JP2016529241A - Ｆａｐｐ２阻害剤及びそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、干渉オリゴヌクレオチド（例えばsiRNAなど）、及び低分子化合物ベースの阻害剤を包含する、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)の阻害剤に基づいて、グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を低減し、Gb3の蓄積と関連する疾患、障害、又は状態を処置する方法及び組成物を提供する。本発明は、ファブリー病、及び、スフィンゴ脂質代謝に関連する他のスフィンゴ脂質症（例えばゴーシェ病など）を処置するのに特に有用である。

Description

本発明は、グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を有するか又はそれに感受性である細胞内のGb3の蓄積を低減するための方法および薬物に関する。
ファブリー病とは、グリコスフィンゴ脂質(GSL)によるリソソーム蓄積障害であって、グリコスフィンゴ脂質からの、末端のα-ガラクトシル残基の加水分解の一因となる酵素である、リソソームα-ガラクトシダーゼA(α-GAL)の、X染色体に関連する遺伝性欠損症から生じる、リソソーム蓄積障害である(Bradyら、N Engl J Med. 1967；276：1163-7)。α-GAL活性の欠損は、ファブリー病患者の細胞内で、主に、グロボトリアオシルセラミド(セラミドトリヘキソシド、CD77、Gb3としてもまた公知の)である、中性グリコスフィンゴ脂質の進行性の沈着を結果としてもたらす。中性グリコスフィンゴ脂質の蓄積は、発疹様の発症から脳卒中及び腎不全に至る多種多様な影響を結果として及ぼしうる。
この疾患の古典的形態の頻度は、男性において約1：40,000〜1：60,000であると推定されており、世界中の異なる民族集団内で報告されている。ファブリー病のための従来の治療は、ファブリー病患者において欠損する組換えα-ガラクトシダーゼA(α-GAL)を施す、酵素置換療法であった。新たな作用機構に基づく、新たな革新的薬物に対する医療上の必要は、依然として大きい。
WO 98/39352 WO 99/14226
Bradyら、N Engl J Med. 1967； 276：1163-7 Altschulら、Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3)：403-410, 1990 Altschulら、Methods in Enzymology, 266, 460-480(1996) Altschulら、"Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25：3389-3402, 1997 Baxevanisら、Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998 Misenerら(編)、Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999 Eng ら、Fabry disease：Baseline medical characteristics of a cohort of 1765 males and females in the Fabry registry, 2007, J. Inherit. Metab. Dis., 30：184-192 Pieroniら、Fabry's disease cardiomyopathy：Echocardiographic detection of endomyocardial glycosphingolipid compartmentalization, 2006, J. Am. Coll. Cardiol., 47：1663-1671 Politei及びCapizzano、Magnetic resonance image findings in 5 young patients with Fabry disease, 2006, Neurologist, 12：103-105 Periodic Table of the Elements、CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito： 1999 "March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Smith, M.B.及びMarch編, J., John Wiley & Sons, New York： 2001 S. M. Bergeら、J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19 www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000007.13?report=fasta&from=30054478&to=30171458 Sambrookら、1989, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press Meinkothら、1984, Anal. Biochem. 138, 267-284 http：//blast.wustl/edu/blast/README.html Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro(Lippincott、Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006 Remington：The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 Songら、Nature Medicine, 9：347-351(2003) McCafferyら、Nature, 418：38-39(2002) Lewisら、Nature Genetics, 32：107-108(2002) Xiaら、Nature Biotech., 20：1006-1010(2002) Martin S. Pure Appl. Chem, Vol. 75, No. 1, pp. 63-70、2003 Synthesis and characterization of Glycosides, Springer, chap. 2, O-Glycoside Formation, Brito-Arias, M. 2007, XII、351p., Hardcover(ISBN：978-0-387-26251-2)
本発明は、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)が、グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の合成を特異的に制御し、したがって、Gb3の蓄積と関連する疾患、障害、又は状態のための新規の標的であるという発見を包含する。ヒトFAPP2阻害剤を使用して、Gb3の蓄積を効果的に低減し、関連する疾患、障害、及び状態であって、ファブリー病、及びゴーシェ病など、スフィンゴ脂質代謝に関連する、他のスフィンゴ脂質症を含む、疾患、障害、及び状態のための新規の治療を提供することができる。
実施例の節で記載される通り、本出願の本発明者らは、GlcCerが、小胞輸送及び非小胞輸送により、それぞれゴルジ扁平婁及びトランスゴルジ網(TGN)における、トポロジー的に異なる2つのグリコシル化経路へと方向づけられていることを発見した。FAPP2は、非小胞経路を媒介し、GlcCerを、TGNへと送達する。驚くべきことに、FAPP2を枯渇させたところ、C12-BODIPY-Gb3の合成は選択的に阻害されたが、C12-BODIPY-GM3の合成は阻害されなかったことから、FAPP2は、Gb3の蓄積を特徴とする疾患、障害、又は状態のための新規の標的となる。実際、本発明者らは、FAPP2を阻害する(例えば、siRNAにより)ことにより、ファブリー病の細胞モデルにおけるGb3の蓄積が低下することを裏付けた。本発明者らは、in vitro GlcCer移行アッセイをさらに開発して、FAPP2阻害剤、特に、低分子化合物によるFAPP2阻害剤を同定し、例えば、フロリジン、及びFAPP2によるGlcCer移行活性を阻害しうる他の化合物を、in vitroアッセイにおいて同定することに成功した。したがって、本発明は、新たな作用機構に基づく、新規の革新的な薬物であって、ファブリー病、及びGb3の蓄積又はスフィンゴ脂質代謝に関連する、他の疾患、障害、又は状態の、より安全で、より有効で、且つ廉価な処置のための薬物を提供する。
一態様では、本発明は、グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を有するか又はそれに感受性である細胞へと、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)を阻害するアリールグルコシド化合物(すなわち、FAPP2阻害剤)などの化合物を投与することにより、細胞内のGb3の蓄積を低減する方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、グリコシド連結を含むアリールグルコシド化合物である。一部の実施形態では、アリールグルコシド化合物は、C-アリールグルコシド化合物である。一部の実施形態では、アリールグルコシド化合物は、O-アリールグルコシド化合物である。アリールグルコシド化合物は、場合によって、置換ビフェニル基又は置換アリール-ヘテロアリール基(例えば、フェニル-チオフェニル)などの、置換ビアリール基を含みうる。場合によって、アリールグルコシド化合物は、二環式の芳香族炭素環及び/又は二環式のヘテロ芳香環を含む、多環式の芳香族炭素環又は多環式のヘテロ芳香環を含みうる。一部の実施形態では、化合物は、グリコシド連結を含まない。
一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)である。一部の実施形態では、細胞は、培養された細胞である。一部の実施形態では、細胞は、生物の細胞である。
別の態様では、本発明は、処置を必要とする対象へと、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)を阻害するアリールグルコシド化合物を投与することにより、グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積と関連する疾患、障害、又は状態を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、疾患、障害、又は状態は、ファブリー病である。
一部の実施形態では、適切なアリールグルコシド化合物は、式I：
、又は薬学的に許容されるその塩
[式中：
Qは、単糖又は修飾単糖であり；
A1は、フェニル、又は窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される、1〜3個のヘテロ原子を有する、5〜6員のヘテロアリール環であり；
A2は、フェニル、又は窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される、1〜3個のヘテロ原子を有する、5〜6員のヘテロアリール環であり；
L1は、共有結合、又はC1〜4の二価で直鎖状若しくは分枝状の炭化水素鎖であり、鎖の1つ若しくは2つのメチレン単位は、-N(R)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)S(O)2-、-S(O)2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-S(O)-、又は-S(O)2-により、任意選択で独立に置きかえられており；
L2は、共有結合又は-O-であり；
各R1は独立に、ハロゲン、-CN、-R；-OR；-SR；-N(R)2；-N(R)C(O)R；-C(O)N(R)2；-N(R)C(O)N(R)2；-N(R)C(O)OR；-OC(O)N(R)2；-N(R)S(O)2R；-S(O)2N(R)2；-OC(O)OR；-C(O)R；-OC(O)R；-C(O)OR；-S(O)R；-S(O)2R；又はCyであり；
各R2は独立に、ハロゲン、-CN、-R、-OR、-SR、-N(R)2、-N(R)C(O)R、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-OC(O)N(R)2、-N(R)SO2R、-S(O)2N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-S(O)R、又は-S(O)2Rであり；
Cyは、p個のR3で置換された環であり、前記環は、3〜8員の、飽和であるか又は部分的に不飽和である、単環式の炭素環；フェニル；8〜10員の、二環式の芳香族炭素環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜2個のヘテロ原子を有する、4〜8員の、飽和であるか又は部分的に不飽和である、単環式の複素環式環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する、5〜6員の、単環式のヘテロ芳香環；並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜5個のヘテロ原子を有する、8〜10員の、二環式のヘテロ芳香環からなる群から選択され；
各Rは独立に、水素、重水素、又はC1〜6脂肪族；3〜8員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である、単環式の炭素環；フェニル；8〜10員の、二環式の芳香族炭素環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜2個のヘテロ原子を有する、4〜8員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である、単環式の複素環式環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する、5〜6員の、単環式のヘテロ芳香環；並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜5個のヘテロ原子を有する、8〜10員の、二環式のヘテロ芳香環から選択される、任意選択で置換された基であり；
各R3は独立に、ハロゲン、-R、-CN、-OR、-SR、-N(R)2、-N(R)C(O)R、-C(O)N(R)2、-C(O)N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-OC(O)N(R)2、-N(R)S(O)2R、-S(O)2N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-S(O)R、-S(O)2R、-B(OR)2、又はフェニル、並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員のヘテロアリールから選択される、任意選択で置換された環であり；
pは、1〜5であり；
xは、0〜5であり；
yは、0〜4である]
の構造を有する。
一部の実施形態では、適切なアリールグルコシド化合物は、式II-a又はII-b：
、又は薬学的に許容されるこれらの塩
[式中、A1、R1、R2、x、及びyの各々は、上記で規定された通りである]の構造を有する。
一部の実施形態では、適切なアリールグルコシド化合物は、
、及び薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される構造を有する。
一部の実施形態では、適切なアリールグルコシド化合物は、ダパグリフロジンではない。
一部の実施形態では、適切なアリールグルコシド化合物は、
の構造を有する。
一部の実施形態では、適切なアリールグルコシド化合物は、
、及び薬学的に許容されるこれらの塩
[式中、各R4は、同じ場合もあり、又は異なる場合もあり、H及び-L2-Qからなる群から選択され、Qは、単糖又は修飾単糖であり、L2は、共有結合又は-O-であり、但し、アリールグルコシド化合物は、少なくとも1つのグリコシド連結を含む]
からなる群から選択される構造を有する。
一部の実施形態では、アリールグルコシド化合物は、1つのグリコシド連結を含む。
一部の実施形態では、阻害剤は、
、及び薬学的に許容されるその塩
からなる群から選択される構造を有する。
さらに別の態様では、本発明は、細胞内のグロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を低減する方法であって、Gb3の蓄積を有するか又はそれに感受性である細胞へと、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)の発現を阻害する干渉オリゴヌクレオチドを投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、siRNA又はshRNAである。
一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)である。一部の実施形態では、細胞は、培養された細胞である。一部の実施形態では、細胞は、生物の細胞である。
なお別の態様では、本発明は、グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積と関連する疾患、障害、又は状態を処置する方法であって、処置を必要とする対象へと、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)の発現を阻害する干渉オリゴヌクレオチドを投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、siRNA又はshRNAである。一部の実施形態では、疾患、障害、又は状態は、ファブリー病である。
一部の実施形態では、適切な干渉オリゴヌクレオチドは、ヒトFAPP2遺伝子又はFAPP2のメッセンジャーRNA(mRNA)の連続配列の逆相補体と、少なくとも70%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%)同一な配列を有する。一部の実施形態では、適切な干渉オリゴヌクレオチドは、ヒトFAPP2遺伝子又はFAPP2のメッセンジャーRNA(mRNA)の連続配列の逆相補体と同一な配列を有する。一部の実施形態では、FAPP2のmRNAは、FAPP2 mRNAアイソフォーム1、FAPP2 mRNAアイソフォーム2、又はFAPP2 mRNAアイソフォーム3を含む。
一部の実施形態では、適切な干渉オリゴヌクレオチドは、50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、又は15ヌクレオチド以下の長さである。一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、16〜22(例えば、16〜21、16〜20、16〜19、16〜18、17〜22、17〜21、17〜20、17〜19、18〜22、18〜21、18〜21、又は18〜20)ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、
[FAPP2.1] GAGAUAGACUGCAGCAUAU[dT][dT]；配列番号3
[FAPP2.2] GAAUUGAUGUGGGAACUUU[dT][dT]；配列番号4
[FAPP2.3] GAAAUCAACCUGUAAUACU[dT][dT]；配列番号5
[FAPP2.4] CCUAAGAAAUCCAACAGAA[dT][dT]；配列番号6
[sh FAPP2.1] CTCTTGTGGCTGAAGAGAGGTCTCAAATT；配列番号7
[shFAPP2.2] TTGGCAGCCTCGATGGTTCCTTCTCTGTG；配列番号8
[shFAPP2.3]-CAGTCTGGATCAGACTCAAGTTGCTCTCC配列番号9；及び/又は
[shFAPP2.4] TCCTGTTAAGATGGATCTTGTTGGAAATA配列番号10
から選択される配列を有するsiRNA又はshRNAである。
一部の実施形態では、適切な干渉オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの化学修飾を含有する。一部の実施形態では、少なくとも1つの化学修飾は、コンフォメーション上拘束されているヌクレオチド類似体(例えば、ロックト核酸)、2'-O-メチル修飾、ホスホロチオエート連結、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
本発明はまた、グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を有するか若しくはそれに感受性である細胞内のGb3の蓄積を低減する方法における使用のため、又はグロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を特徴とする疾患、障害、若しくは状態を防止及び/若しくは処置するための使用のための、請求項1から27のいずれか一項に記載のホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
本発明はまた、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)阻害剤を同定する方法であって、
- アクセプター小胞、蛍光標識部分を含有するドナー小胞、失活剤、及び組換えFAPP2タンパク質を混合して、混合物を形成する工程と、
- 混合物の発光強度を、薬剤の存在下又は非存在下で測定する工程であって、薬剤の存在下で発光強度が低下する場合、前記薬剤が、FAPP2阻害剤であると同定される工程と
を含む方法も提供する。
一部の実施形態では、方法は、
- 1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)を含有するアクセプター小胞、TopFLUORで標識されたGlcCer(好ましくは、1モル%)を含有するドナー小胞及びDilC18(好ましくは、3モル%)並びに組換えFAPP2タンパク質(好ましくは、0.5uM)と混合して、混合物を形成する工程と、
- 混合物の発光強度を、薬剤の存在下又は非存在下にある520nm(485nmの励起)で測定する工程であって、薬剤の存在下で発光強度が低下する場合、前記薬剤が、FAPP2阻害剤であると同定される工程と
を含む。
方法の一部の実施形態では、組換えFAPP2タンパク質は、FAPP2-GLTP-C212又は全長FAPP2(FL)である。一部の実施形態では、アクセプター小胞を、緩衝液中に懸濁させた1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)の超音波処理により形成する。
FAPP2移行活性は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を使用して査定した。FRETアッセイは、アクセプター小胞(緩衝液中に懸濁させた1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)の超音波処理により形成された)と、TopFLUORで標識されたGlcCer(1モル%)を含有するドナー小胞及び失活剤として使用されるDilC18(3モル%)並びに組換えFAPP2タンパク質(0.5uM)の混合を伴う。520nm(485nmの励起)における発光強度の回復は、グルコシルセラミドの、失活させたドナー小胞から、失活させていないアクセプター小胞への、FAPP2により媒介される移行時に生じる。アッセイは、FAPP2-GLTP-C212又は全長FAPP2(FL)を使用して実施した。ハイスループットの阻害剤スクリーンを実行するために、移行活性アッセイを、マイクロプレートフォーマット(384ウェルプレート)へと適応させ、Synergy Neo HTS Multi-Mode Microplate Readerを使用して読み取った。まず、30ulのアクセプターである小型の単層小胞、FAPP2輸送タンパク質、及び薬物を緩衝液中に含有する混合物を、各ウェルへと三連で添加し、1分間にわたり読み取って、蛍光ベースラインを計算した。次いで、30ulのドナー小胞を、各ウェルへと添加し、15又は30分間にわたり読み取った。蛍光発光の増大はもっぱら、FAPP2による輸送の存在下で生じるので、各化合物の阻害率は、蛍光発光を低下させるその能力により査定する。
とりわけ、本発明はまた、1又は複数の、本明細書で記載される低分子又は干渉オリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物又はキットも提供する。
本出願で使用される「約」という用語と、「およそ」という用語とは、同等物として使用される。約/およそを伴うか又は伴わずに本出願で使用される任意の数値は、当業者により理解される、任意の通常の変動に及ぶことが意図される。
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、後続の詳細な説明において明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明の実施形態を指し示すが、例示だけを目的として与えられるものであり、限定を目的として与えられるものではないことを理解されたい。当業者には、本発明の範囲内の多様な変化及び改変は、詳細な説明から明らかとなろう。
図面は、例示だけを目的とするものであり、限定を目的とするものではない。
［図１ａ］脊椎動物におけるGSL合成経路についての例示的な概略図を描示する図である。略号は、以下：SM：スフィンゴミエリン、GCS：GlcCerシンターゼ、LCS：LacCerシンターゼ、Gb3S：Gb3シンターゼ、GM3S：GM3シンターゼ、LC3S：LC3シンターゼ、GA2S：GA2シンターゼの通りである。 ［図１ｂ］異なるマウス組織内の、FAPP2の例示的な発現を描示する図である。 ［図１ｃ］野生型(FAPP2+/+)胚性幹細胞、並びに組換え(FAPP2geo/+)胚性幹細胞及び(FAPP2geo/geo)胚性幹細胞についての例示的なサザンブロット解析を描示する図である。 ［図１ｄ］FAPP2+/+精巣抽出物中及びFAPP2+/+腎臓抽出物中並びにFAPP2-/-精巣抽出物中及びFAPP2-/-腎臓抽出物中の例示的なFAPP2レベルを描示する図である。 ［図１ｅ］FAPP2+/+腎臓皮質切片及びFAPP2-/-腎臓皮質切片の、コレラ毒素B断片(ChTxB)染色、志賀毒素B断片(ShTxB)染色、及び抗GM3染色についての例示的な結果を描示する図である。例示的な写真は、少なくとも5匹のFAPP2+/+マウス及び少なくとも5匹のFAPP2-/-マウスに由来する。バー：50μmである。 ［図１ｆ］FAPP2+/+腎臓皮質切片及びFAPP2-/-腎臓皮質切片の、コレラ毒素B断片(ChTxB)染色、志賀毒素B断片(ShTxB)染色、及び抗GM3染色についての例示的な結果を描示する図である。例示的な写真は、少なくとも5匹のFAPP2+/+マウス及び少なくとも5匹のFAPP2-/-マウスに由来する。バー：50μmである。 ［図２ａ］3H-スフィンゴシンで標識されたHeLa細胞についての、例示的なHPTLCプロファイルを描示する図である。矢印：FAPP2 KDノックダウンにより誘導される変化であり、数：全SL(スフィンゴ脂質)に対する、各GSL種の百分率である。 ［図２ｂ］C12-BODIPY-GlcCerで標識されたHeLa細胞についての、例示的なHPTLCプロファイルを描示する図である。矢印：FAPP2-KDにより低減されるGSLであり、数：全GSLに対する、各GSL種の百分率であり、#：割り当てられていないピークである。 ［図２ｃ］FAPP2及びGSL合成酵素(GCS：GlcCerシンターゼ、LCS：LacCerシンターゼ、GM3S：GM3シンターゼ、Gb3S：Gb3シンターゼ)のサイレンシングの、異なるGSL種(全GSLに対する百分率として表された)に対する例示的な結果を描示する図であり、数：全SLに対する、全GSLの百分率である。結果は、少なくとも3回の独立の実験の平均±SDである。 ［図３ａ］ブレフェルジンA(BFA：Brefeldin A)(5μg/mL)の、Gb3合成及びGM3合成に対する例示的な効果を描示する図である。 ［図３ｂ］免疫蛍光による、HA-Gb3S及びHA-GM3Sの例示的な分布を描示する図である。上パネル：非処置細胞であり、下パネル：ノコダゾール処置細胞(33μMで3時間にわたる)である。挿入図：枠囲いされた領域の拡大図である。HA-Gb3S及びHA-GM3Sの、TGN46との共局在化は、それぞれ、50%及び14%である。データは、1つの条件当たりの細胞少なくとも30個を表す。バー：10μmである。 ［図３ｃ］immunoEMによるHA-Gb3S及びHA-GM3Sの例示的な分布を描示する図である。矢印：トランスゴルジ網における、クラスリンでコーティングされたプロファイルである。データは、少なくとも30枚の層板を表す。バー：100nmである。 ［図３ｄ］ゴルジ内トラフィッキング遮断の、レポータータンパク質[水泡性口内炎ウイルス(VSVG)の糖タンパク質]の輸送に対する例示的な効果(1時点当たりの細胞少なくとも100個についての3回の独立の実験における平均±SD)を描示する図である。3回の独立の実験の平均±SDである。DIC：ジクマロール(dicoumarol)(200μM)である。PLA2(PLA2-KD)のノックダウン又はBet3(BET-3 KD)のノックダウンである。 ［図３ｅ］ゴルジ内トラフィッキング遮断の、GM3及びGb3の合成(3時間にわたる、3H-スフィンゴシンパルス)に対する例示的な効果を描示する図である。3回の独立の実験の平均±SDである。DIC：ジクマロール(200μM)、PLA2-KD：PLA2のノックダウン、BET-3 KD：Bet3のノックダウンである。 ［図４ａ］ノコダゾール処置細胞(3時間、33μM)内の、FAPP2-wt及びFAPP2 W407Aの、例示的なゴルジ内分布を描示する図である。右パネル：枠囲いされた領域の拡大図であり、シスゴルジ-TGN軸に沿った、FAPP2の最大蛍光強度の分布(白矢印)である。 ［図４ｂ］FAPP2-wt及びFAPP2-W407Aの最大標識分布についての例示的な定量化を描示する図である。層板の中央(0、黒破線)は、条件1つ当たり少なくとも50枚の層板内の、GM130の蛍光強度のピークと、TGN46の蛍光強度のピークとから等距離の平面としてとる。バー：10μmである。 ［図４ｃ］Meb4及びGlcCerを欠損させたGM95細胞内の、FAPP2-wt及びFAPP2-W407Aのゴルジ内分布を描示する図である。TGNと関連する標識の百分率が指し示される。条件1つ当たり少なくとも30枚の層板の平均±SEMである。矢印：ゴルジ扁平婁染色；楔形：TGN染色、矢印：クラスリンでコーティングされたプロファイルである。バー：100nmである。 ［図４ｄ］GlcCerのゴルジ内非小胞(赤矢印)輸送及び小胞(青矢印)輸送についての例示的な概略図を描示する図である。挿入図：FAPP2により媒介されるGlcCer移行の方向づけの機構(シアンプロファイル：TGN、赤プロファイル：ゴルジ扁平婁)である。 FAPP2を、ファブリー病(FD)患者に由来する線維芽細胞内の標的として検証する例示的な結果：FAPP2 KDは、FD線維芽細胞内の、Gb3の蓄積を低下させるという結果を例示する図である。6例の異なるFD患者に由来する線維芽細胞(実施例1で記載される突然変異)を、非処置のまま放置するか、又はFAPP2に特異的なsiRNAで、72時間にわたり処置し[Table 2(表2)]、次いで、免疫蛍光のために処理し、Cy3-志賀毒素断片bでGb3について染色し(赤色)、リソソームマーカー(LAMP1、緑色)についても染色した。モック(トランスフェクション媒体で処置した)、FAPP2-KD(FAPP2に特異的なsiRNAで処置した)、LAMP1(後期エンドソーム/リソソームマーカー)、志賀毒素(Gb3マーカー)である。 ［図６ａ］siRNA-GLAsiRNA GLA#1 GCUAUCAUGGCUGCUCCUU[dT][dT]配列番号90siRNA GLA#2 GCAAUCACUGGCGAAAUUU[dT][dT]配列番号91siRNA GLA#3 CAGCUUAGACAGGGAGACA[dT][dT]配列番号92で処置され、Operettaで解析されたHeLa細胞についての例示的な結果を例示する図である。HeLa細胞に、懸濁液中で、siRNA-GLAをトランスフェクトし、96ウェルプレートに播種した。72時間後に、細胞を、4%のPFA中で固定し、サポニンを含有するブロッキング緩衝液で透過処理し、蛍光組換え志賀毒素B(Gb3に特異的に結合する)、Lamp1に対する抗体、及びHoechst 33342で染色した。画像は、Operettaを使用して捕捉した。二重KDを得るため、HeLa細胞は、FAPP2に対するsiRNAと、GLAに対するsiRNAとのミックスと共に、72時間にわたりインキュベートした。次いで、既に記載された同じプロトコールを使用して、細胞を免疫蛍光のために処理した。 ［図６ｂ］図6aで得られたGb3染色の強度についての例示的な定量的解析を描示する図である。 図7は、フロリジン阻害の、FAPP2によるGlcCer移行活性に対する例示的な効果を描示する図である。RFU(相対蛍光単位)、FAPP2-FL-SUMO(低分子ユビキチン関連修飾剤でタグ付けされた、組換えFAPP2全長タンパク質)である。図7Aは、FAPP2が、GlcCerを、ドナーリポソームから、アクセプターリポソームへと、濃度依存的な形で移行することを裏付ける、例示的な結果を描示する図である。 図7は、フロリジン阻害の、FAPP2によるGlcCer移行活性に対する例示的な効果を描示する図である。RFU(相対蛍光単位)、FAPP2-FL-SUMO(低分子ユビキチン関連修飾剤でタグ付けされた、組換えFAPP2全長タンパク質)である。図7Bは、GlcCer(C8-GlCer)は、FAPP2によるGlcCer移行活性と競合するが、セラミド(C6-セラミド)は競合しないことを例示する、例示的な結果を描示する図である。C8-GlcCer及びC6-Cerのいずれの最終濃度も、10uMであった。 図7は、フロリジン阻害の、FAPP2によるGlcCer移行活性に対する例示的な効果を描示する図である。RFU(相対蛍光単位)、FAPP2-FL-SUMO(低分子ユビキチン関連修飾剤でタグ付けされた、組換えFAPP2全長タンパク質)である。図7Cは、フロリジンが、FAPP2によるGlcCerの移行を阻害することを例示する、例示的な結果を描示する図である。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、200uM、500uM、1mM)で実行した。 図7は、フロリジン阻害の、FAPP2によるGlcCer移行活性に対する例示的な効果を描示する図である。RFU(相対蛍光単位)、FAPP2-FL-SUMO(低分子ユビキチン関連修飾剤でタグ付けされた、組換えFAPP2全長タンパク質)である。図7Dは、ダパグリフロジンが、FAPP2によるGlcCer移行活性に対して阻害活性を及ぼさないことを例示する、例示的な結果を描示する図である。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、200uM、500uM、1mM)で実行した。ダパグリフロジンの投与は、GlcCerの移行を阻害しなかったが、投与により、蛍光の増大が誘導された。 ［図８ａ］Creにより媒介されるエクソン4の切出しの後において得られる、野生型FAPP2対立遺伝子(+)、ターゲティングベクター、ターゲティングされる対立遺伝子(geo)、Flpトランスジェニックマウスと交配することにより得られる、flox化対立遺伝子(flox)、及びヌルFAPP2対立遺伝子(-)についての例示的な制限マップ(実施例1を参照されたい)を描示する図である。 ［図８ｂ］8〜10週齢のFAPP2geo/geoマウスに由来する、表示の組織内の、X-Gal染色及びヘマトキシリン-エオシン(HE)染色により評価される、FAPP2の例示的な分布を描示する図である。バー：100μmである。 ［図９ａ］wtマウス及びFAPP2-/-マウスから単離された腎尿細管細胞内のFAPP2及びGM130の発現についての例示的な免疫組織化学を描示する図である。細胞は、抗GM130抗体(緑色)及び抗FAPP2抗体(赤色)で染色される。腎尿細管細胞は、35において記載されている手順に従い単離した。 ［図９ｂ］腎細胞に由来する溶解物についての、例示的なFAPP2ウェスタンブロット解析を描示する図である。 ［図９ｃ］蛍光標識で二重染色された、単離腎尿細管細胞についての例示的なFACS解析を描示する図である。ChTxB[コレラ毒素断片B]、GM1マーカー(緑色)、及びShTxB[志賀毒素断片B]、Gb3マーカー(赤色)(上パネル)である。点線は、バックグラウンド染色についての閾値を指し示す。下パネルは、ChTxB陽性細胞又はShTxB陽性細胞の頻度を示す。矢印は、ShTxB陽性細胞の頻度の選択的低減を指し示す。 ［図９ｄ］図9cにおいて記載されている通り、二重染色された、単離腎尿細管細胞についての、例示的な免疫蛍光を描示する図である。バー：10μmである。 siRNA処置の後における、タンパク質の下方調節についての例示的な結果を描示する図である。タンパク質である、FAPP2、Bet3、及びcPLA2は、表示の、モック処置又はsiRNA処置された(KD)細胞siRNA FAPP2[Table 2(表2)]及びsiRNA Bet3[Table 3(表3)](HeLa、MDCK、HK2、HepG2、SK-N-MC)内で、特異的抗体を使用して検出した。アクチンを、内部対照タンパク質とした。異なるsiRNAの配列については、Table 3(表3)(実施例2を参照されたい)において記載する。全ての実験において、干渉は、異なるsiRNA配列[Table 2(表2)及びTable 3(表3)で報告される]のプールを使用して実施した。 図11は、FAPP2が、Gb3の合成を選択的に制御することを示す、例示的な結果を描示する図である。 ［図１１ａ］図11aは、3H-スフィンゴシンで2時間にわたりパルスされ、0、2、6、及び24時間にわたりチェイスされた、モック処置HeLa細胞又はFAPP2-KD HeLa細胞についての、例示的なパルスチェイスHPTLC解析を描示する図である。結果は、少なくとも3回の独立の実験の平均±SEMである。 ［図１１ｂ］図11bは、異なるGSL合成酵素又はFAPP2をサイレンシングすることにより誘導される、GSLレベルに対する効果を、GSLの合成に関与する遺伝子[Table 3(表3)及びTable 4(表4)を参照されたい]の、siRNAにより媒介されるサイレンシングについての、RT-qPCRベースの評価と比較する例示的な結果を描示する図である。GCS：GlcCerシンターゼ、LCS：LacCerシンターゼ、GM3S：GM3シンターゼ、Gb3S：Gb3シンターゼである。 ［図１１ｃ］図11cは、表示の遺伝子の、siRNAにより媒介されるサイレンシングの、C12-BODIPY-GlcCerにより標識された細胞内で3時間にわたり評価されるGSLの合成に対する効果を比較する例示的な結果を描示する図である。数字は、全GSLと比較した、各所与のGSLへと取り込まれたC12-BODIPY-GlcCerの百分率を指し示す。 ［図１１ｄ］図11dは、Gb3及びGM1の両方を、それぞれ、ShTxB及びChTxBにより検出可能なレベルで発現させるHeLa細胞集団を、FACS(モック)により選択し、次いで、FAPP2 siRNAによる処置にかけた(FAPP2-KD)例示的な結果を描示する図である。青ボックスにより、バックグラウンド染色に対応するShTxB及びChTxB染色の値の範囲を定める。数字は、二重陽性細胞の百分率を指し示す。FAPP-KDにより誘導される、この百分率の減少は、統計学的に有意であり(p<0.001)、GM1だけを発現させる細胞の百分率の増大(16%から28%への)と並行する。 対照細胞内及びFAPP2 KD細胞内のGSL代謝フラックスについての、例示的な数学的モデル化を描示する図である。図11Aに示される実験データについての数学的モデル化において検討される反応及び反応速度である。k=反応速度(k1〜k5)である。 例示的な異なるシミュレーション条件であって、反応速度が、全て同等である(帰無仮説、N)ように要求されるか、又は反応速度を、モック処置細胞(青色)と、FAPP2 KD細胞(赤色)との間で、1回に1つずつ(赤色で枠囲いされたセル)変化させる条件下で最適化された、反応速度及び費用関数(CF)を描示する図である。最低値のCFをもたらすシミュレーションから抽出された反応速度を、ボールド体で表示し、図12Cに示される例示的な代謝モデルに使用した。N(帰無仮説)である。初期シミュレーションでは、全ての反応速度は、モック処置細胞と、FAPP2-KD細胞とについて同じ値をとるように要求された。 点線は、実験データを指し、実線は、数学的モデル化から得られた最良の当てはめを表す、例示的な代謝モデル(実施例1を参照されたい)を描示する図である。 図13は、BFAの、3XHA-Gb3S分布及び3XHA-GM3S分布に対する例示的な効果を描示する図である。 ［図１３ａ］図13aは、定常状態(CTRL)及びBFA処置(5μg/mlで30分間にわたる)時(BFA)における、GM3S及びGb3Sの局在化を示す免疫蛍光についての例示的な結果を描示する図である。 ［図１３ｂ］図13bは、BFA処置の後における、Gb3S、TGN46、及びそれらの共局在化(重合せ図)を示す免疫蛍光についての例示的な結果を描示する図である。バー：10μmである。 ［図１４ａ］異なる細胞系(HeLa、MDCK、HepG2、HK2)内の、FAPP2-KDの、GSLの合成に対する効果を例示する、例示的な結果を描示する図である。また、wtマウス及びFAPP2-/-マウスに由来する、マウス胚線維芽細胞(MEF)内で合成されたGSLも示される(最後の棒グラフ)。GSLの合成は、14C-ガラクトース(HeLa、MDCK、HepG2)又は3H-スフィンゴシン(HK2、MEF)による標識付け(6時間)を介して評価した。アステリスクは、対照細胞又は非処置細胞との統計学的有意差を指し示す。*p<0,05；**p<0,01；***p<0.001である。 ［図１４ｂ］表示の細胞系(HeLa細胞、MDCK細胞、HepG2細胞、HK2細胞)内の、BFAの、GSLの合成に対する効果を例示する、例示的な結果を描示する図である。GSLの合成は、3H-スフィンゴシン又は14C-ガラクトース(MDCK)による標識付け(3時間)を介して評価した。アステリスクは、対照細胞又は非処置細胞との統計学的有意差を指し示す。*p<0,05；**p<0,01；***p<0.001である。 ［図１５ａ］特異的siRNA処置後における、B4GALT5 KD及びB4GALT6 KDの効率であって、RT-qPCRにより推定される効率を示す例示的なグラフを描示する図である。 ［図１５ｂ］B4GALT5 KD及びB4GALT6 KDの、3H-スフィンゴシンで24時間にわたり標識されたHeLa細胞内の、スフィンゴ脂質レベルに対する効果を例示する、例示的な結果を描示する図である。 ［図１５ｃ］免疫蛍光により評価されたB4GALT5の、TGNマーカー(TGN46)と比較した局在化を例示する、例示的な結果を描示する図である。 ［図１５ｄ］IEMにより評価された、B4GALT5の局在化を例示する、例示的な結果を描示する図である。黒矢印は、ゴルジ体内に局在化したB4GALT5を指し示し、楔形は、TGN内に局在化したB4GALT5を指し示し、黒矢印は、クラスリンでコーティングされた円形プロファイルであって、TGNを指し示す円形プロファイルを指す。バー(c)=10μmであり、バー(d)=100nmである。 ［図１６ａ］TGNにおけるGM3Sの異所性発現が、GM3の合成を、FAPP2の枯渇に対して感受性とすることを例示する、例示的な結果を描示する図である。異なる量のタンパク質を発現させる、細胞内の、3XHA-GM3Sの局在化である。低レベル(下パネル)又は高レベル(上パネル)の3XHA-GM3Sを発現させる細胞に由来するゴルジ層板についてのIEMである。矢印は、TGNに局在化した染色を指す。 ［図１６ｂ］発現レベルとの関連における、3XHA-GM3SのTGN局在化についての例示的な定量的解析を描示する図である。 ［図１６ｃ］3H-スフィンゴシンによる3時間にわたるパルスを介して評価された、GM3Sを過剰発現させるHeLa細胞(HeLa-GM3S)内のスフィンゴ脂質の合成を、親HeLa細胞と比較して例示する、例示的な結果を描示する図である。 ［図１６ｄ］BFA処置(5μg/mL)の、GM3Sを過剰発現させるHeLa細胞(HeLa-GM3S)に対する効果を、親HeLa細胞と比較して例示する、例示的な結果を描示する図である。値は、非処置親HeLa細胞と考えられる対照(CTRL)に対するパーセントとして表す。 ［図１６ｅ］FAPP2-KDの、GM3Sを過剰発現させるHeLa細胞(HeLa-GM3S)内の、GM3の合成(3時間にわたる3H-スフィンゴシンパルス)に対する効果を、親HeLa細胞と比較して例示する、例示的な結果を描示する図である。値は、モック処置親HeLa細胞と考えられる対照(CTRL)に対するパーセントとして表す。 ［図１７ａ］FAPP2-PHドメインのE50A突然変異体は、ゴルジ複合体上のARF1を安定化させないことを例示する、例示的な結果を描示する図である。GFPでタグ付けされた、diFAPP2-PH wt又はARF1結合性部位内の突然変異体である、diFAPP2-PH E50A19をコードするプラスミドをトランスフェクトされたCos7細胞を、抗ARF1抗体による間接的免疫蛍光のために処理した。アステリスクは、トランスフェクトされた細胞を指し示す。バー：10μmである。 ［図１７ｂ］ゴルジ複合体上のARF1の安定化についての例示的な定量化であって、ゴルジ会合ARF1蛍光の、全ARF1蛍光に対する百分率として査定される定量化を描示する図である。 ［図１７ｃ］GFPキメラとして発現させた、wt形態(diPH wt、ARF及びPtdIns4Pの両方に結合することが可能である)、又はE50A突然変異体形態(diPH-E50A：ARFに結合することが可能でない；上記の図17A及び19を参照されたい)、又はR18L形態(diPHR18L：PtdIns4Pに結合することが可能でない14)の、FAPP2のタンデムPHドメイン、及び免疫電子顕微鏡法により解析される、これらのゴルジ内分布(バー：100nm)を例示する、例示的な結果を描示する図である。黒矢印は、クラスリンでコーティングされたプロファイルであって、TGNを指し示すプロファイルを指す。右パネルは、TGN会合粒子及び婁会合粒子の定量化を示す図である。データは、条件1つ当たりに解析された、少なくとも30枚の層板についての平均±S.E.M.である。 ［図１８ａ］FAPP2によるGlcCerローディングについての例示的な結果を描示する図である。GlcCerは、FAPP2内のトリプトファン蛍光のシフトを誘導し、シアン線は、C8-GlcCerの濃度を増大させる(挿入図内で詳細に示される通り、0から1.2μMへと)ときのトリプトファン蛍光を指し示し、矢印は、トリプトファン蛍光の最大発光の変化を指し示し、挿入図は、C8-GlcCerの濃度を増大させることの、トリプトファンによる最大発光に対する効果を示す。 ［図１８ｂ］C8-GlcCerローディングの、組換えFAPP2-wt及びFAPP2-W407Aの円偏光二色性に対する効果を例示する、例示的な結果を描示する図である。 ［図１８ｃ］表面プラズモン共鳴により測定される、FAPP2の、POPC又はPOPC及びPtdIns4Pを含有するリポソームへのアフィニティーに対する、C8-GlcCerローディングの効果を例示する、例示的な結果を描示する図である。濃度を増大させる、そのapo形態にあるか、又は当モル量のC8-GlcCerをロードされたFAPP2(0.5〜1.5mg/mLの範囲にわたる)を使用した。結果は、少なくとも3回の独立の実験を表す。 ［図１９ａ］FAPP2-HIS-SUMO-C-212を0.5uMで使用する、TAK-875用量反応アッセイを描示する図である。TAK-875活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した。アッセイは、3つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、25uM)で、且つ、FAPP2を0.5uMとして実行した。TAK-875によるFAPP2活性の阻害は、15分間にわたり測定した。100uMのTAK-875は、FAPP2により媒介されるGlcCerの移行を、著明に低減した。 ［図１９ｂ］時点ゼロにおける、100uMのTAK-875の、FAPP2の移行速度に対する阻害率を示す図である。 ［図２０ａ］FAPP2-HIS-SUMO-C-212を0.5uMで使用する、グリホリン酸用量反応アッセイを描示する図である。グリホリン酸活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。グリホリン酸によるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。100uM及び50uMのグリホリン酸は、FAPP2により媒介されるGlcCerの移行を、著明に低減した。 ［図２０ｂ］時点ゼロにおける、50uMのグリホリン酸の、FAPP2の移行速度に対する阻害率を示す図である。 ［図２１ａ］FAPP2-HIS-SUMO-C-212を0.5uMで使用する、TUG-891用量反応アッセイを描示する図である。TUG 891活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。TUG 891によるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。50uMのTUG-891は、50%のFAPP2移行活性を阻害する。 ［図２１ｂ］時点ゼロにおける、50uMのTUG-891の、FAPP2の移行速度に対する阻害率を示す図である。 ［図２２ａ］FAPP2-HIS-SUMO-C-212を0.5uMで使用する、プランルカスト用量反応アッセイを描示する図である。プランルカスト活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。プランルカストによるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。50uMのプランルカストは、90%のFAPP2移行活性を阻害する。 ［図２２ｂ］時点ゼロにおける、50uMのプランルカストの、FAPP2の移行速度に対する阻害率を示す図である。 ［図２３ａ］FAPP2-HIS-SUMO-C-212を0.5uMで使用する、ザフィルルカスト用量反応アッセイを描示する図である。ザフィルルカスト活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。ザフィルルカストによるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。50uMのザフィルルカストは、90%のFAPP2移行活性を阻害する。 ［図２３ｂ］時点ゼロにおける、50uMのザフィルルカストの、FAPP2の移行速度に対する阻害率を示す図である。 ［図２４ａ］FAPP2-HIS-SUMO-C-212を0.5uMで使用する、チエチルペラジン用量反応アッセイを描示する図である。チエチルペラジン活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。チエチルペラジンによるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。50uMのチエチルペラジンは、60%のFAPP2移行活性を阻害する。 ［図２４ｂ］時点ゼロにおける、50uMのチエチルペラジンの、FAPP2の移行速度に対する阻害率を示す図である。 ［図２５ａ］FAPP2-HIS-SUMO-C-212を0.5uMで使用する、ベンズブロマロン用量反応アッセイを描示する図である。ベンズブロマロン活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。ベンズブロマロンによるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。50uMのベンズブロマロンは、80%のFAPP2移行活性を阻害する。 ［図２５ｂ］時点ゼロにおける、50uMのベンズブロマロンの、FAPP2の移行速度に対する阻害率を示す図である。 ［図２６ａ］FAPP2-FL-SUMO-HISを0.5uMで使用する、レパグリニド用量反応アッセイを描示する図である。レパグリニド活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した。アッセイは、異なる薬物濃度(100uM、50uM、25uM)で、且つ、FAPP2-FL-SUMO-HISを0.5uMとして実行した。レパグリニドによるFAPP2活性の阻害は、15分間にわたり測定した。50uMのレパグリニドは、50%のFAPP2移行活性を阻害する。 ［図２６ｂ］時点ゼロにおける、50uMのレパグリニドの、FAPP2-FLの移行速度に対する阻害率を示す図である。 ［図２７ａ］FAPP2-FL-SUMO-HISを0.5uMで使用する、MK-8245用量反応アッセイを描示する図である。MK-8245活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した。アッセイは、異なる薬物濃度(100uM、50uM、25uM)で、且つ、FAPP2-FL-SUMO-HISを0.5uMとして実行した。MK-8245によるFAPP2活性の阻害は、15分間にわたり測定した。50uMのMK-8245は、40%のFAPP2移行活性を阻害する。 ［図２７ｂ］時点ゼロにおける、50uMのMK-8245の、FAPP2の移行速度に対する阻害率を示す図である。 FAPP2によるGlcCer移行活性の阻害剤として選択された10の化合物の、リソソーム内のGb3の蓄積に対する効果を示す図である。各ヒストグラムは、リソソーム内のGb3の強度の、100%として表される陰性対照(shGLA NT)に対する百分率を表す。PDMP処置は、陽性対照(10μM)として使用した。ヒットは、10μM(赤ブロック)及び50μM(青ブロック)で調べた。破線は、陰性対照(黒線)、陽性対照(赤線)、及び対照間の中央値条件(緑線)におけるGb3蓄積のレベルを指し示す。
定義
本発明をよりたやすく理解するために、まず、若干の用語について、下記で規定する。以下の用語及び他の用語についてのさらなる定義については、本明細書を通して示す。
約又はおよそ：本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語であって、目的の1又は複数の値に適用される用語は、言明された基準値に近似の値を指す。ある特定の実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、そうでないことが言明されるか、又は文脈からそうでないことが明らかでない限りにおいて(このような数が、可能な値の100%を超える場合を除き)、言明された基準値に対して、いずれかの向き(基準値を超える向き又は基準値未満の向き)において、25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%以内に収まる値の範囲を指す。
寛解：本明細書で使用される「寛解」という用語は、状態の防止、低減、若しくは緩和、又は対象の状態の改善を意味する。寛解は、疾患状態の完全な回復又は完全な防止を含むが、これらを要求するわけではない。
機能不全：本明細書で使用される「機能不全」という用語は、機能の異常を指す。分子(例えば、タンパク質)の機能不全は、このような分子と関連する活性の増大又は減少により引き起こされうる。分子の機能不全は、分子自体又は分子と直接的又は間接的に相互作用するか、若しくはこれを調節する他の分子と関連する欠損により引き起こされうる。
改善する(improve)、増大させる、又は低減する：本明細書で使用される「改善する(improve)」、「増大させる」、若しくは「低減する」という用語、又は文法的同等物は、本明細書で記載される処置を開始する前の同じ個体における測定値、又は本明細書で記載される処置の非存在下の対照個体(又は複数の対照個体)における測定値など、ベースラインの測定値と比べた値を指し示す。「対照個体」とは、処置される個体と同じ形態の疾患に罹患する個体であって、処置される個体とほぼ同じ年齢の個体(処置される個体及び対照個体における病期が同等となることを確保するように)である。
阻害：本明細書で使用される「阻害」、「阻害する」、及び「阻害すること」という用語は、目的のタンパク質又は遺伝子の活性及び/又は発現を減少させるか又は低減するプロセス又は方法を指す。タンパク質又は遺伝子の阻害とは、本明細書で記載されるか、又は当技術分野で認知された、1又は複数の方法により測定される通り、タンパク質又は遺伝子の発現若しくは関連する活性を、少なくとも10%以上、例えば、20%、30%、40%、若しくは50%、60%、70%、80%、90%以上低減すること、又は発現若しくは関連する活性の、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上を超える減少を指すことが典型的である。
in vitro：本明細書で使用される「in vitro」という用語は、多細胞生物の内部ではなく、人工的環境、例えば、試験管内又は反応槽内、細胞培養物中などで生じるイベントを指す。
in vivo：本明細書で使用される「in vivo」という用語は、非ヒト動物など、多細胞生物の内部で生じるイベントを指す。
モジュレーター：本明細書で使用される「モジュレーター」という用語は、活性を変化させるか又はこれを誘発する化合物を指す。例えば、モジュレーターの存在は、ある特定の活性の大きさの、モジュレーターの非存在下における活性の大きさと比較した、増大又は減少を結果としてもたらしうる。ある特定の実施形態では、モジュレーターは、1又は複数の活性の大きさを減少させる阻害剤である。ある特定の実施形態では、阻害剤は、1又は複数の生物学的活性を完全に防止する。ある特定の実施形態では、モジュレーターは、少なくとも1つの活性の大きさを増大させる、活性化因子である。ある特定の実施形態では、モジュレーターの存在は、モジュレーターの非存在下では生じない活性を結果としてもたらす。
核酸：本明細書で使用される「核酸」という用語は、その最も広い意味では、オリゴヌクレオチド鎖へと取り込まれるか、又はこれへと取り込まれうる、任意の化合物及び/又は物質を指す。一部の実施形態では、核酸とは、ホスホジエステル連結を介して、オリゴヌクレオチド鎖へと取り込まれるか、又はこれへと取り込まれうる、化合物及び/又は物質である。一部の実施形態では、「核酸」とは、個別の核酸残基(例えば、ヌクレオチド及び/又はヌクレオシド)を指す。一部の実施形態では、「核酸」とは、個別の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用することができる。一部の実施形態では、「核酸」は、RNAのほか、一本鎖及び/又は二本鎖のDNA及び/又はcDNAも包含する。さらに、「核酸」、「DNA」、「RNA」という用語、及び/又は類似の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外の骨格を有する類似体を含む。例えば、当技術分野で公知であり、骨格内に、ホスホジエステル結合ではなく、ペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内にあると考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いの縮重形であり、且つ/又は同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及び/又はRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含みうる。核酸は、天然の供給源から精製することもでき、組換え発現系を使用して作製し、任意選択で、精製することもでき、化学合成などを施すこともできる。適切な場合、例えば、化学合成された分子の場合、核酸は、化学修飾された塩基又は糖、骨格の改変などを有する類似体などのヌクレオシド類似体を含みうる。核酸配列は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、5'から3'方向に提示される。本明細書では、「核酸セグメント」という用語は、より長い核酸配列の部分である核酸配列を指すのに使用される。多くの実施形態では、核酸セグメントは、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10以上の残基を含む。一部の実施形態では、核酸は、天然のヌクレオシド(例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン)；ヌクレオシド類似体(例えば、2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、3-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、C5-プロピニル-シチジン、C5-プロピニル-ウリジン、2-アミノアデノシン、C5-ブロモウリジン、C5-フルオロウリジン、C5-ヨードウリジン、C5-プロピニル-ウリジン、C5-プロピニル-シチジン、C5-メチルシチジン、2-アミノアデノシン、7-デアザアデノシン、7-デアザグアノシン、8-オキソアデノシン、8-オキソグアノシン、O(6)-メチルグアニン、及び2-チオシチジン)；化学修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基(例えば、メチル化塩基)；挿入された塩基；修飾された糖(例えば、2'-フルオロリボース、リボース、2'-デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース)；及び/又は修飾されたリン酸基(例えば、ホスホロチオエート連結及び5'-N-ホスホロアミダイト連結)であるか又はこれを含む。一部の実施形態では、本発明は具体的に、「非修飾核酸」を対象とすることが可能であり、送達を容易とするか又は達成するように化学修飾されていない核酸(例えば、ヌクレオチド及び/又はヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチド及び残基)を意味する。
ポリペプチド：本明細書で使用される「ポリペプチド」は一般に、ペプチド結合により互いと接合させた、少なくとも2つのアミノ酸の連なりである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、それらの各々を、少なくとも1つのペプチド結合により、他のポリペプチドへと接合させた、少なくとも3〜5つのアミノ酸を含みうる。当業者は、ポリペプチドは、場合によって、任意選択で、「非天然の」アミノ酸又は他の実体であるが、それにもかかわらず、ポリペプチド鎖への組込みが可能なアミノ酸又は他の実体を含むことを理解するであろう。
低分子：当技術分野では一般に、「低分子」とは、約5キロドルトン(Kd)未満のサイズの有機分子であることが理解される。一部の実施形態では、低分子は、約4Kd、約3Kd、約2Kd、又は約1Kd未満である。一部の実施形態では、低分子は、約80ドルトン(D)、約600D、約500D、約400D、約300D、約200D、又は約100D未満である。一部の実施形態では、低分子は、1モル当たり約2000g未満、1モル当たり約1500g未満、1モル当たり約1000g未満、1モル当たり約800g未満、又は1モル当たり約500g未満である。一部の実施形態では、低分子は、非ポリマー性である。一部の実施形態では、低分子は、タンパク質、ペプチド、又はアミノ酸ではない。一部の実施形態では、低分子は、核酸又はヌクレオチドではない。一部の実施形態では、低分子は、糖又は多糖ではない。
対象：本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト又は任意の非ヒト動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、又は霊長動物)を指す。多くの実施形態では、対象は、ヒトである。ヒトは、出産前形態及び出産後形態を含む。本発明のある特定の実施形態では、対象は、成人、青年、又は幼児である。対象は、疾患の診断又は処置のために医療関係者を訪れるヒトを指す、患者でありうる。本明細書では、「対象」という用語は、「個体」又は「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患又は障害に罹患している場合もあり、これらに対して感受性の場合もあるが、疾患又は障害の症状を提示する場合もあり、提示しない場合もある。本発明ではまた、医薬組成物の投与及び/又は子宮内処置の方法の実施も想定されている。
実質的な相同性：本明細書では、「実質的な相同性」という語句は、アミノ酸配列又は核酸配列の間の比較を指すのに使用される。当業者に理解される通り、2つの配列は一般に、対応する位置において、相同な残基を含有すれば、「実質的に相同」であると考えられる。相同な残基は、同一な残基でありうる。代替的に、相同な残基は、適切な形で類似な構造的特徴及び/又は機能的特徴を伴う、非同一の残基の場合もある。例えば、当業者に周知の通り、ある特定のアミノ酸は、「疎水性」若しくは「親水性」のアミノ酸、及び/又は「極性」若しくは「非極性」の側鎖を有するアミノ酸と分類されることが典型的である。1つのアミノ酸の、同じ種類の別のアミノ酸による置換は、「相同」置換と考えうることが多い。
当技術分野で周知の通り、アミノ酸配列又は核酸配列は、ヌクレオチド配列のためのBLASTN、並びにアミノ酸配列のためのBLASTP、gapped BLAST、及びPSI-BLASTなど、市販のコンピュータプログラムで利用可能なアルゴリズムを含む、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較することができる。例示的なこのようなプログラムについては、Altschulら、Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3)：403-410, 1990； Altschulら、Methods in Enzymology； Altschulら、"Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25：3389-3402, 1997； Baxevanisら、Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998；及びMisenerら(編)、Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999において記載されている。相同な配列の同定に加えて、上記で言及したプログラムは、相同性の程度についての指標を提供することが典型的である。一部の実施形態では、2つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上が、残基の関連するストレッチにわたり相同であれば、実質的に相同であると考えられる。一部の実施形態では、関連するストレッチは、完全な配列である。一部の実施形態では、関連するストレッチは、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500以上の残基である。
実質的な同一性：本明細書では、「実質的な同一性」という語句は、アミノ酸配列又は核酸配列の間の比較を指すのに使用される。当業者に理解される通り、2つの配列は一般に、対応する位置において、同一な残基を含有すれば、「実質的に同一」であると考えられる。当技術分野で周知の通り、アミノ酸配列又は核酸配列は、ヌクレオチド配列のためのBLASTN、並びにアミノ酸配列のためのBLASTP、gapped BLAST、及びPSI-BLASTなど、市販のコンピュータプログラムで利用可能なアルゴリズムを含む、様々なアルゴリズムのうちのいずれかを使用して比較することができる。例示的なこのようなプログラムについては、Altschulら、Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3)：403-410, 1990； Altschulら、Methods in Enzymology；Altschulら、Nucleic Acids Res. 25：3389-3402, 1997； Baxevanisら、Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998；及びMisenerら(編)、Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999において記載されている。同一な配列の同定に加えて、上記で言及したプログラムは、同一性の程度についての指標を提供することが典型的である。一部の実施形態では、2つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上が、残基の関連するストレッチにわたり同一であれば、実質的に同一であると考えられる。一部の実施形態では、関連するストレッチは、完全な配列である。一部の実施形態では、関連するストレッチは、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500以上の残基である。
〜を患う：疾患、障害、及び/又は状態「を患う」個体は、疾患、障害、及び/又は状態の1又は複数の症状を伴うと診断されているか、又はこれらを提示する。
〜に対して感受性である：疾患、障害、及び/又は状態「に対して感受性である」個体は、疾患、障害、及び/又は状態を伴うとは診断されていない。一部の実施形態では、疾患、障害、及び/又は状態に対して感受性である個体は、疾患、障害、及び/又は状態の症状を呈示しない場合がある。一部の実施形態では、疾患、障害、及び/又は状態に対して感受性である個体は、疾患、障害、及び/又は状態を発症するであろう。一部の実施形態では、疾患、障害、及び/又は状態に対して感受性である個体は、疾患、障害、及び/又は状態を発症しないであろう。
治療有効量：本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、処置された対象に、任意の医療処置に適用可能な、妥当な有益性/危険性比で、治療効果を付与する治療剤の量を指す。治療効果は、客観的な(すなわち、何らかの試験又はマーカーにより測定可能な)場合もあり、主観的な(すなわち、対象が、効果の徴候を示すか、又はこれを感知する)場合もある。特に、「治療有効量」とは、所望の疾患又は状態を処置するか、改善するか、若しくは防止するか、或いは疾患と関連する症状を改善すること、疾患の発症を防止するか若しくはこれを遅延させることにより、且つ/又は、また、疾患の症状の重症度又は頻度を抑制することなどにもより、検出可能な治療効果又は予防効果を呈示するのに有効な、治療剤又は組成物の量を指す。治療有効量は一般に、複数の単位用量を含みうる、投与レジメンにより投与される。任意の特定の治療剤では、治療有効量(及び/又は有効な投与レジメン内の適切な単位用量)は、例えば、投与経路、他の薬剤との組合せに応じて変化しうる。また、任意の特定の患者のための、具体的な治療有効量(及び/又は単位用量)も、処置される障害及び障害の重症度；援用される具体的な薬剤の活性；援用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食餌；投与回数、投与経路、及び/又は援用される具体的な薬剤の排出速度若しくは代謝速度；処置の持続期間など、医療技術分野で周知の因子を含む、様々な因子に依存しうる。
処置：本明細書で使用される「処置」という用語(また、「処置する」又は「処置すること」という用語も使用される)は、特定の疾患、障害、及び/又は状態(例えば、ファブリー病)を、部分的若しくは完全に和らげ、改善し、軽減し、阻害し、これらの発症を遅延させ、これらの重症度を軽減し、且つ/又はこれらの1若しくは複数の症状又は特徴の発生率を低減する、治療剤(例えば、オリゴヌクレオチド、低分子)の任意の投与を指す。このような処置は、関連する疾患、障害、及び/若しくは状態の徴候を呈示しない対象の処置の場合もあり、並びに/又は疾患、障害、及び/若しくは状態の早期の徴候だけを呈示する対象の処置の場合もある。代替的に、又は加えて、このような処置は、関連する疾患、障害、及び/又は状態の、1又は複数の確立された徴候を呈示する対象の処置でありうる。
ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)阻害剤とは、FAPP2によるグルコシルセラミドの移行活性を阻害することが可能な化合物である。
グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を特徴とする疾患、障害、又は状態とは、例えば酵素であるアルファ-ガラクトシダーゼの欠損により、リソソーム内のGb3の蓄積が結果としてもたらされる、ファブリー病である。これは、全身の多くの細胞及び血管の機能の異常をもたらす。この機能不全は、腎臓、心臓、神経系、眼、皮膚、及び消化管など、臓器の多く及び全身系に影響を及ぼす。
本発明では、「ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)の発現を阻害する干渉オリゴヌクレオチド」は、FAPP2のmRNAレベルを低減するときのその効率を評価することにより(例えば、リアルタイムPCRにより)同定することができる。
詳細な説明
本発明は、とりわけ、siRNA及び低分子化合物ベースの阻害剤を含む、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)の阻害剤に基づいて、グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を低減し、Gb3の蓄積と関連する疾患、障害、又は状態を処置する方法及び組成物を提供する。本発明は、ファブリー病、及びゴーシェ病など、スフィンゴ脂質代謝に関連する、他のスフィンゴ脂質症を処置するのに特に有用である。
以下の節では、本発明の多様な態様について詳細に記載する。節の使用は、本発明を限定することを意味しない。各節は、本発明の任意の態様へと適用されうる。本出願では、「又は」の使用は、そうでないことが言明されない限りにおいて、「及び/又は」を意味する。
ファブリー病及び他のスフィンゴ脂質症
ファブリー病とは、グリコスフィンゴ脂質(GSL)によるリソソーム蓄積障害であって、グリコスフィンゴ脂質からの、末端のα-ガラクトシル残基の加水分解の一因となる酵素である、リソソームα-ガラクトシダーゼA(α-GAL)の、X染色体に関連する遺伝性欠損症から生じる、リソソーム蓄積障害である(Brady ら、N Engl J Med. 1967；276：1163-7)。α-GAL活性の欠損は、ファブリー病患者の細胞内で、主に、グロボトリアオシルセラミド(セラミドトリヘキソシド、CD77、Gb3としてもまた公知の)である、中性グリコスフィンゴ脂質の進行性の沈着を結果としてもたらす。
この疾患の古典的形態の頻度は、男性において約1：40,000〜1：60,000であると推定されており、世界中の異なる民族集団内で報告されている。従来、罹患した男性では、α-GALレベルが、ほとんど又は全く検出可能ではなく、これらは、最も重症の患者である。突然変異のうちのあるものは、α-GALのアミノ酸配列の変化を引き起こし、これらは、安定性が低減されたα-GALであって、その適正な三次元形状へとフォールディングしないα-GALの産生を結果としてもたらしうる。患者細胞内で産生されるα-GALは、生物学的活性のうちの一部のレベルに対する潜在的能力は保持することが多いが、細胞の品質管理機構は、小胞体又はER内で、ミスフォールディングしたα-GALを認識し、分解及び消失のために、細胞の別の部分へと最終的に移行するまで、保持する。結果として、α-GALは、それが正常ではGb3を加水分解するリソソームへと、ほとんど又は全く移動しない。これは、特に、血管内皮の細胞内のGb3の蓄積をもたらし、これにより、ファブリー病の症状が引き起こされると考えられている。加えて、ミスフォールディングしたα-GAL酵素の、ER内の蓄積は、細胞の機能不全及び疾患に寄与しうる、細胞に対するストレス及び炎症性応答様の応答をもたらしうる。
ファブリー病の症状は、重度で消耗性の可能性があり、腎不全並びに心臓発作及び脳卒中の危険性の増大を含む。症状は、患者により変化しうるが、ファブリー病の一般的な症状は、数時間〜数日間にわたり持続する急性疼痛のエピソードを伴う、間欠性肢端感覚異常(手足の焼けつくような痛みとして顕在化することが多い「ファブリークライシス」)；角化血管腫(皮膚上の、小型で、***した、赤色調〜紫色の染み)；渦巻き状角膜；乏汗症又は無汗症(発汗能力の減退)；発熱、悪寒、及び運動不耐性；軽度のタンパク尿症；及び消化管障害を含む(Engら、Fabry disease：Baseline medical characteristics of a cohort of 1765 males and females in the Fabry registry, 2007, J. Inherit. Metab. Dis., 30：184-192を参照されたい)。ファブリー病の一般的な心臓合併症は、左室肥大、心弁疾患、冠動脈疾患、伝導異常、心不全、不整脈、及び急性心筋梗塞を含む(Pieroniら、Fabry's disease cardiomyopathy： Echocardiographic detection of endomyocardial glycosphingolipid compartmentalization, 2006, J. Am. Coll. Cardiol., 47： 1663-1671を参照されたい)。ファブリー病の一般的な脳血管症状は、白質病変、知覚障害、めまい、早期脳卒中、及び一過性虚血性発作を含む(Politei及びCapizzano、Magnetic resonance image findings in 5 young patients with Fabry disease, 2006, Neurologist, 12： 103-105を参照されたい)。加えて、糸球体足細胞への損傷は、タンパク尿症及び/又は血尿症をもたらしうる。一部の患者では、ファブリー病の顕在化は、症状の乏しい経過、例えば、症状が、腎臓系又は心血管系など、単一の系に限定される経過をたどる。
多くのリソソーム蓄積障害と異なり、ファブリー病は、若齢の成人が罹患することが多い。例えば、この疾患の古典的形態では、臨床症状は、5歳に始まることもある。臓器及び系への損傷は、進行性であることが典型的であり、30〜50歳代において、大半のファブリー病患者は、重度の腎疾患及び心疾患を発症している。進行性の腎機能不全は、最終的に、透析及び腎臓移植を要求し、ファブリー病患者の主な死因となっている。男性患者の寿命は縮減され、通例、心臓、脳、及び/又は腎臓の血管疾患の結果として、40〜50歳代で死亡する。
他の疾患、状態、又は障害
FAPP2に関連する病因又は成分を有する、他の疾患、障害、又は状態は、例えば、限定せずに述べると、主要特徴又は副次特徴など、その特徴としてのリソソーム機能障害を含む、疾患、障害、又は状態を含む。一部の実施形態は、例えば、Gb3の蓄積など、FAPP2成分を有する、任意の疾患、障害、又は状態を処置するのに使用しうることが想定される。ある特定の実施形態では、FAPP2に関連する病因を有する疾患、障害、又は状態は、ある特定のリソソーム蓄積障害、特に、スフィンゴ脂質症でありうる。一部の実施形態では、スフィンゴ脂質症の形態は、ゴーシェ病である。
ゴーシェ病とは、脂質が、患者の細胞内及びある特定の臓器内に蓄積される、遺伝性疾患である。ゴーシェ病は、スフィンゴ脂質代謝、具体的には、グルコセレブロシダーゼの機能不全により引き起こされると考えられている。グルコセレブロシダーゼは、正常では、脂肪酸であるグルコシルセラミドに作用し、グルコセレブロシダーゼ機能の欠損は、特に、マクロファージなど、白血球内のグルコシルセラミドの蓄積を結果としてもたらす。結果として、グルコシルセラミドは、ゴーシェ病患者の脾臓内、肝臓内、腎臓内、肺内、脳内、及び骨髄内に集積されることが多い。ゴーシェ病の症状は、変化するが、脾臓肥大(脾腫)及び/又は肝臓(肝腫脹)、肝硬変などの肝機能不全、肝機能亢進、汎血球減少症、骨病変、骨粗鬆症、リンパ節腫脹、貧血、低血小板カウント、強膜、神経障害、並びに感染症に対する抵抗性の低下を含みうる。
FAPP2阻害剤
下記の実施例で論じられる通り、本発明者らは、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)が、グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の合成を特異的に制御することを発見した。したがって、FAPP2は、Gb3の蓄積と関連する疾患、障害、又は状態のための新規の標的を表す。FAPP2阻害剤を使用して、Gb3の蓄積を効果的に低減し、関連する疾患、障害、及び状態であって、ファブリー病を含む、疾患、障害、及び状態のための新規の治療を提供することができる。
本発明に適するFAPP2阻害剤は、化合物(例えば、低分子)、タンパク質又はペプチド、抗体、共結晶、ナノ結晶、核酸(例えば、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、siRNA、shRNA、miRNA、リボザイム、アプタマーなど)、炭水化物(例えば、単糖、二糖、又は多糖)、脂質(例えば、リン脂質、トリグリセリド、ステロイドなど)、天然生成物、これらの任意の組合せでありうる。
低分子
一部の実施形態では、適切なFAPP2阻害剤は、低分子化合物である。特に、GlcCerのグリコシル部分の構造と類似の構造を有する低分子化合物は、FAPP2を阻害するのに、特に有効でありうる。したがって、一部の実施形態では、適切なFAPP2阻害剤は、アリールグリコシドである。一部の実施形態では、適切なFAPP2阻害剤は、アリールC-グルコシドである。一部の実施形態では、適切なFAPP2阻害剤は、アリールO-グルコシドである。
一部の実施形態では、適切なFAPP2阻害剤は、式I：
、又は薬学的に許容されるその塩[式中：
Qは、単糖又は修飾単糖であり；
A1は、フェニル、又は窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される、1〜3個のヘテロ原子を有する、5〜6員のヘテロアリール環であり；
A2は、フェニル、又は窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される、1〜3個のヘテロ原子を有する、5〜6員のヘテロアリール環であり；
L1は、共有結合、又はC1〜4の二価で直鎖状若しくは分枝状の炭化水素鎖であり、鎖の1つ若しくは2つのメチレン単位は、-N(R)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)S(O)2-、-S(O)2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-S(O)-、又は-S(O)2-により、任意選択で独立に置きかえられており；
L2は、共有結合又は-O-であり；
各R1は独立に、ハロゲン、-CN、-R；-OR；-SR；-N(R)2；-N(R)C(O)R；-C(O)N(R)2；-N(R)C(O)N(R)2；-N(R)C(O)OR；-OC(O)N(R)2；-N(R)S(O)2R；-S(O)2N(R)2；-OC(O)OR；-C(O)R；-OC(O)R；-C(O)OR；-S(O)R；-S(O)2R；又はCyであり；
各R2は独立に、ハロゲン、-CN、-R、-OR、-SR、-N(R)2、-N(R)C(O)R、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-OC(O)N(R)2、-N(R)SO2R、-S(O)2N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-S(O)R、又は-S(O)2Rであり；
Cyは、p個のR3で置換された環であり、前記環は、3〜8員の、飽和であるか又は部分的に不飽和である、単環式の炭素環；フェニル；8〜10員の、二環式の芳香族炭素環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜2個のヘテロ原子を有する、4〜8員の、飽和であるか又は部分的に不飽和である、単環式の複素環式環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する、5〜6員の、単環式のヘテロ芳香環；並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜5個のヘテロ原子を有する、8〜10員の、二環式のヘテロ芳香環からなる群から選択され；
各Rは独立に、水素、重水素、又はC1〜6脂肪族；3〜8員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である、単環式の炭素環；フェニル；8〜10員の、二環式の芳香族炭素環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜2個のヘテロ原子を有する、4〜8員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である、単環式の複素環式環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する、5〜6員の、単環式のヘテロ芳香環；並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜5個のヘテロ原子を有する、8〜10員の、二環式のヘテロ芳香環から選択される、任意選択で置換された基であり；
各R3は独立に、ハロゲン、-R、-CN、-OR、-SR、-N(R)2、-N(R)C(O)R、-C(O)N(R)2、-C(O)N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-OC(O)N(R)2、-N(R)S(O)2R、-S(O)2N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-S(O)R、-S(O)2R、-B(OR)2、又はフェニル、並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員のヘテロアリールから選択される、任意選択で置換された環であり；
pは、1〜5であり；
xは、0〜5であり；
yは、0〜4である]
の阻害剤を含む。
本明細書で一般に規定されているように、Qは、単糖又は修飾単糖である。一部の実施形態では、Qは、ヘキソースである。一部の実施形態では、Qは、修飾単糖である。一部の実施形態では、Qは、2-デオキシグルコシルである。本明細書で使用される「修飾単糖」という用語は、非修飾単糖の任意の1又は複数のヒドロキシル基が、ハロゲン、-CN、-R、-OR、-SR、-N(R)2、-N(R)C(O)R、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-OC(O)N(R)2、-N(R)SO2R、-S(O)2N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-S(O)R、及び-S(O)2Rからなる群から独立に選択される部分で置き換えられた単糖を指す。
上記で一般に規定されているように、A1は、フェニル、又は窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される、1〜3個のヘテロ原子を有する、5〜6員のヘテロアリール環である。一部の実施形態では、A1は、フェニルである。一部の実施形態では、A1は、チオフェンである。
上記で一般に規定されているように、A2は、フェニル、又は窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される、1〜3個のヘテロ原子を有する、5〜6員のヘテロアリール環である。一部の実施形態では、A2は、フェニルである。
上記で一般に規定されているように、L1は、共有結合、又はC1〜4の二価で直鎖状若しくは分枝状の炭化水素鎖であり、鎖の1つ若しくは2つのメチレン単位は、-N(R)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)S(O)2-、-S(O)2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-O-、-S-、-S(O)-、又は-S(O)2-により、任意選択で独立に置きかえられている。一部の実施形態では、L1は、-C(O)CH2CH2-である。一部の実施形態では、L1は、-CH2-である。
上記で一般に規定されているように、L2は、共有結合又は-O-である。一部の実施形態では、L2は、共有結合である。一部の実施形態では、L2は、-O-である。
上記で一般に規定されているように、各R1は独立に、ハロゲン、-CN、-R；-OR；-SR；-N(R)2；-N(R)C(O)R；-C(O)N(R)2；-N(R)C(O)N(R)2；-N(R)C(O)OR；-OC(O)N(R)2；-N(R)S(O)2R；-S(O)2N(R)2；-OC(O)OR；-C(O)R；-OC(O)R；-C(O)OR；-S(O)R；-S(O)2R；又はCyである。一部の実施形態では、R1は、-OHである。一部の実施形態では、R1は、-OEtである。一部の実施形態では、R1は、フェニル4-フルオロフェニルである。一部の実施形態では、R1は、テトラヒドロフラニルオキシである。一部の実施形態では、R1は、2-シクロプロピルオキシ-エトキシである。
上記で一般に規定されているように、各R2は独立に、ハロゲン、-CN、-R、-OR、-SR、-N(R)2、-N(R)C(O)R、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-OC(O)N(R)2、-N(R)SO2R、-S(O)2N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-S(O)R、又は-S(O)2Rである。一部の実施形態では、R2は、-OHである。一部の実施形態では、R2は、クロロである。一部の実施形態では、R2は、メチルである。
上記で一般に規定されているように、Cyは、p個のR3で置換された環であり、前記環は、3〜8員の、飽和であるか又は部分的に不飽和である、単環式の炭素環；フェニル；8〜10員の、二環式の芳香族炭素環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜2個のヘテロ原子を有する、4〜8員の、飽和であるか又は部分的に不飽和である、単環式の複素環式環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する、5〜6員の、単環式のヘテロ芳香環；並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜5個のヘテロ原子を有する、8〜10員の、二環式のヘテロ芳香環からなる群から選択される。一部の実施形態では、Cyは、p個のR3で置換されたフェニルであり、ここで、pは、1であり、R3は、フルオロである。
上記で一般に規定されているように、各R3は、独立に、ハロゲン、-R、-CN、-OR、-SR、-N(R)2、-N(R)C(O)R、-C(O)N(R)2、-C(O)N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-OC(O)N(R)2、-N(R)S(O)2R、-S(O)2N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-S(O)R、-S(O)2R、-B(OR)2、又はフェニル、並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員のヘテロアリールから選択される、任意選択で置換された環である。一部の実施形態では、R3は、フルオロである。
上記で一般に規定されているように、pは、1〜5である。一部の実施形態では、pは、1である。
上記で一般に規定されているように、xは、0〜5である。一部の実施形態では、xは、1である。
上記で一般に規定されているように、yは、0〜4である。一部の実施形態では、yは、1である。一部の実施形態では、yは、2である。
一部の実施形態では、適切なFAPP2阻害剤は、式II-a又はII-b：
、又は薬学的に許容されるこれらの塩[式中、A1、R1、R2、x、及びyの各々は、単独及び組合せのいずれにおいても、前出の式Iについての実施形態で記載されている通り、又は本明細書の実施形態で記載されている通りである]の構造を有する。
一部の実施形態では、適切なFAPP2阻害剤は、以下の種：
、又は薬学的に許容されるこれらの塩から選択される。
本発明の化合物は、上記で一般に記載された化合物を含み、本明細書で開示される、クラス、サブクラス、及び種によりさらに例示される。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される、以下の定義が適用されるものとする。本発明の目的では、化学元素は、Periodic Table of the Elements、CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Edに従って同定される。加えて、有機化学の一般的原理については、それらの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、"Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito： 1999、及び"March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Smith, M.B.及びMarch, J.編, John Wiley & Sons, New York： 2001において記載されている。
本明細書で使用される「脂肪族」又は「脂肪族基」という用語は、完全に飽和であるか又は1若しくは複数単位の不飽和を含有する、直鎖状(すなわち、非分枝状)又は分枝状の、置換された又は非置換の炭化水素鎖、或いは完全に飽和であるか又は1若しくは複数単位の不飽和を含有するが、芳香族ではなく、分子の残りの部分に対する単一の接合点を有する単環式の炭化水素又は二環式の炭化水素(本明細書ではまた、「炭素環」、「脂環族」、又は「シクロアルキル」とも称する)を意味する。そうでないと指定されない限りにおいて、脂肪族基は、1〜6個の脂肪族炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪族基は、1〜5個の脂肪族炭素原子を含有する。他の実施形態では、脂肪族基は、1〜4個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の実施形態では、脂肪族基は、1〜3個の脂肪族炭素原子を含有し、さらに他の実施形態では、脂肪族基は、1〜2個の脂肪族炭素原子を含有する。一部の実施形態では、「脂環族」(又は「炭素環」又は「シクロアルキル」)とは、単環式のC3〜C6炭化水素であって、完全に飽和であるか又は1若しくは複数単位の不飽和を含有する炭化水素であるが、芳香族ではなく、分子の残りの部分に対する単一の接合点を有する炭化水素を指す。適切な脂肪族基は、直鎖状又は分枝状で、置換されているか又は非置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、及び(シクロアルキル)アルキル、(シクロアルケニル)アルキル、又は(シクロアルキル)アルケニルなど、これらのハイブリッドを含むがこれらに限定されない。
「低級アルキル」という用語は、C1〜4の直鎖状又は分枝状のアルキル基を指す。例示的な低級アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、及びtert-ブチルである。
「低級ハロアルキル」という用語は、C1〜4の直鎖状又は分枝状のアルキル基であって、1又は複数のハロゲン原子で置換されたアルキル基を指す。
「ヘテロ原子」という用語は、酸素、硫黄、窒素、リン、又はケイ素[窒素、硫黄、リン、若しくはケイ素の任意の酸化形態；任意の塩基性窒素の四級化形態；又は複素環式環の置換可能な窒素、例えば、N(3,4-ジヒドロ-2H-ピロリルにおける)、NH(ピロリジニルにおける)又はNR+(N-置換されたピロリジニルにおける)を含む]のうちの1又は複数を意味する。
本明細書で使用される「不飽和」という用語は、部分が、1又は複数の不飽和単位を有することを意味する。
本明細書で使用される「二価のC1〜8(又はC1〜6)による、飽和であるか又は不飽和である、直鎖状又は分枝状の炭化水素鎖」という用語は、本明細書で規定される通り、直鎖状又は分枝状である、二価のアルキレン鎖、アルケニレン鎖、及びアルキニレン鎖を指す。
「アルキレン」という用語は、二価のアルキル基を指す。「アルキレン鎖」とは、ポリメチレン基、すなわち、-(CH2)n-[式中、nは、正の整数、好ましくは、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、又は2〜3である]である。置換アルキレン鎖とは、1又は複数のメチレン水素原子が、置換基で置きかえられた、ポリメチレン基である。適切な置換基は、置換脂肪族基について、下記で記載される置換基を含む。
「アルケニレン」という用語は、二価のアルケニル基を指す。置換アルケニレン鎖とは、少なくとも1つの二重結合を含有するポリメチレン基であって、1又は複数の水素原子が、置換基で置きかえられた、ポリメチレン基である。適切な置換基は、置換脂肪族基について、下記で記載される置換基を含む。
本明細書で使用される「シクロプロピレニル」という用語は、以下の構造：
の、二価のシクロプロピル基を指す。
本明細書で使用される「シクロブチレニル」という用語は、以下の構造：
の、二価のシクロブチル基を指す。
「ハロゲン」という用語は、F、Cl、Br、又はIを意味する。
「アラルキル」、「アラルコキシ」、又は「アリールオキシアルキル」における通り、単独で、又はより大きな部分の一部として使用される「アリール」という用語は、合計5〜14環員を有する、単環式又は二環式の環系であって、系内の少なくとも1つの環が、芳香環であり、系内の各環が、3〜7環員を含有する環系を指す。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と互換的に使用することができる。本発明のある特定の実施形態では、「アリール」とは、フェニル、ナフチル、アントラシルなどを含むがこれらに限定されない芳香環系であって、任意選択で置換されうる芳香環系を指す。本明細書で使用される「アリール」という用語の範囲内にはまた、芳香環を、インダニル、フタルイミジル、ナフチミジル、フェナントリジニル、又はテトラヒドロナフチルなど、1又は複数の非芳香環へと融合させた基も含まれる。
単独で、又はより大きな部分、例えば、「ヘテロアラルキル」、又は「ヘテロアラルコキシ」の一部として使用される「ヘテロアリール」及び「ヘテロアラ-」という用語は、5〜10個の環原子、好ましくは、5、6、又は9個の環原子を有し；環状配置内に共有される、6、10、又は14個のπ電子を有し；炭素原子に加えて、1〜5個のヘテロ原子を有する基を指す。ヘテロアリール基は、限定せずに述べると、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、及びプテリジニルを含む。本明細書で使用される「ヘテロアリール」及び「ヘテロアラ-」という用語はまた、ヘテロ芳香環を、1又は複数のアリール環、脂環式環、又はヘテロシクリル環へと融合させた基を含み、ここで基又は接合点はヘテロ芳香環上にある。非限定的な例は、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、4H-キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、及びピリド[2,3-b]-1,4-オキサジン-3(4H)-オンを含む。ヘテロアリール基は、単環式の場合もあり、二環式の場合もある。「ヘテロアリール」という用語は、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」、又は「ヘテロ芳香族」という用語と互換的に使用することができ、これらの用語のうちのいずれかは、任意選択で置換される環を含む。「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されたアルキル基であって、アルキル部分と、ヘテロアリール部分とが、独立に、任意選択で置換されたアルキル基を指す。
本明細書で使用される「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式基」、及び「複素環式環」という用語は、互換的に使用され、安定的な、5〜7員で単環式の複素環式部分、又は安定的な、7〜10員で二環式の複素環式部分であって、飽和であるか又は部分的に不飽和であり、炭素原子に加えて、1又は複数の、好ましくは、1〜4個のヘテロ原子を有する複素環式部分を指す。複素環の環原子に言及して使用される場合、「窒素」という用語は、置換窒素を含む。例として述べると、酸素、硫黄、又は窒素から選択される0〜3個のヘテロ原子を有する、飽和であるか又は部分的に不飽和である環内では、窒素は、N(3,4-ジヒドロ-2H-ピロリルにおける)の場合もあり、NH(ピロリジニルにおける)の場合もあり、+NR(N-置換されたピロリジニルにおける)の場合もある。
複素環式環は、そのペンダント基へと、任意のヘテロ原子又は炭素原子において接合させ、これにより、安定的な構造を結果としてもたらすことができ、環原子のうちのいずれかを、任意選択で置換することができる。このような、飽和であるか又は部分的に不飽和である、複素環式基の例は、限定せずに述べると、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニルピロリジニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル、及びキヌクリジニルを含む。本明細書では、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、及び「複素環式基」という用語が互換的に使用され、これらはまた、ヘテロシクリル環を、インドリニル、3H-インドリル、クロマニル、フェナントリジニル、又はテトラヒドロキノリニルなど、1又は複数のアリール環、ヘテロアリール環、又は脂環式環へと融合させた基も含み、ここで基又は接合点はヘテロシクリル環上にある。ヘテロシクリル基は、単環式の場合もあり、二環式の場合もある。「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、ヘテロシクリルで置換されたアルキル基であって、アルキル部分と、ヘテロシクリル部分とが、独立に、任意選択で置換されたアルキル基を指す。
本明細書で使用される「部分的に不飽和」という用語は、少なくとも1つの二重結合又は三重結合を含む環部分を指す。「部分的に不飽和」という用語は、本明細書で規定される通り、複数の不飽和部位を有する環を包含することを意図するものであり、アリール部分又はヘテロアリール部分を含むことを意図するものではない。
本明細書で記載される、本発明の化合物は、「任意選択で置換される」部分を含有しうる。一般に、「置換された」という用語は、「任意選択で」という用語を前置する場合であれ、そうでない場合であれ、指示された部分の1又は複数の水素が、適切な置換基で置きかえられることを意味する。そうでないことが指し示されない限りにおいて、「任意選択で置換される」基は、基の各々の置換可能な位置において、適切な置換基を有することが可能であり、任意の所与の構造内の複数の位置を、指定された基から選択される複数の置換基で置換しうる場合、置換基は、あらゆる位置において、同じ場合もあり、異なる場合もある。本発明により想定される置換基の組合せは、安定的であるか又は化学的に可能な化合物の形成を結果としてもたらす組合せであることが好ましい。本明細書で使用される「安定的」という用語は、それらの生成、検出、並びに、ある特定の実施形態では、本明細書で開示される目的のうちの1又は複数のための、それらの回収、精製、及び使用を可能とする条件下におかれた場合に、実質的に変化しない化合物を指す。
「任意選択で置換される」基の、置換可能な炭素原子上の、適切な一価の置換基は、独立に、ハロゲン；-(CH2)0〜4R○；-(CH2)0〜4OR○；-O(CH2)0〜4R○、-O-(CH2)0〜4-C(O)OR○；-(CH2)0〜4CH(OR○)2；-(CH2)0〜4SR○；R○で置換しうる、-(CH2)0〜4Ph；R○で置換しうる、-(CH2)0〜4O(CH2)0〜1Ph；R○で置換しうる、-CH=CHPh；R○で置換しうる、-(CH2)0〜4O(CH2)0〜1ピリジル；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0〜4N(R○)2；-(CH2)0〜4N(R○)C(O)R○；-N(R○)C(S)R○；-(CH2)0〜4N(R○)C(O)NR○ 2；-N(R○)C(S)NR○ 2；-(CH2)0〜4N(R○)C(O)OR○；-N(R○)N(R○)C(O)R○；-N(R○)N(R○)C(O)NR○ 2；-N(R○)N(R○)C(O)OR○；-(CH2)0〜4C(O)R○；-C(S)R○；-(CH2)0〜4C(O)OR○；-(CH2)0〜4C(O)SR○；-(CH2)0〜4C(O)OSiR○ 3；-(CH2)0〜4OC(O)R○；-OC(O)(CH2)0〜4SR-、SC(S)SR○；-(CH2)0〜4SC(O)R○；-(CH2)0〜4C(O)NR○ 2；-C(S)NR○ 2；-C(S)SR○；-SC(S)SR○、-(CH2)0〜4OC(O)NR○ 2；-C(O)N(OR○)R○；-C(O)C(O)R○；-C(O)CH2C(O)R○；-C(NOR○)R○；-(CH2)0〜4SSR○；-(CH2)0〜4S(O)2R○；-(CH2)0〜4S(O)2OR○；-(CH2)0〜4OS(O)2R○；-S(O)2NR○ 2；-(CH2)0〜4S(O)R○；-N(R○)S(O)2NR○ 2；-N(R○)S(O)2R○；-N(OR○)R○；-C(NH)NR○ 2；-P(O)2R○；-P(O)R○ 2；-OP(O)R○ 2；-OP(O)(OR○)2；SiR○ 3；-(C1〜4の直鎖状又は分枝状のアルキレン)O-N(R○)2；又は-(C1〜4の直鎖状又は分枝状のアルキレン)C(O)O-N(R○)2[式中、各R○は、下記で規定される通りに置換することができ、独立に、水素、C1〜6による脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0〜1Ph、-CH2-(5〜6員のヘテロアリール環)、又は5〜6員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である環、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される、0〜4個のヘテロ原子を有するアリール環であるか、或いは、上記の定義にも拘らず、2つのR○の独立の存在は、それらの介在原子と併せて、下記で規定される通りに置換されうる、3〜12員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である環、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される、0〜4個のヘテロ原子を有するアリールによる、単環式若しくは二環式の環を形成する]である。
R○上の適切な一価の置換基(又は2つのR○の独立の存在を、それらの介在原子と併せることにより形成される環)は、独立に、ハロゲン、-(CH2)0〜2R●、-(ハロR●)、-(CH2)0〜2OH、-(CH2)0〜2OR●、-(CH2)0〜2CH(OR●)2；-O(ハロR●)、-CN、-N3、-(CH2)0〜2C(O)R●、-(CH2)0〜2C(O)OH、-(CH2)0〜2C(O)OR●、-(CH2)0〜2SR●、-(CH2)0〜2SH、-(CH2)0〜2NH2、-(CH2)0〜2NHR●、-(CH2)0〜2NR● 2、-NO2、-SiR● 3、-OSiR● 3、-C(O)SR●、-(C1〜4の直鎖状又は分枝状のアルキレン)-C(O)OR●、又は-SSR●[式中、各R●は、非置換であるか、又は、「ハロ」を前置する場合は、1若しくは複数のハロゲンだけで置換されており、C1〜4の脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0〜1Ph、又は5〜6員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である環、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される、0〜4個のヘテロ原子を有するアリール環から独立に選択される]である。R○の飽和炭素原子上の、適切な二価の置換基は、=O及び=Sを含む。
「任意選択で置換される」基の、飽和炭素原子上の、適切な二価の置換基は、以下：=O、=S、=NNR* 2、=NNHC(O)R*、=NNHC(O)OR*、=NNHS(O)2R*、=NR*、=NOR*、-O(C(R* 2))2〜3O-、又は-S(C(R* 2))2〜3S-[式中、R*の各独立の存在は、水素、下記で規定される通りに置換されうる、C1〜6による脂肪族、又は非置換で5〜6員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である環、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される、0〜4個のヘテロ原子を有するアリール環から選択される]を含む。「任意選択で置換される」基の、隣接する置換可能な炭素へと結合させる、適切な二価の置換基は、-O(CR* 2)2〜3O-[式中、R*の各独立の存在は、水素、下記で規定される通りに置換されうるC1〜6による脂肪族、又は非置換で5〜6員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である環、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される、0〜4個のヘテロ原子を有するアリール環から選択される]を含む。
R*の、脂肪族基上の、適切な置換基は、ハロゲン、-R●、-(ハロR●)、-OH、-OR●、-O(ハロR●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2、又は-NO2[式中、各R●は、非置換であるか、又は、「ハロ」を前置する場合は、1若しくは複数のハロゲンだけで置換されており、独立に、C1〜4の脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0〜1Ph、又は5〜6員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である環、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される、0〜4個のヘテロ原子を有するアリール環である]を含む。
「任意選択で置換される」基の、置換可能な窒素上の、適切な置換基は、-R†、-NR† 2、-C(O)R†、-C(O)OR†、-C(O)C(O)R†、-C(O)CH2C(O)R†、-S(O)2R†、-S(O)2NR† 2、-C(S)NR† 2、-C(NH)NR† 2、又は-N(R†)S(O)2R†[式中、各R†は、独立に、水素、下記で規定される通りに置換されうる、C1〜6による脂肪族、非置換の-OPh、又は非置換で5〜6員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である環、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される、0〜4個のヘテロ原子を有するアリール環であるか、或いは、上記の定義にも拘らず、2つのR†の独立の存在は、それらの介在原子と併せて、非置換で、3〜12員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である環、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される、0〜4個のヘテロ原子を有するアリールによる、単環式若しくは二環式の環を形成する]を含む。
R†の、脂肪族基上の、適切な置換基は、独立に、ハロゲン、-R●、-(ハロR●)、-OH、-OR●、-O(ハロR●)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR●、-NH2、-NHR●、-NR● 2、又は-NO2[式中、各R●は、非置換であるか、又は、「ハロ」を前置する場合は、1若しくは複数のハロゲンだけで置換されており、独立に、C1〜4の脂肪族、-CH2Ph、-O(CH2)0〜1Ph、又は5〜6員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である環、又は窒素、酸素、若しくは硫黄から独立に選択される、0〜4個のヘテロ原子を有するアリール環である]である。
本明細書で使用される、「薬学的に許容される塩」という用語は、不要な毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに、ヒト及び下等動物の組織と接触させるときの適切な使用のための、適正な医療判断の範囲内にあり、妥当な有益性/危険性比に相応である塩を指す。当技術分野では、薬学的に許容される塩が周知である。例えば、S. M. Bergeらは、参照により本明細書に組み込まれる、J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19において、薬学的に許容される塩について詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、適切な無機酸及び有機酸と、無機塩基及び有機塩基とに由来する塩を含む。薬学的に許容される、非毒性の酸添加塩の例は、アミノ基の、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、若しくはマロン酸などの有機酸と共に形成される塩、或いはイオン交換法など、当技術分野で使用される他の方法を使用することにより形成される塩である。他の薬学的に許容される塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。
適切な塩基に由来する塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、及びN+(C1〜4アルキル)4塩を含む。代表的なアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩は、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などを含む。さらなる、薬学的に許容される塩は、適切な場合、ハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、低級アルキルスルホン酸イオン、及びアリールスルホン酸イオンなどの対イオンを使用して形成される、非毒性のアンモニウムカチオン、四級アンモニウムカチオン、及びアミンカチオンによる塩を含む。
そうでないことが言明されない限りにおいて、本明細書で描示される構造はまた、構造の全ての異性体[例えば、光学異性体、ジアステレオマー、及び幾何異性体(又は立体配座異性体)]型；例えば、各不斉中心についてのR及びS立体配置、Z二重結合異性体及びE二重結合異性体、並びにZ及びE立体配座異性体を含むことも意図する。したがって、本化合物の単一の立体化学異性体のほか、光学異性体、ジアステレオマー、及び幾何異性体(又は立体配座異性体)による混合物も、本発明の範囲内にある。そうでないことが言明されない限りにおいて、本発明の化合物の全ての互変異性型は、本発明の範囲内にある。加えて、そうでないことが言明されない限りにおいて、本明細書で描示される構造はまた、1又は複数の同位元素に富む原子の存在だけが異なる化合物を含むことも意図する。例えば、重水素若しくは三重水素による水素の置きかえ、又は13C又は14Cに富む炭素による炭素の置きかえを含む、本構造を有する化合物は、本発明の範囲内にある。このような化合物は、例えば、解析ツールとして、生物学的アッセイにおけるプローブとして、又は本発明に従う治療剤として有用である。
さらなる低分子化合物による阻害剤を同定するためのアッセイ
候補阻害剤はまた、FAPP2のGLTPドメイン、GLTP自体、及びGlcCerの、FAPP2との相互作用に基づく相同性モデル化など、コンピュータベースの合理的薬物デザイン法を使用してデザインすることもできる。複数の候補阻害剤(例えば、低分子化合物のライブラリー)を、in vitroスクリーニングアッセイにより、潜在的阻害剤について調べることが典型的である。
一部の実施形態では、薬物(FDAで承認された薬物を含む)を含有する公表ライブラリーをスクリーニングして、そのFAPP2モジュレーター活性が未だに知られていない既存の化合物を同定することができる。一部の実施形態では、当技術分野で周知の方法を使用して、既存の化合物の誘導体又は類似体を含有する修飾ライブラリーを合成し、これをスクリーニングして、新規のFAPP2阻害剤又は改善されたFAPP2阻害剤を同定することができる。適切な低分子化合物ライブラリーは、ChemBridge Libraries社(www.chembridge.com)、BIOMOL International社、ASINEX社、ChemDiv社、ChemDB社、ICCB-Longwood社などの販売元から得ることができる。加えて、デノボ合成された化合物ライブラリーをスクリーニングして、特異的なFAPP2阻害活性を有する新規の化合物を同定することもできる。一部の実施形態では、例えば、FAPP2の結晶構造に基づく、合理的薬物デザイン法を使用して、化合物を合成することができる。
適切なin vitroアッセイは、GlcCerをドナーからアクセプターへと移行するFAPP2の能力に基づきうる。例えば、FRETベースのGlcCer移行アッセイは、アクセプター小胞、蛍光標識されたGlcCerを含有するドナー小胞、失活剤、及び組換えFAPP2タンパク質に基づいてデザインすることができる。阻害剤は、FAPP2により媒介される、GlcCerの、失活させたドナー小胞から、失活させていないアクセプター小胞への移行時に生じる発光強度の回復に基づいて同定することができる。例示的なin vitroアッセイについては、実施例の節において詳細に記載する。当技術分野では、さらなるアッセイも公知であり、本発明に適応させることができる。
干渉オリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、本発明は、FAPP2を阻害するのに有用な干渉オリゴヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、一本鎖である。一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、二本鎖である。一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、二本鎖RNA分子、例えば、siRNA又はshRNAである。本発明に適する干渉オリゴヌクレオチドは、FAPP2の発現又は活性を阻害、低下、低減、又は下方調節することが可能な、任意のオリゴヌクレオチドを含む。
ヒトFAPP2遺伝子の発現を下方調節又は低下することが可能な干渉オリゴヌクレオチドは、ヒトFAPP2遺伝子又はFAPP2のメッセンジャーRNA(mRNA)の配列に基づいてデザインしうることが典型的である。FAPP2のゲノム配列(NC_000007.13、gi|224589819：30054478-30171458 Homo sapiens chromosome 7、GRCh37.p10 Primary Assembly)は、2013年7月25日現在、www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000007.13?report=fasta&from=30054478&to=30171458における、National Center for Biotechnology Information(NCBI)のデータベースにおいて入手可能であり、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。FAPP2 mRNAの任意のアイソフォームは、本発明の範囲内にあると想定され、アイソフォーム1、2、及び3を、下記のTable 1(表1)に示す。
例えば、ヒトFAPP2遺伝子の発現を下方調節又は低下することが可能な干渉オリゴヌクレオチドは、ヒトFAPP2遺伝子又はmRNAの連続配列の逆相補体と実質的に同一な配列を有しうる。一部の実施形態では、本発明に従う干渉オリゴヌクレオチドは、ヒトFAPP2遺伝子又はmRNAの連続配列の逆相補体と、少なくとも約50%(例えば、少なくとも約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%)同一な配列を有する。
代替的に、ヒトFAPP2遺伝子の発現を下方調節又は低下することが可能な干渉オリゴヌクレオチドは、FAPP2 mRNAの標的領域とハイブリダイズするか、又はこれに結合することが可能である。
干渉オリゴヌクレオチドの、FAPP2 mRNAの標的領域とのハイブリダイゼーションは、in vitroでもin vivoでも実施しうることが理解されるであろう。当技術分野で周知の通り、ハイブリダイゼーションは、低度のハイブリダイゼーション条件下で実施することもでき、中程度のハイブリダイゼーション条件下で実施することもでき、且つ/又は厳密なハイブリダイゼーション条件下で実施することもできる。一般に、厳密なハイブリダイゼーション条件とは、その下で、干渉オリゴヌクレオチドを含む核酸分子が、相補的な核酸配列を有する分子を同定するのに使用される、標準的なハイブリダイゼーション条件を指す。厳密なハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%以上の核酸配列の同一性を有する核酸分子の間の結合を許容することが典型的である。標準的な条件は、例えば、その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Sambrookら、1989, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressにおいて開示されている。当技術分野では、許容するヌクレオチドのミスマッチが50%、40%、30%、20%、10%、5%以下のハイブリダイゼーションを達成するのに適するハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件を計算する式が、例えば、その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Meinkothら、1984, Anal. Biochem. 138, 267-284において入手可能である。オリゴヌクレオチド(14〜20bp)と、固定化されたDNAとのハイブリッドは、安定性の低下を示すことが理解されるが、それらのハイブリダイゼーションに最適な条件を規定する場合に考慮に入れるべきである。
ハイブリダイゼーション条件の厳密性は、緩衝液のイオン強度、ヌクレオチドの塩基組成、二重鎖中で最も短い鎖の長さ(n)、及びホルムアミドなど、へリックス不安定化剤の濃度の影響を受ける可能性がある。例えば、ハイブリダイゼーションの厳密性は、塩濃度及び/若しくはホルムアミド濃度を調整することにより変化させることもでき、且つ/又は温度を変化させることにより変化させることもできる。厳密性は、ハイブリダイゼーション工程時に調整することもでき、ハイブリダイゼーション洗浄の後で調整することもできる。サザンブロット又はノーザンブロットにおけるフィルター上の、100を超える相補的な残基を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションのための、厳密なハイブリダイゼーション条件の例は、42℃で1mgのヘパリンを伴う、50%のホルムアミドであり、ハイブリダイゼーションは、一晩にわたり実行される。厳密な洗浄条件の例は、65℃で15分間にわたる、0.2倍濃度のSSCによる洗浄である。一部の実施形態では、高度の厳密性による洗浄の前に、低度の厳密性による洗浄を行って、バックグラウンドのプローブシグナルを除去する。例えば、100を超えるヌクレオチドの二重鎖のための、中程度の厳密性による洗浄の例は、45℃で15分間にわたる、100倍濃度のSSCである。例えば、100を超えるヌクレオチドの二重鎖のための、低度の厳密性による洗浄の例は、40℃で15分間にわたる、4倍濃度のSSCである。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおけるシグナル対ノイズ比が、非類縁プローブについて観察されるシグナル対ノイズ比の2倍(以上)であれば、特異的ハイブリダイゼーションの検出が指し示される。
本発明に適する、例示的な干渉オリゴヌクレオチドを、Table 2(表2)に列挙する。
一部の実施形態では、本発明に従う干渉オリゴヌクレオチドは、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、及び配列番号10のうちのいずれかと、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%同一な配列を有する。一部の実施形態では、配列は、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、及び配列番号10、及びこれらの組合せから選択される。
本発明に従う干渉オリゴヌクレオチドは、任意の適切な長さでありうることが理解されるであろう。例えば、一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、10〜50ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、10〜30ヌクレオチドの長さである。ある特定の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、15〜40ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、適切なsiRNAは、16〜22(例えば、16〜21、16〜20、16〜19、16〜18、17〜22、17〜21、17〜20、17〜19、18〜22、18〜21、18〜21、又は18〜20)ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、適切なsiRNAは、50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、又は15ヌクレオチド以下の長さである。一部の実施形態では、干渉オリゴヌクレオチドは、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、又は50ヌクレオチド以上の長さである。
本明細書で同定されるヌクレオチド配列に照らした「核酸配列の同一性パーセント(%)」は、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列決定し、必要な場合は、ギャップを導入した後における、候補配列内の、基準配列内のヌクレオチドと同一なヌクレオチドの百分率として規定される。核酸配列の同一性パーセントを決定することを目的とするアライメントは、当技術分野の技術の範囲内にある多様な方式で、例えば、BLASTソフトウェア、ALIGNソフトウェア、又はMegalign(DNASTAR社)ソフトウェアなど、市販のコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、アライメントを測定するのに適するパラメータであって、比較される配列の全長にわたり、最大のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。WU-BLAST-2ソフトウェア(Altschulら、Methods in Enzymology, 266, 460-480(1996)；http：//blast.wustl/edu/blast/README.html)を使用して、アミノ酸配列の同一性決定することが好ましい。WU-BLAST-2では、それらの大半がデフォルト値へと設定される、複数の検索パラメータが使用される。調整可能なパラメータは、以下：オーバーラップスパン=1、オーバーラップ分率=0.125、全体閾値(T)=11の値を伴うセットである。HSPスコア(S)及びHSP S2パラメータは、動的な値であり、特定の配列の組成に応じて、プログラム自体により確立されるが、最小値は、調整することができ、上記で指し示した通りに設定される。
化学修飾
本明細書で記載される、干渉オリゴヌクレオチドを含むRNA分子を化学修飾して、細胞内の安定性を増大させ、半減期を延長することができる。可能な修飾は、分子の5'末端及び/若しくは3'末端におけるフランキング配列の付加、又は分子の骨格内の、ホスホジエステラーゼ連結ではない、ホスホロチオエート(チオリン酸としてもまた公知の)連結の使用を含む。加えて、1又は複数のリボース基を、メチル部分を、2'-OHへと付加して、2'-メトキシ部分を形成する(2' O-メチル修飾されたと称する)ように修飾することもできる。また、2'-OH部分を、メチレンリンカー又はエチレンリンカーにより、リボースの3'-炭素又は4'-炭素へと、典型的には、メチレンリンカーにより4'-炭素へと連結して、「ロックト核酸」を形成することもできる(それらの内容が参照により本明細書に組み込まれる、WO 98/39352及びWO 99/14226を参照されたい)。
ある特定の実施形態では、化学修飾はまた、イノシン、クェオシン、及びワイブトシンなど、非定型的塩基のほか、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンの、アセチル-、メチル-、チオ-、及び他の同様な修飾形態であって、内因性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されない修飾形態の使用も含む。修飾塩基の例は、5位で修飾されたウリジン及び/又はシチジン、例えば、5-(2-アミノ)プロピルウリジン、5-ブロモウリジン；8位で修飾されたアデノシン及び/又はグアノシン、例えば、8-ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、7-デアザ-アデノシン；及びO-アルキル化ヌクレオチド及びN-アルキル化ヌクレオチド、例えば、N6-メチルアデノシンを含む。
ある特定の実施形態では、糖部分を、典型的には、リボースの2'-OHで修飾することができる。このような修飾の例は、2'OH-基を、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、又はON[式中、Rは、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニル、又はC1〜C6アルキニルであり、ハロは、F、Cl、Br、又はIである]から選択される基で置きかえる場合を含む。
さらに、化学修飾は、モルホリノ骨格などの修飾骨格、並びに/又はシロキサン連結、スルフィド連結、スルホキシド連結、スルホン連結、スルホネート連結、スルホンアミド連結、及びスルファメート連結；ホルムアセチル連結及びチオホルムアセチル連結；アルケン含有連結；メチレンイミノ連結及びメチレンヒドラジノ連結；アミド連結など、さらなる非天然のヌクレオシド間連結も包含しうる。
本明細書で記載される配列内の、1又は複数のヌクレオチド(又は連結)を修飾することができる。例えば、20マーのオリゴヌクレオチドは、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20の修飾ヌクレオチドを含有しうる。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、費用効果性を維持しながら、所望のレベルのin vivoにおける安定性及び/又はバイオアクセシビリティーを達成するのに必要な、最小限の修飾ヌクレオチドを含有するであろう。
医薬組成物
本発明はさらに、本発明に従う治療有効成分(例えば、干渉オリゴヌクレオチド、低分子、又はこれらの組合せ)を、1又は複数の薬学的に許容される賦形剤と併せて含む医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、任意選択で、1又は複数のさらなる治療活性物質も含みうる。
本明細書で提示される医薬組成物についての記載は、ヒトへの倫理的な投与に適切な医薬組成物を、主に対象とするが、当業者は、このような組成物は一般に、全ての種類の動物への投与に適切であることを理解するであろう。組成物を、多様な動物への投与に適切とするための、ヒトへの投与に適切な医薬組成物の改変は、十分に理解されており、獣医科薬理学の当業者は、このような改変を、行うとしても通常の実験だけで、デザイン及び/又は実施することができる。
本明細書で記載される医薬組成物の処方物は、任意の公知の方法、又は薬理学の技術分野で今後開発される方法により調製することができる。一般に、このような調製法は、有効成分を、希釈剤若しくは別の賦形剤及び/又は1若しくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、必要な場合及び/又は所望の場合は、生成物を、所望される単回又は複数回用量単位へと成型及び/又は包装する工程を含む。
本発明に従う医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、且つ/又は複数の単回単位用量として、調製、包装、及び/又は販売することができる。本明細書で使用される「単位用量」とは、所定量の有効成分を含む、個別量の医薬組成物である。有効成分の量は一般に、対象へと投与される有効成分の投与量、及び/又は、例えば、このような投与量の2分の1若しくは3分の1など、このような投与量の簡便な画分と同等である。
本発明に従う医薬組成物中の、有効成分、薬学的に許容される賦形剤、及び/又は任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の識別、体格、及び/又は状態に応じて、組成物が投与される経路にもさらに応じて変化するであろう。例を目的として述べると、組成物は、0.1%〜100%(w/w)の間の有効成分を含みうる。
加えて、医薬処方物は、薬学的に許容される賦形剤であって、本明細書で使用される通り、所望される特定の剤形に適する、任意及び全ての溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体媒体、分散補助剤又は懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存剤、固体の結合剤、滑沢剤などを含む賦形剤を含みうる。Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro(Lippincott、Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；参照により本明細書に組み込まれる)は、医薬組成物を調合するときに使用される多様な賦形剤、及びその調製のための公知の技法について開示している。任意の従来の賦形媒質が、任意の所望されない生物学的影響を及ぼすか、又は、これとは別に、医薬組成物の他の任意の成分と有害な形で相互作用することなどにより、物質又はその誘導体に対して不適合な場合を除き、その使用は、本発明の範囲内にあると想定される。一部の実施形態では、医薬処方物は、1又は複数の有効成分と、ジメチルスルホキシド(DMSO)とを含むであろう。
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の純度である。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒトにおける使用及び獣医科での使用について承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局により承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、医薬グレードである。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方(USP)、欧州薬局方(EP)、英国薬局方、及び/又は国際薬局方の基準を満たす。
医薬組成物の製造で使用される、薬学的に許容される賦形剤は、不活性の希釈剤、分散剤及び/若しくは造粒剤、界面活性剤及び/若しくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、滑沢剤、並びに/又は油を含むがこれらに限定されない。このような賦形剤は、任意選択で、医薬処方物中に組み入れることができる。ココアバター及び坐剤用蝋、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、並びに/又は芳香剤などの賦形剤も、調合者の判断に従い、組成物中に存在させることができる。
薬剤の調合及び/又は製造における一般的な検討事項は、例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005(参照により本明細書に組み込まれる)において見出すことができる。
投与
本発明の方法では、本明細書で記載される、治療有効量の治療剤の、単回投与のほか、複数回投与も想定される。治療剤(例えば、干渉オリゴヌクレオチド、低分子、又はこれらの組合せ)は、対象の状態の性格、重症度、及び広がりに応じて、規則的な間隔で投与することができる。一部の実施形態では、治療有効量の、本発明の治療剤は、規則的な間隔で[例えば、毎年1回、6カ月ごとに1回、5カ月ごとに1回、3カ月ごとに1回、隔月(2カ月ごとに1回)、毎月(毎月1回)、隔週(2週間ごとに1回)、毎週]定期的に、静脈内投与、経口投与、及び/又は経皮投与することができる。
一部の実施形態では、送達は、静脈内投与を介する。他の実施形態では、投与は、皮下投与、筋内投与、非経口投与、経皮投与、又は経粘膜(例えば、経口又は経鼻)投与でありうる。
一部の実施形態では、提供される干渉オリゴヌクレオチド化合物は、本明細書で記載される異なる経路を介して、多様な方法で、哺乳動物へと投与することができる。例えば、干渉オリゴヌクレオチド化合物は、静脈内注射により投与することができる。Songら、Nature Medicine, 9：347-351(2003)を参照されたい。干渉オリゴヌクレオチド化合物はまた、任意の適切な局所投与法により、特定の臓器又は組織へと直接送達することもできる。また、siRNAなどの干渉オリゴヌクレオチドを、動物へと送達するための他の複数の手法も奏効することが実証されている。例えば、McCafferyら、Nature, 418：38-39(2002)； Lewisら、Nature Genetics, 32：107-108(2002)及びXiaら、Nature Biotech., 20： 1006-1010(2002)を参照されたい。代替的に、干渉オリゴヌクレオチドは、リポソーム内に封入して送達することもでき、イオントフォレーシスにより送達することもでき、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生体分解性ナノカプセル、及び生体接着性マイクロスフェアなど、他の媒体への組込みにより送達することもできる。
上記で記載した通り、「治療有効量」という用語は大部分、本発明の医薬組成物中に含有される治療剤の全量に基づいて決定される。治療有効量は一般に、複数回単位用量を含みうる投与レジメンにより投与される。任意の特定の組成物では、治療有効量(及び/又は有効な投与レジメン内の適切な単位用量)は、例えば、投与経路又は他の薬剤との組合せに応じて変化しうる。
任意の特定の対象では、具体的な投与レジメンを、個別の必要及び酵素置換療法の投与を実施又は監視する担当者の専門的判断に従い、時間経過に応じて調整すべきであり、本明細書で示される投与量範囲は、例示的なものであるに過ぎず、特許請求される本発明の範囲又は実施を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかし、実施例は、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。全ての文献の引用は、参照により組み込まれる。
特定の実施例において、そうでないことが記載されない限りにおいて、各実施例で使用される試薬、プロトコール、及び構築物については、下記で記載する。各場合に、当業者は、特定の試薬又は手順の変化が、許容可能な同等物であることを認識するであろうし、これらの代替物は、本記載の一部と考えられることが想定される。下記の実施例は、具体的な例示的実施形態を提示することだけを意図するものであり、限定的であることを意図するものではない。
試薬及び抗体
以下の実施例で使用される化学試薬は、解析グレード以上の試薬であり、そうでないと指定されない限りにおいて、Sigma社から購入した。細胞培養培地は、Invitrogen社製とした。ヒトFAPP2、ヒトBet3、ヒトcPLA2IVa、及びヒトGM130に対するポリクローナル抗体は、グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質を免疫原として使用して、ウサギにおいて作製した。全てのポリクローナル抗体は、それらの対応する免疫原上でアフィニティー精製した。抗ts045-VSVGクローンであるP5D4、抗Flag M5抗HAモノクローナル抗体、並びに抗ウサギIgG Cy3コンジュゲート抗体及び抗マウスIgG Cy3コンジュゲート抗体は、Sigma社製とした。Alexa 488コンジュゲートコレラ毒素B断片は、Invitrogen社製とした。Cy3コンジュゲート志賀毒素B断片は、記載されている20通りに調製した。GM3(クローン2590)に対するマウスモノクローナル抗体は、Cosmo Bio Co社製とした。TGN46に対するヒツジポリクローナル抗体は、AbD Serotech社製とした。Alexa 488ヤギ抗マウスIgG(H1L)抗体及びAlexa 488ヤギ抗ウサギIgG(H1L)抗体は、Molecular Probes社製とした。全ての非標識の精製脂質は、Avanti Polar Lipids社製とした。3H-スフィンゴシンは、PerkinElmer社製とした。GSLの原液は、クロロホルム/メタノール(容量で2：1)中で調製し、他の脂質の原液は、ヘキサン/2-プロパノール(容量で3：2)中で調製した。脂質溶液は、暗所内-20℃で保管し、使用前に室温へと加熱した。
細胞培養物
HeLa細胞、Meb4細胞、GM95細胞、HepG2細胞、HK2細胞、COS7細胞、及びMDCK細胞を増殖させ、記載されている1通りに、TransIT-LT1(Mirus Bio社)で、一過性にトランスフェクトした。安定発現HeLa-GM3S細胞は、3XHA-GM3Sをコードするプラスミドのトランスフェクション、及びG418(Invitrogen社)の存在下における選択、及び間接的免疫蛍光によるモノクローナルコロニーのスクリーニングの後で得た。
GSLの測定
3H-スフィンゴシン又は14C-ガラクトースによる代謝標識、GSLの抽出、及び高速薄層クロマトグラフィー、及び解析は、記載されている1及び6通りに実施した。
GSL及び輸送の測定
細胞内タンパク質の局在化を評価するための、3H-スフィンゴシンによる代謝標識研究、免疫蛍光研究、及び免疫電子顕微鏡研究、は、記載されている1通りに実施した。VSVGの温度感受性突然変異体(ts045-VSVG)の輸送は、既に記載されている21通りに評価した。タンパク質精製研究、及び蛍光研究は、記載されている22、23通りに実施した。
免疫蛍光解析及び形態計測解析
全ての免疫蛍光実験は、既に記載されている1、14通りに実施した。画像は、LSM 710(Zeiss社)共焦点顕微鏡を使用して得られる共焦点光切片である。共局在化解析は、記載されている14通りに、又はImageJのためのJACoP v2.0アプリケーション内に組み入れられたオブジェクトベースの共局在化法16を使用することにより実施した。略述すると、ノコダゾール処置細胞内の個別の小型層板を、オブジェクトと考え、それらの質量中心位置は、セグメンテーション後に計算し、2つの顕著に異なる標識付け(すなわち、Gb3S/TGN46、又はGM3S/TGN46)についての質量中心位置の、単一の小型層板内の完全な一致を、陽性の共局在化イベントと考えた。
免疫電子顕微鏡法
免疫電子顕微鏡法は、トランスフェクトされたHeLa細胞内、Meb4細胞内、及びGM95細胞内で、既に記載されている1通りに実施した。
組織学的解析
組織学的解析及び免疫蛍光顕微鏡解析及びX-Gal解析は、既に記載されている通り24に実施した。
プラスミド及び構築物
以下の実施例で使用される構築物のうちのいくつかは、RT-PCRにより、HeLa RNAから得、適切なベクターへとクローニングした。略述すると、全RNAを、HeLa細胞から単離し、ポリdTオリゴを、プライマーとして使用して、RT-PCRを実施した。得られたcDNAは、
Gb3Sには、
5'-GTTGAATTCGATCTGGGGATACCATGTCC-3'(配列番号20)
5'-CACCTCGAGCAAGTACATTTTCATGGCCTC-3'(配列番号21)
GM3Sには、
5'-CAGGAATTCAGAATGAGAAGGCCCAGCTTGTTA-3'(配列番号22)
5'-AACGCGGCCGCTGAAATTCACGATCAATGCCTCCA-3'(配列番号23)
LCSには、
5'-ATAGAATTCTGGCTGCAGCATGCGCGC-3'(配列番号24)
5'-CGCGATATCAAGTACTCGTTCACCTGAGCCA-3'(配列番号25)
をプライマーとして使用するPCRのための鋳型として使用した。
PCR産物は、直鎖化されたpCR2.1ベクターへとクローニングし、自動式シークエンシングのために処理した。クローニングされた配列の全ては、ヒトGb3S(AF513325)(配列番号26)、ヒトGM3S(AY152815.2)(配列番号27)、及びヒトLCS[(B4GALT5)(配列番号28)；(NM_004776)(配列番号29)]のそれぞれについてのデータベースで報告される配列にマッチした。次いで、多様なコード配列に対応するDNAを、p3XHA又はp3XFLAGのEcoRI/XhoI(Gb3S)部位；EcoRI/NotI(GM3S)部位；EcoRI/EcoRV部位へとサブクローニングした。
GFP-FAPP2-wt構築物及びW407A構築物は、記載されている1通りに得、GFP-diFAPP2PH-wt及びE50Aは、以下の通りに得た：
GFP-FAPP2-wt DNAを、
PCR a)
5'-TCTGAATTCATGGAGGGGGTGCTGTACA-3(配列番号30)
5'-TATGGTACCGAGCAAGCAAGCCTTGGCTGATCCC-3(配列番号31)
PCR b)
5'-TATGGTACCTTGCTGGAGGGGGTGCTGTACAAGTG-3(配列番号32)
5'-TCACTCGAGTTAGCAAGCCTTGGCTGATCC-3(配列番号33)
をプライマーとして使用する、2つの顕著に異なるPCR反応のための鋳型として使用した。
PCR a)からの産物を、ベクターpEGFP-C1のEcoRI/KpnI部位へとサブクローニングして、構築物pEGFP-FAPP2PHを得た。その後、PCR b)からの産物を、pEGFP-FAPP2PH構築物のKpnI/XhoI部位へとサブクローニングして、GFP-diFAPP2PH-wtを得た。GFP-FAPP2-E50A DNAを鋳型として使用して、GFP-diFAPP2PH-E50A突然変異体を得るのにも、類似の手順を適用した。GFP-FAPP2-E50Aは、プライマー：
5'-GAGCATACAAATGGCAGTCTGTGCAATTCAAGTTCATTCTGTAG-3'(配列番号34)
5'-CTACAGAATGAACTTGAATTGCACAGACTGCCATTTGTATGCTC-3'(配列番号35)
を使用する部位特異的突然変異誘発により、GFP-FAPP2-wtから得た。
統計学的解析
そうでないと指定されない限りにおいて、統計学的解析のためには、両側スチューデントt検定を、データへと適用した。単一のアステリスク=P<0.05；2つのアステリスク=P<0.01；3つのアステリスク=P<0.005である。
(実施例1)
マウスにおけるFAPP2遺伝子アブレーション
細胞のシグナル伝達、接着、増殖、及び分化において重要な役割を果たす2、複合グリコスフィンゴ脂質(GSL)は、ゴルジ複合体内で、一般的な前駆体である、グルコシルセラミド(GlcCer：glucosylceramide)から合成される。GlcCerは、セラミド(Cer)から、GlcCerシンターゼ(GCS)により、初期ゴルジ膜の細胞質ゾル小葉において合成される3、4。内腔小葉へと転位されると、GlcCerは、ラクトシルセラミド(LacCer)へとガラクトシル化され、次いで、これは、後のゴルジ区画内で、複合GSLの異なる系列へと転換される(図1a)5。GlcCerのゴルジ複合体を通した輸送は、膜トラフィッキングを介してなされる場合もあるが、細胞質ゾルGlcCer移行タンパク質であるFAPP2の、複合GSLの合成を促進する作用に起因する非小胞移行を介してなされる場合もある1、6。しかし、GlcCerに対する非小胞輸送及び小胞輸送のそれぞれの役割は、依然として規定されていない7。
この問題に取り組むために、下記で記載される通りに、FAPP2ノックアウト(FAPP2-/-)マウスを作り出し、マウスにおけるFAPP2遺伝子アブレーションの帰結について解析した(図1b〜d及び図8a)。
FAPP2ノックアウトマウスの確立
全ての動物手順は、Animal Care and Experimentation Committee of Gunma Universityのガイドラインに従って実施し、全ての動物は、Institute of Animal Experience Research of Gunma Universityにおいて飼育した。本発明者らは、既に記載されているノックアウト系23を使用して、FAPP2-/-マウスを作り出した。略述すると、FAPP2遺伝子は、129Sv/Jマウス株(RPCI-22：Children's Hospital、Oakland Research Institute)に由来するマウスゲノムBACライブラリーから単離した。FRTで挟んだSA-IRES-β-geo-ポリAカセットを、FAPP2ターゲティングベクター内のイントロン4へと導入し、loxP部位を、イントロン3へと導入した(図8)。組換えES細胞クローンを同定し、ヘテロ接合マウス(FAPP2geo/+)を作り出した。geo/+マウスを、Flpレコンビナーゼを遍在的に発現させるトランスジェニックマウスと交配することにより、SA-IRES-β-geo-ポリAカセットを切り出す(flox/flox)ことが期待され、遺伝子の発現が回復されるであろう。本発明者らは、結果として得られるflox/floxマウスを使用して、それらを、Creトランスジェニックマウスと交配することにより、条件付けFAPP2ノックアウトを作り出した。
以下のプライマー：
5'-GTGCAGGCTGATACGATACTGCAGA-3'(プライマー1)(配列番号11)、
5'-GGATCAAGGCGATGACGTGGATTTC-3'(プライマー2)(配列番号12)、
5'-CCGTACAGTTCCACAAAGGCATCCT -3'(プライマー3)(配列番号13)、
5'-TGGCTGCAGAGCCTTGCTGGTAATG -3'(プライマー4)(配列番号14)、
5'-GTCCCCGGTGATGCTGTGATTGTGA -3'(プライマー5)(配列番号15)
を、PCR解析による遺伝子型解析に使用した。
プライマー1(配列番号11)及びプライマー2(配列番号12)により、FAPP2の野生型対立遺伝子を検出し、プライマー1(配列番号11)及びプライマー3(配列番号13)により、FAPP2のgeo対立遺伝子を検出し、プライマー4(配列番号14)及びプライマー5(配列番号15)により、FAPP2のヌル対立遺伝子を検出した。
全RNAは、RNAiso(宝酒造株式会社)を使用する、フェノール/クロロホルム抽出手順により、成体マウスに由来する臓器から抽出した。3μgの全RNAを、オリゴ(dT)でプライミングして、逆転写酵素により、第1の鎖であるcDNAを合成した。PCRに使用したプライマーは、以下：
FAPP2センスプライマー： 5'-CTCGCATGGACCTCATCATC-3'(配列番号16)、
FAPP2アンチセンスプライマー： 5'-GATGCTGCAATCCACCTCTG-3'(配列番号17)、
GAPDHセンスプライマー： 5'- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'(配列番号18)、
GAPDHアンチセンスプライマー： 5'- TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(配列番号19)
の通りであった。
FAPP2-/-マウスでは、FAPP2は発現しないことを確認するため、FAPP2特異的抗体を使用して、FAPP2-/-マウスからの細胞抽出物のウェスタンブロットを実施した。図1dは、FAPP2-/-マウスに由来する粗抽出物中では、FAPP2タンパク質が検出されなかったことを示す。
(実施例2)
FAPP2の枯渇は、C12-BODIPY-Gb3の合成を選択的に阻害する
FAPP2ノックアウト(FAPP2-/-)マウスは、顕性の表現型を示さなかった。しかし、FAPP2が高度に発現する(図1b及び8b)腎臓内のGSLを視覚化したところ、GSLの1つのクラスの特異的減少が強調された。Gb3に結合する志賀毒素B断片(ShtxB)8、GM1に結合するコレラ毒素B断片(ChtxB)9、及び抗GM3抗体を使用して、GSLの分布を視覚化したところ、既に報告されている、マウス腎臓におけるGb3の分布10、11が確認され、FAPP2-/-腎臓内のGb3染色の選択的低減が示されて、生化学測定値とも符合した(図1e、f)。同様の結果は、FAPP2-/-マウスから単離された初代腎尿細管細胞内でも得られた(図9a、b、d)。
FAPP2は、LacCerに由来する複数のGSL分枝の分岐と一致する、その進化におけるいくぶん最近の出現12に沿って、in vivoにおけるGSLの1つの分枝(すなわち、グロボシド、図1a、e、f)を選択的に制御する。さらに、FAPP2-/-マウスにおける顕性の表現型の欠如は、Gb3シンターゼ(Gb3S)KOマウスにおける表現型の欠如を緊密に想起させる11。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、本発明は、Gb3S KOマウスにおける表現型の欠如は、他のGSLによる代償性活性に起因する可能性もあり、且つ/又は表現型が顕在化するのに十分な刺激への依存に起因する可能性もあることを提起する。
異なるGSL種についての詳細な解析は、3H-スフィンゴシンで標識されたHeLa細胞内で新規に合成されたGSLを検討して実施した(図2及び11)。FAPP2の枯渇は、全ての時点において、3H-LacCer及び3H-Gb3の合成を阻害した(図2及び11a)。しかし、FAPP2 KDはまた、早期の時点において、3H-GlcCerの合成も阻害し、結果としてまた、3H-GM3のレベルも低下させた(図2a及び11a)。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、3H-GlcCer合成の阻害はおそらく、局所的に蓄積された非標識のGlcCerの、GlcCerシンターゼに対する生成物阻害効果に起因すると考えられる1。
GlcCer合成の阻害に続発しうる、複合GSLの変化を回避するため、細胞を、C12-BODIPY-GlcCerで標識することにより、GlcCerの合成をバイパスした。図2bに示す通り、FAPP2の枯渇は、C12-BODIPY-Gb3の合成を選択的に阻害したが、C12-BODIPY-GM3の合成は選択的に阻害しなかったことから、FAPP2枯渇の直接的な帰結は、Gb3合成の低下であり、GM3合成の低下ではないことが指し示される。GSLの生合成に関与する酵素の系統的サイレンシング(図1c、11b、及びc)は、FAPP2のサイレンシングにより誘導されるGSLプロファイルが、LacCerシンターゼ(LCS)のサイレンシングにより誘導されるGSLプロファイルと、LacCerの低下に関しては類似するが、LCS KDが、Gb3及びGM3の一様な低下を誘導するのに対し、FAPP2 KDは、Gb3の合成を選択的に低下させるので、下流におけるGSL種に対するそれらの効果では異なることが強調された。これらの結果は、FAPP2を介して輸送されたGlcCerは、グロボシド(すなわち、Gb3)の合成に特異的に向けられたLacCerのプールにフィードすることを指し示した。
(実施例3)
GSL合成についてのフラックス解析及び数学的モデル化
GSL代謝フラックスの動的評価に続く、数学的モデル化により、実施例2で記載したデータ(図12)を裏付けた。平均して、FAPP2枯渇の、新規に合成されたプールに対する効果(図2b)は、おそらく、GSLサルベージ経路の、Gb3の定常状態レベルへの寄与に起因して、Gb3の定常状態レベルに対する効果(図1及び図2a)より顕著であった。
SLの代謝フラックスを評価するため、FAPP2-KD HeLa細胞及びモック処置されたHeLa細胞(トランスフェクション媒体で処置されたHeLa細胞)を、3H-スフィンゴシンで2時間にわたりパルスした後で、0、2、6、及び24時間にわたりチェイスした(図11a)。FAPP2-KD細胞内のCerの減失速度及びSMの産生速度は、対照細胞と同等であったが、全体的なSMレベルは、全ての時点において、著明に高レベルであった。既に報告した1通り、早期の時点では、FAPP2-KD細胞内のGlcCerレベルは、おそらく、GlcCerの減失が損なわれ、実際、時間経過に応じて蓄積される結果としての、GlcCerの、GCSに対する生成物阻害効果に起因して、低レベルであった。驚くべきことに、FAPP2-KD細胞内では、Gb3及びLacCerの合成は、阻害されたが、GM3の合成は、阻害されなかった。
上記の解析により、FAPP2の枯渇は、GSL代謝の複雑な再構成を誘導することが指し示され、この再構成が、GlcCer輸送が損なわれたことの直接の帰結であるのか、さらなる効果を想定すべきであるのかについての疑問が提起された。この疑問に取り組むため、図11aに示される実験データに基づいて、数学的モデルを構築した。GSL反応は、質量作用の法則に従い、常微分方程式(ODE)により、一次反応としてモデル化した。FAPP2の枯渇が、CerからSMへと至る合成工程(k1)、SMからCerへと至る合成工程(k1R)、CerからGlcCerへと至る合成工程(k2)、GlcCerからLacCerへと至る合成工程(k3)、LacCerからGb3へと至る合成工程(k4)、又はLacCerからGM3へと至る合成工程(k5)に対応する反応速度(k1〜k5)に代替的に影響する、異なる状態を考えた。加えて、k3A及びk3Bを、それぞれ、Gb3及びGM3の合成に向けられた、LacCerの2つのプール(LacCerA及びLacCerB)をもたらす反応速度として導入した(図12a)。GSLの転換についてのODEは、
と読まれる。
反応速度(k1〜k5)は、SBPDと組み合わせた、MATLABツールボックスのSBツールボックス2[www.sbtoolbox2.org]及び局所最適化法である「SBsimplex」を使用して最適化した。最良の当てはめは、目的関数、又は、ここでは、実験によるデータ点と、シミュレーションによるデータ点との距離の二乗として選択される、費用関数(CF)を最小化することにより得た。初期シミュレーションでは、全ての反応速度は、モック処置細胞及びFAPP2-KD細胞について同じ値をとるように要求された(帰無仮説、図12bのN)。後続のシミュレーションでは、モック処置細胞とFAPP2-KD細胞との間で、反応速度を、1回に1つずつ(Nで割り当てられた値に照らして、0.01〜10倍)変化させた(図12b)。最低値のCF(0.019)は、FAPP2の枯渇が、k3A、すなわち、GlcCerからLacCerAへの転換に影響を及ぼすようにモデル化された場合に得られた。したがって、k3Aの低減(0.045から0.0063への)は、FAPP2-枯渇の、GSL代謝フラックスに対する全体的な効果を最もよく説明する変化である。この状態に対応するシミュレーションを、図12cに示す。
(実施例4)
FAPP2は、GlcCerの、シスゴルジからTGNへの移行を駆動する
Gb3合成のFAPP2の枯渇に対する感受性と、GM3合成のFAPP2の枯渇に対する感受性とが異なる原因となる機構について探索するため、Gb3S及びGM3シンターゼ(GM3S)のゴルジ内分布について、2つの独立の手法7を組み合わせることにより研究した。第1に、ゴルジ扁平婁(であり、TGNではない)を、小胞体(ER)へと再分配し(ER-ゴルジ間混合区画を作り出す)、この混合区画からTGNへの小胞トラフィッキングを妨害し13、FAPP2を、ゴルジ膜から放出する14真菌性毒素である、BFAで処置された細胞内のGb3及びGM3の合成を測定した。BFA処置は、Gb3の合成は低下したが、GM3の合成は低下しなかったことから、内因性Gb3Sの主要な画分(であり、内因性GM3Sの主要な画分ではない)は、TGN内に存在し、したがって、BFA誘導性ER-ゴルジ間混合区画内で合成されるその基質から隔離されたままであることが指し示される(図3a)。第2に、内因性酵素の免疫局在化に適する抗体が利用できないため、GM3S及びGb3SのHAタグ付け形態の分布について解析した(図3b、c)。
HeLa細胞内のLCS及びGM3Sの局在化
GM3又はGb3の合成に向けられた、2つの顕著に異なるLacCerプールについて解析して、それらが、同じLacCerシンターゼ(LCS)により産生されたのか、異なる酵素により産生されのかを決定した。B4GALT5遺伝子及びB4GALT6遺伝子のいずれもが、LCSをコードすることが報告されている31ので、第1の工程は、HeLa細胞内のLCSの分子的性格を規定することであった。HeLa細胞内のB4GALT5遺伝子産物又はB4GALT6遺伝子産物の発現をサイレンシングし(図15a)、これらの処置の、GSLレベルに対する効果を、3H-スフィンゴシンパルス標識により、24時間にわたり評価した。図15bに示す通り、B4GALT5 KDは、LacCer及び下流におけるGSL(Gb3及びGM3の両方、図2c、図15b)の合成のほぼ完全な阻害を誘導したが、B4GALT6 KDは、これらを誘導しなかった(図15b)。これらの結果は、免疫電子顕微鏡法(IEM)研究で評価される通り、低レベルの3XFlag-B4GALT5を発現させる細胞内の、ゴルジ扁平婁内及びTGN内の両方に存在する、同じLCSであるB4GALT5により、LacCerの2つのプールが作り出されることを指し示した(図15c、d)。
HA-GM3Sを発現させる細胞を、低発現細胞及び高発現細胞へと分類し(図16a及びb)、低発現細胞を、GM3Sの分布についての形態学的解析のために選択した(図3b、c)。HA-GM3Sは、低レベルで発現させると、主にゴルジ扁平婁内に局在化した(図3b、c)が、高レベルで発現させると、また、TGNにも局在化した(図16a及びb)。この観察を利用して、TGN内に存在するGSL合成酵素により使用される、TGNにおけるLacCerプールにフィードするには、GlcCerのシス-TGN間シャントを作動させるFAPP2の能力が要求されるという仮説に取り組んだ。GM3の合成が、FAPP2を要求したのかどうかについて探索するため、高レベルの3XHA-GM3Sを発現させる、安定的なHeLa細胞クローン(HeLa-GM3S)を単離したところ、GM3Sの著明な画分が、TGN内に存在した。HeLa-GM3Sは、Gb3の産生を代償にして、親HeLa細胞の約7倍のGM3を産生した(図16c)ことは、且つての報告15と符合する。GM3の合成が、BFA処置に対して感受性となり(図16d)、興味深いことにまた、FAPP2 KDに対しても感受性となった(図16e)ことは、これらの細胞内のIEMにより認められる、TGNにおけるGM3Sの異所性局在化と符合し、したがって、この区画内に存在するGSL合成酵素の活性には、GlcCerをTGNへと移行するFAPP2の能力が要求されるという、これらのデータを裏付ける。
Gb3SがTGN内で濃縮された16のに対し、GM3Sは、ゴルジ扁平婁内で濃縮された。さらに、BFAにより、GM3SはERへと再分配されたが、Gb3SはERへと再分配されなかった(図13)ことも、GSLの合成に対するその効果(図3a)と符合する。これらのデータは、HeLa細胞系内、HepG2細胞系内、MDCK細胞系内、MEF細胞系内、及びHK2細胞系内で確認された(図14)。
TGNにおけるグロボシドの合成は、FAPP2が作動させる、GlcCerの非小胞輸送に依拠するが、ゴルジ扁平婁内のGM3の合成はこれに依拠しないことから、GM3の合成は、GlcCerの非小胞輸送ではなくて、GlcCerの小胞輸送に依拠するのかどうかについての疑問が喚起される。この疑問に取り組むために、細胞を、ジクマロールで処置するか、cPLA2を枯渇させるか16、又はTRAPP複合体成分であるBet3を枯渇させることにより、ゴルジ内の膜トラフィッキング1を阻害し、レポータータンパク質であるts045 VSV-G(VSVG)の輸送を追跡した14。これらの処置は、VSVGのゴルジ内の進行を抑制し、GM3の合成を強く阻害したが、Gb3の合成は阻害せず、したがって、GM3/Gb3比の低下がもたらされた(図3d、e)。VSVGの温度感受性突然変異体(ts045-VSVG)の輸送は、既に記載されている21通りに評価した。
これらのデータは、GlcCerの小胞輸送が、ゴルジ扁平婁内でもたらされ、GM3の生合成に使用される、LacCerのプールにフィードするのに対し、FAPP2を介するGlcCerの非小胞輸送は、TGN内でもたらされ、グロボシドの生合成のために、この区画内で使用される、LacCerのプールにフィードするという仮説を裏付ける。この仮説は、いくつかの鍵となる予測：(i)LCSは、ゴルジ扁平婁内だけでなく、また、TGN内にも存在するという予測、(ii)Gb3と同様に、TGNにおいてもたらされる他のLacCer誘導体も、FAPP2に依存するという予測、及び(iii)GM3Sの局在化を、ゴルジ扁平婁から、TGNへと人工的にシフトさせると、GM3の合成は、FAPP2の枯渇に対して感受性となるという予測をもたらした。これらの予測の全ては、検証された。第1に、LCSは、ゴルジ扁平婁及びTGNのいずれにも局在化することが見出された(図15c、d)；第2に、SK-N-MC神経細胞内のFAPP2 KDは、GalNAcの、LacCerへの付加により、TGN内でもたらされる、GA2の合成を、選択的に低下させた(図1a)；第3に、正常では、FAPP2の枯渇に対して非感受性であるGM3の合成が、酵素の過剰発現により、GM3Sの著明な画分を、TGNに局在化するように仕向けると、感受性となる(図16b〜d)。
GSLがTGNにおいて合成されるための、FAPP2への選択的要求は、FAPP2を枯渇させた細胞は、TGNにおいて、GlcCerを濃縮させないというかつての観察1と併せて、FAPP2が、GlcCerの、GlcCerが合成されるシスゴルジから、TGNへの移行を駆動し、この有向輸送は、いかにして維持されるのかという疑問を提起することを指し示す。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、本発明は、シスゴルジ-TGN間のGlcCerの移行を媒介するために、apo FAPP2が、初期ゴルジ膜へと優先的にターゲティングされるのに対し、GlcCerに結合したFAPP2は、TGNへと優先的にターゲティングされることを提起する。この仮説を検定するため、FAPP2-wtの分布を、GlcCerに結合することが不可能であり、したがって、恒常的にapo形態である、FAPP2の単一点突然変異体(FAPP2-W407A)1の分布と比較した。FAPP2-wtの主要な画分が、TGNに局在化するのに対し、FAPP2-W407A突然変異体の主要な画分は、ゴルジ扁平婁に局在化する(図4a〜c)。さらに、GlcCerを合成せず、FAPP2が常にapo FAPP2である細胞系(GM95細胞18)内では、FAPP2-wtは、TGNに局在化せず、主にゴルジ扁平婁内に存在した(図4c)。GlcCerに結合する能力がなく、GlcCerが欠如することの両方により、FAPP2は、そのapo形態をとるように仕向けられ、これにより、TGNによるFAPP2へのターゲティングが損なわれることから、GlcCerへの結合が、FAPP2によるTGNへのターゲティングを正に調節することが例示される。
(実施例5)
FAPP PH-E50Aドメイン突然変異体のARF動員活性についての解析
TGNにおけるFAPP2の局在化は、低分子のGTPaseであるARF1と、TGNにおいて濃縮されるホスホイノシチド20であるPtdIns4P14とに、同時に、且つ、独立に19結合する、そのPHドメインにより決定する。PtdIns4P結合性部位14又はARF結合性部位19における単一点突然変異は、単量体のPHドメインの、ゴルジ複合体への動員を消失させる(参考文献14を参照されたい；データは示さない)ことから、いずれの結合性部位も要求されることが指し示される。しかし、興味深いことに、di-PHが、ARF(di-PH-R18L)又はPtdins4P(di-PH-E50A)に対する2つの結合性部位を有するように、これらの突然変異を、FAPP PHドメインのタンデム形態(di-PH)へと導入すると、今度は、ゴルジ内分布は著明に異なる(図17)が、キメラタンパク質は、ゴルジ複合体へと局在化することが可能となる。
E50A突然変異は、in vitroにおける、FAPP1-PHドメインの、ARF1への結合を損なうことが示されている19。同じ突然変異を、FAPP2-PHドメイン内に導入して、GFP-FAPP2 PH-E50A発現構築物を調製した。GFP-FAPP2 PH-E50Aを、HeLa細胞内で発現させ、次いで、無傷細胞内でARF1に結合するその能力について査定した。ARF1に結合し、ARF-GAP1と競合するその能力14の結果として、そのタンデム形態におけるFAPP-PHは、ゴルジ膜上のARF1を安定化させる14。GFP-FAPP2 PH-E50Aのタンデム形態(diFAPP2-PH-E50A)を発現させたところ、diFAPP2-PH-E50Aは、diFAPP2-PH-wtと比較して、ARF1と相互作用するその能力を、無傷細胞内でもまた喪失したことを検証した(図17a)。
特に、PtdIns4Pへのアフィニティーを低下させ、ARF1へのアフィニティーを増大させた、突然変異体のFAPP-PHドメイン(di-PH-R18L)は、ゴルジ層板全体に分布するが14、ARF1へのアフィニティーを低下させ、PtdIns4Pへのアフィニティーを増大させた、突然変異体のFAPP-PHドメイン(di-PH-E50A)19は、TGNへと優先的に局在化する(図17c)ことから、2つのリガンドのうちで、FAPP2によるTGNへのターゲティングを指示するのは、PtdIns4Pであることが指し示される。
GlcCerに結合したFAPP2による、TGNとの優先的な会合について解析して、apo-FAPP2と比較して、GlcCerに結合したFAPP2が、PtdIns4Pへのアフィニティーを増大させるのかどうかを決定した。GlcCerローディング(下記及び図18で論じられる)は、表面プラズモン共鳴により測定される、FAPP2の、PtdIns4Pへの結合を増大させた(データは示さない)。
(実施例6)
FAPP2によるGlcCerローディングの評価
GlcCerローディング効率は、糖脂質移行タンパク質であるGLTPと比較して保存されている21、推定FAPP2-GlcCer結合性部位内の、鍵となるトリプトファン(W407)の存在を利用することにより測定した。GLTP25及びFAPP2のGLTPHドメイン21について報告されている通り、GlcCerの、全長FAPP2への結合により、トリプトファン蛍光強度の実質的な減少が誘導されたことは、トリプトファン蛍光発光最大値の、低波長へのシフトと符合する。FAPP2-W407A突然変異体について、変化が観察されなかったことから、観察された効果は、W407に関連する蛍光の失活に起因することが確認された(図18a)。25に記載されている手順を適用して、GlcCerをロードしたFAPP2の画分を計算した。略述すると、C8-GlcCerにより占有された結合性部位の画分(α)は、式
α=(F-F0)/Fmax
[式中、F0及びFは、それぞれ、C8-GlcCerの非存在下及び存在下における、FAPP2の発光強度であり、Fmaxは、完全にリガンド結合したFAPP2の発光強度、すなわち、C8-GlcCerが過剰であるときのFAPP2の発光強度である]により計算した。Fmaxは、1/(F-F0)を、1/Lと対比してプロットし、1/L=0[式中、Lは、全糖脂質濃度に等しい]を外挿することにより決定した。FAPP2によるGlcCerローディングを評価する、さらなる独立の手法として、GlcCerへの曝露時における、FAPP2 wt及びFAPP2-W407Aの円偏光二色性(CD：circular dichroism)スペクトルを解析した。GlcCerは、全長FAPP2wtのCDプロファイルに対しては、著明な変化を誘導したが、全長FAPP2-W407AのCDプロファイルに対しては著明な変化を誘導しなかった(図18b)。これらのデータは、FAPP2のGLTP相同性ドメインについて得られた結果21と符合した。
いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、本発明は、apo-FAPP2が、シスゴルジと会合し、ここで、apo-FAPP2が、GlcCerを獲得する結果として、FAPP2の、PtdIns4Pに対する高アフィニティーがもたらされる、「FAPP2サイクル」を提起する。次いで、FAPP2は、PtdIns4Pに富むTGNへと移動し、ここにGlcCerを送達する(図4d)。
これらのデータは、ゴルジ複合体における、GSL生合成の分枝についての新たな枠組みであって、2つの分枝が、2つの並行する順行性の輸送経路から、それらの一般的な前駆体であるGlcCerを受け取る枠組みを確立する(図4d)。これらは、ゴルジ扁平婁を横断し、ガングリオ系列のGSLをもたらすのに使用されるLacCerプールにフィードする、小胞性経路と、介在するゴルジ婁をバイパスして、GlcCerを、TGNへと送達するFAPP2により媒介され、その場でグロボ系列のGSLへと転換される、LacCerのTGNプールにフィードする、非小胞経路とである(図4d及び図1a)。より広い文脈では、これらのデータは、ゴルジ複合体を通してカーゴを輸送する異なる方式が、どのようにして、カーゴ自体を、顕著に異なり、他の点では潜在的に競合的な、グリコシル化経路へと方向づけるのかを示す。
FAPP2が、Gb3の合成を具体的に制御するという知見から、FAPP2は、Gb3の蓄積を特徴とする状態のための候補標的となる。これらは、Gb3を分解するリソソーム酵素である、α-ガラクトシダーゼA内の突然変異と連関するファブリー病により例示される。
(実施例7)
FAPP2の阻害は、ファブリー病患者に由来する細胞内のGb3の蓄積を低減する
本実施例では、FAPP2の阻害により、α-ガラクトシダーゼAを枯渇させたファブリー病患者に由来する細胞内のGb3の蓄積が減少することを裏付ける。
とりわけ、本実施例はまた、Cy3-志賀毒素を使用して、ファブリー病患者に由来する線維芽細胞内のGb3のレベル/分布についても記載する。
材料及び方法
siRNAによる処置
ヒトFAPP2(NM_001197026又はNM_001197026.1)(配列番号89)、ヒトGCS(NM_003358)(配列番号36)、ヒトBet3(NM_014408)(配列番号37)、ヒトB4GALT5(NM_004776)(配列番号38)、ヒトB4GALT6(NM_004775)(配列番号39)、ヒトSIAT9/GM3S(AY152815.2)(配列番号40)、ヒトA4GALT/Gb3S(NM_017436)(配列番号4)、ヒトPLA2(NM_001199562)(配列番号42)に対するsiRNAは、少なくとも3つのsiRNA二重鎖[Table 3(表3)]の混合物を含み、Dharmacon社から得た。HeLa細胞、HK2細胞、HepG2細胞、及びMDCK細胞を、12ウェルプレート内に30%コンフルエンスで播種し、製造元のプロトコールに従って、Oligofectamine(Invitrogen社)又はDharmafect4(Dharmacon社)により、120〜150pmolのsiRNAをトランスフェクトした。siRNAによる初期処置の72時間後に、細胞を直接処理した。サイレンシング効率は、ウェスタンブロット(図10)又は特異的プライマー[Table 4(表4)]を使用するq-PCR(図11)により査定した。
ファブリー病(FD)患者に由来する線維芽細胞内の、Gb3の測定
男性FD患者に由来する線維芽細胞は、患者による説明同意を得た後で、皮膚生検から導出した。正常で年齢を適合させた、対照の線維芽細胞は、Department of Pediatrics、Federico II University of Naplesの検査室において入手可能であった。全ての細胞系は、100U/mlのペニシリン及び100mg/mlのストレプトマイシンを補充した、ダルベッコ改変イーグル培地(Invitrogen社、Grand Island、NY)及び10%のウシ胎仔血清(Sigma-Aldrich社、St Louis、MO)中、5%のCO2を伴う37℃で増殖させた。細胞は、継代4〜6代後において、下記に指し示す実験手順に使用した。
FAPP2KD
FAPP2 KDは、ヒト線維芽細胞内で、D'Angelo ら、2013において記載されているプロトコールに従う、FAPP2-siRNAによる、96時間にわたる処置を介して達成した。siRNAの配列はまた、D'Angeloら、2013の「付録」においても指定されている。
(実施例8)
FRETベースのGlcCer移行アッセイ
本実施例では、薬物開発に使用されうるFAPP2阻害剤について、スクリーニングし、調べ、同定するのに使用しうる、例示的なin vitroアッセイについて例示する。
具体的には、アクセプター小胞[1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)の超音波処理により形成された]を、1mMのジチオトレイトール及び1mMのEDTAを含有する、10mMのNaH2PO4緩衝液、pH 7.4中に懸濁させ、BODIPYで標識されたGlcCer(表示の通り、1又は2モル%)を含有するドナー小胞及び失活剤として使用されるDilC18(3モル%)並びに組換えFAPP2タンパク質(表示の濃度の)と共にインキュベートした。
520nm(485nmの励起)における発光強度の回復は、失活させたドナー小胞から、失活させていないアクセプター小胞への、タンパク質により媒介されるGlcCerの移行時に生じた。
アッセイは、参考文献1及び参考文献25において記載されている通り、全長FAPP2(FL)及び不活性のFL FAPP2-W407A突然変異体を使用して実施した。407位のトリプトファンは、FAPP2の結合活性に極めて重要であることが裏付けられている。
小型単層小胞の超微細構造 小胞のサイズ及び形状は、NANOVANを陰性染色剤として使用して、電子顕微鏡により探索した。小胞のサイズは、直径30〜40nmの範囲にわたった。
フロリジン及びダパグリフロジンは、DMSO(100mM)中に再懸濁させた。アッセイは、4つの異なる濃度(1mM、500uM、200uM、100uM)で実行した。FAPP2 WT及びFAPP2 W407Aの両方を使用して、薬物の、蛍光発光に対する、可能な非特異的効果を強調した。まず、FAPP2、緩衝液中の、アクセプターである小型の単層小胞、及び薬物を含有する混合物を、96ウェルプレートへと添加し、プレートを、プレートリーダーへと、速やかに装填した。2秒間にわたる振とうの後、520nm(485nmの励起)における蛍光発光を、10秒間隔で5分間にわたり測定して、ベースラインの蛍光を計算した。次いで、ドナー小胞を、各ウェルへと添加し、表示の時間にわたり、再度読み取った。実験は、少なくとも3回にわたり繰り返し、各測定は、三連で実施した。
いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、本発明は、FAPP2を阻害することにより、ファブリー病患者に由来する細胞内のGb3の蓄積を低減しうることを提起する。これについて調べるため、FAPP2の発現を、siRNAにより低減し、Cy3-志賀毒素を使用して、ファブリー病患者に由来する線維芽細胞内のGb3のレベル/分布を査定した(図5)。6例の異なるFD患者[上記のTable 5(表5)で指定された突然変異]に由来する線維芽細胞を、非処置のまま放置するか、又はFAPP2に特異的なsiRNAで、72時間にわたり処置し、次いで、免疫蛍光のために処理し、Cy3-志賀毒素断片bでGb3について染色し(赤色)、リソソームマーカー(LAMP1、緑色)についても染色した。ファブリー病患者に由来する線維芽細胞は、全Gb3レベル(志賀毒素染色により査定される)の上昇を示し、リソソーム内のGb3の蓄積(LAMP1染色により査定される)が明らかとなった。FAPP2の枯渇により、染色の顕著な低下が誘導された。
加えて、siRNA及びshRNAを介して、HeLa細胞内のα-ガラクトシダーゼAの発現をノックダウンすること(例えば、細胞ベースのFDモデル)により、FAPP2を、ファブリー病(FD)患者のための標的としても検証した。図6は、FAPP2 KDが、α-ガラクトシダーゼAを枯渇させたHeLa細胞内のGb3の蓄積を低下させる、例示的な結果を例示する。α-ガラクトシダーゼAのKDは、細胞内区画内のGb3の蓄積を誘導し、この増大に、FAPP2の同時的な枯渇を対抗させた(図6)。これらのデータは、FAPP2の阻害が、ファブリー病の細胞モデルにおける、Gb3の蓄積を低下させることを確認する。
ファブリー病を処置するための薬物開発のための低分子を、スクリーニングし、同定するために、簡略型FRETベースin vitroスクリーニングアッセイを開発して、FAPP2を阻害しうる低分子についてスクリーニングした。簡略型FRETベースin vitroスクリーニングアッセイでは、GlcCerをドナーからアクセプターへと移行するFAPP2の能力について調べ、FAPP2の移行活性を阻害することが可能な低分子を同定する。flFAPP2を、Sumo-融合タンパク質として作製し、Rosetta細胞内でアッセイした。
FAPP2は、蛍光C11-GlcCerを、ドナーリポソームから、アクセプターリポソームへと、濃度依存的に移行する(図7a)。短鎖の非標識GlcCerは、FAPP2によるGlcCer移行活性についての競合により、移行を阻害することが可能であったが、セラミドはこれが可能でなかった(図7b)ので、移行活性は、GlcCerに極めて特異的である。C8-GlcCer及びC6-Cerのいずれの最終濃度も、10uMであった。
いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、本発明は、SGLT輸送体に作用して、グルコースの再吸収を阻害する、グルコシドフロリジンが、FAPP2阻害剤としてもまた作用することを提起する。これは、FAPP2のGLTPドメインの、GLTP自体に対する相同性モデル化により、且つ、GlcCerの、FAPP2との相互作用が、GlcCerのグルコシル部分により主に媒介されうることを仮定することにより裏付けられている。フロリジンについて、異なる濃度(100uM、200uM、5000uM、1mM)で調べたところ、薬物は、FAPP2によるGlcCer移行活性を阻害することが見出された(図7c)。驚くべきことに、フロリジンの誘導体であるダパグリフロジンは、阻害活性を有さなかった(図7d)。
(実施例9)
さらなるFAPP2阻害剤
抗糖尿病薬であるフロリジンを使用したときの有望な結果から出発して、他の抗糖尿病化合物が、FAPP2により媒介されるGlcCerの移行を阻害する能力についても調べた。in vitro移行アッセイを使用して、31の活性化合物を含有するSelleckchem Anti-Diabetic Libraryについて調べ、TAK-875を、FAPP2阻害剤として同定した。
TAK-875(Fasiglifam)とは、膵臓の膵島細胞内のGタンパク質共役受容体である、GPR40(遊離脂肪酸受容体1)の選択的アゴニストである。GPR40の活性化は、ベータ細胞からのグルコース依存的なインスリン分泌を改善し、最小限の低血糖症及びHbA1c(糖化ヘモグロビン)の改善を伴う。
TAK-875活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した(図19)。アッセイは、3つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、25uM)で、且つ、FAPP2を0.5uMとして実行した。TAK-875によるFAPP2活性の阻害は、15分間にわたり測定した。100uMのTAK-875は、FAPP2により媒介されるGlcCerの移行を著明に低減した(図19A)。図19Bは、時点ゼロにおける、100uMのTAK-875の、FAPP2の移行速度に対する効果を示す。
TAK-875の同定は、本発明者らに、他のGPRアゴニストについても調べるよう促した。グリホリン酸は、in vitroにおいて、活性が最も大きなFAPP2阻害剤であった。
グリホリン酸とは、遊離脂肪酸受容体(FFAR)である、GPR 120及びGPR 40に対する、新規の選択的アゴニストである。GPR120及びGPR40は、それらの内因性リガンドが、中程度鎖及び長鎖の遊離脂肪酸である、Gタンパク質共役受容体であり、インスリンの放出において、重要な生理学的役割を果たすと考えられている。
グリホリン酸活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した(図20)。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。グリホリン酸によるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。100uM及び50uMのグリホリン酸は、FAPP2により媒介されるGlcCerの移行を著明に低減した(図20A)。図20Bは、時点ゼロにおける、50uMのグリホリン酸の、FAPP2の移行速度に対する効果を示す。
また、TUG-891も、GPRアゴニストスーパーファミリーに属し、TAK-875及びグリホリン酸と同様に、in vitroにおいて、FAPP2移行活性をモジュレートすることが可能である。TUG-891は近年、長鎖遊離脂肪酸(LCFA)受容体4(FFA4；又はGPR120)に対する、強力で選択的なアゴニストとして記載された。
TUG 891活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した(図21)。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。TUG 891によるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。50uMのTUG-891は、50%のFAPP2移行活性を阻害する(図21A)。図21Bは、時点ゼロにおける、50uMのTUG-891の、FAPP2の移行速度に対する効果を示す。
FAPP2活性を阻害することが可能な薬物の新たなクラスの同定を追求して、本発明者らは、薬学的に活性な化合物の、より広範にわたる異質性のライブラリーについてスクリーニングした。選択されたライブラリーは、100%が承認薬(FDA、EMEA、及び他の規制機関)である、1280の低分子を含有する、Prestwick Chemical Library(登録商標)であった。
同定された薬物のうちの1つは、喘息の維持処置に使用される、システイニルロイコトリエン受容体1アンタゴニストである、プランルカストであった。興味深いことに、システイニルロイコトリエン(CysLT)は、アラキドン酸から合成される、炎症性脂質メディエーターのファミリーであり、これにより、プランルカストは、なぜ、FAPP2の、GlcCerへの結合を阻害することが可能であるのかが説明される。
プランルカスト活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した(図22)。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。プランルカストによるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。50uMのプランルカストは、90%のFAPP2移行活性を阻害する(図22A)。図22Bは、時点ゼロにおける、50uMのプランルカストの、FAPP2の移行速度に対する効果を示す。
ザフィルルカストとは、喘息の維持処置のための、経口ロイコトリエン受容体アンタゴニストLTRAである。ザフィルルカストは、Prestwick Chemical Library(登録商標)をスクリーニングすることにより、FAPP2阻害剤として同定されている。
ザフィルルカスト活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した(図23)。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。ザフィルルカストによるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。50uMのザフィルルカストは、90%のFAPP2移行活性を阻害する(図23A)。図23Bは、時点ゼロにおける、50uMのザフィルルカストの、FAPP2の移行速度に対する効果を示す。
Prestwick Chemical Library(登録商標)のスクリーニングでは、FAPP2による輸送活性に対して阻害効果を及ぼす化合物の異なるクラスである、フェノチアジンも見出された。
チエチルペラジン(Torecan)とは、フェノチアジンクラスの制吐薬である。チエチルペラジンは、向精神薬として認可又は使用されたことはないが、このような効果を有しうる。チエチルペラジンは、1型、2型、及び4型のドパミン受容体、2A型及び2C型の5-HT受容体、ムスカリン受容体1〜5、アルファ(1)-受容体、及びヒスタミンH1受容体におけるアンタゴニストである。チエチルペラジンの向精神薬効果は、ドパミン及びセロトニンの2型受容体におけるアンタゴニズムに起因するが、セロトニン5-HT2受容体における活性が、ドパミン2型受容体における活性より大きい。
チエチルペラジン活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した(図24)。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。チエチルペラジンによるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。50uMのチエチルペラジンは、60%のFAPP2移行活性を阻害する(図24A)。図24Bは、時点ゼロにおける、50uMのチエチルペラジンの、FAPP2の移行速度に対する効果を示す。
ベンズブロマロンは、Prestwick Chemical Library(登録商標)をスクリーニングすることにより、FAPP2阻害剤として同定されたものであり、今日までのところ、in vitroで同定された、最も強力なFAPP2阻害剤のうちの1つを表す。
ベンズブロマロンとは、とりわけ、第一選択処置であるアロプリノールが、奏効しないか又は忍容不可能な有害作用をもたらす場合に痛風の処置で使用される、尿酸***剤及び非競合的キサンチンオキシダーゼ阻害剤である。ベンズブロマロンは、抗不整脈薬であるアミオダロンと、構造的に類縁である。
ベンズブロマロン活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した(図25)。アッセイは、4つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、10uM、1uM)で、且つ、FAPP2-C212を0.5uMとして実行した。ベンズブロマロンによるFAPP2活性の阻害は、30分間にわたり測定した。50uMのベンズブロマロンは、80%のFAPP2移行活性を阻害する(図25A)。図25Bは、時点ゼロにおける、50uMのベンズブロマロンの、FAPP2の移行速度に対する効果を示す。
レパグリニドとは、非インスリン依存性糖尿病(NIDDM)の処置に使用される、経口血糖降下剤である。スルホニル尿素と同様に、レパグリニドは、ATP感受性K+チャネルを阻害し、これにより、インスリンを放出するように、Ca++チャネルを活性化し、細胞内カルシウムを増大させて、インスリンの、膵臓の膵島のβ細胞からの放出を刺激することにより作用する。
レパグリニド活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した(図26)。アッセイは、3つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、25uM)で、且つ、FAPP2-FL-SUMO-Hisを0.5uMとして実行した。レパグリニドによるFAPP2活性の阻害は、15分間にわたり測定した。50uMのレパグリニドは、50%のFAPP2移行活性を阻害する(図26A)。図26Bは、時点ゼロにおける、50uMのレパグリニドの、FAPP2-FLの移行速度に対する阻害率を示す。
MK-8245とは、前臨床において、糖尿病及び脂質異常症に対して、治療域が著明に改善された有効性を伴う、ステアロイルCoAデサチュラーゼ(SCD)阻害剤である。MK-8245は現在、MercK社により開発されつつある。
MK-8245活性は、蛍光共鳴エネルギー移動アッセイを使用して評価した(図27)。アッセイは、3つの異なる薬物濃度(100uM、50uM、25uM)で、且つ、FAPP2-FL-SUMO-Hisを0.5uMとして実行した。MK-8245によるFAPP2活性の阻害は、15分間にわたり測定した。50uMのMK-8245は、40%のFAPP2移行活性を阻害する(図27A)。図27Bは、時点ゼロにおける、50uMのMK-8245の、FAPP2-FLの移行速度に対する阻害率を示す。
(実施例10)
FAPP2阻害剤の化学合成
本発明のC-アリールグルコシド及びO-アリールグルコシドは、当業者に公知の方法に従い、合成することができる。特に、このような方法は、Martin S. Pure Appl. Chem, Vol. 75, No. 1, pp. 63-70、2003及びSynthesis and characterization of Glycosides, Springer, chap. 2, O-Glycoside Formation, Brito-Arias, M. 2007, XII、351p., Hardcover(ISBN：978-0-387-26251-2)において見出すことができる。
(実施例11)
ファブリー病細胞モデルにおける、FAPP2阻害剤の、Gb3レベルに対する生物学的効果の解析
本実施例では、FAPP2の阻害が、ファブリー病細胞モデルにおけるGb3レベルを低下させることを裏付ける(図28)。Hela-shGLA(クローン4G)細胞(すなわち、上記で記載されたHeLa細胞であって、上記で記載されたshRNAを使用して、GLAについて安定的にノックダウンされたHeLa細胞)を、384ウェルプレートに播種した(ウェル1つ当たりの細胞500個)。24時間後に、細胞を、10の異なるFAPP2移行活性阻害剤で処置した。化合物を、完全培養培地中、10μM〜50μMの濃度で希釈し、細胞を、37℃で72時間にわたりインキュベートした。各条件について、四連で調べた。対照細胞を、0.1%のDMSO(陰性対照)又は10μMのPDMP(陽性対照)で処置した。インキュベーションの後、細胞を、4%のPFA中で固定し、Cy3-志賀毒素B、抗LampI抗体、及びHoechst 33342で染色した。画像は、Operetta Systemを使用して捕捉し、リソソーム(LampIにより検出される)内の、Gb3スポット(志賀毒素Bにより検出される)の強度は、各条件について計算した。ウェル1つ当たり5つずつの視野(対照ウェル内のウェル1つ当たりの細胞約1000個)について解析した。
FAPP2におけるGlcCer移行活性を阻害するのに活性であることが見出された10の化合物について調べて、それらが、ファブリー病細胞モデルにおいて、Gb3レベルを低下させる生物学的効果であって、Cy3/志賀毒素による染色を介して強調される効果を及ぼすのかどうかを評価した。この効果は、陰性対照(DMSOで処置された細胞)と比較して、明確に確認された。陽性対照として、本発明者らは、その毒性のために臨床では使用することができないタンパク質及び脂質のグリコシル化に対する一般的な阻害剤である、PDMP(D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノール)を使用した。
同等物
当業者は、以下の日常的な実験を使用して、本明細書で記載される、本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識するか、又はこれらを確認することが可能であろう。本発明の範囲は、上記の「発明を実施するための形態」に限定されることを意図するものではなく、付属の特許請求の範囲に示される通りである。本明細書及び特許請求の範囲で使用される冠詞である「ある(a)」、「ある(an)」、及び「その」は、反対のことが明確に指し示されない限りにおいて、複数形の指示対象を含むと理解されるべきである。反対のことが指し示されるか、又はそうでないことが文脈から明らかでない限りにおいて、群の1又は複数の構成要素の間の「又は」を含む、特許請求の範囲又は記載は、群の構成要素のうちの1つ、複数、又は全てが、所与の生成物又は方法において存在するか、これにおいて援用されるか、又は他の形でこれに関連すれば満たされると考えられる。本発明は、群のうちのちょうど1つの構成要素が、所与の生成物又は方法において存在するか、これにおいて援用されるか、又は他の形でこれに関連する実施形態を含む。本発明はまた、群の構成要素のうちの複数又は全てが、所与の生成物又は方法において存在するか、これにおいて援用されるか、又は他の形でこれに関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、又は禁忌若しくは矛盾の生じることが当業者に明らかとならない限りにおいて、請求項のうちの1又は複数に由来する、1又は複数の限定、要素、条項、記載用語などを、同じ基礎請求項(又は、関連する場合、他の任意の請求項)に従属する別の請求項へと導入した、変化、組合せ、及び順列を包含することも理解されたい。要素を、例えば、マーカッシュ群又は類似のフォーマットによる一覧として提示する場合、要素の各亜群もまた開示され、任意の要素を群から除外しうることも理解されたい。一般に、本発明又は本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと称する場合、本発明のある特定の実施形態又は本発明の態様は、このような要素、特徴などからなるか、又はこれらから本質的になることを理解されたい。簡便さを目的とすると、これらの実施形態は、あらゆる場合において、本明細書で具体的に示されているわけではない。また、本発明の任意の実施形態、例えば、先行技術において見出される任意の実施形態は、具体的な除外が、本明細書で列挙されるのかどうかに関わらず、特許請求の範囲から明示的に除外されることも理解されたい。
また、反対のことが明確に指し示されない限りにおいて、本明細書で特許請求される任意の方法であって、複数の行為を含む方法では、方法の行為の順序は、方法の行為が列挙される順序に必ずしも限定されないが、本発明は、順序がそのように限定された実施形態も含むことも理解されたい。さらに、特許請求の範囲により、組成物が列挙される場合、本発明は、組成物を使用する方法及び組成物を作製する方法も包含する。特許請求の範囲により、組成物が列挙される場合、本発明は、組成物を使用する方法及び組成物を作製する方法も包含することを理解されたい。
参考文献の組込み
本出願で引用される、全ての刊行物及び特許文献は、各個別の刊行物又は特許文献の内容が本明細書に組み込まれた場合と同程度に、参照によりそれらの全体において組み込まれる。
（参考文献）

Claims (33)

  1. グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を有するか又はそれに感受性である細胞内のGb3の蓄積を低減する方法における使用のための、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)阻害剤。
  2. グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を特徴とする疾患、障害、又は状態を防止及び/又は処置するための使用のための、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)阻害剤。
  3. 細胞内のグロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を低減する方法であって、Gb3の蓄積を有するか又はそれに感受性である細胞へと、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)の阻害剤を投与する工程を含む方法。
  4. グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積と関連する疾患、障害、又は状態を処置する方法であって、処置を必要とする対象へと、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)の阻害剤を投与する工程を含む方法。
  5. 細胞が、哺乳動物細胞である、請求項1若しくは2に記載の阻害剤、又は請求項3若しくは4に記載の方法。
  6. 細胞が、培養された細胞である、請求項1若しくは2に記載の阻害剤、又は請求項3若しくは4に記載の方法。
  7. 細胞が、生物の細胞である、請求項1若しくは2に記載の阻害剤、又は請求項3若しくは4に記載の方法。
  8. 前記阻害剤が、グリコシド連結を含むアリールグルコシド化合物、又は干渉オリゴヌクレオチドである、請求項1から7のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  9. 前記アリールグルコシド化合物が、C-アリールグルコシド化合物、又はO-アリールグルコシド化合物である、請求項8に記載の阻害剤又は方法。
  10. アリールグルコシド化合物が、式I：
    、又は薬学的に許容されるその塩[式中：
    Qは、単糖又は修飾単糖であり；
    A1は、フェニル、又は、窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される、1〜3個のヘテロ原子を有する、5〜6員のヘテロアリール環であり；
    A2は、フェニル、又は、窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される、1〜3個のヘテロ原子を有する、5〜6員のヘテロアリール環であり；
    L1は、共有結合、又は、C1〜4の二価で直鎖状若しくは分枝状の炭化水素鎖であり、鎖の1つ若しくは2つのメチレン単位は、-N(R)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-N(R)S(O)2-、-S(O)2N(R)-、-O-、-C(O)-、-OC(O)-、-C(O)O-、-S-、-S(O)-、又は-S(O)2-により、任意選択で独立に置きかえられており；
    L2は、共有結合又は-O-であり；
    各R1は独立に、ハロゲン、-CN、-R；-OR；-SR；-N(R)2；-N(R)C(O)R；-C(O)N(R)2；-N(R)C(O)N(R)2；-N(R)C(O)OR；-OC(O)N(R)2；-N(R)S(O)2R；-S(O)2N(R)2；-OC(O)OR；-C(O)R；-OC(O)R；-C(O)OR；-S(O)R；-S(O)2R又はCyであり；
    各R2は独立に、ハロゲン、-CN、-R、-OR、-SR、-N(R)2、-N(R)C(O)R、-C(O)N(R)2、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-OC(O)N(R)2、-N(R)SO2R、-S(O)2N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-S(O)R、又は-S(O)2Rであり；
    Cyは、p個のR3で置換された環であり、前記環は、3〜8員の、飽和であるか又は部分的に不飽和である、単環式の炭素環；フェニル；8〜10員の、二環式の芳香族炭素環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜2個のヘテロ原子を有する、4〜8員の、飽和であるか又は部分的に不飽和である、単環式の複素環式環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する、5〜6員の、単環式のヘテロ芳香環；並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜5個のヘテロ原子を有する、8〜10員の、二環式のヘテロ芳香環からなる群から選択され；
    各Rは独立に、水素、重水素、又はC1〜6脂肪族；3〜8員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である、単環式の炭素環；フェニル；8〜10員の、二環式の芳香族炭素環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜2個のヘテロ原子を有する、4〜8員の、飽和であるか若しくは部分的に不飽和である、単環式の複素環式環；窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する、5〜6員の、単環式のヘテロ芳香環；並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜5個のヘテロ原子を有する、8〜10員の、二環式のヘテロ芳香環から選択される、任意選択で置換された基であり；
    各R3は独立に、ハロゲン、-R、-CN、-OR、-SR、-N(R)2、-N(R)C(O)R、-C(O)N(R)2、
    -C(O)N(R)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-OC(O)N(R)2、-N(R)S(O)2R、
    -S(O)2N(R)2、-C(O)R、-C(O)OR、-OC(O)R、-S(O)R、-S(O)2R、-B(OR)2、又はフェニル、並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員のヘテロアリールから選択される、任意選択で置換された環であり；
    pは、1〜5であり；xは、0〜5であり；yは、0〜4である]
    の構造を有する、請求項8又は9に記載の阻害剤又は方法。
  11. アリールグルコシド化合物が、式II-a又はII-b：
    、又は薬学的に許容されるこれらの塩[式中、A1、R1、R2、x、及びyの各々は、請求項10に規定の通りである]の構造を有する、請求項8又は9に記載の阻害剤又は方法。
  12. アリールグルコシド化合物が、
    、又は薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される構造を有する、請求項8又は9に記載の阻害剤又は方法。
  13. アリールグルコシド化合物が、
    、又は薬学的に許容されるその塩の構造を有する、請求項12に記載の方法。
  14. アリールグルコシド化合物が、
    、又は薬学的に許容されるこれらの塩
    [式中、各R4は、同じ場合もあり、又は異なる場合もあり、H及び-L2-Qからなる群から選択され、Qは、単糖又は修飾単糖であり、L2は、共有結合又は-O-であり、但し、アリールグルコシド化合物は、少なくとも1つのグリコシド連結を含む]
    からなる群から選択される構造を有する、請求項8又は9に記載の阻害剤又は方法。
  15. アリールグルコシド化合物が、1つのグリコシド連結を含む、請求項14に記載の阻害剤又は方法。
  16. 前記阻害剤が、
    、又は薬学的に許容されるこれらの塩からなる群から選択される構造を有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  17. 前記阻害剤が、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)の発現を阻害する干渉オリゴヌクレオチドである、請求項1から7のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  18. 干渉オリゴヌクレオチドが、siRNA又はshRNAである、請求項17に記載の阻害剤又は方法。
  19. 干渉オリゴヌクレオチドが、ヒトFAPP2遺伝子又はFAPP2のメッセンジャーRNA(mRNA)の連続配列の逆相補体と、少なくとも80%同一な配列を有する、請求項17又は18に記載の阻害剤又は方法。
  20. 干渉オリゴヌクレオチドが、ヒトFAPP2遺伝子又はFAPP2のメッセンジャーRNA(mRNA)の連続配列の逆相補体と、少なくとも90%同一な配列を有する、請求項17から19のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  21. 干渉オリゴヌクレオチドが、ヒトFAPP2遺伝子又はFAPP2のメッセンジャーRNA(mRNA)の連続配列の逆相補体と同一な配列を有する、請求項19又は20に記載の阻害剤又は方法。
  22. FAPP2のmRNAが、FAPP2 mRNAアイソフォーム1、FAPP2 mRNAアイソフォーム2、及びFAPP2 mRNAアイソフォーム3のうちの1つを含む、請求項17から20のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  23. 干渉オリゴヌクレオチドが、25ヌクレオチド未満の長さである、請求項17から22のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  24. 干渉オリゴヌクレオチドが、16〜22ヌクレオチドの長さである、請求項17から23のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  25. 干渉オリゴヌクレオチドが、
    [FAPP2.1] GAGAUAGACUGCAGCAUAU[dT][dT]配列番号3；
    [FAPP2.2] GAAUUGAUGUGGGAACUUU[dT][dT]配列番号4；
    [FAPP2.3] GAAAUCAACCUGUAAUACU[dT][dT]配列番号5；
    [FAPP2.4] CCUAAGAAAUCCAACAGAA[dT][dT]配列番号6；
    [sh FAPP2.1] CTCTTGTGGCTGAAGAGAGGTCTCAAATT配列番号7；
    [shFAPP2.2] TTGGCAGCCTCGATGGTTCCTTCTCTGTG配列番号8；
    [shFAPP2.3]-CAGTCTGGATCAGACTCAAGTTGCTCTCC配列番号9；及び/又は
    [shFAPP2.4] TCCTGTTAAGATGGATCTTGTTGGAAATA配列番号10
    から選択される配列を有するsiRNA又はshRNAである、請求項17から24のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  26. 干渉オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項17から25のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  27. 少なくとも1つの化学修飾が、コンフォメーション上拘束されているヌクレオチド類似体、2'-O-メチル修飾、ホスホロチオエート連結、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項26に記載の阻害剤又は方法。
  28. 疾患、障害、又は状態が、ファブリー病、又はゴーシェ病などのスフィンゴ脂質症である、請求項1から27のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  29. 疾患、障害、又は状態が、ファブリー病である、請求項1から28のいずれか一項に記載の阻害剤又は方法。
  30. グロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を有するか若しくはそれに感受性である細胞内のGb3の蓄積を低減する方法における使用のため、又はグロボトリアオシルセラミド(Gb3)の蓄積を特徴とする疾患、障害、若しくは状態を防止及び/若しくは処置するための使用のための、請求項1から27のいずれか一項に記載のホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  31. ホスファチジルイノシトール-4-リン酸アダプター2(FAPP2)阻害剤を同定する方法であって、
    アクセプター小胞、蛍光標識部分を含有するドナー小胞、失活剤、及び組換えFAPP2タンパク質を混合して、混合物を形成する工程と、
    混合物の発光強度を、薬剤の存在下又は非存在下で測定する工程であって、薬剤の存在下で発光強度が低下する場合、前記薬剤がFAPP2阻害剤であると同定される工程と
    を含む方法。
  32. 組換えFAPP2タンパク質が、FAPP2-GLTP-C212又は全長FAPP2(FL)である、請求項31に記載の方法。
  33. アクセプター小胞が、1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)を含有する、請求項31に記載の方法。
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