JP2016529890A - １段階自己加水分解前処理及び酵素加水分解を利用してリグノセルロース系バイオマスを処理する方法 - Google Patents

Abstract

リグノセルロース系バイオマスを処理する方法であって、ソフトリグノセルロース系バイオマス原料を準備するステップと、1段階加圧水熱前処理において、原料を、3.5〜9.0の範囲内のpHで、log過酷度Roが3.75以下になるまで前処理して、非溶解固体が少なくとも5.0重量%のキシランを含む前処理されたバイオマススラリーを生成するステップと、前処理されたバイオマスを、エンドグルカナーゼ活性、エキソグルカナーゼ活性、β-グルコシダーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、及びβ-キシロシダーゼ活性を少なくとも1100（nkat/gグルカン）のエンドグルカナーゼ活性レベル、少なくとも280（nkat/gグルカン）のエキソグルカナーゼ活性レベル、少なくとも3000（nkat/gグルカン）のβ-グルコシダーゼ活性レベル、少なくとも1400（nkat/gグルカン）のエンドキシラナーゼ活性レベル、及び少なくとも75（nkat/gグルカン）のβ-キシロシダーゼ活性レベルで含む酵素混合物により触媒される少なくとも24時間の酵素加水分解を利用して、補助水分を添加して又は添加せずに加水分解して、C5モノマーの収率が前処理前の原料の元のキシロース及びアラビノース含量の少なくとも55%である加水分解物を生成するステップと、を含む方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、概して、リグノセルロース系バイオマスを発酵性糖に処理する方法、特に水熱前処理に依存する方法に関する。

石油及び他の化石燃料への歴史的な依存は、温室効果ガスの大気中レベルの劇的な憂慮すべき増加に関係している。温室効果ガス蓄積を軽減するために、多くの国々で、公式の政策指示により支持された国際的な取り組みがなされている。これらの軽減への取り組みの中心的な1つの焦点は、燃料及び他の化学製品の前駆体の源としての石油を置き換えるために、再生可能植物バイオマスを利用するためのプロセス及び技術を開発することである。地球上の植物由来バイオマスの年間増加量は、乾燥重量で毎年約1×10^11メートルトンであると推定されている。Lieth及びWhittaker(1975)を参照されたい。したがって、バイオマス利用は、持続可能な経済の発展における最終的な目標である。

サトウキビ、根菜及び穀類作物等の糖及びデンプン系植物材料から生成される燃料エタノールは、すでに幅広く使用されており、現在世界的生産量は、毎年730億リットルを超える。エタノールは、かねてから化石燃料の許容される代替物と考えられており、燃料ブレンドへの添加剤として、又はさらに個人車用の燃料として直接、容易に使用することができる。しかしながら、これらの「第1世代」バイオエタノール技術により生成されるエタノールの使用は、実際には、温室効果ガス排出の劇的な低減を実現していない。正味の削減量は、最終エタノール生産量に対する全化石燃料投入量を全て考慮した場合、石油と比較してわずか約13%である。Farrellら(2006)を参照されたい。さらに、「第1世代」バイオエタノール市場に対し、経済的及び道徳的な面の両方から異議が唱えられている。これは実際に、人間の食物としての作物の需要を、個人車のための需要と直接競合させるものである。また、実際に、燃料エタノールの需要は、貧しい穀物輸入国にとって問題となることが判明している穀物価格の上昇に関連している。

リグノセルロース系バイオマス、例えば作物廃棄物(茎、穂軸、核、柄、殻、皮等)、草、わら、木片、古紙等から、バイオエタノール及び他の生成物が生成され得る、食用作物を消費しないバイオマス変換システム、いわゆる「第2世代」バイオ精製の開発に大きな関心が寄せられている。「第2世代」技術において、主にセルロースから得られる発酵性6炭素(C6)糖、及びヘミセルロースから得られる発酵性5炭素(C5)糖が、酵素加水分解により、又はいくつかの場合には、純粋な化学的加水分解により、バイオマス多糖類ポリマー鎖から遊離する。「第2世代」バイオ精製においてバイオマス変換から得られる発酵性糖は、燃料エタノール、若しくは代替としてブタノール等の他の燃料、又は、バイオプラスチックの合成における使用のための乳酸モノマー、又は、他の多くの生成物を生成するために使用され得る。

C5及びC6糖の両方の全収率は、リグノセルロース系バイオマス処理の商業化における中心的考慮点である。エタノール生成、及びラクテート又は他の化学物質の生成の場合、C5及びC6糖プロセスストリームの両方を1つの糖溶液に組み合わせることが有利となり得る。エタノール生成においてC5及びC6糖の両方を効率的に消費し得る改変された発酵生物が、現在利用可能である。例えば、Madhavanら(2012)、Dumonら(2012)、Huら(2011)、Kuhadら(2011)、Ghoshら(2011)、Kurianら(2010)、Jojimaら(2010)、Sanchezら(2010)、Bettigaら(2009)、Matsushikaら(2009)を参照されたい。

その物理的構造の制限のため、リグノセルロース系バイオマスは、いくつかの前処理プロセスなしには、酵素加水分解により発酵性糖に効果的に変換することができない。様々な異なる前処理スキームが報告されており、それぞれ、異なる利点及び欠点を提供する。再検討のために、Agborら(2011)、Girioら(2010)、Alviraら(2010)、Taherzadeh及びKarimi(2008)を参照されたい。環境的及び「再生可能性」の観点から、水熱前処理が特に魅力的である。これらは、約160〜230℃の温度の加圧蒸気/液体の熱水を利用して、セルロースストランドと複雑に関連した疎水性リグニンを穏やかに溶解し、C5糖に富むヘミセルロースの主成分を可溶化し、生産的酵素結合への接近性を改善するようにセルロースストランドを破壊する。水熱前処理は、既存の石炭及びバイオマス燃焼発電プラントと都合よく統合して、タービン蒸気及び「余剰」発電容量を効率的に利用することができる。

水熱プロセスの場合、競合する目的の間で前処理を最適化しなければならないことが、当該技術分野において周知であり、広く議論されている。一方、前処理は、理想的には、モノマー性ヘミセルロース由来糖の最終的収率を最大化するために、ヘミセルロース糖含量を維持するべきである。さらに、それと同時に、前処理は、モノマー性セルロース由来糖の妥当な収率を最小限の酵素消費で得ることができるような酵素加水分解の感受性へと、セルロース鎖を十分に暴露し、事前に調整するべきである。酵素消費もまた、現在定義されているような「世界市場経済」に関連する「経済的採算性」の境で揺れているバイオマス処理の商業化における、中心的考慮点である。近年における劇的な改善にもかかわらず、市販の酵素調製物の高いコストが、バイオマス変換における最も高い運営コストの1つとなっている。

水熱前処理温度及び反応器滞留時間が増加すると、フルフラール及び縮合反応の生成物を含む他の物質への化学的転換に起因して、ヘミセルロースから得られるC5糖のより高い生成量が、回復不可能なほど失われる。モノマー性6炭素グルコースへの効率的な酵素加水分解のためにセルロース繊維を適切に調整するためには、さらに高い温度及び滞留時間が必要である。

先行技術において、水熱前処理のしばしば使用されるパラメータの「過酷度」は、典型的には対数値として言及される「R_o」である。Roは、式R_o=tEXP[T-100/14.75](式中、tは、分単位の滞留時間であり、Tは、摂氏温度での反応温度である)に従う、前処理温度及び反応器滞留時間の複合的尺度である。

所与のバイオマス原料に対する前処理条件の最適化には、本来、ヘミセルロースからの高いモノマー性C5糖収率(低過酷度)の要求と、セルロースからの高いモノマー性C6糖収率(高過酷度)の要求との間にある程度の妥協点が必要である。

ヘミセルロース及びセルロースの両方からの糖収率を最大化するための、並びにセルラーゼ触媒のキシロオリゴマー阻害を最小限化するための、様々な異なる水熱前処理戦略が報告されている。いくつかの場合において、ヘミセルロース分解(酸、pH<3.5)又はリグニン可溶化(塩基、pH>9.0)を触媒するために、外因性の酸又は塩基が添加される。他の場合において、水熱前処理は、リグノセルロース自体から得られる非常に弱い酢酸(pH3.5〜9.0)のみを使用して行われる。これらの弱pH条件下での水熱前処理は、ヘミセルロースエステル自体から遊離した酢酸がヘミセルロース加水分解をさらに触媒するため、「自己加水分解」プロセスと呼ばれている。

酸触媒の存在下ではより低い温度でも同等のヘミセルロース可溶化が生じ得るため、「希酸」又は「酸浸漬」処理として知られる酸触媒水熱前処理は、典型的には高収率のC5糖を提供する。希酸前処理に続く酵素加水分解後の全C5糖収率は、典型的には、所与のバイオマス原料から理論的に遊離し得るものの約75%以上である。例えば、Baboukaniuら(2012)、Wonら(2012)、Luら(2009)、Jeongら(2010)、Leeら(2008)、Sassnerら(2008)、Thomsenら(2006)、Chungら(2005)を参照されたい。

対照的に、酸触媒の非存在下ではより高い温度での前処理が必要であるため、自己加水分解水熱前処理は、典型的にはそれよりはるかに低い収率のC5糖を提供する。商業的に非現実的な低い乾燥物質含量で行われる自己加水分解前処理を除いて、自己加水分解処理は、典型的には理論的回収率の40%未満のC5糖収率を提供する。例えば、Diazら(2010)、Dogarisら(2009)を参照されたい。商業的に非現実的な反応時間及び極めて高い酵素用量が使用された場合において、自己加水分解からの53%もの高いC5収率が報告されている。しかしながら、これらの非常に高いC5収率でさえも、希酸前処理を使用して日常的に得られるレベルをはるかに下回っている。例えば、Leeら(2009)、Ohgrenら(2007)を参照されたい。

自己加水分解により得られるより低いC5収率の結果、商業的バイオマス変換システムにおける水熱前処理に関するほとんどの報告は、希酸プロセスに焦点を置いている。いわゆる「2段階」希酸前処理の使用により、約85%のヘミセルロース由来C5糖収率が達成されている。2段階前処理においては、より低い初期温度を使用してヘミセルロースが可溶化され、その後C5に富む液体画分が分離される。第2の段階において、より高い温度を使用してセルロース鎖が調整される。例えば、Mesaら(2011)、Kimら(2011)、Chenら(2010)、Jinら(2010)、Monavariら(2009)、Soderstromら(2005)、Soderstromら(2004)、Soderstromら(2003)、Kimら(2001)、Leeら(1997)、Paptheofanousら(1995)を参照されたい。米国国立再生可能エネルギー研究所(US National Renewable Energy Laboratory、NREL)により報告された1つの精密な「2段階」希酸前処理システムは、原料としてトウモロコシ茎葉を使用して、約90%のC5収率を達成したと主張している。Humbirdら(2011)を参照されたい。

自己加水分解は、それにより提供されるC5収率がより低いにもかかわらず、依然として商業規模での希酸前処理に勝る競走上の利点を提供する。

自己加水分解プロセスの利点のうち最も注目すべきは、加水分解していない残留リグニンが、希酸プロセスから回収されたリグニンと比較して、非常に高い市場価値を有することである。第1に、希酸前処理において典型的に使用される硫酸は、残留硫黄含量をもたらす。これにより、得られるリグニンは、別様には「環境に優しい」石炭代替物として自己加水分解から得られる硫黄不含リグニン燃料ペレットを消費する傾向にある商業的発電所にとって、魅力がなくなる。第2に、硫酸触媒水熱前処理中に生じるリグニンのスルホン化により、リグニンは比較的親水性となり、それにより機械的な保水能力が増加する。この親水性は、商業的使用のためのリグニンの乾燥のコストを増加させると共に、リグニンの水分を吸収する傾向を考慮すると、屋外保存に好適でないものとする。希酸前処理による、リグノセルロース系バイオマス変換のためのNRELのプロセスのいわゆる「技術経済モデル」は、リグニンを販売可能な商品としてではなく、プロセス蒸気用の燃料の内部源として説明するのみである。Humbirdら(2011)を参照されたい。対照的に、自己加水分解に依存するプロセススキームの「経済的採算性」は、清浄な乾燥リグニンペレットの堅調な販売からの大きな寄与を含む。これは、典型的なソフトリグノセルロース系バイオマス原料が、乾燥物質含量の10%〜40%の高い割合のリグニンを含むという点で、特に重要である。したがって、自己加水分解システムからのプロセス糖収率が、希酸システムと比べて減少し得るとしても、全体的な「採算性」は同等のままであるか、又はさらにそれより高くなり得る。

自己加水分解プロセスはまた、希酸の他の周知の欠点を回避する。「環境に優しい」処理が好まれる哲学的方向性から逸脱する硫酸の必要性は、プロセス材料としての酸の相当な運営コストを導入し、精密な廃水処理システム、及び高価な耐食性機器が必要になる。

自己加水分解はまた、控え目な処理シナリオに有利に拡張可能である。NRELにより説明される希酸プロセスは、非常に複雑及び精密であり、より小規模で構築するのは現実的に不可能であり、1時間当たり約100トンのバイオマス原料の巨大規模でのみ可能である。そのような規模は、超集約的バイオマス処理シナリオにおいてのみ適切である。Humbirdら(2011)を参照されたい。トウモロコシ茎葉の超集約型バイオマス処理は、化学的に増強された過剰生産において栽培される遺伝子組み換えトウモロコシが豊富な米国においては、十分適切となり得る。しかしながら、そのようなシステムは、世界の他の国ではより関連性が低い。そのようなシステムは、控え目なバイオマス処理シナリオ、例えば、遺伝子組み換え及び化学的増強を用いても、典型的にはトウモロコシよりもはるかに少ないヘクタール当たりのバイオマスを生成する、サトウキビ若しくはヤシ油若しくはソルガム畑でのオンサイト処理、又は麦わらの地域的処理には不適切である。

自己加水分解システムは、希酸とは対照的に、法的に「環境に優しく」、容易に拡張可能であり、精密な廃水処理システムの必要性による重荷がない。したがって、糖収率の点だけでは希酸システムより明らかに有利ではない可能性があるとしても、改善された自己加水分解システムを提供することが有利である。

自己加水分解による低いC5モノマー収率の問題により、一般に、リグノセルロース系バイオマス処理技術の商業的提供者は、他の手法を追求することを余儀なくされた。改善されたC5収率を提供するように設計された、いくつかの「2段階」前処理システムが、自己加水分解前処理と共に報告されている。特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６を参照されたい。これらの「2段階」前処理スキームにおいて、いくつかのC5に富む液体画分は、より低温での前処理の後に固体/液体分離により除去され、その後、より高温での固体画分の前処理が続く。これらの公開特許出願のほとんどは、実際の実験結果を報告していない。特許文献１におけるその2段階自己加水分解前処理の説明において、Chemtex Italiaは、麦わらを使用した全部で26の実験例を、52%の平均C5糖回収率と共に報告している。これらのC5回収率値は、エタノール及び他の有用な生成物への発酵において実際に消費される基質である、C5回収率自体とモノマー糖収率とを区別していない。

リグノセルロース系バイオマスを処理するためのスキームに第2の前処理段階を導入すると、追加的な複雑性及びコストがもたらされる。したがって、単純な1段階自己加水分解システムを使用して、2段階前処理の利点を実質的に達成することが有利である。

国際公開第２０１０／１１３１２９号 米国特許出願公開第２０１０／０２７９３６１号明細書 国際公開第２００９／１０８７７３号 米国特許出願公開第２００９／０３０８３８３号明細書 米国特許第８，０５７，６３９号明細書 米国特許出願公開第２０１３／００２９４０６号明細書

我々は、1段階自己加水分解前処理が非常に低い過酷度まで行われる場合、妥当なグルコース収率を達成しながらも、理論的収率の55%以上という予想外に高い最終C5モノマー収率を達成できることを発見した。バイオマス原料が前処理された材料の非溶解固体の含量が少なくとも5.0重量%の残留キシラン含量を維持するような低い過酷度まで前処理される場合、前処理中のC5の損失が最小限化される。。さらに、予想に反して、この非常に高い残留キシラン含量は、酵素加水分解中、十分に高いキシラナーゼ活性及びキシロシダーゼ活性が使用される場合、非常に低いパーセンテージのグルコースへのセルロース変換のみを犠牲にしながら、高い回収率でキシロースモノマーに酵素加水分解され得る。

これらの非常に低い過酷度のレベルにおいて、セルラーゼ活性又は発酵生物に影響する可溶性副生成物の生成は低く維持されるので、前処理された材料は、典型的にはいかなる洗浄又は他の解毒ステップも必要とせずに、直接、酵素加水分解及びその後の発酵に使用され得る。

自己加水分解前処理に供されたソフトリグノセルロース系バイオマス原料の、前処理過酷度係数の関数としてのキシラン価を示す図である。 前処理された原料の、キシラン価の関数としての非溶解固体中のキシランの重量パーセンテージを示す図である。 自己加水分解前処理に供されたソフトリグノセルロース系バイオマス原料の、キシラン価の関数としての可溶性及び不溶性形態でのC5回収率を示す図である。 自己加水分解前処理に供されたソフトリグノセルロース系バイオマス原料の、キシラン価の関数としての全C5回収率を示す図である。 自己加水分解前処理に供されたソフトリグノセルロース系バイオマス原料の、キシラン価の関数としての酢酸、フルフラール及び5-HMFの生成を示す図である。 非常に低い過酷度の自己加水分解前処理に供されたソフトリグノセルロース系バイオマス原料の、セルロース変換率に対する溶解固体の除去の効果を示す図である。 非常に低い過酷度の自己加水分解前処理に供されたソフトリグノセルロース系バイオマス原料からの液体画分の、HPLC特性決定を示す図である。 固体画分が酵素加水分解に供され、続いて、後加水分解のために液体画分が導入された場合の、時間の関数としてのC5糖回収率を示す図である。 非常に低い過酷度の自己加水分解により前処理され、酵素加水分解され、解毒して発酵阻害物質を除去せずに、合わせられた液体及び固体画分として使用された麦わらを使用した、改変酵母株によるエタノール発酵の発酵プロファイルを示す図である。 一実施形態のプロセススキームを示す図である。 C5バイパスにおける、時間の関数としてのセルロース変換率を示す図である。 C5バイパスにおける、時間の関数としてのキシラン変換率を示す図である。 全スラリーにおける、時間の関数としてのセルロース変換率を示す図である。 全スラリーにおける、時間の関数としてのキシラン変換率を示す図である。 全スラリーにおける、加水分解時間の関数として前処理及び加水分解後の全C6及びC5回収率を示す図である。

いくつかの実施形態において、本発明は、リグノセルロース系バイオマスを処理する方法であって、
ソフトリグノセルロース系バイオマス原料を準備するステップと、
1段階加圧水熱前処理において、原料を、3.5〜9.0の範囲内のpHで、log過酷度Roが3.75以下になるまで前処理して、非溶解固体が少なくとも5.0重量%のキシランを含む前処理されたバイオマススラリーを生成するステップと、
前処理されたバイオマスを、エンドグルカナーゼ活性、エキソグルカナーゼ活性、β-グルコシダーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、及びβ-キシロシダーゼ活性を少なくとも1100（nkat/gグルカン）のエンドグルカナーゼ活性レベル、少なくとも280（nkat/gグルカン）のエキソグルカナーゼ活性レベル、少なくとも3000（nkat/gグルカン）のβ-グルコシダーゼ活性レベル、少なくとも1400（nkat/gグルカン）のエンドキシラナーゼ活性レベル、及び少なくとも75（nkat/gグルカン）のβ-キシロシダーゼ活性レベルで含む酵素混合物により触媒される少なくとも24時間の酵素加水分解を利用して、補助水分を添加して又は添加せずに加水分解して、C5モノマーの収率が前処理前の原料の元のキシロース及びアラビノース含量の少なくとも55%である加水分解物を生成するステップと、
を含む方法を提供する。

いくつかの実施形態において、前処理されたバイオマスは固体画分及び液体画分の両方を含む全スラリーとして加水分解される。

本明細書において使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有する。

「約」は、本明細書において量的数値又は範囲に関して使用される場合、相対的に見て、言及される数又は範囲の+/-10%を指す。

「自己加水分解」は、前処理中にヘミセルロース加水分解により遊離した酢酸が、ヘミセルロース加水分解をさらに触媒する前処理プロセスを指し、3.5〜9.0のpHで行われるリグノセルロース系バイオマスの任意の水熱前処理に該当する。

「リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物」は、前処理されたリグノセルロース系バイオマスの酵素加水分解を提供するのに十分であり、またエンドセルラーゼ(エンドグルカナーゼ)活性、エキソセルラーゼ(エキソグルカナーゼ)活性、エンドキシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性及びβ-グルコシダーゼ活性を含む、酵素活性の市販の混合物を指す。「リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された」という用語は、酵素混合物が、前処理されたリグノセルロース系バイオマスの発酵性糖への加水分解における加水分解収率を改善する、及び/又は酵素消費を低減するという特定の目的のために選択及び/又は改変された、製品開発プロセスを指す。

乾燥物質レベル「において(で)」前処理を行うということは、加圧水熱前処理の開始時の原料の乾燥物質含量を指す。前処理は、バイオマスの水分のpHが、加圧水熱前処理の開始時のpHであるpH「において(で)」行われる。

DMとしても示される「乾燥物質」は、可溶性及び不溶性両方の全固体を指し、事実上「非水分量」を意味する。乾燥物質含量は、105℃で一定重量が達成されるまで乾燥させることにより測定される。

「繊維構造」は、前処理後の繊維断片の平均サイズが750umを超える限り維持される。

「グルカン」は、本明細書で使用される場合、セルロース及び他のグルコ-オリゴマーを指す。

「水熱前処理」は、高温液体、気化蒸気、又は高温液体若しくは蒸気若しくはその両方を含む加圧蒸気としての水を使用して、酸又は他の化学物質を添加して又は添加せずに、120℃以上の温度でバイオマスを「加熱処理」することを指す。

「1段階加圧水熱前処理」は、バイオマスを単一の通過で加熱するように構成される単一反応器内で、バイオマスが加圧水熱前処理を受ける前処理であって、加圧水熱前処理に供された原料から液体画分を除去するための固体/液体分離ステップの後、それ以上加圧水熱前処理が適用されない前処理を指す。

「固体/液体分離」は、圧縮による力、遠心力又は他の力の印加により固体から液体が分離される、能動的機械プロセスを指す。

「ソフトリグノセルロース系バイオマス」は、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを含む木以外の植物バイオマスを指す。

「固体画分」及び「液体画分」は、固体/液体分離における前処理されたバイオマスの分別を指す。分離された液体は、集合的に「液体画分」と呼ばれる。相当量の不溶性固体含量を含む残留画分は、「固体画分」と呼ばれる。「固体画分」は、乾燥物質含量を有し、典型的には、相当量の残留「液体画分」も含む。

「理論的収率」は、ポリマーセルロースから、又はポリマーヘミセルロース構造から得られたモル当量の純粋なモノマー糖を指し、構成モノマー糖はまた、エステル化又は別様に置換されてもよい。理論的収率のパーセンテージとしての「C5モノマー収率」は、以下のように決定される。前処理の前に、バイオマス原料は、Sluiterら(2008)の強酸加水分解法を用い、ガラクトース及びマンノースがキシロースと共溶出するHPLCカラム及び溶出システムを使用して、炭水化物について分析される。そのようなシステムの例は、Phenomenex製REZEX(商標)Monossacharide H+カラム及びBiorad製AMINEX HPX 87C(商標)カラムを含む。強酸加水分解中、エステル及び酸に不安定な置換が除去される。別段に指定される場合を除き、前処理されていないバイオマスにおいて決定される「キシロース」+アラビノースの総量は、100%理論的C5モノマー回収率とみなされ、これは集合的に「C5モノマー回収率」と呼ぶことができる。モノマー糖の決定は、精製外部標準を用いた標準曲線に基づき、HPLC特性決定を使用してなされる。実際のC5モノマー回収率は、C5モノマーの直接測定用の試料のHPLC特性決定により決定され、これは次いで、理論的収率のパーセントとして表現される。

「キシラン価」は、以下のように決定される前処理されたバイオマスの特性決定を指す。前処理されたバイオマスは、全体の約30%が固体（約30%の全固体）で得られ、典型的に固体/液体分離の後に、固体画分、及び液体画分が提供される。次いで、この約30%の全固体を有する前処理されたバイオマスは、1:3の全固体(DM)対水の重量比で70℃の水と混合することにより、部分的に洗浄される。このようにして洗浄された前処理されたバイオマスは、次いで約30%の全固体まで圧縮される。このようにして洗浄され、約30%の全固体まで圧縮された、前処理されたバイオマスのキシラン含量は、参照により全体が本明細書に明示的に組み込まれるA. Sluiterら、「Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass」、US National Renewable Energy Laboratory (NREL) Laboratory Analytical Procedure (LAP)(発行日2008年4月25日、Technical Report NREL/TP-510-42618(2008年4月改訂)に記載)の方法を使用して決定される。ガラクトース及びマンノースがキシロースと共溶出するHPLCカラム及び溶出システムが使用される。そのようなシステムの例は、Phenomenex製REZEX(商標)Monossacharide H+カラム及びBiorad製AMINEX HPX 87C(商標)カラムを含む。説明されるようなこのキシラン含量の測定は、これらの条件下において固体画分から洗浄されていない残留液体画分からの可溶性物質のある程度の寄与を含む。したがって、「キシラン価」は、不溶性固体中の残留キシラン含量、並びに「液体画分」中の可溶性キシロース及びキシロオリゴマー含量の「加重した組合せ」の測定値を提供する。

非溶解固体のキシラン含量は、前処理されたバイオマスの代表試料を取出し、それを固体/液体分離に供して、少なくとも30%の全固体を有する固体画分を提供することによって決定される。次いで、この少なくとも30%の全固体を有する前処理されたバイオマスは、1:3の全固体(DM)対水の重量比で70℃の水と混合することにより、部分的に洗浄される。このようにして洗浄された前処理されたバイオマスは、次いで少なくとも30%の全固体まで圧縮され、再度1:3の全固体(DM)対水の重量比で70℃の水と混合することにより洗浄される。次いで、この洗浄された材料は再度少なくとも30%の全固体まで圧縮され、再度1:3の全固体(DM)対水の重量比で70℃の水と混合することにより洗浄される。次いで、この洗浄された材料は再度少なくとも30%の全固体まで圧縮され、分析するための非溶解固体の試料として使用される。次いで、非溶解固体試料のキシラン含量は、キシラン価の測定に関する上記説明に記載のように決定され、試料の全固体含量の重量パーセンテージとして表される。

少なくとも、麦わら、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ穂軸、空果房、稲わら、オート麦わら、大麦わら、菜種わら、ライ麦わら、ソルガム、スイートソルガム、大豆茎葉、スイッチグラス、ギョウギシバ及びその他の草、バガス、ビートパルプ、トウモロコシ繊維、又はそれらの任意の組合せ等のバイオマスを含む、任意の好適なソフトリグノセルロース系バイオマスが使用され得る。リグノセルロース系バイオマスは、紙、新聞紙、ダンボール、又は他の都市若しくはオフィス廃棄物等の他のリグノセルロース系材料を含んでもよい。リグノセルロース系バイオマスは、異なる原料に由来する材料の混合物として使用されてもよく、生の、部分的に乾燥した、若しくは完全に乾燥したもの、又はそれらの任意の組合せであってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、少なくとも約10kg、又は少なくとも100kg、又は少なくとも500kgのバイオマス原料を使用して実行される。

リグノセルロース系バイオマスは、緩く組織化されたヘミセルロースのマトリックス内にインターカレートされ、疎水性リグニンに富む環境内に封入された結晶セルロース繊維を含む。セルロース自体は、D-グルコースの長い直鎖ポリマーを含むが、ヘミセルロースは、全ての5炭素アルドペントース(C5糖)、並びにグルコース及びマンノースを含むいくつかの6炭素(C6)糖のモノマーを含む、短い分岐鎖炭水化物の不均質混合物である。リグニンは、極めて不均質なポリマーであり、任意の特定の主構造を持たず、疎水性フェニルプロパノイドモノマーを含む。

好適なリグノセルロース系バイオマスは、典型的には、前処理前の乾燥質量の20%〜50%の量のセルロース、前処理前の乾燥質量の10%〜40%の量のリグニン、及び15%〜40%の量のヘミセルロースを含む。

いくつかの実施形態において、バイオマス原料は、水熱前処理の前に、粒子サイズ低減及び/又は他の機械的処理、例えば粉砕、ミリング、寸断、切断、又は他のプロセスに供されてもよい。いくつかの実施形態において、バイオマス原料は、加圧前処理の前に、Knudsenら(1998)において説明されるように、有益な塩を洗浄及び/又は浸出されてもよい。いくつかの実施形態において、原料は、加圧前処理の前に、99℃までの温度で浸漬されてもよい。

いくつかの実施形態において、原料は、水熱前処理の前に、まず水溶液中に浸漬される。いくつかの実施形態において、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，１２３，８６４号明細書に記載のように、前処理において、後のステップから得られる酢酸含有液体中に原料を浸漬させることが有利となり得る。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／９３５，５８７号明細書に記載のように、可能な限り高い乾燥物質含量で処理を行うことが有利である。高い乾燥物質で前処理を行うことは、不必要な水の加熱に対するプロセスエネルギーの支出を回避する。しかしながら、酵素加水分解からの最適な最終糖収率を達成するために、ある程度の水分は必要である。典型的には、その本来の保水能力で、又はその付近でバイオマス原料を前処理することが有利である。これは、所与の原料が、過剰の水の中での浸漬に続く、通常の商業的スクリュープレスの機械的限界までの圧縮の後に到達する水分のレベル、典型的には30%〜45%DMである。いくつかの実施形態において、水熱前処理は、少なくとも35%のDM含量で行われる。水熱前処理中は、ある程度の水分が加熱中に追加されるため、DM含量が減少し得ることが、当業者に容易に理解されるだろう。いくつかの実施形態において、原料は、少なくとも20%、又は少なくとも25%、又は少なくとも30%、又は少なくとも40%、又は40%以下、又は35%以下、又は30%以下のDM含量で前処理される。

いくつかの実施形態において、水溶液での浸漬/湿潤は、前処理前のpHを、典型的に自己加水分解に有利である3.5〜9.0の範囲に調整するのに役立ち得る。前処理中、可溶化されたヘミセルロースから酢酸が遊離するため、pHは、典型的にはより酸性のレベルに変化し得ることが、容易に理解されるだろう。

いくつかの実施形態において、水熱前処理は、湿潤酸化前処理に必要とされるような補助酸素なしに、又は、オルガノソルブ前処理に必要とされるような有機溶媒の添加なしに、又は、マイクロ波前処理に必要とされるようなマイクロ波加熱の使用なしに行われる。いくつかの実施形態において、水熱前処理は、140℃以上、又は150℃以上、又は160℃以上、又は160℃〜200℃、又は170℃〜190℃、又は180℃以下、又は170℃以下の温度で行われる。

いくつかの実施形態において、ある程度のC5含量は、加圧前処理の前に浸漬ステップにより除去され得る。いくつかの実施形態において、単一反応器は、バイオマスを単一の標的温度に加熱するように構成され得る。代替として、単一反応器は、バイオマスが単一の通過中、2つ以上の温度領域に暴露されるように、反応器内の温度勾配に影響するように構成され得る。いくつかの実施形態において、前処理の過程中に、加圧反応器内からある程度の可溶化されたバイオマス成分を部分的に除去することが有利となり得る。

好適な水熱前処理反応器は、典型的には、紙パルプ産業から知られているほとんどのパルプ化反応器を含む。いくつかの実施形態において、水熱前処理は、10バール以下、又は12バール以下、又は4バール以上、又は8バール以上、又は8バール〜18バール、又は18バール〜20バールまで加圧された反応器内で蒸気により行われる。いくつかの実施形態において、前処理反応器は、原料の連続流入のために構成される。

いくつかの実施形態において、圧力下で、ある程度の期間又は「滞留時間」の間、湿潤バイオマスが反応器を通して移送される。滞留時間は、有利には、より高いバイオマス処理量を促進するために、短時間に維持される。しかしながら、得られる前処理過酷度は、温度及び滞留時間の両方によって決定される。水熱前処理中の温度は、有利には、より低く維持されるが、これは、本発明の方法が非常に低い前処理過酷度を得ることを追及するためだけではなく、より低い温度がより低い蒸気圧力を使用して達成され得るためである。前処理温度が180℃以下のレベルとなり得る限り、したがって飽和蒸気圧が10バール以下に維持される限り、より低い腐食傾向を経験することとなり、はるかに低いグレードの圧力金具及び鋼組成を使用することができ、これにより工場資本コストが低減される。いくつかの実施形態において、反応器は、バイオマスを、160℃〜200℃、又は170℃〜190℃の単一の標的温度に加熱するように構成される。いくつかの実施形態において、滞留時間は、60分未満、又は30分未満、又は20分未満、又は15分未満、又は14分未満、又は13分未満、又は12分未満、又は10分未満、又は8分未満、又は5分未満である。

バイオマス原料は、様々な手段により、大気圧から加圧反応器内に投入され得る。いくつかの実施形態において、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０６２，５２２号明細書に記載のシステム等のスルース(sluice)型「パーティクルポンプ」システムを使用して、バイオマス原料が投入され得る。いくつかの実施形態において、いわゆる「スクリュープラグ」供給機器を使用して前処理反応器に投入することが有利となり得る。

前処理されたバイオマスは、様々な手段により加圧反応器から排出され得る。いくつかの実施形態において、前処理されたバイオマスは、材料の繊維構造を維持するような様式で排出される。前処理されたバイオマスの繊維構造を維持することは、これによって、前処理された材料の固体画分が、通常のスクリュープレス機器を使用して、固体/液体分離中に比較的高い乾燥物質レベルまで圧縮され、それによりメンブレンフィルタプレスシステムの追加的費用及び複雑性が回避され得るため、有利である。

繊維構造は、非爆発的様式で加圧反応器から原料を除去することにより維持され得る。いくつかの実施形態において、非爆発的除去は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０４３，４８６号明細書に記載のもの等のスルース型システムを使用して達成されてもよく、それにより繊維構造が維持され得る。いくつかの実施形態において、非爆発的除去は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／９９６，３９２号明細書に記載のもの等の液体サイクロン除去システムを使用して達成されてもよく、それにより繊維構造が維持され得る。

いくつかの実施形態において、前処理されたバイオマスは、前処理された材料の爆発的な放出を含む「蒸気爆発」を利用して、加圧前処理反応器から除去され得る。蒸気爆発した前処理されたバイオマスは、その繊維構造を維持しておらず、したがって、その繊維構造を維持する前処理されたバイオマスによる通常のスクリュープレスシステムを使用して達成され得るものに匹敵する乾燥物質含量を達成するために、より精密な固体/液体分離システムを必要とする。

バイオマス原料は、logRoが3.75以下の非常に低い過酷度まで前処理される。これは、典型的に10%以上のキシラン価を有する前処理されたバイオマスとなり得る。「キシラン価」というパラメータは、不溶性固体中に残っている残留キシラン含量、並びに液体画分中の可溶性キシロース及びキシロオリゴマーの濃度の両方を加重した組合せを反映する複合的測定値を指す。より低いRo過酷度では、キシラン価はより高い。したがって、最も高いキシラン価は、最も低い前処理過酷度を指す。キシラン価は、非溶解固体中の残留キシラン含量がより高い非常に低い過酷度であっても、従来の過酷度の尺度logR_oとの逆直線関係を提供する。様々な異なる原料の、前処理過酷度logRoと得られる前処理されたバイオマスのキシラン価との関係を図1に示し、これは、実施例1において詳細に説明される。

等しいキシラン価を有する異なる前処理されたバイオマス原料は、等しいC5モノマー回収率を示すことから、キシラン価は、前処理過酷度の尺度として特に有用である。対照的に、従来のRo過酷度は、単に前処理条件の経験的説明であり、これは異なるバイオマス原料の間の比較の合理的根拠を提供しない。例えば、図1に示すように、過酷度logR_o=3.75までの1段階自己加水分解は、6〜7%のキシラン価を有する前処理されたサトウキビバガス及びトウモロコシ茎葉を提供し、一方、典型的な麦わら系統では、前処理された原料の得られるキシラン価は、約10%である。

当業者は、所望のキシラン価を有する前処理されたバイオマスを提供するために、所与の原料に対する適切な前処理過酷度logRoを容易に決定することができる。いくつかの実施形態において、バイオマス原料は、logRoが3.75以下、又は3.74以下、又は3.73以下、又は3.72以下、又は3.71以下、又は3.70以下、又は3.69以下、又は3.68以下、又は3.67以下、又は3.66以下、又は3.65以下、又は3.64以下、又は3.63以下、又は3.62以下、又は3.61以下、又は3.60以下、又は3.59以下、又は3.58以下、又は3.57以下、又は3.56以下、又は3.55以下、又は3.54以下、又は3.53以下、又は3.52以下、又は3.51以下、又は3.50以下、又は3.45以下、又は3.40以下である非常に低い過酷度まで前処理される。いくつかの実施形態において、バイオマスは、11%以上、又は12%以上、又は13%以上、又は14%以上、又は15%以上、又は16%以上、又は17%以上のキシラン価を有する前処理されたバイオマスを提供するために非常に低い過酷度logRoまで前処理される。

キシラン価は、オンラインで、例えば近赤外分光モニターによって提供されるような簡易測定に基づいて容易に測定することができるので、生産規模のバイオマス処理における実用的な手段として有用である。キシラン価はさらに、国際公開第２０１３／１２０４９２号に記載のように、前処理の制御のための終点の尺度として使用することができる。

非溶解固体中の可溶性キシラン含量及び残留キシラン含量の両方の複合的尺度を示す、キシラン価に対する代替として、前処理の効果は、非溶解固体中の残留キシラン含量で表すことができる。非溶解固体中の残留キシラン含量とキシラン価との関係を図2に示し、これは実施例1で説明される。当業者は、非溶解固体中の所望の残留キシラン含量を有する前処理されたバイオマスを提供するために、所与の原料に対する適切な前処理過酷度logRoを容易に決定することができる。例えば、図2に示すように、10%のキシラン価を有する前処理されたバイオマスを生成するのに十分な過酷度での1段階自己加水分解は、典型的に、麦わら、サトウキビバガス、空果房、及びトウモロコシ茎葉を含むがこれらに限定されないソフトリグノセルロース系原料に関して、約5.0重量%の非溶解固体中の残留キシラン含量を有する前処理されたバイオマスを生成し得る。いくつかの実施形態において、バイオマス原料は、非溶解固体の残留キシラン含量が少なくとも5.0重量%、又は少なくとも5.1重量%、又は少なくとも5.2重量%、又は少なくとも5.3重量%、又は少なくとも5.4重量%、又は少なくとも5.5重量%、又は少なくとも5.6重量%、又は少なくとも5.7重量%、又は少なくとも5.8重量%、又は少なくとも5.9重量%、又は少なくとも6.0重量%、又は少なくとも6.1重量%、又は少なくとも6.2重量%、又は少なくとも6.3重量%、又は少なくとも6.4重量%、又は少なくとも6.5重量%、又は少なくとも6.6重量%、又は少なくとも6.7重量%、又は少なくとも6.8重量%、又は少なくとも6.9重量%、又は少なくとも7.0重量%、又は少なくとも7.1重量%、又は少なくとも7.2重量%、又は少なくとも7.3重量%、又は少なくとも7.4重量%、又は少なくとも7.5重量%、又は少なくとも7.6重量%、又は少なくとも7.7重量%、又は少なくとも7.8重量%、又は少なくとも7.9重量%、又は少なくとも8.0重量%、又は少なくとも8.1重量%、又は少なくとも8.2重量%、又は少なくとも8.3重量%、又は少なくとも8.4重量%、又は少なくとも8.5重量%である前処理されたバイオマスを提供するために適した過酷度logRoまで前処理される。

バイオマス原料は、前処理された原料のキシラン価が10%以上であるか、又は前処理された原料中の非溶解固体の残留キシラン含量が少なくとも5.0%以上である、非常に低い過酷度まで前処理されることが有利である。この非常に低い過酷度のレベルは、前処理中に可溶化される、又は回復不可能なほど失われる前処理前の原料の全ヘミセルロース含量が最小限化されるプロセスに対応する。我々は、予想外にも、酵素加水分解中、十分に高いキシラナーゼ活性及びキシロシダーゼ活性が使用される場合、1段階自己加水分解により非常に低い過酷度まで前処理された原料の酵素加水分解後に、麦わら、サトウキビバガス、スイートソルガムバガス、トウモロコシ茎葉、及び空果房の典型的な系統では、理論値の少なくとも55%という高い最終C5モノマー収率が、認識され得るほどのC6モノマー収率の損失なしに得ることができることを発見した。非常に低い過酷度レベルにおいては、大量の原料のヘミセルロース含量が前処理後の固体画分中に残留し、これは後に、十分なキシラナーゼ活性及びキシロシダーゼ活性が使用される酵素加水分解を利用して、高い回収率でC5モノマーに加水分解され得る。

「キシロース回収率」に関する報告は、多くの場合、本明細書で報告されるキシロース回収率と比較できない観点から表現されていることに注目すべきである。例えば、Ohgrenら(2007)及びLeeら(2009)は、高いキシロース回収率を報告している。しかしながら、これらの値は、前処理されたバイオマスからのキシロース回収率のみを示しており、前処理前の原料の元のヘミセルロース含量のパーセンテージとして表現されていない。又は、例えば、国際公開第２０１０／１１３１２９号は、前処理前の原料のヘミセルロース含量のパーセンテージとしてのヘミセルロース回収率に言及しているが、全ヘミセルロース回収率よりも常に低いモノマー収率を示していない。いくつかの実施形態において、理論値の少なくとも56%、又は少なくとも57%、又は少なくとも58%、又は少なくとも59%、又は少なくとも60%、又は少なくとも61%、又は少なくとも62%、又は少なくとも63%、又は少なくとも64%、又は少なくとも65%というC5モノマー収率を、酵素加水分解後の加水分解物において得ることができる。

酵素加水分解は、様々な異なる方法により行われ得る。いくつかの実施形態において、前処理されたバイオマスは全スラリーの状態で加水分解され、これは、前処理されたバイオマスからの実質的に全ての固体が、溶解及び非溶解固体の両方を含む1つの反応混合物において酵素加水分解に供されることを意味する。本明細書において使用される場合、「全スラリー」という用語は、酵素加水分解開始時の非溶解固体:溶解固体の重量比が2.2:1未満である酵素加水分解反応混合物を指す。

前処理されたバイオマススラリーの「非溶解固体」及び「溶解固体」の含量は以下のように決定される。

「全固体」及び「ろ過全固体」の含量は、Weissら(2009)に記載される手順により決定される。それらの値から、「非溶解固体」及び「溶解固体」の含量を以下の式により計算することができる。

[非溶解固体](重量%)=([全固体](重量%)-[ろ過全固体](重量%))/(1-[ろ過全固体](重量%))

[溶解固体](重量%)=[全固体](重量%)-[非溶解固体](重量%)

いくつかの実施形態において、酵素加水分解前に、前処理されたバイオマスは固体/液体分離ステップに供され、別個の固体画分及び液体画分を生産する。このような分離は、前処理されたバイオマス中の溶解固体のいくつかの成分が酵素加水分解中に使用される1種以上の酵素の活性を阻害するよう典型的に作用することから、一般に有利である。例えば、図6に示され、実施例4で説明されるように、前処理されたバイオマス全スラリーからの溶解固体含量の除去は、GENENCOR(商標)製ACCELLERASE TRIO(商標)の商標又はNOVOZYMES(商標)によるCELLIC CTEC3(商標)の商標で提供される、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物を使用して、原料が本明細書に記載のように前処理され、高い乾燥物質含量で酵素加水分解に供されたことにより達成されるセルロース変換率を明らかに改善する。

しかしながら、驚くべきことに、実施例10で説明されるように、前処理されたバイオマススラリーがより低い乾燥物質含量まで十分に希釈される場合、前処理されたバイオマススラリー中に存在する阻害物質の濃度は、全スラリー加水分解において、さらに、より低い酵素用量レベルで、同等の変換率を得ることができるほどに、十分に希釈される。

高い乾燥物質含量で行われることが望まれる酵素加水分解前の、固体/液体分離ステップを使用する実施形態において、実行可能な最高レベルの固体画分中の乾燥物質含量を達成すること、又は、代替として、固体画分から実行可能な最大量の溶解固体を除去することが有利である。いくつかの実施形態において、固体/液体分離は、少なくとも40重量%、又は少なくとも45重量%、又は少なくとも50重量%、又は少なくとも55重量%のDM含量を有する固体画分を達成する。繊維構造が維持されるような様式でバイオマス原料が前処理された場合、通常のスクリュープレスシステムを使用した固体/液体分離は、典型的には、固体画分において50%もの高いDMレベルを達成し得る。いくつかの実施形態において、例えばメンブレンフィルタプレスシステムを使用して、より効果的な固体/液体分離を達成するために、より高い工場資本経費を負担することが有利となり得る。いくつかの実施形態において、溶解固体は、連続的な洗浄及びプレスにより、又は紙パルプ技術分野において知られた置換洗浄技術により、固体画分から除去され得る。いくつかの実施形態において、直接固体/液体分離により、又は洗浄及び固体/液体分離のいくつかの組合せにより、固体画分の溶解固体含量は、少なくとも50%、又は少なくとも55%、又は少なくとも60%、又は少なくとも65%、又は少なくとも70%、又は少なくとも75%低減される。

このような固体/液体分離から得られた液体画分は、次いで、固体画分の酵素加水分解の間、固体画分から別個に維持することができる。我々は、この一時的分離を「C5バイパス」と呼ぶ。C5に富む「バイパス」材料は、次いで、固体画分の酵素加水分解が所望のグルカン変換度に到達した後に、加水分解混合物中に再添加され得る。我々は、これを「C5バイパス」材料の「後加水分解」として示す。この方法では、別様には前処理されたバイオマススラリー中に存在する酵素阻害溶解固体により引き起こされ得る干渉が、C5モノマー収率の損失なしに、最小限化される。1段階自己加水分解により10%以上のキシラン価を有するか、又は5.0%以上の非溶解固体のキシラン含量を有する前処理された材料を提供するため非常に低い過酷度まで前処理された、麦わら、サトウキビバガス、スイートソルガムバガス、トウモロコシ茎葉、及び空果房の典型的系統等のソフトリグノセルロース系バイオマス原料から得られた液体画分は、典型的には、少量のC6モノマー成分(1×)、いくつかの他の糖を含む主要グルコース、より多量の可溶性C6オリゴマー成分(約2×〜7×)、より多量のC5モノマー成分(約4×〜8×)、いくつかのアラビノース及び他の糖を含む主要キシロース、並びにはるかに多量の可溶性キシロオリゴマー成分(約18×〜30×)を含む。可溶性キシロオリゴマーは、典型的には、いくつかのより長鎖のオリゴマーと共に、主にキシロヘキソース、キシロペントース、キシロテトラオース、キシロトリオース及びキシロビオースを含む。これらのキシロースオリゴマー(又はキシロオリゴマー)は、典型的には、固体画分の酵素加水分解に使用される酵素活性により、「後加水分解」中、酵素的に加水分解される。または、言い換えると、分離された液体画分と加水分解された固体画分を混合することによって、液体画分中のキシロオリゴマーは、加水分解された固体画分中に残っている酵素活性の作用により、キシロースモノマーに分解される。

あるいは、いくつかの実施形態において、分離された液体画分は、他の目的に使用することができる。いくつかの実施形態において、分離された液体画分は、加水分解物の発酵からのエタノールの回収後に得られる希薄な蒸留残渣と混合することができる。混合された液体画分と希薄な蒸留残渣は、次いで、バイオメタン基質として使用することができる。あるいは、希薄な蒸留残渣及び液体画分は、別個のバイオメタン基質として使用することができる。驚くべきことに、希薄な蒸留残渣及び液体画分のバイオメタンポテンシャルは、10%以上のキシラン価を有する前処理されたバイオマスを生成する非常に低い過酷度の後に増大される。したがって、いくつかの実施形態において、バイオメタンの収率向上が、エタノールの幾分かの収率低下を相殺することができるという点で、非常に低い過酷度でC6発酵を行うことが有利である。いくつかの実施形態において、少なくとも75、又は少なくとも78、又は少なくとも80、又は少なくとも82、又は少なくとも85、又は少なくとも87、又は少なくとも90、又は少なくとも92、又は少なくとも95 NM3メタン/トンのバイオマス原料のバイオメタン収率を、液体画分と希薄な蒸留残渣を合わせて含むバイオメタン基質から生産することができ、ここで、原料は、少なくとも10%のキシラン価を有するか、又は非溶解固体が少なくとも5.0重量%のキシランを含む、前処理されたバイオマスを生成するために、低い過酷度logRoまで前処理される。いくつかの実施形態において、全スラリー加水分解物自体はバイオメタン基質として使用される。

いくつかの実施形態において、本発明は、リグノセルロース系バイオマスを処理する方法であって、
ソフトリグノセルロース系バイオマス原料を準備するステップと、
前処理されたバイオマスが10%以上のキシラン価を有することを特徴とするような非常に低い過酷度まで、原料を、1段階加圧水熱前処理において、3.5〜9.0の範囲内のpHで前処理するステップと、
前処理されたバイオマスを、固体画分及び液体画分に分離するステップと、
エンドグルカナーゼ活性、エキソグルカナーゼ活性、β-グルコシダーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、及びキシロシダーゼ活性を含む酵素混合物により触媒される酵素加水分解を利用して、補助水分を添加して又は添加せずに固体画分を加水分解するステップと、
その後、分離された液体画分及び加水分解された固体画分を混合するステップであって、液体画分中のキシロオリゴマーが、加水分解された固体画分中に残っている酵素活性の作用により、キシロースモノマーに分解されるステップと
を含む方法を提供する。

いくつかの実施形態において、分離された固体画分からの、若しくは分離された液体画分が後加水分解で添加されている加水分解された固体画分からの、又は全スラリーからの酵素加水分解物は、続いて、エタノールを生成するために発酵に供される。

いくつかの実施形態において、加水分解物の発酵後に回収された希薄な蒸留残渣は、バイオメタン生成の基質として使用される。いくつかの実施形態において、分離された液体画分は、加水分解物の発酵後に回収された希薄な蒸留残渣と混合して、合わせられたバイオメタン基質として使用される。

「固体画分」及び「液体画分」は、さらに細分化されるか、又は処理されてもよいことが、容易に理解されるだろう。いくつかの実施形態において、バイオマスは、固体/液体分離と同時に前処理反応器から除去され得る。いくつかの実施形態において、前処理されたバイオマスは、反応器から排出された後、典型的には単純で低コストのスクリュープレスシステムを使用して固体/液体分離ステップに供され、固体画分及び液体画分を生成する。

当該技術分野において周知のように、セルラーゼ活性を利用する酵素加水分解は、加水分解が、より低い乾燥物質含量で行われる場合、より効率的である。より高い固体濃度は、セルラーゼ触媒を効果的に阻害するが、この周知の効果の正確な原因は完全には理解されていない。例えば、Kristensenら(2009)を参照されたい。当該技術分野における通説では、実行可能な最も高い乾燥物質含量での加水分解が有利であるとされているが、これは、必然的に、酵素消費の増加に関係する。酵素のコストを節約するより低い乾燥物質含量において、同じ酵素加水分解の効果が、同じ酵素調製物を使用して達成することができる。

当業者は、慣例的な実験を通して、所与のバイオマス原料及び酵素調製物に対して、所与のプロセス目標を達成するために適切な酵素加水分解を行うためのDMレベルを容易に決定するだろう。いくつかの実施形態において、酵素消費を増加させる結果となる場合もあるにもかかわらず、20%を超える非常に高いDMで加水分解を行うことが有利となり得る。一般に、水の消費を最小限化することや、エタノール蒸留のエネルギーコストを節約することなどの様々な理由により、実行可能な最も高い乾燥物質レベルで加水分解を行うことが有利であると考えられており、これは、より高い乾燥物質レベルでの酵素加水分解により生成されるより高い濃度の糖が、より高い濃度のエタノールをもたらし、その結果、蒸留コストが低減するからである。いくつかの実施形態において、分離された固体画分、又は全スラリーの酵素加水分解は、8% DM以上、又は9% DM以上、又は10% DM以上、又は11% DM以上、又は12% DM以上、又は13% DM以上、又は14% DM以上、又は15% DM以上、又は16% DM以上、又は17% DM以上、又は18% DM% DM以上、又は19% DM以上、又は20% DM以上、又は21% DM以上、又は22% DM以上、又は23% DM以上、又は25% DM以上、又は30% DM以上、又は35% DM以上で行われてもよい。

いくつかの実施形態において、固体画分は、前処理されたバイオマスの固体/液体分離から40%DM以上で回収されるが、酵素加水分解がより低いDMレベルで行われ得るように、追加的な水分が添加される。水分は、添加剤、例えば任意の分子量のポリエチレングリコール(PEG)若しくは界面活性剤、塩、アンモニア、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、若しくは水酸化ナトリウム等のpH調整用化学物質、抗細菌若しくは抗菌剤、又は他の材料と共に、又はそれを含めずに、真水、凝縮水、又は他のプロセス溶液の形態で添加されてもよいことが容易に理解されるだろう。

本発明の方法により、加水分解物における少なくとも55%以上のC5モノマー収率を達成するために、酵素加水分解は、様々な酵素活性を利用して行われる。酵素加水分解において利用される酵素の混合物は、少なくとも以下の、エンドグルカナーゼ活性、エキソグルカナーゼ活性、β-グルコシダーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、及びβ-キシロシダーゼ活性を含むべきである。加水分解が行われる際の乾燥物質含量、プロセス目標として所望されるグルカン変換率、及びプロセス目標として所望される加水分解時間に依存して、様々な異なる酵素用量レベルを適用することができることは、当業者に容易に理解されるだろう。したがって、より高い乾燥物質、迅速な加水分解に適する酵素用量レベルは、より低い乾燥物質、より長い加水分解の時間枠において、大きく低減することができ、使用することができる。

概して、加水分解物における少なくとも55%以上のC5モノマー収率は、典型的には、24時間、一般には18時間〜60時間の範囲内の短い時間枠において、比較的早く達成することができる。一度非溶解固体からキシラン含量が実質的に除去されると、エンド-及びエキソ-グルカナーゼは比較的少ない障害で生産的結合に接近するので、これらの非常に高いC5モノマーの回収は実行可能な程度に早く達成されることが有利である。いくつかの実施形態において、高いC5モノマー収率が達成された後に過剰なエンド-及びエキソ-グルカナーゼ活性を有する酵素混合物を追加することが有利になり得る。これらの高いC5モノマー収率を典型的に達成することができる加水分解の時間枠は、例えば図11において示され、12%DMでの全スラリー加水分解におけるキシラン変換を示す、実施例10において説明され、ここで、前処理後の全C5回収率は約77%であった。示されるように、非常に低い酵素用量レベルであっても、少なくとも55%のC5モノマー収率を40時間以内に達成することができる。

55%以上のC5モノマー収率を達成するための、本発明の方法を実行するのに適した様々な酵素活性の適切なレベルは、典型的に、以下の通りである。

エンドグルカナーゼは、4-(1,3;1,4)-β-D-グルカン 4-グルカノヒドロラーゼを指し、β-1,4-グルカナーゼ(EC 3.2.1.4)としても知られている。限界値を明らかにするために、エンドグルカナーゼ活性を、Ghose (1987)の方法を利用して、基質としてヒドロキシル-エチルセルロース(HEC)を使用して決定して、nkat/g 酵素調製物で表す。典型的に、エンドグルカナーゼのレベルは、酵素加水分解の開始時において、少なくとも1100 nkat/g グルカンであるべきである。プロセス目標、例えば加水分解速度、変換度合及び乾燥物質含量に依存して、エンドグルカナーゼ活性レベルは1100〜30000 nkat/g グルカンの範囲内で異なり得る。いくつかの実施形態において、範囲は1100〜2832、又は1130〜1529、又は2317〜3852、又は3000〜5120、又は4000〜8000、又は7000〜10000、又は11000〜20000であってもよい。

エキソグルカナーゼは、4-β-D-グルカンセロビオヒドロラーゼ(EC 3.2.1.91)を指す。限界値を明らかにするために、エキソグルカナーゼ活性を、Bailey及びTahtiharju (2003)の方法を利用して、基質として4-メチル-ウンベリフェリル-β-D-ラクトシドを使用して決定して、nkat/g 酵素調製物で表す。典型的に、エキソグルカナーゼのレベルは、酵素加水分解の開始時において、少なくとも280 nkat/g グルカンであるべきである。プロセス目標、例えば加水分解速度、変換度合及び乾燥物質含量に依存して、活性レベルは280〜20000 nkat/g グルカンの範囲内で異なり得る。いくつかの実施形態において、範囲は280〜690、又は370〜560、又は400〜932、又は700〜1240、又は1200〜2000、又は3000〜5000であってもよい。

β-グルコシダーゼは、β-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ(EC 3.2.1.21)を指す。限界値を明らかにするために、β-グルコシダーゼ活性を、Berghem及びPettersson (1974)の方法を利用して、基質として4-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシドを使用して決定して、nkat/g 酵素調製物で表す。典型的に、β-グルコシダーゼのレベルは、酵素加水分解の開始時において、少なくとも3000 nkat/g グルカンであるべきである。プロセス目標、例えば加水分解速度、変換度合及び乾燥物質含量に依存して、活性レベルは3000〜50000 nkat/g グルカンの範囲内で異なり得る。いくつかの実施形態において、範囲は3000〜7500、又は4000〜6010、又は5000〜1000、又は7000〜14000、又は15000〜25000であってもよい。

エンドキシラナーゼは、4-β-D-キシランキシラノヒドロラーゼ(EC 3.2.1.8)を指す。限界値を明らかにするために、エンドキシラナーゼ活性を、Baileyら(1992)の方法を利用して、基質としてバーチウッドキシランを使用して決定して、nkat/g 酵素調製物で表す。pHを試験活性における適切なレベルに調節するために、クエン酸緩衝液を使用してもよい。典型的に、エンドキシラナーゼのレベルは、酵素加水分解の開始時において、少なくとも1400 nkat/g グルカンであるべきである。プロセス目標、例えば加水分解速度、変換度合及び乾燥物質含量に依存して、活性レベルは1400〜70000 nkat/g グルカンの範囲内で異なり得る。いくつかの実施形態において、範囲は1400〜3800、又は4000〜5000、又は6000〜7000、又は7000〜8000、又は9000〜12000、又は11000〜15000、又は15000〜20000、又は18000〜30000であってもよい。

β-キシロシダーゼは、4-β-D-キシランキシロヒドロラーゼ (EC 3.2.1.37)を指す。限界値を明らかにするために、β-キシロシダーゼ活性を、Poutanen及びPuls (1988)の方法を利用して、基質としてパラ-ニトロフェニル-β-D-キシラノピラノシド(xylanopyranoside)を使用して決定して、nkat/g 酵素調製物で表す。典型的に、β-キシロシダーゼのレベルは、酵素加水分解の開始時において、少なくとも75 nkat/g グルカンであるべきである。プロセス目標、例えば加水分解速度、変換度合及び乾燥物質含量に依存して、活性レベルは75〜124、又は100〜300、又は250〜500、又は400〜800、又は700〜20000 nkat/g グルカンの範囲内で異なり得る。いくつかの実施形態において、範囲は700〜900、又は800〜1400、又は1100〜1700、又は1500〜2500、又は2000〜3500、又は3000〜5000、又は4000〜10000、又は8000〜20000であってもよい。

活性の決定のために使用される上記に示したアッセイはいずれも、適切な方法(測定のために適切な希釈液へと試料を調節することを含む)に変更してもよい。アッセイは、同様のバックグランドの乾燥物質含量を有する試料に公知の活性を添加する標準曲線との比較による加水分解混合物から採取された代表試料の測定に適応させてもよい。

当業者に容易に理解されるように、本発明の方法を実行するのに好適な酵素混合物の組成は、比較的広い範囲内で変動し得る。好適な酵素調製物は、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物を含む。最適化の間の酵素混合物の選択及び改変は、遺伝子組み換え技術、例えばZhangら(2006)により説明されるもの、又は当該技術分野において知られた他の方法等を含み得る。リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物は、典型的には、製造者及び/又は供給者により適宜特定される。これらは、典型的には、一般用途の、又は動物飼料、食品、繊維用洗浄剤の生産、若しくは製紙産業における使用に最適化された市販のセルラーゼ調製物とは異なる。いくつかの実施形態において、GENENCOR(商標)により提供され、また遺伝子改変されたトリコデルマリーゼイ(Trichoderma reesei)の発酵から単離されたエキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エンドキシラナーゼ、キシロシダーゼ、及びβ-グルコシダーゼを含む、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物、例えば、ACCELLERASE TRIO(商標)の商標で販売されている市販のセルラーゼ調製物等が使用される。いくつかの実施形態において、NOVOZYMES(商標)により提供され、またエキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エンドキシラナーゼ、キシロシダーゼ、及びβ-グルコシダーゼを含む、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物、例えば、CELLIC CTEC2(商標)又はCELLIC CTEC3(商標)の商標で販売されている市販のセルラーゼ調製物等が使用される。

リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された3つの市販のセルラーゼ調製物において表示されている酵素活性を、詳細に分析した。これらの市販のセルラーゼ調製物のそれぞれにおいて、12の異なる酵素活性のレベルを特性決定し、タンパク質のグラム当たりで表現した。実験の詳細は、実施例8に記載される。結果を表1に示す。この実施例において使用されるアッセイ方法は、本明細書において活性の決定が依存する方法と同じではないことに注目すべきである。これらの結果は、一般化された、定性的な比較のみを提供し、本発明の方法に関する特許請求の範囲を限定するものとして捉えるべきではない。

代替として、リグノセルロース系バイオマスを加水分解するのに効果的な酵素混合物は、当該技術分野において周知の方法により、好気性及び嫌気性細菌、白色腐朽菌、軟腐朽菌、並びに嫌気性菌を含む様々な微生物から得ることができる。例えば、Singhaniaら(2010)を参照されたい。セルラーゼを産生する生物は、典型的には、リグノセルロース系基質の加水分解に好適となるような適切な割合の異なる酵素の混合物を分泌する。リグノセルロース系バイオマスの変換に有用なセルラーゼ調製物の好ましい源は、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)、フザリウム(Fusarium)、フミコーラ(Humicola)、アスペルギルス(Aspergillus)及びファネロケーテ(Phanerochaete)の種等の菌類を含む。

特に、1つの菌種であるトリコデルマリーゼイが広く研究されている。野生型トリコデルマリーゼイは、セルラーゼ鎖の還元及び非還元末端に対するそれぞれの特異性を有する2種のエキソセルラーゼ(セロビオヒドロラーゼ)、異なるセルロース認識部位を有する少なくとも5種の異なるエンドセルラーゼ、2種のβ-グルコシダーゼ、並びに様々なエンドキシラナーゼ及びエキソキシロシダーゼを含む、酵素の混合物を分泌する。Rouvinen, J.ら(1990)、Divne, C.ら(1994)、Martinez, D.ら(2008)を参照されたい。市販のセルラーゼ調製物は、典型的には、アルファ-アラビノフラノシダーゼ及びアセチルキシランエステラーゼ活性も含む。例えば、Vinzant, T.ら(2001)を参照されたい。

野生型生物により自然に分泌される混合物中に存在する割合とは異なる相対的比率の酵素活性の最適化された混合物は、以前に、より高い糖収率をもたらすことが示されている。Rosgaardら(2007)を参照されたい。実際に、16もの多くの異なる酵素タンパク質を含む酵素ブレンドの最適化は、有利にも、所与の前処理を受ける所与のバイオマス原料に対して別個に決定され得ることが示唆されている。Billard, H.ら(2012)、Banerjee, G.ら(2010)を参照されたい。しかしながら、商業的実用性として、商業的酵素供給者は、典型的には、大量生産において規模の経済性を得ることができるために、実行可能な最小数の異なる酵素ブレンドを生成することを追求する。

いくつかの実施形態において、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物を、1種以上の追加的又は補助的酵素活性で補完することが有利となり得る。いくつかの実施形態において、単に市販の調製物中に存在する1種以上の成分酵素の相対的比率を増加させることが有利となり得る。いくつかの実施形態において、特殊な追加的活性を導入することが有利となり得る。例えば、所与のバイオマス原料を使用して本発明の方法を実行する際、1種以上の補助的酵素活性の使用により有利に加水分解され得る特定の加水分解していない炭水化物結合が特定されてもよい。そのような加水分解していない結合は、当該技術分野において周知の方法を使用して、可溶性の加水分解物中、又は不溶性の加水分解されていない残渣中で、オリゴマー炭水化物の特性決定により特定されてもよい。また、加水分解していない結合は、Nguema-Onaら(2012)により説明されているように、特定の炭水化物結合に対するモノクローナル抗体を使用して、総合的なマイクロアレイポリマープロファイリングにより特定されてもよい。いくつかの実施形態において、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物を、追加的なエンドキシラナーゼ、β-グルコシダーゼ、マンナナーゼ、グルクロニダーゼ、キシランエステラーゼ、アミラーゼ、キシロシダーゼ、グルクロニルエステラーゼ、又はアラビノフラノシダーゼの任意の1種以上を使用して補完することが有利となり得る。

代替として、いくつかの実施形態において、Humbirdら(2011)により説明されるように、リグノセルロース系バイオマス処理施設においてオンサイトで酵素を生成することが有利となり得る。いくつかの実施形態において、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物は、特定のバイオマス原料に適切な特定の酵素活性で特別に補完して、又は補完せずに、オンサイトで生成され得る。

いくつかの実施形態において、酵素混合物は、マンノシダーゼ(EC3.2.1.25)、a-D-ガラクトシダーゼ(EC3.2.1.22)、a-L-アラビノフラノシダーゼ(EC3.2.1.55)、a-D-グルクロニダーゼ(EC3.2.1.139)、シンナモイルエステラーゼ(EC3.1.1.-)、又はフェルロイルエステラーゼ(EC3.1.1.73)、アセチルキシランエステラーゼ(EC3.1.1.72); B-1,3キシロシダーゼ活性(EC3.2.1.72);アルファ1,3及び/又はアルファ1,5アラビノフラノシダーゼ活性(EC3.2.1.23);又は他の活性の任意の1種以上をさらに含んでもよい。

1段階自己加水分解により非常に低い過酷度のレベルまで前処理されたバイオマスの別の驚くべき特徴は、発酵生物の阻害物質として機能する前処理副生成物の濃度が、非常に低いレベルに維持されるということである。その結果、典型的には、本発明の方法により得られる加水分解されたバイオマスは、いかなる洗浄又は他の解毒ステップを必要とすることもなく、直接発酵に使用することが可能である。

当該技術分野において周知のように、自己加水分解水熱前処理は、典型的には、「発酵阻害物質」として作用し、発酵生物の増殖及び/又は代謝を阻害する様々な可溶性副生成物を生成する。リグノセルロース系原料の特性、及び前処理の過酷度に依存して、異なる発酵阻害物質が異なる量で生成される。Klinkeら(2004)を参照されたい。自己加水分解前処理中、典型的には、(1)フラン、主に単糖又はオリゴ糖からの分解生成物である2-フルフラール及び5-HMF(5ヒドロキシメチルフルフラール)、(2)リグニン構造の分解生成物であるモノマーフェノール、及び(3)小分子有機酸、主に、ヘミセルロース及びリグニン中のアセチル基に由来する酢酸の、少なくとも3つのカテゴリーの発酵阻害物質が形成される。異なる阻害物質の混合物が、酵母株を使用して(例えばPalmquistら(1999)を参照されたい)、またエタノール性大腸菌(Escherichia coli)を使用して(例えばZaldivarら(1999)を参照されたい)、バイオエタノール発酵において相乗的に作用することが示されている。いくつかの実施形態において、揮発性阻害物質、中でも特にフルフラールのレベルを低減するために、当該技術分野において周知の方法を使用して、前処理されたバイオマスをフラッシュ蒸発に供することが有利となり得る。我々の経験では、10%以上のキシラン価まで前処理された、麦わら、スイートソルガムバガス、サトウキビバガス、トウモロコシ茎葉、及び空果房等のバイオマス原料の典型的な系統による自己加水分解を使用すると、酢酸及びフルフラールレベルのみが、発酵生物を阻害する可能性がある。バイオマス原料が、DM35%以上で、10%以上のキシラン価まで前処理される場合、及び、その後固体画分が、DMを調整するための水を添加するが洗浄ステップなしで25%以下のDMで酵素加水分解される場合、加水分解物中のフルフラールレベルは、典型的には、3g/kg未満に、また酢酸レベルは9g/kg未満に維持できる。これらのレベルは、典型的には、特殊な系統を使用した酵母発酵に許容され得る。酵素加水分解中、ある程度の追加の酢酸が、固体画分中のヘミセルロースの分解から放出される。いくつかの実施形態において、電気透析又は当該技術分野において知られた他の方法を使用して、液体画分及び/又は加水分解された固体画分からある程度の酢酸含量を除去することが有利となり得る。

異なる原料は、反応器滞留時間及び温度の様々な異なる組合せを使用して、1段階自己加水分解を利用して、10%以上のキシラン価を有する前処理されたバイオマスを生成するのに十分な低い過酷度logRoまで、前処理され得る。当業者は、慣例的な実験を通して、所与の原料を用い、所与の反応器を使用し、また所与のバイオマス反応器投入及び反応器排出システムを用いた、適用すべき適切な前処理ルーチンを容易に決定するだろう。スルースシステム又はスクリュープラグ供給機器により投入され、「パーティクルポンプ」スルースシステム又は液体サイクロンシステムにより排出される連続反応器を使用して原料が前処理される場合、10%以上のキシラン価の非常に低い過酷度は、麦わら又は空果房の典型的な系統を使用して、180℃の温度及び24分の反応器滞留時間、又は175℃〜185℃の範囲内の温度で18〜35分の範囲内の滞留時間、又は170℃〜190℃の範囲内の温度で13〜40分の範囲内の滞留時間により達成され得る。トウモロコシ茎葉、サトウキビバガス、及びスイートソルガムバガスの典型的な系統では、10%以上のキシラン価の非常に低い過酷度は、典型的には、175℃〜185℃の範囲内で8〜25分の範囲内の滞留時間、又は、170℃〜190℃の範囲内の温度で6〜35分の範囲内の滞留時間を使用して達成され得る。滞留時間及び温度は、同等レベルのR_o過酷度を達成するように調整され得ることが、当業者に容易に理解されるだろう。

10%以上のキシラン価まで前処理された原料の酵素加水分解は、典型的には、特定の洗浄又は解毒ステップを必要とすることなく、商業的に妥当な酵素消費で、20%を超える高いDMで行うことができ、固体画分は、少なくとも40%のDMまで圧縮され、又は、固体画分の溶解固体含量は、少なくとも50%低減される。

いくつかの実施形態において、酵素混合物は、マンノシダーゼ(EC3.2.1.25)、a-D-ガラクトシダーゼ(EC3.2.1.22)、a-L-アラビノフラノシダーゼ(EC3.2.1.55)、a-D-グルクロニダーゼ(EC3.2.1.139)、シンナモイルエステラーゼ(EC3.1.1.-)、又はフェルロイルエステラーゼ(EC3.1.1.73)、アセチルキシランエステラーゼ(EC3.1.1.72);B-1,3キシロシダーゼ活性(EC3.2.1.72);アルファ1,3及び/又はアルファ1,5アラビノフラノシダーゼ活性(EC3.2.1.23);又は他の活性の任意の1種以上をさらに含んでもよい。

当業者は、酵素加水分解について、適用すべき所与の酵素調製物の適切な用量レベル、適切なpH、及び温度条件、並びに適切な期間を容易に決定するだろう。上記の通り、加水分解の期間は、プロセス目標に依存して異なり得る。より長い加水分解は、最終的により良好なグルコース変換率をもたらすが、生産規模において高い資本コスト及び運営コストを課す。いくつかの実施形態において、加水分解の期間は、少なくとも24時間、又は少なくとも36時間、又は少なくとも48時間、又は少なくとも64時間、又は少なくとも72時間、又は少なくとも96時間、又は24〜150時間の期間である。一般に、酵素のコストを最小限化するために、より低い酵素用量レベルを維持することが有利である。いくつかの実施形態において、高い酵素用量を使用することが有利となり得る。本発明の方法を実行する上で、当業者は、地域のバイオマスコスト、生成物ストリームの市場価格、全工場資本コスト、及び償却スキームを含む関連要因、並びにその他の要因を考慮して、酵素用量の経済的最適化を決定することができる。リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物が使用される実施形態において、製造者により提供される一般的用量範囲を使用して、最適化すべき大まかな範囲を決定することができる。

いくつかの実施形態において、分離された固体画分が所望の程度の変換率まで酵素加水分解された後、C5バイパス中に維持されている液体画分は、後加水分解のために加水分解物混合物と混合される。いくつかの実施形態において、回収された液体画分は全て1度に添加されてもよく、一方他の実施形態において、液体画分のいくつかの成分が除去されてもよく、及び/又は、液体画分は徐々に添加されてもよい。いくつかの実施形態において、固体画分は、液体画分との混合の前に、少なくとも50%、又は少なくとも55%、又は少なくとも60%のセルロース変換率まで加水分解され、すなわち、少なくとも特定の理論的収率のグルコースモノマーが加水分解物中に得られる。液体画分中に存在するキシロオリゴマーの実質的部分が、典型的には、加水分解物混合物中で活性を維持するキシラナーゼ及び他の酵素の作用により、キシロースモノマーに加水分解され得る。いくつかの実施形態において、後加水分解は、少なくとも6時間、又は15時間〜50時間の期間、又は少なくとも24時間行われる。いくつかの実施形態において、液体画分中に存在する少なくとも60質量%、又は少なくとも65質量%、又は少なくとも70質量%、又は少なくとも75質量%、又は少なくとも80質量%、又は少なくとも85質量%、又は少なくとも90質量%のキシロオリゴマーが、後加水分解中、加水分解物混合物中で活性を維持するキシラナーゼ及び他の酵素の作用により、キシロースモノマーに加水分解される。いくつかの実施形態において、液体画分は、化学添加剤のさらなる添加なしに直接加水分解物と混合される。いくつかの実施形態において、酢酸、フルフラール又はフェノール等の液体画分のいくつかの成分は、加水分解物との混合前に液体画分から除去されてもよい。

いくつかの実施形態において、固体画分の酵素加水分解及び/又は液体画分の後加水分解は、同時糖化発酵(SSF)プロセスとして行われてもよい。当該技術分野において周知であるように、SSFが酵素加水分解に最適な温度と同じ温度で行われ得る場合、酵素加水分解の過程で導入された発酵生物が、グルコース及びキシロースモノマーを消費し、それにより酵素触媒反応の生成物阻害を低減するため、酵素消費は最小限化され得る。いくつかの実施形態において、後加水分解は、発酵生物の添加なしに、少なくとも60%のセルロース変換率まで繊維画分が加水分解された後にのみ行われる。いくつかの実施形態において、SSFは酵素加水分解の初期の後に行うことができ、これは、酵素加水分解の初期の後に発酵生物が添加され、発酵と加水分解の両方が、場合により酵素加水分解の最適ではない温度で継続される。

麦わら、サトウキビバガス、スイートソルガムバガス、トウモロコシ茎葉、又は空果房の典型的系統等のバイオマス原料が、1段階自己加水分解により、10%以上のキシラン価を有する前処理されたバイオマスを生成するのに十分な低い過酷度logRoまで、35%以上のDMで前処理され、少なくとも40%のDMを有する、又は溶解固体が少なくとも50%除去された、前処理されたバイオマスの固体画分が得られ、固体画分が、その後、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物を使用して、15%〜27%のDMで酵素加水分解に供され、酵素加水分解が少なくとも48時間行われ、少なくとも50%のグルコース変換率が達成された後に、液体画分が固体画分加水分解物に添加され、また、添加された液体画分が、少なくとも6時間の期間、後加水分解を受ける場合、典型的には、理論的最大C5モノマー収率の60%以上のC5モノマー収率に対応する、合わせられたC5/C6加水分解物中のC5モノマー濃度を達成することが可能である。

いくつかの実施形態において、合わせられたC5/C6加水分解物は、1種以上の改変酵母株を使用して、直接エタノールに発酵され得る。

図9は、一実施形態のプロセススキームを示す。示されるように、ソフトリグノセルロース系バイオマスが、DM35%以上まで浸漬、洗浄、又は湿潤される。バイオマスは、1段階自己加水分解において、加圧蒸気を使用して3.5〜9.0の範囲内のpHで、10%以上のキシラン価を特徴とする過酷度まで前処理される。前処理されたバイオマスは、固体/液体分離に供され、液体画分及び40%以上のDM含量を有する固体画分を生成する。固体画分は、適切なDM含量に調整され、次いで15%以上のDM含量で60%以上のセルロース変換率まで酵素加水分解を受ける。分離された液体画分は、その後、加水分解された固体画分と混合されて後加水分解に供され、それにより、液体画分中に存在するキシロオリゴマーの実質的な量が、キシロースモノマーに加水分解される。説明されたような加水分解及び後加水分解の終了後、C5モノマー収率は、典型的には少なくとも60%であり、一方セルロース変換率は、同様に少なくとも60%である。

代替の実施形態において、前処理されたバイオマスは、全スラリーとして酵素加水分解に供される。さらに別の実施形態において、液体画分は分離され、固体画分が酵素加水分解及びその後の発酵に供される。いくつかの実施形態において、このような発酵からのエタノールの回収の後に、残留する希薄な蒸留残渣を分離された液体画分と混合させて、バイオメタン基質として使用することができる。

実施例1
前処理過酷度の尺度としての固体画分の「キシラン価」の特性決定

麦わら(WS)、トウモロコシ茎葉(CS)、スイートサトウキビバガス(SCB)及び空果房(EFB)を、0〜10g酢酸/kg乾燥物質バイオマス(pH>4.0)で浸漬してから、35〜50%乾燥物質で前処理した。約60kg DM/hのバイオマスを、170〜200℃の温度で、12〜18分の滞留時間で前処理した。バイオマスは、スルースシステムを使用して反応器内に投入され、前処理された材料は、スルースシステムを使用して排出された。加圧前処理反応器内の圧力は、使用された温度での飽和蒸気の圧力に対応した。前処理されたバイオマスを、スクリュープレスを使用した固体/液体分離に供し、液体画分、及び約30%の乾燥物質を有する固体画分を生成した。固体画分を、約3kg水/kg乾燥バイオマスで洗浄し、再び約30%乾燥物質まで圧縮した。前処理反応器及びプロセスに関する詳細は、Petersenら(2009)においてさらに説明されている。

原材料を、Sluiterら(2005)及びSluiterら(2008)に記載の方法に従い、Phenomenex製Rezex Monossacharide H+カラムを備えたDionex Ultimate 3000 HPLCシステムを使用して、炭水化物について分析した。3時間の連続前処理後、液体画分及び固体画分の試料を採取し、試料が安定な状態の前処理から得られることを確実とするため、試料を3時間にわたり3回採取した。固体画分を、Sluiterら(2008)に記載の方法に従い、Rezex Monossacharide H+ Monosaccharideカラムを備えたDionex製Ultimate 3000 HPLCシステムを用いて、炭水化物について分析した。液体画分を、Sluiterら(2006)に記載の方法に従い、Rezex Monossacharide H+ Monosaccharideカラムを備えたDionex製Ultimate 3000 HPLCシステムを用いて、炭水化物及び分解生成物について分析した。固体画分中の分解生成物を、1:4の比で5mM硫酸を含む水中に固体画分を懸濁させることにより分析し、その後、Sluiterら(2006)に記載の方法に従い、Rezex Monossacharide H+カラムを備えたDionex製Ultimate 3000 HPLCシステムを用いて分析した。乾燥物質含量及び懸濁固体の量を、Weissら(2009)に記載の方法に従い分析した。物質収支は、Petersenら(2009)に記載のように設定し、セルロース及びヘミセルロース回収率を決定した。バイオマス乾燥物質のkg当たりの、前処理中に5-HMF又はフルフラールに分解した糖の量、及びヘミセルロースから放出されたアセテートの量も同様に定量したが、フラッシングによるフルフラールの損失は考慮されていない。

前処理プロセスの過酷度は、一般に、Overendら(1987)により初めて考案された過酷度係数(severity factor)により説明される。過酷度係数は、典型的には、log(R₀)=t*eksp((T-Tref)/14.75)(式中、R₀は、過酷度係数であり、tは、分単位での滞留時間であり、Tは、温度であり、T_refは、参照温度、典型的には100℃である)のような対数値として表現される。過酷度係数は、Belkecemiら(1991)、Jacobsen及びWyman(2000)又はLloydら(2003)により説明されるように、ヘミセルロース可溶化の反応速度論に基づく。したがって、前処理の過酷度は、前処理後に固体画分中に残っている残留ヘミセルロース含量に関連する。

説明されたように調製及び洗浄された固体画分を、Sluiterら(2008)により説明される方法に従い、Phenomenex製Rezex Monossacharide H+カラムを備えたDionex Ultimate 3000 HPLCシステムを用いて、C5含量について分析した。上述のように生成及び洗浄された固体画分中のキシラン含量は、水熱自己加水分解により前処理した場合の、例えば麦わら、トウモロコシ茎葉又はEFB等のソフトリグノセルロース系バイオマスについての過酷度係数に直線的に依存する。上述のように調製及び洗浄された固体画分中のキシラン含量としての過酷度の定義は、前処理設定の間で振り替え可能である。キシラン価は、洗浄された固体画分中の測定されたキシラン含量であり、これは可溶性物質からのある程度の寄与を含む。前処理過酷度log(R_o)に対するキシラン価の依存性は、図1において、麦わら、トウモロコシ茎葉、サトウキビバガス及び油やし処理からの空果房に関して示されている。

示されるように、1段階自己加水分解により前処理された試験バイオマス原料のそれぞれにおいて、キシラン価と前処理過酷度との間に明確な逆直線関係が存在する。

実験における非溶解固体のキシラン含量はまた、繊維(オリゴマー及びモノマー)間において、繊維画分中の全キシラン含量から液体中の溶解キシラン含量を減ずることにより計算した。

[繊維中の固体キシラン](重量%) = [繊維画分中の全キシラン](重量%) - [繊維画分中の溶解キシラン](重量%)

溶解キシラン含量は、[繊維画分中の重量%としての(溶解固体/全固体)]×[液体画分中の溶解キシラン濃度]により計算される。

図2において、前処理された、麦わら(PWS)、トウモロコシ茎葉(PCS)、サトウキビバガス(SCB)、及び油やしからの空果房(PEFB)の、計算された非溶解固体のキシラン含量(重量%)を、キシラン価の関数として示す。

実施例2
前処理過酷度の関数としてのC5回収率

実施例1に記載のように、バイオマス原料を前処理し、試料を特性決定した。図3は、麦わらが1段階自己加水分解により前処理された実験における、キシラン価の関数としてのC5回収率(キシロース+アラビノース)を示す。C5回収率は、非水溶性固体(WIS)、水溶性固体(WSS)及び全回収率として示されている。示されるように、非水溶性及び水溶性固体の両方としてのC5回収率は、キシラン価が増加すると共に増加する。キシラン価が10%を超えて増加すると、水溶性固体としてのC5回収率は減少するが、非水溶性固体としてのC5回収率は増加し続ける。

試験された麦わらの典型的な系統は、前処理前に、乾燥物質を基準として約27%のヘミセルロースを含有していた。図4は、自己加水分解により前処理された麦わら、トウモロコシ茎葉、サトウキビバガス及びEFBの、キシラン価の関数としての前処理後の全C5回収率を示す。試験されたトウモロコシ茎葉、スイートサトウキビバガス及びEFBの典型的な系統は、前処理前に乾燥物質を基準としてそれぞれ約25%、19%及び23%のC5含量を含有していた。示されるように、全ての原料において、前処理後の全C5回収率は、前処理されたバイオマスのキシラン価により定義されるような前処理過酷度に依存する。示されるように、前処理後に回収されたC5含量の90%を完全にC5モノマーに加水分解できる場合、酵素加水分解後に少なくとも60%の最終C5モノマー収率が典型的に予想され得、前処理過酷度は10%以上のキシラン価をもたらすことを特徴とする。

実施例3
前処理過酷度の関数としての酵素及び酵母増殖を阻害する分解生成物の生成

実施例1に記載のように、バイオマス原料を前処理し、試料を特性決定した。図5は、麦わらが1段階自己加水分解により前処理された実験における、キシラン価の関数としての、酢酸放出並びにフルフラール及び5-ヒドロキシ-メチル-フルフラール(5-HMF)の生成の依存性を示す。示されるように、発酵酵母を阻害することが周知であり、いくつかの場合においてはセルラーゼ酵素も阻害するこれらの分解生成物の生成は、10%未満のキシラン価において指数関数的増加を示す。10%以上のキシラン価において、フルフラール及び酢酸のレベルは、前処理されたバイオマスの発酵を、解毒ステップを必要とすることなく可能にする範囲内に収まる。酢酸については、レベルは、10%以上のキシラン価まで前処理されたバイオマスの酵素加水分解の間さらに増加するが、通常、C5及びC6糖の両方を消費するように改変された酵母が十分耐えられるレベルまでである。

実施例4
固体画分のDM%の関数としての、固体画分中に残留する材料によるセルラーゼ酵素の阻害

原理的に国際公開第２００６／０５６８３８号において説明及び使用されている6チャンバ反応器として機能する、6チャンバ自由落下反応器内で実験を行った。6チャンバ加水分解反応器は、20%DMを超える固体濃度での液化及び加水分解による実験を行うために設計した。反応器は、それぞれ幅24cm及び高さ50cmの6つの別個のチャンバに分割された、水平に設置されたドラムからなる。各チャンバ内の3つのパドルを備えた水平回転軸が、混合/撹拌に使用される。1.1kWモータが駆動部として使用され、回転速度は、2.5rpm〜16.5rpmの範囲内で調整可能である。回転方向は、時計方向と反時計方向との間で1分おきに変化するようにプログラムされる。外側の水充填加熱ジャケットが、80℃までの温度の制御を可能にする。

この実験には、実施例1に記載のシステムを使用して、1段階自己加水分解により前処理された麦わらを使用した。バイオマスを35%超のDMまで湿潤させ、10.5%のキシラン価を有する前処理された材料を生成する、約3.7の過酷度logRoまで、蒸気により4.0超のpHで前処理した。前処理は、Skaerbaek、DenmarkのInbiconパイロットプラントにおいて行われた。バイオマスは、スルースシステムを使用して前処理反応器内に投入され、前処理されたバイオマスは、スルースシステムを使用して反応器から除去された。いくつかの場合において、前処理されたバイオマスを、スクリュープレスを使用した固体/液体分離に供し、液体画分及び固体画分を生成した。固体画分は、約30%のDM含量を有し、最初のセルロース及びリグニンの大部分、ヘミセルロースの一部、並びに全部で約25%の溶解固体を含有していた。

6チャンバ反応器のチャンバに、全ての溶解及び非溶解固体を含む全ての前処理されたバイオマス、又は、全溶解固体の約25%を含む圧縮固体画分を充填した。乾燥物質含量は、19%DMに調整した。次いで、前処理されたバイオマスを、0.08mlのNovozymes製CTec2(商標)/gグルカン、又は0.2〜0.3mlのDupont、Genencor製Accellerase TRIO(商標)/gグルカンを使用して、50℃及びpH5.0〜5.3で加水分解させた。リグノセルロース系バイオマス変換に最適化されたこれらの市販のセルラーゼ調製物のこれらの用量レベルは、十分製造者により提案される範囲内であった。酵素加水分解実験は、6rpmの混合速度で96時間行った。

本明細書に記載のように測定されたAccellerase TRIOを用いる実験における酵素活性は、最初、エキソグルカナーゼ280〜5000 nkat/g グルカン、エンドグルカナーゼ1100〜20000 nkat/g グルカン、β-グルコシダーゼ3000〜25000 nkat/g グルカン、エンドキシラナーゼ1400〜30000 nkat/g グルカン、β-キシロシダーゼ75〜25000 nkat/g グルカンのnkat/g グルカンの範囲内であったことを示すことができる。

図6は、酵素加水分解前に除去された%溶解固体の関数としての、これらの条件下での酵素加水分解後のセルロース変換率を示す。示されるように、これらの酵素用量レベルにおける75%の溶解固体の除去は、絶対的にセルロース変換率を10〜20%改善する。したがって、酵素加水分解が分離された固体画分を使用して行われることとなる場合、酵素加水分解前に少なくとも40%のDM含量まで固体画分を圧縮すること、又は別様に溶解固体含量を少なくとも50%低減することが、典型的に、改善された酵素性能が提供されるため、有利である。

実施例5
10%超のキシラン価まで前処理されたバイオマスから得られた液体画分の糖含量及び加水分解

麦わら、トウモロコシ茎葉、及びサトウキビバガスを、キシラン価11.5%を有する前処理された麦わら(WS)を生成する、3.63の過酷度logRo、キシラン価12.3%を有する前処理されたサトウキビバガス(SCB)を生成する、3.51のlogRo、及びキシラン価15.5%を有する前処理されたトウモロコシ茎葉(CS)を生成する、3.35のlogRoまで前処理した。前処理された原料を、固体/液体分離に供して、実施例4に記載のように液体画分及び固体画分を生成した。液体画分を、Sluiter、Hamesら、2005に記載の方法に従い、Rezex Monossacharideカラムを備えたDionex Ultimate 3000 HPLCシステムを使用して、炭水化物及び分解生成物について分析した。表2は、モノマー及びオリゴマーのグルコース/グルカン、キシロース/キシラン及びアラビノース/アラビナンのカテゴリーに細分化された、DM含量のパーセントとして表現される液体画分の糖含量を示す。示されるように、ある程度のグルコース含量がモノマー及びオリゴマー形態の両方で存在するが、糖含量の大部分はオリゴマーキシランである。自己加水分解を利用して得られる液体画分中のキシランオリゴマーの優位性は、希酸前処理を使用して得られる液体画分と極めて対照的である。希酸水熱前処理により前処理されたバイオマスにおいては、液体画分は、典型的に、酸触媒の作用によりモノマー構成成分に加水分解される。

前処理された麦わらからの液体画分を、モジュール型Dionex ICS-5000クロマトグラフィーシステムを使用し、Thermo Scientific Dionex CarboPacTM PA200カラムを用いてさらにHPLCにより特性決定した。NaOH/NaOAc勾配条件を使用して検体を分離し、金電極を用いて統合パルスアンペロメトリック検出(IPAD)により測定した。図7は、液体画分の溶出プロファイルを示す下のトレースに対して、キシロビオース(X₂)、キシロトリオース(X₃)、キシロテトラオース(X₄)、キシロペンタオース(X₅)、及びキシロヘキサオース(X₆)標準の溶出プロファイルを上のトレースとして重ね合わせたHPLCクロマトグラムを示す。示されるように、自己加水分解されたバイオマスの液体画分は、少量のキシロースモノマー、並びに比較的多量のキシロビオース(X₂)、キシロトリオース(X₃)、キシロテトラオース(X₄)、キシロペンタオース(X₅)、及びキシロヘキサオース(X₆)をその他の材料と共に含む混合物を含有する。

実施例6
10%超のキシラン価まで前処理され、40%超のDMまで圧縮されたバイオマスから得られた固体画分の酵素加水分解及び繊維加水分解後の液体画分の添加、その後の後加水分解

実施例4に記載のように、6チャンバ自由落下反応器内で実験を行った。

実験には、1段階自己加水分解により、11.5%〜15.6%の範囲のキシラン価を有する前処理されたバイオマスを生成する、約3.19〜3.73の過酷度logRoまで前処理された麦わら、トウモロコシ茎葉、又はサトウキビバガスを使用した。バイオマスを切断して35%超のDMまで湿潤させ、170〜190℃で12分間、蒸気により前処理した。前処理は、Skaerbaek、DenmarkのInbiconパイロットプラントにおいて行われた。前処理されたバイオマスを、スクリュープレスを使用した固体/液体分離に供し、40%超のDMを有する固体画分を生成した。液体画分を、その後加水分解物に添加する(後加水分解)ために保存した(C5バイパス)。

6チャンバ反応器のチャンバに、約10kgの圧縮後の前処理されたバイオマス固体画分を充填し、水の添加により19〜22%DMに調整した。前処理された固体画分を、GENENCOR-DuPONT製ACCELLERASE TRIO(商標)を使用して、50℃及びpH5.0〜5.3で加水分解した。混合速度は6rpmであった。加水分解実験を96時間行い、その後、保存液体画分(C5バイパス)を添加し、50℃及びpH5.0〜5.3で48時間、後加水分解を行った。

HPLC試料を毎日採取し、Rezex Monosaccharideカラムを備えたDionex Ultimate 3000 HPLCシステムを使用して、外部標準を使用した定量化により、セルロース及びヘミセルロースの変換を追跡し、グルコース、キシロース及びアラビノースについて分析した。

図8は、キシラン価12.3%まで前処理され、グルカンのg当たり0.3mlのAccellerase Trio(商標)(Genencor)を使用して加水分解されたサトウキビバガスを使用し、固体画分の96時間の加水分解後に液体画分を追加した、ヘミセルロースの変換率の加水分解データを示す。示されているのは、典型的な加水分解プロファイルである。C5モノマー回収率は、加水分解反応において存在する材料からの理論的収率のパーセントとして表現される。固体画分中のヘミセルロースのほとんどは、固体画分の加水分解における最初の24時間以内にモノマー糖に変換されている。96時間後の液体画分の追加は、理論的潜在収率を増加させ、これは、液体画分が添加された直後に観察されるC5変換率の降下を説明している。最初の24時間以内に、液体画分からのC5のほとんどは、モノマーに変換される。液体画分が添加される直前のC5変換率と、加水分解の終了点でのC5変換率を比較すると、これらの条件下でサトウキビバガスを使用した場合、液体画分中のC5変換率を90%と計算することができる。

表3は、異なる状況下で前処理され、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物、Accellerase Trio(商標)(Genencor)の異なる用量レベルを使用して加水分解された、異なるバイオマスに対する加水分解データを示す。使用された全ての酵素用量レベルは、製造者により提案される範囲内であった。示されるように、1段階自己加水分解並びにC5バイパス及び後加水分解を用いた酵素加水分解を利用し、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物の製造者の推奨する用量を用いて、60%以上のC5モノマー収率を達成しながらも、60%以上のセルロース変換率を達成することができる。

本明細書に記載のように測定されたAccellerase TRIOを用いる表3において示される実験における酵素活性は、最初、エキソグルカナーゼ280〜5000 nkat/g グルカン、エンドグルカナーゼ1100〜20000 nkat/g グルカン、β-グルコシダーゼ3000〜25000 nkat/g グルカン、エンドキシラナーゼ1400〜30000 nkat/g グルカン、β-キシロシダーゼ75〜25000 nkat/g グルカンのnkat/g グルカンの範囲内であったことを示すことができる。

実施例7
改変酵母による、合わせられた加水分解物中のC5及びC6糖のエタノールへの共発酵

10%超のキシラン価までの1段階自己加水分解前処理により調製されたソフトリグノセルロース系バイオマス(この場合麦わら)から生成された加水分解物の使用に関する一例として、図9は、発酵の前に、解毒又は任意の他のプロセスステップを行わずに、C5及びC6糖の両方を変換することができるGMO酵母(TERRANOL(商標)製V1株)により実行された発酵についてのデータを示す。実施例4において記載されたように分離された前処理された麦わらからの固体画分は、Novozymes製Cellic Ctec2(商標)を使用して加水分解され、その後、保存液体画分と合わせられ、発酵阻害物質を除去する任意の解毒なしに使用された。

加水分解物は、発酵前にKOHペレットでpH5.5に調整され、3g/Lの尿素が加えられた。発酵は、バッチ発酵として行われた。反応器内の最初の細胞濃度は、0.75g dw/Lであった。発酵は、10%NH₃の自動添加を利用して、pH5.5に制御された。温度は30℃に維持され、撹拌速度は300rpmであった。示されるように、酢酸、フルフラール、及び典型的により高レベルの前処理過酷度で阻害性であることが明らかな他の化合物の存在下にもかかわらず、グルコース及びキシロースが容易に消費され、エタノールが容易に生成された。

実施例8
市販のセルラーゼ調製物中の活性レベルの実験的測定

GENENCOR(商標)製ACCELLERASE TRIO(商標)、並びにNOVOZYMES(商標)製CELLIC CTEC2(商標)及びCELLIC CTEC3(商標)の市販の調製物を、酵素調製物が同等の密度を有する、すなわち、同等サイズのアリコートが同等の質量を有するように希釈した。同体積の希釈酵素調製物を添加し、2回又は3回分析測定を行った。

CBHI(エキソセルラーゼ)活性の分析は、50mM NaOAC緩衝液中で、pH5、25℃で25分間行った。モデル基質である4-メチルウンベリフェリル-β-セロビオシドからの4-メチルウンベリフェロン放出(吸収:347nm)の持続的速度を追うことで活性を3回測定した。活性単位は、1μモルMeUmb当量/分であった。酵素調製物濃度は、CTEC3、ACTrio、及びCTEC2分析においてそれぞれ0.16、0.14、0.17mg/mlであった。基質濃度は、0.5mg/mlであった。

エンド-1,4-β-グルカナーゼ活性の分析は、50mM NaOAC緩衝液中で、pH5、50℃で60分間行った。モデル基質であるAvicel PH-101からの還元末端の生成に関連する吸収の変化を追うことで活性を3回測定した。活性単位は、1μモルグルコース当量/分であった。酵素調製物濃度は、CTEC3、ACTrio、及びCTEC2分析においてそれぞれ0.80、0.67、0.79mg/mlであった。基質濃度は、80mg/mlであった。

β-グルコシダーゼ活性の分析は、50mM NaOAC緩衝液中で、pH5、50℃で20分間行った。モデル基質であるセロビオースからのグルコースの放出に関連する吸収の変化を追うことで活性を3回測定した。活性単位は、2μモルグルコース/分であった。酵素調製物濃度は、CTEC3、ACTrio、及びCTEC2分析においてそれぞれ0.1、0.12、0.12mg/mlであった。基質濃度は、1.7mg/mlであった。

エンド-1,4-β-キシラナーゼ活性の分析は、50mM NaOAC緩衝液中で、pH5、50℃で60分間行った。モデル基質である水抽出可能なアラビノキシランからの還元末端の生成に関連する吸収の変化を追うことで活性を3回測定した。活性単位は、1μモルグルコース当量/分であった。酵素調製物濃度は、CTEC3、ACTrio、及びCTEC2分析においてそれぞれ1.12、0.97、1.12mg/mlであった。基質濃度は、10mg/mlであった。

β-キシロシダーゼ活性の分析は、50mM NaOAC緩衝液中で、pH5、50℃で60分間行った。モデル基質である水抽出可能なアラビノキシランの加水分解に関連するキシロースの放出を追うことで活性を2回測定した。活性単位は、1μモルキシロース/分であった。酵素調製物濃度は、CTEC3、ACTrio、及びCTEC2分析においてそれぞれ1.12、0.97、1.12mg/mlであった。基質濃度は、10mg/mlであった。

β-L-アラビノフラノシダーゼ活性の分析は、50mM NaOAC緩衝液中で、pH5、50℃で60分間行った。モデル基質である水抽出可能なアラビノキシランの加水分解に関連するアラビノアーゼの放出を追うことで活性を3回測定した。活性単位は、1μモルアラビノース/分であった。酵素調製物濃度は、CTEC3、ACTrio、及びCTEC2分析においてそれぞれ1.12、0.97、1.12mg/mlであった。基質濃度は、10mg/mlであった。

アミログルコシダーゼ(AMG)活性の分析は、50mM NaOAC緩衝液中で、pH5、50℃で80分間行った。モデル基質である可溶性コーンスターチからのグルコース放出に関連する吸収の変化を追うことで活性を3回測定した。活性単位は、1μモルグルコース/分であった。酵素調製物濃度は、CTEC3、ACTrio、及びCTEC2分析においてそれぞれ1.12、0.97、1.12mg/mlであった。基質濃度は、10mg/mlであった。

α-アミラーゼ活性の分析は、50mM NaOAC緩衝液中で、pH5、50℃で60分間行った。モデル基質である可溶性コーンスターチからの還元末端の生成に関連する吸収の変化を追うことで活性を3回測定した。活性単位は、1μモルグルコース当量/分であった。酵素調製物濃度は、CTEC3、ACTrio、及びCTEC2分析においてそれぞれ1.12、0.97、1.12mg/mlであった。基質濃度は、10mg/mlであった。

アセチルキシランエステラーゼ活性の分析は、100mMスクシネート緩衝液中で、pH5、25℃で25分間行った。モデル基質である4 4-ニトロフェニルアセテートからの4-ニトロフェニル放出(吸収:410nm)の持続的速度を追うことで活性を3回測定した。活性単位は、1μモルpNP当量/分であった。酵素調製物濃度は、CTEC3、ACTrio、及びCTEC2分析においてそれぞれ0.48、0.42、0.51mg/mlであった。基質濃度は、10mg/mlであった。

活性測定の結果を、表1に示す。

これらの結果は、酵素調製物間の定性的な比較を提供するものであるが、本発明における特許請求の範囲の適用上、大抵の場合において、酵素活性を表すnkat値を決定するために使用される方法によって行われない。

実施例9
低い過酷度、1段階自己加水分解により前処理された原料の酵素加水分解において高いC5モノマー収率を達成するために重要な酵素活性の同定

実施例4に記載のように、3.52の過酷度logRo(183℃で12分の滞留時間)まで麦わらを前処理して、13.5%のキシラン価を有し、図2から見積もられるような、非溶解固体中に残留する約7.8重量%のキシランを有する、前処理されたバイオマスを生産した。前処理からのグルカン回収率は100%だった。前処理からのキシラン回収率は77%だった。

濾紙分解活性(Filter Paper Units)(FPU)のセルラーゼ活性測定では、3つの別個の市販のセルラーゼ酵素調製物、GENENCOR(商標)製ACCELLERASE TRIO(商標)、NOVOZYMES(商標)製CELLIC CTEC3(商標)、NOVOZYMES(商標)製CELLUCLAST及びNOVOZYME 188をそれぞれ1:0.2の重量比で混合させた混合物について測定した。FPU活性はGhose (1987)の方法により測定され、CTEC3について179 FPU/g 酵素調製物、及びCELLUCLCAST/188について60 FPU/g 酵素調製物であることがわかった。

加水分解実験は、初期乾燥物質含量が22%DMであり、1 重量%のポリエチレングリコール(PEG)が添加され、固体画分の初期加水分解が94時間行われ、液体画分(C5バイパス)が添加されることによる後加水分解が50時間行われ、使用される酵素が14.3 FPU/g グルカンのFPU/g グルカンと等価用量で適用されるCTEC3、ACTRIO、又はCELLUCLAST/188であったこと以外は、本質的に実施例6に記載のように行われた。

適用された酵素の実際の用量は、CTEC3 0.08 g/g グルカン、AcTRIO 0.24 g/g グルカン、CELLUCLAST/188 0.22 g/g グルカンであった。

本明細書に記載のように測定されるべき、本実験において使用された、酵素活性(nkat/g グルカン)は、以下のように評価された。

+ Juhaszら(2005)により報告された値に基づく
a 基質として4-メチルウンベリフェリル-ベータ-セロビオシドを使用して測定
b 基質としてカルボキシメチルセルロース(CMC)を使用する最小のエンドグルカナーゼ値を報告するACCELLERASE TRIOの製品情報シート、及び例えば、Doriら(1995)による例において報告されている、ヒドロキシエチルセルロースの相当する値がCMC値の約0.35倍であるという仮定に基づく
c 最小値を報告するACCELLERASE TRIOの製品情報シートに基づく
d TrioとCelluclastを酵素調製物gあたり3.86:1で含むキシロシダーゼ活性の代替的測定比に基づく
e CTEC3とTRIOを酵素調製物gあたり3.12:1で含むエンドグルカナーゼ活性の代替的測定比に基づく
f CTEC3とTRIOを酵素調製物gあたり3.76:1で含むベータ-グルコシダーゼ活性の代替的測定比に基づく

本明細書に記載のように測定されたこれらの実験における酵素活性は、最初、エキソグルカナーゼ280〜1240 nkat/g グルカン、エンドグルカナーゼ1100〜8000 nkat/g グルカン、β-グルコシダーゼ3000〜15000 nkat/g グルカン、エンドキシラナーゼ9000〜30000 nkat/g グルカン、β-キシロシダーゼ75〜1400 nkat/g グルカンのnkat/g グルカンの範囲内であったことを示すことができる。

図11は、様々な反応チャンバにおける時間の関数としてのセルロース変換率を示す。セルロース変換率は、グルコース濃度を試料が採取された瞬間での理論的グルコースポテンシャルで除することにより測定される。C5バイパスを添加する場合、バイパスは分解されない少量のグルコースオリゴマーを含有するのでグルコースポテンシャルが変化し、その結果、全体の変換率は減少する。示されるように、セルロース変換反応速度について、CTEC及びTRIOチャンバは同等であるが、CELLUCLAST/188チャンバは同等ではない。これは、キシラナーゼ及びキシロシダーゼ活性がかなり低いレベルであるためである。

図12は、時間の関数としての対応するキシラン変換率を示す。キシラン変換率は、セルロース変換率と同じ方法で計算されるが、C5-バイパスを加水分解物に添加した場合、C5-バイパスは多量のキシロースオリゴマーを含有するので、変換率は、最初、劇的に降下する。示されるように、キシラン変換反応速度について、CTEC及びTRIOチャンバは同等であるが、CELLUCLAST/188チャンバは同等ではない。これもまた、キシラナーゼ及びキシロシダーゼ活性がかなり低いレベルであるためである。

前処理からのキシラン回収率が77%だった場合、図12で示されるキシラン回収率は加水分解物における非常に高い最終C5モノマー回収率に相当し、例えば、図12において80%の変換率は、(0.80)*(0.77)= 61.6%のC5モノマー回収率に相当する。

グルカン及びキシラン含量は、Sluiter, A., B. Hamesら(2005)、「Determination of Sugars, Byproducts, and Degradation Products in Liquid Fraction Process Samples, NREL - Biomass Program」及びSluiter, A., B. Hamesら(2006)、「Determintation of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass, NREL- Biomass Program」に記載のように測定される。

実施例10
全スラリーを使用してより低い酵素用量において同等の変換収率を可能にするより低い乾燥物質への希釈

実施例9に記載される実験において、6-チャンバ加水分解反応器の2つのチャンバを全スラリーの加水分解を比較するために使用し、ここで、前処理後の固体画分から分離された液体画分は、後で加水分解物に添加されるべきバイパスとして保存せずに、その代わり、固体画分に戻して混合し、同時に加水分解した。全スラリーは、12%DMまで希釈され、これは、溶解固体が除去され、22%DMでの固体画分の加水分解からの分離が維持された(C5バイパス)、実施例9に記載される反応で達成されたものとほぼ同等の阻害溶解物質の濃度を与える。CTEC3及びACTRIOは、酵素調製物として使用され、10.7 FPU/g グルカンのより低い用量で適用された。

本明細書に記載のように測定されるべき、本実験において使用された、酵素活性(nkat/g グルカン)は、以下のように(実施例9で与えられた値に基づいて)評価された。

本明細書に記載のように測定されたこれらの実験における酵素活性は、最初、エキソグルカナーゼ280〜1240 nkat/g グルカン、エンドグルカナーゼ1100〜8000 nkat/g グルカン、β-グルコシダーゼ3000〜15000 nkat/g グルカン、エンドキシラナーゼ9000〜30000 nkat/g グルカン、β-キシロシダーゼ75〜1400 nkat/g グルカンのnkat/g グルカンの範囲内であったことを示すことができる。

図13は、両方の全スラリー加水分解試料について、時間の関数としてセルロース変換率を示す。セルロース変換率は実施例9に記載のように測定される。示されるように、セルロース変換反応速度について、CTEC及びTRIOチャンバは同等である。さらに、より低い酵素用量にもかかわらず、変換レベルは、実施例9に記載のような、C5バイパス及び後加水分解により達成されるものと同等である。

図14は、両方の全スラリー加水分解試料について、時間の関数としての対応するキシラン変換率を示す。示されるように、キシラン変換反応速度について、CTEC及びTRIOチャンバはほぼ同等である。前処理からのキシラン回収率が77%だった場合、図14で示されるキシラン回収率は加水分解物における非常に高い最終C5モノマー回収率に相当し、例えば、図12において80%の変換率は、(0.80)*(0.77)= 61.6%のC5モノマー回収率に相当する。示されるように、全スラリー加水分解において、図14における71%のキシラン変換率に相当する、少なくとも55%の非常に高いC5モノマー回収率は、これらの条件下、41時間以内の加水分解により達成される。

実施例9及び10に記載される実験について、前処理、加水分解及び回収の様々なパラメータを表4に示す。

実施例11
前処理されたサトウキビバガスの全スラリー加水分解

実施例4に記載のように、3.43の過酷度logRo(180℃で12分の滞留時間)までサトウキビバガスを前処理して、12.0%のキシラン価を有し、図2から見積もられるような、非溶解固体中に残留する約6.8重量%のキシランを有する前処理されたバイオマスを生産した。前処理からのキシラン回収率は83%だった。反応器から取り出した後、スラリーは約57%の繊維画分及び液体画分まで圧縮された。前処理された材料、繊維画分、並びに液体画分を集めて、分析した。試料の乾燥物質及び組成は、上記実施例に記載のように測定された。

実験は、実施例6に記載される6-チャンバ反応器で行われた。前処理されたバガスを全スラリー混合物として使用し、ここで、繊維画分を酵素添加の前に液体画分と混合させる。その後、乾燥物質含量は、水により18重量%DMに調節された。加水分解は、20重量%の水酸化カルシウム溶液(Ca(OH)₂)の使用により、pHを4.7〜5.3に調節して、50℃で実施された。Accellerase Trioは、酵素として、0.16mL/g グルカン(9.5 FPU/g グルカン)の濃度で使用された。1日ごとに試料を採取し、糖含量について分析した。118時間後に加水分解を停止した。実験は、ダブル測定で行った。

本明細書に記載のように測定されるべき、本実験において使用された、酵素活性(nkat/g グルカン)は、最初、以下のように(実施例9で与えられた値に基づいて)評価された。

本明細書に記載のように測定されたこれらの実験における酵素活性は、最初、エキソグルカナーゼ nkat/g グルカン、エンドグルカナーゼ nkat/g グルカン、β-グルコシダーゼ nkat/g グルカン、エンドキシラナーゼ nkat/g グルカン、β-キシロシダーゼ グルカンのnkat/g グルカンの範囲内であったことを示すことができる。

本実施例11に記載される実験について、前処理、加水分解及び回収の様々なパラメータを表5に示す。

図15は、バガスの全スラリーの加水分解について、加水分解時間の関数としての加水分解物における全C5及びC6モノマー回収率を示す。示されるように、少なくとも55%の全C5モノマー回収率は、これらの条件下、24時間以内に達成される。

実施例12
低い過酷度の自己加水分解により前処理された原料からの加水分解物のC6エタノール発酵後に残っている希薄な蒸留残渣の改善されたバイオメタンポテンシャル

実施例4に記載のように、3つの異なる過酷度まで麦わらを前処理して、3.0%、9.1%及び13.2%のキシラン価を有し、図2から見積もられるような、非溶解固体中に残留する、それぞれ、約2.0重量%、4.3重量%及び7.8重量%のキシランを有する前処理されたバイオマスを生産した。

前処理された材料は固体/液体分離に供されて、その後酵素加水分解実験に使用された繊維画分、並びに加水分解から分離が維持された液体画分を生成した。固体画分は、CTEC3を使用して、3.0%のキシラン価の試料について0.052 g/g グルカン、9.1%のキシラン価の試料について.056 g/g グルカン、及び13.2%のキシラン価の試料について0.075 g/g グルカンのそれぞれの用量で、加水分解された。

本明細書に記載のように測定されたこれらの実験における酵素活性は、最初、エキソグルカナーゼ nkat/g グルカン、エンドグルカナーゼ nkat/g グルカン、β-グルコシダーゼ nkat/g グルカン、エンドキシラナーゼ nkat/g グルカン、β-キシロシダーゼ グルカンのnkat/g グルカンの範囲内であったことを示すことができる。

加水分解は、22%DMで、pHを5.0に調節して、50℃で、144時間行われた。144時間後、通常のパン酵母(C6発酵)を加水分解物に添加し、温度を37℃に下げて、発酵/加水分解をさらに60時間継続した。加水分解/発酵の終了時において、エタノール濃度は、異なるグループ間で61.77〜63.68 g/kgのエタノールになり、ほぼ等しかった。

発酵させた加水分解物からの、及び対応する分離された液体画分からのバイオメタン生産量は、二重のバッチアッセイで、Denmark、Fredericia、Fredericia Spildevand製接種を使用して、5〜6.5の接種/基質(substratio)比(揮発性固体を基準として)で、測定された。

それぞれの前処理についての物質収支は、慎重に測定され、3つの異なる過酷度レベルそれぞれからの各加水分解物のC6エタノール発酵から残留する希薄な蒸留残渣のメタンポテンシャルを評価するために使用された。観測されたバイオメタンポテンシャルに対して公知のエタノールの寄与を減じて、1トンの麦わら乾燥物質からの見積メタン生産量を測定した。結果を表6に示す。

実施形態及び実施例は、単なる説明であり、特許請求の範囲を限定することを意図しない。本明細書において引用される参考文献はそれぞれ、参照により全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

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「キシラン価」は、以下のように決定される前処理されたバイオマスの特性決定を指す。前処理されたバイオマスは、全体の約30%が固体（約30%の全固体）で得られ、典型的に固体/液体分離の後に、固体画分、及び液体画分が提供される。次いで、この約30%の全固体を有する前処理されたバイオマスは、1:3の全固体(DM)対水の重量比で70℃の水と混合することにより、部分的に洗浄される。このようにして洗浄された前処理されたバイオマスは、次いで約30%の全固体まで圧縮される。このようにして洗浄され、約30%の全固体まで圧縮された、前処理されたバイオマスのキシラン含量は、A. Sluiterら、「Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass」、US National Renewable Energy Laboratory (NREL) Laboratory Analytical Procedure (LAP)(発行日2008年4月25日、Technical Report NREL/TP-510-42618(2008年4月改訂)に記載)の方法を使用して決定される。ガラクトース及びマンノースがキシロースと共溶出するHPLCカラム及び溶出システムが使用される。そのようなシステムの例は、Phenomenex製REZEX(商標)Monossacharide H+カラム及びBiorad製AMINEX HPX 87C(商標)カラムを含む。説明されるようなこのキシラン含量の測定は、これらの条件下において固体画分から洗浄されていない残留液体画分からの可溶性物質のある程度の寄与を含む。したがって、「キシラン価」は、不溶性固体中の残留キシラン含量、並びに「液体画分」中の可溶性キシロース及びキシロオリゴマー含量の「加重した組合せ」の測定値を提供する。

いくつかの実施形態において、原料は、水熱前処理の前に、まず水溶液中に浸漬される。いくつかの実施形態において、米国特許第８，１２３，８６４号明細書に記載のように、前処理において、後のステップから得られる酢酸含有液体中に原料を浸漬させることが有利となり得る。米国特許出願公開第２０１２／９３５，５８７号明細書に記載のように、可能な限り高い乾燥物質含量で処理を行うことが有利である。高い乾燥物質で前処理を行うことは、不必要な水の加熱に対するプロセスエネルギーの支出を回避する。しかしながら、酵素加水分解からの最適な最終糖収率を達成するために、ある程度の水分は必要である。典型的には、その本来の保水能力で、又はその付近でバイオマス原料を前処理することが有利である。これは、所与の原料が、過剰の水の中での浸漬に続く、通常の商業的スクリュープレスの機械的限界までの圧縮の後に到達する水分のレベル、典型的には30%〜45%DMである。いくつかの実施形態において、水熱前処理は、少なくとも35%のDM含量で行われる。水熱前処理中は、ある程度の水分が加熱中に追加されるため、DM含量が減少し得ることが、当業者に容易に理解されるだろう。いくつかの実施形態において、原料は、少なくとも20%、又は少なくとも25%、又は少なくとも30%、又は少なくとも40%、又は40%以下、又は35%以下、又は30%以下のDM含量で前処理される。

バイオマス原料は、様々な手段により、大気圧から加圧反応器内に投入され得る。いくつかの実施形態において、米国特許出願公開第２０１３／０６２，５２２号明細書に記載のシステム等のスルース(sluice)型「パーティクルポンプ」システムを使用して、バイオマス原料が投入され得る。いくつかの実施形態において、いわゆる「スクリュープラグ」供給機器を使用して前処理反応器に投入することが有利となり得る。

繊維構造は、非爆発的様式で加圧反応器から原料を除去することにより維持され得る。いくつかの実施形態において、非爆発的除去は、米国特許出願公開第２０１３／０４３，４８６号明細書に記載のもの等のスルース型システムを使用して達成されてもよく、それにより繊維構造が維持され得る。いくつかの実施形態において、非爆発的除去は、米国特許出願公開第２０１２／９９６，３９２号明細書に記載のもの等の液体サイクロン除去システムを使用して達成されてもよく、それにより繊維構造が維持され得る。

実施形態及び実施例は、単なる説明であり、特許請求の範囲を限定することを意図しない。

Claims (17)

1. リグノセルロース系バイオマスを処理する方法であって、
   ソフトリグノセルロース系バイオマス原料を準備するステップと、
   1段階加圧水熱前処理において、原料を、3.5〜9.0の範囲内のpHで、log過酷度Roが3.75以下になるまで前処理して、非溶解固体が少なくとも5.0重量%のキシランを含む前処理されたバイオマススラリーを生成するステップと、
   前処理されたバイオマスを、エンドグルカナーゼ活性、エキソグルカナーゼ活性、β-グルコシダーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、及びβ-キシロシダーゼ活性を少なくとも1100（nkat/gグルカン）のエンドグルカナーゼ活性レベル、少なくとも280（nkat/gグルカン）のエキソグルカナーゼ活性レベル、少なくとも3000（nkat/gグルカン）のβ-グルコシダーゼ活性レベル、少なくとも1400（nkat/gグルカン）のエンドキシラナーゼ活性レベル、及び少なくとも75（nkat/gグルカン）のβ-キシロシダーゼ活性レベルで含む酵素混合物により触媒される少なくとも24時間の酵素加水分解を利用して、補助水分を添加して又は添加せずに加水分解して、C5モノマーの収率が前処理前の原料の元のキシロース及びアラビノース含量の少なくとも55%である加水分解物を生成するステップと、
   を含む方法。
2. 前処理されたバイオマスが、全スラリーとして加水分解される、請求項１に記載の方法。
3. 加水分解が、8%〜19%の乾燥物質含量で行われる、請求項２に記載の方法。
4. 全スラリー加水分解物が、バイオメタン基質として使用される、請求項２に記載の方法。
5. 前処理されたバイオマスが、固体/液体分離ステップに供され、液体画分及び少なくとも40重量%の乾燥物質含量を有する固体画分を生成して、固体画分が加水分解される、請求項１に記載の方法。
6. 加水分解が、20%以上の乾燥物質含量で行われる、請求項４に記載の方法。
7. 固体画分の酵素加水分解が所望のグルカン変換度に到達した後に、分離された液体画分が、加水分解混合物中に再添加される、請求項４に記載の方法。
8. 液体画分中に存在するキシロオリゴマーの少なくとも85%が、後加水分解中にキシロースモノマーに加水分解される、請求項７に記載の方法。
9. グルコースへの少なくとも50%のセルロース変換率が達成された後に、液体画分が、加水分解された固体画分に添加される、請求項７に記載の方法。
10. 原料が、麦わら、トウモロコシ茎葉、サトウキビバガス、スイートソルガムバガス、又は空果房である、請求項１に記載の方法。
11. 原料が、少なくとも35%の乾燥物質含量で加圧前処理を受ける、請求項１に記載の方法。
12. 加圧前処理が、10バール以下の圧力で行われる、請求項１に記載の方法。
13. 原料が、液体サイクロンシステムを使用して、加圧前処理反応器から除去される、請求項１に記載の方法。
14. 原料が、バイオマスが12%以上のキシラン価を有することを特徴とするような過酷度まで前処理される、請求項１に記載の方法。
15. 酵素加水分解が、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販のセルラーゼ調製物を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
16. 酵素加水分解が、少なくとも96時間行われる、請求項１に記載の方法。
17. 合わせられたC5/C6加水分解物が、1種以上の改変酵母株を使用してエタノールに直接発酵されることをさらに特徴とする、請求項１に記載の方法。
    

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