JP2017038566A - エクソソームの精製用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、エクソソームの表面に発現している抗原分子の種類や発現量の制限を受けずにエクソソーム全般を捕捉することが可能であり、かつ、操作が容易なエクソソームの精製方法を提供することである。【解決手段】本発明は、エクソソームへの結合活性を有する特定のペプチドを含有するエクソソームの精製用組成物を提供することにより、前記課題を解決する。【選択図】図１

Description

本発明は、エクソソームの精製用組成物に関し、具体的には、エクソソームへの結合活性を有するペプチドを利用したエクソソームの精製技術等に関するものである。

エクソソームは、細胞から分泌される直径２０〜１２０ｎｍの膜で覆われた粒子である。エクソソームは、血液、唾液、尿、脳脊髄液等の広範な生体液中に存在しており、その内部には、タンパク質、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」と言う。）等の様々な物質が含まれていることが知られている。最近では、エクソソームは、その内部に包含する物質を介した細胞間の情報伝達機能を有することが示唆されており、各種疾患や生命現象のバイオマーカーとして注目されている。

エクソソームに内包される物質の中でも、特に、ｍｉＲＮＡは、疾患のバイオマーカーとして注目されている。ｍｉＲＮＡは、エクソソームに内包されることにより、血液中でも長期間安定に存在している。現在までに７００種余りのｍｉＲＮＡが確認されており、これらのうちの比較的少数のｍｉＲＮＡの発現パターンを解析することによって、例えば、腫瘍が発生している臓器を高精度に特定することができる。このように、生体内において極めて重要な情報を有するｍｉＲＮＡを内包したエクソソームを回収する技術は、医療等の分野において極めて重要である。

エクソソームを回収・精製する技術としては、これまでにいくつかの方法が報告されており、例えば、（１）超遠心法、（２）遠心によるペレットダウン、（３）粒子のサイズによる分画、（４）免疫沈降法等が知られている（非特許文献１）。

超遠心法は、試料を超遠心する（具体的には、１０００００×ｇで７０分間の遠心操作を２〜３回行う）ことによって、エクソソームを沈殿させて回収したり（沈降速度分画法）、ショ糖などの密度勾配溶液を用いることで、大きさや密度に基づいてより厳密に分画したりする技術（密度勾配分画法）であり、特に前者は、最も一般的に利用されている標準的な方法である。

遠心によるペレットダウンは、試料に試薬（ポリマー）を添加し、遠心機を用いてエクソソームを沈殿させることにより濃縮する技術であり、遠心機のみでエクソソームを濃縮することができ、操作が容易であるという利点を有する。

粒子のサイズによる分画は、試料を複数（通常、２〜３つ）のフィルターに通して、エクソソームを捕捉する技術であり、操作が容易であるという利点を有する。例えば、２つのフィルターが使用される場合、１つ目の約２００ｎｍのポアサイズのトップフィルターを用いて大きな粒子を取り除き、２つ目の約２０ｎｍのポアサイズのボトムフィルターを用いてエクソソームを捕捉することができる。

免疫沈降法は、特定のタンパク質が表面に存在するエクソソームを、当該タンパク質に対する抗体が固定化された磁性ビーズを用いて回収する技術である。免疫沈降法では、特定のエクソソーム抗原（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等）が表面に存在するエクソソームを捕捉することができ、また、使用する抗体を変えることで、種々のエクソソーム膜表面抗原を標的とした免疫沈降が行えるという利点を有する。また、免疫沈降法の操作は、他の技術に比して容易に行うことができる。

落谷孝広編（２０１４）「エクソソーム解析マスターレッスン（ｍｉＲＮＡ研究からがん診断まで応用∞！研究戦略とプロトコールが本と動画でよくわかる、実験医学別冊 最強のステップＵＰシリーズ）」羊土社

しかしながら、これまでに報告されたエクソソームの回収技術は、各々利点を有するものの、なお解決が望まれる問題点を有している。

すなわち、超遠心法は、当該方法で使用される超遠心機が高価であり、また遠心操作に時間がかかる。また、超遠心法は、多くの試料を処理するには不向きであり、さらには、血清試料を用いた際にアルブミン、ＩｇＧ、プロテオソーム等のタンパク質が精製物中に混入する等の欠点を有している。

遠心によるペレットダウンは、あくまでも濃縮方法であるため、用いる試料によっては、著しく多くの夾雑タンパク質が混入することがある。また、培養上清、血清、尿等の試料ごとに試薬の組成を最適化することが必要であり、操作が煩雑である。

粒子のサイズによる分画は、エクソソームを溶解する必要があるため、解析対象は核酸のみとなるという問題点を有している。

免疫沈降法は、ある特定の抗原分子を標的とする方法であるため、その抗原分子が発現しているエクソソームは捕捉できるが、発現していないエクソソームは補足できないという問題を有している。すなわち、当該方法は、試料中の一部のエクソソームしか捕捉できないという問題点を有している。

したがって、上記の問題点を克服できるような新たなエクソソームの回収技術の開発が求められている。

本発明は、上記に鑑み、エクソソームの表面に発現している抗原分子の種類や発現量の制限を受けずにエクソソーム全般を捕捉することが可能であり、かつ、操作が容易なエクソソームの精製方法を提供することを目的としている。

本発明者らは、前記の課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、（１）Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘ、Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ、ＬＬ３７等の特定のペプチドがエクソソームへの結合活性を有すること、および（２）当該ペプチドを用いることにより、エクソソーム膜を破壊することなくエクソソームを効率的に回収できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。

（１）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドを含有していることを特徴とする、エクソソームの精製用組成物：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。

（２）前記ペプチドが結合する担体をさらに含むことを特徴とする、（１）に記載のエクソソームの精製用組成物。

（３）前記担体が磁性支持体であることを特徴とする、（２）に記載のエクソソームの精製用組成物。

（４）ペプチドと生物学的試料とを接触させる工程を含むエクソソームの精製方法であって、
前記ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドであることを特徴とする、エクソソームの精製方法：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。

（５）前記ペプチドが担体に結合したものであることを特徴とする、（４）に記載のエクソソームの精製方法。

（６）前記担体が磁性支持体であることを特徴とする、（５）に記載のエクソソームの精製方法。

（７）ペプチドを含むエクソソームの精製用キットであって、
前記ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドであることを特徴とする、エクソソームの精製用キット：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。

（８）被験者が疾患を有するか否かを判定するためのデータ取得方法であって、
（ａ）（４）〜（６）のいずれかに記載の方法を用いて生物学的試料からエクソソームを精製する精製工程、および
（ｂ）前記（ａ）で精製されたエクソソームに内包されるｍｉＲＮＡのレベルを検出する検出工程
を含むことを特徴とする、データ取得方法。

（９）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドを含有していることを特徴とする、エクソソームを標識するための組成物：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。

本発明におけるペプチドは、エクソソームの特定の抗原分子に結合するものではなく、エクソソームの脂質二重膜に結合する性質を有するため、抗原分子の種類や発現量に左右されることなく、広くエクソソームを捕捉することができる。

また、本発明のペプチドを磁性支持体に結合させる態様では、ペプチドに結合したエクソソームを磁石により回収することができるため、操作が極めて容易である。

試験例１の実験操作手順を示す図である。 試験例２の実験操作手順を示す図である。

本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。

本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、「タンパク質」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、アミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。

〔１．エクソソームの精製用組成物〕
本発明の第１の実施形態において、特定のペプチドを含有していることを特徴とする、エクソソームの精製用組成物を提供する。本発明は、エクソソームの脂質二重膜に結合できるペプチドを初めて見出したことに基づくものであり、それ故、当該ペプチドを含有する本発明の組成物は、エクソソームを極めて効率的に精製することができる。

以下、本発明の組成物について詳述する。

〔１−１．ペプチド〕
本発明において「ペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合により結合した縮合重合体を意味し、エクソソームへの結合活性を有している限り別段限定されない。本発明におけるペプチドとしては、例えば、エクソソームの効率的な回収の観点から、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘ、Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ、またはＬＬ３７が好ましく、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘがより好ましい。

上記に列挙したペプチドについては、従来、特定の生物種の細胞の細胞膜に、特異的または非特異的に結合してその細胞膜を破壊し、結果としてその細胞自体を破壊することが報告されていた（Y. Shai, Biochimica et Biophysica Acta 1462, 55-70, 1999）。したがって、これらのペプチドは、エクソソームという特定の膜構造体への結合活性を有することが知られていなかったことはもとより、そもそも結合先の細胞（より具体的には、細胞膜）を破壊する活性を有していたことから、エクソソームの回収に利用されることは全く想定されないものであった。よって、本発明のペプチドが、エクソソームへの結合活性を有すると共に、エクソソームを破壊することなく効率的に回収できるとの知見は極めて驚くべきことである。

なお、本発明のペプチドが、エクソソームを破壊することなく回収できることは、エクソソームに内包されたｍｉＲＮＡを検出する下記の実施例の結果より明らかである。

本実施形態において使用されるペプチドとしては、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドが用いられることが好ましい：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。

前記（ａ）のペプチドについて具体的に説明する。配列番号１は、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘと呼ばれるキイロスズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）由来のペプチドであり、全長１４アミノ酸残基から構成されるペプチドである。配列番号２は、Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎと呼ばれるｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ由来のペプチド（配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド）の一部であり、全長１６アミノ酸残基から構成されるペプチドである（「Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ（ｎ−１６）」ともいう。）。本ペプチドは、Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎの機能ドメインにより構成されている。配列番号３は、ＬＬ３７と呼ばれるヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来のペプチドであり、全長３７アミノ酸残基から構成されるペプチドである。ＬＬ３７は、抗菌ペプチドであるカテリシジン（Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）の一種であり、具体的には、ｈＣＡＰ-１８のＣ末端領域がタンパク質切断により遊離したペプチドである。

前記（ｂ）のペプチドは、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等であって、エクソソームへの結合活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。ここで欠失、置換または付加されてもよいアミノ酸の数は、前記機能を失わせない限り、限定されてないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって欠失、置換または付加できる程度の数をいい、好ましくは５アミノ酸以内であり、より好ましくは３アミノ酸以内（例えば、３、２または１アミノ酸）である。また、明細書中において「変異」とは、部位特異的突然変異誘発法等によって人為的に導入された変異を主に意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。

変異するアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されていることが好ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。さらに、標的アミノ酸残基は、共通した性質をできるだけ多く有するアミノ酸残基に変異させることがより好ましい。

本明細書において「機能的に同等」とは、対象となるペプチドが、目的とするペプチドと同等（同一および／または類似）の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれ得る。変異を導入したペプチドが所望の機能を有するかどうかは、その変異ペプチドがエクソソームへの結合活性を有するかどうか調べることにより判断できる。

ペプチドが、エクソソームへの結合活性を有するペプチドであるか否かを判定するためには、ペプチドと、エクソソーム（または、エクソソームを含む試料）とを接触させたときに、ペプチドがエクソソームと複合体を形成しているか否かを試験すればよい。すなわち、ペプチドと、エクソソーム（または、エクソソームを含む試料）とを接触させたときに、ペプチドがエクソソームと複合体を形成していれば、当該ペプチドを、エクソソームへの結合活性を有するペプチドであると判定することができる。

具体的な判定方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。例えば、所望のペプチドを磁性ビーズ上に固定化させ、当該ビーズとエクソソームとを接触させる。次いで、磁気によって磁性ビーズを回収し、当該回収物中にエクソソームのマーカー（例えば、ｍｉＲＮＡ、ＣＤ９等）が含まれていれば、当該ペプチドを、エクソソームへの結合活性を有するペプチドであると判定することができる。さらに具体的な判定方法は、後述する実施例に記載の方法に従えばよい。

前記（ｃ）のペプチドも、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等を意図しており、エクソソームへの結合活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。アミノ酸配列の相同性とは、アミノ酸配列全体（または機能発現に必要な領域）で、少なくとも８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990) を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝１００、wordlength ＝１２とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝５０、wordlength ＝３とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。

本明細書において「相同性」とは、性質が類似のアミノ酸残基数の割合（homology、positive等）を意図しているが、より好ましくは、同一のアミノ酸残基数の割合、すなわち同一性（identity）である。なお、アミノ酸の性質については上述したとおりである。

本発明におけるペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているものであればよいが、これに限定されるものではなく、糖鎖やイソプレノイド基などのペプチド以外の構造を含む複合ペプチドであってもよい。アミノ酸の官能基は修飾されていてもよい。アミノ酸はＬ型であることが好ましいが、これに限定されない。

本発明におけるペプチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得、例えば、ペプチドの発現ベクターが導入された形質転換体によって発現されても、化学合成されてもよい。すなわち、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。化学合成法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Model MultiPep RS（Intavis AG）など）を利用することができる。

〔１−２．担体〕
本発明の組成物はまた、前記ペプチドが結合する担体を包含し得る。本発明の組成物は、前記ペプチドと共に担体を含むことで、エクソソームの回収をより効率的に、かつ、簡便に行うことができる。

本発明において「担体」とは、ペプチドの足場となる支持体を意味し、ペプチドを保持できる構造物であれば別段限定されない。本発明における担体は、それに結合するペプチドの機能を弱めない支持体であることが好ましい。かかる担体としては、例えば、ガラス、ナイロンメンブレン、半導体ウェハー、ラテックス粒子、マイクロビーズ、シリカビーズ、磁性支持体等が挙げられる。その中でも、エクソソームの回収の容易性の観点から、磁性支持体が好ましい。磁性支持体は、磁性体を含んでいる担体であれば別段限定されないが、好ましくは、磁性ビーズが用いられる。

〔１−３．ペプチドと担体の結合方法〕
本発明の組成物が、ペプチドおよび担体を含有している場合、ペプチドと担体とは結合した状態で（すなわち、複合体として）、組成物中に含有されていることが好ましい。

本発明において「ペプチド」と「担体」の結合方法は、別段限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。また、ペプチドと担体との結合は直接的であっても間接的であってもよい。例えば、ビオチンと結合したペプチドと、担体と結合したストレプトアビジンとを混合することによって、ペプチドと担体との間接的な結合を形成することが可能である。ストレプトアビジンは４量体を形成しているので、１つの「担体と結合したストレプトアビジン」に対して４つの「ビオチンと結合したペプチド」が結合して複合体を形成する。１つの複合体は、４つのペプチドを介してエクソソームに結合することができるので、複合体とエクソソームとの間の結合力が極めて高くなる。当該複合体を用いれば、極めて高収率にてエクソソームを回収することができる。

ビオチンと結合したペプチドを作製する方法は特に限定されない。例えば、ビオチンとペプチドとを直接結合させても間接的に結合させてもよい。ペプチドの構造およびそれに基づく機能をできるだけ正常に維持するという観点からは、ビオチンとペプチドとを間接的に結合させることが好ましい。ビオチンとペプチドとを間接的に結合させる場合には、例えば、本発明のペプチドに任意のリンカーを連結した後に、ペプチドと連結したリンカーに対してビオチンを結合させればよい。

リンカーは、ポリペプチドからなるリンカー（「ペプチドリンカー」ともいう。）であってもよいし、タンパク質同士を連結することが可能な周知の架橋剤やスペーサーアームであってもよい。

ペプチドリンカーの場合、リンカーの長さやそれを構成するアミノ酸の種類は、当業者により適宜設定され得る。ペプチドリンカーの長さは、別段限定されるものではなく、通常、１〜２０個、好ましくは、１〜１０個（例えば、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、１個）のアミノ酸からなるリンカーが使用される。また、ペプチドリンカーに用いられるアミノ酸の種類も、別段限定されるものではないが、例えば、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）等が使用され得る。とりわけ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＧＳ（配列番号８）等のペプチドリンカーや、これらが複数回繰り返されたペプチドリンカー（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９）等）が好ましく用いられる。

タンパク質同士を連結することが可能な周知の架橋剤としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジルアミド、Ｎ−マレインイミド、イソチオシアネート、ブロモアセトアミド等が挙げられるがこれらに限定されない。

スペーサーアームとしては、周知のものであれば別段限定されないが、例えば、炭素鎖を含むスペーサーアームが用いられ、より好ましくは、炭素数６個の炭素鎖を有するｈｅｘａｎｏｎａｔｅが用いられる。

担体と結合したストレプトアビジンを作製する方法は特に限定されない。例えば、担体とストレプトアビジンとを直接結合させてもよく、担体とストレプトアビジンとを間接的に結合させてもよい。適宜、公知の手法に従って、担体と結合したストレプトアビジンを作製すればよい。

担体と結合するペプチドの種類は、一種類であってもよいし、複数種類の組み合わせであってもよい。複数種類のペプチドが組み合わせて用いられる場合、その組み合わせは別段限定されないが、例えば、下記の組み合わせであり得る。

（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。

（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。

（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。

（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。

担体と結合する物質として、上記のペプチドまたはペプチドの組み合わせに加えて、さらに、エクソソームの細胞表面抗原に対する抗体を組み合わせることもできる。エクソソームの細胞表面抗原としては、例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等が挙げられる。これらの抗体と組み合わせることで、エクソソームの捕捉の漏れを減らし、精製効率を高めることが可能となる。

〔その他〕
本発明の組成物は、上記のペプチドおよび担体に加えて、さらなる物質を含んでいてもよい。かかる物質は、別段限定されることなく、例えば、組成物中でペプチドを安定させる物質やペプチドの機能を促進する物質等が含まれ得る。

なお、本明細書において、上記ペプチドと担体が結合した複合体のことを、「ペプチドを備える担体」や「ペプチド固定化担体」等と呼ぶことがある。これらの用語は、本明細書においては、同義で用いられる。

〔２．エクソソームの精製方法〕
本発明の第２の実施形態において、特定のペプチドと生物学的試料とを接触させる工程を含むエクソソームの精製方法を提供する。

本実施形態においては、上記ペプチドは担体に結合したものであってもよい。つまり、本実施形態においては、上記のペプチド固定化担体を生物学的試料と接触させて、生物学的試料からエクソソームの精製を行ってもよい。

本実施形態において使用されるペプチドとしては、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドが用いられることが好ましい：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。

本実施形態におけるペプチドの詳細については、上述のとおりである。

本実施形態において、「生物学的試料」とは、生物の体内から採取された検体を意味し、エクソソームを包含した検体である。生物学的試料としては、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、涙液、汗、母乳、羊水、脳脊髄液（髄液）、骨髄液、胸水、腹水、関節液、眼房水、硝子体液等が含まれるがこれらに限定されない。生物学的試料の選択は、目的に応じて、当業者により適宜設定され得る。例えば、採取の容易さの観点からは、血液、血漿、血清、唾液、尿等が好ましく用いられる。

本発明における生物学的試料の由来は、エクソソームを保有する生物種由来であれば別段限定されない。生物学的試料の由来となる生物種としては、例えば、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）等が挙げられる。生物学的試料の由来は、使用されるペプチドとの相性によって、適宜設定される。例えば、本発明において使用されるペプチドが上記の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドである場合、生物学的試料の由来となる生物種は、好ましくは、哺乳類であり、より好ましくは、ヒトである。これは、上記の（ａ）〜（ｃ）のペプチドが、哺乳類（とりわけ、ヒト）のエクソソームに対して高い親和性を有していることに基づくものである。

本実施形態において、ペプチド（または、ペプチド固定化担体）と生物学的試料との接触は、ペプチド（または、ペプチド固定化担体）が生物学的試料中のエクソソームと結合できるような条件下で行われるものであれば、その方法は別段限定されない。ペプチド（または、ペプチド固定化担体）と生物学的試料との接触は、例えば、ペプチド（または、ペプチド固定化担体）と生物学的試料とを混合することにより行われ、好ましくは、ペプチド（または、ペプチド固定化担体）と生物学的試料中のエクソソームが結合するために十分な時間の間、混合状態が保持される。

本実施形態において、生物学的試料との接触に供されるペプチド（または、ペプチド固定化担体）の濃度は、使用される生物学的試料の種類等に基づき、当業者により適宜設定される。すなわち、ペプチド（または、ペプチド固定化担体）の濃度は、エクソソームとの結合が適当に行える濃度であれば別段限定されない。例えば、生物学的試料が血清であり、血清とペプチド固定化担体とが接触される場合、血清とペプチド固定化担体の割合（血清／ペプチド固定化担体（体積比））は、例えば、１〜２０、好ましくは、５〜１５（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５等）であり得る。より好ましくは、血清とペプチド固定化担体の割合は、１０である。

ペプチド（または、ペプチド固定化担体）と生物学的試料との接触が行われた後、さらに洗浄工程が行われることが好ましい。洗浄工程は、適当な溶液を用いて、適当な回数洗浄することにより行われる。洗浄工程は、前記接触工程で得られたペプチド（または、ペプチド固定化担体）とエクソソームの複合体が解離しない条件下で行われるものであれば、その方法（例えば、使用される溶液の種類や洗浄回数等）は別段限定されない。本洗浄工程において、担体が磁性支持体（好ましくは、磁性ビーズ）である場合、外部から磁力を与えることで容易にエクソソームの結合した磁性支持体（好ましくは、磁性ビーズ）を分離することができる。洗浄工程において、ペプチド（または、ペプチド固定化担体）に対して未結合の物質（不純物を含む）を除去した後、適当な溶液、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等に再懸濁して、精製されたエクソソームの濃縮物を得ることができる。

〔３．エクソソームの精製用キット〕
本発明の第３の実施形態において、特定のペプチドを含むエクソソームの精製用キットを提供する。本実施形態のエクソソームの精製用キットは、ペプチドおよび担体を含むものであってもよいし、担体に結合したペプチドを含むものであってもよい。

本発明において「キット」とは、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュ等）を備えた包装が意図されるが、組成物としての一物質中に材料を含有している形態もまた、「キット」に包含される。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましい。本明細書においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。本発明のキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。

本実施形態において使用されるペプチドとしては、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドが用いられることが好ましい：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。

また、本発明の別の態様では、以下の（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドが好ましく使用される：
（ｄ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなり、かつ、そのＮ末端側にビオチンが結合しているペプチド、
（ｅ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、そのＮ末端側にビオチンが結合しており、さらに、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
（ｆ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、そのＮ末端側にビオチンが結合しており、さらに、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。

（ｄ）〜（ｆ）の態様の場合、ペプチドと共にキットに内包されている担体は、その表面にストレプトアビジンが結合していることが好ましい。それにより、ペプチドと担体は、それぞれに結合しているビオチンとストレプトアビジンとを介して容易に結合することができる。

さらなる態様では、上記（ｄ）〜（ｆ）のペプチドにおいて、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドとビオチンとの間にリンカーを有し得る。ペプチドとビオチンとの間にリンカーを配することにより、ペプチドの構造およびそれに基づく機能をできるだけ正常に維持することが可能となる。リンカーに関しては、上述したとおりであるが、例えば、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）を用いた、ＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９）等のリンカーが使用される。

本発明のキットにおいて、ペプチドが担体に結合した状態で含まれている場合は、キットの開封後、エクソソームの精製にすぐに使用することができる。一方、ペプチドと担体とが別々の状態で含まれている場合は、キットの開封後、ペプチドと担体の結合処理を行った後で、エクソソームの精製に使用することができる。ペプチドと担体の結合は、当分野における通常の知識に基づいて行うことができるが、ペプチドと担体の結合方法が記載された指示書がキットに含まれていることが好ましい。

〔４．データ取得方法〕
本発明の第４の実施形態において、被験者が疾患を有するか否かを判定するためのデータ取得方法を提供する。

本実施形態においては、上述したエクソソームの精製方法によりエクソソームを精製し、精製されたエクソソームに内包されるｍｉＲＮＡのレベルを検出することにより、判定のためのデータを取得する。

エクソソームに内包されるｍｉＲＮＡは、疾患のバイオマーカーとして注目されており、例えば、腫瘍（例えば、頭頸部がん、膀胱がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、卵巣がん、白血病等）や肝疾患（例えば、慢性Ｃ型肝炎等）等の疾患を高精度で特定することができる。それらの疾患の中でも、とりわけ、腫瘍については、その疾患と関連する多くのｍｉＲＮＡが知られている。腫瘍を示すバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−１２５ａ（以上、頭頸部がん）、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８８（以上、膀胱がん）、ｍｉＲ−１４１（前立腺がん）、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１５５（以上、肺がん）、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−９２（以上、大腸がん）、ｍｉＲ−１８４ａ（食道がん）、ｍｉＲ−５００（肝臓がん）、ｍｉＲ−２１（脳腫瘍）、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２００（卵巣がん）、ｍｉＲ−９８（白血病）等が挙げられる。

また、特定のｍｉＲＮＡは、特定の生物学的試料中のエクソソームに内包される傾向がある。例えば、頭頸部がんを示すｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−１２５ａは、唾液中のエクソソームに多く内包されており、膀胱がんを示すｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８８は、尿中のエクソソームに多く内包されている。また、前立腺がん、肺がん、大腸がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、卵巣がん、白血病等を示すｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１８４ａ、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−２００、ｍｉＲ−９８は、血液（血漿）中のエクソソームに多く内包されている。したがって、データ取得の目的に応じて、生物学的試料を適宜選択することが好ましい。

エクソソームからｍｉＲＮＡの抽出方法としては、当分野で既知である任意の方法が用いられる。容易にｍｉＲＮＡの抽出が行えるという観点からキットが用いられてもよく、例えば、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が使用される。

ｍｉＲＮＡの検出方法としては別段限定されず、生物学的試料中から特定の配列を有するｍｉＲＮＡを検出・測定できる方法であれば何でもよい。かかる方法としては、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法等が挙げられる。操作の簡便さの観点からは、リアルタイムＰＣＲが用いられることが好ましく、一度に多くのｍｉＲＮＡについてのアッセイを行う場合には、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法を用いることが好ましい。

被験者が疾患を有するか否かの判定は、上記ｍｉＲＮＡのレベルを基準として行うことができる。例えば、被験者のｍｉＲＮＡレベルと正常な対象のｍｉＲＮＡレベルとを比較したとき、被験者のｍｉＲＮＡレベルが正常な対象のｍｉＲＮＡレベルよりも高い場合、被験者は当該ｍｉＲＮＡに関連する疾患を有する可能性が高いと判定することができる。あるいは、被験者のｍｉＲＮＡレベルと正常な対象のｍｉＲＮＡレベルとを比較したとき、被験者のｍｉＲＮＡレベルが正常な対象のｍｉＲＮＡレベルよりも低い場合、被験者は当該ｍｉＲＮＡに関連する疾患を有する可能性が高いと判定することができる。あるいは、被験者のｍｉＲＮＡレベルと正常な対象のｍｉＲＮＡレベルとを比較したとき、被験者のｍｉＲＮＡレベルが正常な対象のｍｉＲＮＡレベルよりも高い場合、被験者は当該ｍｉＲＮＡに関連する疾患を有する可能性が低いと判定することができる。あるいは、被験者のｍｉＲＮＡレベルと正常な対象のｍｉＲＮＡレベルとを比較したとき、被験者のｍｉＲＮＡレベルが正常な対象のｍｉＲＮＡレベルよりも低い場合、被験者は当該ｍｉＲＮＡに関連する疾患を有する可能性が低いと判定することができる。

なお、本発明における「被験者が疾患を有する」とは、被験者が現時点で疾患を発症している場合を示すだけでなく、被験者が潜在的に疾患を発症する可能性を有している場合（被験者が現時点では疾患を発症していないが、将来的に疾患を発症する可能性を有する場合）も含む。

〔５．エクソソームを標識するための組成物〕
本発明の第５の実施形態において、特定のペプチドを含有していることを特徴とする、エクソソームを標識するための組成物を提供する。本発明の組成物は、エクソソームを極めて効果的に標識することができる。

本実施形態において使用されるペプチドとしては、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドが用いられることが好ましい：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。

本実施形態におけるペプチドの詳細については、上述のとおりである。

本発明の組成物では、上記ペプチドが標識化合物と結合していることが好ましい。本発明に利用可能な標識化合物としては別段限定されず、適宜、公知の標識化合物を用いることが可能である。標識化合物としては、例えば、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ４８８等）、放射性同位体、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ（例えばＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ等）、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ等）を用いることが可能である。

ペプチドと標識化合物とを結合させる方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることが可能である。また、ペプチドと標識化合物との結合は直接的であっても間接的であってもよい。例えば、ビオチンと結合したペプチドと、標識化合物と結合したストレプトアビジンとを混合することによって、ペプチドと標識化合物との間接的な結合が可能である。

ビオチンと結合したペプチドを作製する方法は特に限定されない。例えば、ビオチンとペプチドとを直接結合させても間接的に結合させてもよい。ビオチンとペプチドとを間接的に結合させる場合には、例えば、本発明のペプチドを任意のタンパク質と結合させた後に、ペプチドと結合させたタンパク質に対してビオチンを結合させるか、あるいは、任意のタンパク質にビオチンを結合させた後に、ビオチンと結合させたタンパク質に対して本発明のペプチドを結合させればよい。

上述したタンパク質としては特に限定されないが、例えば、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ等）、標識タンパク質（例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等）を用いることが可能である。

標識化合物と結合したストレプトアビジンを作製する方法は特に限定されない。例えば、標識化合物とストレプトアビジンとを直接結合させてもよく、標識化合物とストレプトアビジンとを間接的に結合させてもよい。適宜、公知の手法に従って、標識化合物と結合したストレプトアビジンを作製すればよい。

上述した本発明のペプチドは、エクソソームの脂質二重膜に対して高い結合能を示す。したがって、本発明の組成物は、特定の抗原分子を発現したエクソソームのみならず、広くエクソソーム全般を標識するのに好ましいといえる。本発明の組成物は、例えば、エクソソームを蛍光で標識することで、エクソソームを可視化し、細胞内への取り込みを観察する分野等において有用である。

その他、前記〔１〕〜〔５〕の各項目で記載した内容は、他の項目においても適宜援用できることを付言する。また、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。

〔１．本発明の方法によるエクソソームの回収とｍｉＲＮＡの抽出〕
〔１−１．ペプチドを固定化した磁性ビーズの調製〕
磁性ビーズとしてＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ-２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＶＥＲＩＴＡＳ社製）を用いた。この磁性ビーズには、ストレプトアビジンが固定化されており、ビオチン−ストレプトアビジンの相互作用を利用して、ビオチン修飾されたペプチドを磁性ビーズに固定化できる。まず磁性ビーズの洗浄を行なった後、ビオチン修飾されたペプチドを固定化し、未結合のペプチドを洗浄により取り除くことで、ペプチド固定化磁性ビーズを調製した。

具体的には、５０μｌの磁性ビーズを、１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、当該チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。チューブをマグネットスタンドから外し、０．５ｍｌのＰＢＳを加えて撹拌した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分間静置し、上清を捨て洗浄した。この洗浄操作を合計で、３回行なった。洗浄した磁性ビーズを、２００μｌのＰＢＳで再懸濁した。

ビオチン修飾されたペプチドを５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解し、ペプチドの濃度が１００μＭとなるように調整した。ビオチン修飾されたペプチドとして、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘ（配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端をビオチンで修飾したものを受託合成）、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ-Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ（ｎ−１６）（配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端をビオチンで修飾したものを受託合成）、ＬＣ-ＬＬ３７，ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（フナコシ社製、ＡＳ−６３６９３）を用いた。

マイクロチューブに、１８０μｌのＰＢＳ、２０μｌのビオチン修飾されたペプチド（１００μＭ）、２００μｌの上記で洗浄した磁性ビーズを加え（合計で４００μｌ）、室温で３０分撹拌し、ビオチン修飾したペプチドを磁性ビーズに固定化した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨てた。チューブをマグネットスタンドから外し、０．５ｍｌのＰＢＳを加えて撹拌した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分静置し、上清を捨て洗浄した。この洗浄操作を合計で、３回行なった。このように洗浄したペプチド固定化磁性ビーズを、最終的に５０μｌのＰＢＳで再懸濁した。

〔１−２．ペプチド固定化磁性ビーズを用いたエクソソームの回収とｍｉＲＮＡの抽出〕
血清として、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｔｙｐｅ ＡＢ（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。血清を、遠心分離機を用いて、１４０００ｇで１０分間、４℃で遠心を行い、血球などの成分を沈殿させた。沈殿物を吸わないように、血清上清を回収した。このように前処理した血清上清のうち０．５ｍｌを、１．５ｍｌのマイクロチューブに加え、さらに上記〔１−１．〕で作製したペプチド固定化磁性ビーズ（５０μｌのＭａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘ、５０μｌのＬＬ３７または５０μｌのＨｅｍｏｌｙｓｉｎ（ｎ−１６））を加え、室温で３０分間撹拌し、エクソソームをペプチド固定化磁性ビーズに結合させた。チューブをマグネットスタンドにセットして１分間静置し、上清を捨てた。チューブをマグネットスタンドから外し、０．５ｍｌのＰＢＳを加えて撹拌した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分間静置し、上清を捨て洗浄した。この洗浄操作を合計で、２回（試験例１）または３回（試験例２）行なった。

回収したエクソソームからのｍｉＲＮＡの抽出は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて行なった。具体的には、上記のエクソソームが結合している磁性ビーズに、キット付属の３００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌ３）を添加して、５分間振盪し、エクソソーム内のｍｉＲＮＡを溶出した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分間静置して上清（ｍｉＲＮＡ画分）を回収し、付属のスピンカラムを用いて同社のプロトコールに従ってｍｉＲＮＡの抽出を行なった。スピンカラムに結合したｍｉＲＮＡは、５０μｌのＲＮａｓｅ-ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで溶出し回収した。

〔２．超遠心法によるエクソソームの回収とｍｉＲＮＡの抽出〕
血清としてＨｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｔｙｐｅ ＡＢ（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。血清を、遠心分離機を用いて、１４０００ｇで１０分間、４℃で遠心を行い、血球などの成分を沈殿させた。沈殿物を吸わないように、上清を回収し、０．２μｍのフィルターで濾過を行なった。このように前処理した血清上清のうち２ｍｌを、超遠心分離機 Ｏｐｔｉｍａ ＴＬＸ（ベックマン・コールター社製）を用いて１１００００ｇで７０分間、４℃で遠心を行ない、エクソソームを沈殿させた。上清を取り除き、再び２ｍｌの前処理した血清上清を加え、超遠心分離機 Ｏｐｔｉｍａ ＴＬＸ（ベックマン・コールター社製）を用いて１１００００ｇで７０分間、４℃で遠心を行なった。合計で４ｍｌの血清からエクソソームを沈殿させた後、上清を取り除いて、２ｍｌのＰＢＳを加えて撹拌後、超遠心分離機 Ｏｐｔｉｍａ ＴＬＸ（ベックマン・コールター社製）用いて１１００００ｇで７０分間、４℃で遠心を行ない洗浄した。この洗浄操作をもう一度行ない、合計で２回の洗浄を行なった。最終的に、沈殿したエクソソームを０．２ｍｌのＰＢＳで再懸濁した。

回収したエクソソームからｍｉＲＮＡの抽出を行なった。ｍｉＲＮＡの抽出は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて行なった。具体的には、２５μｌの回収したエクソソーム溶液（血清０．５ｍｌ相当）に、キット付属の３００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌ３）を混合し、付属のスピンカラムを用いて同社のプロトコールに従ってｍｉＲＮＡの抽出を行なった。スピンカラムに結合したｍｉＲＮＡは、５０μｌのＲＮａｓｅ-ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで溶出し回収した。

〔３．血清からのｍｉＲＮＡの直接抽出〕
血清として、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｔｙｐｅ ＡＢ（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。血清を、遠心分離機を用いて、１４０００ｇで１０分間、４℃で遠心を行い、血球などの成分を沈殿させた。沈殿物を吸わないように、上清を回収し、０．２μｍのフィルターで濾過を行なった。このように前処理した血清上清から直接、ｍｉＲＮＡの抽出を行なった。ｍｉＲＮＡの精製は、ＲＮＡｚｏｌ ＲＴ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＥＮＴＥＲ社製）とＰｕｒｅＬｉｎｋ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製）とを組み合わせて行なった。前処理した血清上清（０．５ｍｌ）を、１．５ｍｌのマイクロチューブに加え、１ｍｌのＲＮＡｚｏｌ ＲＴ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＥＮＴＥＲ社製）と混合し、１５秒間撹拌した後、１０分間静置した。１２０００ｇで１５分間、４℃で遠心を行ない、ＤＮＡ、多糖、タンパク質などを沈殿させた。４００μｌの上清（ＲＮＡ画分）と２１５μｌの９９．５％エタノールとを混合し、付属のスピンカラムを用いて同社のプロトコールに従ってｍｉＲＮＡの抽出を行なった。スピンカラムに結合したｍｉＲＮＡを、５０μｌのＲＮａｓｅ-ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで溶出し回収した。

〔４．免疫沈降法を用いたエクソソームの回収とｍｉＲＮＡの抽出〕
血清として、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｔｙｐｅ ＡＢ（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。血清を、遠心分離機を用いて、１４０００ｇで１０分間、４℃で遠心を行い、血球などの成分を沈殿させた。沈殿物を吸わないように、血清上清を回収した。このように前処理した上清から、エクソソームをＥｘｏＣａｐ ＣＤ６３ Ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ（ＪＳＲライフサイエンス社製）を用いて、同社のプロトコールに従って回収した。具体的には、前処理した血清上清のうち０．５ｍｌを、１．５ｍｌのマイクロチューブに加え、キット付属の１００μｌのＣＤ６３ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓと、キット付属のＷａｓｈｉｎｇ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（４００μｌ）とを加え、室温で３０分間撹拌し、エクソソームをＣＤ６３ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓに結合させた。チューブをマグネットスタンドにセットして１分間静置し、上清を捨てた。チューブをマグネットスタンドから外し、キット付属のＷａｓｈｉｎｇ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍｌ）を加えて撹拌した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分間静置し、上清を捨て洗浄した。この洗浄操作を合計で、３回行なった。

回収したエクソソームからのｍｉＲＮＡの抽出は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて行なった。具体的には、上記のエクソソームが結合したＣＤ６３ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓに、キット付属の３００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌ３）を添加して、５分間振盪し、エクソソーム内のｍｉＲＮＡを溶出した。チューブをマグネットスタンドにセットして１分間静置して上清（ｍｉＲＮＡ画分）を回収し、付属のスピンカラムを用いて同社のプロトコールに従ってｍｉＲＮＡの抽出を行なった。スピンカラムに結合したｍｉＲＮＡは、５０μｌのＲＮａｓｅ-ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで溶出し回収した。

〔５．ＲＴ-ＰＣＲ法によるｍｉＲＮＡの定量〕
エクソソームに含まれるｍｉＲＮＡをＲＴ-ＰＣＲ法を用いて定量した。ＲＴ-ＰＣＲ法は、まず（ａ）ＲＮＡを、逆転写反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＲＴ）によりＤＮＡに変換し、（ｂ）変換されたＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をリアルタイムＰＣＲにより定量する方法である。ｍｉＲＮＡとして、エクソソームに特異的に含まれることが知られているｍｉＲ１４２-３ｐを定量した。（ａ）の逆転写反応には、ＲＴ反応試薬としてＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製）を、プライマーとしてＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ：ｈｓａ-ｍｉＲ-１４２-３ｐ（Ａｓｓａｙ ＩＤ：０００４６４）（ライフテクノロジーズ社製）を用い、同社のプロトコールに従って行なった。（ｂ）のリアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲ反応試薬としてＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ， ｎｏ ＵＮＧ（ライフテクノロジーズ社製）を、プライマーとしてＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ：ｈｓａ-ｍｉＲ-１４２-３ｐ（Ａｓｓａｙ ＩＤ：０００４６４）（ライフテクノロジーズ社製）を用い、同社のプロトコールに従って行なった。

〔６．試験例１〕
エクソソームの回収方法として最も標準的な方法は、超遠心法である。この超遠心法と本発明の方法、および血清からｍｉＲＮＡを直接抽出する方法について、エクソソームの回収効率について比較を行なった。エクソソームの回収量は、エクソソームに含まれているｍｉＲＮＡを定量することによって評価した。

超遠心法は、上記〔２．〕のとおりに行い、これを比較例１とした。

一方、本発明の方法は、上記〔１．〕のとおりに行い、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘを用いた場合を実施例１とした。

また、血清からｍｉＲＮＡを直接抽出する方法は、上記〔３．〕のとおりに行い、これを比較例２とした。

それぞれの抽出したｍｉＲＮＡ試料を用いてＲＴ-ＰＣＲを行ない、ｍｉＲ１４２-３ｐを定量した。ＲＴ-ＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づき、血清からｍｉＲＮＡを直接抽出した場合のｍｉＲ１４２-３ｐの量を１として、それぞれの相対濃度を算出した（表１）。表１中、Ｃｔ値は、ＰＣＲ産物が一定量に達するサイクル数を示し、ΔＣｔは、各例のＣｔ値から基準とした例のＣｔ値を引いた値を示し、具体的には、各例のＣｔ値から比較例２のＣｔ値を引いた値を示す。

その結果、比較例１のｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、７３９．２９、実施例１のｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、３４．３となった（表１）。本発明の方法は、超遠心法と比べるとｍｉＲ１４２-３ｐの量は低い収量であったが、血清からｍｉＲＮＡを直接抽出した場合と比べると約３４倍と高い収量であった。すなわち、本発明の方法は、血清からｍｉＲＮＡを直接抽出する場合と比べると収率が極めて高く、ｍｉＲＮＡを効率的に回収できることが分かった。

〔７．試験例２〕
エクソソームを回収する方法として、超遠心法以外にも種々の方法が開発されている。その中でも、本発明の手法と同じように磁性ビーズを用いてエクソソームを回収する免疫沈降法が知られている。この免疫沈降法は、エクソソームの表面に存在する特定の抗原タンパク質に結合する抗体を磁性ビーズに固定化し、この抗体を介して磁性ビーズにエクソソームを結合させる。この免疫沈降法、本発明の方法、および超遠心法について、エクソソームの回収効率について比較を行なった。エクソソームの回収量は、エクソソームに含まれているｍｉＲＮＡを定量することによって評価した。

免疫沈降法は、上記〔４．〕のとおりに行い、これを比較例３とした。

一方、本発明の方法は、上記〔１．〕のとおりに行い、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘを用いた場合を実施例２、ＬＬ３７を用いた場合を実施例３、Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ（ｎ−１６）を用いた場合を実施例４とした。

また、超遠心法は、上記〔２．〕のとおりに行い、これを比較例４とした。

それぞれの抽出したｍｉＲＮＡサンプルを用いてＲＴ-ＰＣＲを行ない、ｍｉＲ１４２-３ｐを定量した。ＲＴ-ＰＣＲにより得られたＣｔ値に基づき、免疫沈降法でエクソソームを回収してｍｉＲＮＡを抽出した場合のｍｉＲ１４２-３ｐの量を１として、それぞれの相対濃度を算出した（表２）。表２中、Ｃｔ値は、ＰＣＲ産物が一定量に達するサイクル数を示し、ΔＣｔは、各例のＣｔ値から基準とした例のＣｔ値を引いた値を示し、具体的には、各例のＣｔ値から比較例３のＣｔ値を引いた値を示す。

その結果、比較例４のｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、１４．３、本発明の方法である実施例２、３および４のｍｉＲ１４２-３ｐの相対濃度は、それぞれ０．７５、０．４９、０．１３であった（表２）。ｍｉＲ１４２-３ｐの収量の比較から、本発明の方法におけるエクソソームとの親和性の高さは、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘ（実施例２）＞ＬＬ３７（実施例３）＞Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ（ｎ−１６）（実施例４）の順で高く、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘがエクソソームに対して最も高い親和性を有することが分かった。

また、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘを利用した磁性ビーズの方法は、免疫沈降法のａｎｔｉ-ＣＤ６３抗体を利用した磁性ビーズの方法に比べ、ｍｉＲ１４２-３ｐの収量は、約７５％であった。この結果から、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘのエクソソームに対する親和性は、抗体のエクソソームに対する親和性と同程度の極めて高い親和性を有することが分かった。

本発明によると、エクソソームにおける抗原分子の発現状態に関わらず、広くエクソソームを捕捉し、回収することができる。したがって、本発明によると、エクソソームの回収が容易となり、またその内部に包含される物質の解析を詳細に行うことができるようになるため、種々の技術分野、とりわけ、製薬や医療分野において有用である。

Claims (9)

1. 以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドを含有していることを特徴とする、エクソソームの精製用組成物：
   （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
   （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
   （ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。
2. 前記ペプチドが結合する担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のエクソソームの精製用組成物。
3. 前記担体が磁性支持体であることを特徴とする、請求項２に記載のエクソソームの精製用組成物。
4. ペプチドと生物学的試料とを接触させる工程を含むエクソソームの精製方法であって、
   前記ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドであることを特徴とする、エクソソームの精製方法：
   （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
   （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
   （ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。
5. 前記ペプチドが担体に結合したものであることを特徴とする、請求項４に記載のエクソソームの精製方法。
6. 前記担体が磁性支持体であることを特徴とする、請求項５に記載のエクソソームの精製方法。
7. ペプチドを含むエクソソームの精製用キットであって、
   前記ペプチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドであることを特徴とする、エクソソームの精製用キット：
   （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
   （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
   （ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。
8. 被験者が疾患を有するか否かを判定するためのデータ取得方法であって、
   （ａ）請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法を用いて生物学的試料からエクソソームを精製する精製工程、および
   （ｂ）前記（ａ）で精製されたエクソソームに内包されるｍｉＲＮＡのレベルを検出する検出工程
   を含むことを特徴とする、データ取得方法。
9. 以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドを含有していることを特徴とする、エクソソームを標識するための組成物：
   （ａ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
   （ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド、
   （ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エクソソームへの結合活性を有するペプチド。

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