JP2016529482A - 新規アッセイ - Google Patents
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Abstract
本発明は、組織におけるアミロイド沈着を含む疾患、特に、アルツハイマー病、AMD、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成に罹患しているヒト患者の(a)血漿または他の体液のCFI生物活性;および(b)血漿または他の体液中のCFIの生物活性を定量的に測定するように設計されたCFI生物活性アッセイに関する。
Description
本発明は、組織におけるアミロイド沈着を含む疾患、特に、アルツハイマー病、AMD、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成に罹患しているヒト患者の(a)血漿または他の体液のCFI生物活性;および(b)血漿または他の体液中のCFIの生物活性を定量的に測定するように設計されたCFI生物活性アッセイに関する。
補体の活性化、特に、補体カスケードの第二経路は、加齢性黄斑変性(AMD)の病因の中心であると考えられている。補体因子I(CFI)およびH因子(CFH)は、第二経路の活性化および増幅の制御に重要な役割を果たす。
H因子は、豊富に存在する150kDaの糖タンパク質であり、循環中の平均濃度は500μg/mLである(Rodriguez de Cordoba et al., 2004)。I因子は、88kDaのヘテロ二量体セリンプロテアーゼであり、血清濃度はおよそ39〜100μg/mlである(De Paula et al., 2003)。補体H因子の重要な機能は、様々な機構による液相および表面における第二経路の主要な阻害剤である。I因子の役割は、適当な補因子の存在下でC3bおよびC4bのタンパク質分解切断によるC3およびC5コンベルターゼの活性化を調節することである。H因子の1つの重要な機能は、液相中で、C3bを不活性化するためにI因子の必須補因子として働いて、不活性型のC3b、すなわちiC3bの形成をもたらすことである。ゆえに、C3bに対するそれらの作用を通じて、両因子は第二経路におけるC3コンベルターゼ形成を阻害する。C3bの存在下での液相中でH因子またはI因子のいずれかの活性を測定するためには、ウエスタンブロットを用いたin vitro補因子アッセイが使用されてきた(Brandstatter et al., 2012)。
AMDの最初期臨床ホールマークおよびリスク因子の1つは、ドルーゼンとして知られる網膜下細胞外タンパク質沈着の形成である。ドルーゼン中の多くの他のタンパク質の中でも、β−アミロイドタンパク質は、AMDの発症を招く主要な刺激の1つであると考えられている。しかしながら、ドルーゼンからのAMDの発症の機序は、厳密に決定されていない。
β−アミロイドペプチド(BAMまたはAβ)による補体の活性化は、疾患の進行の基礎にある重要な機序の1つであることが提案されている。Bradt et al. (1998)は、血清または補体タンパク質混合物などの補体供給源への線維性BAM1−40およびBAM1−42の添加が、BAMとC3活性化フラグメントとの共有エステル結合複合体の生成をもたらすことを見出し、BAMによる補体の活性化の第1の直接的証拠となる。より最近では、補体の活性化におけるBAMの関与は、Wang et al (2008)による試験でさらに実証され、そこでは、BAM1−40は、CFIおよびCFHと結合して、補因子アッセイにおいてCFIがC3bを切断してiC3bを生じる能力を阻害したことが示され、これはウエスタンブロットにおいて可視的なiC3bシグナルの欠如により明らかになった。
一実施形態では、本発明は、ヒト体液のCFI生物活性またはヒト体液中のCFIの生物活性を定量的に測定する方法であって、体液またはCFIのC3bからiC3bへの変換能を定量的に測定する工程を含んでなる方法に関する。さらに、本発明はまた、精製または組換え型のCFIのいずれかのCFI生物活性を定量的に測定することを可能とし、精製または組換え型のCFIのC3bからiC3bへの変換能を定量的に測定することを含んでなる。
第2の実施形態では、本発明は、ヒト体液のCFI生物活性またはヒト体液中のCFIの生物活性を定量的に測定する方法であって、
(a)ヒト体液を希釈剤(例えば、PBS)で希釈する工程;
(b)前記希釈ヒト体液にCFHおよびC3bを加える工程;
(c)工程(b)で得られた溶液をインキュベートする工程;および
(d)生じたiC3bの量を測定する工程
を含んでなる方法に関する。
(a)ヒト体液を希釈剤(例えば、PBS)で希釈する工程;
(b)前記希釈ヒト体液にCFHおよびC3bを加える工程;
(c)工程(b)で得られた溶液をインキュベートする工程;および
(d)生じたiC3bの量を測定する工程
を含んでなる方法に関する。
第3の実施形態では、前記ヒト体液は血漿である。
第4の実施形態では、
(a)血漿をPBS中に約200〜250倍で希釈した後、PBS中に2倍連続希釈し;
(b)6μLのCFHおよびC3bを、各終濃度80μg/mLとなるように前記血漿に加え;かつ
(c)第2の実施形態の工程(c)のインキュベーションを37℃で2時間行い;さらに
(d)ELISAを用いてiC3bの量を測定する。
(a)血漿をPBS中に約200〜250倍で希釈した後、PBS中に2倍連続希釈し;
(b)6μLのCFHおよびC3bを、各終濃度80μg/mLとなるように前記血漿に加え;かつ
(c)第2の実施形態の工程(c)のインキュベーションを37℃で2時間行い;さらに
(d)ELISAを用いてiC3bの量を測定する。
第5の実施形態では、ヒト血漿または体液のCFI生物活性は、50%のC3bをiC3bへ変換するのに必要な血漿または体液の容量であるEC50で測定される。
第6の実施形態では、ヒト血漿または体液のCFI生物活性は、mU/容量で測定され、mUが、50%のC3bをiC3bへ変換するのに必要な血漿または体液の容量nL(EC50)の逆数として定義される。
第7の実施形態では、血漿または体液中のCFIの生物活性は、式:1000/(EC50(nL)×[CFIμg/ml])を用いて、CFIのμg量当たりの単位で導き出される。
第8の実施形態では、本発明は、抗BAM抗体のバッチ間の効力を測定する方法であって、
(a)抗BAM抗体の第1バッチをBAMとともにインキュベートする工程;
(b)工程(a)で得られたBAMをCFIとともにインキュベートする工程;
(c)CFHおよびC3bを工程(b)の混合物に加える工程;
(d)生じたiC3bの量を測定する工程;
(e)生じたiC3bの量を用いて、第1バッチのCFI生物活性を決定する工程;
(f)抗BAM抗体の第2バッチに対してa〜e)の工程を繰り返す工程;および
(g)抗BAM抗体バッチ間の効力を決定するために、抗BAM抗体の第1バッチと抗SAM抗体の第2バッチのCFI生物活性を比較する工程(ここで、第1バッチの決定に用いる試薬の量は、第2バッチの決定に用いる量とそれぞれ同じである)
を含んでなる方法に関する。
(a)抗BAM抗体の第1バッチをBAMとともにインキュベートする工程;
(b)工程(a)で得られたBAMをCFIとともにインキュベートする工程;
(c)CFHおよびC3bを工程(b)の混合物に加える工程;
(d)生じたiC3bの量を測定する工程;
(e)生じたiC3bの量を用いて、第1バッチのCFI生物活性を決定する工程;
(f)抗BAM抗体の第2バッチに対してa〜e)の工程を繰り返す工程;および
(g)抗BAM抗体バッチ間の効力を決定するために、抗BAM抗体の第1バッチと抗SAM抗体の第2バッチのCFI生物活性を比較する工程(ここで、第1バッチの決定に用いる試薬の量は、第2バッチの決定に用いる量とそれぞれ同じである)
を含んでなる方法に関する。
第9の実施形態では、本発明は、ヒト患者の組織におけるアミロイド沈着を含む疾患を治療する方法であって、
a)患者の体液のCFI生物活性または体液中のCFIの生物活性を測定する工程;および
b)CFI生物活性を測定した後、所定量よりも低いCFI生物活性を有する患者に、その疾患を治療するのに有効な量の抗BAM抗体を提供する工程
を含んでなる方法に関する。
a)患者の体液のCFI生物活性または体液中のCFIの生物活性を測定する工程;および
b)CFI生物活性を測定した後、所定量よりも低いCFI生物活性を有する患者に、その疾患を治療するのに有効な量の抗BAM抗体を提供する工程
を含んでなる方法に関する。
第10の実施形態では、前記疾患は、アルツハイマー病、AMD、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成である。
第11の実施形態では、本発明は、
a)患者の体液のCFI生物活性または体液中のCFIの生物活性を測定する工程;および
b)CFI生物活性を測定した後、所定量よりも低いCFI生物活性を有する患者に、その疾患を治療するのに有効な量の抗BAM抗体を提供する工程
を含んでなる、ヒト患者の組織におけるアミロイド沈着を含む疾患の治療において使用するための抗BAM抗体に関する。
a)患者の体液のCFI生物活性または体液中のCFIの生物活性を測定する工程;および
b)CFI生物活性を測定した後、所定量よりも低いCFI生物活性を有する患者に、その疾患を治療するのに有効な量の抗BAM抗体を提供する工程
を含んでなる、ヒト患者の組織におけるアミロイド沈着を含む疾患の治療において使用するための抗BAM抗体に関する。
第12の実施形態では、前記疾患は、アルツハイマー病、AMD、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成である。
第12の実施形態では、本発明は、精製または組換え型のCFIのいずれかのCFI生物活性を定量的に測定する方法であって、
(a)精製または組換え型のCFIを希釈剤で希釈する工程;
(b)CFHおよびC3bを、工程a)で作製したCFI溶液に加える工程;
(c)得られた工程(b)の溶液をインキュベートする工程;および
(d)生じたiC3bの量を測定する工程
を含んでなる方法に関する。
(a)精製または組換え型のCFIを希釈剤で希釈する工程;
(b)CFHおよびC3bを、工程a)で作製したCFI溶液に加える工程;
(c)得られた工程(b)の溶液をインキュベートする工程;および
(d)生じたiC3bの量を測定する工程
を含んでなる方法に関する。
補体I因子(CFI)およびβ−アミロイドペプチド(BAM)は加齢性黄斑変性(AMD)の病因に関与する2つの重要な因子であることが知られている。BAMとCFIの生物活性との間の関係をさらに定義するために、まず、CFIの生物活性を測定するためのin vitro補因子アッセイを確立した。このアッセイは、背景の節に言及したウエスタンブロットの代わりに、iC3bの定量的検出のためにELISA法を用いる。この研究で、本発明者らは、BAM1−40およびBAM1−42が補因子アッセイにおいてCFIの酵素的生物活性に影響を及ぼすかどうか、ならびにBAMとCFIの生物活性との間の関係が定量的に測定可能かどうかを検討するために一連の試験を行った。BAMとCFIはAMDの発症の重要な寄与因子であるということを考えると、それらの関係を正確に定量するためのアッセイがあれば、そのアッセイの潜在的適用が意味あるものとなると考えられる。例えば、そのアッセイは、治療的介入の過程で、CFI生物活性の変化を測定するためのバイオマーカーアッセイとなり得る。
本発明者らの同時係属特許出願WO2009/040336号およびWO2007/113172号は、とりわけ、AMD、緑内障、β−アミロイド白内障形成、アルツハイマー病を治療する抗体を教示している。WO2002/040336号およびWO2007/113172号は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。特に注目されるものとして、以下のCDRを含んでなるWO2009/040336に記載されている抗体がある。
VH3遺伝子ファミリーに由来するヒト重鎖可変領域内の
CDRH1: DNGMA(配列番号1)
CDRH2: FISNLAYSI DYADTVTG(配列番号2)
CDRH3: GTWFAY(配列番号3):
CDRH1: DNGMA(配列番号1)
CDRH2: FISNLAYSI DYADTVTG(配列番号2)
CDRH3: GTWFAY(配列番号3):
GenPeptエントリーCAA51 135(配列番号7)に開示されているアミノ酸配列に由来するヒト軽鎖可変領域内の
CDRL1: RVSQSLLHSNGYTYLH(配列番号4)
CDRL2: KVSNRFS(配列番号5)
CDRL3: SQTRHVPYT(配列番号6)
CDRL1: RVSQSLLHSNGYTYLH(配列番号4)
CDRL2: KVSNRFS(配列番号5)
CDRL3: SQTRHVPYT(配列番号6)
また、特に注目されるものとして、配列番号8で示される配列セットを有する重鎖可変領域と配列番号9で示される配列セットを有する軽鎖可変領域とを有する抗体がある。
特に注目されるさらなるものとして、配列番号10で示される配列セットを有する重鎖と配列番号11で示される配列セットを有する軽鎖とを含んでなる抗体(本明細書では化合物Aと定義される)がある。本発明のアッセイは、上記抗体を用いる過程で、CFI生物活性の変化を測定するための生物マーカーアッセイとして有用であることが示される。さらに、本アッセイは、WO2009/040336号およびWO2207/113172号に開示されている抗体に等しく限定されず、その機序がBAMにより抑制されるCFI生物活性の回復により組織におけるアミロイド沈着を含む疾患(特に、アルツハイマー病、AMD、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成)を治療するいずれの抗体に適用することもできる。
本発明者らは、今般、BAM1−42が、補因子アッセイにおいてCFIが、C3bをiC3bに変換する能力の低下により示されるようにCFI生物活性を低下させることを示した。その後、本発明者らは、(a)抗BAM抗体がBAMにより阻害されたCFI生物活性を逆転または回復させることができることを実証し;かつ(b)本発明者らは、抗BAM療法中または療法後にヒトおよびマウス血漿におけるCFI生物活性の変化を定量するためのバイオマーカーアッセイを開発した。言い換えれば、本CFI定量的生物活性アッセイは、組織におけるアミロイド沈着を含む疾患(特に、アルツハイマー病、AMD、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成)に罹患したヒト患者が、まず、患者の体液中のCFI生物活性または体液中のCFIのレベルを決定することにより、抗BAM抗体の受容から利益を受け得るかどうかを確認するために使用することができる。また、このアッセイは、抗BAM抗体療法を受けた患者が、抗BAM抗体が投与される前と投与された後を比較することにより、患者の体液中のCFI生物活性または体液中のCFIのレベルを決定することによってプラスの効果を有したかどうか決定するために使用することもできる。本CFIバイオマーカーアッセイは、好ましくは、本明細書に記載のようにヒト体液(例えば、血漿)サンプルを用いてin vitroで実施される。
一般に、本CFI生物活性アッセイは、
(a)ヒト体液を希釈剤(例えば、PBS)で希釈する工程;
(b)前記希釈ヒト体液にCFHおよびC3bを加える工程;
(c)得られた工程(b)の溶液をインキュベートする工程;および
(d)生じたiC3bの量を測定する工程
を含んでなる方法により達成することができる。
(a)ヒト体液を希釈剤(例えば、PBS)で希釈する工程;
(b)前記希釈ヒト体液にCFHおよびC3bを加える工程;
(c)得られた工程(b)の溶液をインキュベートする工程;および
(d)生じたiC3bの量を測定する工程
を含んでなる方法により達成することができる。
本発明者らはまた、本CFI生物活性アッセイが、
(a)抗BAM抗体をBAMとともにインキュベートする工程;
(b)工程(a)で得られたBAMをCFIとともにインキュベートする工程;
(c)工程(b)の混合物にCFHおよびC3bを加える工程;
(d)変換されたiC3bの量を測定してCFI生物活性を測定する工程;および
(e)バッチ間の抗BAM抗体の効力を相関させるために抗BAM抗体のバッチ間のCFI生物活性を比較する工程
を含んでなる方法により抗BAM抗体のバッチ間バッチ効力を測定するために使用することができる。
(a)抗BAM抗体をBAMとともにインキュベートする工程;
(b)工程(a)で得られたBAMをCFIとともにインキュベートする工程;
(c)工程(b)の混合物にCFHおよびC3bを加える工程;
(d)変換されたiC3bの量を測定してCFI生物活性を測定する工程;および
(e)バッチ間の抗BAM抗体の効力を相関させるために抗BAM抗体のバッチ間のCFI生物活性を比較する工程
を含んでなる方法により抗BAM抗体のバッチ間バッチ効力を測定するために使用することができる。
本明細書で使用する場合、「CFI生物活性」および「CFIの生物活性」は、同じものを意味し、次のようにして得られる。
一実施形態では、ヒト血漿または体液のCFI生物活性は、50%のC3bをiC3bへ変換するのに必要な血漿または体液の容量であるEC50として測定される。
別の実施形態では、ヒト血漿または体液のCFI生物活性は、EC50の逆数として測定される。例えば、1つの方法では、それは容量当たりのmUとして測定することができ、mUは、50%のC3bをiC3bへ変換するのに必要な血漿または体液の容量nL(EC50)の逆数として測定される。
別の実施形態では、血漿または体液中のCFIの生物活性は、式:1000/(EC50(nL)×[CFIμg/ml])を用いて、CFIのμg量当たりの単位で導き出される。
パートI−CFI生物活性を測定するためのELISAアッセイを確立するための実行可能性試験
材料の供給源
I因子、H因子、C3b、およびiC3bタンパク質は、Complement Technology Inc(タイラー、テキサス州)から購入した。MicroVue iC3b EIAキット(ELISAキット)は、Quidel Corp(サンタ・クララ、CA)から購入した。アミロイドβ−タンパク質(1−40)(HCl型)およびアミロイドβ−タンパク質(1−42)(TFA型)をPeptides International,Inc.(ルイビル、KY)から購入した。
材料の供給源
I因子、H因子、C3b、およびiC3bタンパク質は、Complement Technology Inc(タイラー、テキサス州)から購入した。MicroVue iC3b EIAキット(ELISAキット)は、Quidel Corp(サンタ・クララ、CA)から購入した。アミロイドβ−タンパク質(1−40)(HCl型)およびアミロイドβ−タンパク質(1−42)(TFA型)をPeptides International,Inc.(ルイビル、KY)から購入した。
1.1 標品の調製
参照標品iC3b(1.1mg/mL)を用いて、アッセイマトリックスとして、アッセイバッファー(10mM Tris、60mM NaCl、0.1%BSA、0.1%Tween 20、pH7.2)中、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、および10μg/mLの公称濃度で標品を調製した。
参照標品iC3b(1.1mg/mL)を用いて、アッセイマトリックスとして、アッセイバッファー(10mM Tris、60mM NaCl、0.1%BSA、0.1%Tween 20、pH7.2)中、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、および10μg/mLの公称濃度で標品を調製した。
1.2. BAM溶液の調製
1mMのBAM1−40: 0.55mgを含有するHCl形態のアミロイド−β−タンパク質(1−40)のバイアル全部を、15分間、Branson 1210ソニケーターでの音波処理により127μLのPBSに溶かした。この溶液を4℃で保存した。
1mMのBAM1−40: 0.55mgを含有するHCl形態のアミロイド−β−タンパク質(1−40)のバイアル全部を、15分間、Branson 1210ソニケーターでの音波処理により127μLのPBSに溶かした。この溶液を4℃で保存した。
1mMのTFA形態のBAM1−42(ロット1): 0.56mgを含有するアミロイド−β−タンパク質(1−42)のバイアル全部を、15分間、音波処理により、124μLのPBSに懸濁させた。懸濁液中、BAM1−42の溶解を、1/10容量のDMSOを用いて試みたが、これは成功しなかった。この懸濁液を最終的に、NaOHおよびHClを用いて(全90μLのBAMに対して、6μL 0.5N NaOH、2μL 1N HClを使用した)pHを約7に調製することにより溶かした。最終1mMの溶液を4℃で保存した。BAM 1−42の別のバイアル(ロット2)を、そのまま112μLの1mM NaOHに溶かした後、12μLの10×PBSを加えて最終的な1×PBS溶液を作製することにより1mMの溶液を作製した。ロット2 BAM1−42溶液のアリコートに、4℃で9日間の保存の後、ソニケーターにて15分間音波処理を施した。音波処理済みおよび非音波処理の両方のBAM1−42溶液(ロット2)を4℃で保存した。
1.3. in vitro補因子アッセイ
BAM1−40またはBAM1−42(0〜400μM)をCFI(0〜30μg/mL)と混合し、37℃で30〜60分間プレインキュベートした。CFH(10〜80μg/mL)およびC3b(80〜150μg/mL)の混合物を、CFIまたはBAM/CFI混合物を含有する試験管に加えた。37℃で30分のインキュベーション後、反応混合物をそのままアッセイバッファーで希釈し、iC3bのELISA検出に使用した。
BAM1−40またはBAM1−42(0〜400μM)をCFI(0〜30μg/mL)と混合し、37℃で30〜60分間プレインキュベートした。CFH(10〜80μg/mL)およびC3b(80〜150μg/mL)の混合物を、CFIまたはBAM/CFI混合物を含有する試験管に加えた。37℃で30分のインキュベーション後、反応混合物をそのままアッセイバッファーで希釈し、iC3bのELISA検出に使用した。
1.4. iC3bのELISA検出
以下に示したもの以外の詳細な手順は、ELISAキットとともに提供された説明書に従って行った。希釈した反応混合物および標品を8ウェルストリップにウェル当たり60μLで適用し、室温で30分間インキュベートした。プレート洗浄機にてインハウス洗浄バッファー(10mM Tris、60mM NaCl、0.1%Tween 20、pH7.2)で5分洗浄した後、8ウェルストリップにウェル当たり50μLのHRP抗ヒトiC3bコンジュゲートを添加し、室温で30分間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、8ウェルストリップをプレート洗浄機で5回洗浄し、キットに提供されている100μLのHRP基質とともにさらに30分間インキュベートした。反応を50μLの停止バッファーの添加により停止した。405nmでの吸光度を10分以内に測定した。
以下に示したもの以外の詳細な手順は、ELISAキットとともに提供された説明書に従って行った。希釈した反応混合物および標品を8ウェルストリップにウェル当たり60μLで適用し、室温で30分間インキュベートした。プレート洗浄機にてインハウス洗浄バッファー(10mM Tris、60mM NaCl、0.1%Tween 20、pH7.2)で5分洗浄した後、8ウェルストリップにウェル当たり50μLのHRP抗ヒトiC3bコンジュゲートを添加し、室温で30分間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、8ウェルストリップをプレート洗浄機で5回洗浄し、キットに提供されている100μLのHRP基質とともにさらに30分間インキュベートした。反応を50μLの停止バッファーの添加により停止した。405nmでの吸光度を10分以内に測定した。
1.5. 主要コンピューターシステムおよびデータ処理
BioTek ELx800マイクロプレートリーダー(ウィーヌースキー、VT)を用いて吸光度データを取得し、これはDell PCワークステーションによりGen5(商標)ソフトウエア(BioTek)で制御した。取得したデータは、Gen5ソフトウエア(BioTek)およびMicrosoft Excel 2003を用いて処理した。iC3b定量のための標準曲線は、標品の濃度をそれらの対応する405nmでの吸光度(Y軸、OD405)に対して対数スケール(X軸)でプロットすることにより作成し、4−パラメーターロジスティックアルゴリズムを用いて当てはめを行った。サンプル中のiC3b濃度をこの標準曲線に基づいて決定した。Microsoft XLfitを用いてBAMまたはCFIの濃度に対するiC3bの濃度の曲線をグラフ化した。
BioTek ELx800マイクロプレートリーダー(ウィーヌースキー、VT)を用いて吸光度データを取得し、これはDell PCワークステーションによりGen5(商標)ソフトウエア(BioTek)で制御した。取得したデータは、Gen5ソフトウエア(BioTek)およびMicrosoft Excel 2003を用いて処理した。iC3b定量のための標準曲線は、標品の濃度をそれらの対応する405nmでの吸光度(Y軸、OD405)に対して対数スケール(X軸)でプロットすることにより作成し、4−パラメーターロジスティックアルゴリズムを用いて当てはめを行った。サンプル中のiC3b濃度をこの標準曲線に基づいて決定した。Microsoft XLfitを用いてBAMまたはCFIの濃度に対するiC3bの濃度の曲線をグラフ化した。
2.実行可能性試験の結果および考察
2.2 補因子アッセイの最終産物iC3bの測定
ELISA法を用い、補因子アッセイにおいて、CFIにより切断されたC3bの最終産物iC3bの濃度を定量し、これがCFIの生物活性の測定でもあった。ELISA検出の直接的な読み取り値はOD405であり、次にこれを、同じELISAプレート中で用いたiC3b標品に基づき、iC3bの濃度に変換した。CFI生物活性の質的評価のために、OD405を、OD405とiC3b濃度の間の関係が非線形であったとしても相関がある場合には、iC3b濃度に変換せずにそのまま使用した場合があった。iC3b標品を用いた場合、0.03〜3μg/mLの範囲の典型的なiC3b標準曲線を得た。
2.2 補因子アッセイの最終産物iC3bの測定
ELISA法を用い、補因子アッセイにおいて、CFIにより切断されたC3bの最終産物iC3bの濃度を定量し、これがCFIの生物活性の測定でもあった。ELISA検出の直接的な読み取り値はOD405であり、次にこれを、同じELISAプレート中で用いたiC3b標品に基づき、iC3bの濃度に変換した。CFI生物活性の質的評価のために、OD405を、OD405とiC3b濃度の間の関係が非線形であったとしても相関がある場合には、iC3b濃度に変換せずにそのまま使用した場合があった。iC3b標品を用いた場合、0.03〜3μg/mLの範囲の典型的なiC3b標準曲線を得た。
2.2 補因子アッセイにおけるCFIの滴定
CFIの生物活性に及ぼすBAMの影響を試験するために、CFIの濃度の適当な範囲が必要であった。1pg/mL〜10μg/mLにわたる濃度のCFIをまず、1ログ刻みで合計8ログ試験した。この8ログ試験の結果に基づき、0.3ng/mL〜1000ng/mLの範囲の濃度のCFIを、補因子アッセイにおいて、半ログ刻みでさらに試験した。次の一連の実験においてBAMの影響を試験するために、3〜10,000ng/mLの間のCFIの最適濃度範囲を選択した。
CFIの生物活性に及ぼすBAMの影響を試験するために、CFIの濃度の適当な範囲が必要であった。1pg/mL〜10μg/mLにわたる濃度のCFIをまず、1ログ刻みで合計8ログ試験した。この8ログ試験の結果に基づき、0.3ng/mL〜1000ng/mLの範囲の濃度のCFIを、補因子アッセイにおいて、半ログ刻みでさらに試験した。次の一連の実験においてBAMの影響を試験するために、3〜10,000ng/mLの間のCFIの最適濃度範囲を選択した。
2.3. CFIの生物活性に及ぼす0日目のBAMの影響
Wang et al. (2008)に記載された方法に基づき、HCl形態のBAM1−40を用い、PBS中での音波処理により溶かした。同様に、PBS中の音波処理で最初BAM1−42の溶解を試みたが、失敗した。BAM1−42は最終的に、pHを調整することにより溶解させた。新たに作製したBAM1−40溶液およびBAM1−42懸濁液(0日目)を、従前の実験から示唆された濃度範囲でのCFIの生物活性に関する補因子アッセイで試験した。BAMはCFI用量応答曲線をシフトさせなかったことから、0日目の両BAMは、PBS対照と比較してより高濃度でのBAM処理CFIにおいて、iC3b生産の低下にもかかわらず、CFI生物活性の阻害において不活性であると結論づけられた。このような低下は、おそらく、高い希釈倍率および一試験点などの技術的理由によるものであった。
Wang et al. (2008)に記載された方法に基づき、HCl形態のBAM1−40を用い、PBS中での音波処理により溶かした。同様に、PBS中の音波処理で最初BAM1−42の溶解を試みたが、失敗した。BAM1−42は最終的に、pHを調整することにより溶解させた。新たに作製したBAM1−40溶液およびBAM1−42懸濁液(0日目)を、従前の実験から示唆された濃度範囲でのCFIの生物活性に関する補因子アッセイで試験した。BAMはCFI用量応答曲線をシフトさせなかったことから、0日目の両BAMは、PBS対照と比較してより高濃度でのBAM処理CFIにおいて、iC3b生産の低下にもかかわらず、CFI生物活性の阻害において不活性であると結論づけられた。このような低下は、おそらく、高い希釈倍率および一試験点などの技術的理由によるものであった。
2.4 CFIの生物活性に及ぼすエージングを行ったBAMの影響
極めて多くの文献が、BAMが凝集して、高い活性を有するオリゴマーとなることを示している(Uversky, 2010; Bertoncini and Celej, 2011, Straub and Thirumalai, 2011)。従って、その活性が0日目に検出できないBAM溶液は、経時的にその活性を高め得ると推論された。従前の試験から4℃で保存した両BAM溶液を補因子アッセイにおいて2日間および3日間エージングを行った後に再び試験した。補因子アッセイにおけるCFIおよびCFHの濃度は、C3bからiC3bの切断効率に有意に寄与したことが知られている(Brandstaetter et al., 2012)。BAMの広範囲の潜在的阻害効果を、特に低活性終端において検出するために、異なるiC3b変換効率を有する5つの異なる補因子アッセイを用いた:
・1μg/mL CFI、10μg/mL CFH(低iC3b変換効率)
・1μg/mL CFI、30μg/mL CFH(中−低iC3b変換効率)
・10μg/mL CFI、10μg/mL CFH(中iC3b変換効率)
・10μg/mL CFI、30μg/mL CFH(中−高iC3b変換効率)
・10μg/mL CFI、80μg/mL CFH(高iC3b変換効率)
極めて多くの文献が、BAMが凝集して、高い活性を有するオリゴマーとなることを示している(Uversky, 2010; Bertoncini and Celej, 2011, Straub and Thirumalai, 2011)。従って、その活性が0日目に検出できないBAM溶液は、経時的にその活性を高め得ると推論された。従前の試験から4℃で保存した両BAM溶液を補因子アッセイにおいて2日間および3日間エージングを行った後に再び試験した。補因子アッセイにおけるCFIおよびCFHの濃度は、C3bからiC3bの切断効率に有意に寄与したことが知られている(Brandstaetter et al., 2012)。BAMの広範囲の潜在的阻害効果を、特に低活性終端において検出するために、異なるiC3b変換効率を有する5つの異なる補因子アッセイを用いた:
・1μg/mL CFI、10μg/mL CFH(低iC3b変換効率)
・1μg/mL CFI、30μg/mL CFH(中−低iC3b変換効率)
・10μg/mL CFI、10μg/mL CFH(中iC3b変換効率)
・10μg/mL CFI、30μg/mL CFH(中−高iC3b変換効率)
・10μg/mL CFI、80μg/mL CFH(高iC3b変換効率)
3回の独立した実験からの結果は、2日間または3日間エージングを行ったBAM1−40溶液および1−42溶液は、エージング無しのものよりも有意に高いCFI阻害活性を有することを一貫して示した。(1)BAM1−42はCFI生物活性の阻害においてBAM1−40よりもはるかに活性が高く(表1)、かつ、(2)補因子アッセイ条件は、BAMを介したCFI生物活性の阻害効率に実際に影響を及ぼしたと結論づけられる。従って、低、中および高iC3b変換効率条件下でそのIC50を特定するために、3日目のBAM1−42を選択した。低、中および高iC3b変換効率条件下でのBAM1−42のIC50および高効率条件は、それぞれ1.5μM、31.2μM、および60.1μであった。
2.5 BAM1−42はCFI生物活性の真の阻害剤か。
BAM1−42がCFI生物活性の真の阻害剤かどうかに答えるために、特異性を実証するための補因子アッセイでの陰性対照を試験する必要がある。陰性対照を探すために、2つのアプローチを使用した。まず、BAM1−42およびBAM1−40を処理するために煮沸を選択したが、これは、煮沸が通常、高分子の生物活性を破壊するからである。次に、エージングにより促進されたBAM阻害活性および新たに作製したBAMは従前の実験で検出可能な活性を示さなかったことを示したので、新たなBAM1−42溶液(ロット2)を作製し、新鮮なうちに、8日間エージングを行ったBAM1−42(ロット1)とともに陰性対照として用いた。
BAM1−42がCFI生物活性の真の阻害剤かどうかに答えるために、特異性を実証するための補因子アッセイでの陰性対照を試験する必要がある。陰性対照を探すために、2つのアプローチを使用した。まず、BAM1−42およびBAM1−40を処理するために煮沸を選択したが、これは、煮沸が通常、高分子の生物活性を破壊するからである。次に、エージングにより促進されたBAM阻害活性および新たに作製したBAMは従前の実験で検出可能な活性を示さなかったことを示したので、新たなBAM1−42溶液(ロット2)を作製し、新鮮なうちに、8日間エージングを行ったBAM1−42(ロット1)とともに陰性対照として用いた。
予期しないことに、15分間の煮沸はCFIに対するBAM1−40の阻害活性を有意に高め(図1)、一方、煮沸はBAM1−42の活性を有意に変化させなかった(示されていない)。BAMの煮沸がBAMの活性を増強する手段として記載されていなくても、それは、高温がBAMのβシート形成を促進する(Jiang et al., 2012)という事実と一致する。従って、煮沸はまたBAM1−42活性も増強し得るとの仮説に至ることが論理的である。BAM1−42の活性は、ほぼ反応プラトーに達したことから、この実験で煮沸はそれに影響を及ぼすとは思われないことは驚くことではなかった。要約すると、本発明者らは、思いがけないことに、煮沸がCFIに対するBAMの阻害活性を促進したことを見出した。
BAMの陰性対照を探すための第2のアプローチは予想された結果をもたらした。新たに作製したBAM1−42(ロット2)は認め得るほどの活性を有さないことが示され、一方、8日目のBAM1−42(ロット1)はやはり、2日目または3日目に示されるものよりも強い阻害活性を持っていた(図2)。よって、BAM1−42は、CFI生物活性の阻害剤と考えることができる。
2.6 音波処理はBAM1−42の活性を増強した。
BAM1−42(ロット2)は、新たに作製した場合には活性は無かった。さらに、このロット2 BAM1−42を、7日間エージングを行った後に試験したところ、それは10μg/mLのCFIに関して約25%だけCFI生物活性を阻害し、一方、ロット1 BAM1−42は、3日目および8日目(42)に試験したところ、ほぼ100%CFI生物活性を阻害した。BAM 1−42(ロット2)は、ロット2には音波処理を適用しなかったこと以外は、ロット1溶液を作製するための主要な手段に基づいて溶液とした。音波処理が活性の増強に役割を果たしたかどうかを試験するために、BAM1−42(9日間エージングを行ったロット2)溶液を2つのアリコートに分けた。1アリコートをBranson 1210ソニケーターで15分間音波処理し、もう1つのアリコートはそのままとした。音波処理済みと非音波処理の両方のBAM1−42溶液を、BAM1−40とともに、補因子アッセイで試験した。結果は明白に、BAMがCFI生物活性を阻害する活性構造を形成するためには音波処理が重要であったことを示す(図3)。
BAM1−42(ロット2)は、新たに作製した場合には活性は無かった。さらに、このロット2 BAM1−42を、7日間エージングを行った後に試験したところ、それは10μg/mLのCFIに関して約25%だけCFI生物活性を阻害し、一方、ロット1 BAM1−42は、3日目および8日目(42)に試験したところ、ほぼ100%CFI生物活性を阻害した。BAM 1−42(ロット2)は、ロット2には音波処理を適用しなかったこと以外は、ロット1溶液を作製するための主要な手段に基づいて溶液とした。音波処理が活性の増強に役割を果たしたかどうかを試験するために、BAM1−42(9日間エージングを行ったロット2)溶液を2つのアリコートに分けた。1アリコートをBranson 1210ソニケーターで15分間音波処理し、もう1つのアリコートはそのままとした。音波処理済みと非音波処理の両方のBAM1−42溶液を、BAM1−40とともに、補因子アッセイで試験した。結果は明白に、BAMがCFI生物活性を阻害する活性構造を形成するためには音波処理が重要であったことを示す(図3)。
2.7 BAM1−42の存在下でのCFI用量応答
本発明者らは、BAM1−42が、CFIがC3bを切断してiC3bを生じる能力を阻害することを実証した。取り組むべき重要な問題は、CFI生物活性がどれほどBAM1−42により影響を受けるか、および生物活性の見かけの低下をどのように定量するかということであろう。これらの問題に応えるために、CFI用量応答試験を行い、補因子アッセイにおいて、200μM BAM1−42(ロット2、音波処理無しで7日間エージング)の存在下または不在下、CFIを10ng/mL〜30μg/mLの範囲で試験した。BAM1−42は、CFIの生物活性を、PBS対照に比べてEC50で約5分の1に低下させた(BAM1−42のEC50:3324.5ng/mL;PBSのEC50:686ng/mL)。
本発明者らは、BAM1−42が、CFIがC3bを切断してiC3bを生じる能力を阻害することを実証した。取り組むべき重要な問題は、CFI生物活性がどれほどBAM1−42により影響を受けるか、および生物活性の見かけの低下をどのように定量するかということであろう。これらの問題に応えるために、CFI用量応答試験を行い、補因子アッセイにおいて、200μM BAM1−42(ロット2、音波処理無しで7日間エージング)の存在下または不在下、CFIを10ng/mL〜30μg/mLの範囲で試験した。BAM1−42は、CFIの生物活性を、PBS対照に比べてEC50で約5分の1に低下させた(BAM1−42のEC50:3324.5ng/mL;PBSのEC50:686ng/mL)。
本発明者らは、Ghosh et al, 1998に記載されているような再パラメーター化4−パラメーターロジスティック方程式を用いて、同じデータのさらなる分析を行った。上記で既に述べたように、C3bからiC3bへの濃度依存変換は、CFIを200μM BAM1−42とともにプレインキュベートすることによって低下した(図4)。50%の利用可能C3bを切断するのに必要なCFIの量はおよそ632ng/mlであった。これに対し、BAM1−42とともにプレインキュベートした後では、同じ切断率を達成するために、およそ3200ng/ml CFI当量が必要とされた。これはCFI生物活性に5分の1へのBAM1−42依存性の正味の低下をもたらし、これは、推定EC50の95%信頼限界にオーバーラップは無かったことから、統計学的に有意であると思われる(図4、括弧の中の数字)。
実行可能性試験の結果
本試験で、本発明者らは、BAM1−40とBAM1−42の両方が、調製して適切なエージングを行った場合、CFHを補因子として加えている間は、C3bを切断してiC3bを生じるCFIの生物活性を阻害することができることを確認した。加えて、この一連の試験は、CFIの生物活性(本レポートで評価)、おそらくはまたCFHの生物活性も、効果的に測定することができる定量的補因子アッセイの基礎を確立する。
本試験で、本発明者らは、BAM1−40とBAM1−42の両方が、調製して適切なエージングを行った場合、CFHを補因子として加えている間は、C3bを切断してiC3bを生じるCFIの生物活性を阻害することができることを確認した。加えて、この一連の試験は、CFIの生物活性(本レポートで評価)、おそらくはまたCFHの生物活性も、効果的に測定することができる定量的補因子アッセイの基礎を確立する。
CFI生物活性のBAM依存的低下は、反応の最終産物を検出するために用いたELISA法の定量的性質のために、本方法を用いて迅速かつ正確に定量することができる。これは、文献に報告されている最良の定性的方法、すなわち、ウエスタンブロットまたはSDS−PAGE技術とは対照的である。本発明者らはまた、BAM1−42の阻害活性がBAM1−40に関して見られたものよりもはるかに大きかったことを示した。音波処理、煮沸、および4℃でのエージングなどの種々の処理は、CFI生物活性の遮断に関して測定した場合、BAMの活性に有意に影響を及ぼす。in vitro補因子アッセイ条件は、C3bの切断が異なる効率で制御できるように微調整されており、これは、種々の適用のために特殊なアッセイ構成を確立しようとする本発明者らの試みを前進させる極度の柔軟性を与える。
パートII−本発明者らのELISAアッセイは、抗BAM抗体の投与前後で、硝子体液中のAMD患者のCFI生物活性、およびアルツハイマー患者の血漿のCFI生物活性を測定することができることの証明
材料の供給先
I因子、H因子、C3b、およびiC3bは、Complement Technology,Inc(タイラー、テキサス州)から購入した。MicroVue iC3b EIAキット(ELISAキット)は、Quidel Corp(サンタクララ、CA)から購入した。補体因子I用のELISAキットは、USCN Life Science(武漢、中国)から購入した。βアミロイド組換えペプチド(1−42)(Ultra Pure、TFA Form)は、Covanceから購入した。
材料の供給先
I因子、H因子、C3b、およびiC3bは、Complement Technology,Inc(タイラー、テキサス州)から購入した。MicroVue iC3b EIAキット(ELISAキット)は、Quidel Corp(サンタクララ、CA)から購入した。補体因子I用のELISAキットは、USCN Life Science(武漢、中国)から購入した。βアミロイド組換えペプチド(1−42)(Ultra Pure、TFA Form)は、Covanceから購入した。
以下の抗アミロイド抗体および対照抗体を本試験に用いた。
3.1. 標品の調製
2.1と同様に、参照標品iC3b(1.1mg/mL)を用い、アッセイマトリックスとして、アッセイバッファー(10mM Tris、60mM NaCl、0.1%BSA、0.1%Tween 20、pH7.2)中、5ng/mL〜10000ng/mLの間の公称濃度で標品を調製した。
2.1と同様に、参照標品iC3b(1.1mg/mL)を用い、アッセイマトリックスとして、アッセイバッファー(10mM Tris、60mM NaCl、0.1%BSA、0.1%Tween 20、pH7.2)中、5ng/mL〜10000ng/mLの間の公称濃度で標品を調製した。
3.2. in vitro血漿補因子アッセイ
2.4でのin vitro補因子アッセイと同様に、CFH(80μg/mL)およびC3b(80μg/mL)を、PBSで希釈した血漿と混合し、これをCFI源として使用した。この混合物を37℃で1〜2時間インキュベートした。陰性対照として、PBSで予め10倍希釈した後に60℃で2時間処理した血漿サンプルを一部のアッセイに含めた。インキュベーション後、この反応混合物を2.7に記載した手順に従って、iC3bの定量に用いた。
2.4でのin vitro補因子アッセイと同様に、CFH(80μg/mL)およびC3b(80μg/mL)を、PBSで希釈した血漿と混合し、これをCFI源として使用した。この混合物を37℃で1〜2時間インキュベートした。陰性対照として、PBSで予め10倍希釈した後に60℃で2時間処理した血漿サンプルを一部のアッセイに含めた。インキュベーション後、この反応混合物を2.7に記載した手順に従って、iC3bの定量に用いた。
3.3. iC3bのELISA検出
試験の過程で、2つのELISA法を使用した。試験の第1の半分では、Quidelからの市販キットを用い、そのキット手順に従った。本発明者らは、iC3bの検出のためのインハウスELISA法を開発した。簡単に述べれば、96ウェルプレートをモノクローナル抗ヒトiC3b抗体(Quidel カタログ番号:A209)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次に、このプレートを、プレート洗浄機を用いて1ウェル当たり300μLの洗浄バッファーで5回洗浄し、各ウェルに200μLのブロッキングバッファーを充填した。プレートを振盪しながら室温で1時間インキュベートし、5回洗浄した。アッセイバッファーで希釈した100マイクロリットルの標品およびサンプルを適当なウェルに加え、振盪しながら室温で1時間インキュベートした。その後、このプレートを5回洗浄した。100マイクロリットルのHRPコンジュゲート抗ヒトC3c(AbD Serotec カタログ番号:2222−6604P)を各ウェルに加え、振盪しながら室温で1時間インキュベートした。その後、このプレートを5回洗浄した。100マイクロリットルのUltra−TMB ELISA基質(Thermo カタログ番号:34028)を加え、振盪しながら室温で10〜30分間インキュベートし、1ウェル当たり100μLの2M硫酸を加えることにより反応を停止させた。その後、450nmで吸光度を測定した。データは、Gen 5(商標)ソフトウエアを用いて処理した。
試験の過程で、2つのELISA法を使用した。試験の第1の半分では、Quidelからの市販キットを用い、そのキット手順に従った。本発明者らは、iC3bの検出のためのインハウスELISA法を開発した。簡単に述べれば、96ウェルプレートをモノクローナル抗ヒトiC3b抗体(Quidel カタログ番号:A209)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。次に、このプレートを、プレート洗浄機を用いて1ウェル当たり300μLの洗浄バッファーで5回洗浄し、各ウェルに200μLのブロッキングバッファーを充填した。プレートを振盪しながら室温で1時間インキュベートし、5回洗浄した。アッセイバッファーで希釈した100マイクロリットルの標品およびサンプルを適当なウェルに加え、振盪しながら室温で1時間インキュベートした。その後、このプレートを5回洗浄した。100マイクロリットルのHRPコンジュゲート抗ヒトC3c(AbD Serotec カタログ番号:2222−6604P)を各ウェルに加え、振盪しながら室温で1時間インキュベートした。その後、このプレートを5回洗浄した。100マイクロリットルのUltra−TMB ELISA基質(Thermo カタログ番号:34028)を加え、振盪しながら室温で10〜30分間インキュベートし、1ウェル当たり100μLの2M硫酸を加えることにより反応を停止させた。その後、450nmで吸光度を測定した。データは、Gen 5(商標)ソフトウエアを用いて処理した。
3.4. CFIのELISA検出
ヒト血漿中のCFIタンパク質濃度は、USCN Life ScienceからのヒトCFI用の市販ELISAキットを用いて測定した。8つのヒト血漿サンプル(このうち4つは補体グレートであった)は個々のドナーに由来し、採血後すぐに血液サンプルから調製されたものである(Bioreclamationから入手)。これらの血漿サンプル中のヒトCFI濃度は、ELISAキットを用い、キット中に提供されている手順に従って測定した。対照として、Complement Technology(タイラー、テキサス州)から購入した精製ヒト血清CFIタンパク質もまた試験に含めた。
ヒト血漿中のCFIタンパク質濃度は、USCN Life ScienceからのヒトCFI用の市販ELISAキットを用いて測定した。8つのヒト血漿サンプル(このうち4つは補体グレートであった)は個々のドナーに由来し、採血後すぐに血液サンプルから調製されたものである(Bioreclamationから入手)。これらの血漿サンプル中のヒトCFI濃度は、ELISAキットを用い、キット中に提供されている手順に従って測定した。対照として、Complement Technology(タイラー、テキサス州)から購入した精製ヒト血清CFIタンパク質もまた試験に含めた。
3.5. 主要なコンピューターシステムおよびデータ処理
BioTek ELx800マイクロプレートリーダー(ウィヌースキ、VT)を用いて吸収データを取得し、これはソフトウエア(BioTek)を介してDell PCワークステーションにより制御した。取得したデータは、Gen5ソフトウエア(BioTek)およびMicrosoft Excel 2003を用いて処理した。iC3b定量のための標準曲線は、標品の濃度をそれらの対応する405nmまたは450nmでの吸光度(Y軸)に対して対数スケール(X軸)でプロットすることにより作成し、4−パラメーターロジスティックアルゴリズムを用いて当てはめを行った。サンプル中のiC3b濃度をこの標準曲線に基づいて決定した。Microsoft XLfitを用いて、抗体BAMまたはCFIの濃度に対するiC3bの濃度の曲線をグラフ化した。
BioTek ELx800マイクロプレートリーダー(ウィヌースキ、VT)を用いて吸収データを取得し、これはソフトウエア(BioTek)を介してDell PCワークステーションにより制御した。取得したデータは、Gen5ソフトウエア(BioTek)およびMicrosoft Excel 2003を用いて処理した。iC3b定量のための標準曲線は、標品の濃度をそれらの対応する405nmまたは450nmでの吸光度(Y軸)に対して対数スケール(X軸)でプロットすることにより作成し、4−パラメーターロジスティックアルゴリズムを用いて当てはめを行った。サンプル中のiC3b濃度をこの標準曲線に基づいて決定した。Microsoft XLfitを用いて、抗体BAMまたはCFIの濃度に対するiC3bの濃度の曲線をグラフ化した。
3.6 CFI用量および経時的応答
パートIに示されるように、補因子CFHの存在下でCFIが基質C3bをiC3bに変換する、in vitro補因子アッセイが確立されている。このアッセイにおけるCFIの生物活性を十分特徴付けるために、30、100、300、および1000ng/mLのCFIを80μg/mLのCFHおよび80μg/mLのC3bとともに37℃で0.5、1、2、4および22時間インキュベートした。最終産物iC3bの濃度は、iC3b ELISAキットを用いて決定した。2時間のインキュベーション時間内で、産生されたiC3bは、一貫して、試験した範囲内でCFIの濃度に比例していた。この結果は、in vitro血漿補因子アッセイを開発するに至らせた。
パートIに示されるように、補因子CFHの存在下でCFIが基質C3bをiC3bに変換する、in vitro補因子アッセイが確立されている。このアッセイにおけるCFIの生物活性を十分特徴付けるために、30、100、300、および1000ng/mLのCFIを80μg/mLのCFHおよび80μg/mLのC3bとともに37℃で0.5、1、2、4および22時間インキュベートした。最終産物iC3bの濃度は、iC3b ELISAキットを用いて決定した。2時間のインキュベーション時間内で、産生されたiC3bは、一貫して、試験した範囲内でCFIの濃度に比例していた。この結果は、in vitro血漿補因子アッセイを開発するに至らせた。
3.7 in vitro血漿補因子アッセイの確立
血漿中のCFIの生物活性は、特定の疾患の重要なバイオマーカーであると考えられている。しかしながら、血漿中のCFIの生物活性を正確に測定するアッセイは存在しない。本発明者らは、純粋なタンパク質形態でCFIまたはCFH生物活性を測定するためのin vitro補因子アッセイを開発するために、本発明者らは、既存の方法の改変により、血漿CFIの生物活性を測定するための別のアッセイを開発するのにより良い状況にいた。血漿は、高分子と小分子の複合物である。CFIは循環中におよそ39〜100μg/ml(De Paula et al., 2003)の濃度で、CFHはおよそ500μg/mL(Rodriguez de Cordoba et al., 2004)の濃度で存在することが報告されている。血漿中のCFIの生物活性を測定するためには、血漿源のCFHおよび他の分子の作用を最小限にしなければならない。本発明者らは、希釈血漿中のCFH(<1μg/mL)が反応の外的CFH(80μg/mL)と比べて無視できるようにするために、血漿を少なくとも500倍に希釈することによってこの実施を計画する。このように、上記の補因子アッセイはCFIの極めて高感度のアッセイであることから、希釈血漿中のCFIは、CFI源として使用した場合、なお検出の範囲内にある。
血漿中のCFIの生物活性は、特定の疾患の重要なバイオマーカーであると考えられている。しかしながら、血漿中のCFIの生物活性を正確に測定するアッセイは存在しない。本発明者らは、純粋なタンパク質形態でCFIまたはCFH生物活性を測定するためのin vitro補因子アッセイを開発するために、本発明者らは、既存の方法の改変により、血漿CFIの生物活性を測定するための別のアッセイを開発するのにより良い状況にいた。血漿は、高分子と小分子の複合物である。CFIは循環中におよそ39〜100μg/ml(De Paula et al., 2003)の濃度で、CFHはおよそ500μg/mL(Rodriguez de Cordoba et al., 2004)の濃度で存在することが報告されている。血漿中のCFIの生物活性を測定するためには、血漿源のCFHおよび他の分子の作用を最小限にしなければならない。本発明者らは、希釈血漿中のCFH(<1μg/mL)が反応の外的CFH(80μg/mL)と比べて無視できるようにするために、血漿を少なくとも500倍に希釈することによってこの実施を計画する。このように、上記の補因子アッセイはCFIの極めて高感度のアッセイであることから、希釈血漿中のCFIは、CFI源として使用した場合、なお検出の範囲内にある。
同じドナーHPL8由来のヒト血漿サンプルは、2.7に記載の方法に従って2回の独立した実験で試験した。このアッセイでは、1mUのCFI生物活性は、補因子アッセイで50%のC3bをiC3bへ変換するのに必要なCFIの量または血漿容量nLの逆数として定義される。2回の実験で同じドナー由来の血漿CFI生物活性は、作成された曲線によればそれぞれ2.9nLおよび3.2nLであった(図5および図6)。血漿中のCFIタンパク質濃度は92.95μg/mLであったので、CFIの量当たりの単位として定義すれば、それらはそれぞれ3.7U/μg CFIおよび3.4U/μg CFIであった(次節参照)。他のドナーの血漿サンプルもまた試験したところ、CFI生物活性は2.3nLまたは3.6U/μg CFIであった(血漿中のCFI濃度は123.4μg/mLであった)(次節参照)。これらの結果は、血漿CFI生物活性を測定するための方法は高感度で実行可能性があることを示す。
同様に、血漿中、マウスCFI生物活性を、ヒト血漿CFI生物活性に用いたものと同じ方法に従って試験した。マウスCFHおよびC3bタンパク質は利用できないので、真正なマウス補因子アッセイは確立できない。マウスタンパク質とヒトタンパク質の間の有意な相同性のために、マウスCFIは、ヒトCFHおよびC3bとともに働き得る。仮説を立てると、マウス血漿CFIは実際に、たとえ10分の1の活性であったとしても、ヒトCFHの存在下でヒトC3bをiC3bに変換することができる(図7)。
3.8. ヒト血漿中のCFI濃度の測定
ヒト血漿サンプル中に存在するCFIタンパク質の量に換算したヒト血漿中のCFI生物活性を定義するために、血漿中のCFI濃度を決定する必要がある。USCN Life ScienceからのヒトCFI用の市販ELISAキットを使用した。8つのヒト血漿サンプルで、製造者の説明書に従ってCFI濃度を決定した。これらのサンプル中のCFIの濃度は、報告されているCFI濃度範囲内に入る。しかしながら、補因子アッセイで使用して上手くいった精製血清CFIタンパク質は、このキットによっては検出できなかった。このことは、ヒト血漿サンプルにおいて、このキットにより検出されたCFI濃度の精度についての疑問を浮上させた。
ヒト血漿サンプル中に存在するCFIタンパク質の量に換算したヒト血漿中のCFI生物活性を定義するために、血漿中のCFI濃度を決定する必要がある。USCN Life ScienceからのヒトCFI用の市販ELISAキットを使用した。8つのヒト血漿サンプルで、製造者の説明書に従ってCFI濃度を決定した。これらのサンプル中のCFIの濃度は、報告されているCFI濃度範囲内に入る。しかしながら、補因子アッセイで使用して上手くいった精製血清CFIタンパク質は、このキットによっては検出できなかった。このことは、ヒト血漿サンプルにおいて、このキットにより検出されたCFI濃度の精度についての疑問を浮上させた。
製造者によれば、このキットは、大腸菌(E Coli)で発現させた組換えCFIペプチドに対して生じたモノクローナル抗体を使用しており、このことが上記の矛盾を説明するかもしれない。ヒト血漿サンプル中のCFIを正確に定量するためには、ヒト血清CFIタンパク質を検出する信頼性のあるCFI ELISA法が望ましいと思われる。
3.9. 活性BAM溶液の調製
本研究では、若干異なる手順および処理を用いて3ロットのBAM1−42溶液を調製した。まず、BAM溶液を作製し、4℃で数日エージングを行った場合には、次にそれを補因子アッセイでCFIの阻害活性に関して試験した。所望の活性まででなければ、それを再びエージングするか、または37℃で数時間から最大一晩激しく振盪しながら処理し、その後、活性を再び試験した。IC50が1〜10μMに達した際にのみ、そのBAM溶液を活性と見なし、アッセイに使用するものとした。試験の後期ほど、BAM活性を一貫したものに保持するために、活性なBAM溶液を小アリコートに分割し、−70℃で保存した。典型的なBAM用量応答曲線を(図8)に示し、IC50は2.06μMである。
本研究では、若干異なる手順および処理を用いて3ロットのBAM1−42溶液を調製した。まず、BAM溶液を作製し、4℃で数日エージングを行った場合には、次にそれを補因子アッセイでCFIの阻害活性に関して試験した。所望の活性まででなければ、それを再びエージングするか、または37℃で数時間から最大一晩激しく振盪しながら処理し、その後、活性を再び試験した。IC50が1〜10μMに達した際にのみ、そのBAM溶液を活性と見なし、アッセイに使用するものとした。試験の後期ほど、BAM活性を一貫したものに保持するために、活性なBAM溶液を小アリコートに分割し、−70℃で保存した。典型的なBAM用量応答曲線を(図8)に示し、IC50は2.06μMである。
3.10. 補因子アッセイにおいてBAMの活性に及ぼす抗BAM抗体の効果
BAMにより媒介されるCFI生物活性の阻害に及ぼす抗BAM抗体の効果を調べるために、BAMの異なるエピトープに標的化された数種の市販マウスモノクローナル抗体を選択した。まず、100μg/mL〜300μg/mLの単回用量抗体を、手順に記載されているように試験した。試験した抗体の中で、6E10は、BAMの活性を逆転させ、CFIの生物活性を回復させ得る最も強力な抗体であった。マウスアイソタイプ対照抗体IgG2bもまたCFIの生物活性を増強することができ、顕著なバックグラウンドを生じ、真の特異的な抗BAMの効果を識別することを困難とする。このことはマウスIgG2bである4G8にとっては問題である。この効果はmIgG1ではあまり明確でないが、このアイソタイプはいくらかのバックグラウンドを生じることがある。しかしながら、mIgG1の効果はそれほど頻繁には見られず、mIgG2bに関して見られたものよりもずっと小規模でしか見られなかった。BAMは、IgGを含め、血中の複数の分子と結合することが報告されている(Huang et al., 1993)。この問題のため、真の阻害活性を確認するために、抗BAM抗体の複数のクローンを、異なるアッセイ条件にて、単回用量応答または8用量応答で試験した。選択した結果を図9および図10に示す。
BAMにより媒介されるCFI生物活性の阻害に及ぼす抗BAM抗体の効果を調べるために、BAMの異なるエピトープに標的化された数種の市販マウスモノクローナル抗体を選択した。まず、100μg/mL〜300μg/mLの単回用量抗体を、手順に記載されているように試験した。試験した抗体の中で、6E10は、BAMの活性を逆転させ、CFIの生物活性を回復させ得る最も強力な抗体であった。マウスアイソタイプ対照抗体IgG2bもまたCFIの生物活性を増強することができ、顕著なバックグラウンドを生じ、真の特異的な抗BAMの効果を識別することを困難とする。このことはマウスIgG2bである4G8にとっては問題である。この効果はmIgG1ではあまり明確でないが、このアイソタイプはいくらかのバックグラウンドを生じることがある。しかしながら、mIgG1の効果はそれほど頻繁には見られず、mIgG2bに関して見られたものよりもずっと小規模でしか見られなかった。BAMは、IgGを含め、血中の複数の分子と結合することが報告されている(Huang et al., 1993)。この問題のため、真の阻害活性を確認するために、抗BAM抗体の複数のクローンを、異なるアッセイ条件にて、単回用量応答または8用量応答で試験した。選択した結果を図9および図10に示す。
3.11. BAMとの非特異的抗体結合を最小化するための抗体補因子アッセイの至適化
3.10に示されるように、マウスアイソタイプ対照IgGs、特にmIgG2bは、ヒンジのレベルでのBAMとの潜在的相互作用によりCFI生物活性を増強するという点で、顕著なバックグラウンドを生じた。このような効果を軽減するために、Tween 20、Triton X−100、グアニジンおよびヒト血清アルブミンなどの複数の薬剤を補因子アッセイで試験し、それらがCFI生物活性またはBAM活性に干渉するかどうかを最初に調べた。Tween 20およびTriton X−100は、CFI生物活性に影響を及ぼさなかったが、BAMの阻害活性を完全に無効した。他方、グアニジンは、CFIの生物活性とBAMの阻害活性の両方を有意に低下させた。しかしながら、この効果は差異的であるとは思われなかった(図11)。考え合わせると、これまでに試験した薬剤の中にIgG BAM結合の問題を解決できるものは無かった。最後に、試薬の添加順序を逆にすることによって別の戦略を試験した。通常、最初にBAMおよび抗BAM抗体をインキュベートし、次に、この混合物にCFIを加え、最後にCFHおよびC3bを加えた。この試験では、最初にBAMおよびCFIをインキュベートし、次に、抗BAM抗体を加えて、それがCFI生物活性に及ぼすBAMの作用を逆転させることができるかどうかを調べた。それは可能であったが、ずっと低い活性であり、産生されたiC3bの量は5μg/mLより低かったであった。しかしながら、これがさらなる至適化の出発点となり得た。
3.10に示されるように、マウスアイソタイプ対照IgGs、特にmIgG2bは、ヒンジのレベルでのBAMとの潜在的相互作用によりCFI生物活性を増強するという点で、顕著なバックグラウンドを生じた。このような効果を軽減するために、Tween 20、Triton X−100、グアニジンおよびヒト血清アルブミンなどの複数の薬剤を補因子アッセイで試験し、それらがCFI生物活性またはBAM活性に干渉するかどうかを最初に調べた。Tween 20およびTriton X−100は、CFI生物活性に影響を及ぼさなかったが、BAMの阻害活性を完全に無効した。他方、グアニジンは、CFIの生物活性とBAMの阻害活性の両方を有意に低下させた。しかしながら、この効果は差異的であるとは思われなかった(図11)。考え合わせると、これまでに試験した薬剤の中にIgG BAM結合の問題を解決できるものは無かった。最後に、試薬の添加順序を逆にすることによって別の戦略を試験した。通常、最初にBAMおよび抗BAM抗体をインキュベートし、次に、この混合物にCFIを加え、最後にCFHおよびC3bを加えた。この試験では、最初にBAMおよびCFIをインキュベートし、次に、抗BAM抗体を加えて、それがCFI生物活性に及ぼすBAMの作用を逆転させることができるかどうかを調べた。それは可能であったが、ずっと低い活性であり、産生されたiC3bの量は5μg/mLより低かったであった。しかしながら、これがさらなる至適化の出発点となり得た。
3.12 硝子体液サンプルにおけるAMDとCFI生物活性との間の関係
追加試験を行い、1名のAMD患者および2名の非AMD対象からの硝子体液サンプルにおいて、CFI濃度とその分子の生物活性の両方を決定した。CFIの濃度は、AMD患者と2名の非AMD患者に関して、それぞれ364.65、1363.95および817.36ng/mlであった。補因子アッセイを用いたこの分子の生物活性の評価は、AMD患者の生物活性応答曲線により、2名のAMD患者に関しては右側へシフトしたことが明らかになった(それぞれ、AMDに関して約164nL EC50、2名の非AMD対象に関してそれぞれ約17nLおよび35nL EC50)。活性に関しては、これらの値は、AMDサンプルでは約6.1U CFI生物活性/硝子体液ml、非AMD対象では58.8および28.6U CFI生物活性/硝子体液mlに換算される。CFIの生物活性をサンプル中に存在するタンパク質の量に対して補正すると以下の値となった:AMDおよび2名の非AMD患者について、16.8、44.4および34.7U/μg(図12)。これらのデータは、AMDでは、非AMD対象に見られるものに比べてCFIの生物活性が低下することを示唆し、この機構がこの疾患の病因に関与する可能性があることを示す。
追加試験を行い、1名のAMD患者および2名の非AMD対象からの硝子体液サンプルにおいて、CFI濃度とその分子の生物活性の両方を決定した。CFIの濃度は、AMD患者と2名の非AMD患者に関して、それぞれ364.65、1363.95および817.36ng/mlであった。補因子アッセイを用いたこの分子の生物活性の評価は、AMD患者の生物活性応答曲線により、2名のAMD患者に関しては右側へシフトしたことが明らかになった(それぞれ、AMDに関して約164nL EC50、2名の非AMD対象に関してそれぞれ約17nLおよび35nL EC50)。活性に関しては、これらの値は、AMDサンプルでは約6.1U CFI生物活性/硝子体液ml、非AMD対象では58.8および28.6U CFI生物活性/硝子体液mlに換算される。CFIの生物活性をサンプル中に存在するタンパク質の量に対して補正すると以下の値となった:AMDおよび2名の非AMD患者について、16.8、44.4および34.7U/μg(図12)。これらのデータは、AMDでは、非AMD対象に見られるものに比べてCFIの生物活性が低下することを示唆し、この機構がこの疾患の病因に関与する可能性があることを示す。
3.15. CFI生物活性が量よりもむしろ生物学的関連がより大きいことをさらに確認する、得られた供給源によってCFIの生物活性が異なるかどうかのさらなる確認
精製されたCFIと組換え手段によって作製したCFIに相当する2つのサンプルで、CFI生物活性の測定を行った。
精製されたCFIと組換え手段によって作製したCFIに相当する2つのサンプルで、CFI生物活性の測定を行った。
両調製物が同等の濃度であったことを確認するために、本発明者らはCFI ELISAを用いて、免疫反応性の観点から、精製調製物と組換え調製物の濃度が等しいかどうかを決定した。精製材料と組換え材料の両方を複数の濃度について、2反復でCFI ELISAにかけたところ、これらの試験は3つの異なる時機に行った(図では実験#1〜#3と表示)。これらの試験の結果を図13に示す。図13は、組換え材料に対する生成材料のEC50比はおよそ1であること、この差は統計学的に有意ではないことを示す。これらのデータは、精製材料および組換え材料の量はほぼ同じであることを示す。
この概念のさらなる裏付けは、標品として精製材料および未知品として種々の濃度の組換え材料を使用する回収試験から得られる。この試験からの結果を下表にまとめる。
表のデータは、組換え材料を用いた場合、本発明者らがこのアッセイで、本発明者らが加えた標品として精製CFIを使用するものの100%を回収していることを示し、両調製物のタンパク質濃度が等しいという見解が強調される。
生物活性の測定は3回行い、3つの時機に実行した。両CFI保存溶液を、60mg/mL CFIで始めて1/3ログ連続希釈して8つのサブストックとした。CFI生物活性を低濃度に維持するために、10μg/mL CFHを使用した。補因子アッセイは、各反応に関して、5mLの2倍CFIサブストックを、5mLのCFHおよびC3b 2倍混合物と、終濃度80mg/mLで混合することにより設定した。この反応混合物を37℃で1時間インキュベートした後、反応におけるiC3b産生は、特殊なELISAにより評価した。
アッセイでは、1mUのCFI生物活性は、生産され得る最大濃度の半分のiC3bを生成するCFIの量(EC50)の逆数として定義される。サンプルのCFI生物活性を得るためには、以下の計算が適用される:1/(CFIのEC50(μg))。この式から、U/μgのCFIとして表されるCFI生物活性レベルが得られる。3つの実験からの推定EC50は、精製材料および組換え材料でそれぞれ32.6(9.3〜108.8)および60.8(21.6〜168.0)ng/mlであった。データに当てはめたモデルもEC50組換え/精製比を推定した。この値は1.8(1.5〜2.2)であり、この比は1とは有意に異なった(P<0.001)(図14)。
反応容量は10μLであることから、反応物中に存在するCFIの量は、推定EC50(ng/ml)の100分の1であった。この値から最大1/2量のiC3bを生成するCFIの量(ng)が得られる。これらの量を1000で割ることで、数値をμgに変換する。CFIの推定EC50(μg)を逆数にすることにより、両サンプルの推定生物活性が得られる:精製CFI生物活性=3,067.5(919.1〜10,752.7);組換えCFI生物活性=1,644.7(585.2〜4,629.6)U/μgのCFI。
これらのデータは、同じ濃度のタンパク質は取得可能であるが、そのタンパク質の生物活性は変わり得ることを証明する。全体的に見れば、これらの結果は、組換えCFI生物活性が血清から精製された材料のおよそ2分の1であるが、タンパク質濃度は等しいことを示す。
3.14. 抗BAM抗体はアルツハイマー患者においてCFI生物活性を調節することができることに証拠の提供
最後に、化合物Aで処置したアルツハイマー病患者由来のヒトサンプルのセットを、一回のアッセイでCFI生物活性に関して評価した。アッセイ条件を以下に示す。
・80μg/ml CFHおよびC3b
・0.01〜25nLの血漿(ハーフログ希釈)
・インキュベーション2時間
・ELISAによるiC3bの測定
・1名の患者からのサンプルを1回のアッセイで測定する。
・各アッセイは1回行う。
・アッセイ間の変動を制御するために、各アッセイで共通の血漿サンプルを測定した。
最後に、化合物Aで処置したアルツハイマー病患者由来のヒトサンプルのセットを、一回のアッセイでCFI生物活性に関して評価した。アッセイ条件を以下に示す。
・80μg/ml CFHおよびC3b
・0.01〜25nLの血漿(ハーフログ希釈)
・インキュベーション2時間
・ELISAによるiC3bの測定
・1名の患者からのサンプルを1回のアッセイで測定する。
・各アッセイは1回行う。
・アッセイ間の変動を制御するために、各アッセイで共通の血漿サンプルを測定した。
図15は、この評価の結果を示す。化合物Aは、695および1367の時点で単回用量(6mg/kg)として静脈内投与した場合、この薬剤のそれぞれ2回目および3回目の投与後に10%および28%のCFI生物活性の全体的上昇を誘導した。このデータは、抗BAM処置がアルツハイマー病患者においてCFI生物活性を調節することを示唆する。
結論
本研究のパートIで、本発明者らは、ヒトおよびマウス血漿においてCFI生物活性を測定するための方法を確立した。パートIIで、本発明者らは、数種の抗BAM抗体が、CFI生物活性を元の生物活性に戻すことによりBAM活性を阻害し得ることを証明した。さらに、AMD患者および非AMD患者由来の種々のサンプルからのデータは、AMDでは、CFIの生物活性が低下し、この低下がAMD眼に見られる択一的補体カスケードの活性化の一因であり得るという見解に裏付けを与える。最後に、本発明者らは、抗BAM抗体は、アルツハイマー病などのβ−アミロイド関連疾患において血漿中のCFI生物活性を回復させることを証明した。
本研究のパートIで、本発明者らは、ヒトおよびマウス血漿においてCFI生物活性を測定するための方法を確立した。パートIIで、本発明者らは、数種の抗BAM抗体が、CFI生物活性を元の生物活性に戻すことによりBAM活性を阻害し得ることを証明した。さらに、AMD患者および非AMD患者由来の種々のサンプルからのデータは、AMDでは、CFIの生物活性が低下し、この低下がAMD眼に見られる択一的補体カスケードの活性化の一因であり得るという見解に裏付けを与える。最後に、本発明者らは、抗BAM抗体は、アルツハイマー病などのβ−アミロイド関連疾患において血漿中のCFI生物活性を回復させることを証明した。
略語リスト
参照文献
本明細書に引用される付加的タンパク質配列
CAA51135軽鎖アクセプターフレームワークV領域アミノ酸配列(配列番号7)
CAA51135軽鎖アクセプターフレームワークV領域アミノ酸配列(配列番号7)
ヒト化重鎖V領域変異体H2アミノ酸配列(配列番号8)
ヒト化軽鎖V領域変異体L1アミノ酸配列(配列番号9)
成熟H2重鎖アミノ酸配列(Fc変異型二重突然変異 太字)(配列番号10)
成熟軽鎖アミノ酸配列(配列番号11)
Claims (11)
- ヒト体液のCFI生物活性またはヒト体液中のCFIの生物活性を定量的に測定する方法であって、体液またはCFIのC3bからiC3bへの変換能を測定する工程を含んでなる、方法。
- ヒト体液のCFI生物活性またはヒト体液中のCFIの生物活性を定量的に測定する方法であって、
(a)ヒト体液を希釈剤で希釈する工程;
(b)前記希釈ヒト体液にCFHおよびC3bを加える工程;
(c)工程(b)で得られた溶液をインキュベートする工程;および
(d)生じたiC3bの量を測定する工程
を含んでなる、方法。 - ヒト体液が血漿であり、希釈剤がPBSである、請求項2に記載の方法。
- (a)血漿をPBS中に約200〜250倍で希釈した後、さらにPBS中に2倍連続希釈し;
(b)6μLのCFHおよびC3bを、各終濃度80μg/mLとなるように前記血漿に加え;かつ
(c)請求項1の工程(c)のインキュベーションを37℃で2時間行い;さらに
(d)ELISAを用いてiC3bの量を測定する、
請求項3に記載の方法。 - ヒト血漿のCFI生物活性がmU/容量で測定され、mUが50%のC3bをiC3bへ変換するのに必要な血漿容量nL(EC50)の逆数として定義される、請求項4に記載の方法。
- 血漿中のCFIの生物活性が、式」1/(EC50(nL)×[CFIμg/ml])×1000を用いて(EC50は請求項5で定義される通り)、CFIのμg量当たりの単位で導き出される、請求項3に記載の方法。
- 抗BAM抗体のバッチ間の効力を測定する方法であって、
(a)抗BAM抗体の第1バッチをBAMとともにインキュベートする工程;
(b)工程(a)で得られたBAMをCFIとともにインキュベートする工程;
(c)CFHおよびC3bを工程(b)の混合物に加える工程;
(d)生じたiC3bの量を測定する工程;
(e)生じたiC3bの量を用いて、第1バッチのCFI生物活性を決定する工程;
(f)抗BAM抗体の第2バッチに対してa)〜e)の工程を繰り返す工程;および
(g)抗BAM抗体バッチ間の効力を決定するために、抗BAM抗体の第1バッチと抗SAM抗体の第2バッチのCFI生物活性を比較する工程であって、第1バッチの決定に用いる抗BAM抗体およびBAMの量は、第2バッチの決定に用いる量とそれぞれ同じである、
を含んでなる、方法。 - ヒト患者の組織におけるアミロイド沈着を含む疾患を治療する方法であって、
a)請求項2に記載の方法によって患者の体液のCFI生物活性または体液中のCFIの生物活性を測定する工程;および
b)CFI生物活性を測定した後、所定量よりも低いCFI生物活性を有する患者に、その疾患を治療するのに有効な量の抗BAM抗体を提供する工程
を含んでなる、方法。 - 前記疾患が、アルツハイマー病、AMD、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成である、請求項8に記載の方法。
- 組織におけるアミロイド沈着を含む疾患を有するヒト対象の治療で使用するための抗BAM抗体であって、所定量より低いCFI生物活性を有するヒト対象に投与される、抗体。
- 前記疾患が、アルツハイマー病、AMD、緑内障、またはβ−アミロイド白内障形成である、請求項10に記載の抗体。
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