JP2017023008A - Method for culturing stem cells using incubator having polyrotaxane block copolymer surface - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、幹細胞の培養方法に関する。詳細には、ポリロタキサンブロック共重合体で表面をコーティングした培養器を用いた幹細胞の培養方法に関する。さらに詳細には、ポリロタキサンブロック共重合体表面を有する培養器を用いて多能性幹細胞を培養して、その未分化性を維持する方法、あるいは特定の細胞への分化を誘導する方法に関する。 The present invention relates to a method for culturing stem cells. Specifically, the present invention relates to a method for culturing stem cells using a culture vessel whose surface is coated with a polyrotaxane block copolymer. More specifically, the present invention relates to a method for culturing pluripotent stem cells using a culture vessel having a polyrotaxane block copolymer surface and maintaining the undifferentiation property, or a method for inducing differentiation into specific cells.
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）やヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）などのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、創薬や再生医療への応用が期待されている。多能性幹細胞を安全に、そして再現性良く培養し、増殖させることは，これらの細胞を医療応用する上では必須の基盤技術となる。特に、再生医療の産業利用上においては、幹細胞を未分化状態で多量に扱う必要があることから、天然および合成の高分子を用いて多能性幹細胞の増殖を支持すると同時に多分化能を維持する技術について広範な研究が行われている（非特許文献１）。 Human pluripotent stem cells (hPSC) such as human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are expected to be applied to drug discovery and regenerative medicine. Cultivating and proliferating pluripotent stem cells safely and reproducibly is an essential fundamental technology for medical application of these cells. In particular, in the industrial use of regenerative medicine, it is necessary to handle stem cells in large quantities in an undifferentiated state. Therefore, natural and synthetic polymers are used to support the proliferation of pluripotent stem cells while maintaining pluripotency. Extensive research has been conducted on the technology to be performed (Non-Patent Document 1).
未分化状態でｈＰＳＣを維持するために現在最もよく使用されている手法は、フィーダー細胞上（例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）や、ヒト***線維芽細胞、ヒト脂肪由来細胞など）あるいは、マトリゲル上もしくはゲルトレックス上において培養を行うというものである。しかし、フィーダー細胞を用いたｈＰＳＣの培養は、時間がかかり、フィーダー細胞のロットごとにばらつきが生じるという問題があり、また労働集約的でもある。一方、マトリゲルとゲルトレックスは、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、へパラン硫酸プロテオグリカン、エナクチン、増殖因子などを含むマウスＥＨＳ肉腫から分離された基質により構成されており、多くのｈＥＳＣ株の多分化能を支持することが報告されている。しかし、これらは厳密な組成が明らかでなく、異種生物由来成分を含むものであるため、このような培養条件を用いた場合にはｈＰＳＣの臨床応用が妨げられる。また、ヒトには無いシアル酸のＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）などの免疫原性エピトープや、異種感染ウイルスのヒトへの伝播に関する懸念がある（非特許文献２）。 Currently the most commonly used techniques for maintaining hPSCs in an undifferentiated state are on feeder cells (eg mouse embryonic fibroblasts (MEF), human foreskin fibroblasts, human adipose derived cells, etc.) or The culture is carried out on Matrigel or Geltrex. However, culturing hPSCs using feeder cells is time consuming, has a problem that it varies from lot to lot of feeder cells, and is labor intensive. Matrigel and Gertrex, on the other hand, are composed of substrates isolated from mouse EHS sarcoma, including laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, enactin, growth factors, etc., and support the multipotency of many hESC strains It has been reported to do. However, since the exact composition is not clear and contains components derived from different organisms, the clinical application of hPSC is hindered when such culture conditions are used. There are also concerns regarding immunogenic epitopes such as sialic acid N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc), which are not found in humans, and transmission of heterologous infectious viruses to humans (Non-patent Document 2).
ｈＥＳＣやｈｉＰＳＣなどの細胞の製造を、優良製造規範（ｃＧＭＰ）に適合した施設においてフィーダー細胞や異種生物由来成分を含まない条件下で大規模に行うことが現在求められているが、フィーダー細胞の存在が特にｈＰＳＣの利用を制限している。ｈＰＳＣの多分化能の維持のためには、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、Ｗｎｔ、およびアクチビン／Ｎｏｄａｌ経路が重要であると考えられており、さまざまな研究により、フィーダー細胞の関与しない代替的なｈＰＳＣ培養条件が試みられているが、ｈＰＳＣの自己複製能力の維持を担う主成分は明らかとされていない（非特許文献３）。 The production of cells such as hESC and hiPSC is currently required to be carried out on a large scale under conditions that do not contain components derived from feeder cells and heterologous organisms in facilities that conform to the Good Manufacturing Practice (cGMP). The presence in particular limits the use of hPSC. The basic FGF (bFGF), Wnt, and activin / Nodal pathways are thought to be important for maintaining hPSC pluripotency, and various studies have shown that alternative hPSCs that do not involve feeder cells Although culture conditions have been tried, the main component responsible for maintaining the self-renewal ability of hPSC has not been clarified (Non-patent Document 3).
再生医療に向けた将来的な研究に必要とされる保存可能なｈＰＳＣ集団を作成するためには、ｈＰＳＣの多分化能が維持されるように増殖を制御することが重要な技術となる。近年、ｈＰＳＣを培養しつつ、その多分化能を維持するために、化学組成の明らかな培地と共に、細胞培養マトリクスの開発が進められている。これらのマトリクスは、化学組成が明らか、あるいは異種生物由来成分を含まないものであるが、特定の培地の組み合わせを必要とする。また、これらの細胞マトリクス上で多分化能を維持できるのは、特定のｈＰＳＣだけである。ｈＰＳＣ培養のために最適なマトリクスを決定することは、現在は容易でない（非特許文献４）。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を医療等に利用するために、これらの細胞を安全、簡便、安価に増殖させる培養技術がすでに十分に確立されているとは言えない。また、多能性幹細胞の分化を制御（促進）する技術にも、多様なニーズが存在している。 In order to create a storable hPSC population required for future research toward regenerative medicine, it is important to control proliferation so that the pluripotency of hPSC is maintained. In recent years, in order to maintain the pluripotency while culturing hPSC, a cell culture matrix has been developed together with a medium having a clear chemical composition. These matrices have a clear chemical composition or are free of xenogeneic components, but require specific media combinations. Also, only specific hPSCs can maintain pluripotency on these cell matrices. It is currently not easy to determine the optimal matrix for hPSC culture (Non-patent Document 4). In order to utilize human pluripotent stem cells (hPSC) for medical treatment, it cannot be said that a culture technique for proliferating these cells safely, simply and inexpensively has already been sufficiently established. There are also various needs for techniques for controlling (promoting) differentiation of pluripotent stem cells.
一方、培養器材に接着した細胞では、器材の物理化学的特性を反映して生理活性シグナルが細胞内へ伝達され、それによって細胞の増殖、分化、死滅など代謝活動が調節されることが知られている。そのため、材料表面の物理化学的因子を制御し、それに従った細胞機能制御に関する研究がここ十年ほど活発に行われてきた（非特許文献５〜７）。例えば、種々の弾力性を有するエラストマー表面上での間葉系幹細胞の分化特性は、接着しているエラストマーのヤング率が低くなることにより神経及び脂肪細胞への分化が促進され、高くなることにより骨芽細胞への分化が促進されることなどが知られている（非特許文献８）。また、ｈＥＳＣは物理刺激感受性であり、培養器上のマイクロポストアレイのマトリクス剛性が高まると、細胞骨格の収縮性が増加し、硬い基質によってｈＥＳＣの多能性の維持が促進されることが知られている（非特許文献９および１０）。しかしながら、このような器材の物理化学的特性を調整することで幹細胞の分化もしくは未分化維持を制御する技術も、この分野における多様なニーズを満たすまでに十分に確立されてはいない。 On the other hand, in cells that adhere to culture equipment, it is known that a physiological activity signal is transmitted into the cells reflecting the physicochemical characteristics of the equipment, thereby regulating metabolic activities such as cell proliferation, differentiation, and death. ing. For this reason, research on physicochemical factors on the surface of materials and cell function control according to them has been actively conducted for the past 10 years (Non-Patent Documents 5 to 7). For example, the differentiation characteristics of mesenchymal stem cells on elastomeric surfaces with various elasticity are enhanced by the differentiation of nerves and adipocytes being promoted by lowering the Young's modulus of the adhered elastomer. It is known that differentiation into osteoblasts is promoted (Non-patent Document 8). In addition, hESC is sensitive to physical stimuli, and it is known that when the matrix stiffness of the micropost array on the incubator increases, the contractility of the cytoskeleton increases and the maintenance of pluripotency of hESC is promoted by a hard substrate. (Non-Patent Documents 9 and 10). However, a technique for controlling the differentiation or undifferentiation maintenance of stem cells by adjusting the physicochemical characteristics of such equipment has not been sufficiently established to satisfy various needs in this field.
本発明は、新たな多能性幹細胞の培養技術を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、安全性の高い多能性幹細胞の培養技術を提供することを目的の一つとし、扱いが簡便な多能性幹細胞の培養技術を提供することを別の目的の一つとし、さらに、コストが安価な多能性幹細胞の培養技術を提供することを別の目的の一つとする。 An object of the present invention is to provide a new pluripotent stem cell culture technique. Another object of the present invention is to provide a highly safe culture technique for pluripotent stem cells, and to provide a culture technique for pluripotent stem cells that is easy to handle. Furthermore, another object is to provide a pluripotent stem cell culture technique at low cost.
本発明は、一つの態様において、ポリロタキサン（ＰＲＸ）ブロック共重合体で表面をコーティングした培養器を用いて、幹細胞を培養する方法を提供する。本発明者らは、ポリロタキサン（ＰＲＸ）ブロック共重合体で表面をコーティングした培養器を用いて幹細胞を培養することで、多能性幹細胞の未分化性を維持することが可能であること、また、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進することが可能であることを見いだした。 In one embodiment, the present invention provides a method of culturing stem cells using a culture vessel whose surface is coated with a polyrotaxane (PRX) block copolymer. The present inventors can maintain the undifferentiation of pluripotent stem cells by culturing stem cells using an incubator whose surface is coated with a polyrotaxane (PRX) block copolymer, They found that it is possible to promote differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes.
本発明は、一つの態様において、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養方法であって、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器上で該多能性幹細胞を培養する工程を含む方法を提供する。 In one embodiment, the present invention provides a cell culture method for maintaining the undifferentiated nature of pluripotent stem cells, the pluripotent stem cells on a culture vessel having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer. A method comprising the step of culturing
本方法の一つの態様において、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）またはｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、特に、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、***線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、もしくは心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞のいずれかである。本方法の一つの態様において、多能性幹細胞は霊長類または齧歯類の細胞であり、より具体的にはヒト、マウス、またはラットの細胞のいずれかである。あるいは、ブタ、ウサギ、サルの多能性幹細胞も使用されうる。 In one embodiment of the method, the pluripotent stem cells are ES cells (embryonic stem cells) or iPS cells (artificial pluripotent stem cells), in particular skin fibroblast-derived iPS cells, fetal lung cell-derived iPS cells, foreskin Either a fibroblast-derived iPS cell or a cardiac fibroblast-derived iPS cell. In one embodiment of the method, the pluripotent stem cell is a primate or rodent cell, more specifically either a human, mouse or rat cell. Alternatively, porcine, rabbit, monkey pluripotent stem cells can also be used.
本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、環状分子としてα−、β−もしくはγ−シクロデキストリンを含む。シクロデキストリン（以下、ＣＤともいう）はメトキシ基により修飾されていてもよい。本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体が線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む場合、ＰＥＧの分子量は１５０００〜２５０００でありうる。環状分子と線状分子との分子数の比率は２０：１〜１０：１でありうる。本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、ブロック分子としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）および／またはＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体のブロック分子として、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが用いられる場合、ＢＭＡモル分率は０．３〜０．４でありうる。 In one embodiment of the method, the polyrotaxane block copolymer comprises α-, β-, or γ-cyclodextrin as a cyclic molecule. Cyclodextrin (hereinafter also referred to as CD) may be modified with a methoxy group. In one embodiment of the method, the polyrotaxane block copolymer comprises polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol (PPG) as the linear molecule. When the polyrotaxane block copolymer includes polyethylene glycol (PEG) as a linear molecule, the molecular weight of PEG can be 15000-25000. The ratio of the number of molecules of cyclic molecules and linear molecules can be 20: 1 to 10: 1. In one embodiment of the method, the polyrotaxane block copolymer comprises MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and / or BMA (n-butyl methacrylate) as the block molecule. When a combination of MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and BMA (n-butyl methacrylate) is used as the block molecule of the polyrotaxane block copolymer, the BMA molar fraction can be 0.3 to 0.4. .
本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、培養器上での分子運動性因子Ｍｆの値が０．３以上である。 In one embodiment of this method, the polyrotaxane block copolymer has a molecular mobility factor Mf value of 0.3 or more on the incubator.
本方法の一つの態様において、培養器の素材は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）を含む。 In one embodiment of the method, the incubator material comprises glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyolefin, polycarbonate, or acrylic block copolymer (BCF).
一つの態様において、本方法は、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器に、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地を添加する工程をさらに含む。一つの態様において、本方法は、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器に、多能性幹細胞を播種する工程をさらに含む。 In one embodiment, the method further comprises the step of adding a cell culture medium for maintaining the undifferentiation of pluripotent stem cells to a culture vessel having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer. In one embodiment, the method further comprises seeding pluripotent stem cells in a culture vessel having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer.
本方法の一つの態様においては、培養培地として、多能性幹細胞の未分化性を維持するために調合された培地が使用される。 In one embodiment of this method, a culture medium prepared to maintain the undifferentiated nature of pluripotent stem cells is used as the culture medium.
本発明は、一つの態様において、細胞培養用のキットであって、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器と、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地とを含む、キットを提供する。 In one embodiment, the present invention provides a cell culture kit, a culture vessel having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer, and a cell culture medium for maintaining the undifferentiation of pluripotent stem cells And a kit comprising:
本キットの一つの態様において、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）またはｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、特に、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、***線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、もしくは心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞のいずれかである。本キットの一つの態様において、多能性幹細胞は霊長類または齧歯類の細胞であり、より具体的にはヒト、マウス、またはラットの細胞のいずれかである。 In one embodiment of this kit, the pluripotent stem cells are ES cells (embryonic stem cells) or iPS cells (artificial pluripotent stem cells), in particular skin fibroblast-derived iPS cells, fetal lung cell-derived iPS cells, foreskin Either a fibroblast-derived iPS cell or a cardiac fibroblast-derived iPS cell. In one embodiment of the kit, the pluripotent stem cell is a primate or rodent cell, more specifically either a human, mouse or rat cell.
本キットの一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、環状分子としてシクロデキストリン（α−、β−もしくはγ−シクロデキストリン）を含む。シクロデキストリンはメトキシ基により修飾されていてもよい。本キットの一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体が線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む場合、ＰＥＧの分子量は１５０００〜２５０００でありうる。環状分子と線状分子との分子数の比率は２０：１〜１０：１でありうる。本キットの一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、ブロック分子としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）および／またはＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体のブロック分子として、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが用いられる場合、ＢＭＡモル分率は０．３〜０．４でありうる。 In one embodiment of the kit, the polyrotaxane block copolymer comprises cyclodextrin (α-, β-, or γ-cyclodextrin) as a cyclic molecule. The cyclodextrin may be modified with a methoxy group. In one embodiment of the kit, the polyrotaxane block copolymer comprises polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol (PPG) as a linear molecule. When the polyrotaxane block copolymer includes polyethylene glycol (PEG) as a linear molecule, the molecular weight of PEG can be 15000-25000. The ratio of the number of molecules of cyclic molecules and linear molecules can be 20: 1 to 10: 1. In one embodiment of the kit, the polyrotaxane block copolymer comprises MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and / or BMA (n-butyl methacrylate) as a block molecule. When a combination of MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and BMA (n-butyl methacrylate) is used as the block molecule of the polyrotaxane block copolymer, the BMA molar fraction can be 0.3 to 0.4. .
本キットの一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、培養器上での分子運動性因子Ｍｆの値が０．３以上である。 In one embodiment of this kit, the polyrotaxane block copolymer has a molecular mobility factor Mf value of 0.3 or more on the incubator.
本キットの一つの態様において、培養器の素材は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）を含む。 In one embodiment of the kit, the incubator material comprises glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyolefin, polycarbonate, or acrylic block copolymer (BCF).
本キットの一つの態様においては、培養培地として、多能性幹細胞の未分化性を維持するために調合された培地が含められる。培養培地は、液体の形で提供されても、乾燥粉末の形で提供されてもよい。培養培地は、１つの容器に全ての成分が含まれていても、成分ごとに複数の容器に分けられていてもよい。 In one embodiment of the kit, the culture medium includes a medium formulated to maintain the undifferentiated nature of pluripotent stem cells. The culture medium may be provided in liquid form or in the form of a dry powder. The culture medium may contain all the components in one container, or may be divided into a plurality of containers for each component.
本発明は、一つの態様において、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地を含む、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器を提供する。 In one embodiment, the present invention provides an incubator having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer comprising a cell culture medium for maintaining the undifferentiated nature of pluripotent stem cells.
本培養器の一つの態様において、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）またはｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、特に、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、***線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、もしくは心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞のいずれかである。本培養器の一つの態様において、多能性幹細胞は霊長類または齧歯類の細胞であり、より具体的にはヒト、マウス、またはラットの細胞のいずれかである。 In one embodiment of the incubator, the pluripotent stem cells are ES cells (embryonic stem cells) or iPS cells (artificial pluripotent stem cells), in particular skin fibroblast-derived iPS cells, fetal lung cell-derived iPS cells, Either foreskin fibroblast-derived iPS cells or cardiac fibroblast-derived iPS cells. In one embodiment of the incubator, the pluripotent stem cells are primate or rodent cells, more specifically either human, mouse, or rat cells.
本培養器の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、環状分子としてα−、β−もしくはγ−シクロデキストリンを含む。シクロデキストリンはメトキシ基により修飾されていてもよい。本培養器の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体が線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む場合、ＰＥＧの分子量は１５０００〜２５０００でありうる。環状分子と線状分子との分子数の比率は２０：１〜１０：１でありうる。本培養器の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、ブロック分子としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）および／またはＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体のブロック分子として、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが用いられる場合、ＢＭＡモル分率は０．３〜０．４でありうる。 In one embodiment of the incubator, the polyrotaxane block copolymer contains α-, β-, or γ-cyclodextrin as a cyclic molecule. The cyclodextrin may be modified with a methoxy group. In one embodiment of the incubator, the polyrotaxane block copolymer contains polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol (PPG) as a linear molecule. When the polyrotaxane block copolymer includes polyethylene glycol (PEG) as a linear molecule, the molecular weight of PEG can be 15000-25000. The ratio of the number of molecules of cyclic molecules and linear molecules can be 20: 1 to 10: 1. In one embodiment of the incubator, the polyrotaxane block copolymer contains MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and / or BMA (n-butyl methacrylate) as a block molecule. When a combination of MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and BMA (n-butyl methacrylate) is used as the block molecule of the polyrotaxane block copolymer, the BMA molar fraction can be 0.3 to 0.4. .
本培養器の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、培養器上での分子運動性因子Ｍｆの値が０．３以上である。 In one embodiment of the present incubator, the polyrotaxane block copolymer has a molecular mobility factor Mf value of 0.3 or more on the incubator.
本培養器の一つの態様において、培養器の素材は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）を含む。 In one embodiment of the incubator, the incubator material includes glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyolefin, polycarbonate, or acrylic block copolymer (BCF).
本培養器の一つの態様においては、培養培地として、多能性幹細胞の未分化性を維持するために調合された培地が含められている。 In one embodiment of the incubator, a culture medium prepared to maintain the undifferentiated nature of pluripotent stem cells is included as the culture medium.
本発明は、一つの態様において、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養方法であって、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器上で該多能性幹細胞を培養する工程を含む方法を提供する。 In one embodiment, the present invention provides a cell culture method for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes, wherein the pluripotent stem cell has a surface coated with a polyrotaxane block copolymer. A method comprising the step of culturing sex stem cells is provided.
本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、環状分子としてα−、β−もしくはγ−シクロデキストリンを含む。シクロデキストリンはメトキシ基により修飾されていてもよい。本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体が線状分子としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む場合、ＰＥＧの分子量は１５０００〜２５０００でありうる。環状分子と線状分子との分子数の比率は２０：１〜１０：１でありうる。本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、ブロック分子としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）および／またはＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）を含む。ポリロタキサンブロック共重合体のブロック分子として、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが用いられる場合、ＢＭＡモル分率は０．３〜０．４でありうる。 In one embodiment of the method, the polyrotaxane block copolymer comprises α-, β-, or γ-cyclodextrin as a cyclic molecule. The cyclodextrin may be modified with a methoxy group. In one embodiment of the method, the polyrotaxane block copolymer comprises polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol (PPG) as the linear molecule. When the polyrotaxane block copolymer includes polyethylene glycol (PEG) as a linear molecule, the molecular weight of PEG can be 15000-25000. The ratio of the number of molecules of cyclic molecules and linear molecules can be 20: 1 to 10: 1. In one embodiment of the method, the polyrotaxane block copolymer comprises MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and / or BMA (n-butyl methacrylate) as the block molecule. When a combination of MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and BMA (n-butyl methacrylate) is used as the block molecule of the polyrotaxane block copolymer, the BMA molar fraction can be 0.3 to 0.4. .
本方法の一つの態様において、ポリロタキサンブロック共重合体は、培養器上での分子運動性因子Ｍｆの値が０．３以上である。 In one embodiment of this method, the polyrotaxane block copolymer has a molecular mobility factor Mf value of 0.3 or more on the incubator.
本方法の一つの態様において、培養器の素材は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、またはポリカーボネートを含む。 In one embodiment of the method, the incubator material comprises glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyolefin, or polycarbonate.
一つの態様において、本方法は、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器に、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地を添加する工程をさらに含む。一つの態様において、本方法は、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器に、多能性幹細胞を播種する工程をさらに含む。 In one embodiment, the method further comprises the step of adding a cell culture medium for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes into a culture vessel having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer. . In one embodiment, the method further comprises seeding pluripotent stem cells in a culture vessel having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer.
本方法の一つの態様においては、培養培地として、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するために調合された培地が使用される。 In one embodiment of this method, a culture medium prepared to promote differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes is used as the culture medium.
一つの態様において、本方法は、多能性幹細胞に心筋細胞への分化を促進する刺激を与える工程をさらに含む。 In one embodiment, the method further comprises the step of providing a pluripotent stem cell with a stimulus that promotes differentiation into cardiomyocytes.
さらに、本発明は、さらなる態様において、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器と、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地とを含む、細胞培養用のキット、あるいは、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地を含む、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器も提供する。 Furthermore, the present invention, in a further aspect, a cell culture comprising a culture vessel having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer, and a cell culture medium for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes. And a culture vessel having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer, including a cell culture medium for promoting the differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes.
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明者らは、高い表面分子運動性を有するＰＲＸブロック共重合体表面上で多能性幹細胞を培養すると、幹細胞を未分化状態で維持可能であることを見出した。ポリロタキサンを用いて表面を加工した培養器上でマウス線維芽細胞あるいはラット間葉系幹細胞を培養した際の挙動が以前に調べられているが（上記非特許文献５〜７を参照）、これらの文献が、細胞の変化の促進を示しているのとは対照的である。また、本発明者らは予想外なことに、ＰＲＸブロック共重合体表面上での培養により、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進することも可能なことをあわせて見出した。 The present invention is described in detail below. The present inventors have found that when pluripotent stem cells are cultured on the surface of a PRX block copolymer having high surface molecular mobility, the stem cells can be maintained in an undifferentiated state. The behavior of mouse fibroblasts or rat mesenchymal stem cells cultured on an incubator whose surface has been processed with polyrotaxane has been previously investigated (see Non-Patent Documents 5 to 7 above). In contrast to the literature showing accelerated cell changes. In addition, the present inventors have unexpectedly found that the differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes can be promoted by culturing on the surface of the PRX block copolymer.
ポリロタキサン（ＰＲＸ）
ロタキサンは、大環状分子を線状分子が貫通し、線状分子の両末端に嵩高い部位を結合させることで、立体障害でリングが軸から抜けなくなったものである。ポリロタキサンでは、複数の大環状分子の環内を１本の線状分子が貫いている。本発明は、一つの態様において、ポリロタキサン（ＰＲＸ）ブロック共重合体で表面をコーティングした培養器を用いて、幹細胞を培養する方法を提供するものである。本発明において用いられる線状分子や環状分子は特に限定されないが、線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、及びポリメチルビニルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上であることが好ましい。また、線状分子の平均分子量は２００〜１０００００、特に１００００〜４００００あるいは１５０００〜２５０００であることが好ましく、例えば、分子量２００００のポリエチレングリコールが使用される。環状分子としては、α、β又はγ−シクロデキストリンであることが好ましいが、これと類似の環状構造を持つものであってもよく、そのような環状構造としては環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、環状ポリアミン等が挙げられる。線状分子と環状分子の組み合わせとしては、α−シクロデキストリンとポリエチレングリコールとの組合せが好ましい。なお、α−シクロデキストリンとポリエチレングリコールとの組合せによるポリロタキサンの合成例は、上記の特許文献１〜３にも開示されており、その内容は参照により本明細書にも取り込まれる。好ましい環状分子の分子数と線状分子の分子数との比率は５０：１〜４：１であり、２０：１〜１０：１の比率がより好ましく、例えば、１２：１の比率が用いられる。すなわち、好ましくは線状分子１分子に４〜５０個の環状分子が含まれ、より好ましくは１０〜２０個の環状分子が含まれ、例えば、１２個の環状分子が含まれる。α−シクロデキストリンをポリエチレングリコールに貫通させる場合、α−シクロデキストリンとポリエチレングリコールの繰り返し単位（エチレンオキシド単位）の比の化学量論数は１：２といわれている。
Polyrotaxane (PRX)
A rotaxane is one in which a linear molecule penetrates a macrocyclic molecule and bonds bulky sites to both ends of the linear molecule, so that the ring cannot be removed from the axis due to steric hindrance. In polyrotaxane, one linear molecule penetrates the ring of a plurality of macrocyclic molecules. In one embodiment, the present invention provides a method of culturing stem cells using a culture vessel whose surface is coated with a polyrotaxane (PRX) block copolymer. The linear molecule and cyclic molecule used in the present invention are not particularly limited, but the linear molecule is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, a copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol, and polymethyl vinyl ether. It is preferable that it is 1 type, or 2 or more types. The average molecular weight of the linear molecules is preferably 200 to 100,000, particularly 10,000 to 40,000 or 15,000 to 25,000. For example, polyethylene glycol having a molecular weight of 20,000 is used. The cyclic molecule is preferably α, β or γ-cyclodextrin, but may have a similar cyclic structure, such as cyclic polyether, cyclic polyester, cyclic Examples include polyether amines and cyclic polyamines. As a combination of a linear molecule and a cyclic molecule, a combination of α-cyclodextrin and polyethylene glycol is preferable. In addition, the synthesis example of the polyrotaxane by the combination of (alpha) -cyclodextrin and polyethyleneglycol is also disclosed by said patent document 1-3, The content is taken in in this specification by reference. The ratio of the number of molecules of cyclic molecules to the number of molecules of linear molecules is 50: 1 to 4: 1, more preferably 20: 1 to 10: 1, for example, a ratio of 12: 1 is used. . That is, 4 to 50 cyclic molecules are preferably included in one molecule of the linear molecule, more preferably 10 to 20 cyclic molecules are included, for example, 12 cyclic molecules are included. When penetrating α-cyclodextrin into polyethylene glycol, the stoichiometric number of the ratio of repeating units (ethylene oxide units) of α-cyclodextrin and polyethylene glycol is said to be 1: 2.
本発明において用いられる嵩高い置換基としては、線状分子から環状分子が抜け落ちるのを防止できればどのような基であってもよいが、例えば１以上のベンゼン環を有する基、１以上の第三ブチルを有する基、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）、又はＭＰＣとＢＭＡとの組み合わせが好ましい。１以上のベンゼン環を有する基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フレオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジルエステル（ＯＢｚ）基等が挙げられ、また、１以上の第三ブチルを有する基としては、第三ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）基、アミノ酸第三ブチルエステル（ＯＢｕ基）等が挙げられる。上記のうち、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが特に好ましい。 The bulky substituent used in the present invention may be any group as long as the cyclic molecule can be prevented from falling off from the linear molecule, for example, a group having one or more benzene rings, and one or more third groups. A group having butyl, MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine), BMA (n-butyl methacrylate), or a combination of MPC and BMA is preferred. Examples of the group having one or more benzene rings include a benzyloxycarbonyl (Z) group, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, a benzyl ester (OBz) group, and the like. Examples of the group having tributyl include a tertiary butylcarbonyl (Boc) group and an amino acid tertiary butyl ester (OBu group). Among the above, a combination of MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and BMA (n-butyl methacrylate) is particularly preferable.
本発明において、ポリロタキサンブロック共重合体のブロック分子として、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせが用いられる場合、ＢＭＡモル分率は０．２〜０．５でよく、好ましくは０．３〜０．４である。ここで、モル分率とは、ＭＰＣとＢＭＡ（ＰＢＭ）の総重合度を１にした際の、それぞれのモノマーの重合度の割合を指す。 In the present invention, when a combination of MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and BMA (n-butyl methacrylate) is used as a block molecule of the polyrotaxane block copolymer, the BMA molar fraction is 0.2 to 0.00. 5 may be sufficient, Preferably it is 0.3-0.4. Here, the molar fraction refers to the ratio of the polymerization degree of each monomer when the total polymerization degree of MPC and BMA (PBM) is 1.
本発明のポリロタキサンとしては、上記線状分子がポリエチレングリコール、上記環状分子がα−シクロデキストリン、上記嵩高い置換基を有する部分がＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）との組み合わせであることが特に好ましい。この場合、ＰＥＧの分子量は約２００００であり、ＰＥＧ１分子に含まれるシクロデキストリンの数はおよそ１２個、例えば、９〜１５個でありうる。図１には、ＲＡＦＴ重合によるポリロタキサン・ブロック共重合体の合成の概略が模式的に示されている。 As the polyrotaxane of the present invention, the linear molecule is polyethylene glycol, the cyclic molecule is α-cyclodextrin, and the portion having the bulky substituent is MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and BMA (n-butyl methacrylate). It is particularly preferable to use a combination. In this case, the molecular weight of PEG is about 20000, and the number of cyclodextrins contained in one PEG molecule can be about 12, for example, 9-15. FIG. 1 schematically shows an outline of synthesis of a polyrotaxane block copolymer by RAFT polymerization.
ＰＲＸブロック共重合体
ＰＲＸ部分の調製には、使用する環状分子であるシクロデキストリン（ＣＤ）の大きさと線状高分子鎖の断面の立体的相補性が必要であり、たとえば最も環サイズの小さなα−ＣＤではＰＥＧ、次に大きなβ−ＣＤではポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）やその共重合体などが用いられる（シクロデキストリンの空孔の内径はα体で０．４５〜０．６ｎｍ、β体で０．６〜０．８ｎｍ、γ体で０．８〜０．９５ｎｍ程度）。また、化学量論的にはα−ＣＤはＰＥＧの繰り返し単位であるＥＧの２ユニットを包接可能であることから、環状分子の数には、使用する線状高分子の分子量によって上限がある。例えば、実施例１の方法で合成した場合には、ＣＤの貫通率は概ね数〜６０％程度である。分子運動性が高いＰＲＸブロック共重合体は好ましくは、分子量２００００のＰＥＧ１分子あたり４〜５０個のα−ＣＤ分子を含み、より好ましくは８〜３０個のα−ＣＤ分子を含み、さらにより好ましくは１０〜２０個のα−ＣＤ分子を含む。
Preparation of the PRX block copolymer PRX part requires the steric complementarity of the cyclodextrin (CD), which is the cyclic molecule used, and the cross section of the linear polymer chain. PEG is used for CD, and polypropylene glycol (PPG) or a copolymer thereof is used for the next largest β-CD (the internal diameter of cyclodextrin pores is 0.45-0.6 nm for α-form and 0 for β-form. .6 to 0.8 nm, about 0.8 to 0.95 nm for γ-form). Stoichiometrically, α-CD can include 2 units of EG, which is a repeating unit of PEG, so the number of cyclic molecules has an upper limit depending on the molecular weight of the linear polymer used. . For example, when synthesized by the method of Example 1, the penetration rate of CD is approximately several to 60%. The high molecular mobility PRX block copolymer preferably comprises 4-50 α-CD molecules, more preferably 8-30 α-CD molecules, even more preferably, per PEG molecule having a molecular weight of 20000. Contains 10-20 α-CD molecules.
ＰＲＸとブロック共重合体を形成するために導入する連鎖は、重合反応可能なモノマーであれば何でも利用可能であるが、例えば、既存の材料への固定化、生体成分への影響を最小にすることを目的としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）とＢＭＡ（ｎ−ブチルメタクリレート）とのランダム共重合体を導入することができる。生体適合性を目指したＭＰＣとＢＭＡの組成については以前に検討され、ＢＭＡモル分率０．３が最も優れた生体適合性を示すことが明らかになっているが、例えば、既存の材料への固定化を目的としつつ生体成分への影響を極小にする観点からＢＭＡモル分率０．４を目安として合成することもできる。 The chain introduced to form a block copolymer with PRX can be any monomer that can undergo a polymerization reaction, but for example, it can be immobilized on an existing material and the influence on biological components is minimized. For this purpose, a random copolymer of MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and BMA (n-butyl methacrylate) can be introduced. The composition of MPC and BMA aimed at biocompatibility has been studied previously and it has been shown that a BMA molar fraction of 0.3 shows the best biocompatibility. From the viewpoint of minimizing the influence on biological components while aiming at immobilization, the BMA molar fraction of 0.4 can also be used as a guide.
本発明に係るＣＤはメトキシ修飾されていることが好ましい。ＰＲＸのメトキシ修飾（ＯＭｅ化）は元々水溶性付与を目的としており、ＣＤ未修飾のＰＲＸでは水溶性が乏しいので生体環境下でのＣＤ運動性が期待できない。ＯＭｅ化の程度は数〜９０％以上まで広範囲にわたる。シクロデキストリンにメトキシ基を導入する場合、導入率（導入されたメトキシ基の数／シクロデキストリンの数）は５０％以上が好ましく、６０％以上、７０％以上もしくは８０％以上であってもよいが、９０％以上がより好ましい。範囲としては、導入率は５０〜１００％が好ましく、６０〜１００％、７０〜１００％もしくは８０〜１００％であってもよいが、９０〜１００％がより好ましい。 The CD according to the present invention is preferably methoxy-modified. The methoxy modification (OMe) of PRX is originally intended to impart water solubility, and CD non-modified PRX is poor in water solubility, so CD motility in a living environment cannot be expected. The degree of OMe conversion ranges from a few to over 90%. When a methoxy group is introduced into cyclodextrin, the introduction rate (number of introduced methoxy groups / number of cyclodextrins) is preferably 50% or more, and may be 60% or more, 70% or more, or 80% or more. 90% or more is more preferable. As a range, the introduction rate is preferably 50 to 100%, and may be 60 to 100%, 70 to 100%, or 80 to 100%, but 90 to 100% is more preferable.
ＰＲＸ中のシクロデキストリンなどの環状分子は、メトキシの他にも、メチル、ヒドロキシプロピル、モノアセチル等の修飾基を含んでいてもよく、また、ＲＧＤモチーフを含むペプチド等のペプチドにより修飾されていてもよい。さらに、シクロデキストリンには、コラーゲンなどのタンパク質が結合されていてもよい。 In addition to methoxy, cyclic molecules such as cyclodextrin in PRX may contain a modifying group such as methyl, hydroxypropyl, or monoacetyl, and are modified with a peptide such as a peptide containing an RGD motif. Also good. Furthermore, proteins such as collagen may be bound to the cyclodextrin.
細胞応答に最も影響力があるＣＤ運動性については、ＱＣＭ−Ｄ（Quartz Crystal Microbalance-Dissipation）測定によって得られるＰＲＸ共重合体の水中でのエネルギー散逸量をコーティング質量に相当する周波数変化で標準化した数値（Ｍｆ）を水和分子運動性の尺度として用いることができる。高分子をキャストした際の質量増加による共振周波数変化（△ｆ）に対する空気−水の環境変化時のエネルギー散逸量変化（△Ｄ）の割合が、水中での分子運動性因子（△Ｄ／△ｆ＝Ｍｆ）と定義されている（Inoue Y, Ye L, Ishihara K, Yui N: Preparation and surface properties of polyrotaxane-containing tri-block copolymers as a design for dynamic biomaterials surfaces. Colloid Surf. B: Biointerface 2012, 89: 223-227）。Ｍｆは汎用高分子では疎水性から親水性になるにつれて０．１〜０．２程度の値を示すが、ＰＲＸブロック共重合体ではＣＤ数を調整することによって親水性を保持したまま０．１〜１．０程度まで広範囲に変化させることができる。分子運動性が高いＰＲＸブロック共重合体のＭｆは好ましくは０．１以上であり、より好ましくは０．２以上であり、さらにより好ましくは０．３以上である。範囲としては、Ｍｆは好ましくは０．１〜１．０であり、より好ましくは０．２〜１．０であり、さらにより好ましくは０．３〜１．０である。 For the CD motility that has the most influence on the cell response, the amount of energy dissipation in water of the PRX copolymer obtained by QCM-D (Quartz Crystal Microbalance-Dissipation) measurement was standardized by the frequency change corresponding to the coating mass. The numerical value (Mf) can be used as a measure of hydration molecular mobility. The ratio of the change in energy dissipation (ΔD) when the air-water environment changes to the change in resonance frequency (Δf) due to mass increase when the polymer is cast is the molecular mobility factor in water (ΔD / Δ f = Mf) (Inoue Y, Ye L, Ishihara K, Yui N: Preparation and surface properties of polyrotaxane-containing tri-block copolymers as a design for dynamic biomaterials surfaces. Colloid Surf. B: Biointerface 2012, 89: 223-227). Mf shows a value of about 0.1 to 0.2 as the polymer becomes hydrophobic from the hydrophobicity to the general purpose polymer. However, in the PRX block copolymer, 0.1% is maintained while maintaining the hydrophilicity by adjusting the CD number. It can be changed over a wide range up to about 1.0. The Mf of the PRX block copolymer having a high molecular mobility is preferably 0.1 or more, more preferably 0.2 or more, and still more preferably 0.3 or more. As a range, Mf is preferably 0.1 to 1.0, more preferably 0.2 to 1.0, and still more preferably 0.3 to 1.0.
幹細胞
本発明において利用可能な多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）またはｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、特に、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、***線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、もしくは心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞が挙げられる。また、ＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞も用いられうる。本発明において好ましく利用可能な多能性幹細胞は、霊長類または齧歯類の細胞であり、より具体的にはヒト、マウス、またはラットの細胞のいずれかである。あるいは、ブタ、ウサギ、サルの多能性幹細胞も使用されうる。
Stem cells As pluripotent stem cells that can be used in the present invention, ES cells (embryonic stem cells) or iPS cells (artificial pluripotent stem cells), particularly skin fibroblast-derived iPS cells, fetal lung cell-derived iPS cells, foreskin Examples include fibroblast-derived iPS cells or cardiac fibroblast-derived iPS cells. Also, GS cells (pluripotent germ stem cells), fusion cells of ES cells and somatic cells can be used. The pluripotent stem cells that can be preferably used in the present invention are primate or rodent cells, and more specifically human, mouse, or rat cells. Alternatively, porcine, rabbit, monkey pluripotent stem cells can also be used.
ｉＰＳ細胞であるヒト皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、ヒト胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、ヒト***線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、ヒト心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞は、例えば、理研バイオリソースセンターおよびＡＴＣＣ社、ＪＣＲＢ細胞バンクより入手可能である。ヒトｉＰＳＣ株は、２５３Ｇ１、ＩＭＲ９０−１、ＩＭＲ９０−４などが利用可能である。ＥＳ細胞であるヒト胚性幹細胞は、例えば、理研バイオリソースセンターより入手可能である。ヒトＥＳＣ株としては、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−３、Ｈ１、Ｈ９などが利用可能である。 Human skin fibroblast-derived iPS cells, human fetal lung cell-derived iPS cells, human foreskin fibroblast-derived iPS cells, and human cardiac fibroblast-derived iPS cells, which are iPS cells, are, for example, RIKEN BioResource Center and ATCC, JCRB Available from cell banks. As human iPSC strains, 253G1, IMR90-1, IMR90-4 and the like can be used. Human embryonic stem cells that are ES cells are available from, for example, the RIKEN BioResource Center. Examples of human ESC strains that can be used include KhES-1, KhES-3, H1, and H9.
培養培地
未分化維持用の培養培地としては、例えば、Primate ES Cell Medium＋4 ng/ml human basic FGF（ReproCELL社）およびhuman ES medium（ReproCell社）、Pluripotent Stem Cell SFM XF/FF（ATCC社）、DMEM/HamF12(2mM L-Glutamine)＋20%KSR+0.1mM NEAA＋0.1mM 2-Mercaptoethanol＋5ng/ml human bFGF等を利用することができる。また、mTeSR1（StemCell Technologies社）、TeSR2（StemCell Technologies社）、StemPro hESC SFM（Invitrogen社）、hESF-GRO（株式会社細胞科学研究所）等も挙げられる。本願の実施例においては、未分化培地として、Gibco社製ＤＭＥＭ、EQUITECH-BIO社製牛血清１５％、Gibco社製２−メルカプトエタノール０．１ｍＭ、Gibco社製ＮＥＡＡ ０．１ｍＭ、Millipore社製ＬＩＦ ０．１％の混合培地が用いられている。さらに、以下の文献に記載の培地も利用されうる：
(1) Liu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346:131-139, 2006.
(2) Vallier, L. et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005.
(3) Li, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 91:688-698, 2005.
(4) Yao, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6907-6912, 2006.
(5) Lu, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:5688-5693, 2006.
The culture medium for culture media undifferentiated maintained, for example, Primate ES Cell Medium + 4 ng / ml human basic FGF (ReproCELL Co.) and human ES medium (ReproCell Co.), Pluripotent Stem Cell SFM XF / FF (ATCC Corp.), DMEM / HamF12 (2 mM L-Glutamine) + 20% KSR + 0.1 mM NEAA + 0.1 mM 2-Mercaptoethanol + 5 ng / ml human bFGF can be used. Examples also include mTeSR1 (StemCell Technologies), TeSR2 (StemCell Technologies), StemPro hESC SFM (Invitrogen), hESF-GRO (Cell Science Laboratory). In the examples of the present application, Gibco's DMEM, EQUITECH-BIO's bovine serum 15%, Gibco's 2-mercaptoethanol 0.1 mM, Gibco's NEAA 0.1 mM, Millipore's LIF are used as undifferentiated media. A 0.1% mixed medium is used. In addition, the media described in the following literature can also be used:
(1) Liu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346: 131-139, 2006.
(2) Vallier, L. et al., J. Cell Sci. 118: 4495-4509, 2005.
(3) Li, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 91: 688-698, 2005.
(4) Yao, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 6907-6912, 2006.
(5) Lu, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 5688-5693, 2006.
心筋分化用の培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（例えば、２０％ ＦＢＳ（Gibco）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Sigma）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Sigma）、０．００１％ ２−メルカプトエタノール（GIBCO）、および０．００５Ｎ ＮａＯＨ、並びに１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（R&D Systems）含有、あるいは、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Sigma）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Sigma）、０．５ｍＭ Ｌ−カルニチン（Sigma）、０．００１％ ２−メルカプトエタノール（GIBCO）、および１−２％ウシ血清アルブミン（Wako）、または０．４％ヒト血清アルブミン（Sigma）、並びに５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Axon）および２μＭ ＢＩＯ（Calbiochem）含有）、ＤＭＥＭを基本とした心筋分化培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution（Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール）、またはStemPro-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）のような培地が例示される。本願の実施例においては、分化誘導培地として、GIBCO社製αＭＥＭと０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％牛血清の混合培地が使用されている。 As a medium for myocardial differentiation, for example, myocardial differentiation medium based on IMDM medium (for example, 20% FBS (Gibco), 1% MEM non-essential amino acid solution (Sigma), 1% penicillin-streptomycin (GIBCO), 2 mM Contains L-glutamine (Sigma), 0.001% 2-mercaptoethanol (GIBCO), and 0.005N NaOH, and 10 ng / ml BMP4 (R & D Systems), or 1% MEM non-essential amino acid solution (Sigma), 1 % Penicillin-streptomycin (GIBCO), 2 mM L-glutamine (Sigma), 0.5 mM L-carnitine (Sigma), 0.001% 2-mercaptoethanol (GIBCO), and 1-2% bovine serum albumin (Wako), Or 0.4% human serum albumin (Sigma), and 5 μM CHIR99021 (Axon) and μM BIO (containing Calbiochem), DMEM-based myocardial differentiation medium (for example, DMEM / F12 medium (Sigma) 200 ml, fetal calf serum (GIBCO) 50 ml, MEM non-essential amino acid solution (Sigma) 2.5 ml), Examples of the medium include penicillin-streptomycin (GIBCO) 2.5 ml, 200 mM L-glutamine 2.5 ml, 2-mercaptoethanol), or StemPro-34SFM (GIBCO) + BMP4 (10 ng / ml). In the examples of the present application, a mixed medium of αMEM manufactured by GIBCO and 0.05 mM 2-mercaptoethanol and 10% bovine serum is used as the differentiation induction medium.
培養器
本発明は、一つの態様において、多能性幹細胞の未分化維持培養用の培養器を提供し、また、別の態様において、多能性幹細胞の心筋細胞分化促進用の培養器を提供する。培養器の素材としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネートなどのプラスチック素材やガラス素材が利用可能であるが、これらに限定されない。近年では、アクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）なども開発されている。形状においても、コンタミネーションやクロスコンタミネーションを引き起こさず、底面積の大きな容器形状であればよく、限定的な形状はない。これまでには、薄い円柱構造の培養皿や立方体様構造の培養フラスコなどが主に使用されている。また、メンブレンの形状に加工したセルカルチャーインサートなども使用されており、その形状は限定的ではない。培養器としては、例えば、２７φの直径を持つガラスボトムディシュ（IWAKI社製）等を利用できる。
In another aspect, the present invention provides an incubator for undifferentiated maintenance culture of pluripotent stem cells, and in another aspect, an incubator for promoting cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells. To do. As a material of the incubator, plastic materials such as polystyrene, polypropylene, polyethylene, polyolefin, polycarbonate, and glass materials can be used, but are not limited thereto. In recent years, acrylic block copolymers (BCF) and the like have also been developed. Also in the shape, there is no limited shape as long as the container shape has a large bottom area without causing contamination or cross-contamination. So far, a thin columnar culture dish or a cube-like culture flask has been mainly used. In addition, cell culture inserts processed into a membrane shape are also used, and the shape is not limited. As the incubator, for example, a glass bottom dish (manufactured by IWAKI) having a diameter of 27φ can be used.
コーティング方法
培養器へのポリロタキサンのコーティングは、例えば、ポリマー溶液（例えば、０．０５ｗｔ％、蒸留水：エタノール＝１：１混合溶媒）をキャストし、一晩程度乾燥させることで行うことができる。そのほかにもポリマー溶液に板状の表面を浸漬させ、クリーンベンチ内でフリースタンディングさせ乾燥させるディップコーティングや、スピンコーティング法によるコーティングも可能である。ポリロタキサンをコーティングした培養器は、多能性幹細胞の未分化維持培養用の培養器として、また、多能性幹細胞の心筋細胞分化促進用の培養器として使用できる。
Coating Method The polyrotaxane can be coated on the incubator by, for example, casting a polymer solution (for example, 0.05 wt%, distilled water: ethanol = 1: 1 mixed solvent) and drying it overnight. In addition, dip coating in which a plate-like surface is immersed in a polymer solution, free standing in a clean bench and dried, or coating by spin coating is also possible. The culture vessel coated with polyrotaxane can be used as a culture vessel for undifferentiated maintenance culture of pluripotent stem cells and a culture vessel for promoting cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells.
キット
本発明に係るキットは、細胞培養用のキットであって、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器と、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地あるいは多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地を含む。本発明に係るキットに含まれる多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地あるいは多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地としては、例示的に本明細書中に記載のものが挙げられるが、それらに限定はされない。培養培地の形態は、液体、固体、ゲル、粉末など任意のものでよく、解凍して、あるいは水に溶解して用いるものでもよい。培養培地は、１つの容器に全ての成分が含まれていても、成分ごとに複数の容器に分けられていてもよく、キットに含まれる培養培地の種類、数等に制限はない。また、培地は任意のサプリメントを加えて用いるものであってもよい。さらに、本発明に係るキットには、培養器と培地に加えて、取扱説明書や他の付属品が含まれていてもよい。
The kit according to the present invention is a kit for cell culture, comprising a culture vessel having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer, and a cell culture medium for maintaining the undifferentiated nature of pluripotent stem cells or A cell culture medium for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes is included. As a cell culture medium for maintaining the undifferentiation of pluripotent stem cells contained in the kit according to the present invention or a cell culture medium for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes, Although what is described in a specification is mentioned, it is not limited to them. The culture medium may be in any form such as liquid, solid, gel, powder, etc., and may be thawed or dissolved in water. The culture medium may contain all the components in one container, or may be divided into a plurality of containers for each component, and there is no limitation on the type, number, etc. of the culture medium included in the kit. Further, the medium may be used after adding any supplement. Further, the kit according to the present invention may include an instruction manual and other accessories in addition to the incubator and the culture medium.
培養培地を含むＰＲＸ表面被覆培養器
本発明の一つの態様により、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地あるいは多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための細胞培養培地を含む、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器が提供される。この培養器は、本発明に係るキットに含まれる培養器に、本発明に係るキットに含まれる培地を加えることでも作製されうる。この培養器に所望の細胞を播種して、培養に用いることができる。すなわち、この培養器中の細胞培養培地には、培養する細胞が含まれていてもよい。
PRX surface-coated incubator containing culture medium Cell culture medium for maintaining undifferentiated pluripotent stem cells or cells for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes according to one embodiment of the present invention An incubator having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer comprising a culture medium is provided. This incubator can also be produced by adding the medium contained in the kit according to the present invention to the incubator included in the kit according to the present invention. Desired cells can be seeded in this incubator and used for culture. That is, the cell culture medium in this incubator may contain cells to be cultured.
細胞の培養
細胞の培養条件としては、細胞を維持または増幅し得る方法である限り特に制限されないが、培養温度として、例えば３０〜４０℃の範囲内、好ましくは３６〜３８℃の範囲内、より好ましくは３７℃を好適に例示することができる。また、細胞をより好適に維持または増幅する観点から、培地交換や継代を適当な時期に行うことが好ましい。培地交換の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に制限されないが、例えば１〜５日間経過毎、好ましくは３日間経過毎とすることができる。継代の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に制限されず、細胞の集団が大きくなってきたタイミングで適宜行うことができ、例えば、４〜１２日間経過毎、好ましくは６〜１０日間経過毎とすることができる。
Cell culture conditions are not particularly limited as long as the cells can be maintained or amplified, but the culture temperature is, for example, in the range of 30 to 40 ° C, preferably in the range of 36 to 38 ° C. Preferably 37 degreeC can be illustrated suitably. In addition, from the viewpoint of more suitably maintaining or amplifying the cells, it is preferable to perform medium exchange or passage at an appropriate time. The frequency of medium exchange is not particularly limited as long as the cells can be maintained or amplified, but may be, for example, every 1 to 5 days, preferably every 3 days. The frequency of passage is not particularly limited as long as the cells can be maintained or amplified, and can be appropriately performed at the timing when the population of cells becomes large. For example, every 4 to 12 days, preferably 6 to 10 It can be every day.
本発明に係る培養器上で培養した多能性幹細胞は、分化誘導を行って各種組織、細胞に分化させてもよい。例えば、多能性幹細胞は、中枢神経および感覚系の細胞、角膜、網膜、神経幹細胞、心筋細胞、インシュリン産生細胞、肝細胞、骨、軟骨、造血幹細胞、筋肉、血管、または腎臓の細胞などへと分化させることができる。特に、多能性幹細胞から心筋細胞への分化は、本発明に従って、ポリロタキサンをコーティングした培養器上での培養により、効率よく行うことができる。 Pluripotent stem cells cultured on the incubator according to the present invention may be induced to differentiate into various tissues and cells. For example, pluripotent stem cells can be sent to cells of the central and sensory systems, cornea, retina, neural stem cells, cardiomyocytes, insulin-producing cells, hepatocytes, bone, cartilage, hematopoietic stem cells, muscle, blood vessels, or kidney cells And can be differentiated. In particular, differentiation from pluripotent stem cells to cardiomyocytes can be efficiently carried out by culturing on a culture vessel coated with polyrotaxane according to the present invention.
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
実施例１：ＰＲＸブロック共重合体の合成
Ａ．ＰＥＧマクロＣＴＡ（4-(benzodithioyl)-4-cyanopentanoic acid）の調製
ＰＥＧ（分子量２００００，１ｇ，０．０５ｍｍｏｌ）とジヂメチルアミノピリジン（０．００１８ｇ，０．１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、ＣＴＡ（０．１４ｇ，０．５ｍｍｏｌ）と水溶性カルボジイミド（０．０８２ｇ，０．５ｍｍｏｌ）を加えて１２時間撹拌した。更にジクロロメタンを加えて、冷ジエチルエーテル中で沈殿させて回収した。得られた粗生成物を水に溶解して透析し凍結乾燥した。
Example 1: Synthesis of PRX block copolymer Preparation of PEG macro CTA (4- (benzodithioyl) -4-cyanopentanoic acid) Dissolve PEG (molecular weight 20000, 1 g, 0.05 mmol) and dimethylaminopyridine (0.0018 g, 0.15 mmol) in dichloromethane (5 mL). CTA (0.14 g, 0.5 mmol) and water-soluble carbodiimide (0.082 g, 0.5 mmol) were added and stirred for 12 hours. Further dichloromethane was added and recovered by precipitation in cold diethyl ether. The obtained crude product was dissolved in water, dialyzed and lyophilized.
Ｂ．ＣＤ包接錯体（擬ＰＲＸ）の調製
得られたＰＥＧマクロＣＴＡ（０．３５ｇ）をα−ＣＤ（３．５ｇ）水溶液（２５ｍｌ）に常温で加えて、生じた沈殿物を遠心分離で回収し、水（２５ｍＬ）を加えて再度遠心分離した上で凍結乾燥した。
B. Preparation of CD inclusion complex (pseudo-PRX) The obtained PEG macro CTA (0.35 g) was added to an α-CD (3.5 g) aqueous solution (25 ml) at room temperature, and the resulting precipitate was collected by centrifugation. Water (25 mL) was added, and the mixture was centrifuged again and lyophilized.
Ｃ．ＰＲＸブロック共重合体の合成
ＣＤ包接錯体（０．６ｇ）をＭＰＣ（０．３５４ｇ，１．２ｍｍｏｌ）およびＢＭＡ（０．６３３ｇ，４．４５ｍｍｏｌ）とエタノール／トルエン（１／１）混合溶媒中でＡＩＢＮ（０．８２ｍｇ，５μｍｏｌ）を開始剤としてアルゴン雰囲気下で１５分間反応させ、更に６０℃で２４時間反応させた。溶媒１５ｍＬを加えて、生じた沈殿物を遠心分離で回収した。粗成物を引き続きエタノール、アセトン、ジメチルスルフォキシドで洗浄して未反応モノマーおよびＣＤを除去した。得られた沈殿物を更に４０℃で真空乾燥して最終生成物とした。
C. Synthesis of PRX block copolymer CD inclusion complex (0.6 g) in MPC (0.354 g, 1.2 mmol) and BMA (0.633 g, 4.45 mmol) and ethanol / toluene (1/1) mixed solvent Then, AIBN (0.82 mg, 5 μmol) was reacted as an initiator in an argon atmosphere for 15 minutes, and further reacted at 60 ° C. for 24 hours. 15 mL of solvent was added, and the resulting precipitate was collected by centrifugation. The crude product was subsequently washed with ethanol, acetone, dimethyl sulfoxide to remove unreacted monomer and CD. The resulting precipitate was further vacuum dried at 40 ° C. to obtain the final product.
Ｄ．ＯＭｅ−ＰＲＸブロック共重合体の合成（ＰＲＸブロック共重合体のＯＭｅ化）
合成したＰＲＸブロック共重合体（２００ｍｇ）を脱水ジメチルスルフォキシド（７ｍＬ）に溶解し、水素化ナトリウム（０．１５５ｇ，６．３ｍｍｏｌ）を加えてアルゴン雰囲気下室温で３０分間反応させた。次にヨードメタン（０．１０２ｇ，０．７１９ｍｍｏｌ）を徐々に加えて室温で３時間反応させた。ｐＨを中性にしてから反応溶液を３日間透析し、凍結乾燥して目的物を得た。
D. Synthesis of OMe-PRX block copolymer (OMe conversion of PRX block copolymer)
The synthesized PRX block copolymer (200 mg) was dissolved in dehydrated dimethyl sulfoxide (7 mL), sodium hydride (0.155 g, 6.3 mmol) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes in an argon atmosphere. Next, iodomethane (0.102 g, 0.719 mmol) was gradually added and reacted at room temperature for 3 hours. After neutralizing the pH, the reaction solution was dialyzed for 3 days and freeze-dried to obtain the desired product.
Ｅ．ランダム共重合体（対照）の合成
ＰＲＸブロック共重合体と同様なＯＭｅおよびＯＨ基を有するランダム共重合体は、ＢＭＡ（０．６３３ｇ，４．４５ｍｍｏｌ）、ＭＰＣ（０．３５４ｇ，１．２ｍｍｏｌ）、ＨＥＭＡ（０．６３７ｇ，４．９ｍｍｏｌ）、ＭＥＡ（１．１０６ｇ，８．５１ｍｍｏｌ）をトルエン／エタノール混合溶媒（１／１）（８ｍＬ）中でＡＩＢＮ（０．４ｍｇ）を開始剤としてアルゴン雰囲気下６０℃で２４時間反応させて合成した。反応溶液は冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、水中で２日間透析してから凍結乾燥して目的物を得た。
E. Synthesis of Random Copolymer (Control) A random copolymer having OMe and OH groups similar to the PRX block copolymer is BMA (0.633 g, 4.45 mmol), MPC (0.354 g, 1.2 mmol). , HEMA (0.637 g, 4.9 mmol), MEA (1.16 g, 8.51 mmol) in toluene / ethanol mixed solvent (1/1) (8 mL) with AIBN (0.4 mg) as an initiator in an argon atmosphere The reaction was carried out at 60 ° C. for 24 hours under synthesis. The reaction solution was precipitated in cold diethyl ether, dialyzed in water for 2 days, and lyophilized to obtain the desired product.
実施例２：ＰＲＸ処理器材での人工多機能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の未分化特性評価
２７φの直径を持つガラスボトムディシュ（IWAKI社製）に、１５０μＬのポリマー溶液（０．０５ｗｔ％、蒸留水：エタノール＝１：１混合溶媒）をキャストし、一晩クリーンベンチで乾燥させた。用いたポリマーはＰＲＸ−Ａ（分子運動性が最も高いＰＲＸブロック共重合体であり、分子量２００００のＰＥＧ１分子あたりのα−ＣＤ貫通数１２、α−ＣＤへのメトキシ基導入率９０％のもの）、ＰＲＸ−Ｂ（分子運動性が低いＰＲＸブロック共重合体であり、α−ＣＤ貫通数１０４、α−ＣＤへのメトキシ基導入率６１％のもの）、そしてＲａｎｄｏｍ（非ＰＲＸ構造の汎用性メタクリレートポリマーであり、メトキシ基導入率１１ｍｏｌ％であってＰＲＸ−２と同様なメトキシ基を有するもの）の３種類である。比較対象として、未修飾のガラスボトムディシュ及び未分化維持のためのフィーダー細胞であるＳＮＬ（European Collection of Cell Cultures社製）をサンプル群に加えて実験を行った。マウス由来のｉＰＳ細胞（iPS-MEF-Ng-178B-5、京都大学ｉＰＳ細胞研究所ＣｉＲＡ樹立）を３．０ｘ１０４細胞／ｍＬ濃度で未分化培地（Gibco社製ＤＭＥＭ、EQUITECH-BIO社製牛血清１５％、Gibco社製２−メルカプトエタノール０．１ｍＭ、Gibco社製ＮＥＡＡ ０．１ｍＭ、Millipore社製ＬＩＦ ０．１％の混合培地）に分散させ、それぞれ１ｍＬずつサンプルディシュに播種した。播種後毎日培地交換を行いながら８日間接着の様子を観察した。なお、ウェスタンブロットによる未分化マーカータンパク質（Ｏｃｔ−４）の発現解析は以下の手順で行った。まず未分化培地で培養したｉＰＳ細胞（８日間）のトータルタンパク質をInvent Biotechnology社製Minute Detergent-Free protein extraction kitを用いて抽出した。その後、Pierce社製Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡキットを用いて抽出タンパク質濃度を定量した。用いた検量線は濃度既知のウシ血清アルブミン（Pierce社製Standard）溶液で作製した。抽出タンパク質溶液は９００μｇ／ｍＬの濃度に調整し、１０μＬのタンパク質溶液を１０μＬのLamiel Buffer（BioRad社製）と混合し、それぞれ１０〜２０％アクリルアミドグラディエントゲル（BioRad社製）中２００Ｖで３０分間電気泳動させた。その後Biorad社製Turbo Blotting Systemを用いて、泳動ゲルのタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。その後、Wako製スキムミルク（５％）で１時間ブロッキングを行い、抗Ｏｃｔ４抗体（ウサギ由来、Cell Signaling Technology社製）及び抗アクチン抗体（ウサギ由来、Sigma-Aldrich社製）を希釈した１％スキムミルク溶液と常温で１時間半反応させた。その後ＰＢＳで３回洗浄を行い、Cell Signaling Technology社製ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧを希釈した１％スキムミルク溶液と常温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄を行い、GE Healthcare社製Blotting Substrateで処理した後、GE Healthcare社製ImageQuant LAS500システムにて撮影を行った。
Example 2: Evaluation of undifferentiated characteristics of artificial multifunctional stem cells (iPS cells) using PRX treatment equipment In a glass bottom dish (manufactured by IWAKI) having a diameter of 27φ, 150 μL of a polymer solution (0.05 wt%, distilled water) : Ethanol = 1: 1 mixed solvent), and dried overnight on a clean bench. The polymer used was PRX-A (a PRX block copolymer having the highest molecular mobility, 12 α-CD penetrations per PEG molecule having a molecular weight of 20000, and 90% introduction rate of methoxy group into α-CD). , PRX-B (PRX block copolymer with low molecular mobility, α-CD penetration number 104, methoxy group introduction rate 61% to α-CD), and Random (universal methacrylate with non-PRX structure) Polymers having a methoxy group introduction rate of 11 mol% and having the same methoxy group as PRX-2). For comparison, an unmodified glass bottom dish and SNL (manufactured by European Collection of Cell Cultures), which is a feeder cell for maintaining undifferentiation, were added to the sample group for experiments. Mouse-derived iPS cells (iPS-MEF-Ng-178B-5, Kyoto University iPS Cell Research Institute CiRA establishment) at a concentration of 3.0 × 10 4 cells / mL, undifferentiated medium (Dib manufactured by Gibco, cattle manufactured by EQUITECH-BIO) The mixture was dispersed in serum 15%, Gibco 2-mercaptoethanol 0.1 mM, Gibco NEAA 0.1 mM, Millipore LIF 0.1% mixed medium), and each 1 mL was seeded on a sample dish. The state of adhesion was observed for 8 days while changing the medium every day after seeding. The expression analysis of undifferentiated marker protein (Oct-4) by Western blot was performed according to the following procedure. First, the total protein of iPS cells (8 days) cultured in an undifferentiated medium was extracted using Minute Detergent-Free protein extraction kit manufactured by Invent Biotechnology. Thereafter, the extracted protein concentration was quantified using a Micro-BCA kit manufactured by Pierce. The calibration curve used was prepared from a bovine serum albumin (Pierce Standard) solution with a known concentration. The extracted protein solution was adjusted to a concentration of 900 μg / mL, 10 μL of the protein solution was mixed with 10 μL of Lamiel Buffer (manufactured by BioRad), and each was electrically charged at 200 V in a 10-20% acrylamide gradient gel (manufactured by BioRad) for 30 minutes. Electrophoresed. Thereafter, the protein on the electrophoresis gel was transferred to a PVDF membrane using a Turbo Blotting System manufactured by Biorad. Thereafter, blocking was performed with skim milk (5%) manufactured by Wako for 1 hour, and a 1% skim milk solution diluted with anti-Oct4 antibody (derived from rabbit, Cell Signaling Technology) and anti-actin antibody (derived from rabbit, manufactured by Sigma-Aldrich) was diluted. For 1 hour and a half at room temperature. Thereafter, the plate was washed three times with PBS, and reacted with a 1% skim milk solution diluted with Cell Signaling Technology HRP-labeled anti-rabbit IgG for 1 hour at room temperature. After washing with PBS three times and processing with GE Healthcare Blotting Substrate, the images were taken with an ImageQuant LAS500 system manufactured by GE Healthcare.
図２はｉＰＳ細胞の播種後８日目の様子を示す。全ての表面で播種したｉＰＳ細胞は安定に接着し、ほぼコンフルエントに増殖していることが確かめられた。なお定量結果でも、殆どの表面で同じレベルの細胞接着数が見られ（３次元に増殖するフィーダー細胞上での接着数を除く）、構築したＰＲＸ表面はｉＰＳ細胞の接着及び増殖にも十分効果的であることが示された。なお、ＧＦＰ−Ｎａｎｏｇの蛍光発現を観察したところ、フィーダー細胞であるＳＮＬ表面にて培養されたｉＰＳ細胞で最も強いＮａｎｏｇの発現が見られた。未処理のガラス表面、無可動のＲａｎｄｏｍ表面、ゼラチン表面では弱いＮａｎｏｇの発現が見られ、未分化能が大きく低下していることが確認された。しかし高い分子運動性を有するＰＲＸ−Ａ表面ではやや強いＮａｎｏｇの発現が見られ、胚様細胞塊の形態も、より維持されていることが確認された。このことは、高い分子運動性表面に接着したｉＰＳ細胞の場合、材料表面との相互作用が弱く細胞−細胞間相互作用が強くなっているためと考えられ、高い分子運動性を有するＰＲＸ表面が未分化特性を維持する上で効果的であることを示している。 FIG. 2 shows a state 8 days after seeding of iPS cells. It was confirmed that iPS cells seeded on all surfaces adhered stably and proliferated almost confluently. Even in the quantitative results, the same level of cell adhesion was found on most surfaces (excluding the number of adhesions on feeder cells that grow three-dimensionally), and the constructed PRX surface was also sufficiently effective for iPS cell adhesion and proliferation. It was shown that In addition, when the fluorescence expression of GFP-Nanog was observed, the strongest Nanog expression was seen in the iPS cell cultured on the SNL surface which is a feeder cell. Weak Nanog expression was observed on the untreated glass surface, the non-movable Random surface, and the gelatin surface, and it was confirmed that the undifferentiated ability was greatly reduced. However, a slightly strong Nanog expression was observed on the PRX-A surface having high molecular mobility, and it was confirmed that the morphology of the embryoid-like cell mass was more maintained. This is thought to be because iPS cells adhered to a highly molecularly motile surface have a weak interaction with the material surface and a strong cell-cell interaction. It is effective in maintaining undifferentiated characteristics.
更に、それぞれの表面に接着したｉＰＳ細胞の未分化維持特性をタンパク質レベルで確認するため、ウエスタンブロットにて未分化マーカータンパク質の一種であるＯｃｔ−４の発現を調べた。図３は未分化８日目のｉＰＳ細胞でのＯｃｔ−４とアクチンの発現結果を示す。ＳＮＬ表面では、基板との相互作用が弱いために同じタンパク質総量に対してアクチン発現量が比較的低く検出された一方でＯｃｔ−４発現がアクチン発現に対して高く検出され、ＳＮＬ上では材料表面との相互作用を弱めながら未分化特性を維持するに適した環境が与えられているのが確認された。一方、高い分子運動性を有するＰＲＸ−Ａ表面では、タンパク質総量に対するアクチン発現量が著しく低下した中でＯｃｔ−４発現が高く検出された。また、その程度はゼラチンなど基板との相互作用が強い表面と比べても著しかった。このことは、培養器材上へコーティングされたＰＲＸ表面の高い分子運動性によりｉＰＳ細胞の未分化性が維持されることを示している。 Furthermore, in order to confirm the undifferentiation maintenance property of iPS cells adhered to each surface at the protein level, the expression of Oct-4, which is a kind of undifferentiated marker protein, was examined by Western blot. FIG. 3 shows the expression results of Oct-4 and actin in undifferentiated day 8 iPS cells. On the SNL surface, since the interaction with the substrate is weak, the expression level of actin is detected to be relatively low with respect to the same total protein amount, while the expression of Oct-4 is detected to be high with respect to the expression of actin. It was confirmed that the environment suitable for maintaining the undifferentiated characteristics was given while weakening the interaction. On the other hand, on the PRX-A surface having high molecular mobility, Oct-4 expression was detected high while the expression level of actin relative to the total amount of protein was significantly reduced. In addition, the degree was remarkable even when compared with a surface having strong interaction with a substrate such as gelatin. This indicates that the undifferentiated nature of iPS cells is maintained by the high molecular mobility of the PRX surface coated on the culture equipment.
実施例３：ＰＲＸ処理器材でのｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化とＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子解析
上記の３種類のポリマー表面と未修飾のガラス表面、そしてゼラチン修飾ディシュ（０．１％ゼラチン溶液にてコーティング、Life Technology社製）にそれぞれ２．０ｘ１０４細胞／ｍＬのｉＰＳ細胞溶液を１ｍＬずつ播種し、心筋細胞へ分化させながら異なる培養器材での分化特性を調べることにした。分化誘導培地はGibco社製αＭＥＭと０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％牛血清の混合培地を使用しており、播種後２日ごとに培地交換を行った。播種７日目には１０ｎｇ／ｍＬのトリコスタチンＡ（Wako社製）含有の分化誘導培地に置換させ、１日インキュベーションした後にトリコスタチンＡ無含有の分化誘導培地に再び置換させながら分化の様子を観察した。
Example 3: Differentiation of iPS cells into cardiomyocytes using PRX treatment equipment and gene analysis by RT-PCR The above three types of polymer surfaces, unmodified glass surfaces, and gelatin-modified dishes (in 0.1% gelatin solution) In this way, 1 mL each of 2.0 × 10 4 cells / mL of iPS cell solution was seeded on Life Technology Co., Ltd.), and differentiation characteristics with different culture devices were examined while differentiating into cardiomyocytes. The differentiation induction medium was a mixed medium of Gibco αMEM and 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 10% bovine serum, and the medium was changed every two days after seeding. On day 7 of sowing, the medium was replaced with a differentiation-inducing medium containing 10 ng / mL trichostatin A (manufactured by Wako), and after one day of incubation, the state of differentiation was replaced again with a differentiation-inducing medium containing no trichostatin A. Observed.
図４はｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化８日後（トリコスタチンＡ処理一日後）の接着形態を示す。全ての表面で分化培地でもｉＰＳ細胞が安定に接着及び増殖を見せていた。またＧＦＰ−Ｎａｎｏｇの発現が全ての表面でほとんど見られておらず、分化培地の影響で接着ｉＰＳ細胞の多分化能が消失していることが確認された。一般的に心筋細胞への分化に有利であることが知られているゼラチン（ポジティブコントロール）表面と比較して、最も分子運動性の高いＰＲＸ−Ａ表面では、分化８日目の段階で拍動コロニーが見られ始めた。その接着の様子でも、拍動が見られているゼラチンとＰＲＸ−Ａ表面では密集した細胞コロニーが広がっていることが特徴的にみられており、ｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化および拍動組織の形成において、高い表面分子運動性を有するＰＲＸブロック共重合体表面が優れていることが示された。 FIG. 4 shows the adhesion form 8 days after differentiation of iPS cells into cardiomyocytes (one day after treatment with trichostatin A). IPS cells stably adhered and proliferated in the differentiation medium on all surfaces. In addition, almost no expression of GFP-Nanog was observed on all surfaces, and it was confirmed that the pluripotency of adherent iPS cells was lost due to the influence of the differentiation medium. Compared to the gelatin (positive control) surface, which is generally known to be advantageous for differentiation into cardiomyocytes, the PRX-A surface with the highest molecular mobility has a pulsation on the 8th day of differentiation. Colonies began to be seen. Even in the state of adhesion, it is characteristically that dense cell colonies are spreading on the surface of gelatin and PRX-A where pulsation is observed, differentiation of iPS cells into cardiomyocytes and pulsatile tissue It was shown that the PRX block copolymer surface having high surface molecular mobility is excellent in the formation of.
図５は心筋分化後の８日目、１２日目、１７日目のｉＰＳ細胞での拍動コロニー数を示す。分化初期である８日目にはゼラチン表面で最も多い拍動コロニー数が見られたが、分化時間の延長とともにその数が減少していた。一方ＰＲＸ−Ａ表面では分化初期のコロニー数はゼラチンの２０％程度だったが、時間経過とともにコロニー数が増え、分化１７日目にはもっとも多いコロニー数を示した。この結果は、高い表面分子運動性を有するＰＲＸ−Ａ表面が拍動コロニー数を増加させるのに最も有利な環境を提供していることを示している。 FIG. 5 shows the number of beating colonies in iPS cells on the 8th, 12th and 17th days after myocardial differentiation. On the 8th day, which was the early stage of differentiation, the largest number of beating colonies were observed on the gelatin surface, but the number decreased as the differentiation time increased. On the other hand, on the PRX-A surface, the number of colonies at the initial stage of differentiation was about 20% of that of gelatin. However, the number of colonies increased with time, and the largest number of colonies was shown on the 17th day of differentiation. This result shows that the PRX-A surface with high surface molecular mobility provides the most advantageous environment for increasing the number of beating colonies.
実施例４：ＲＴ−ＰＣＲによる心筋細胞分化マーカーｍＲＮＡの発現量解析
分化誘導培地中で分化されたそれぞれのｉＰＳ細胞中の分化マーカー遺伝子の発現量を調べるため、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの発現量定量を行った。Ambion社製のPureLink RNA Mini kitを利用し、分化細胞中のトータルＲＮＡを抽出した後、Thermo社製のNanodrop2000を利用し、ＲＮＡの濃度定量を行った。トータルＲＮＡ濃度を１００ｎｇ／μＬに調整し、Applied Biosystems社製のｃＤＮＡ逆転写キットを用いてｃＤＮＡの合成を行った。５０ｎｇのｃＤＮＡを２５μＬのToyobo社製SYBR-RT-PCR Master mixと混合し、２μＬのプライマー溶液（２５μＭ）と混合した後、Applied Biosystems社製Step-One Puls RT-PCR機にてＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲのプライマー及びＰＣＲ反応条件は以下のようである。
Example 4: Analysis of expression level of cardiomyocyte differentiation marker mRNA by RT-PCR In order to examine the expression level of a differentiation marker gene in each iPS cell differentiated in a differentiation-inducing medium, quantification of mRNA expression level by RT-PCR Went. The total RNA in the differentiated cells was extracted using the PureLink RNA Mini kit manufactured by Ambion, and then the RNA concentration was quantified using Nanodrop 2000 manufactured by Thermo. The total RNA concentration was adjusted to 100 ng / μL, and cDNA was synthesized using a cDNA reverse transcription kit manufactured by Applied Biosystems. 50 ng of cDNA was mixed with 25 μL of Toyobo SYBR-RT-PCR Master mix, mixed with 2 μL of primer solution (25 μM), and then PCR analysis was performed with an Applied Biosystems Step-One Puls RT-PCR machine. It was. PCR primers and PCR reaction conditions are as follows.
プライマー（Sigma-Aldrich社製）：
αＭＨＣ：
Ｆ−ＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡ
Ｒ−ＴＧＴＣＣＴＣＧＡＴＣＴＴＧＴＣＧＡＡＣ
ＨＣＮ４：
Ｆ−ＣＧＡＣＡＧＣＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＴＡ
Ｒ−ＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴＣＧＡＡＡＣＧＣ
ＴｎＴ２：
Ｆ−ＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡ
Ｒ−ＣＧＣＣＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧ
ＧＡＰＤＨ：
Ｆ−ＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＣ
Ｒ−ＣＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧ
反応条件：
９５℃２分後、４０サイクルの９５℃２０秒、５５℃３０秒、６８℃３０秒
Primer (Sigma-Aldrich):
αMHC:
F-ACGGTGACCATAAAGAGGA
R-TGTCCTCGATCTTGTCGAAC
HCN4:
F-CGACAGCGCATCCATGAACTA
R-GCTGGAAGACCTCGAAACGC
TnT2:
F-GAAACAGGATCAACGACAACCA
R-CGCCCCGGTGACTTTGG
GAPDH:
F-TGCGACTTCAACAGCAACTC
R-CTTGCTCAGTGTCCTTCTGTG
Reaction conditions:
After 2 minutes at 95 ° C, 40 cycles of 95 ° C for 20 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 30 seconds
図６はそれぞれの表面で心筋分化したｉＰＳ細胞でのｍＲＮＡの発現量のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示す。いずれの結果も拍動コロニーの数が最も多くみられたＰＲＸ−Ａ表面での分化マーカー遺伝子の発現が分化１７日目では最も高くみられ、心筋細胞への高い分化能が遺伝子レベルにおいても確かめられた。 FIG. 6 shows the results of RT-PCR analysis of mRNA expression levels in iPS cells differentiated in myocardium on each surface. In any of the results, the expression of the differentiation marker gene on the PRX-A surface where the number of beating colonies was the largest was seen highest on the 17th day of differentiation, and the high differentiation ability to cardiomyocytes was also confirmed at the gene level. It was.
実施例５：ウエスタンブロットによる細胞内骨格系シグナルの発現定量
タンパク質レベルでの接着及び分化ｉＰＳ細胞の状態を解析するため、まず実施例２に記述されている方法で分化１７日目のｉＰＳ細胞のトータルタンパク質の抽出及び濃度定量を行った。活性ＲｈｏＡとＲＯＣＫのタンパク質発現を調べるため、１００μｇのトータルタンパク質をそれぞれAbcam社製RhoA Activation Assay kit及びROCK Assay kitを用いて反応させ、１０μＬ反応溶液を２．５μＬのLamiel Buffer（BioRad社製）と混合し、１２％アクリルアミドゲル中１５０Ｖで３０分間電気泳動させた。その後Biorad社製Turbo Blotting Systemを用いて、泳動ゲルのタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。その後、Wako製スキムミルク（５％）で１時間ブロッキングを行い、キット内の抗活性型ＲｈｏＡ抗体及び抗活性型ＲＯＣＫ抗体を希釈した１％スキムミルク溶液と常温で１時間半反応させた。その後ＰＢＳで３回洗浄を行い、Cell Signaling Technology社製ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧを希釈した１％スキムミルク溶液と常温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄を行い、GE Healthcare社製Blotting Substrateで処理した後、GE Healthcare社製ImageQuant LAS500システムにて撮影を行った。
Example 5: Expression quantification of intracellular skeletal system signal by Western blot To analyze the state of adhesion and differentiated iPS cells at the protein level, iPS cells at 17 days of differentiation were first analyzed by the method described in Example 2. Total protein extraction and concentration quantification were performed. In order to examine the protein expression of active RhoA and ROCK, 100 μg of total protein was reacted with the AbA RhoA Activation Assay kit and ROCK Assay kit, respectively. Mixed and electrophoresed in a 12% acrylamide gel at 150V for 30 minutes. Thereafter, the protein on the electrophoresis gel was transferred to a PVDF membrane using a Turbo Blotting System manufactured by Biorad. Thereafter, blocking was performed with skim milk (5%) manufactured by Wako for 1 hour, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour and a half with a 1% skim milk solution in which the anti-active RhoA antibody and the anti-active ROCK antibody in the kit were diluted. Thereafter, the plate was washed three times with PBS, and reacted with a 1% skim milk solution diluted with Cell Signaling Technology HRP-labeled anti-rabbit IgG for 1 hour at room temperature. After washing with PBS three times and processing with GE Healthcare Blotting Substrate, the images were taken with an ImageQuant LAS500 system manufactured by GE Healthcare.
図７はウエスタンブロットによる分化１７日目の活性Ｒａｃ１、活性ＲｈｏＡ（ＲｈｏＡ−ＧＴＰ）とＲＯＣＫ（ＲＯＣＫ−ＧＴＰ）のタンパク質発現を示す。細胞との相互作用が高いと予想されるゼラチン表面では高い活性ＲｈｏＡ発現が確認され、ゼラチン表面ではＲｈｏＡからなる骨格系シグナル伝達経路が支配的であることが確かめられた。 FIG. 7 shows protein expression of active Rac1, active RhoA (RhoA-GTP) and ROCK (ROCK-GTP) on day 17 of differentiation by Western blot. Highly active RhoA expression was confirmed on the gelatin surface, which is expected to have a high interaction with cells, and it was confirmed that the skeletal system signal transduction pathway composed of RhoA is dominant on the gelatin surface.
実施例６：ＥＬＩＳＡによるカドヘリン発現の定量
１０μｇのトータルタンパク質内のカドヘリン発現量をそれぞれBoster Biological Technology社製N-Cadherin ELISAキット及びRayBio社製E-Cadherin ELISAキットにて定量した。用いた検量線はキット内の濃度既知のマウス由来Ｎ−カドヘリン及びＥ−カドヘリン・スタンダードで作製し、４５０ｎｍでの吸収強度からタンパク質発現量を定量した。ｉＰＳ細胞の未分化維持及び細胞間相互作用の形成が必須である心筋細胞への分化促進にはカドヘリンの発現量増加が必要であると考えられる。特に心筋細胞への効率的な分化のためには、Ｎ−カドヘリンの多発現が必要とされる。図８に示すように、分子運動性の高いＰＲＸ−Ａの表面では未分化段階からＮ−カドヘリンの発現が最も多く見られ、心筋細胞への分化に有利な環境を構築していることがわかった。更に、心筋細胞への分化１７日目ではゼラチンとともに高いＮ−カドヘリンの発現が見られており、図５で示した最も多い拍動コロニーを形成した結果とも合致した結果が得られた。一方ゼラチンでは、ＰＲＸ−Ａと同様に高いＮ−カドヘリン発現を見せているものの、Ｅ−カドヘリン発現も高く、典型的な心筋分化細胞のカドヘリン発現とは異なる傾向が認められた。ＰＲＸ−Ａでは、未分化状態で高く検出されたＥ−カドヘリンの発現量が分化の際著しく低下すると同時にＮ−カドヘリンのみが高い発現量を維持していた。
Example 6: Quantification of cadherin expression by ELISA The amount of cadherin expression in 10 μg of total protein was quantified with an N-Cadherin ELISA kit manufactured by Boster Biological Technology and an E-Cadherin ELISA kit manufactured by RayBio, respectively. The calibration curve used was prepared from mouse-derived N-cadherin and E-cadherin standard with known concentrations in the kit, and the protein expression level was quantified from the absorption intensity at 450 nm. It is considered that an increase in the expression level of cadherin is necessary for promoting differentiation into cardiomyocytes, which is essential for maintaining undifferentiated iPS cells and forming cell-cell interactions. In particular, multiple expression of N-cadherin is required for efficient differentiation into cardiomyocytes. As shown in FIG. 8, the expression of N-cadherin is most frequently observed from the undifferentiated stage on the surface of PRX-A having high molecular mobility, and it is found that an environment favorable for differentiation into cardiomyocytes is constructed. It was. Furthermore, on day 17 of differentiation into cardiomyocytes, high N-cadherin expression was observed together with gelatin, and the results consistent with the results of forming the most pulsatile colonies shown in FIG. 5 were obtained. On the other hand, gelatin showed high N-cadherin expression like PRX-A, but also high E-cadherin expression, and a tendency different from typical cadherin expression of differentiated myocardial cells was observed. In PRX-A, the expression level of E-cadherin, which was highly detected in an undifferentiated state, was significantly reduced during differentiation, and at the same time, only N-cadherin maintained a high expression level.
実施例７：免疫染色によるＮ−カドヘリンの分布状態
心筋分化後に高く検出されたＮ−カドヘリン発現の分布状態を調べるため、免疫染色にて心筋分化細胞でのＮ−カドヘリン発現を観察した。心筋分化した細胞をＰＢＳで洗浄した後、４％ホルムアルデヒド（Merck社製）溶液にて１５分間室温で固定化した。ＰＢＳで３回洗浄した後、５％ヤギ血清と０．３％トリトン−Ｘ１００を含んだブロッキング溶液に１時間接触させた。その後ウサギ抗Ｎ−カドヘリン抗体（Abcam社製）を希釈した溶液に接触させ、４℃で一晩反応させた。その後ＰＢＳで３回洗浄を行い、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ（Abcam社製）溶液にて常温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄を行い、ＤＡＰＩ入りのProLong gold antifade溶液（Life Technology社製）にて封入し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察を行った。
Example 7: Distribution state of N-cadherin by immunostaining In order to examine the distribution state of N-cadherin expression detected highly after myocardial differentiation, N-cadherin expression in cardiomyocyte differentiated cells was observed by immunostaining. The myocardial differentiated cells were washed with PBS, and then fixed with a 4% formaldehyde (Merck) solution for 15 minutes at room temperature. After washing 3 times with PBS, it was contacted for 1 hour with a blocking solution containing 5% goat serum and 0.3% Triton-X100. Thereafter, a rabbit anti-N-cadherin antibody (manufactured by Abcam) was brought into contact with the diluted solution and reacted overnight at 4 ° C. Thereafter, the plate was washed 3 times with PBS, and reacted with Alexa488-labeled anti-rabbit IgG (Abcam) solution at room temperature for 1 hour. The plate was washed three times with PBS, sealed with a DAPI-containing ProLong gold antifade solution (manufactured by Life Technology), and observed with a confocal laser microscope.
図９は心筋分化１７日目のｉＰＳ細胞のＮ−カドヘリンの蛍光免疫染色像を示している。同様なＮ−カドヘリン発現量でも、ＰＲＸ−Ａ表面では核が小さく密集した構造を持っており、更にＮ−カドヘリンによって細胞の密集体が形成されていることがわかる。一方ゼラチン表面ではＮ−カドヘリンによる細胞の密集体形成がＰＲＸ−Ａほど緻密になっていないことが確認された。この結果は、分子運動性の高いＰＲＸブロック共重合体により簡便にコーティングされた表面では、幹細胞の接着挙動が制御され、細胞−細胞間相互作用の調節にまで影響を及ぼしていることを示唆している。即ち、分子運動性の高いＰＲＸブロック共重合体は、細胞間相互作用の制御が必須である幹細胞の未分化維持表面及び心筋細胞への分化誘導表面の作製に有用である。 FIG. 9 shows a fluorescent immunostaining image of N-cadherin of iPS cells on day 17 of myocardial differentiation. It can be seen that even with a similar expression level of N-cadherin, the PRX-A surface has a small and dense structure of nuclei, and further, a cluster of cells is formed by N-cadherin. On the other hand, on the gelatin surface, it was confirmed that the cell aggregate formation by N-cadherin was not as dense as PRX-A. This result suggests that the adhesion of stem cells is controlled on the surface simply coated with the PRX block copolymer with high molecular mobility and affects the regulation of cell-cell interaction. ing. That is, a PRX block copolymer having high molecular mobility is useful for producing an undifferentiated maintenance surface of stem cells and a differentiation-inducing surface into cardiomyocytes, in which control of cell-cell interaction is essential.
以上の結果により、ＰＲＸブロック共重合体の簡便なコーティングによって、細胞間相互作用を制御し、幹細胞の分化能を含む特性の調節が可能な表面が実現することが明らかとなった。接着ｉＰＳ細胞の未分化マーカータンパク質解析により、高い表面分子運動性を有するＰＲＸブロック共重合体表面は、幹細胞を未分化状態で維持可能であることが見いだされた。これは、ＲｈｏＡ−ＲＯＣＫ活性の低下によって細胞内情報伝達系が調節されているためと考えられる。このことは、幹細胞を未分化状態で多量に扱う必要がある再生医療の産業利用上において極めて重要であるといえる。 From the above results, it has been clarified that a simple coating of the PRX block copolymer realizes a surface capable of controlling cell-cell interaction and adjusting characteristics including stem cell differentiation ability. From the analysis of undifferentiated marker protein of adherent iPS cells, it was found that the PRX block copolymer surface having high surface molecular mobility can maintain stem cells in an undifferentiated state. This is probably because the intracellular signal transduction system is regulated by a decrease in RhoA-ROCK activity. This can be said to be extremely important for industrial use of regenerative medicine in which stem cells need to be handled in a large amount in an undifferentiated state.
また、本発明者らは、高い表面分子運動性を有するＰＲＸブロック共重合体表面がｉＰＳ細胞などの幹細胞からの心筋細胞への分化に優れていることを見いだした。さらに、心筋細胞から間葉系分化組織を構築する上で細胞−細胞間相互作用を媒介するＮ−カドヘリン発現を誘導できることも見いだされた。このことは、細胞の分化誘導のみならず分化細胞による組織再生にも優れていることを示唆している。コラーゲン表面でみられる強いＥ−カドヘリン発現および弱いＮ−カドヘリン発現と比較すると、高い表面分子運動性を有するＰＲＸブロック共重合体表面ではＥ−カドヘリン発現に比べてＮ−カドヘリン発現が高くなっており、上皮間葉転換に優れていることが示唆されている。
In addition, the present inventors have found that the surface of a PRX block copolymer having high surface molecular mobility is excellent in differentiation from stem cells such as iPS cells into cardiomyocytes. Furthermore, it has also been found that N-cadherin expression that mediates cell-cell interaction can be induced in constructing mesenchymal differentiated tissue from cardiomyocytes. This suggests that it is excellent not only for induction of cell differentiation but also for tissue regeneration by differentiated cells. Compared with the strong E-cadherin expression and weak N-cadherin expression seen on the collagen surface, the PRX block copolymer surface with high surface molecular mobility shows higher N-cadherin expression than E-cadherin expression. It has been suggested that it excels in epithelial-mesenchymal transition.
Claims (20)
ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器上で該多能性幹細胞を培養する工程を含む方法。 A cell culture method for maintaining the undifferentiated nature of pluripotent stem cells,
A method comprising culturing the pluripotent stem cell on an incubator having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer.
ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器と、
多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養培地とを含む、キット。 A cell culture kit comprising:
An incubator having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer;
A cell culture medium for maintaining the undifferentiated nature of pluripotent stem cells.
ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器上で該多能性幹細胞を培養する工程を含む方法。 A cell culture method for promoting differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes,
A method comprising culturing the pluripotent stem cell on an incubator having a surface coated with a polyrotaxane block copolymer.
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