JP2016530232A - Mir−34活性のバイオマーカー - Google Patents
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Abstract
本発明は、miR−34がp53に依存しないという発見の一部分に基づく。miR−34がTP53に依存しない腫瘍抑制経路において機能することが発見されている。具体的には、miR−34によって誘導される癌細胞の成長の阻害は、p53が正常な及びp53欠乏の細胞において同様であることがわかった。したがって、miR−34は、p53から離れた腫瘍抑制の間においてより中心的な役割を有する。p53がない場合には、miR−34は特定の他のmiRNAとは異なり、限定されないが、p21WAF1/CIP1(CDKN1A)、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3及びMDM2を含む、p53によって調節されることが知られている遺伝子の上方制御並びにHDAC1の下方制御を引き起こすために十分である。したがって、これらのバイオマーカーはmiR−34活性のバイオマーカーとして使用され得る。本発明は、さらに、これらのバイオマーカーの幾つかがmiR−34活性への治療反応のために不可欠であり、それゆえにmiR−34活性の必須のバイオマーカーであるという発見に基づく。【選択図】 図1
Description
<関連出願への相互参照>
本出願は、2013年6月24日に出願された米国仮特許出願第61/838,847号及び2013年8月28日に出願された米国仮特許出願第61/870,997号への優先権の利益を主張し、その内容はそれら全体の参照によって本明細書中に組み込まれる。
本出願は、2013年6月24日に出願された米国仮特許出願第61/838,847号及び2013年8月28日に出願された米国仮特許出願第61/870,997号への優先権の利益を主張し、その内容はそれら全体の参照によって本明細書中に組み込まれる。
<米国政府の権利>
本発明は、アメリカ国立衛生研究所認可番号1R43CA134071及び1R43CA137939の下での研究の実施から作成された。米国政府は本発明の権利を有し得る。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所認可番号1R43CA134071及び1R43CA137939の下での研究の実施から作成された。米国政府は本発明の権利を有し得る。
<配列表>
本出願は、EFS−Web経由でASCIIフォーマットにて提出された配列リストを含み、その全体の参照によって本明細書中に組み込まれる。6月23日に作成された前記ASCIIのコピーは「112172−242 Sequence Listing TEXT」と命名され、30,360バイトである。
本出願は、EFS−Web経由でASCIIフォーマットにて提出された配列リストを含み、その全体の参照によって本明細書中に組み込まれる。6月23日に作成された前記ASCIIのコピーは「112172−242 Sequence Listing TEXT」と命名され、30,360バイトである。
本発明は、一般に癌治療に関し、より具体的には、疾患の処置、診断、予後、及び/又は疾患の進行の評価における、miR−34のようなマイクロRNA(miRNA)分子を含む方法と組成物に関する。
マイクロRNA−34(miR−34)は、多くの固形及び血液癌のタイプの機能喪失を示す有力な腫瘍抑制因子である(非特許文献1−3)。それは、おそらく、増殖、老化、アポトーシス及び転移を制御する多くの腫瘍遺伝子を抑制することにより広範囲の癌細胞を阻害する (非特許文献4−5)。miR−34は、さらに、癌幹細胞の成長を妨げることができ(非特許文献6−7)、これはmiR−34治療の発達のための強い論理的根拠を提供する。miR−34の治療への応用のための証拠は、合成miR−34模倣物を詰めたナノ粒子の全身送達に反応して強固な腫瘍阻害を示した、肺、肝臓、前立腺、及びリンパ腫のネズミ科の腫瘍モデル中で生み出された (非特許文献5、7−10)。miR−34に基づく治療は、現在、第I相の臨床試験中である。
miR−34の役割への多くの見識が、腫瘍抑制因子TP53(p53)が3つのmiR−34ファミリーであるmiR−34a/b/cのすべての発現を転写的に誘導することを実証する最近の報告により加えられた(非特許文献11−15)。TP53は、さらに、miR−215、miR−192及びmiR−194の内在性のレベルを高め、それらはすべて、培養中の癌細胞の増殖を阻害する能力を有する (非特許文献16−18)。miR−215とmiR−192は異なるゲノムの遺伝子座にコードされているが、それらは同一のシード配列(seed sequences)(配列相同性が全体の90.5%)を共有しており、それゆえにmiR−215/192とまとめて呼ばれることがある。幾つかのmiRNAについて、miR−215/192は、プロテアソーム分解によってTP53の安定性を負に制御するユビキチンリガーゼであるMDM2(HDM2とも呼ばれる)を抑制することによりTP53の活性を刺激するため、TP53とmiRNA間の正の制御は、相互的である(非特許文献18−20)。miR−215/192と同様に、TP53を不活性化するNADに依存する脱アセチル化酵素であるSIRT1(silent information regulator 1)、TP53のトランス活性化を負に制御するMDM2様のタンパク質をコードするMDM4、及びTP53のDNA結合部位の一部に結合する転写因子をコードするYY1を抑制することによってTP53への正のフィードバックループにおいてmiR−34aは機能する(非特許文献21−22)。それゆえに、TP53がmiR−34によって誘導される表現型の機能の必要条件であり得る。
癌におけるTP53の高い変異率を考慮すると、この必要条件が無傷の(intact)TP53を有する患者へのmiR−34に基づく治療の適用を実質的に制限するだろう。利用可能なデータは、TP53がmiR−215/192の阻害活性を増強するという見方を支持するが(非特許文献18)、miR−34によって誘導される腫瘍の抑制におけるTP53の必要性は議論されており、TP53の実際の寄与は不明である。
したがって、著しい進歩が様々な癌の診断と処置におけるマイクロRNAの使用において作られているが、特定のマイクロRNA治療は、ある部分母集団において有効でない、又は効果が少ないことがある。ある部分母集団において、たとえば、TP53欠乏細胞又は癌のタイプにおいて、よりよい解決方法が必要である。患者が特定の治療に反応し得るかどうかを予測するため、又は患者が特定の治療に反応しているかどうかを迅速に決定するための能力は、よりよい結果を提供するが、癌の処置に関する時間と費用を減少し得る。
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本発明は、miR−34の機能がp53に依存しないという発見の少なくとも一部分に基づく。miR−34がTP53に依存しない腫瘍抑制経路において機能することが発見されている。具体的には、miR−34によって誘導される癌細胞の成長の阻害は、p53が正常な及びp53欠乏細胞において同様であることがわかった。したがって、miR−34は、p53から離れた腫瘍抑制の間においてより中心的な役割を有する。p53がない場合には、miR−34は特定の他のmiRNAとは異なり、限定されないが、p21WAF1/CIP1(CDKN1A)、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3及びMDM2を含む、p53によって調節されることが知られている遺伝子の上方制御並びにHDAC1の下方制御を引き起こすために十分である。したがって、本発明は、これらのバイオマーカーがmiR−34活性のバイオマーカーとして使用され得ることを提供する。様々な実施形態において、必須のバイオマーカーはDNA、mRNA又はタンパク質(あるいはその組み合わせ)である。必須のバイオマーカーがDNAである場合、それは、発現抑制されず、いずれかの不活性化する変異がない遺伝子のDNAであり得る。さらに、本発明は、これらのバイオマーカーの幾つかがmiR−34活性への治療反応のために不可欠であり、それゆえにmiR−34活性の必須のバイオマーカーであるという発見に基づく。
<処置の方法>
幾つかの実施形態において、癌を有する被検体を処置する方法が提供される。処置の2つの一般的な方法が提供される。方法の第1のセットは、miR−34治療が被検体の適切な処置の方法であるかどうかを決定するために、miR−34活性の1つ以上の必須のバイオマーカーを使用するスクリーニングの工程を含む。方法の第2のセットは、miR−34治療薬による被検体の処置に対する反応を決定するために、被検体のmiR−34活性のバイオマーカーの相対的なレベルを測定する工程を含む。
幾つかの実施形態において、癌を有する被検体を処置する方法が提供される。処置の2つの一般的な方法が提供される。方法の第1のセットは、miR−34治療が被検体の適切な処置の方法であるかどうかを決定するために、miR−34活性の1つ以上の必須のバイオマーカーを使用するスクリーニングの工程を含む。方法の第2のセットは、miR−34治療薬による被検体の処置に対する反応を決定するために、被検体のmiR−34活性のバイオマーカーの相対的なレベルを測定する工程を含む。
幾つかの実施形態において、第1のセットは、癌を有する被検体を処置する方法を提供し、前記方法は:
(a)miR−34活性の少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在又は不在について被検体をスクリーニングする工程;
(b)miR−34活性のための必須のバイオマーカーが存在すると決定される場合に、被検体にmiR−34治療薬を投与する工程;及び
(c)miR−34活性のための必須のバイオマーカーが存在しない場合、被検体に代替療法を施す工程、
を含み、それによって被検体を処置する。少なくとも1つの必須のバイオマーカーは、p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2及びHDAC1からなる群から選択され得る。幾つかの態様において、少なくとも1つの必須のバイオマーカーはp21CIP1/WAF1を含み、また、幾つかの態様において、被検体がスクリーニングされる単独の必須のバイオマーカーはp21CIP1/WAF1である。例えば、少なくとも1つの必須のバイオマーカーは、p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3及びMDM2からなる群から選択され得、少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在は、参照レベル以上の発現レベル又は活性レベルを含む。別の例において、少なくとも1つの必須のバイオマーカーはHDAC1であり、少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在は、参照レベル以下の発現レベル又は活性レベルを含む。
(a)miR−34活性の少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在又は不在について被検体をスクリーニングする工程;
(b)miR−34活性のための必須のバイオマーカーが存在すると決定される場合に、被検体にmiR−34治療薬を投与する工程;及び
(c)miR−34活性のための必須のバイオマーカーが存在しない場合、被検体に代替療法を施す工程、
を含み、それによって被検体を処置する。少なくとも1つの必須のバイオマーカーは、p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2及びHDAC1からなる群から選択され得る。幾つかの態様において、少なくとも1つの必須のバイオマーカーはp21CIP1/WAF1を含み、また、幾つかの態様において、被検体がスクリーニングされる単独の必須のバイオマーカーはp21CIP1/WAF1である。例えば、少なくとも1つの必須のバイオマーカーは、p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3及びMDM2からなる群から選択され得、少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在は、参照レベル以上の発現レベル又は活性レベルを含む。別の例において、少なくとも1つの必須のバイオマーカーはHDAC1であり、少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在は、参照レベル以下の発現レベル又は活性レベルを含む。
幾つかの実施形態において、第2のセットは、miR−34治療薬で処置されている被検体の癌治療に対する反応を決定する方法を提供し、前記方法は:
(a)被検体のmiR−34活性の少なくとも1つのバイオマーカーの第1のレベルを測定する工程;
(b)被検体にmiR−34治療薬を投与する工程;
(c)被検体のバイオマーカーの第2のレベルを測定する工程;
(d)第1のレベルと比較して第2のレベルがmiR−34治療の効果を示す場合、被検体にさらにmiR−34治療薬を投与する工程;及び
(e)第1のレベルと比較して第2のレベルがmiR−34治療の不十分な効果を示す場合、被検体に代替療法を施す工程、
を含み、それによって癌治療への被検体の反応を決定し、適切な処置を提供する。バイオマーカーは、p21CIP1/WAF1、p53、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2及びHDAC1からなる群から選択され得る。幾つかの態様において、工程(b)及び(d)のmiR−34治療薬は同じものである。
(a)被検体のmiR−34活性の少なくとも1つのバイオマーカーの第1のレベルを測定する工程;
(b)被検体にmiR−34治療薬を投与する工程;
(c)被検体のバイオマーカーの第2のレベルを測定する工程;
(d)第1のレベルと比較して第2のレベルがmiR−34治療の効果を示す場合、被検体にさらにmiR−34治療薬を投与する工程;及び
(e)第1のレベルと比較して第2のレベルがmiR−34治療の不十分な効果を示す場合、被検体に代替療法を施す工程、
を含み、それによって癌治療への被検体の反応を決定し、適切な処置を提供する。バイオマーカーは、p21CIP1/WAF1、p53、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2及びHDAC1からなる群から選択され得る。幾つかの態様において、工程(b)及び(d)のmiR−34治療薬は同じものである。
被検体は肺癌、膵癌、肝臓の癌、肝細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、食道癌又は結腸癌を有し得る。幾つかの態様において、被検体はp21CIP1/WAF1陽性癌細胞を有すると決定された。例えば、被検体はp21CIP1/WAF1陽性癌細胞及びp53欠乏癌細胞を有すると決定され得る。例えば、被検体は、p21CIP1/WAF1野性型(+/+)又はヘテロ接合性の(+/−)遺伝子及びホモ接合性に不活化された(−/−)p53遺伝子を有する癌細胞を有すると決定され得る。別の例において、被検体は、p21CIP1/WAF1野性型(+/+)又はヘテロ接合性の(+/−)遺伝子を有し、機能的なp53タンパク質を欠失している癌細胞を有すると決定され得る。別の例において、被検体は、機能的なp21CIP1/WAF1タンパク質及び機能的でないp53タンパク質を有するか又はp53タンパク質を欠失していると決定され得る。被検体は、血液系腫瘍、例えば、白血病(急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性単球性白血病(AMoL)又はその他の白血病);リンパ腫(ホジキンリンパ腫(4つのすべてのサブタイプ)、濾胞性リンパ腫、B細胞リンパ腫又は非ホジキンリンパ腫(すべてのサブタイプ));骨髄腫(例えば多発性骨髄腫);あるいは骨髄異形成症候群を有し得る。
miR−34治療薬は、miR−34を含み得、さらに随意にmiR−215及びmiR−192の少なくとも1つを含み得る。miR−34は、miR−34a、b又はc、あるいはmiR−449a、b、又はcであり得る。細胞増殖のレベルは、miR−34治療薬の投与後に減少し得る。腫瘍のサイズ又は進行は、miR−34治療薬の投与後に減少あるいは遅くなり得る。
幾つかの態様において、代替療法は、非miR−34マイクロRNA治療又は非マイクロRNA治療になり得る。例えば、代替療法は、中断された治療、化学療法、放射線療法、手術、緩和療法、miR−215及びmiR−192から選択され得る。代替療法は、非miR−34マイクロRNA治療及び非マイクロRNA治療の任意の組み合わせになり得る。例えば、代替療法は、miR−215及びmiR−192の少なくとも1つを含み得る。
本発明は、miR−34の機能がp53に依存しないという発見の少なくとも一部分に基づく。miR−34がTP53に依存しない腫瘍抑制経路において機能することが発見されている。具体的には、miR−34によって誘導される癌細胞の成長の阻害は、p53が正常な及びp53欠乏細胞において同様であることがわかった。したがって、miR−34は、p53から離れた腫瘍抑制の間においてより中心的な役割を有する。p53がない場合には、miR−34は特定の他のmiRNAとは異なり、限定されないが、p21WAF1/CIP1(CDKN1A)、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3及びMDM2を含む、p53によって調節されることが知られている遺伝子の上方制御並びにHDAC1の下方制御を引き起こすために十分である。したがって、これらのバイオマーカーは、miR−34活性のバイオマーカーとして使用され得る。さらに、本発明は、これらのバイオマーカーの幾つかがmiR−34活性への治療反応のために不可欠であり、それゆえにmiR−34活性の必須のバイオマーカーであるという発見に基づく。p21CIP1/WAF1がmiR−34の下流の重要なエフェクター分子であることがさらにわかった。p21CIP1/WAF1とは対照的に、p53は、p53に依存しない腫瘍抑制因子として機能するためにmiR−34によってバイパスされ得る。図1は、miR−34及びp53の一般的で異なる抑制経路を例証する。
miR−34の置換は、癌を処置するための有望なアプローチとして現れた。miR−34はp53によって転写的に誘導される。しかしながら、miR−34は、miR−34の表現型に必要であると疑われた正のフィードバックループのp53をさらに活性化する。p53及びmiR−34の間の機能的な関係と、miR−215/192を含む他のp53によって制御されるmiRNAのそれは、それらの内在性のp53の状態に関してのみ異なる同質遺伝子的な癌細胞株の集団を使用して決定された。miR−34によって誘導される癌細胞の成長の阻害は、p53が正常な及びp53欠乏細胞と同様である。miR−34とは対照的に、miR−215/192はp53を通して機能する。p53がない場合には、miR−215/192ではなくmiR−34が、細胞周期依存性キナーゼ阻害物質p21CIP1/WAF1(CDKN1A)の上方制御を誘導するのに十分である。そのため、p53の他の下流の標的とは異なり、miR−34は、p53が正常な及びp53欠乏細胞と同様の活性を示すので、miR−34はそれらのp53の状態に関係なく患者の治療において有効になり得る。miR−34のp53に依存しない機能は、さらに重要な治療の意味合いを有し、患者が特定の治療にどれくらいよく反応しているかを決定することと同様に、患者が特定の治療に反応する可能性が最も高いことを予測することを支援し得る。
ヒストンデアセチラーゼ1(HDAC1)は、miR−34の直接的な標的として同定され、HDAC1の抑制は、p21CIP1/WAF1の誘導をもたらし、miR−34の細胞の表現型を模倣する。p21CIP1/WAF1の枯渇は、特にmiR−34が癌細胞の増殖を阻害する能力を妨げる。データは、miR−34が以前にp53のために用意された腫瘍抑制因子の経路を制御し、それらのp53の状態に関係なく癌患者に魅力的な治療の戦略を提供することを示唆する。
確立されたパラダイムは、miR−34を、細胞周期の進行及びアポトーシスに関連する遺伝子を抑制することにより、TP53の下流で機能する細胞のエフェクター分子としてみなしている。しかしながら、我々のデータは、miR−34がp53に依存せずp53と平行して、より中心的な役割を有することを示唆する。この命題の支持は本明細書中で提供される。異なるmiR−34経路の存在は、miR−34がない場合での無傷なp53の反応を示すmiR−34ノックアウトマウスによってもたらされた観察(Concepcion et al.,PLoS Genet 8(7):e1002797(2012))と同様に、miR−34a遺伝子のTP53に依存しない転写制御によってさらに実証される(Christofferson et al.,Cell Death Differ 17(2):236−45(2009))。miR−34及びp53は、重複する機能を備えた2つの経路の界面を作り、転写によるp53、並びにSIRT1、YY1及びMDM4の転写後抑制によるmiR−34のように、相互に互いに活性化してもよい。
p53欠乏細胞において、miR−34によって誘導されるp21CIP1/WAF1の発現は、HDAC1抑制の間接的な効果である。HDAC1は以前にp21遺伝子(CDKN1A)の制御に関連付けられた。証拠の支持は、p21CIP1/WAF1及び、p21CIP1/WAF1の発現がHDAC阻害剤のトリコスタチンA(TSA)での処置の後に誘導されるp53変異ヒト骨肉腫細胞の高められたレベルを示すHDAC1欠乏胚性幹細胞に由来する(Sowa et al.,Biochem Biophys Res Commun(1997);Lagger et al.,Embo J 21(11):2672−81(2002))。これらの研究において、CDKN1Aプロモーター中の2つのSp1結合部位がTSAに反応する要素として同定され、これはTP53がない場合において、Sp1がCDKN1A遺伝子の活性化を制御する転写因子であることを示唆する。我々のデータは、p21CIP1/WAF1がmiR−34aの機能のための機能的な必要条件であることを示す。しかしながら、p21CIP1/WAF1の枯渇の効果は細胞株間で変化する。p21CIP1/WAF1の枯渇は、RKO細胞のmiR−34aの抗増殖活性を完全に無効にし、SW48細胞中においては単にそれを弱めた。同様に、miR−34aの阻害活性は、p21CIP1/WAF1を欠くTP53陰性Hep3B肝細胞癌細胞中で完全には減少しなかったが、著しく減少した(データは示していない)。対照的に、従来の研究は、HCT116p21−/−細胞中のp21CIP1/WAF1に依存するmiR−34aの表現型を明らかにしなかった(非特許文献13)。したがって、p21CIP1/WAF1の枯渇の効果は、細胞株を横断して変化するように見える。miR−34の表現型は、癌の変化にさらされる他の分子のイベントによってさらに制御され得る。CDKN1Aの欠失はマウスにおける自発的な腫瘍形成をもたらし得るが、ヒトの癌における体細胞の機能喪失の変異はまれである(Lagger et al.,Embo J 21(11):2672−81(2002))。しかしながら、発現の減少が、結腸直腸、頚部、食道及び肺癌において認められ、これらの幾つかにおいて、これはCDKN1Aプロモーターの高メチル化による(Dotsch et al.,Cold Spring Harb Perspect Biol 2(9):a004887(2010);Toledo et al.,Cancer Cell 9(4):273−85(2006))。したがって、miR−34の模倣物は、miR−34治療に対する反応の「予測的な」マーカー、つまりmiR−34活性に必須のマーカーとして考慮されなければならないCDKN1Aの発現抑制又は減少を伴う癌においてそれほど活性がないことがあり得る。
p21CIP1/WAF1のmiR−34特異的な誘導は、p53が正常な及びp53欠乏細胞を阻害するその不変の能力についての説明を提供する。これは、p53がない場合においてp21WAF1/CIP1を誘導することができないmiR−215/192とは対照的であり、従って、TP53−/−細胞における阻害活性を減少させる。miR−215/192で生成されたデータは、miR−215/192が、MDM2の抑制によって、TP53への正のフィードバックループ中で機能するという以前に記載されたモデルに適合した(非特許文献18)。興味深いことに、SIRT1、YY1又はMDM4によるmiR−34からTP53への報告された正のフィードバックは、これらのタンパク質がmiR−34aによって発現され、下方制御されたという事実にもかかわらず、抗増殖のmiR−34の表現型に寄与するようには見えない。これらの遺伝子産物に対するsiRNAの適度な効果を考慮すると、それらは、即時の抗増殖miR−34反応に関与しないかもしれないが、後の時点で追加効果を明らかにすることがある。
癌細胞の増殖のmiR−34aによって誘導される阻害はp53に依存せず、これはmiR−34治療がp53の状態に関係なく癌患者に有効であることを示唆する。HDAC1を抑制し、p21CIP1/WAF1を誘導するmiR−34の能力は、中心的な腫瘍抑制因子としてのその立場を著しく強くし、他の重要な発癌経路においてその機能を補完する。
<スクリーニング及び処置の方法>
従って、本発明は癌を有する被検体を処置するための方法及び組成物を提供する。本発明は、さらに、治療反応を評価する又は予測することを含む、miR−34治療薬で処置される又は処置されている被検体の癌治療に対する反応を決定するための方法を提供する。
従って、本発明は癌を有する被検体を処置するための方法及び組成物を提供する。本発明は、さらに、治療反応を評価する又は予測することを含む、miR−34治療薬で処置される又は処置されている被検体の癌治療に対する反応を決定するための方法を提供する。
本発明は、さらに、miR−34活性のための予測的なバイオマーカーとしてのp21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2又はHDAC1を、単独、あるいは組み合わせた使用を提供する。本発明は、さらに、miR−34治療薬を投与することを含む癌治療に対する反応を決定するためのバイオマーカーとしてのp21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2又はHDAC1を単独、あるいは組み合わせた使用を提供する。使用において、miR−34はmiR−34a、b又はc、あるいはmiR−449a、b、又はcであり得る。
幾つかの実施形態において、癌を有する被検体を処置する方法は、miR−34活性に必須の少なくとも1つのバイオマーカーの存在又は不在についての被検体のスクリーニングを含む。幾つかの実施形態において、前記方法は:
(a)miR−34活性の少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在又は不在について被検体をスクリーニングする工程;
(b)miR−34活性のための必須のバイオマーカーが存在すると決定される場合に、被検体にmiR−34治療薬を投与する工程;及び
(c)miR−34活性のための必須のバイオマーカーが存在しない場合、被検体に代替療法を施す工程、
を含み、それによって被検体を処置する。
(a)miR−34活性の少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在又は不在について被検体をスクリーニングする工程;
(b)miR−34活性のための必須のバイオマーカーが存在すると決定される場合に、被検体にmiR−34治療薬を投与する工程;及び
(c)miR−34活性のための必須のバイオマーカーが存在しない場合、被検体に代替療法を施す工程、
を含み、それによって被検体を処置する。
幾つかの実施形態において、必須のバイオマーカーは、p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2又はHDAC1であり得る。例えば、被検体は、p21CIP1/WAF1の存在又は不在についてスクリーニングされ得、p21CIP1/WAF1が存在すると決定された場合、miR−34治療薬が被検体に投与され得る。幾つかの実施形態において、細胞増殖のレベルは、miR−34治療薬の投与後に減少する。幾つかの実施形態において、被検体はp21陽性癌細胞を有することが決定された。例えば、被検体はp21陽性及びp53欠乏癌細胞を有することが決定された。例えば、被検体はp21CIP1/WAF1野性型(+/+)又はヘテロ接合性の(+/−)遺伝子及びホモ接合性に不活化された(−/−)p53遺伝子を有する癌細胞を有することが決定され得る。別の例において、被検体はp21CIP1/WAF1野性型(+/+)又はヘテロ接合性の(+/−)遺伝子を有し、機能的なp53タンパク質を欠失している癌細胞を有することが決定され得る。別の例において、被検体は機能的なp21CIP1/WAF1タンパク質及び機能的でないp53タンパク質を有するか又はp53タンパク質を欠失していると決定され得る。p21陽性及びp53欠乏であり得る癌の例は、p21陽性/p53陰性の癌並びに、非小細胞肺癌(NSCLC)、前立腺癌、膀胱癌(Koga et al.,Jpn J Cancer Res 91(4):416−23(2000))、食道癌(Nakamura et al.,Dis Esophagus 17(4):315−21(2004));乳癌(Thor et al.,Breast Cancer Res Treat 61(1):33−43(2000))及び胃癌(Xiangming et al.,148(2):181−8(2000))を含む、様々なタイプの癌を含む。
幾つかの実施形態において、miR−34治療薬で処置されている被検体の癌治療に対する反応を決定する方法は:
(a)被検体のmiR−34活性の少なくとも1つのバイオマーカーの第1のレベルを測定する工程;
(b)被検体にmiR−34治療薬を投与する工程;
(c)被検体のバイオマーカーの第2のレベルを測定する工程;
(d)第1のレベルと比較して第2のレベルがmiR−34治療の効果を示す場合、被検体にさらにmiR−34治療薬を投与する工程;及び
(e)第1のレベルと比較して第2のレベルがmiR−34治療の不十分な効果を示す場合、被検体に代替療法を施す工程、
を含み、それによって癌治療に対する被検体の反応を決定し、被検体を処置する。
(a)被検体のmiR−34活性の少なくとも1つのバイオマーカーの第1のレベルを測定する工程;
(b)被検体にmiR−34治療薬を投与する工程;
(c)被検体のバイオマーカーの第2のレベルを測定する工程;
(d)第1のレベルと比較して第2のレベルがmiR−34治療の効果を示す場合、被検体にさらにmiR−34治療薬を投与する工程;及び
(e)第1のレベルと比較して第2のレベルがmiR−34治療の不十分な効果を示す場合、被検体に代替療法を施す工程、
を含み、それによって癌治療に対する被検体の反応を決定し、被検体を処置する。
工程(b)及び(d)において投与されたmiR−34治療薬は、同じもの又は異なるものであり得る。代替療法は、(i)非miR−34マイクロRNA治療、(ii)非マイクロRNA治療又は(iii)(i)及び(ii)の任意の組み合わせであり得る。例えば、代替療法は、miR−215又はmiR−192の少なくとも1つを含み得る。幾つかの実施形態において、反応を決定することは、別の処置と比較して、処置の時間が長くかかる又は短くて済むということを決定することであり得る。
<miR−34治療薬>
マイクロRNA(miRNA)は、多数の遺伝子産物及び細胞経路を制御することによって翻訳後に遺伝子発現を調節し、細胞運命を決定する小さな非翻訳領域の自然に生じるRNA分子である。
マイクロRNA(miRNA)は、多数の遺伝子産物及び細胞経路を制御することによって翻訳後に遺伝子発現を調節し、細胞運命を決定する小さな非翻訳領域の自然に生じるRNA分子である。
miR−34が、癌治療及び他の疾患と障害の治療のための介入点を示す多数の細胞活性の制御に関与することは以前に実証された(米国特許第7,888,010号及び8,173,611号、これらは参照によって本明細書中に組込まれる)。miR−34は、さらに、多くの重要な腫瘍遺伝子の発現を制御するその能力によって腫瘍抑制因子として機能する(米国特許出願公開第2009/0227533号、これは参照によって本明細書中に組込まれる)。miR−34によって直接的又は間接的に制御される癌関連遺伝子は、アンジオジェニン、オーロラキナーゼB、BCL10、BRCA1、BRCA2、BUB1、サイクリンA2、サイクリンD1、サイクリンD3、CDK−4、CDKインヒビター2C、FAS、フォークヘッドボックスM1、HDAC−1、c−Jun、MCAM、Mcl−1、c−met、Myb L2、NF1、NF2、PI3−キナーゼ、ポロ様キナーゼ1、R−RAS、SMAD3、TGFベータ受容体、TPD52腫瘍タンパク質D52、及びWnt−7bである。したがって、miR−34は、細胞の増殖及び生存の決定的な制御因子であるタンパク質の活性を管理する。これらの標的は、ヒト癌において頻繁に制御を解除される。
マイクロRNA−34置換療法は、癌を処置するための有望なアプローチとして現れ、現在第I相の臨床試験中である。miR−34は、p53によって転写的に誘導される。miR−34は、さらに、先行文献がmiR−34の表現型に必要とされ得ることを示唆した正のフィードバックループ中のp53を活性化する。しかしながら、TP53遺伝子の変異は、すべての癌の約半分で生じる、ヒト癌で見られる最も一般的な遺伝子変化である。
miR−34治療は、miR−34治療薬を含む治療である。miR−34治療は、miR−34治療薬を含む併用治療を含み得る。例えば、miR−34治療は、miR−34治療薬を含み得、さらに、miR−215(SEQ ID NO:1)又はmiR−192(SEQ ID NO:2)等の別のマイクロRNA治療法を含み得る。別の例において、miR−34治療は、miR−34治療薬を含み得、さらに、化学療法、放射線療法又は手術等の非マイクロRNA治療を含み得る。
miR−34治療薬は、被検体のmiR−34の量を増加させる薬剤である。幾つかの実施形態において、miR−34治療薬は、ヒトmiR−34及びそのアナログを含む。miR−34は、限定されないが、miR−34a、miR−34b、miR−34c、miR−449a、miR−449b、miR−449c、修飾されたmiR−34核酸及びそのいずれかの組み合せを含み得る。オリゴヌクレオチドのように、miR−34治療薬は、二本鎖又は一本鎖であり得る。幾つかの実施形態において、miR−34は、miR−34a(SEQ ID NO:3)、miR−34b(SEQ ID NO:4)又はmiR−34c(SEQ ID NO:5)のシード配列を含む(表1)。幾つかの実施形態において、miR−34は、miR−449a(SEQ ID NO:6)、miR−449b(SEQ ID NO:7)又はmiR−449c(SEQ ID NO:8)のシード配列を含む(表1)。これらのマイクロRNAは当該技術分野で周知であり、当業者は、それらが慣習的に自然に発生する配列(本明細書中に提供される)及び化学的に修飾されたもの並びにその相同配列も含むことを理解するだろう。一般的に、使用されるmiRNAは、2つの異なる鎖あるいはヘアピン構造のいずれかを有する、17−25ヌクレオチド長の二本鎖RNA分子である。二本鎖の内の1つはガイド鎖(guide strand)と呼ばれ、対応する与えられたmiRNAのシード配列と同一又は実質的に相補的な配列を含む。本明細書中で使用される「実質的に相補的な」とは、最も多くて1つ又は2つのミスマッチ及び/あるいは欠失が認められることを意味する。幾つかの実施形態において、ガイド鎖は、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%又は100%、シード配列と相同な配列を含む。幾つかの実施形態において、他方の鎖(「パッセンジャー鎖」(passenger strand))は、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は99%、本明細書中に提供されるそれぞれの完全長の配列の補体(complement)と同一の配列を含む。様々なmiR−34治療薬は、例えば、参照によって本明細書に組込まれる米国特許第8,173,611号、米国特許出願公開第2009/0227533号及び2012/0288933号に記載されているもののように使用され得る。
典型的に、miR−34は、例えば米国特許第7,858,117号及び7,371,404号;米国特許出願公開第2009/0306194号及び2011/0009641号に記載されているもののようなリポソームにおいて処方される。発現ベクター、脂質又は様々なリガンド抱合体、ポリマーに基づくナノ粒子などを含む、他の送達技術が利用可能である。
miR−34治療薬は、さらに化学的に修飾され得る;例えば、修飾されたmiR−34は、パッセンジャー鎖上の5’キャップ(例えば、NH2−(CH2)6−O−)及び/又は同じ鎖の1番目と2番目のヌクレオチドにミスマッチを有し得る。他の可能な化学修飾は、骨格修飾(例えば、ホスホロチオエート、モルフォリノ)、リボース修飾(例えば、2’−OMe、2’−Me、2’−F、2’−4’−固定/架橋糖(例えば、LNA、ENA、UNA))と同様に核酸塩基修飾(例えば、Peacock et al.,2011.J Am Chem Soc.,133(24):9200-9203を参照)を含み得る。ある実施形態において、miR−34は、米国特許第7,960,359号及び米国特許出願公開第2012/0276627号並びに2012/0288933号に記載されているような修飾を有する。
miR−34治療薬は、様々な方法で、例えば、局所的に、経腸的に又は非経口的に投与され得る。具体的には、非経口的送達は静脈内又は皮下投与を含み得る。例えば、miR−34は、例えば、必要であれば2、4、6又は8週以上の間、1週間当たり1、2、3又はそれ以上の用量で、1用量当たり0.01−3.0、0.025−1.0又は0.25−0.5mg/kgで、1用量当たり約0.001−10.0mg/kgの間の範囲の用量でのスローボーラス(slow−bolus)注射として非経口的に投与され得る。
<被検体/癌>
本発明の方法において、被検体は動物、例えば、ヒト等の哺乳動物であり得る。幾つかの実施形態において、被検体は、癌を有する、癌の疑いのある又は癌になりやすいヒトであり得る。癌になりやすい被検体は、歴史的な(例えば、前癌)、環境上の(喫煙、過度の直射日光暴露、ある化学製品への暴露)又は遺伝上の(例えば、リンチ症候群)指標を有し得る。典型的な癌は、限定されないが、肺癌(非小細胞肺癌(NSCLC)、例えば、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌)、膵癌、肝臓の癌、肝細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、食道癌又は結腸癌を含む。幾つかの実施形態において、被検体は、p21CIP1/WAF1陽性の癌細胞を有し得る。幾つかの実施形態において、被検体は、p53欠乏癌細胞を有し得る。ある例において、被検体は、p21CIP1/WAF1陽性及びp53欠乏の両方である癌細胞を有することがわかった。例えば、被検体は、p21CIP1/WAF1野性型(+/+)又はヘテロ接合性の(+/−)遺伝子及びホモ接合性に不活化された(−/−)p53遺伝子を有する癌細胞を有すると決定され得る。別の例において、被検体は、p21CIP1/WAF1野性型(+/+)又はヘテロ接合性の(+/−)遺伝子を有し、機能的なp53タンパク質を欠失している癌細胞を有すると決定され得る。別の例において、被検体は、機能的なp21CIP1/WAF1タンパク質及び機能的でないp53タンパク質を有するか又はp53タンパク質を欠失していると決定され得る。幾つかの実施形態において、被検体は、非miR−34miRNA治療又は非miRNA治療等の先の第一選択療法に失敗しているかもしれない。例えば、被検体は、第一選択治療への1つ以上の顕著な副作用を経験したことがあり得る、又は第一選択治療は、被検体の癌細胞を処置しなかったかもしれない。例えば、miR−192又はmiR−215等の第一選択miRNA治療の投与は、被検体の癌細胞の増殖を止めない。幾つかの実施形態において、被検体は、原発性又は転移癌、あるいは第1、II、III又はIV期の癌であり得る。
本発明の方法において、被検体は動物、例えば、ヒト等の哺乳動物であり得る。幾つかの実施形態において、被検体は、癌を有する、癌の疑いのある又は癌になりやすいヒトであり得る。癌になりやすい被検体は、歴史的な(例えば、前癌)、環境上の(喫煙、過度の直射日光暴露、ある化学製品への暴露)又は遺伝上の(例えば、リンチ症候群)指標を有し得る。典型的な癌は、限定されないが、肺癌(非小細胞肺癌(NSCLC)、例えば、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌)、膵癌、肝臓の癌、肝細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、食道癌又は結腸癌を含む。幾つかの実施形態において、被検体は、p21CIP1/WAF1陽性の癌細胞を有し得る。幾つかの実施形態において、被検体は、p53欠乏癌細胞を有し得る。ある例において、被検体は、p21CIP1/WAF1陽性及びp53欠乏の両方である癌細胞を有することがわかった。例えば、被検体は、p21CIP1/WAF1野性型(+/+)又はヘテロ接合性の(+/−)遺伝子及びホモ接合性に不活化された(−/−)p53遺伝子を有する癌細胞を有すると決定され得る。別の例において、被検体は、p21CIP1/WAF1野性型(+/+)又はヘテロ接合性の(+/−)遺伝子を有し、機能的なp53タンパク質を欠失している癌細胞を有すると決定され得る。別の例において、被検体は、機能的なp21CIP1/WAF1タンパク質及び機能的でないp53タンパク質を有するか又はp53タンパク質を欠失していると決定され得る。幾つかの実施形態において、被検体は、非miR−34miRNA治療又は非miRNA治療等の先の第一選択療法に失敗しているかもしれない。例えば、被検体は、第一選択治療への1つ以上の顕著な副作用を経験したことがあり得る、又は第一選択治療は、被検体の癌細胞を処置しなかったかもしれない。例えば、miR−192又はmiR−215等の第一選択miRNA治療の投与は、被検体の癌細胞の増殖を止めない。幾つかの実施形態において、被検体は、原発性又は転移癌、あるいは第1、II、III又はIV期の癌であり得る。
<バイオマーカー>
miR−34活性のバイオマーカーは、miR−34活性のための代理(proxy)であり、例えば、その発現又は活性が、miR−34が機能的に活性であることを示す分子である。例えば、miR−34活性のバイオマーカーは、HDAC1、miR−34と相互作用する分子、又はmiR−34によって誘導される分子等のmiR−34の直接的な標的であり得る。図1は、その一部がp53と共通しており、その一部が別であるmiR−34活性のバイオマーカーであるmiR−34の標的を示す。さらに以下に議論されるように、これらのバイオマーカーの発現レベル又は活性は、アッセイを使用して測定され得る。幾つかの態様において、miR−34活性のバイオマーカーは、miR−34活性の予測マーカーとして、つまり、被検体がmiR−34治療薬にどのように反応するかを予測するために使用され得る。幾つかの態様において、miR−34活性のバイオマーカーの発現レベル又は活性レベルの変化は、被検体がmiR−34治療にどれくらいよく反応しているかを決定するために使用され得る。miR−34活性のバイオマーカーは、限定されないが、以下に詳細に記載された、p21CIP1/WAF1(CDKN1A)(OMIM#116899)(SEQ ID No:9)、p53(OMIM#191170)(SEQ ID NO:10)、PUMA(OMIM#605854)(SEQ ID NO:11)、BAX(OMIM#600040)(SEQ ID NO:12)、NOXA(OMIM#604959)(SEQ ID NO:13)、PHLDA3(OMIM#607054)(SEQ ID NO:14)、MDM2(OMIM#164785)(SEQ ID NO:15)、及びHDAC1(OMIM#601241)(SEQ ID NO:16)を含む。これらのバイオマーカーの例及びそれらの配列表は、米国特許出願公開第2008/0274956号、2010/0292085号、2009/0298054号及び国際公開公報第2000/075184号において議論されており、これらのすべては参照によって本明細書中に組み込まれる。
miR−34活性のバイオマーカーは、miR−34活性のための代理(proxy)であり、例えば、その発現又は活性が、miR−34が機能的に活性であることを示す分子である。例えば、miR−34活性のバイオマーカーは、HDAC1、miR−34と相互作用する分子、又はmiR−34によって誘導される分子等のmiR−34の直接的な標的であり得る。図1は、その一部がp53と共通しており、その一部が別であるmiR−34活性のバイオマーカーであるmiR−34の標的を示す。さらに以下に議論されるように、これらのバイオマーカーの発現レベル又は活性は、アッセイを使用して測定され得る。幾つかの態様において、miR−34活性のバイオマーカーは、miR−34活性の予測マーカーとして、つまり、被検体がmiR−34治療薬にどのように反応するかを予測するために使用され得る。幾つかの態様において、miR−34活性のバイオマーカーの発現レベル又は活性レベルの変化は、被検体がmiR−34治療にどれくらいよく反応しているかを決定するために使用され得る。miR−34活性のバイオマーカーは、限定されないが、以下に詳細に記載された、p21CIP1/WAF1(CDKN1A)(OMIM#116899)(SEQ ID No:9)、p53(OMIM#191170)(SEQ ID NO:10)、PUMA(OMIM#605854)(SEQ ID NO:11)、BAX(OMIM#600040)(SEQ ID NO:12)、NOXA(OMIM#604959)(SEQ ID NO:13)、PHLDA3(OMIM#607054)(SEQ ID NO:14)、MDM2(OMIM#164785)(SEQ ID NO:15)、及びHDAC1(OMIM#601241)(SEQ ID NO:16)を含む。これらのバイオマーカーの例及びそれらの配列表は、米国特許出願公開第2008/0274956号、2010/0292085号、2009/0298054号及び国際公開公報第2000/075184号において議論されており、これらのすべては参照によって本明細書中に組み込まれる。
miR−34活性の必須のバイオマーカーは、それが存在しない場合に、被検体をmiR−34治療に反応しなくするバイオマーカー、つまりmiR−34に反応のバイオマーカーである。例えば、p21CIP1/WAF1(CDKN1A)等のmiR−34活性の幾つかのバイオマーカーは、miR−34活性の必須バイオマーカーである一方で、例えば、p53等のmiR−34活性の他のバイオマーカーはmiR−34活性に必要ではない。例えば、miR−34活性のバイオマーカーは、miR−34が被検体に活性であることを示し得るが、それにもかかわらず、miR−34活性の必須のバイオマーカーが存在しない場合、それらは被検体の治療の利益にならないことがある。miR−34活性の必須のバイオマーカーは、限定されないが、p21CIP1/WAF1(CDKN1A)、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2及びHDAC1を含み得る。発現レベル又は活性レベルが参照レベル以上の場合、バイオマーカーは存在すると決定され、そうでなければ、バイオマーカーはないと決定される。参照レベルは、細胞のタイプ又は被検体に依存して変わり得る。例えば、参照レベルは、特定のアッセイによって検知できる最低レベルであり得る。例えば、参照レベルは、被検体のバイオマーカーのための発現又は活性の標準範囲と同等、あるいはその範囲内であり得る。例えば、バイオマーカーは、発現レベル又は活性レベルが参照レベルの、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、33%、40%、50%、60%、70%、75%、80%あるいは90%以内にある場合に存在すると決定され得る。
バイオマーカーは、第1のレベルのバイオマーカーの発現又は活性及び第2のレベルのバイオマーカーの発現又は活性の間に相対的な変化がある場合、miR−34治療薬の有効性を示し得る。少なくとも3%、4%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%又は100%の第1のレベル及び第2のレベルの間の相対的な変化は、miR−34治療薬の有効性を示し得る。バイオマーカーに依存して、第2のレベルは、有効性を示す第1のレベルより高く又はより低くなり得る。例えば、第2のレベルは、p21等の、miR−34治療薬に応じて上昇すると予想されるmiR−34活性のバイオマーカーのための第1のレベルより少なくとも50%大きくなり得る。他の例において、第2のレベルは、HDAC1等の、miR−34治療薬に応じて低下すると予想されるmiR−34活性のバイオマーカーのための第1のレベルより少なくとも50%小さくなり得る。
<p21CIP1/WAF1>
ヒトp21CIP1/WAF1は、サイクリン依存キナーゼ(CDK)阻害剤をコードする遺伝子のCDKN1A上の染色体6p21.2に局在化されている。タンパク質p21CIP1/WAF1は、1992年に最初に述べられた(Xiong et al.,Cell 71:505−514(1992))。p21CIP1/WAF1は、有力な腫瘍抑制因子であり、そのほかの点では、p53によって転写的に制御されることが知られており、p53の反応のために必要である。p21CIP1/WAF1の主要な機能は、サイクリン依存キナーゼ(CDK)を阻害することによる細胞周期の停止及び増殖性細胞核抗原(PCNA)に結合することによるDNA合成の阻害を含む(Abbas et al.,Nat Rev Cancer 9(6):400−14(2009))。しかしながら、p21CIP1/WAF1は、さらに、WNT4、STAT3、MYC及びTERTによって制御されるものを含む、他の発癌経路を阻害し得る(Abbas et al.,Nat Rev Cancer 9(6):400−14(2009))。
ヒトp21CIP1/WAF1は、サイクリン依存キナーゼ(CDK)阻害剤をコードする遺伝子のCDKN1A上の染色体6p21.2に局在化されている。タンパク質p21CIP1/WAF1は、1992年に最初に述べられた(Xiong et al.,Cell 71:505−514(1992))。p21CIP1/WAF1は、有力な腫瘍抑制因子であり、そのほかの点では、p53によって転写的に制御されることが知られており、p53の反応のために必要である。p21CIP1/WAF1の主要な機能は、サイクリン依存キナーゼ(CDK)を阻害することによる細胞周期の停止及び増殖性細胞核抗原(PCNA)に結合することによるDNA合成の阻害を含む(Abbas et al.,Nat Rev Cancer 9(6):400−14(2009))。しかしながら、p21CIP1/WAF1は、さらに、WNT4、STAT3、MYC及びTERTによって制御されるものを含む、他の発癌経路を阻害し得る(Abbas et al.,Nat Rev Cancer 9(6):400−14(2009))。
p21CIP1/WAF1は、サイクリン/CDK複合体の活性の制御に関連するCKIのCip/Kipファミリー(p21CIP1/WAF1、p27KIP1及びp57KIP2)に属し、CDKの阻害を通してサイクリンが触媒する細胞周期の進行のプロセスを負に制御することを示した(米国特許出願公開第2005/043262号)。p21CIP1/WAF1の変質は、細胞増殖の制御に悪影響を及ぼし、癌へのなりやすさを増加させ得る。そのようなp21CIP1/WAF1の多形性は様々なヒトの癌で観察された。
p21CIP1/WAF1陽性癌細胞は、機能的なp21CIP1/WAF1の検出できる発現レベル又は活性レベルを有する癌細胞である。例えば、p21CIP1/WAF1陽性癌細胞は、野性型のp21CIP1/WAF1活性又は発現レベルを有する癌細胞であり得る。例えば、p21CIP1/WAF1の活性レベルは、細胞増殖を測定すること又はp21CIP1/WAF1に向けられたsiRNAを使用することによって検出され得る。
<p53>
上で議論されるように、腫瘍抑制因子TP53(p53)は、3つのmiR−34ファミリーすべての発現を転写的に誘導するが、癌において高い変異率を有している。p53が正常な癌細胞はp53野性型の発現及び活性を有している。p53欠失癌細胞は、p53が正常な細胞より低い発現レベル及び/又は活性レベルを有する。ヘテロ接合性又はホモ接合性のTP53の変異を有する癌細胞はp53欠失癌細胞である。例えば、ドミナントネガティブ変異を有する細胞はp53欠失癌細胞である。幾つかの実施形態において、p53欠失癌細胞は少しも内在性のp53を有しない。幾つかの実施形態において、p53欠失癌細胞は機能的なp53を有しない。肺癌(非小細胞肺癌(NSCLC)、例えば、腺癌、扁平上皮癌及び大細胞癌)、膵癌、肝臓の癌、肝細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺、脳、胃、膀胱、食道、又は、結腸癌細胞はp53欠失癌細胞であり得る。p53タンパク質あるいはmRNAの発現又は活性のレベルは、アッセイによって測定され得る。例えば、発現レベルは機能的なp53タンパク質のレベルであり得る。例えば、ゲノムのテストはドミナントネガティブ変異を測定し得る。
上で議論されるように、腫瘍抑制因子TP53(p53)は、3つのmiR−34ファミリーすべての発現を転写的に誘導するが、癌において高い変異率を有している。p53が正常な癌細胞はp53野性型の発現及び活性を有している。p53欠失癌細胞は、p53が正常な細胞より低い発現レベル及び/又は活性レベルを有する。ヘテロ接合性又はホモ接合性のTP53の変異を有する癌細胞はp53欠失癌細胞である。例えば、ドミナントネガティブ変異を有する細胞はp53欠失癌細胞である。幾つかの実施形態において、p53欠失癌細胞は少しも内在性のp53を有しない。幾つかの実施形態において、p53欠失癌細胞は機能的なp53を有しない。肺癌(非小細胞肺癌(NSCLC)、例えば、腺癌、扁平上皮癌及び大細胞癌)、膵癌、肝臓の癌、肝細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺、脳、胃、膀胱、食道、又は、結腸癌細胞はp53欠失癌細胞であり得る。p53タンパク質あるいはmRNAの発現又は活性のレベルは、アッセイによって測定され得る。例えば、発現レベルは機能的なp53タンパク質のレベルであり得る。例えば、ゲノムのテストはドミナントネガティブ変異を測定し得る。
<他のバイオマーカー>
PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2及びHDAC1は、miR−34活性の他の典型的なバイオマーカーである。PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3及びMDM2はmiR−34によって上方制御される。既知の薬物標的であるHDAC1は、miR−34aで形質転換された細胞中で下方制御され、転写制御に関連付けられる。HDAC1の転写物は、その3’−非翻訳領域(UTR)に、miR−34に直接的に標的にされるmiR−34結合部位を有しており、HDAC1を抑制する。
PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2及びHDAC1は、miR−34活性の他の典型的なバイオマーカーである。PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3及びMDM2はmiR−34によって上方制御される。既知の薬物標的であるHDAC1は、miR−34aで形質転換された細胞中で下方制御され、転写制御に関連付けられる。HDAC1の転写物は、その3’−非翻訳領域(UTR)に、miR−34に直接的に標的にされるmiR−34結合部位を有しており、HDAC1を抑制する。
<アッセイ>
様々なアッセイが、本発明の方法を実施する際のパラメータを測定するために使用され得る。幾つかの実施形態において、アッセイは、直接的に又は間接的に遺伝子、mRNA及びタンパク質の発現あるいは活性を測定することができる。幾つかの実施形態において、活性アッセイは間接的に遺伝子、mRNAあるいはタンパク質の発現レベルを測定するために使用され得る。通常のアッセイは、限定されないが、増殖反応アッセイ、定量的逆転写酵素PCR(qRT−PCR)、ルシフェラーゼレポーターアッセイ、ELISAおよびウエスタン解析を含む。幾つかの実施形態において、アッセイは、被検体からの血液又は組織サンプル等の、例えば、腫瘍生検サンプルのような生体試料を使用して実施され得る。幾つかの実施形態において、他のパラメータは、処置に対する反応の指標として測定され得る。例えば、腫瘍サイズ、アポトーシスの割合、細胞増殖、脱毛等が測定され得る。
様々なアッセイが、本発明の方法を実施する際のパラメータを測定するために使用され得る。幾つかの実施形態において、アッセイは、直接的に又は間接的に遺伝子、mRNA及びタンパク質の発現あるいは活性を測定することができる。幾つかの実施形態において、活性アッセイは間接的に遺伝子、mRNAあるいはタンパク質の発現レベルを測定するために使用され得る。通常のアッセイは、限定されないが、増殖反応アッセイ、定量的逆転写酵素PCR(qRT−PCR)、ルシフェラーゼレポーターアッセイ、ELISAおよびウエスタン解析を含む。幾つかの実施形態において、アッセイは、被検体からの血液又は組織サンプル等の、例えば、腫瘍生検サンプルのような生体試料を使用して実施され得る。幾つかの実施形態において、他のパラメータは、処置に対する反応の指標として測定され得る。例えば、腫瘍サイズ、アポトーシスの割合、細胞増殖、脱毛等が測定され得る。
<代替癌治療>
本発明の方法は、非miR−34 マイクロRNA治療又は非マイクロRNA治療等のmiR−34治療薬以外の癌治療を使用できる。これらの治療は、miR−34治療としてmiR−34治療薬と共に使用され得、あるいは、それらは代替療法として使用され得る。miR−34治療薬を除外する癌治療は、代替療法として本明細書中で参照されるだろう。例えば、代替療法は「第一選択」療法として、つまり、miR−34治療薬を投与する前に使用され得る。幾つかの実施形態において、代替療法はマイクロRNA治療である。例えば、代替療法は、miR−215治療薬、miR−192治療薬、又はmiR−34を除くマイクロRNA治療薬の組み合わせ等のマイクロRNAであり得る。幾つかの実施形態において、代替療法は非マイクロRNA治療である。非マイクロRNA治療は、限定されないが、中断された治療、化学療法、放射線、手術、緩和療法、標的治療等(例えば、EGFR−TKI(例えばエルロチニブ、ゲフィチニブ等)、べバシズマブ、クリゾチニブ)を含む。
本発明の方法は、非miR−34 マイクロRNA治療又は非マイクロRNA治療等のmiR−34治療薬以外の癌治療を使用できる。これらの治療は、miR−34治療としてmiR−34治療薬と共に使用され得、あるいは、それらは代替療法として使用され得る。miR−34治療薬を除外する癌治療は、代替療法として本明細書中で参照されるだろう。例えば、代替療法は「第一選択」療法として、つまり、miR−34治療薬を投与する前に使用され得る。幾つかの実施形態において、代替療法はマイクロRNA治療である。例えば、代替療法は、miR−215治療薬、miR−192治療薬、又はmiR−34を除くマイクロRNA治療薬の組み合わせ等のマイクロRNAであり得る。幾つかの実施形態において、代替療法は非マイクロRNA治療である。非マイクロRNA治療は、限定されないが、中断された治療、化学療法、放射線、手術、緩和療法、標的治療等(例えば、EGFR−TKI(例えばエルロチニブ、ゲフィチニブ等)、べバシズマブ、クリゾチニブ)を含む。
<概論>
本発明の方法において、「投与」はいかなる特定の送達システムにも限定されず、限定されずに、非経口(皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内又は腹腔内を含む)、直腸、局所的、経皮的又は経口(例えば、カプセル剤、懸濁剤又は錠剤)を含み得る。個体への投与は、単回投与、あるいは繰り返し投与並びに、様々な生理学的に許容可能な塩形態のうちのいずれか、並びに/又は許容可能な医薬品の担体並びに/又は医薬組成物の一部としての添加剤で生じ得る。生理学的に許容可能な塩の形態及び標準的な医薬製剤技術、用量並びに賦形剤は、当業者に周知である(例えば、Physicians’Desk Reference(PDR(登録商標))2005, 59th ed.,Medical Economics Company,2004;and Remington:The Science and Practice of Pharmacy,eds.Gennado et al.,21st ed.,Lippincott,Williams & Wilkins,2005を参照)。
本発明の方法において、「投与」はいかなる特定の送達システムにも限定されず、限定されずに、非経口(皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内又は腹腔内を含む)、直腸、局所的、経皮的又は経口(例えば、カプセル剤、懸濁剤又は錠剤)を含み得る。個体への投与は、単回投与、あるいは繰り返し投与並びに、様々な生理学的に許容可能な塩形態のうちのいずれか、並びに/又は許容可能な医薬品の担体並びに/又は医薬組成物の一部としての添加剤で生じ得る。生理学的に許容可能な塩の形態及び標準的な医薬製剤技術、用量並びに賦形剤は、当業者に周知である(例えば、Physicians’Desk Reference(PDR(登録商標))2005, 59th ed.,Medical Economics Company,2004;and Remington:The Science and Practice of Pharmacy,eds.Gennado et al.,21st ed.,Lippincott,Williams & Wilkins,2005を参照)。
さらに、1匹の動物において達成される有効な用量は、ヒトを含む別の動物に使用するために、当技術分野において既知の換算係数を使用して外挿され得る(例えば、Freireich et al.,Cancer Chemother Reports 50(4):219−244(1966);表2の等価表面積投与量係数を参照されたい)。
以下の実施例は、本発明の実例となる実施形態を提供する。当業者は、本発明の精神又は範囲を変更せずに実施され得る多数の修飾と変化を認識するだろう。そのような修飾及び変化は本発明の範囲内に含まれる。実施例は本発明をいかなる方法にも限定するものではない。
<実施例1−材料及び方法>
細胞培養、オリゴ(oligos)及び増殖アッセイ。MCF10A乳癌及びSW48由来の同質遺伝子的な癌細胞、HCT116、DLD−1並びにRKO結腸直腸癌細胞株を、Horizon Discovery Ltd(Cambridge、UK)から得た。表3を参照されたい。合成miRNA模倣物及びsiRNAは、Life Technologies(Ambion、Austin、TX)から購入した。TP53経路の刺激のために、細胞は、28時間、10μMのエトポシドで前処置され、RNAは、qRT−PCR分析のために回収された。Lipofectamine(登録商標)2000(Invitrogen)又はRNAiMAX(商標)(Invitrogen)を使用する最適な形質転換の条件を、増殖に必要な紡錘体のタンパク質であるEG5に対するsiRNAを使用して細胞株ごとに決定した。リバーストランスフェクションを2重又は3重で実施した。簡単に、RNAseを含まない水のオリゴ溶液5μlを、Lipofectamine(登録商標)2000(SW48、MCF10A、DLD−1、HCT116)あるいはRNAiMAX(RKO)を含む、ウェル当たり20μlのOpti−MEM(登録商標)に添加した。混合物を、脂質RNA複合体を形成するために室温で20分間インキュベートした。その後、培地中で懸濁された細胞の75μlを、各細胞株の成長速度に依存して、ウェル当たり6,000−10,000細胞の終濃度に達するように添加した。約18時間後、上澄みを除去し、新鮮な培地と取り替えた。細胞増殖を、トランスフェクション後3−4日、alamarBlue(登録商標)(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して決定した。alamarBlue(登録商標)の基質は、生細胞の数に比例する、生細胞の蛍光産物に代謝的に変換される。非線形回帰及びEC50の値を、Graphpad(Prism)ソフトウェアを使用して計算した。すべてのEC50の値は、回帰曲線の95%信頼区間内(P<0.05)にあった。本明細書中で使用されるEC50の値は最大半量のmiRNA活性として定義された。
細胞培養、オリゴ(oligos)及び増殖アッセイ。MCF10A乳癌及びSW48由来の同質遺伝子的な癌細胞、HCT116、DLD−1並びにRKO結腸直腸癌細胞株を、Horizon Discovery Ltd(Cambridge、UK)から得た。表3を参照されたい。合成miRNA模倣物及びsiRNAは、Life Technologies(Ambion、Austin、TX)から購入した。TP53経路の刺激のために、細胞は、28時間、10μMのエトポシドで前処置され、RNAは、qRT−PCR分析のために回収された。Lipofectamine(登録商標)2000(Invitrogen)又はRNAiMAX(商標)(Invitrogen)を使用する最適な形質転換の条件を、増殖に必要な紡錘体のタンパク質であるEG5に対するsiRNAを使用して細胞株ごとに決定した。リバーストランスフェクションを2重又は3重で実施した。簡単に、RNAseを含まない水のオリゴ溶液5μlを、Lipofectamine(登録商標)2000(SW48、MCF10A、DLD−1、HCT116)あるいはRNAiMAX(RKO)を含む、ウェル当たり20μlのOpti−MEM(登録商標)に添加した。混合物を、脂質RNA複合体を形成するために室温で20分間インキュベートした。その後、培地中で懸濁された細胞の75μlを、各細胞株の成長速度に依存して、ウェル当たり6,000−10,000細胞の終濃度に達するように添加した。約18時間後、上澄みを除去し、新鮮な培地と取り替えた。細胞増殖を、トランスフェクション後3−4日、alamarBlue(登録商標)(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して決定した。alamarBlue(登録商標)の基質は、生細胞の数に比例する、生細胞の蛍光産物に代謝的に変換される。非線形回帰及びEC50の値を、Graphpad(Prism)ソフトウェアを使用して計算した。すべてのEC50の値は、回帰曲線の95%信頼区間内(P<0.05)にあった。本明細書中で使用されるEC50の値は最大半量のmiRNA活性として定義された。
定量的逆転写酵素PCR。培養した同質遺伝子的な癌細胞株のRNAの合計を、メーカーの指示書に従って、mirVANA(商標)PARIS(商標)RNA isolation kit(Ambion)を使用して単離した。miRNAのqRT−PCR検出のために、RNAと、hsa−miR−34a、hsa−miR−215、hsa−miR−192、hsa−miR−194、hsa−miR−34b、及びhsa−miR−34c(アッセイID 000426、000518、000491、000492、002102、000428;TaqMan(登録商標)miRNA Assay,Applied Biosystems)の各々のmiRNA特異的RTプライマーの合計10ngを2分間、70℃で熱変性させ、MMLV逆転写酵素(cat.no.28025−021,Invitrogen)を使用して逆転写した。miRNAの発現レベルを、Plutinum Taq Polymerase reagents(Invitrogen)及びABI Prism 7900 SDS instrument(Applied Biosystems)を使用するPCRによって決定した。PCR反応を、1分間で95℃にサンプルを熱することにより実施し、続けて、複数のサイクルの間、5秒間95℃及び30秒間60℃でサンプルをインキュベートした。ハウスキーピングmiRNAのmiR−191及びmiR−103(アッセイID 002299及び000439)を、ウェルからウェルのRNAの入力分散を調節するための内部基準として増幅させた。生のCt値はハウスキーピングmiRNAsのCTの幾何平均に基準化され、未処置のmiR−NC又は擬似的に遺伝子導入された細胞との相対的な倍差(fold−differences)として表した。
ヒトmRNAの検出のために、random decamers(AM5722G、Ambion)を備えた合計10ナノグラムのRNAを使用してcDNAを作成した。遺伝子特異的な増幅を、多数のTaqman Gene Expression Assays(Invitrogen)を使用して実行した。ハウスキーピングGAPDHとシクロフィリンA(Taqman(登録商標);Invitrogen)のmRNAレベルをローディング対照として使用した。上記のように、生のCtをハウスキーピングmRNAのそれに基準化し分析した。
部位特異的な突然変異誘発。ヒトHDAC1の3’UTR全体に融合されたルシフェラーゼレポーターをコードするヒトHDAC1の3’−UTRレンチレポータールシフェラーゼベクター(pLenti−UTR−Luc HDAC1,HDAC1 wt)を、Applied Biological Materials,Incから購入した。突然変異誘発の2ラウンドを、HDAC1’3−UTRのmiR−34結合部位(HDAC1 mut)に6つの点突然変異を誘導するために実施した。部位特異的な突然変異のために、QuikChange XL Site−Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies)をメーカーの指示書に従って使用した。第1のラウンドでは、次のプライマーを使用した:SEQ ID NO:17(CCTCAAGTGA GCCAAGAAAC AATAACTGCC CTCTGTCTGTC)及びSEQ ID NO:18(GACAGACAGA GGGCAGTTAT TGTTTCTTGG CTCACTTGAGG)。陽性クローンを配列決定(UT Austin)により確認し、次のプライマーを使用して、突然変異誘発の第2のラウンドのための鋳型として使用した:SEQ ID NO:19(GGCCTCAAG TGAGCCAAAA ATAAATAACT GCCCTCTGTC TGTC)及びSEQ ID NO:20(GACAGACAGA GGGCAGTTAT TTATTTTTGG CTCACTTGAG GCC)。遺伝子導入で使用されるすべてのベクターを、配列決定によって確認した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ。SW48−/−及びH1299細胞を、Lipofectamine2000(Life Technology)を使用して96ウェルプレート中で、それぞれ1nM又は10nMのmiR−34aで逆転写した。対照として、細胞を同じ濃度のmiR−NCで遺伝子導入した。翌日、細胞を、各々100ngのHDAC1wt又はHDAC1mutルシフェラーゼプラスミドで先に遺伝子導入した。48時間後、細胞溶解物を調製し、PiereceのBCAシステム(Thermo Scientific)を使用して定量した。発光を、POLARStar OPTIMAプレート・リーダ(BMG Labtech)及びLuciferase Assay System(Promega)を使用して決定した。発光を総タンパク質入力で基準化した。
ウエスタン解析。200,000個のSW48及びRKO細胞を、6ウェルプレート中に播種し、2.5μlのLipofectamine2000又はRNAiMaxを使用して6ウェルプレート中においてmiRNAの模倣物及びsiRNAで逆転写した。3日後、RIPAバッファー(Cell Signaling)中で細胞溶解物を収集し、タンパク質濃度をThermo ScientificのBCAアッセイキットを使用して測定した。総細胞溶解物の2.5μgを、それぞれ12%SDS−PAGEにロードし、その後、PVDF膜に移した。膜を、p21、HDAC1、c−MET及びアクチン(Cell Signaling)用の特定の一時抗体で、4℃で一晩ブロットした。膜を、Tween(商標)−20を0.2%含む1×リン酸緩衝食塩水(PBS)中で洗浄し、室温で1時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体でインキュベートした。Tween(商標)−20を0.2%含む1×PBSで洗浄後、膜をECL検出試薬(Thermo Scientific)でインキュベートし、タンパク質のバンドをAFP X−ray film developer(AFP Image Corp.)を使用して可視化した。
ヒト組織サンプル。NSCLC腫瘍サンプル及び対応する正常隣接組織(NAT)はProteoGenexとNational Disease Research Interchangeから購入した。HDAC1 mRNA及びmiR−34aのレベルを、qRT−PCRにより決定し、各腫瘍及びNATペア間の相対的な発現として示した。直線回帰を、GraphPadを使用して計算した。
統計解析。統計解析を、Excel及びGraphpad(Prism)ソフトウェアを使用して行った。平均及び標準偏差を二重又は三重の実験から計算した。P値を、図の説明文中で示されるように、両側スチューデントt検定又はF検定によって得た。
<実施例2−miR−34による癌細胞の増殖の阻害はTP53に依存しない>
本研究で使用された同質遺伝子的な細胞は、MCF10A乳癌並びに結腸直腸癌細胞株SW48、HCT116、RKO及びDLD−1に由来する(表3を参照のこと)。これらの細胞では、TP53は、野性型(+/+)ヘテロ接合型(+/−)又はホモ接合性不活性化型(−/−)のいずれかである(Sur et al.,Proc Natl Acad Sci USA 106(10):3964−9(2009))。親DLD−1細胞(DLD−1par)は、1つの対立遺伝子が変異されており、他方が局所的に(epitopically)発現抑制されたS241F/SIL TP53の遺伝子型のため、機能的なTP53タンパク質を発現しない。したがって、点突然変異が部位特異的な突然変異誘発によって修正されているDLD−1+/SIL細胞(+/−)は、無傷なTP53を備えたDLD−1の参照株として役立つ(Sur et al.,Proc Natl Acad Sci USA 106(10):3964−9(2009))。各非同質遺伝子的な細胞株は、他の癌抑制遺伝子及びmiRNAの阻害作用に影響を与え得る癌遺伝子における変異を示す(表3を参照のこと)。
本研究で使用された同質遺伝子的な細胞は、MCF10A乳癌並びに結腸直腸癌細胞株SW48、HCT116、RKO及びDLD−1に由来する(表3を参照のこと)。これらの細胞では、TP53は、野性型(+/+)ヘテロ接合型(+/−)又はホモ接合性不活性化型(−/−)のいずれかである(Sur et al.,Proc Natl Acad Sci USA 106(10):3964−9(2009))。親DLD−1細胞(DLD−1par)は、1つの対立遺伝子が変異されており、他方が局所的に(epitopically)発現抑制されたS241F/SIL TP53の遺伝子型のため、機能的なTP53タンパク質を発現しない。したがって、点突然変異が部位特異的な突然変異誘発によって修正されているDLD−1+/SIL細胞(+/−)は、無傷なTP53を備えたDLD−1の参照株として役立つ(Sur et al.,Proc Natl Acad Sci USA 106(10):3964−9(2009))。各非同質遺伝子的な細胞株は、他の癌抑制遺伝子及びmiRNAの阻害作用に影響を与え得る癌遺伝子における変異を示す(表3を参照のこと)。
同質遺伝子的な細胞株におけるTP53の連続的な不活性化を確認するために、TP53の反応を、28時間、DNA損傷試薬のエトポシドに細胞を暴露することにより誘導し、すべてのRNAを回収した。定量的逆転写酵素PCR(qRT−PCR)解析は、それらの遺伝子型に従って、TP53のmRNA及びTP53に調節される標的遺伝子における対立遺伝子に依存する増加を示した(図2A−2E)。TP53のmRNAはTP53−/−細胞中で検出できなかった。TP53に調節される遺伝子の増加したmRNAレベルは、公表されたデータ(Brady et al.,Cell 145(4):571−83(2011))に類似しており、おそらくこれらの遺伝子の細胞タイプ特異的な調節のために細胞株間で異なっている。同様に、TP53に調節されるmiRNA、miR−34a/b/c、miR−192、miR−194及びmiR−215の誘導は、細胞株に依存し(すべての細胞株だがDLD−1+/−は、miR−34b/cの発現を欠失していた)、miR−215はSW48及びDLD−1細胞において単独で検出された。
同質遺伝子的な細胞を、miR−34a、miR−34c、miR−192、miR−194及びmiR−215の模倣物で遺伝子導入した。用量反応曲線を作成し、EC50の値を計算するために、段階希釈でmiRNAを使用した。負の対照として、疑似的に遺伝子導入された細胞及び組み替えられた(scrambled)配列を運ぶmiRNAで遺伝子導入された細胞を使用した(miR−NC)。インキュベーションの3−4日後、細胞増殖を、alamarBlue(商標登録)を使用して評価した。図3に示されるように、miRNAの模倣物は、対照と比較して40−80%まで細胞増殖を阻害した。TP53は、癌細胞を阻害するmiR−215及びmiR−192の能力を増強し、TP53+/+細胞と比較して28−35倍低いEC50の値を備えたMCF10A及びSW48細胞で最も大きかった(表4を参照のこと)。対照的に、miR−34a及びmiR−34cの阻害活性は、TP53陽性及びTP53陰性細胞と同じであった(図3A−6D、表4を参照のこと)。RKO細胞は、TP53がない状態でより大きな阻害を示し、さらに、TP53がmiR−34によって誘導される表現型に必須ではないことを実証した(図7A−7B)。興味深いことに、無傷のTP53が存在する状態において、miR−215/192の最大の阻害活性はmiR−34a/cの最大活性よりも大きく、これは、miR−215/192がTP53の正のフィードバックループ中で機能し、TP53によって排他的に制御される補助的な経路を利用することを示唆している。
<実施例3−miR−215ではなくmiR−34aが、TP53がない状態でのTP53に調節される遺伝子を誘導する>
TP53陽性及びTP53欠乏細胞中のmiR−34に誘導される表現型を理解するために、TP53/miR−34系に関連する遺伝子の発現レベルを決定した。TP53に依存しない効果の考えられる1つの説明は、これらの細胞が内在性のSIRT1又はMDM4を発現しないということである。しかしながら、qRT−PCRによって確認されるように、TP53+/+及びTP53−/−細胞の両方は、検出できるSIRT1及びMDM4のmRNAのレベルを保持し、これは、TP53非依存型の表現型がこれらの遺伝子産物の欠失によらないことを示唆する(図8)。むしろ、両方のmRNAは、このmiRNAによってSIRT1及びMDM4が直接的に標的とされることを示す実験データに従って、miR−34で遺伝子導入された細胞の中で減少した(非特許文献21−22)。同様に、miR−34aの標的のMET及びmiR−215の標的のBCL2は、それぞれのmiRNAによって遺伝子導入された細胞の中で特異的に下方制御された(図8)。TP53のmRNAのレベルは、その定義された遺伝子型と一致して、SW48−/−細胞において検出できなかった。SW48+/+細胞において、TP53のmRNAレベルは一定で、これらのmiRNAによるTP53への正のフィードバックループがTP53の新規合成を必要としないが翻訳後に生じるという仮説に一致している。これは、miR−215がTP53陽性細胞中のp21CIP1/WAF1(p21、CDKN1A)の発現を誘導することを示す観察によってさらに実証されるが、TP53欠乏細胞中ではそうではない。意外なことに、miR−34aは、TP53+/+細胞だけでなくTP53欠失細胞のp21、PUMA及びMDM2を誘導することができた(図8)。この現象がSW48に特異的ではないことを保証するために、我々は、miR−34aで遺伝子導入された他のすべての同質遺伝子的な癌細胞をテストし、TP53によって転写的に制御される他の遺伝子にまで分析を拡張した。これらは、AKT/PKBの負の制御因子として機能するPHドメインのみのタンパク質である腫瘍抑制因子のPHLDA3と同様に、アポトーシス促進性のタンパク質BAX及びNOXAを含む(Kawase et al.,Cell 136:535−50(2009))。SW48細胞からのデータに一致して、miR−34aは、機能的なTP53が存在する状態だけでなく、存在しない状態においても、6つの転写物の蓄積を誘導した(図9A及び9B)。
TP53陽性及びTP53欠乏細胞中のmiR−34に誘導される表現型を理解するために、TP53/miR−34系に関連する遺伝子の発現レベルを決定した。TP53に依存しない効果の考えられる1つの説明は、これらの細胞が内在性のSIRT1又はMDM4を発現しないということである。しかしながら、qRT−PCRによって確認されるように、TP53+/+及びTP53−/−細胞の両方は、検出できるSIRT1及びMDM4のmRNAのレベルを保持し、これは、TP53非依存型の表現型がこれらの遺伝子産物の欠失によらないことを示唆する(図8)。むしろ、両方のmRNAは、このmiRNAによってSIRT1及びMDM4が直接的に標的とされることを示す実験データに従って、miR−34で遺伝子導入された細胞の中で減少した(非特許文献21−22)。同様に、miR−34aの標的のMET及びmiR−215の標的のBCL2は、それぞれのmiRNAによって遺伝子導入された細胞の中で特異的に下方制御された(図8)。TP53のmRNAのレベルは、その定義された遺伝子型と一致して、SW48−/−細胞において検出できなかった。SW48+/+細胞において、TP53のmRNAレベルは一定で、これらのmiRNAによるTP53への正のフィードバックループがTP53の新規合成を必要としないが翻訳後に生じるという仮説に一致している。これは、miR−215がTP53陽性細胞中のp21CIP1/WAF1(p21、CDKN1A)の発現を誘導することを示す観察によってさらに実証されるが、TP53欠乏細胞中ではそうではない。意外なことに、miR−34aは、TP53+/+細胞だけでなくTP53欠失細胞のp21、PUMA及びMDM2を誘導することができた(図8)。この現象がSW48に特異的ではないことを保証するために、我々は、miR−34aで遺伝子導入された他のすべての同質遺伝子的な癌細胞をテストし、TP53によって転写的に制御される他の遺伝子にまで分析を拡張した。これらは、AKT/PKBの負の制御因子として機能するPHドメインのみのタンパク質である腫瘍抑制因子のPHLDA3と同様に、アポトーシス促進性のタンパク質BAX及びNOXAを含む(Kawase et al.,Cell 136:535−50(2009))。SW48細胞からのデータに一致して、miR−34aは、機能的なTP53が存在する状態だけでなく、存在しない状態においても、6つの転写物の蓄積を誘導した(図9A及び9B)。
<実施例4−HDAC1はmiR−34aの直接的な標的である>
p21CIP1/WAF1のTP53に依存しない上方制御のもっともらしい説明は、他のTP53ファミリーである、TP63及びTP73の潜在的な関与である。両タンパク質は、TP53とは異なる役割を果たす;しかしながら、それらは、さらに、TP53のそれと重複する遺伝子のセットを制御する。TP63及びTP73の内在性のmRNAレベルを、miR−34aで遺伝子導入されたTP53野生型及びTP53欠失細胞中で測定した。しかしながら、どの細胞も、これらの遺伝子産物の関与がありそうもないことを示唆する、検出できるレベルのTP63又はTP73を示さなかった(データは示していない)。
p21CIP1/WAF1のTP53に依存しない上方制御のもっともらしい説明は、他のTP53ファミリーである、TP63及びTP73の潜在的な関与である。両タンパク質は、TP53とは異なる役割を果たす;しかしながら、それらは、さらに、TP53のそれと重複する遺伝子のセットを制御する。TP63及びTP73の内在性のmRNAレベルを、miR−34aで遺伝子導入されたTP53野生型及びTP53欠失細胞中で測定した。しかしながら、どの細胞も、これらの遺伝子産物の関与がありそうもないことを示唆する、検出できるレベルのTP63又はTP73を示さなかった(データは示していない)。
次に、p21CIP1/WAF1の発現を制御できるTP53及び核制御因子に依存しない制御機構を分析した。興味のある候補の1つはHDAC1であり、なぜならば、その3’UTRに推定上のmiR−34a結合部位を有しており(図10)、miR−34aで遺伝子導入された細胞中で下方制御され(図11)、TP53が存在しない状態でのp21CIP1/WAF1の転写制御に関係づけられるためである(Lagger et al.,Mol Cell Biol 23(8):2669−79(2003))。HDAC1がmiR−34aによって直接的に抑制されるかどうかを証明するために、miR−34aを、HDAC1 3’UTR全体(SEQ ID NO:21)に融合するルシフェラーゼレポーターを抑制することができるかどうかを決定するために調べた。このレポーターは、内在性のmiR−34aを欠く2つの細胞株中で一時的に発現された。その後、細胞は、miR−34a(SEQ ID NO:3)又はmiR−215(SEQ ID NO:1)で遺伝子導入され、後者は、HDAC1の抑制は予測されず、負の対照として使用された。図12A中で示されるように、miR−34aの遺伝子導入は、制御に関連する両細胞株において50%まで発光を減少させた。この抑制は、miR−34a結合部位(SEQ ID NO:22)の変異で完全に消され(図12A)、これは、HDAC1 3’UTRがこの部位でmiR−34aに直接的に標的にされていることを示唆する。HDAC1のmiR−34aに依存する抑制がヒト腫瘍標本に反映されるかどうかをさらに評価するために、miR−34aの発現レベルを減少させた文献(非特許文献9)において以前使用された14の非小細胞肺癌サンプルのコホートを調べた。腫瘍HDAC1のmRNA及びmiR−34aのレベルを、qRT−PCRによって決定し、それぞれの正常隣接組織のレベルに基準化した。ピアソン法による分析は、HDAC1のmRNA及びmiR−34aのレベル間の統計的に有意な逆相関を示し(図12B)、これは、ヒト腫瘍中のHDAC1の制御において、miR−34aの役割を支援する。
<実施例5−HDAC1の阻害はmiR−34aの表現型を模倣する>
以前の結果は、p21CIP1/WAF1遺伝子の制御にHDAC1を関連付けた。例えば、HDAC1欠乏胚性幹細胞は、p21CIP1/WAF1の高められたレベルを示し、HDAC阻害剤のトリコスタチンA(TSA)を使用するHDAC1の阻害は、TP53がない場合でのp21CIP1/WAF1の発現を誘導し得る(Sowa et al.,1997; Lagger et al.,2002)。HDAC1の枯渇におけるp21CIP1/WAF1のTP53に依存しない誘導を確認するために、我々は、HDAC1にsiRNAでTP53陰性細胞を遺伝子導入し、ウエスタンブロットによって細胞溶解物を評価した。結果をmiR−34a又はmiR−215で遺伝子導入された細胞と比較した。2つの細胞株をテストし、負の対照として擬似的な及びmiR−NCで処理された細胞を含めた。予想通りに、miR−34aで遺伝子導入された細胞中で、Metは単独で下方制御され、HDAC1タンパク質は、miR−34a及びHDAC1のsiRNAの両方によって減少した(図13−14)。注目すべきことに、両方のオリゴヌクレオチドは、これらの細胞のp21CIP1/WAF1タンパク質の発現の著しい増大を誘導した。この観察は、TP53欠乏細胞のp21CIP1/WAF1を誘導しなかったmiR−215と著しく対照的であった。しかしながら、TP53陽性細胞へのmiR−215の遺伝子導入は、miR−215からTP53までの正のフィードバックループの結果として、p21CIP1/WAF1のmiR−215に依存する誘導はTP53によって触媒されるという仮説(Picchiori et al.,Cancer Cell 18(4):367−81(2011))と一致して、TP53陽性細胞のp21CIP1/WAF1タンパク質の増加をもたらした(図15)。
以前の結果は、p21CIP1/WAF1遺伝子の制御にHDAC1を関連付けた。例えば、HDAC1欠乏胚性幹細胞は、p21CIP1/WAF1の高められたレベルを示し、HDAC阻害剤のトリコスタチンA(TSA)を使用するHDAC1の阻害は、TP53がない場合でのp21CIP1/WAF1の発現を誘導し得る(Sowa et al.,1997; Lagger et al.,2002)。HDAC1の枯渇におけるp21CIP1/WAF1のTP53に依存しない誘導を確認するために、我々は、HDAC1にsiRNAでTP53陰性細胞を遺伝子導入し、ウエスタンブロットによって細胞溶解物を評価した。結果をmiR−34a又はmiR−215で遺伝子導入された細胞と比較した。2つの細胞株をテストし、負の対照として擬似的な及びmiR−NCで処理された細胞を含めた。予想通りに、miR−34aで遺伝子導入された細胞中で、Metは単独で下方制御され、HDAC1タンパク質は、miR−34a及びHDAC1のsiRNAの両方によって減少した(図13−14)。注目すべきことに、両方のオリゴヌクレオチドは、これらの細胞のp21CIP1/WAF1タンパク質の発現の著しい増大を誘導した。この観察は、TP53欠乏細胞のp21CIP1/WAF1を誘導しなかったmiR−215と著しく対照的であった。しかしながら、TP53陽性細胞へのmiR−215の遺伝子導入は、miR−215からTP53までの正のフィードバックループの結果として、p21CIP1/WAF1のmiR−215に依存する誘導はTP53によって触媒されるという仮説(Picchiori et al.,Cancer Cell 18(4):367−81(2011))と一致して、TP53陽性細胞のp21CIP1/WAF1タンパク質の増加をもたらした(図15)。
HDAC1の阻害がmiR−34aの表現型を模倣できるかどうかを調査するために、我々は、TP53陽性及びTP53欠乏のSW48細胞の両方のHDAC1に対するsiRNAの増殖効果を測定した。さらに、細胞を、TP53の機能に拮抗できる遺伝子産物に対して向けられた一連の他のsiRNAで遺伝子導入した。これらの遺伝子は、確認された又は予測されたmiR−34aの標的のどちらかであり、miR−34aに遺伝子導入された細胞の中で抑制された少数の他のものと同様に、YY1、MDM4及びSIRT1を含む(データは示していない)。siRNAの一時的な遺伝子導入は、qRT−PCRによって確認されるような標的mRNAの80%を越えるノックダウンをもたらした(図16A−16G)。さらに対照として、細胞を、miR−34a及びmiR−215で遺伝子導入した。我々は、両細胞株で同じである癌細胞の阻害のレベルをもたらすsiRNAを同定しようとした。予想通りに、miR−34aは等しくSW48+/+及びSW48−/−細胞を阻害し、miR−215の活性はTP53に依存した(図17)。ほとんどのsiRNAは、SIRT1及びYY1に対するsiRNAを含む一方の細胞タイプ中の細胞増殖を減少しなかった。MDM4のノックダウンは、SW48+/+細胞の増殖を阻害できたが、SW48−/−細胞において効果を有しなかった。これはmiR−215の表現型を暗示し、DNA制御よりむしろTP53のトランス活性化を調整する際のMDM4の役割を確認する(Toledo et al.,2006)。対照的に、HDAC1のノックダウンは、miR−34aと同様に癌細胞の成長を阻害し、それは同質遺伝子的な両細胞株において同じであった。同様の結果を、p21CIP1/WAF1を通してmiR−34aの反応を触媒する際のHDAC1のための役割をさらに実証する、トリコスタチンAで処置された細胞から得た(図18A−18B)。
<実施例6−p21の枯渇は癌細胞の増殖のmiR−34aによって誘導される阻害を妨げる>
様々な細胞株において作成された用量反応データは、p21CIP1/WAF1の発現が癌細胞の増殖のmiR−34aによって誘導される阻害において重要なイベントであることを示唆する。p21CIP1/WAF1の発現レベルはTP53陽性及びTP53陰性の細胞を阻害するmiR−34aの能力と著しく関連する。例えば、miR−34aの阻害活性は、MCF10A及びSW48細胞において同じであり、TP53−/−及びTP53+/+細胞の両方におけるp21CIP1/WAF1の同じ発現レベルと関連していた(図3)。HCT116細胞は、より高いmiR−34aの濃度(30nM、図3)でのTP53+/+細胞中のmiR−34aの阻害活性をわずかに増加させたものと一致して、TP53+/+細胞と比較してTP53−/−においてより高いp21CIP1/WAF1のmRNAのレベルを示した。RKO細胞において、p21CIP1/WAF1のレベルは、TP53−/−細胞においてより高く、RKO−/−対RKO+/+細胞における増殖の大きな阻害を反映した(図7A−7B)。さらに、p21CIP1/WAF1の誘導は、低いmiR−34aの濃度で明白であり、細胞増殖の阻害と逆に関連していた(図19)。
様々な細胞株において作成された用量反応データは、p21CIP1/WAF1の発現が癌細胞の増殖のmiR−34aによって誘導される阻害において重要なイベントであることを示唆する。p21CIP1/WAF1の発現レベルはTP53陽性及びTP53陰性の細胞を阻害するmiR−34aの能力と著しく関連する。例えば、miR−34aの阻害活性は、MCF10A及びSW48細胞において同じであり、TP53−/−及びTP53+/+細胞の両方におけるp21CIP1/WAF1の同じ発現レベルと関連していた(図3)。HCT116細胞は、より高いmiR−34aの濃度(30nM、図3)でのTP53+/+細胞中のmiR−34aの阻害活性をわずかに増加させたものと一致して、TP53+/+細胞と比較してTP53−/−においてより高いp21CIP1/WAF1のmRNAのレベルを示した。RKO細胞において、p21CIP1/WAF1のレベルは、TP53−/−細胞においてより高く、RKO−/−対RKO+/+細胞における増殖の大きな阻害を反映した(図7A−7B)。さらに、p21CIP1/WAF1の誘導は、低いmiR−34aの濃度で明白であり、細胞増殖の阻害と逆に関連していた(図19)。
p21CIP1/WAF1の発現がmiR−34aによって誘導される表現型に必要とされるかどうかについて取り組むために、我々は、p21CIP1/WAF1に対して向けられたmiR−34a及びsiRNAで共遺伝子導入する細胞による干渉アッセイを実施した。対照として、細胞を、miR−34a、miR−215又はmiR−NCで遺伝子導入した。それぞれのmiRNAを、遺伝子導入されたRNAの総量がmiR−34a/si−p21の組み合わせの1つと等しくなるように、負の対照のオリゴで補った。標的とされた遺伝子の下方制御は、ウエスタン解析によって証明された(図20)。miR−34aだけが、RKO細胞の増殖を20−30%まで減少させた(図21)。対照的に、miR−34a/si−p21の組み合わせは癌細胞の増殖に効果がなく、これは、p21CIP1/WAF1の発現が実際にmiR−34の腫瘍抑制因子の反応を触媒するために必要な因子であることを示唆する。p21CIP1/WAF1に依存する表現型は、p21CIP1/WAF1を欠く同質遺伝子的なSW48癌細胞(図22)及びTP53陰性のHep3B肝細胞癌細胞(図23)において再現できた。
<実施例7−インビボでのmiR−34aの模倣物の全身送達は、腫瘍のp21CIP1/WAF1の発現を誘導する>
miR−34aが癌を有する動物のp21CIP1/WAF1の上方制御を誘導するかどうかについて取り組むために、Hep3B肝細胞癌細胞を、NOD/SCIDマウスの肝臓の外側左葉へ外科的に移植した。Hep3B癌細胞は機能的なTP53を欠いている。約5週間後、検出できる大きな腫瘍をマウスが発達させた時、マウスの体重1kg当たり1mgの濃度でmiR−34aの模倣物の1用量を、静脈内尾静脈注射によって投与した。miR−34aの模倣物は、miR−34aの模倣物を含むリポソーム製剤である。1mg/kgの用量は、20μgのmiR−34aと等しい。24時間後、マウスを屠殺し、タンパク質溶解物の調製に使用する腫瘍組織を収集した。p21CIP1/WAF1タンパク質の発現を決定するために、ウエスタン解析によって溶解物を調査した。図24Aに示されるように、3匹のMRX34処置マウスのうちの2匹が高レベルでp21CIP1/WAF1を発現した。対照的に、対照の腫瘍のどれもが、p21CIP1/WAF1タンパク質の高められた発現を示さなかった。同様に、miR−34aで一時的に遺伝子導入されたHep3B細胞は、p21CIP1/WAF1の上方制御を示した。図24Bを参照されたい。データは、miR−34aに基づく治療が機能的なTP53を欠く腫瘍においてp21CIP1/WAF1を誘導できることを示唆する。
miR−34aが癌を有する動物のp21CIP1/WAF1の上方制御を誘導するかどうかについて取り組むために、Hep3B肝細胞癌細胞を、NOD/SCIDマウスの肝臓の外側左葉へ外科的に移植した。Hep3B癌細胞は機能的なTP53を欠いている。約5週間後、検出できる大きな腫瘍をマウスが発達させた時、マウスの体重1kg当たり1mgの濃度でmiR−34aの模倣物の1用量を、静脈内尾静脈注射によって投与した。miR−34aの模倣物は、miR−34aの模倣物を含むリポソーム製剤である。1mg/kgの用量は、20μgのmiR−34aと等しい。24時間後、マウスを屠殺し、タンパク質溶解物の調製に使用する腫瘍組織を収集した。p21CIP1/WAF1タンパク質の発現を決定するために、ウエスタン解析によって溶解物を調査した。図24Aに示されるように、3匹のMRX34処置マウスのうちの2匹が高レベルでp21CIP1/WAF1を発現した。対照的に、対照の腫瘍のどれもが、p21CIP1/WAF1タンパク質の高められた発現を示さなかった。同様に、miR−34aで一時的に遺伝子導入されたHep3B細胞は、p21CIP1/WAF1の上方制御を示した。図24Bを参照されたい。データは、miR−34aに基づく治療が機能的なTP53を欠く腫瘍においてp21CIP1/WAF1を誘導できることを示唆する。
Claims (35)
- 癌を有する被検体を処置する方法であって、前記方法は:
(a)miR−34活性の少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在又は不在について被検体をスクリーニングする工程;
(b)miR−34活性のための必須のバイオマーカーが存在すると決定される場合に、被検体にmiR−34治療薬を投与する工程;及び
(c)miR−34活性のための必須のバイオマーカーが存在しない場合、被検体に代替療法を施す工程、
を含み、それによって被検体を処置する、方法。 - 被検体が、肺癌、膵癌、肝臓の癌、肝細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、食道癌又は結腸癌を有することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの必須のバイオマーカーが、p21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3、MDM2及びHDAC1からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの必須のバイオマーカーが、p21CIP1/WAF1を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 被検体をスクリーニングするための単独の必須のバイオマーカーが、p21CIP1/WAF1であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- miR−34が、miR−34a、miR−34b、miR−34c、miR−449a、miR−449b、又はmiR−449cであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 代替療法が、中断された治療であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- miR−34治療薬が、miR−34を含み、さらに随意にmiR−215及びmiR−192の少なくとも1つを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 代替療法が、非miR−34マイクロRNA治療であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 代替療法が、化学療法、放射線療法及び手術から選択され、されに随意にmiR−215及びmiR−192の少なくとも1つを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 被験体が、p21CIP1/WAF1陽性癌細胞を有すると決定されたことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 被験体が、p21CIP1/WAF1陽性癌細胞及びp53欠乏癌細胞を有すると決定されたことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 被験体が、機能的なp53タンパク質を欠失している癌細胞を有すると決定されたことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 被験体が、野性型又はヘテロ接合性のp21CIP1/WAF1遺伝子を有する癌細胞を有すると決定されたことを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 被験体が、p53欠乏癌細胞を有すると決定され、被験体が、p21WAF1/CIP1の有無についてスクリーニングされ、p21WAF1/CIP1が存在すると決定される場合、miR−34治療薬が被験体に投与され、p21WAF1/CIP1が存在しないと決定される場合、miR−34治療薬が中断されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- miR−34治療薬で処置されている被検体の癌治療に対する反応を決定する方法であって、前記方法は:
(a)被検体のmiR−34活性の少なくとも1つのバイオマーカーの第1のレベルを測定する工程;
(b)被検体にmiR−34治療薬を投与する工程;
(c)被検体のバイオマーカーの第2のレベルを測定する工程;
(d)第1のレベルと比較して第2のレベルがmiR−34治療の効果を示す場合、被検体にさらにmiR−34治療薬を投与する工程;及び
(e)第1のレベルと比較して第2のレベルがmiR−34治療の不十分な効果を示す場合、被検体に代替療法を施す工程、
を含み、それによって癌治療への被検体の反応を決定する、方法。 - 被検体が、肺癌、膵癌、肝臓の癌、肝細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、食道癌又は結腸癌を有することを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 第1のレベルから第2のレベルの10%の差異が、miR−34治療薬の効果を示すことを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- (b)及び(d)のmiR−34治療薬が同じであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 代替療法が、非マイクロRNA治療であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 非マイクロRNA治療が、中断された治療、化学療法、放射線療法又は手術であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 代替療法が、非miR−34マイクロRNA治療であることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 代替療法が、miR−215及びmiR−192の少なくとも1つを含むことを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 少なくとも1つのバイオマーカーが、miR−34活性の必須のバイオマーカーであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 少なくとも1つの必須のバイオマーカーがp21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3及びMDM2からなる群から選択され、第2のレベルが第1のレベルより高い場合に効果が示されることを特徴とする、請求項24に記載の方法。
- 少なくとも1つの必須のバイオマーカーがHDAC1であり、第2のレベルが第1のレベルより低い場合に効果が示されることを特徴とする、請求項24に記載の方法。
- 少なくとも1つの必須のバイオマーカーがp21CIP1/WAF1であり、代替療法が中断された治療であることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
- 被検体の癌細胞を処置する方法であって、前記方法は:p53欠乏及びp21CIP1/WAF1陽性の癌細胞を有する被検体を選択する工程、及びmiR−34治療薬で被検体を処置する工程を含む、方法。
- 被検体が、肺癌、膵癌、肝臓の癌、肝細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、食道癌又は結腸癌を有することを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 被検体が、膀胱癌、食道癌、乳癌又は胃癌を有することを特徴とする、請求項29に記載の方法。
- 被検体が、白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性単球性白血病(AMoL)、リンパ腫、ホジキンリンパ腫(4つのすべてのサブタイプ)、濾胞性リンパ腫、B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(すべてのサブタイプ)、骨髄腫、多発性骨髄腫、又は骨髄異形成症候群を有することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 必須のバイオマーカーが、DNA、mRNA又はタンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- DNAが、発現抑制されず、いずれかの不活性化する変異がない遺伝子であることを特徴とする、請求項32に記載の方法。
- (i)少なくとも1つの必須のバイオマーカーがp21CIP1/WAF1、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3及びMDM2からなる群から選択され、(ii)少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在が参照レベル以上の発現レベル又は活性レベルを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- (i)少なくとも1つの必須のバイオマーカーがHDAC1であり;(ii)少なくとも1つの必須のバイオマーカーの存在が参照レベル以下の発現レベル又は活性レベルを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
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