変換のうち、１つ又は複数の前処理を行って求めることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項記載のコンピュータが実行可能なプログラム。

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