JP2016530298A - γδT細胞の調節 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年9月5日に出願されたU.S.61/874269の119条(e)に基づく優先権の恩典を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部分とみなされ、且つその全体が参照により本出願の開示に組み込まれる。
本発明は、T細胞媒介免疫応答の分野に関する。具体的には、RORγt、IL−7及びBTLAによるγδT細胞のレベル及び活性の調節に関する。
添付の配列表中の物質は、参照することにより本出願に組み込まれるものとする。添付の配列表のテキストファイル名は、BURN1650_1WO_Sequence_Listingであり、2014年9月4日に作成され、9kbである。ファイルは、Windows OSを使用するコンピュータ上で、Microsoft Wordを用いて、評価され得る。
T細胞の特定サブセットの分化は、転写因子であるレチノイド関連オーファン受容体γアイソフォームt(RORγt)(Rorcによってコードされる)の発現により促進される。RORγtは、そのDNA結合ドメイン(DBD)を通して、古典的ROR DNA結合部位へと活性化機能−2(AF2)ドメインを介してLXXLLモチーフを含む核リプレッサーまたはアクチベーターを動員することにより、遺伝子発現をトランス活性化する転写因子のRORファミリーのメンバーである。T細胞において、RORγtは、Il17遺伝子のプロモーターに結合し、活性化させて、炎症性サイトカインIL−17を発現させ、通常のCD4+TH細胞(TH17)の分化を駆動し、自然様(innate−like)ガンマデルタ(γδ)T細胞を維持する。γδT細胞の表現型プロファイリングは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)のメンバーであるCD27の発現に基づいて、2つの大きなサブグループを識別した。したがって、CD27+サブセットは、IFNγを産生し、一方、CD27−サブセットは、IL−17を産生する。発達中に、γδT細胞は、初期の胸腺前駆細胞の生存を制御しかつTCR−γ遺伝子座におけるV(D)J組換えを誘導するIL−7シグナル伝達に大きく依存する。更に、IL−7は、γδT細胞の恒常性を維持し、優先的にCD27−IL−17+サブセットを増殖する。IL−17を産生するγδT細胞の能力は、TCRシグナル伝達、その真実の生来の性質を指す機能とは独立して、胸腺分化の間に取得される。γδT細胞は、生来の受容体および抗原受容体(いずれも、感染に対する迅速な応答を開始する)を通して活性化され得る有効な炎症エフェクターとして現れる。
本発明は、BTLA、IL−7及びRORγtがγδT細胞の活性及びレベルを調節するという発見に関する。具体的には、本発明は、BTLAの発現を調節することにより、γδT細胞の恒常性及び機能を調節する方法を提供する。本発明は、更に、BTLA、RORγt及びIL−7の活性及び発現を調節する薬剤、並びにそのような薬剤のスクリーニングのための方法を提供する。本発明はまた、BTLA、RORγt及びIL−7のモジュレーターを使用して、自己免疫疾患または炎症性疾患を処置するための方法を提供する。
RORγt+リンパ球は、低下したレベルのBTLAを発現する
自然リンパ球集団におけるBTLAの発現を定義するために、GFPを発現するRorcレポーターマウス(Rorc(t)gfp/+マウス)を、細胞のサブセットを識別するために使用した。鼠径リンパ節(iLN)のRORγt+集団内で、BTLA+TCRβ+細胞とBTLAlowTCRβ−細胞を区別した(図1A〜B)。RORγt+細胞間で、BTLAlowTCRβ−集団は、γδT細胞を>95%含み(図1C)、全てのγδT細胞(RORγt+及びRORγt−を問わず)は、概して、通常のT細胞よりも有意に低い(4分の1)レベルのBTLAを発現した(図1D)。しかし、RORγt+γδT細胞とRORγt−γδT細胞の間で表面BTLAに有意な差があった(図1E〜F)。さらに低いレベルのBTLAも、CD27を欠くRORγt+γδT細胞において同定されたが、これは、BTLA発現に対する制御の更なるレベルを示す(図1G〜I)。リンパ節のRORγt+細胞間で、IL−17産生及び自己免疫病態に関連するCD27−γδT細胞サブセットは、最低レベルのBTLAを発現した。
RORγtは、Btlaの転写リプレッサーである
マウス及びヒトにおけるRORγt+自然リンパ球でのBTLAの選択的下方調節は、潜在的な制御性相互作用を示唆した。PP由来のILCにおけるRORγtの最大の発現が、iLN由来のγδT細胞におけるよりも、5.5倍大きいことが観察された(図2A〜B)。このデータは、ILCにおけるBTLAのレベル低下(図8E及び図2C)とあわせて、RORγt発現レベルとBTLA発現レベルとの間に逆相関があることを示唆している。RORγtがBTLA発現をアンタゴナイズするかどうかをテストするために、発明者らはBTLA+マウスT細胞株において、IRES−GFPレトロウイルスを使用して、RORγtを異所的に発現させた。興味深いことに、RORγtの高レベルの異所性発現がBTLA発現の低下をもたらしたことが判明した(図2D〜E)。さらに、これらの細胞におけるRORγtのノックダウンがBTLA発現を回復させたが(図11A)、一方、RORγt阻害剤ジゴキシンによるRORγt発現Jurkat細胞の処置が、タンパク質及びmRNAレベルの両方でBTLAの発現を誘導した(図11B)が、これは、BTLAの、活性RORγt依存性抑制を示す。
BTLAはリンパ節及び胸腺におけるγδT細胞の恒常性を負に制御する
RORγtによるBTLAの制御によってiLNにおけるγδT細胞サブセットの分布に変化が生じるかどうかを決定した。γδT細胞間で、野生型と比較したBTLA欠損iLNにおけるCD27−細胞の頻度の増大が観察され(図3A〜B)、Vγ2発現細胞に対してより顕著な偏りを有し、おそらく、BTLAの非存在下でこれらの細胞の無制限の胚発生を反映している(図3C)。さらに、BTLA欠損iLNにおいて、CD27−γδT細胞サブセットの数の有意な増大が観察されたが、一方、CD27+γδT細胞の数はより少なくなる傾向にあり、全γδT細胞数は、野性型とBtla−/−マウスとで違いがなかった(図3D〜H)。これらのデータは総合して、BTLAが、γδT細胞ニッチ内でCD27−細胞の細胞固有の増殖を制御していることを示す。CD27−の数のこの増大は、主要なγδT細胞サブセットの顕著な再分布をもたらした(図3I)。
IL−7及びBTLAは、負のフィードバックループを形成する
BTLA欠損マウスにおけるCD27−γδT細胞の数の増大は、欠陥のある胸腺発達により、部分的に説明することができるが、しかし、CD27−サブセットの頻度の増大は、所属リンパ節に特異的であった。末梢リンパ器官におけるBTLA欠損マウスのCD27−γδT細胞の増殖が、無制限のIL−7受容体シグナル伝達に起因し得ると論理づけられたが、それはIL−7が、γδT細胞の恒常性に重要であり、そして優先的にCD27−サブセットに影響を与えているからである。この点で、IL−7で処置したγδT細胞の持続した生存率が、未処置の培養物と比較して、エクスビボで培養したリンパ節リンパ球で観察された(図4A)。さらに、BTLA欠損γδT細胞は、野生型の対照と比較したIL−7の刺激による頻度の増大(図4B)及び培養4日後も存続するそれらの能力の増強(図4C〜F)により測定した通り、IL−7の処置に対して、特に、CD27−サブセット内で応答性が過度になったが、これは、CD127の発現レベルの差異によるものではなかった(図16)。したがって、BTLAは、IL−7に対するγδT細胞応答性を制限する。
BTLAは、γδT細胞のIL−17及びTNF産生を制御する
成熟したγδT細胞は、サイトカインであるIL−17及びTNFの分泌を介して炎症反応に寄与する。発明者らは、BTLAが、IL−7で刺激したγδT細胞の機能を阻害するかどうかを、IL−17及びTNF産生に対する影響を調べることにより決定しようとした。予想された通り、γδT細胞サブセット間で、より高い頻度のCD27−細胞がIL−17を発現し、一方、より多くのCD27+細胞がTNFを発現した(図5)。注目すべきことに、IL−7処置は、全てのサブセットにおいて、IL−17及びTNFを発現する細胞の頻度を増強した(図5)。しかしながら、外因性IL−7とは関係なく、BTLA欠損マウス由来の有意に多くのCD27−γδT細胞が、CD27−の野生型細胞と比較してIL−17(図5A〜B)またはTNF(図5C〜D)を産生した。その上、Vγ2発現とは関係なく、より高い頻度のIL−17産生Btla−/−γδTが存在した(図18)。したがって、BTLAは、IL−17及びTNFを産生するγδT細胞のCD27−サブセットの恒常的な事前にプログラムされた能力を、負に制御する。極めて対照的に、BTLA欠損γδT細胞のCD27+サブセット内で、IL−17及びTNF発現細胞の頻度の全体的な低下を観察した(図5)。これらの結果は総合して、BTLAが、恒常性に対する影響とは無関係な、細胞特異的な様式で、γδT細胞サブセットにおけるサイトカイン産生を制御することを示している。
Btla−/−動物は、皮膚炎を起こしやすい
γδT細胞は、皮膚の炎症の確立に重要な役割を果たす。マウスにおいて、IL−17産生γδT細胞は、イミキモド(IMQ)で活性化した乾癬の重要なイニシエーターであることが示され、そして、BTLA欠損が、疾患のこのモデルに感受性を与える可能性があると論理づけられた。急性皮膚炎誘発モデルを使用すると、IMQの単回皮膚適用後3日目に、最小限の影響を受けた野生型動物と比較して、実質的な炎症がBTLA欠損動物の皮膚で観察された。IMQで処置したBtla−/−マウスの皮膚内で、広範な紅斑と有意に多くの表皮過形成があった(図6A〜C)。更に、CD27−Vγ3−(非DETC)でありVγ2を発現する浸潤性γδT細胞(図19)及びLy6G+顆粒球の数は、Btla−/−動物において一致して有意に増大した(図6D〜E)。興味深いことに、Btla−/−マウスは、定常状態で、増大した皮膚γδT細胞を示した(図6D〜E)が、これは、BTLAの欠如によってマウスが皮膚の炎症にかかりやすくなることを示唆している。リンパ節においてCD27−γδT細胞の優先的な増殖はなかった(図6F)が、これは、全身性応答が無く、かつ局所的なBTLA依存性γδT細胞応答があることを示唆している。先に示したように、IMQに対する応答は、CD4+γδT細胞とは無関係であった(図20)。
議論
BTLAがリンパ組織におけるγδT細胞及びILCの恒常性を制御することが実証された。RORγtは、本質的にBTLAのmRNAの転写を抑制し、BTLAの翻訳及び膜発現を制限し、一方、IL−7は、RORγtを相殺するようにBTLAの膜発現を増大させる。これらの観察は、二次リンパ組織における自然リンパ球の数を制御する恒常性の重要な構成成分としてBTLAを定義する。BTLAはまた、成熟リンパ節γδT細胞におけるIL−7依存性増殖及びIL−17及びTNFの産生を制御する。したがって、炎症性刺激に応答して、BTLAは、皮膚炎に対する感受性の増大と相関する調節不全の炎症性γδT細胞の割合を含むBTLA欠損動物において明らかにされている自己免疫病理にブレーキを提供する。
方法及び物質
マウス及びマウス細胞調製物:マウスは、C57BL/6バックグラウンドで交配し、SBMRIの動物施設で飼育した。Rorc(t)gfp/+、Btla−/−、及びB6.SJL−PtprcaPep3/BoyJマウスは、Jackson社からのものであり、Rag2−/−Il2rg−/− マウスは、Taconic社からのものである。BM細胞(2×106/マウス)の細胞移入は、眼窩内送達により実施した。iLN、PPまたは脾臓細胞は、70μmのストレーナーを通して粉砕することにより調製した。ILC及びCD27−γδT細胞は、BDIMag(商標)システム(BD Biosciences社、パロアルト、CA)を用いて濃縮した。BM細胞は、PBSにより大腿骨から洗い出した。以前に記載されているように小腸固有層リンパ球を調製した(Steinberg et al., 2008,J.Exp.Med.205:1463)。
オリゴ配列(5'−3'):
生成物は、TOPO TAクローニングキット(Life Technologies社)を用いてクローニングし、その後、BamHI(New England Biolabs社 Ipswich、MA)及びHindIII(New England Biolabs社)を用いて切り出し、pGL4.17ルシフェラーゼ構築物(Promega社、 Madison, WI)に連結した。
AF2オリゴは、ヌクレオチド位置1429〜1449に及び、DBDオリゴは、ヌクレオチド位置85〜293に及んだ。変異は配列決定で確認した。BTLAプロモーター点突然変異は、ラウンド−ワールドPCR反応において、以下のオリゴ(5'−3')を用いて作製した:
小文字での記載はRORγt部位を示す。Fプライマーにおいて、太字、下線付きの小文字の残基は、ヌクレオチド置換を示す(図11及び図12も参照)。
マウス:ビオチン−CD8a、CD11b、CD11c、CD19、CD27、DX5、I−Ab、Grl、及びTer119。
ヒト:ビオチン−CD8a、CD11 b、CD19、CD27、CD41、HLA−DR、及びTCRap。
マウス:TCRαβ−APC−eFluor(商標)780、TCRαβ−PE、TORO−PE、TCRO−APC、CD27−PECy7、TCRVy2−PerCP−eFluor(商標)710、CD127−PECy7、CD127−Alexa Fluor(商標)647、BTLA−PE、HVEM−APC、DX5−FITC、CD90.2−eFluor(商標)450、CD11b−PerCP−Cy5.5、CD11b−APC、CD11c−APC、B220−APC、CD45.1−FITC、IL−17A−PE、TNF−FITC、TCRVγ3−APC、Ly6G−FITC。
ヒト:BTLA−PE、CD3−eFluor(商標)450、CD117−PerCP−eFluor(商標)710、IL−22−APC、CD127−APC−eFluor(商標)780、CCR6−FITC、CD11b−PECy7。全ての抗体はeBiosciences社(サンディエゴ、CA)から購入した。抗ヒトBTLA−PE及び抗マウスIL−17Aは、BioLegend社(San Diego、CA)から購入した。抗マウスTNF−FITCは、BD Biosciences社からのものであった。
Claims (25)
- γδT細胞のレベル及び/または活性を調節する1つまたは複数の薬剤を対象に投与し、それにより、炎症性疾患または自己免疫疾患を処置することを含む、その必要のある対象における炎症性疾患または自己免疫疾患を処置する方法。
- 前記薬剤が、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)の発現または活性を増大させる、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤が、レチノイド関連オーファン受容体ガンマアイソフォームt(RORγt)の発現または活性を阻害する、請求項2に記載の方法。
- 前記薬剤が、IL−7の発現または活性を増大させる、請求項2に記載の方法。
- 前記薬剤が、γδT細胞によるIL−17またはTNFの産生を調節する、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤が、RORγt−γδT細胞またはRORγt+γδT細胞のレベルを調節する、請求項1に記載の方法。
- 一つの薬剤が、BTLAの発現または活性を増大させ、かつ第二の薬剤が、RORγtの発現または活性を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤が、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)−BTLA相互作用を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 炎症性疾患または自己免疫疾患が、乾癬、多発性硬化症、糖尿病、皮膚炎、セリアック病、癌、硬化性胆管炎、及び関節リウマチからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- BTLAの発現または活性を調節する薬剤を投与することを含む、γδT細胞のレベル及び/または活性を調節する方法。
- 前記薬剤が、BTLAの発現または活性を増大させ、かつγδT細胞のレベル及び/または活性を増大させる、請求項10に記載の方法。
- 前記薬剤が、IL−7の発現もしくは活性を増大させるか、またはRORγtの発現もしくは活性を阻害する、請求項11に記載の方法。
- 前記薬剤が、HVEM−BTLA相互作用を阻害する、請求項11に記載の方法。
- 前記薬剤が、BTLAの発現または活性を低下させ、かつγδT細胞のレベル及び/または活性を低下させる、請求項10に記載の方法。
- 前記薬剤が、IL−7の発現もしくは活性を阻害するか、またはRORγtの発現もしくは活性を増大させる、請求項14に記載の方法。
- BTLAの発現または活性を調節する薬剤を投与することを含む、γδT細胞のIL−17またはTNF産生を調節する方法。
- 前記薬剤が、BTLAの発現または活性を増大させ、かつγδT細胞のIL−17またはTNF産生を低下させる、請求項16に記載の方法。
- 前記薬剤が、IL−7の発現もしくは活性を増大させるか、またはRORγtの発現もしくは活性を阻害する、請求項17に記載の方法。
- 前記薬剤が、HVEM−BTLA相互作用を阻害する、請求項17に記載の方法。
- 前記薬剤が、BTLAの発現または活性を阻害し、かつγδT細胞のIL−17またはTNF産生を増大させる、請求項16に記載の方法。
- 前記薬剤が、IL−7の発現もしくは活性を阻害するか、またはRORγtの発現もしくは活性を増大させる、請求項20に記載の方法。
- (a)リンパ球培養物を薬剤と接触させること;
(b)工程(a)からの培養物中のγδT細胞のレベルを決定すること;及び
(c)(b)からのγδT細胞のレベルを、前記薬剤と接触していないリンパ球培養物中のγδT細胞のレベルと比較すること
を含む、BTLAアゴニストをスクリーニングする方法であって、
前記薬剤と接触したリンパ球培養物中のγδT細胞の増大したレベルは、前記薬剤がBTLAアゴニストであることを示す、
方法。 - リンパ球培養物が、自然リンパ系細胞(ILC)及びCD27−γδT細胞について濃縮されている、請求項22に記載の方法。
- γδT細胞のレベルが、γδT細胞表面マーカーを有する細胞を同定することによって決定される、請求項22に記載の方法。
- 細胞表面マーカーが、BTLA、CD27、及びRORγtからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
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