JP2016535058A - 腫瘍細胞へのRNAiトリガーのインビボ送達のためのポリ結合体 - Google Patents
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Abstract
Description
RNAiトリガーおよび他の実質的に細胞膜不透過性である化合物を生細胞中に送達することは、細胞の膜系が複雑なことから、非常に制限される。アンチセンス、RNAiおよび遺伝子治療にて使用される薬物は、比較的大きな親水性ポリマーであり、高い負電荷を帯びていることが多い。これらの物理的特性の双方により、これらの物質が細胞膜を通過して直接的に分散することは著しく制限されている。したがって、RNAiトリガー送達の主な障壁は、RNAiトリガーを、細胞膜を通過させ、細胞の細胞質または核に送達することである。
式中、R4は、RGDリガンドまたは立体安定化剤を含み、R1およびR2は、アミノ酸側鎖である。R1は、好ましくは、疎水性アミノ酸の側基である。好ましい疎水性アミノ酸は、アラニンである。R2は、好ましくは、中性pHで非荷電の親水性アミノ酸の側鎖である。好ましい非荷電親水性アミノ酸は、シトルリンである。ジペプチドの後のアミノ酸とアミドベンジル基との間にてインビボで酵素的切断が生じると、R4がポリマーから外れ、脱離反応が開始し、アミドベンジル−カルバマートが自然転位して、その結果ポリマーアミンが復元される。
式中、Nは、RNAiトリガーを含み、L2は、A1A2−アミドベンジル−カルバマートなどの生理学的に不安定な可逆的連結であり、Pは、両親媒性膜活性ポリアミンを含み、Rは、RGDリガンドを含み、それぞれは本明細書に記載する通りであり、PEGは、ポリエチレングリコールまたは他の立体安定化剤を含み、L1は、生理学的に不安定な連結であり、yは、ゼロより大きい整数であり、zは、ゼロ(0)より大きい整数であり、yとzの和の値は、修飾されていない膜活性ポリアミン中のアミンの数により求めたポリアミンP上に存在するアミンの数の50%よりも大きい。
R−A1A2−アミドベンジル−カルバマート−(式2a)
および
PEG−A1A2−アミドベンジル−カルバマート−(式2b)
式中、A1A2はジペプチドであり、A1はアミノ酸であり、A2はアミノ酸である。RGDリガンドは、PEGリンカーなどのリンカーを介してジペプチドに連結され得る。好ましい立体安定化剤は、ポリエチレングリコール(PEG)である。A1は、好ましくは、疎水性アミノ酸である。A2は、好ましくは、非荷電親水性アミノ酸である。A1およびA2は、好ましくは、アミド結合を介して連結される。好ましいアミドベンジル基は、p−アミドベンジル基である。カルバマートは、カルボナートとポリマーアミンとの反応によって生成される。好ましいカルボナートは、活性化したアミン反応性カルボナートである。A1A2−アミノベンジル−カルバマート連結は、そのジペプチドが内因性プロテアーゼによりインビボで切断されるまで、したがって、立体安定化剤またはRGDリガンドのポリアミンからの切断まで、安定である。ジペプチドの後(A2とアミドベンジルの間)の酵素的切断後、アミドベンジル−カルバマートが自然転位して、その結果ポリマーアミンが復元される。
(図2A)種々のPEGジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。(A)PEG−GlyGly−PABC−PNP。
(図2B)種々のPEGジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。(B)PEG−AsnGly−PABC−PNP。
(図2C)種々のPEGジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。(C)PEG−PheLys−PABC−PNP。
(図2D)種々のPEGジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。(D)PEG−ValCit−PABC−PNP。
(図2E)種々のPEGジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。(E)PEG−AlaAsn−PABC−PNP。
(図2F)種々のPEGジペプチドマスキング剤の構造を示す図である。(F)PEG−PheLys(CH3)2−PABC−PNP。
(図3)ジペプチドマスキング剤を用いるポリアミンの可逆的修飾を示す図である。Rは、RGDリガンドまたはPEGを含み、AAは、ジペプチドであり(保護基ありまたは保護基なしのいずれか)であり、R3は、アミン反応性カルボナートであり、ポリアミンは、両親媒性膜活性ポリアミンである。
(図4)アミドベンジル−カルバマートが自然転位して、その結果ポリマーアミンが復元される脱離反応を示す図である。AA(A1A2)はジペプチドであり、R4はRGDリガンドまたは立体安定化剤を含む。
(図5)PEGジペプチドマスキング剤の合成を示す図である。RはPEGを含み、A1およびA2はアミノ酸(保護または非保護のいずれか)である。
(図6)(A)ジペプチドのNHSエステル、(B)Fmoc保護誘導体からのH−Asn(DMCP)−OHおよびH−Lys(MMT)−OHのアミノ酸、ならびに(C)Fmoc−A1A2−OHの生成を示す図である。A、A1およびA2はアミノ酸である。
(図7)(A)Fmoc−AA−PABAおよびFmoc−A−PABAの生成、ならびに(B)H−Lys(CH3)2−PABAとFmoc−Phe−NHSの結合を示す図である。
(図8)H−A1A2−PABAおよびH−A1−PABAの生成を示す図である。
(図9)PEGn−A1A2−PABAの生成を示す図である。
(図10)PEG−AA−PABC−PNP(A)および(B)の生成を示す図である。
(図11)N−Boc−エチルエトキシアクリラートとプロピルメタクリラートのRAFT共重合を示す図である。
(図12)アジド−PEG−アミンを用いたポリマー末端修飾を示す図である。
(図13)RGDマスキング剤の一例によって修飾したポリアミンを示す図である。RGDリガンド−PEG1−ジアミン−ジアリールヒドラゾン−PEG2−ジペプチド−アミドベンジル−カルボマート−ポリアミン。
によって単位の一部(すなわち、RGDリガンド、PEG1など)として明示されていない原子は、連結原子とみなされ、両側の表示を付けた単位の一部とみなされ得る。
本発明は、インテグリン発現腫瘍細胞にRNA干渉(RNAi)トリガーをインビボで送達するための結合体および方法を提供する。本記載の結合体は、送達対象のRNAiトリガーに共有結合した、インテグリンを標的にする可逆的に修飾した膜活性ポリアミンを含む。インテグリン標的化は、本明細書にて記載されるRGDリガンドによってもたらされる。膜活性ポリアミンの可逆的修飾は、本明細書にて記載されるRNAリガンドおよび立体安定化ペプチダーゼ切断可能マスキング剤によってもたらされる。ペプチダーゼで切断可能な連結は、プロテアーゼ不存在下での加水分解に対して安定であり、保存およびインビボ循環にて長期間の安定性をもたらす。循環における半減期の向上(長期化)により、腫瘍組織などの組織におけるRGDリガンドを介した累積の可能性が時間的に広がりやすくなる。RNAiトリガーのインビボ送達は、遺伝子発現の治療的阻害(ノックダウン)に有用である。
式中、Nは、RNAiトリガーであり、L1は、生理学的に不安定な連結であり、Pは、両親媒性膜活性ポリアミンであり、M1は、ジペプチド−アミドベンジル−カルバマート連結を介してPに連結したRGDリガンド(RGDマスキング剤)を含み、M2は、ジペプチド−アミドベンジル−カルバマート連結を介してPに連結した立体安定化剤(PEGマスキング剤)を含む。yおよびzはそれぞれ、いかなるマスキング剤もないポリアミンP上のアミンの量によって求めた場合で、y+zの値が、P上にある第一級アミンの数の50%より大きい値、60%より大きい値、70%より大きい値、80%より大きい値、または90%より大きい値を有することを条件とし、ゼロより大きい整数である。Pは、修飾されていない状態において、膜活性ポリアミンである。送達ポリマーのM1 y−P−M2 zは膜活性ではない。M1およびM2を連結することによるPの第一級アミンの可逆的修飾は、Pの膜活性を可逆的に抑制または不活性化する。一部の小さな両親媒性膜活性ポリアミン、たとえばメリチンペプチドなどは、わずか3〜5個の第一級アミンしか含まないことに留意されたい。アミンのある百分率の修飾は、ポリマーの集団におけるアミンの百分率の修飾を反映することになる。M1およびM2が切断されると、ポリアミンのアミンが復元され、これにより、Pは、修飾されていない膜活性状態に戻る。
(RまたはPEG)−A1A2−アミドベンジル−カルボナート
式中、Rは、RGDリガンドを含み、PEGは、他の立体安定化剤のポリエチレングリコールを含み、A1A2は、第1のアミノ酸A1および第2のアミノ酸A2を含むジペプチドであり、カルボナートは、活性化アミン反応性カルボナートである。マスキング剤カルボナートとポリマーアミンとの反応により、カルバマート連結が生じる。RNAリガンドまたは立体安定化剤は、カルボナートとポリマーアミンとの反応前またはカルバマート連結の生成後に、ジペプチドに接続され得る。マスキング剤は、そのジペプチドが内因性プロテアーゼによりインビボで切断されるまで、したがって、RGDリガンドまたは立体安定化剤のポリアミンからの切断まで、ポリマーに安定的に連結している。ジペプチドの後(A2とアミドベンジルの間)の酵素的切断後、アミドベンジル−カルバマートが自然転位して、その結果ポリマーアミンが復元される。RGDリガンドは、PEGリンカーなどのリンカーを介してジペプチドに連結され得る。好ましい立体安定化マスキング剤は、非荷電である。好ましい非荷電性立体安定化剤は、ポリエチレングリコール(PEG)である。好ましいジペプチドは、非荷電親水性アミノ酸(A2)にアミド結合を介して連結した疎水性のアミノ酸(A1)からなる。好ましいアミドベンジル基は、p−アミドベンジル基である。好ましいカルボナートは、活性化アミン反応性カルボナートである。
式中、R4は、RGDリガンドまたは立体安定化剤を含み、R3は、アミン反応性カルボナート部分を含み、R1およびR2は、アミノ酸側鎖である。R1は、好ましくは、疎水性アミノ酸の側基である。好ましい疎水性アミノ酸は、アラニンである。R2は、好ましくは、非荷電親水性アミノ酸の側鎖である。好ましい非荷電親水性アミノ酸は、シトルリンである。好ましい活性化カルボナートは、パラ−ニトロフェノールである。しかしながら、パラ−ニトロフェノールの代わりに、当該技術分野にて知られている他のアミン反応性カルボナートを問題なく使用できる。以下で表されるように、活性化カルボナートとアミンとの反応により、RGDリガンドまたは立体安定化剤が、ペプチダーゼで切断可能なジペプチド−アミドベンジルカルバマート連結を介して、膜活性ポリアミンに接続される。
式中、R4、R1およびR2は、上述の通りである。ジペプチドの後のアミノ酸とアミドベンジル基との間にて酵素的切断が生じると、R4がポリマーから外れ、脱離反応を誘発し、アミドベンジル−カルバマートが自然転位して、その結果ポリマーアミンが復元される。
式中、R7は、RGDリガンド含有部分との反応に適し、R3のカルボナートよりもアミン反応性が小さい反応性基を含む。R1、R2およびR3は、上記で定義した通りである。一実施形態において、R7は、PEG連結部分(本明細書にてPEG2とも称される)をさらに含む。本発明者らは、ジペプチドと反応性基との間にPEG連結部分を挿入すると、組み合わせた後のRGDマスキング剤の溶解性およびインビボ機能が向上することを見出した。好ましいPEG連結部分は、(CH2−CH2−O)4−44である。ポリマーアミンを反応性基(R7)含有ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートで修飾した後、反応性基R7との反応を介して、RGDリガンド含有部分を共有結合させる。ジペプチドとRGDリガンド含有部分を連結させるのに適した例示の反応性基部分には、HyNicおよびアルデヒド(アリールアルデヒドを含む)、「クリック」ケミストリー架橋剤(ある特定のアジドおよびアルキン)が挙げられるが、これらに限定されない。式3の例示的な分子は、(4−ホルミルベンズアルデヒド)−PEG−Ala−Cit−ara−アミノベンジルカルボナートである。
式中、
Xは−NH−、−O−または−CH2−であり、
Yは−NH−または−O−であり、
R1は、好ましくは、−(CH2)k−フェニル(kは1、2、3、4、5、6であり、k=1の場合フェニルアラニン)、−CH−(CH3)2(バリン)、−CH2−CH−(CH3)2(ロイシン)、−CH(CH3)−CH2−CH3(イソロイシン)、−CH3(アラニン)、または
であり、
R2は、好ましくは、水素(グリシン)、−(CH2)3−NH−C(O)−NH2(シトルリン)、−CH2−C(O)−NH2(アスパラギン)、−(CH2)2−C(O)−NH2(グルタミン)、−(CH2)4−N−(CH3)2(リシン(CH3)2)、−(CH2)k−C(O)−NH2(kは1、2、3、4、5、6である)、−CH2−C(O)−NR'R''(アスパラギン酸アミド)、−(CH2)2−C(O)−NR'R''(グルタミン酸アミド)、−CH2−C(O)−OR'(アスパラギン酸エステル)または−(CH2)2−C(O)−OR'(グルタミン酸エステル)であり、式中、R'およびR''はアルキル基であり、
R4は、RGDリガンドまたはポリエチレングリコールを含み、
ポリアミンは、両親媒性膜活性ポリアミンである。
式中、
X、Y、R1、R2およびR4は、上述の通りであり、
R5は、2、4または6位であり、かつ−CH2−O−C(O)−O−Zであり、式中、Zは、
−ハロゲン化物、
であり、
R6は、独立して、R5により占有されている位置を除く2、3、4、5または6位のそれぞれで、水素、アルキル、−(CH2)n−CH3(式中n=0〜4)、−(CH2)−(CH3)2またはハロゲン化物である。
のアミノ酸配列からなり、式中、Xは天然アミノ酸であり、mはゼロ(0)または1であり、n1〜n6は独立して0、1、2または3である。存在する場合(n=1、2または3)、各Xの1つまたは複数のアミノ酸は、他の位置のアミノ酸の選択に依存しない。一実施形態において、m、n1、n2およびn5はそれぞれ1であり、n3、n4およびn6はそれぞれゼロ(0)である。別の実施形態において、mは1であり、Xn1はアラニンであり、Xn2はアスパラギン酸であり、Xn5はフェニルアラニンであり、n3、n4およびn6はそれぞれゼロ(0)である
。RGDペプチドは、RGDアミノ酸配列に連結した非ペプチド成分を有し得る。たとえば、ペプチドのアミノ末端がアシル化されてもよいし、またはリンカーがペプチドのカルボキシ末端に接続していてもよい。別の実施形態において、mは1であり、Xn1はアシル化されたアラニンであり、Xn2はアスパラギン酸であり、Xn5はフェニルアラニンであり、n3、n4およびn6はそれぞれゼロ(0)である。
式中、nは整数である。
式中、R9およびR10は、独立して、水素またはアルキルであり、連結して環を形成してよい。R11は、グアニジニウム基をグリシン−アスパラギン酸ジペプチドに連結するリンカーである。グアニジニウム基は、上記で示した構造とその共鳴構造の両方を含む。好ましいリンカーは、
−(C1RR)−(C2RR)−(C3RR)−または−(C1RR)−(C2RR)−(C3RR)−(C4RR')−
であり、式中、a)各Rは、独立して、任意であり、存在する場合は、独立して、水素、アルキルまたはアリールであり、b)R'は水素、アルキル、アリールまたはNH2であり、c)C1、C2およびC3は、単結合、単結合と二重結合または芳香族結合によって連結され得る。
同様に、本明細書にて示すRGDリガンド構造中には明記していないが、アミノ酸のアスパラギン酸が中性または中性に近いpH(pH6.5〜7.5)で負に帯電していることはよく知られており、そのように理解される。
式中、R13は、
である。
式中、
R14は、
であり、
Aは、リンカーを含む。リンカーは、RGD模倣体をジペプチドアミドベンジル−カルボナートなどの別の分子に接続するか、溶解性の向上をもたらすか、または別の分子への共有結合の手段を提供する。
式中、
nは、0、1、2または3であり、
Yは、不在か、
であり、
Zは、不在か、
であり、
mは、0、1、2、3または4であり、
PEG(図13中のPEG1)は(CH2−CH2−O)4−44であり、
R12は、R7と反応して共有結合を形成できる反応性基を含む。
である。
式中、R14は、上記で定義したグアニジニウム含有部分であり、A'は、PEG含有リンカーを含み、R1は、好ましくは、疎水性アミノ酸の側基であり、R2は、好ましくは、(中性pHで)非荷電の親水性アミノ酸の側鎖であり、R3は、アミン反応性カルボナートである。一実施形態において、リンカーA'は、4〜48のエトキシ単位を有するPEG基を含む。別の実施形態において、リンカーA'は、ジアシルヒドラジンまたは他の連結化学により隔てられた、4〜44のエチレン単位を有する第1のPEG(PEG1)基と、4〜44のエチレン基を有する第2のPEG(PEG2)基とを含む。一実施形態において、ジアシルヒドラゾンは、リシンなどのジアミンを介して第1のPEG基と連結している。ジアリールヒドラゾンは、HyNic(ヒドラジノ−ニコチンアミド)とアリールアルデヒドとの反応によって生成することができる。
式中、R14、R1、R2およびA'は、上記で定義した通りである。一実施形態において、RGDは、ジペプチドを両親媒性膜活性ポリアミンに連結した後、ジペプチドに連結する。一実施形態において、アリールアルデヒド−PEG2−ジペプチド−アミドベンジル−カルボナートを、初めにポリアミンと反応させて、アリールアルデヒド−PEG2−ジペプチド−アミドベンジル−カルバマート−ポリアミンを生成する。次いで、この化合物をRGDリガンド−PEG1−ジアミン−HyNicと反応させて、RGDリガンド−PEG1−ジアミン−ジアリールヒドラゾン−PEG2−ジペプチド−アミドベンジル−カルボマート−ポリアミンを生成する(図13参照)。
−(A)a−(B)b−
式中、Aは、ペンダント第一級アミン官能基を含み、Bは、ペンダント疎水性基を含む。aおよびbは、0を超える整数である。ポリマーは、ランダム、ブロックまたは交互であってよい。追加モノマーの組み込みは、許容される。
一実施形態において、RNAiトリガーは、生理学的に不安定な結合またはリンカーを介して送達ポリマーに連結される。生理学的に不安定なリンカーは、特定の生理学的条件下にあるときに化学的変化(たとえば切断)を生じるように選択される(たとえば、細胞質の還元環境におけるジスルフィド結合の切断)。生理学的に不安定な連結の切断によるトリガーのポリマーからの放出は、トリガーと適切な細胞成分との活性のための相互作用を促す。
薬理学および毒物学において、投与経路とは、薬物、流体、毒または他の物質が体に接触する経路である。一般に、哺乳動物の治療のための薬物および核酸の投与方法は、当該技術分野においてよく知られており、本発明の組成物の投与に適用することができる。本発明の化合物は、任意の好適な経路を介して、最も好ましくは非経口により、当該経路に適切に合わせた調製物で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、注入により、たとえば静脈内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内投与することができる。そのため、本発明はまた、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
RNAiトリガーは、研究目的のために、または細胞内に治療的である変化をもたらすために送達することができる。RNAiトリガーのインビボ送達は、研究試薬として、ならびに種々の治療、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学および薬理ゲノムの各用途に有用である。本発明者らは、肝細胞において内因性遺伝子発現の阻害をもたらすRNAiトリガー送達を開示している。RNAiトリガーの送達後に測定したレポータ(マーカ)遺伝子発現のレベルでは、他のRNAiトリガーの送達後における遺伝子発現と類似レベルの合理的な予想が示されている。当業者によって有益とみなされる治療レベルは、疾患ごとに異なる。たとえば、血友病AおよびBはそれぞれX連鎖凝固第VIII因子および第IX因子の欠乏によって引き起こされる。その臨床経過は、第VIII因子または第IX因子の正常血清レベルのパーセンテージに大きく左右され、2%未満は重症、2〜5%は中等症、5〜30%は軽症とされる。したがって、重症患者における循環因子を正常レベルの1%から2%へ増加することは、有益であるとみなすことができる。6%を超えるレベルでは、自然出血を防げるが、手術または傷害に伴うものは防げない。同様に、遺伝子の阻害は、治療上の効果をもたらすために、100%である必要はない。遺伝子治療の当業者であれば、十分なレベルのマーカ遺伝子の結果に基づいて、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例において、マーカ遺伝子が発現されて第VIII因子の正常レベルの2体積%に匹敵するレベルでタンパク質を産生する場合、第VIII因子をコードする遺伝子も同様のレベルで発現していることが合理的に予想できる。したがって、レポータまたはマーカ遺伝子は、細胞内タンパク質全体の発現の有用な実例として役立つ。
NaHCO3水溶液中のアミノ酸カップリングおよびシリル基の脱保護を除き、すべての反応を新しい無水溶媒を用いて無水条件で実施した。カラム精製は、明記した溶離液を用いてシリカゲル上で行った。質量スペクトル(MS)は、エレクトロスプレーイオン化を用いて取得した。
a)AAのNHSエステルを、対応するアミノ酸からNHSおよびDCCを用いて調製し、さらに精製することなく用いた(図5A)。
Fmoc−GlyGly−OH 1aを得るために、グリシン(75mg、1mmol)およびNaHCO3(100mg、1.2mmol)をH2O(10ml)およびジメトキシエタン(DME)(5ml)中に溶解した。DME中のFmoc−Gly−NHS溶液(5ml、1mmol)を加えた。THF(2.5ml)を加え、混合物を超音波処理して均質にし、20時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、残留物をEtOAcおよびH2O中5%KHCO3溶液で処理した。生成物をEtOAcで4回抽出し、pH=3のブラインで洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、濃縮し、減圧下で乾燥させた。収率321mg(90%)。MS:775.0[2M+2Na]+;377.4[M+Na]+;355.1[M+1]+.
i)DME(40ml)中のFmoc−Phe−NHS(4.96g、10.26mmol)を、H2O(40ml)およびTHF(20ml)の混合物中にL−シトルリン(1.80g、10.26mmol)およびNaHCO3(0.86g、10.26mmol)を含む溶液に加えた。反応物を15時間撹拌した。活性化によるDCCの残渣を濾過し、有機溶媒をロータリーエバポレータで除去した。残留物にH2O(100ml)およびiPrOH(10ml)を加えた。懸濁液を5%KHSO4でpH=3まで酸性化し、生成物をEtOAc:iPrOH=9:1溶液(3×、500ml)で抽出し、ブライン:iPrOH=9:1(2×、50ml)の混合物で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、濾過して濃縮し、オイルポンプで乾燥させた。エーテルでトリチュレートして、純粋な生成物1eを得た。収率3.84g(68%)。MS:545.6[M+Na]+;528.5[M−H2O]+;306.3[M−Fmoc+H2O]+.
生成物1a〜hを、2−エトキシ−1−エトキシカルボニル−1,2−ジヒドロキノリン(EEDQ)の存在下で、p−アミノベンジルアルコール(PABA)とカップリングし、2a〜hを生成した。PABA部分にアミノ酸を1つしか連結していない4つの代表的化合物3j〜lも調製した(図7A)。
Fmoc誘導体2a〜h、j〜lを、3iについて上述した通りにDMF中でEt3Nにより処置し、続いて濃縮し、減圧下にて乾燥させた。粗生成物をDMF中に溶解して0.1M溶液を作製し、さらに精製することなく用いた。
H−AA−PABA 3b、e、g、h、j、k〜mのいずれかのアミノ基をPEG酸のNHSエステルでアシル化して(DIEA、DMF、5〜10時間)、22a〜kを得た。次いで、生成物22a〜kのヒドロキシル基をp−ニトロフェニルカルボナート((PNP)2CO、ジオキサンまたはTHF、40〜60℃、10時間)に変換して23a〜kを得た。23a、d、gを得るために、TFA水溶液(TFA/H2O=3:1、5℃、2〜3時間)を用いる処理によりAsnおよびGluから保護基を除去し、所望の生成物24a〜cを得た。
生成物22a(n=11、AA=GluGly)。DMF中の3bの0.1M溶液(3.5ml、0.35mmol)をPEG11−NHSエステル(240mg、0.35mmol)およびDIEA(0.061ml、0.35mmol)とともに10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで40℃/オイルポンプにて除去し、生成物をカラムにより溶離液CHCl3:MeOH:AcOH=38:2:1で精製した。収率274mg(78%)。MS:1015.6[M+NH4]+、998.7[M+1]+.
生成物23a(n=11、AA=Glu(2PhiPr)Gly)を得るために、DCM(15ml)中の生成物22a(274mg、0.274mmol)を(PNP)2CO(418mg、1.372mmol)およびDIEA(0.143ml、0.823mmol)とともに暗所で15時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレータで除去し、生成物をカラムによりCHCl3中の4%MeOH、0.2%AcOHの溶離液で精製した。収率260mg(81%)。MS:1180.7[M+NH4]+ .
生成物24a(n=11、AA=GluGly)。生成物23a(250mg、0.215mmol)をCHCl3の3%TFA溶液(16ml)中で35分間撹拌し、ロータリーエバポレータで濃縮し、減圧下にて乾燥させた。収率224mg(100%)。(MS:1062.6[M+NH4]+ .;1045.9[M+1]+.
A.RGD−PEG−チオエート:
1.RGD模倣体#1−PEG8−チオエート、MW982.1
2.RGD模倣体#2−PEG8−チオエート、MW1022.2
3.RGD模倣体#3−PEG8−チオエート、MW1080.2
4.RGD模倣体#3−PEG12−チオエート、MW1212.4
B.RGD−HyNic:
1.RGD模倣体#1−PEG12−HyNic、MW1272
2.RGD模倣体#1a−HyNic、MW802.8
3.RGD模倣体#1b−HyNic、MW830.9(RGD)
C.RGE−PEG12−HyNic(対照)MW1282
D.RGDペプチド−HyNic:RGD4C、[NH2−ACDCRGDCFCG−Lys(e−6−HyNic);SEQ ID NO:5]、MW1407.83
プロテアーゼで切断可能なマスキング剤のアミン含有ポリマーへの連結−p−アシルアミドベンジルカルバマート連結の形成
A.RGD−PEG−チオエート
100mMのHEPES pH9.0緩衝液中で、Cy3標識ポリマーをSPDP−PEG24−FCit−パラ−ニトロフェノールと所望の比率で室温にて1時間合わせた。次いで、100mMのHEPES pH9.0緩衝液中で、SPDP−PEG24−FCit−修飾ポリマーをPEG12−FCitと1:8(ポリマー:PEG12−FCit)の重量比で室温にて1時間反応させた。その後、修飾したポリマーをsephadex G−50スピンカラムを用いて精製した。
100mMのHEPES pH9.0緩衝液中で、Cy3標識ポリマーをアルデヒド−PEG12/24−TFP(Quanta Biodesign #10082)と所望の比率で室温にて1時間合わせた。次いで、100mMのHEPES pH9.0緩衝液中で、アルデヒド−PEG12/24−TFP−修飾ポリマーをPEG12−FCitと1:8(ポリマー:PEG12−FCit)の重量比で室温にて1時間反応させた。その後、修飾したポリマーをsephadex G−50スピンカラムを用いて精製した。
p−アシルアミドベンジルアルコール誘導体の活性化(アミン反応性)カルボナートをpH>8のH2O中で両親媒性膜活性ポリアミンのアミノ基と反応させて、p−アシルアミドベンジルカルバマートを得る。
R1はPEGを含み、
R2は両親媒性膜活性ポリアミンであり、
AAはジペプチド(保護ありまたは保護なしのいずれか)、
Zはアミン反応性カルボナートである。
A.RGD−PEG−チオエートおよびPEG−ジペプチドマスキング剤を用いたsiRNA送達結合体の生成
示したポリマーを、5mMのHEPES pH8.0緩衝液中で、SMPTと1:0.015(ポリマー:SMPT)の重量比で室温にて1時間反応させた。
1)プロトコール1。示したポリマーを、5mMのHEPES pH8.0緩衝液中で、SMPTと1:0.015(ポリマー:SMPT)の重量比で室温にて1時間反応させた。
示したポリマーを、5mMのHEPES pH8.0緩衝液中で、SMPTと1:0.015(ポリマー:SMPT)の重量比で室温にて1時間反応させた。
示したポリマーを、5mMのHEPES pH8.0緩衝液中で、SMPTと1:0.015(ポリマー:SMPT)の重量比で室温にて1時間反応させた。
示したポリマーを、5mMのHEPES pH8.0緩衝液中で、アジド−PEG4−NHSと1:0.015(ポリマー:アジド)の重量比で室温にて1時間反応させた。
モノアジドポリマーを、50mMのHEPES pH9.0緩衝液中で、アルデヒド−PEG−ジペプチドマスキング剤(アルデヒド−PEG24−ACit)と1:0.5(ポリマー:PEG)の重量比で、PEG−ジペプチドマスキング剤(PEG12−ACit)と1:2(ポリマー:PEG)の重量比で室温にて1時間反応させた。次いで、50mMのHEPES pH9.0緩衝液中で、修飾ポリマーをアルキン−siRNAと1:0.2(ポリマー:アルキン−siRNA)の重量比で室温にて終夜反応させ、siRNAを連結した。次に、50mMのHEPES pH9.0緩衝液中で、修飾ポリマーをプロテアーゼ切断可能PEG(PEG12−ACit)と1:6(ポリマー:PEG)の重量比で室温にて1時間反応させた。
腫瘍細胞を2ml中50,000/mlで6ウェルプレート中のカバーガラス上に24時間播種した。5μg/mlのCy3標識RGD−PEG−チオエートまたはCy3標識RGD−PEG−HyNic(プロトコール1〜5)修飾ポリマー(0.2mg/mlの50μl、RGD−PEG、RGD#1)を細胞に滴加し、細胞を37℃で24時間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、10%ホルマリン溶液で30分間固定した。固定後、細胞をPBSで2回洗浄した。
等張グルコース100〜200μg中のCy3−標識RGD(チオール−RGD#1)/PEG修飾Lau1005−116C−1(エチルエトキシアミンアクリラート54%/ブチルアクリラート46%のRAFTコポリマー、分画1、保護基ありのMW104k、保護基なしのMW76k、PDI1.2)(0.5または1mg/mlの200μl)を、ヒト腫瘍異種移植片を有する免疫不全マウスに尾静脈投与により注入した。注入から4時間後、動物を屠殺し、腫瘍を採取した。腫瘍全体を10%ホルマリン溶液中で最低4時間インキュベーションして固定した。次いで、腫瘍を30%スクロース溶液に終夜または平衡になるまで浸した。飽和した腫瘍を液体窒素で急速凍結し、スライドガラス(VWR superfrost plus micro slide)上で7μmスライスの凍結切片にした。次いで、切片をAlexa Fluor 488 ファロイジン(2単位/ml)およびToPro−3ヨウ化物(0.2μM)で室温にて20分間染色した。染色後、切片をPBSで2回洗浄し、Vectashield封入剤を用いて上部にカバーガラスを取り付け、Zeiss LSM 710レーザー走査型レーザー共焦点顕微鏡で観察した。代表的な画像を撮り、組織およびCy3蛍光の細胞分布を示した。A498腫瘍モデルにおいて、RGD修飾ポリマーは、腫瘍の移植場所(皮下、肝臓または腎臓)にかかわらず、腫瘍組織に深く浸透し、腫瘍細胞中に入っていた。対照ポリマー(RGDなし(PEGのみ)またはRGE修飾のいずれか)は、腫瘍細胞中に入ることなく、主に脈管構造中にとどまった。肝臓移植したHepG2腫瘍モデルにおいて、RGD結合体の腫瘍組織への強い浸透が認められた。
等張グルコース中のRGD標的化結合体(500μg、1.67mg/mlの300μl)をヒト腫瘍異種移植片を有する免疫不全マウスに尾静脈投与により注入した。注入から72時間後、動物を屠殺し、腫瘍を採取した。腫瘍組織をTri試薬(Molecular Research Center)中で均質化して全RNAを単離した。関連するmRNAノックダウンを定量的RT−PCRを用いて決定した。
A498細胞(ATCC)を10%FBS(Invitrogen)を添加したMEM(Invitrogen)中で培養した。786−O RCC細胞(ATCC)を1×MEM非必須アミノ酸溶液(Invitrogen)および10%FBSを添加したRPMI(Invitrogen)中で培養した。細胞を回収し、計測し、氷上でマトリゲルマトリックスHC(BD Biosciences、30体積%)と混合した。
SQ腫瘍移植のために、マウスを導入室内に置くことにより3%イソフルランで麻酔を導入した。麻酔後、マウスをドレープ上に置き、3%イソフルランの麻酔をノーズコーンから追加した。マウスを腹臥位(右または左)にして置き、逆の脇腹に注入を施した。注入の直前に、1.0mlのシリンジに細胞/マトリゲル混合物を入れ、27ゲージのニードルカテーテルをシリンジ先端に取り付けた。次いで、充填したシリンジをシリンジポンプ(Harvard Apparatus、モデルPHD2000)に取り付け、空気を抜くためにプライミングした。針を脇腹の皮膚層の真下に挿入し、細胞(10μlまたは20μl)を毎分250μlの速度で注入した。注入後、針を抜き、マウスを、ケージの下に配置されたウォータージャケット加熱パッドにより熱供給される回復ケージ内に置いた。通常の活動レベルに回復したら、動物を飼育ラックに戻した。
HepG2細胞に、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)ベクターpMIR85およびネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子ベクターpMIR3の2つの発現ベクターをコトランスフェクトし、安定してSEAPを発現する細胞株を作製した。10%FBSおよび300μg/mlのG418を添加したDMEM中で細胞を培養した。10%FBSを添加したMcCoy 5A培地中でHT−29結腸癌細胞を培養した。腫瘍移植のために、細胞を回収し、計測し、マトリゲル(BD Biosciences、40体積%)と混合した。無胸腺ヌードマウスに約3%イソフルランで麻酔をかけ、胸骨臥位にして置いた。剣状突起の直下に小さな1〜2cmの腹部正中線切開を施した。湿った綿棒を用いて、肝左葉をゆっくり体外に出した。肝左葉をゆっくり収縮させ、シリンジ針を左葉の中央に挿入した。注入の直前に、1.0mlのシリンジに細胞/マトリゲル混合物を入れ、27ゲージのニードルカテーテルをシリンジ先端に取り付けた。次いで、充填したシリンジをシリンジポンプ(Harvard Apparatus、モデルPHD2000)に取り付け、空気を抜くためにプライミングした。肝臓被膜のすぐ下約0.5cmにシリンジ針を斜め下にして挿入した。100,000細胞を含有する細胞/マトリゲル混合物10μlをシリンジポンプを用いて肝臓に注入した。確実に注入が完了するように、針を15〜20秒肝臓内に残したままにした。その後、針を肝臓から抜き、注入部位に綿棒を置いて、細胞の漏出または出血を防いだ。マトリゲル/細胞混合物は視認可能な塊を形成し、針の除去後も消失しなかった。次いで、肝葉を腹部内にゆっくり戻し、腹壁を閉じた。HepG2腫瘍マウスについては、腫瘍移植後、1週間に1回血清を採取し、腫瘍成長を観察するためにSEAPアッセイにかけた。ほとんどの研究に関して、SEAP値に基づいて、腫瘍測定値が約4〜8mmと推定される移植後4〜5週間の腫瘍マウスを使用した。HT−29腫瘍マウスについては、組織観察に基づいて、腫瘍が概して長さおよび幅4〜8mmに達した移植後5〜6週間の腫瘍マウスを使用した。
定量的PCRに備えて、製造業者のプロトコールに従ってTriReagent(Molecular Research Center,Cincinnati,OH)中で均質化した組織サンプルから全RNAを単離した。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies)を用いて、約500ngのRNAを逆転写した。ヒト(腫瘍)Aha1発現には、TaqMan Gene Expression Master Mix(Life Technologies)またはVeriQuest Probe Master Mix(Affymetrix)を用いる、ヒトAha1(アッセイID:Hs00201602_m1)およびCycA(Part#:4326316E)用に事前に製造されたTaqMan遺伝子発現アッセイを3連のbiplex反応に用いた。ヒト(腫瘍)EG5発現には、TaqMan Gene Expression Master Mix(Life Technologies)またはVeriQuest Probe Master Mix(Affymetrix)を用いる、ヒトEG5(アッセイID:Hs00189698_m1)およびCycA(Part#:4326316E)用に事前に製造されたTaqMan遺伝子発現アッセイを3連のbiplex反応に用いた。定量的PCRは、7500 FastまたはStepOnePlus Real−Time PCRsystem(Life Technologies)を用いて実施した。ΔΔCT法を用いて、相対遺伝子発現を算出した。
RGD標的化siRNA送達結合体をRGD模倣体#1−PEG−チオエートまたはRGD模倣体#1−PEG−HyNicを用いて生成した。500μgのLau 41648−106ポリマーを8×PEG12−FCit/0.5×アルデヒド−PEG24−FCit(プロトコール1を用いたRGD模倣体#1−PEG−HyNicを含有)またはSPDP−PEG24−FCit(RGD−PEG−チオエート含有)および100μgのAha1 siRNAで修飾した。腎臓RCC腫瘍マウスを記載の通りに作製し、Aha1結合体の単回尾静脈注入により処置した。注入後72時間でマウスを安楽死させ、Trizol試薬を製造業者の推奨に従って用いて、全RNAを腎臓腫瘍から調製した。相対Aha1 mRNAレベルをRT−qPCRにより記載の通りに送達緩衝液のみで処置したマウスと比較して決定した。標的リガンドまたはRGE対照リガンドなしで生成した結合体は、25〜35%の遺伝子発現の減少を示した。RGD標的化結合体は、腫瘍Aha1発現において、50〜70%の遺伝子減少を示した(n=3または4)。
RGD模倣体#1−PEGおよびプロトコール1を用いて、RGD模倣体#1標的化siRNA送達結合体を生成した。500μgのLau 41648−106ポリマーを8×PEG12−FCit/0.5×アルデヒド−PEG24−FCitおよび100μgのAha1 siRNAで修飾した。RGD模倣体#1−PEG−HyNicをこれらのサンプルの標的リガンドとして使用した。転移性(皮下)および正所性腎臓RCC腫瘍の両方を有するマウスを上述の通りに作製し、Aha1結合体の単回尾静脈注入により処置した。注入後72時間でマウスを安楽死させ、Trizol試薬を製造業者の推奨に従って用いて、全RNAを腎臓腫瘍から調製した。腫瘍移植部位における相対ヒト(腫瘍)Aha1 mRNAレベルをRT−qPCRにより上述の通りに決定し、送達緩衝液のみを注入したマウスに対して正規化した。RGD−標的化結合体は、腫瘍Aha1発現において40〜50%の遺伝子減少を示した(n=3または4)。
肝臓に影響を及ぼす癌には、肝細胞(たとえば、肝細胞癌、HCC)に由来する癌および結腸、肺、腎臓または胸部などの他の組織に由来する転移性癌が含まれる。αvβ3インテグリンを発現することおよびRGD結合体にインビトロで結合することが知られている種々の癌細胞型を肝臓に移植した。RGD標的化siRNA送達結合体をRGD模倣体#1−HyNicまたはRDG模倣体#1−PEG−チオエートを用いて生成した。500μgのLau 41648−106ポリマーを8×PEG12−FCit/0.5×アルデヒド−PEG24−FCit(プロトコール1または5)または8×PEG12−FCit−/0.5×SPDP−PEG24−FCit(RGD−PEG−チオエートプロトコール使用)および100μgのAha1 siRNAで修飾した。次いで、担腫瘍マウスに単回用量のAha1 siRNA送達結合体を尾静脈注入により投与して処置した。注入後72時間でマウスを安楽死させ、Trizol試薬を製造業者の推奨に従って用いて、全RNAを肝臓腫瘍から調製した。各腫瘍型について、腫瘍Aha1 mRNAレベルを、送達緩衝液のみを与えたマウスの腫瘍に対して正規化した。RGD標的化結合体は、腫瘍Aha1遺伝子発現において50〜60%の減少を示した(n=3または4)。
ポリマーEmi 1034−68C−1
ポリマーEmi 1034−81F−1
ポリマーLH 1073−20C−1
RGD模倣体#1bおよびプロトコール2を用いて、RGD模倣体#1標的化siRNA送達結合体を生成し、400μgのEmi 1034−68C−1、Emi 1034−81F−1またはLH 1073−20C−1ポリマーを8×PEG12ACit/0.5×アルデヒド−PEG24−ACitおよび80μgのAha1 siRNAで修飾した。RGD模倣体#1bをこれらの生成物の標的リガンドとして使用した。次いで、正所性RCC腫瘍マウスに単回用量のAha1結合体を尾静脈注入により投与して処置した。注入後72時間でマウスを安楽死させ、Trizol試薬を製造業者の推奨に従って用いて、全RNAを肝臓腫瘍から調製した。腫瘍Aha1 mRNAレベルを、送達緩衝液のみを与えたマウスの腫瘍に対して正規化した。
RGD模倣体#1bおよびプロトコール2を用いて、RGD模倣体#1標的化siRNA送達結合体を生成した。8×PEG12−FCit/0.5×アルデヒド−PEG12−FCit(FCitジペプチドでマスクした送達結合体の場合)または8×PEG12−ACit/0.5×アルデヒド−PEG24−ACit(ACitジペプチドでマスクした送達結合体の場合)および80μgのAha1 siRNAを用いて、400μgのEmi 1034−68C−1ポリマーを修飾した。RGD模倣体#1b−HyNicをこれらの生成物の標的リガンドとして使用した。次いで、正所性RCC腫瘍マウスに単回用量のAha1 siRNA送達結合体を尾静脈注入により投与して処置した。注入後72時間でマウスを安楽死させ、Trizol試薬を製造業者の推奨に従って用いて、全RNAを肝臓腫瘍から調製した。腫瘍Aha1 mRNAレベルを、送達緩衝液のみを与えたマウスの腫瘍に対して正規化した。ACitまたはFCitのsiRNA送達結合体の間で遺伝子ノックダウンの有効性に有意差はなかった。RGD標的化結合体は、ACitまたはFCit結合体のそれぞれに関して、腫瘍Aha1遺伝子発現(n=3)において51%または53%の低減を示した。
siRNAは、以下の配列を有していた。
AhaI siRNA:
p=ホスフェート
ヌクレオチドの前のd=2'−デオキシ
s=ホスホロチオエート連結
ヌクレオチドの後のf=2'−F置換
小文字=2'−O−CH3置換
5'にC−6アミノ修飾を有する粗製のセンス鎖RNA(3.4mg、506nmol)を−80℃のEtOH中の酢酸ナトリウム(0.3M)を用いて沈殿させ、凍結乾燥し、300μLの0.2M NaHCO3(pH8〜9)中に溶解した。ジベンゾシクロオクチン−N−ヒドロキシスクシンイミジル(ジベンゾシクロオクチン−S−S−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(DBCO−NHS)、品番761532 Aldrich)(2.86mg、5060nmol)を286μLのDMF中に溶解し、RNA溶液を加えた。反応混合物をよく混合し、室温で2時間進行させた。反応をRP−HPLCを用いてモニターした。反応完了後、反応混合物を乾燥させ、RP−HPLCを用いて精製した。RNA結合体が収率45%(229nmol)で調製された。RNA結合体の純度をRP−HPLCにより決定し(純度:96.6%)、密度をMALDI−TOF/TOFにより確認した(質量計算値:7164.0、質量実測値:7164.8)。
Fmoc−Gly−OH(CAS 29022−11−5)(1.57g、5.28mmol)をTHF(30ml)中に溶解し、撹拌するために氷水浴中に置いた。NHS(0.668g、5.81mmol)およびDCC(1.2g、5.81mmol)を溶液に加え、5分間撹拌し、氷浴を取り外した。反応混合物を20℃で16時間撹拌し、0℃まで1時間冷却し、次いで濾過し、濃縮し、真空下で乾燥させた。粗生成物をTHF(20ml)中に溶解し、H2O(30ml)中のH−Asp(2−PhiPr)−OH(CAS 200336−86−3)(1.328g、5.28mmol)およびNaHCO3(600mg、7.14mmol)の溶液に加えた。1,2−ジメトキシエタン(DME、30ml)を加えて溶液を均質にし、16時間撹拌した。THFおよびDMEをロータリーエバポレータで除去し、残留物をH2O(150ml)で希釈し、3%HClでpH=3まで酸性化し、Fmoc−Gly−Asp(O−2PhiPr)−OH(2)を得た。生成物をEtOAcで5回抽出し、ブラインですすぎ、乾燥させ(Na2SO4)、濃縮し、真空下で乾燥させた。収量2.54g。粗生成物を次工程で使用した。収率は100%と推測される。
ジペプチド2(1.168g、2.2mmol)をDCM(20ml)中に溶解し、撹拌するために氷水浴に置いた。NHS(291mg、2.53mmol)およびDCC(522mg、2.53mmol)を溶液に加え、0℃で5分間、次いで20℃で16時間撹拌した。反応混合物を氷浴で1時間冷却し、濾過し、濃縮し、真空下で乾燥させた。取得したNHS誘導体をDCM(15ml)中に溶解し、4−[3−(Boc−アミノ)プロパン−1−イルオキシ]−アニリン(APOA−Boc、644mg、2.42mmol)(Quelever,Frederic,and KrausOrganic&Biomolecular Chemistry,1(10),1676−1683;2003)およびTEA(175μl、1.25mmol)の溶液に加えた。反応物を20℃で3時間撹拌し、1,4−ジオキサン(10ml)を加えた。すべての揮発性物質を減圧下で除去した。残留物をEtOAc(200ml)中に溶解し、5%KHSO4(2×40ml)、水(1×40ml)、高濃度の重炭酸ナトリウム溶液(1×40ml)およびブライン(1×40ml)で洗浄した。有機層を乾燥させ(Na2SO4)、次いで濃縮し、真空下で乾燥させた。収量1.714g。粗生成物のFmoc−Gly−Asp(O−2PhiPr)−BAPOA−Boc(3)を次工程で使用した。収率は100%と推定される。
化合物3(800mg、1.02mmol)をHClのジオキサン中氷***液(4M、22ml)で処理し、0℃で45分間撹拌した。冷却浴を取り外し、懸濁液を濃縮した。残留物をCHCl3(2.5ml)中に懸濁し、ジエチルエーテル(45ml)を加え、固体を分離した。4−[3−(アミノ)プロパン−1−イルオキシ]−アニリン(APOA)誘導体のHCl塩の再沈殿手順を2回繰り返し、生成物を減圧下で乾燥させた。収率:557mg(92%)。
DCM(8ml)中にBoc−Peg12−CO2H(Quanta Biodesign Limited 10761、803mg、1.12mmol)を含む0℃の溶液に、NHS(193mg、1.68mmol)と、続いてDCC(346mg、1.68mmol)を加えた。冷却を取り外し、24時間撹拌し続けた。反応混合物を−20℃まで冷却し、濾過し、濃縮した。NHS誘導体をDMF(14ml)中の化合物4(667mg、1.12mmol)およびDIEA(154μl、0.89mmol)の溶液で処理し、16時間撹拌し、濾過し、濃縮した。得られた粗残留物をSiO2フラッシュクロマトグラフィーによりDCM:MeOH:酢酸(92.5:7:0.5)で溶出して精製した。収率:575mg(41%)。
化合物5(140mg、0.11mmol)をTFA(3ml)およびH2O(1ml)で処置した。混合物を20分間撹拌し、冷H2Oで希釈し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去した。残留物をEt2Oで3回トリチュレートし、減圧下で乾燥させ、さらに精製することなく使用した。収率:115mg(90%)。
DCM(3ml)中に6(105mg、0.091mmol)およびDIEA(31μl、0.18mmol)を含有する溶液に、Boc−HyNic−NHS(Abrams,M.J.,Juweid,M.,Tenkate,C.I.,Schwartz,D.A.,Hauser,M.M..Gaul,F.E.,Fuccello,A.J.,Rubin,R.H.,Strauss,H.W.,Fischmann,A.J.J.Nucl.Med.31,2022−2028,1990.)(35mg、0.10mmol)を加えた。
混合物を16時間撹拌し、MeOH中のエチルアミン(30μl、2.0M)で処理し、さらに3時間撹拌した(過剰の未反応Boc−HyNic−NHSをクエンチした)。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去した。粗残留物をDMF(3ml)中に溶解し、次いでTEA(400μl)で処置し、16時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータでオイルポンプ減圧下にて除去した。粗生成物を、分取HPLCにより、Thermo Aquasil C18カラム(5u、100Å)を用いて、H2O(0.1%ギ酸)中ACN(0.1%ギ酸)のグラジエント(18〜43%)で30分間かけて溶出して精製した。収率:36mg(34%)。
NHS(589mg、5.12mmol)をDMF(25ml)中の3−グアニジノ安息香酸(1g、4.65mmol;Chandrakumar,N.,et al.US Pat.5,773,646)の撹拌溶液に加え、5分間撹拌し、次いで、DCC(1.056g、5.12mmol)を反応混合物に加えた。撹拌を2時間続け、次いで、この反応混合物を−20℃に30分間冷却し、生成物を濾過し、冷DMFで洗浄し、オイルポンプを用いて減圧下にて乾燥させた。収率:1.283g(100%)。
7(36mg、0.031mmol)およびNaHCO3(13mg、0.155mmol)を含むH2O(1ml)およびTHF(0.9ml)の混合物を3−グアナジノ安息香酸(1)(19.5mg、0.071mmol)のNHSエステルで処理し、22時間撹拌した。次いで、混合物をH2Oで希釈し、THFをロータリーエバポレータで除去した。残留物をpH=3(1%HCl)の水(3ml)中に懸濁させ、固形不純物を濾去した。生成物を減圧下で濃縮し、粗残留物をH2O(0.8ml)、アセトン(0.8ml)およびTFA(1.8ml)の混合物で処理し、40分間撹拌した。アセトン(2ml)による溶液の希釈が完了したら、すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去した。得られた粗生成物を、分取HPLCにより、Thermo Aquasil C18カラム(5u、100Å)を用いて、H2O(0.1%ギ酸)中ACN(0.1%ギ酸)のグラジエント(18〜43%)で30分間かけて溶出して精製した。収率:34mg(89%)。
ジメチルホルムアミド(DMF)、ピペリジン、ジクロロメタン(DCM)、ジエチルエーテル(Et2O)、H2O(HPLC等級)、アセトニトリル(ACN)(HPLC等級)、トリエチルアミン(TEA)、F3CCO2H(TFA)およびトリイソプロピルシラン(TIPS)。PyBOP(ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート)をOakwood Products Inc.から購入した。リンクアミドMBHA樹脂、Fmoc−Gly−OHおよびFmoc−Asp(tBu)−OHをNovabiochemから購入した。4−(N−Fmocパラ−アミノフェノキシ)−酪酸およびジ−boc m−グアニジノ安息香酸を当該技術分野の標準的な技術を用いて合成した。フリット化ポリプロピレン製シリンジをTorviqから購入した。溶媒AはH2O:F3CCO2H 100:0.1v/vであり、溶媒BはCH3CN:F3CCO2H 100:0.1v/vである。Fmoc−Lys(HyNic)−OHを先に記載の通りに合成した。
リンクアミドMBHA樹脂をフリット化ポリプロピレン製シリンジ内に入れ、使用前にDCM中で2時間かき混ぜた。以下の標準固相ペプチド合成条件を用いた。Fmoc脱保護は、10ml(樹脂1mmol当たり)のピペリジン:DMF溶液(20:80v/v)に20分間浸すことにより実施した。アミドカップリングは、樹脂を、0.1M濃度のDMF中の4当量のFmocアミノ酸、4当量のPyBOPおよび10当量のトリエチルアミンに40分間浸すことにより実施した。
精製(90%を超える均質性まで)を、Phenomenex Gemini C18(250×21.2mm、粒径5μm)カラムを備えた分取型Shimadzu HPLCにより、10〜30%のB溶媒グラジエントを用いて20分かけて実施した。Waters xBridge C18(4.6×250mm、粒径5μm)カラムを備える分析用Shimadzu HPLCにより、10〜60%のBグラジエントを用いて50分間かけて、純度を評価した。HPLC分画の凍結乾燥により、TFA塩の精製ペプチドを得た。
A.PEG12/24−FCit−PABOC−PNPの合成
1)ジペプチド前駆体の調製:
a)Fmoc−FCit−OH
THF(5ml)中のFmoc−Phe−OPfp(EMD NovaBiochem 852226)(553mg、1mmol)の溶液を、H2O(2.6ml)中のH−Cit−OH(Sigma−Aldrich C7629)(184mg、1.05mmol)およびNaHCO3(88.2mg、1.05mmol)の溶液に加えた。THF(2ml)を加えて溶液を均質にし、10時間撹拌した。THFをロータリーエバポレータで除去し、残留物をH2O(10ml)およびiPrOH(1ml)で希釈し、3%HClでpH=1まで酸性化した。生成物を9:1のEtOAc:iPrOH溶液で5回抽出し、ブライン:iPrOHの9:1混合物ですすぎ、乾燥させ(Na2SO4)、濃縮し、減圧下で乾燥させた。エーテルでトリチュレートして、313mgの純粋な生成物を得た(57%)。類似の条件をFmoc−ACit−OHの調製に用いることができる。
DCM(150ml)およびMeOH(50ml)中のFmoc−FCit−OH(5.98g、10.97mmol)およびPABA(2.70g、21.95mmol)の溶液をEEDQ(5.43g、21.95mmol)で処理し、20℃で15時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、残留物をEt2Oでトリチュレートし、生成物を濾過し、減圧下で乾燥させた。収率6.14g(86%)。類似の条件をFmoc−ACit−PAB−OHの調製に用いることができる。
Fmoc−FCit−PAB−OH(0.83mmol)をDMF(11ml)中のEt3N(3.5ml)とともに10時間撹拌することによりFmoc脱保護した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで40℃/オイルポンプ減圧下にて除去し、粗生成物を得て、これをさらに精製することなく用いた。
Quanta Biodesign 製品番号:10262
Quanta Biodesign 製品番号:10304
1.PEG12−FCit−PAB−OH
DMF(3ml)中のH2N−FCit−PAB−OH(0.88mmol)およびDIEA(167μl、0.96mmol)の溶液に、DMF(3ml)中のPEG12−NHS(Quanta Biodesign 10262)またはPEG24−NHS(Quanta Biodesign 10304)(0.8mmol)の溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、濾過し、濃縮した。粗製物をCHCl3:MeOH(1:1、5ml)からEt2O(45ml)中に沈殿させ、さらに精製することなく用いた。収率:420mg(53%)。
ジオキサン(4ml)中にPEG12/24−FCit−PAB−OH(419mg、0.42mmol)、(PNP)2CO(Sigma−Aldrich 161691)(766mg、2.52mmol)およびDIEA(263μl、1.52mmol)を含む溶液を暗所で50℃にて15時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレータで除去し、残留DIEAをDMFからの蒸発により除去した。生成物をカラムによりCHCl3:EtOAc:MeOH=4.5:5:0.5、続いてCHCl3中MeOH(12〜15%)のグラジエントの溶出で精製した。収率:390mg(80%)。
A.N−Boc−エチルエトキシアクリラートとプロピルメタクリラートのRAFT共重合(図11)
他の膜活性ポリマーを得るために、Aは、保護されたエチル、プロピルまたはブチルアミノアクリラートであってもよい。Bは、疎水性のより高い(10〜24個の炭素原子、C18を示す)アクリラート、疎水性のより低い(1〜6個の炭素原子、C4を示す)アクリラートまたは疎水性の高いアクリラートと疎水性の低いアクリラートとの組み合わせであり得る。
アミンアクリラート/Cnメタクリラートからなるコポリマーを以下のように合成した。モノマーを秤量し、示した比率でジオキサン中に加えた。AIBN(アゾビス−イソブチロニトリル)を加え、窒素を反応物に通して室温で1時間バブリングした。次いで、反応混合物を60℃の油浴中に3時間置いた。次いで、ポリマーを減圧下で乾燥させた。ポリマーをGPCにより精製した。その後、ポリマー画分を酢酸中2M HCl7mlで室温にて30分間脱保護した。30分後、水15mlを反応混合物に加え、この混合物を3.5kDa MWCO透析チューブに移した。ポリマーをNaClで終夜透析し、次いでdH2Oでもう1日透析した。その後、水を凍結乾燥により除去し、ポリマーをdH2O中に溶解した。
Xmol%のアミン保護ビニルエーテル(たとえば、2−ビニルオキシエチルフタルイミド)をオーブンで乾燥した丸底フラスコの無水ジクロロメタン中に窒素雰囲気下で加える。この溶液に、Ymol%の低級疎水性基(たとえば、プロピル、ブチル)ビニルエーテルおよび任意でZmol%の高級疎水性基(たとえば、ドデシル、オクタデシル)ビニルエーテルを加える(図1)。溶液を−50〜−78℃の浴中に置き、2−ビニルオキシエチルフタルイミドを沈殿させる。この溶液に10mol%のBF3・(OCH2CH3)2を加え、反応を−50〜−78℃で2〜3時間進行させる。メタノール中の水酸化アンモニウム溶液の添加により重合を停止させる。ポリマーを減圧下で乾燥させ、次いで、1,4−ジオキサン/メタノール(2/1)に加える。フタルイミドに対して20mol当量のヒドラジンを加えてアミンから保護基を除去する。溶液を3時間還流させ、次いで、減圧下で乾燥させる。得られた固体を0.5mol/LのHClに溶解し、15分間還流させてポリマーの塩酸塩を生成し、蒸留水で希釈し、さらに1時間還流させる。次いで、溶液をNaOHで中和し、室温まで冷却し、分子セルロースチューブに移し、蒸留水で透析し、凍結乾燥させる。サイズ排除または他のクロマトグラフィーを用いてポリマーをさらに精製することができる。ポリマーの分子量は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーおよび多角度光散乱を用いるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC−MALS)を含めた標準的な手順に従ってカラムを用いて評価する。
1)モノマー合成
2,2'−アゾビス(2−メチルプロピオニトリル)(AIBN、ラジカル反応開始剤)、4−シアノ−4−(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸(CPCPA、RAFT剤)および酢酸ブチルをSigma Aldrichから購入した。プロピルメタクリラートモノマー(Alfa Aesar)を濾過して阻害剤を除去した。
乾燥させた沈殿生成物をDCM(100mg/ml)に溶解した。曇点に到達する直後までヘキサンを加えた(約20ml)。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層(約60%のポリマーである濃稠な液体)を抽出し、ヘキサン中に完全に沈殿させた。ヘキサンをさらに添加することにより、残りの上部の溶液も同様に完全に沈殿させた。両方の分画を遠心分離にかけ、その後、ポリマーを単離し、減圧下で乾燥させた。分画1:MW87,000(PDI1.5)、分画2:MW52,000(PDI1.5〜1.6)。
約10mgのポリマーを0.5mlの89.8%ジクロロメタン、10%テトラヒドロフラン、0.2%トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散度(PDI)を、Shimadzu Prominence HPLCに接続したWyatt Helos II多角度光散乱検出器を用い、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを用いて測定した。粗製ポリマー:MW:73,000(PDI1.7),分画1:MW87,000(PDI:1.5)、分画2:MW52,000(PDI1.5〜1.6)
モノマーのモル供給比は、80 BAEEA:20 プロピルメタクリラート(CAS:2210−28−8)およびモノマーの合計モルを基準にして3%のAIBN触媒であった。BAEEA(6.53g、25.2mmol)(A)、プロピルメタクリラート(0.808g、6.3mmol)(B)、AIBN(0.155g、0.945mmol)およびジオキサン(34.5ml)を攪拌子を入れた50mlのガラスチューブに加えた。化合物AおよびBを実施例16Aiにて前述した通りに調製した。反応は3連で設定した。各溶液を長いピペットを用いて窒素で1時間バブリングした。ピペットを外し、各チューブに慎重に栓をした。各溶液を油浴を用いて60℃で3時間加熱した。各溶液を室温まで冷却し、丸底中で合わせた。粗製ポリマーを減圧下で乾燥させた。MALSにより得た分子量:55,000(PDI2.1)、H1NMRを用いて取得したポリマー組成:74:26 アミン:アルキル。
乾燥させた粗製ポリマーを75%ジクロロメタン、25%テトラヒドロフランおよび0.2%トリエチルアミン中に50mg/mlで加えた。次いで、ポリマーをJordi Gel DVB 104Å〜500mm/22mmカラムで、流速5ml/分および注入10mlを用いて分別した。先の分画を15〜17分で回収し、後の分画を17〜19分で回収した。分画15〜17:MW138,000(PDI1.1)、分画17〜19:MW64,000(PDI1.2)。
約10mgのポリマーを0.5mlの89.8%ジクロロメタン、10%テトラヒドロフラン、0.2%トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散度(PDI)を、Shimadzu Prominence HPLCに接続したWyatt Helos II多角度光散乱検出器を用い、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを用いて測定した。粗製ポリマー:MW:55,000(PDI2.1)、分画15〜17:MW138,000(PDI:1.1)、分画17〜19:MW64,000(PDI1.2)
アミン/ブチル/オクタデシルポリ(ビニルエーテル)ターポリマーを、2−ビニルオキシエチルフタルイミド(5g、23.02mmol)、ブチルビニルエーテル(0.665g、6.58mmol)およびオクタデシルビニルエーテル(0.488g、1.64mmol)のモノマーから合成した。2−ビニルオキシエチルフタルイミドを、電磁攪拌棒を入れ、オーブンで乾燥した200mlの丸底フラスコの無水ジクロロメタン36ml中にアルゴン雰囲気下で加えた。この溶液にブチルビニルエーテルおよびn−オクタデシルビニルエーテルを加えた。モノマーを室温(RT)で完全に溶解し、澄明な均質溶液を得た。次いで、この澄明溶液を含む反応容器を、ACS等級の変性アルコールおよびエチレングリコールの1:1溶液にドライアイスを添加することにより作製した−50℃の浴中に置き、フタルイミドモノマーの視認可能な沈殿を生成させた。約1.5分間の冷却後、BF3・(OCH2CH3)2(0.058g、0.411mmol)を加えて重合反応を開始した。重合が開始すると、フタルイミドモノマーが溶解した。反応を−50℃で3時間進行させた。5mlのメタノール中1%水酸化アンモニウムを添加することにより重合を停止した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。
モノマーのモル供給比は、52.5 BAEAA:47.5 プロピルアクリラート(CAS:925−60−0)およびCTA(CPCPA)の反応開始剤(AIBN)に対する比は、6.66:1であった。BAEAA(2.6851g、10.35mmol)、プロピルアクリラート(1.0742g、9.41mmol)、CPCPA(0.0105g、0.0375mmol)、AIBN(0.000924g、0.00563mmol)および酢酸ブチル(15.9ml)を攪拌子を入れた40mlのガラスバイアルに加えた。セプタムキャップ付きの長い皮下注射針を用いて、溶液を窒素で1時間バブリングした。針を外し、油浴を用いて溶液を80℃で16時間加熱した。各溶液を室温まで冷却した。粗製ポリマーをヘキサン(約8倍量)を用いて沈殿させ、遠心分離にかけた。溶媒をデカントし、ポリマーをヘキサンですすぎ、DCM中に溶解した。溶解したポリマーをヘキサン(約8倍量)で再度沈殿させた。遠心分離後、溶媒をデカントし、ポリマーを減圧下で乾燥させた。MALSにより得た分子量:59,640(PDI1.328)、H1NMRを用いて取得したポリマー組成:55.4:44.6 アミン:アルキル。
50mlの遠心チューブ中で、60%ヘプタン/40%ジオキサンに、試料を溶媒1ml当たり試料25mgで超音波処理を用いて溶解した。試料を10秒間ボルテックス処理し、4時間静置した。上部から溶媒をピペットで除き、沈殿したポリマーをヘキサンで2回すすいだ。試料を高真空を用いて乾燥させた。
少量のポリマーを10mg/mlで、75%DCM、20%THFおよび5%ACNに溶解した。分子量および多分散度(PDI)を、Shimadzu Prominence HPLCに接続したWyatt Helos II多角度光散乱検出器を用い、Phenogel 5μ Linear(2)7.8×300カラムを用いて測定した。粗製ポリマー:MW:59,640(PDI1.328)、分画1:MW80,540(PDI:1.120)。
精製したBOC保護ポリマーを酢酸中2M HCl(7ml)と0.5時間反応させてBOC保護基を除去し、アミンを生じさせた。dH2O15mlを反応物に加え、この溶液を3500MWカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩で24時間、次いでdH2Oで18時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いで、DI H2Oに20mg/mlの濃度で溶解した。ポリマー溶液を2〜8℃で保存した。
モノマーのモル供給比は、65 BAEAA:35 ブチルアクリラート(CAS:141−32−2)およびCTA(CPCPA)の反応開始剤(AIBN)に対する比は、6.66:1であった。BAEAA(0.9876g、3.809mmol)、ブチルアクリラート(0.2607g、2.034mmol)、CPCPA(0.0035g、0.0125mmol)、AIBN(0.000308g、0.00188mmol)および酢酸ブチル(5.3ml)を攪拌子を入れた20mlのガラスバイアルに加えた。セプタムキャップ付きの長い皮下注射針を用いて、溶液を窒素で1時間バブリングした。針を外し、油浴を用いて溶液を80℃で16時間加熱した。各溶液を室温まで冷却した。粗製ポリマーをヘキサン(約8倍量)を用いて沈殿させ、遠心分離にかけた。溶媒をデカントし、ポリマーをヘキサンですすぎ、DCM中に溶解した。溶解したポリマーをヘキサン(約8倍量)で再度沈殿させた。遠心分離後、溶媒をデカントし、ポリマーを減圧下で乾燥させた。MALSにより得た分子量:63,260(PDI1.318)、H1NMRを用いて取得したポリマー組成:68.7:31.3 アミン:アルキル。
50mlの遠心チューブ中で、60%ヘプタン/40%ジオキサンに、試料を溶媒1ml当たり試料25mgで超音波処理を用いて溶解した。試料を10秒間ボルテックス処理し、4時間静置した。上部から溶媒をピペットで除き、沈殿したポリマーをヘキサンで2回すすいだ。試料を高真空を用いて乾燥させた。
少量のポリマーを10mg/mlで、75%DCM、20%THFおよび5%ACNに溶解した。分子量および多分散度(PDI)を、Shimadzu Prominence HPLCに接続したWyatt Helos II多角度光散乱検出器を用い、Phenogel 5μ Linear(2)7.8×300カラムを用いて測定した。粗製ポリマー:MW:63,260(PDI1.318)、分画1:MW65,990(PDI:1.246)。
精製したBOC保護ポリマーを酢酸中2M HCl(7ml)と0.5時間反応させてBOC保護基を除去し、アミンを生じさせた。dH2O15mlを反応物に加え、この溶液を3500MWカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩で24時間、次いでdH2Oで18時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いで、DI H2Oに20mg/mlの濃度で溶解した。ポリマー溶液を2〜8℃で保存した。
すべてのメリチンペプチドは、当該技術分野において標準的なペプチド合成技術を用いて作製した。好適なメリチンペプチドは、全L型アミノ酸、全D型アミノ酸(インベルソ)であり得る。L型またはD型とは別に、メリチンペプチド配列は逆であってよい(レトロ)。
セプタムキャップおよび撹拌子を備えた40mlのシンチレーションバイアル中で、ポリマー(Emi 1034−68C等級、1g、0.0143mmol)を無水ジクロロメタン(Sigma)20mlに溶解した。ペンタフルオロフェノール(Sigma、26.3mg、0.143mmol)およびN,N'−ジシクロヘキシルカルボジイミド(Sigma、29.5mg、0.143mmol)を撹拌しながらフラスコに加えた。脱気用のN2ガスラインおよび針を用いて、N2で系を約10分間パージした。反応物を室温で終夜撹拌した。追加のペンタフルオロフェノール(Sigma、26.3mg、0.143mmol)およびN,N'−ジシクロヘキシルカルボジイミド(Sigma、29.5mg、0.143mmol)をフラスコに加え、系をN2ガスでパージし、反応物を室温で3時間撹拌した。ポリマーをヘキサン(約10倍量、Sigma)で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを微量のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン(約10倍量)で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマーを微量の酢酸エチル(Sigma)に溶解し、ヘキサン(約10倍量)で沈殿させ、遠心分離し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿物を、固体が一定の重量に達するまで高真空下で乾燥させた。
Claims (20)
- 次式によって表される構造を含む、インテグリン陽性腫瘍細胞にRNAiトリガーをインビボで送達するための化合物:
R−A1A2−アミドベンジル−カルバマート−P
式中、Rは、RGDリガンドを含み、A1は、疎水性アミノ酸であり、A2は、アミド結合を介してA1に連結した非荷電親水性アミノ酸であり、該非荷電親水性アミノ酸は、中性pHで非荷電であり、Pは、膜活性ポリアミンを含む。 - A1が、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
- A2が、シトルリン、グリシン、スレオニン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される、請求項1〜2のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記インテグリンがαvβ3インテグリンである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記RGDリガンドがRGD模倣体を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記RGD模倣体が、アミド結合を介してグリシン−アスパラギン酸ジペプチドに連結したグアニジニウム基を含む、請求項6に記載の化合物。
- 生理学的に不安定な可逆的共有結合を介して前記膜活性ポリアミンに連結したポリエチレングリコールをさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記RNAiトリガーが前記膜活性ポリアミンに共有結合している、請求項1〜11のいずれか一項に記載の化合物。
- 以下の段階を含む、インテグリン陽性腫瘍細胞にRNAiトリガーをインビボで送達するための化合物を生成するために、膜活性ポリアミンを可逆的に修飾するための方法:
(a)前記ポリアミン上の1つまたは複数のアミンを、次式によって表される構造をそれぞれ有する1つまたは複数の第1の化合物と反応させることにより、前記1つまたは複数のアミンを可逆的に修飾する段階:
式中、R3は、前記アミンと反応してカルバマートを生成することができるアミン反応性カルボナート部分を含み、R7は、前記アミン反応性カルボナートよりもアミン反応性の低い第1の反応性基を含み、R1は、疎水性アミノ酸の側基であり、R2は、非荷電親水性アミノ酸の側鎖であり、ならびに
(b)R7を、次式によって表される構造を有する第2の化合物と反応させる段階:
式中、R14は、
からなる群から選択され、
Aは、前記R7の第1の反応性基と反応して共有結合を形成することができる第2の反応性基に連結した、4〜44のエトキシ単位を有するポリエチレングリコールを含む。 - R7が、4〜44のエトキシ単位を有するポリエチレングリコール基をさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記ポリアミン上の1つまたは複数のアミンを、次式によって表される構造をそれぞれ有する1つまたは複数の化合物と反応させることにより、前記1つまたは複数のアミンを可逆的に修飾する段階をさらに含む、請求項15〜16のいずれか一項に記載の方法:
PEG−A1A2−アミドベンジル−カルボナート
PEGは、ポリエチレングリコールを含み、A1は、疎水性アミノ酸であり、A2は、アミド結合を介してA1に連結した非荷電親水性アミノ酸であり、該非荷電親水性アミノ酸は、中性pHで非荷電である。 - 前記ポリアミン上のアミンの数の80%以上が可逆的に修飾され、該修飾されたポリアミンが膜活性でない、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。
- RNAiトリガー分子が、生理学的に不安定な結合を介して前記ポリアミンに共有結合される、請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インテグリンがαvβ3インテグリンである、請求項15〜19のいずれか一項に記載の方法。
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