JP2016515544A - Humanized anti-CD134 (OX40) antibody and use thereof - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトCD134と特異的に結合する抗体を提供する。抗ヒトCD134抗体は、例えば、活性化された従来のヒトエフェクターCD4および／またはCD8 Tリンパ球（Teff）上、ならびに活性化されたヒト抑制性調節性CD4 Tリンパ球（Treg）上に発現されるヒトCD134上の非OX40リガンド（OX40L）結合性ドメインを含む、ヒトCD134の細胞外ドメインと特異的に結合する。ヒト化抗ヒトCD134抗体は、癌治療のために（例えば、Teffに抗癌エフェクター機能を与えるため、および／またはTregの抑制機能を阻害するために）有用である。The present invention provides antibodies that specifically bind to human CD134. Anti-human CD134 antibodies are expressed, for example, on activated conventional human effector CD4 and / or CD8 T lymphocytes (Teff) and on activated human inhibitory regulatory CD4 T lymphocytes (Treg). Specifically bind to the extracellular domain of human CD134, including the non-OX40 ligand (OX40L) binding domain on human CD134. Humanized anti-human CD134 antibodies are useful for cancer therapy (eg, to confer anti-cancer effector function to Teff and / or to inhibit the suppressive function of Treg).

Description

本出願は、2013年3月18日に出願されたEP13159794.0の優先権を主張する。   This application claims the priority of EP 13159794.0 filed on March 18, 2013.

発明の分野
本発明は、癌の治療のための抗体、その抗体の使用、および特にCD134と結合するヒト化抗体に関する。 The present invention relates to antibodies for the treatment of cancer, the use of the antibodies, and in particular humanized antibodies that bind to CD134.

発明の背景
抗腫瘍T細胞の機能を強化することは、癌を治療するための独特なアプローチの1つである。調節性Tリンパ球によって主として媒介される能動的な免疫寛容の誘導によって、腫瘍細胞が免疫系を「回避する」ことについては、かなりの証拠がある（Tregs; Quezda et al. Immunol Rev 2011; 241:104-118（非特許文献1））。このため、エフェクター性（すなわち、腫瘍細胞の直接的または間接的な根絶）Tリンパ球（Teff）と、寛容原性（すなわち、Teffエフェクター機能および生存の抑制）Tregとのバランスが、有効な抗腫瘍免疫療法のためには極めて重要であるように思われる。言い換えれば、腫瘍特異的Teffのエフェクター機能を強化することによって、および／または腫瘍特異的Tregの抑制機能を弱めることによって、有効な抗腫瘍免疫応答を得ることができる。これらの応答を媒介することが示されている重要な受容体の1つは、CD134（OX40）受容体である。（Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-431（非特許文献2））。 BACKGROUND OF THE INVENTION Enhancing the function of anti-tumor T cells is one of the unique approaches for treating cancer. There is considerable evidence that tumor cells “evade” the immune system by induction of active tolerance, primarily mediated by regulatory T lymphocytes (Tregs; Quezda et al. Immunol Rev 2011; 241 : 104-118 (Non-Patent Document 1)). Thus, the balance between effector (ie, direct or indirect eradication of tumor cells) T lymphocytes (Teff) and tolerogenic (ie, suppression of Teff effector function and survival) Treg is an effective anti-tumor. It seems extremely important for tumor immunotherapy. In other words, an effective anti-tumor immune response can be obtained by enhancing the effector function of tumor-specific Teff and / or by weakening the suppressive function of tumor-specific Treg. One important receptor that has been shown to mediate these responses is the CD134 (OX40) receptor. (Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-431 (Non-patent Document 2)).

CD134（OX40、TNFRSF4およびACT35としても知られる）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである。このCD134表面共刺激受容体は、活性化されたTリンパ球上で発現され、それらの生存および機能に重要な役割を果たす。CD134を発現するTリンパ球の存在は、さまざまなヒト悪性腫瘍、および癌患者の流入領域リンパ節において実証されている（Ramstad et al. Am J Surg 2000; 179: 400-406（非特許文献3）；Vetto et al. Am J Surg 1997; 174: 258-265（非特許文献4））。   CD134 (also known as OX40, TNFRSF4 and ACT35) is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily. This CD134 surface costimulatory receptor is expressed on activated T lymphocytes and plays an important role in their survival and function. The presence of T lymphocytes expressing CD134 has been demonstrated in various human malignancies and in the draining lymph nodes of cancer patients (Ramstad et al. Am J Surg 2000; 179: 400-406). ); Vetto et al. Am J Surg 1997; 174: 258-265 (non-patent document 4)).

担癌マウスにおけるマウスCD134受容体のインビボ連結（可溶性マウスOX40リガンド（OX40L）-免疫グロブリン融合タンパク質、または抗マウスCD134特異的抗体などのマウスOX40L模倣体のいずれかによる）は、抗腫瘍免疫を強化して、例えばリンパ腫、黒色腫、肉腫、結腸癌、乳癌および神経膠腫といった、さまざまなマウス悪性腫瘍細胞株のマウスモデルにおいて無腫瘍での生存を導く（Sugamura et al. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-31（非特許文献2））。   In vivo linking of mouse CD134 receptor in tumor-bearing mice (either with soluble mouse OX40 ligand (OX40L) -immunoglobulin fusion protein or mouse OX40L mimics such as anti-mouse CD134 specific antibodies) enhances anti-tumor immunity Thus leading to tumor-free survival in mouse models of various mouse malignant cell lines such as lymphoma, melanoma, sarcoma, colon cancer, breast cancer and glioma (Sugamura et al. Nature Rev Imm 2004; 4 : 420-31 (Non-Patent Document 2)).

OX40R結合剤の使用を通じてOX40Rを係合させることによって、抗原に対する哺乳動物の免疫応答を強化させることが提唱されている（国際公開公報第WO99/42585号（特許文献１））。ここではOX40結合剤全般に言及しているが、重点はOX40Lまたはその一部の使用に置かれている；抗OX40抗体の開示は、それらがOX40Lと同等であるという状況にある。事実、このWeinbergのチームは、この研究を非ヒト霊長動物による試験へと進める際にもやはり、OX40L結合部位と結合し、かつ全体的にOX40Lによく似ている抗体を計画的に選んでいる（Weinberg et al. J Immunther 2006; 29: 575-585（非特許文献5））。   It has been proposed to enhance a mammal's immune response to an antigen by engaging OX40R through the use of an OX40R binding agent (International Publication No. WO99 / 42585 (Patent Document 1)). Reference is made here to OX40 binding agents in general, but the emphasis is on the use of OX40L or parts thereof; the disclosure of anti-OX40 antibodies is in a situation where they are equivalent to OX40L. In fact, the Weinberg team is deliberately selecting antibodies that bind to the OX40L binding site and generally closely resemble OX40L, even when the study goes on to testing with non-human primates. (Weinberg et al. J Immunther 2006; 29: 575-585 (non-patent document 5)).

Al-Shamkhani et al. （Eur J Chem 1996; 26: 1695-1699（非特許文献6））は、活性化されたマウスT細胞上でのOX40の発現の差異について探る目的で、OX40L結合を遮断しないOX86と呼ばれる抗OX40抗体を用いた；Hirschhorn-Cymerman et al.（J Exp Med 2009; 206: 1103-1116（非特許文献7））は、可能性のある化学免疫療法として、マウスモデルにおいてOX86をシクロホスファミドとともに用いた。しかし、OX86はヒトOX40と結合しないと予想され、ヒトにおいて有効と考えられる抗体を選択する場合には、Weinbergの業績に鑑みて、OX40L結合部位で結合する抗体が選択されると考えられる。   Al-Shamkhani et al. (Eur J Chem 1996; 26: 1695-1699) blocked OX40L binding to explore differences in OX40 expression on activated mouse T cells. An anti-OX40 antibody called OX86 was used; Hirschhorn-Cymerman et al. (J Exp Med 2009; 206: 1103-1116) reported OX86 in a mouse model as a potential chemoimmunotherapy. Was used with cyclophosphamide. However, when OX86 is expected not to bind to human OX40, and an antibody that is considered effective in humans is selected, in view of Weinberg's achievement, an antibody that binds at the OX40L binding site is considered to be selected.

重症複合免疫不全（SCID）マウスにおけるヒトCD134受容体のインビボ連結（ヒトCD134上のOX40L結合ドメインと相互作用する抗ヒトCD134特異的抗体による；US 2009/0214560 A1（特許文献2））は、抗腫瘍免疫を強化させ、それは、例えばリンパ腫、前立腺癌、結腸癌および乳癌といった、さまざまなヒト悪性腫瘍細胞株の腫瘍成長の阻害を導く。   In vivo ligation of human CD134 receptor in severe combined immunodeficiency (SCID) mice (by anti-human CD134-specific antibodies that interact with the OX40L binding domain on human CD134; US 2009/0214560 A1) Enhancing tumor immunity, which leads to inhibition of tumor growth of various human malignant cell lines such as lymphoma, prostate cancer, colon cancer and breast cancer.

ヒトにおけるヒトCD134連結媒介性の抗腫瘍免疫応答の正確な機序はまだ解明されていないが、OX40Lとの相互作用によって刺激されるCD134膜貫通シグナル伝達経路を介して媒介されると考えられている。この相互作用は、三量体OX40LのCD134との結合によって媒介される。最近の抗癌療法では、三量体化したOX40リガンドの使用が、抗OX40抗体よりも有効な薬剤であると提唱されている（Morris et al. Mol Immunol 2007; 44: 3112-3121（非特許文献7））。   The exact mechanism of human CD134-linkage-mediated anti-tumor immune response in humans is not yet elucidated, but is thought to be mediated through the CD134 transmembrane signaling pathway stimulated by interaction with OX40L Yes. This interaction is mediated by the binding of trimer OX40L to CD134. In recent anti-cancer therapies, the use of trimerized OX40 ligand has been proposed to be more effective than anti-OX40 antibodies (Morris et al. Mol Immunol 2007; 44: 3112-3121) Reference 7)).

WO99/42585WO99 / 42585 US 2009/0214560 A1US 2009/0214560 A1

Tregs; Quezda et al. Immunol Rev 2011; 241:104-118Tregs; Quezda et al. Immunol Rev 2011; 241: 104-118 Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-431Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-431 Ramstad et al. Am J Surg 2000; 179: 400-406Ramstad et al. Am J Surg 2000; 179: 400-406 Vetto et al. Am J Surg 1997; 174: 258-265Vetto et al. Am J Surg 1997; 174: 258-265 Weinberg et al. J Immunther 2006; 29: 575-585Weinberg et al. J Immunther 2006; 29: 575-585 Eur J Chem 1996; 26: 1695-1699Eur J Chem 1996; 26: 1695-1699 J Exp Med 2009; 206: 1103-1116J Exp Med 2009; 206: 1103-1116 Morris et al. Mol Immunol 2007; 44: 3112-3121Morris et al. Mol Immunol 2007; 44: 3112-3121

本発明は、
（a）図27のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図27のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子を提供する。 The present invention
(A) the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of FIG. 27 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (b) the amino acid sequence of FIG. 27 or one, two Alternatively, a binding molecule comprising a light chain variable region comprising a variant of that sequence having three amino acid substitutions is provided.

本発明はさらに、
（a）図26のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図26のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子を提供する。 The present invention further includes
(A) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of FIG. 26 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (b) the amino acid sequence of FIG. 26 or one, two Alternatively, a binding molecule comprising a light chain variable region comprising a variant of that sequence having three amino acid substitutions is provided.

いくつかの態様において、単離された結合性分子はヒトCD134と結合する。本発明の結合性分子は、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げないと考えられる。   In some embodiments, the isolated binding molecule binds human CD134. The binding molecules of the invention are believed not to interfere with the binding of the human CD134 (OX40) receptor to the OX40 ligand (OX40L).

そのような結合性分子には、適した抗CD134抗体、抗CD134抗体の抗原結合性断片、および抗CD134抗体の誘導体が含まれる。いくつかの態様において、結合性分子はヒトCD134と1×10^-7Mまたはそれ未満のK_dで結合する。結合性分子は、エフェクターT細胞上のヒトCD134に対するアゴニスト活性および／または調節性T細胞上のヒトCD134に対するアンタゴニスト活性を有する。いくつかのさらなる態様において、結合性分子は、ヒトCD134と100nMまたはそれ未満の、例えば50nM未満の、または20nM未満のK_dで特異的に結合するヒトモノクローナル抗体である。 Such binding molecules include suitable anti-CD134 antibodies, antigen-binding fragments of anti-CD134 antibodies, and derivatives of anti-CD134 antibodies. In some embodiments, the binding molecule binds to human CD134 with a K _d of 1 × 10 ⁻⁷ M or less. The binding molecule has agonist activity against human CD134 on effector T cells and / or antagonist activity against human CD134 on regulatory T cells. In some further embodiments, the binding molecule is a human monoclonal antibody that specifically binds human CD134 with a K _d of 100 nM or less, such as less than 50 nM, or less than 20 nM.

本発明はまた、1つまたは複数の結合性分子と薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供する。いくつかの態様において、結合性分子はヒトモノクローナル抗CD134抗体またはその抗原結合性断片である。組成物が、追加的な薬学的な剤、例えば免疫療法剤、化学療法剤およびホルモン療法剤をさらに含んでもよい。   The invention also provides a composition comprising one or more binding molecules and a pharmaceutically acceptable carrier. In some embodiments, the binding molecule is a human monoclonal anti-CD134 antibody or antigen-binding fragment thereof. The composition may further comprise additional pharmaceutical agents such as immunotherapeutic agents, chemotherapeutic agents and hormonal therapeutic agents.

本発明はさらに、結合性分子を用いる診断方法および治療方法を提供する。いくつかの態様においては、哺乳動物における癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示された結合性分子または結合性分子を含む組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む方法が提供される。いくつかの他の態様において、本開示は、哺乳動物における免疫応答を強化する方法であって、結合性分子または結合性分子を含む組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本方法に用いられる結合性分子は、ヒトモノクローナル抗CD134抗体、またはヒトCD134と結合するその抗原結合性断片であり、ここで抗体はOX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げない。   The present invention further provides diagnostic and therapeutic methods using binding molecules. In some embodiments, a method of treating or preventing cancer in a mammal, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of a binding molecule or a composition comprising the binding molecule disclosed herein. A method comprising steps is provided. In some other embodiments, the present disclosure is a method of enhancing an immune response in a mammal, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of a binding molecule or a composition comprising the binding molecule. Provide a method. In some embodiments, the binding molecule used in the method is a human monoclonal anti-CD134 antibody, or antigen-binding fragment thereof that binds human CD134, wherein the antibody is human CD134 (OX40L) against OX40 ligand (OX40L). ) Does not interfere with receptor binding.

本発明はさらに、結合性分子のアミノ酸配列をコードする核酸分子、そのような核酸を含むベクター、ベクターを含む宿主細胞、および結合性分子を調製する方法も提供する。   The invention further provides nucleic acid molecules encoding the amino acid sequence of the binding molecule, vectors containing such nucleic acids, host cells containing the vectors, and methods for preparing binding molecules.

本開示はまた他の局面も提供するが、それらは特許請求の範囲を含む本開示の全体から明らかになるであろう。   The present disclosure also provides other aspects, which will be apparent from the entirety of this disclosure, including the claims.

ヒトTリンパ球の表面ヒトCD134発現に対する、PHA-Mへの曝露の経時的推移および用量効果。Time course and dose effect of exposure to PHA-M on surface human CD134 expression of human T lymphocytes. 休止状態の、およびPHA-Mで活性化されたヒトCD4 Tリンパ球上でのヒトCD134発現。Human CD134 expression on quiescent and PHA-M activated human CD4 T lymphocytes. PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、マウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35、クローン12H3およびクローン20E5の結合特性。Binding properties of mouse anti-human CD134 antibody clones ACT35, clone 12H3 and clone 20E5 on human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA-M. PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性CD4 Tリンパ球およびCD8 Tリンパ球上での、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5の結合。Binding of mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 on human CD134-expressing CD4 and CD8 T lymphocytes stimulated with PHA-M. PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、非標識マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3またはクローン20E5と、市販のPE結合マウス抗CD134抗体クローンACT35またはクローンL106との交差競合。Cross competition of unlabeled mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 or clone 20E5 with commercially available PE-conjugated mouse anti-CD134 antibody clone ACT35 or clone L106 on human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA-M. PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3またはクローン20E5の、ヒトOX40Lとの同時結合。Co-binding of mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 or clone 20E5 with human OX40L on human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA-M. ヒトエフェクターTリンパ球（Teff）および調節性Tリンパ球（Treg）の表面ヒトCD134発現に対する、抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激薬（stimulator）ビーズへの曝露の効果の経時的推移。Time course of the effect of exposure to anti-human CD3 / anti-human CD28 antibody stimulator beads on surface human CD134 expression of human effector T lymphocytes (Teff) and regulatory T lymphocytes (Treg). PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3もしくはクローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の用量効果。Dose effect of exposure to mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 or clone 20E5 or to human OX40L on proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA-M. PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3とヒトOX40Lとの組み合わせ、またはマウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5とヒトOX40Lとの組み合わせの効果。Effect of a combination of mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and human OX40L or mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 and human OX40L on proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA-M. 抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性ヒトエフェクターTリンパ球の増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3もしくはクローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の効果。Effect of exposure to mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 or clone 20E5 or to human OX40L on proliferation of human CD134-expressing human effector T lymphocytes stimulated with anti-human CD3 / anti-human CD28 antibody-stimulated beads. 抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性ヒトエフェクターTリンパ球の増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3もしくはクローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の効果。Effect of exposure to mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 or clone 20E5 or to human OX40L on proliferation of human CD134-expressing human effector T lymphocytes stimulated with anti-human CD3 / anti-human CD28 antibody-stimulated beads. 抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性ヒト調節性Tリンパ球の増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3もしくはクローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の効果。Effect of exposure to mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 or clone 20E5 or to human OX40L on proliferation of human CD134-expressing human regulatory T lymphocytes stimulated with anti-human CD3 / anti-human CD28 antibody-stimulated beads. 抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性ヒトエフェクターTリンパ球（A）および調節性Tリンパ球（B）のヒトOX40L媒介性増殖に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の効果。Mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 for human OX40L-mediated proliferation of human CD134-expressing human effector T lymphocytes (A) and regulatory T lymphocytes (B) stimulated with anti-human CD3 / anti-human CD28 antibody-stimulated beads Effect. ヒトCD134発現性ヒトエフェクターTリンパ球増殖のヒトCD134発現性ヒト調節性Tリンパ球媒介性抑制に対する、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3もしくはクローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の効果。Effect of exposure to mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 or clone 20E5 or to human OX40L on human CD134-expressing human regulatory T lymphocyte-mediated suppression of human CD134-expressing human effector T lymphocyte proliferation. （IL-2を加えないか、または加えた）CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性CD4 Tリンパ球およびCD8 Tリンパ球上での、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5の結合。Binding of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 on human CD134-expressing CD4 T lymphocytes and CD8 T lymphocytes stimulated with CD3 / CD28 beads (with or without IL-2 added) . PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5またはヒトOX40Lの効果。Effect of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 or human OX40L on proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA-M. PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5またはヒトOX40Lの効果。Effect of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 or human OX40L on proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA-M. PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5またはヒトOX40Lの効果。Effect of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 or human OX40L on proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA-M. PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5への、またはヒトOX40Lへの曝露の用量効果。Dose effect of exposure to chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 or to human OX40L on proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA-M. PHA-Mで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5とヒトOX40Lとの組み合わせの効果。Effect of a combination of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 and human OX40L on proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA-M. （IL-2を加えないか、または加えた）CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対する、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5またはヒトOX40Lの効果。Effect of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 or human OX40L on proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with CD3 / CD28 beads (with or without IL-2 added). マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の、非還元性および還元性の組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合。（A）検討した非還元性条件（a、b）および還元性条件（c、d）。Binding of mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 with non-reducing and reducing recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein. (A) Non-reducing conditions examined (a, b) and reducing conditions (c, d). マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の、非還元性および還元性の組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合。（B）クーマシーブリリアントブルー染色を用いた、非還元性条件下（a、b）および還元性条件下（c、d）での組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質（rhuCD134）の電気泳動移動パターン。Binding of mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 with non-reducing and reducing recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein. (B) Electrophoretic transfer of recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein (rhuCD134) under non-reducing conditions (a, b) and reducing conditions (c, d) using Coomassie brilliant blue staining pattern. マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の、非還元性および還元性の組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合。（C）マウスIgG1κアイソタイプ対照抗体（mIgG1）に、またはマウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5（それぞれm12H3およびm20E5）に曝露させた非還元性（a、b）および還元性（c、d）組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質のウエスタンブロット。Binding of mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 with non-reducing and reducing recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein. (C) Non-reducing (a, b) and reducing (c, d) pairs exposed to mouse IgG1κ isotype control antibody (mIgG1) or to mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 (m12H3 and m20E5, respectively) Replacement human CD134: Western blot of human Fcγ fusion protein. 完全長ヒトCD134（「CRD1」と表記）における、およびさまざまな短縮型ヒトCD134形態（「CRD2」、「CRD3」、「CRD4」および「短縮型（tc）CRD4」と表記）における、システインリッチドメイン（CRD）の略図。Cysteine-rich domain in full-length human CD134 (designated “CRD1”) and in various truncated human CD134 forms (designated “CRD2,” “CRD3,” “CRD4,” and “truncated (tc) CRD4”) Schematic of (CRD). 完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表記）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD2」、「CRD3」、「CRD4」および「短縮型（tc）CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の結合。Transient with the full-length human CD134 construct (labeled “CRD1”) or with various truncated human CD134 constructs (labeled “CRD2,” “CRD3,” “CRD4,” and “truncated (tc) CRD4”) Binding of mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 on 293-F cell lines transfected into 完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表記）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD2」、「CRD3」、「CRD4」および「短縮型（tc）CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の結合。Transient with the full-length human CD134 construct (labeled “CRD1”) or with various truncated human CD134 constructs (labeled “CRD2,” “CRD3,” “CRD4,” and “truncated (tc) CRD4”) Binding of mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 on 293-F cell lines transfected into 完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表記）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD2」、「CRD3」、「CRD4」および「短縮型（tc）CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、キメラ型ヒトIgG4κならびに／またはIgG1κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の結合。Transient with the full-length human CD134 construct (labeled “CRD1”) or with various truncated human CD134 constructs (labeled “CRD2,” “CRD3,” “CRD4,” and “truncated (tc) CRD4”) Binding of chimeric human IgG4κ and / or IgG1κ anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 on 293-F cell lines transfected into 完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表記）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD2」、「CRD3」、「CRD4」および「短縮型（tc）CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、キメラ型ヒトIgG4κならびに／またはIgG1κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の結合。Transient with the full-length human CD134 construct (labeled “CRD1”) or with various truncated human CD134 constructs (labeled “CRD2,” “CRD3,” “CRD4,” and “truncated (tc) CRD4”) Binding of chimeric human IgG4κ and / or IgG1κ anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 on 293-F cell lines transfected into マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3（A）の、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）のアミノ酸配列に対応するヒトCD134由来ペプチドとの結合。Corresponds to the amino acid sequence of the truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (as defined by Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) of mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 (A) Binding with human CD134-derived peptide. キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3（B）の、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）のアミノ酸配列に対応するヒトCD134由来ペプチドとの結合。Amino acid sequence of the truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (as defined by Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) of the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 (B) To human CD134-derived peptide corresponding to. モノクローナル抗体20E5の可変領域。マウス可変領域（m20E5VHおよびm20E5VL）；ヒト化20E5可変重鎖（hu20E5_h1、hu20E5_h2およびhu20E5_h3）ならびにヒト化20E5可変軽鎖（hu20E5_l1およびhu20E5_l2）。m20E5VH：SEQ ID NO：4；m20E5VL：SEQ ID NO 5。Variable region of monoclonal antibody 20E5. Mouse variable region (m20E5VH and m20E5VL); humanized 20E5 variable heavy chain (hu20E5_h1, hu20E5_h2 and hu20E5_h3) and humanized 20E5 variable light chain (hu20E5_l1 and hu20E5_l2). m20E5VH: SEQ ID NO: 4; m20E5VL: SEQ ID NO 5. モノクローナル抗体12H3の可変領域。マウス可変領域（m12H3VHおよびm12H3VL）；ヒト化12H3可変重鎖（hu12H3_h1、hu12H3_h2およびhu12H3_h3）ならびにヒト化12H3可変軽鎖（hu12H3_l1およびhu12H3_l2）。m12H3VH：SEQ ID NO：12；m12H3VL：SEQ ID NO：13。Variable region of monoclonal antibody 12H3. Mouse variable region (m12H3VH and m12H3VL); humanized 12H3 variable heavy chain (hu12H3_h1, hu12H3_h2 and hu12H3_h3) and humanized 12H3 variable light chain (hu12H3_l1 and hu12H3_l2). m12H3VH: SEQ ID NO: 12; m12H3VL: SEQ ID NO: 13. ヒト化20E5可変領域。Humanized 20E5 variable region. ヒト化12H3可変領域。Humanized 12H3 variable region. プレートに結合した組換えヒトCD134に対するヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の結合特性。Binding characteristics of humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 versions VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) and VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) to recombinant human CD134 bound to the plate. プレートに結合した組換えヒトCD134に対するヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の結合特性。Binding characteristics of humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 versions VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) and VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) to recombinant human CD134 bound to the plate. プレートに結合した組換えヒトCD134に対するビオチン化親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の結合特性。Binding properties of biotinylated parental mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 to recombinant human CD134 bound to the plate. プレートに結合した組換えヒトCD134との結合に関する、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3（EC₅₀である20ng／mLで）との競合特性。Biotinylated parental mouse anti-human CD134 of humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 versions VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) and VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) for binding to recombinant human CD134 bound to the plate Competition properties with antibody clone 12H3 (EC ₅₀ at 20 ng / mL). 安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5（A）およびクローンno.23（B）上でのヒト完全長CD134の発現レベル。Expression levels of human full-length CD134 on stably transfected 293-F cell lines clone no. 5 (A) and clone no. 23 (B). 安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5上の表面ヒトCD134に対する、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の結合特性。Humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 version VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) and VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) against surface human CD134 on stably transfected 293-F cell line clone no.5 Binding characteristics. 安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5上の表面ヒトCD134に対する、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の結合特性。Humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 version VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) and VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) against surface human CD134 on stably transfected 293-F cell line clone no.5 Binding characteristics. 安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.23上の表面ヒトCD134に対する、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の結合特性。Humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 version VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) and VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) against surface human CD134 on stably transfected 293-F cell line clone no.23 Binding characteristics. 完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表示）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD3」および「CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3、VL2H1、VL2VH2、VL2VH3の結合。On the 293-F cell line transiently transfected with the full-length human CD134 construct (labeled “CRD1”) or with various truncated human CD134 constructs (labeled “CRD3” and “CRD4”), Binding of humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 version VL1H1, VL1VH2, VL1VH3, VL2H1, VL2VH2, VL2VH3. 完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表示）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD3」および「CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3、VL2H1、VL2VH2、VL2VH3の結合。On the 293-F cell line transiently transfected with the full-length human CD134 construct (labeled “CRD1”) or with various truncated human CD134 constructs (labeled “CRD3” and “CRD4”), Binding of humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 version VL1H1, VL1VH2, VL1VH3, VL2H1, VL2VH2, VL2VH3. 完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表示）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD3」および「CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3、VL2H1、VL2VH2、VL2VH3の結合。On the 293-F cell line transiently transfected with the full-length human CD134 construct (labeled “CRD1”) or with various truncated human CD134 constructs (labeled “CRD3” and “CRD4”), Binding of humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 version VL1H1, VL1VH2, VL1VH3, VL2H1, VL2VH2, VL2VH3. 完全長ヒトCD134構築物（「CRD1」と表示）で、またはさまざまな短縮型ヒトCD134構築物（「CRD3」および「CRD4」と表記）で一過性に形質移入した293-F細胞株上での、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンVL1H1の結合。On the 293-F cell line transiently transfected with the full-length human CD134 construct (labeled “CRD1”) or with various truncated human CD134 constructs (labeled “CRD3” and “CRD4”), Binding of humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 version VL1H1. 安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5上の表面ヒトCD134に対する、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の結合特性。Binding properties of biotinylated parental mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 to surface human CD134 on stably transfected 293-F cell line clone no.5. 安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5上の表面ヒトCD134との結合に関する、ヒト化ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンVL1H1、VL1VH2、VL1VH3（A）およびVL2H1、VL2VH2、VL2VH3（B）の、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3（EC₅₀である700ng／mLで）との競合特性。Humanized human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 version VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) and VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (for binding to surface human CD134 on stably transfected 293-F cell line clone no.5 B) Competitive properties of biotinylated parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 (EC ₅₀ at 700 ng / mL). 表記濃度の可溶性OX40Lおよび可溶性マウス抗ヒトCD134 12H3 IgG1抗体による、増大させたTreg（CD4+ CD25+ CD127 dim/-）におけるFOXP3発現のダウンレギュレーション。Y軸は、PEと連結させた抗FOX3P抗体を用いて検出したFOXP3幾何平均蛍光強度（GeoMFI）を示している。m12H3＝マウス12H3 IgG1。データは、1人のドナーからの三重反復試料を表している。Down-regulation of FOXP3 expression in increased Treg (CD4 + CD25 + CD127 dim / −) by the indicated concentrations of soluble OX40L and soluble mouse anti-human CD134 12H3 IgG1 antibody. The Y axis shows FOXP3 geometric mean fluorescence intensity (GeoMFI) detected using an anti-FOX3P antibody conjugated with PE. m12H3 = mouse 12H3 IgG1. Data represent triplicate samples from one donor. プレートに結合したヒト化抗ヒトCD134 12H3 VL1VH1抗体により、Teff増殖に対するTregの阻害効果がアイソタイプ対照と比較して弱められたことを示しているFACS分析のヒストグラム。Teff細胞は、Celltrace（商標）Violet色素によって検出した。Treg：Teffector比は1：2であった。Histogram of FACS analysis showing that the humanized anti-human CD134 12H3 VL1VH1 antibody bound to the plate attenuated the inhibitory effect of Treg on Teff proliferation compared to the isotype control. Teff cells were detected with Celltrace ™ Violet dye. The Treg: Teffector ratio was 1: 2. 複製指数の関数としてプロットした、ドナー7015から単離されたTreg：Teff比0：1（Tregなし）におけるTeff細胞の増殖に対する、記載されたプレートに結合した抗ヒトCD134抗体の効果。M＝マウス；ch＝キメラ型；h＝ヒト。mIgG1アイソタイプ対照との比較で、^*p＜0.05；^**p＜0.01；^***p＜0.001。ヒトOX40Lを、抗His抗体を伴うか（OX40L）または伴わずに（OX40L no His）用いた。Effect of anti-human CD134 antibody bound to the described plate on the proliferation of Teff cells in Treg: Teff ratio 0: 1 (no Treg) isolated from donor 7015, plotted as a function of replication index. M = mouse; ch = chimeric type; h = human. ^* p <0.05; ^** p <0.01; ^*** p <0.001 compared to the mIgG1 isotype control. Human OX40L was used with or without anti-His antibody (OX40L) (OX40L no His). 複製指数の関数としてプロットした、ドナー7015から単離されたTreg：Teff比1：4におけるTeff細胞の増殖に対する、記載されたプレートに結合した抗ヒトCD134抗体の効果。M＝マウス；ch＝キメラ型；h＝ヒト。mIgG1アイソタイプ対照との比較で、^*p＜0.05；^**p＜0.01；^***p＜0.001。ヒトOX40Lを、抗His抗体を伴うか（OX40L）または伴わずに（OX40L no His）用いた。Effect of anti-human CD134 antibody bound to the described plate on the proliferation of Teff cells at a Treg: Teff ratio of 1: 4 isolated from donor 7015, plotted as a function of replication index. M = mouse; ch = chimeric type; h = human. ^* p <0.05; ^** p <0.01; ^*** p <0.001 compared to the mIgG1 isotype control. Human OX40L was used with or without anti-His antibody (OX40L) (OX40L no His). 親マウス抗ヒトCD134 20E5抗体に由来するヒト化重鎖可変領域（VH）のアラインメント。SEQ ID NO：は、各配列に関して、配列の名称の末尾に示されている（20E5_VH1_64＝SEQ ID NO：64のアミノ酸配列、など）。Alignment of humanized heavy chain variable region (VH) derived from parent mouse anti-human CD134 20E5 antibody. SEQ ID NO: is shown at the end of the sequence name for each sequence (20E5_VH1_64 = amino acid sequence of SEQ ID NO: 64, etc.). 親マウス抗ヒトCD134 20E5抗体に由来するヒト化重鎖可変領域（VH）のアラインメント。SEQ ID NO：は、各配列に関して、配列の名称の末尾に示されている（20E5_VH1_64＝SEQ ID NO：64のアミノ酸配列、など）。Alignment of humanized heavy chain variable region (VH) derived from parent mouse anti-human CD134 20E5 antibody. SEQ ID NO: is shown at the end of the sequence name for each sequence (20E5_VH1_64 = amino acid sequence of SEQ ID NO: 64, etc.). 親マウス抗ヒトCD134 12H3抗体に由来するヒト化重鎖可変領域（VH）のアラインメント。SEQ ID NO：は、各配列に関して、配列の名称の末尾に示されている（12H3_VH1_69＝SEQ ID NO：69のアミノ酸配列、など）。Alignment of humanized heavy chain variable region (VH) derived from parental mouse anti-human CD134 12H3 antibody. SEQ ID NO: is shown at the end of the sequence name for each sequence (12H3_VH1_69 = amino acid sequence of SEQ ID NO: 69, etc.). 親マウス抗ヒトCD134 12H3抗体に由来するヒト化重鎖可変領域（VH）のアラインメント。SEQ ID NO：は、各配列に関して、配列の名称の末尾に示されている（12H3_VH1_69＝SEQ ID NO：69のアミノ酸配列、など）。Alignment of humanized heavy chain variable region (VH) derived from parental mouse anti-human CD134 12H3 antibody. SEQ ID NO: is shown at the end of the sequence name for each sequence (12H3_VH1_69 = amino acid sequence of SEQ ID NO: 69, etc.).

発明の説明
T細胞活性化は、T細胞受容体を通じた抗原刺激によってだけではなく、共刺激分子を介した共刺激シグナルによっても媒介される。いくつかある共刺激分子のうち、腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーであるOX40（CD134）は、エフェクターT細胞およびメモリーT細胞の生存およびホメオスタシスにおいて鍵となる役割を果たしている。OX40共刺激に関する従来の理解によれば、OX40とOX40リガンド（OX40L）との相互作用は、活性化されたT細胞が、特化した抗原提示細胞（APC）と結合した時に起こる。続いて、サイトカイン産生、増量および生存を含むT細胞機能が、OX40共刺激シグナルによって強化される。OX40とOX40Lとの相互作用は、抗原認識から2〜3日後のT細胞-樹状細胞（DC）相互作用の際に起こる。OX40を発現するT細胞は、DC以外のOX40L発現細胞とも相互作用して、細胞からOX40シグナルを受け取ることができ、それはメモリーT細胞の生成、Th2応答の強化、および炎症反応の長期化のために必須なシグナルをもたらしうる。このため、OX40とOX40Lとの最適な相互作用は、二段階で形成されると考えられる：活性化されたCD4 T細胞上に発現されたOX40Lが、他のレスポンダーCD4 T細胞上に発現されたOX40と相互作用して、メモリーCD4 T細胞の最適な生成を導く（Soroosh et al., J Immunol 2006; 176: 5975-87）、または、CD4+補助細胞上に発現されたOX40Lが、Th2細胞上のOX40との相互作用を通じてTh2細胞の生存性を向上させる可能性もある（Kim et al. Immunity 2003; 18: 643-54）。加えて、Th1発生についてはそうではないが、インビボTh2発生のためにはB細胞上のOX40L発現が必要であり（Linton et al. J Exp Med 2003; 197: 875-83）、OX40Lを発現するマスト細胞は、T細胞上のOX40とマスト細胞上のOX40Lとの相互作用を通じて、エフェクターT細胞の機能を直接的に強化する（Kashiwakura et al. J Immunol 2004; 173: 5247-5257；Nakae et al. J Immunol 2006; 176: 2238-2248）。加えて、内皮細胞もOX40Lを発現することから（Imura et al. J Exp Med 1996; 183: 2185-95）、OX40の内皮細胞との結合が血管炎症に関与している可能性もある。レスポンダーT細胞および調節性T細胞のいずれに対しても、過剰なOX40シグナルは、Treg媒介性の免疫抑制を抑制する。レスポンダーT細胞内に移行したOX40シグナルは、それらをTreg媒介性の抑制に対して抵抗性にする。一方、Treg細胞内に移行したOX40シグナルはTreg抑制機能を直接的に阻害するものの、OX40シグナルがTreg細胞におけるFoxp3発現レベルを制御しうるか否かについては議論がある。加えて、故意でのOX40刺激により、iTreg細胞（誘導性Treg細胞）のTGF-β依存性分化が阻害される。阻害は一部には、OX40で刺激されたエフェクターT細胞によって産生されるIL-4およびIFN-γなどのエフェクター性サイトカインによって媒介されうる。重要なこととして、OX40Lの遮断によってiTreg分化が顕著に促進されて移植免疫寛容が誘導されるが、これはTreg細胞によって媒介される可能性がある。このため、OX40は、T細胞媒介性の自己免疫を制御するための分子標的として有望である。その上、最近の諸研究から、マスト細胞によって発現されるOX40LとTreg細胞によって発現されるOX40との相互作用により、マスト細胞の機能およびTreg細胞の抑制機能が相互に抑制される可能性が報告されている（Gri et al. Immunity 2008; 29: 771-81；Piconese et al. Blood 2009; 114: 2639-48）。 Description of the invention
T cell activation is mediated not only by antigen stimulation through T cell receptors, but also by costimulatory signals via costimulatory molecules. Among several costimulatory molecules, OX40 (CD134), a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor family, plays a key role in effector and memory T cell survival and homeostasis. According to conventional understanding of OX40 costimulation, the interaction between OX40 and OX40 ligand (OX40L) occurs when activated T cells bind to specialized antigen presenting cells (APCs). Subsequently, T cell functions including cytokine production, expansion and survival are enhanced by OX40 costimulatory signals. The interaction between OX40 and OX40L occurs during T cell-dendritic cell (DC) interactions 2-3 days after antigen recognition. T cells expressing OX40 can also interact with OX40L-expressing cells other than DC and receive OX40 signals from the cells, which generate memory T cells, enhance Th2 responses, and prolong inflammatory responses Can provide an essential signal. For this reason, the optimal interaction between OX40 and OX40L appears to be formed in two stages: OX40L expressed on activated CD4 T cells was expressed on other responder CD4 T cells Interaction with OX40 leads to optimal generation of memory CD4 T cells (Soroosh et al., J Immunol 2006; 176: 5975-87), or OX40L expressed on CD4 + accessory cells on Th2 cells May also improve the survival of Th2 cells through interaction with OX40 (Kim et al. Immunity 2003; 18: 643-54). In addition, although not for Th1 development, in vivo Th2 development requires OX40L expression on B cells (Linton et al. J Exp Med 2003; 197: 875-83) and expresses OX40L Mast cells directly enhance the function of effector T cells through the interaction of OX40 on T cells and OX40L on mast cells (Kashiwakura et al. J Immunol 2004; 173: 5247-5257; Nakae et al J Immunol 2006; 176: 2238-2248). In addition, since endothelial cells also express OX40L (Imura et al. J Exp Med 1996; 183: 2185-95), OX40 binding to endothelial cells may be involved in vascular inflammation. Excess OX40 signal suppresses Treg-mediated immunosuppression for both responder and regulatory T cells. OX40 signals translocated into responder T cells make them resistant to Treg-mediated suppression. On the other hand, although the OX40 signal transferred into Treg cells directly inhibits the Treg suppression function, there is a debate as to whether OX40 signal can control Foxp3 expression level in Treg cells. In addition, deliberate OX40 stimulation inhibits TGF-β-dependent differentiation of iTreg cells (inducible Treg cells). Inhibition can be mediated in part by effector cytokines such as IL-4 and IFN-γ produced by effector T cells stimulated with OX40. Importantly, blockage of OX40L significantly promotes iTreg differentiation and induces transplantation tolerance, which may be mediated by Treg cells. Thus, OX40 is a promising molecular target for controlling T cell-mediated autoimmunity. In addition, recent studies have reported that the interaction between OX40L expressed by mast cells and OX40 expressed by Treg cells may mutually suppress the function of mast cells and the suppressive function of Treg cells. (Gri et al. Immunity 2008; 29: 771-81; Piconese et al. Blood 2009; 114: 2639-48).

マウスは免疫学者によって選ばれる実験ツールであり、その免疫応答の研究により、ヒト免疫系の働きに関して多大な識見が得られている。マウスおよびヒトの系の一般的な構造は極めて類似しているように思われる；しかし、重要な相違点も存在する。例えば、マウスでは、CD134は、Teffが活性化された際にその上に発現され、一方、TregはCD134を構成性に発現する（Piconese et al. J Exp Med 2008; 205: 825-839）。ヒトでは、CD134はTeffおよびTregのいずれの上でも発現されるが、それは活性化された際のみであり（例えば、以下の実施例2（g）、「抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズによる刺激後のヒトエフェクターTリンパ球および調節性Tリンパ球上でのCD134発現」を参照）。さらに、マウスTregはマウスTeffのアポトーシスを誘導することで抑制を実現するが（Pandiyan et al. Nat Immunol 2007; 8: 1353; Scheffold et al. Nat Immunol 2007; 8: 1285-1287）、一方、ヒトTregはヒトTeffにおけるアポトーシスを誘導して抑制を達成することはない（Vercoulen et al. Plos ONE 2009; 4: e7183）。以上を総合すると、これらのデータは、ヒトの免疫系とマウスの免疫系ではTreg抑制機能におけるCD134の役割が異なることを示している。   Mice are an experimental tool of choice by immunologists, and research on their immune responses has provided a great deal of insight into how the human immune system works. The general structure of mouse and human systems appears to be very similar; however, there are important differences. For example, in mice, CD134 is expressed thereon when Teff is activated, while Treg constitutively expresses CD134 (Piconese et al. J Exp Med 2008; 205: 825-839). In humans, CD134 is expressed on both Teff and Treg, but only when activated (eg, Example 2 (g) below, “anti-human CD3 / anti-human CD28 antibody stimulated beads”). ("CD134 expression on human effector and regulatory T lymphocytes after stimulation with"). Furthermore, mouse Treg achieves suppression by inducing apoptosis of mouse Teff (Pandiyan et al. Nat Immunol 2007; 8: 1353; Scheffold et al. Nat Immunol 2007; 8: 1285-1287), whereas human Treg does not induce and suppress apoptosis in human Teff (Vercoulen et al. Plos ONE 2009; 4: e7183). Taken together, these data indicate that the role of CD134 in Treg suppression functions is different between the human immune system and the mouse immune system.

「結合性分子」という用語は、（1）抗体、（2）抗体の抗原結合性断片、および（3）抗体の誘導体を範囲に含み、それぞれは本明細書に定義した通りである。「CD134と結合する」または「CD134との結合」という用語は、BIAcoreアッセイなどのインビトロアッセイにおける、またはOctet（表面プラズモン共鳴）による、本明細書に定義した結合性分子とCD134受容体との結合のことを指す。結合性分子は、約1×10^-6Mまたはそれ未満の、例えば、約5×10^-7Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10^-7Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10^-8Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10^-9Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10^-10Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10^-11Mまたはそれ未満の、例えば、約1×10^-12Mまたはそれ未満の、結合親和性（K_d）を有する。 The term “binding molecule” covers (1) an antibody, (2) an antigen-binding fragment of an antibody, and (3) a derivative of an antibody, each as defined herein. The term “binds to CD134” or “binding to CD134” refers to the binding of a binding molecule as defined herein to the CD134 receptor in an in vitro assay, such as a BIAcore assay, or by Octet (surface plasmon resonance). Refers to that. A binding molecule is about 1 × 10 ⁻⁶ M or less, such as about 5 × 10 ⁻⁷ M or less, such as about 1 × 10 ⁻⁷ M or less, such as about 1 ×. 10 ⁻⁸ M or less, for example about 1 × 10 ⁻⁹ M or less, for example about 1 × 10 ⁻¹⁰ M or less, for example about 1 × 10 ⁻¹¹ M or less For example, having a binding affinity (K _d ) of about 1 × 10 ⁻¹² M or less.

「単離された抗体」または「単離された結合性分子」という用語は、（1）その天然の状態で付随している天然の随伴構成要素を伴っていない；（2）同じ種に由来する他のタンパク質を含んでいない；（3）異なる種に由来する細胞によって発現される；または（4）自然界には存在しない、抗体または結合性分子のことを指す。単離された抗体の例には、CD134を用いてアフィニティー精製された抗CD134抗体、インビトロでハイブリドーマまたは他の細胞株によって生成された抗CD134抗体、ヒト化抗CD134抗体、およびトランスジェニック動物に由来するヒト抗CD134抗体が含まれる。   The terms “isolated antibody” or “isolated binding molecule” are (1) not accompanied by naturally associated components that are naturally associated; (2) derived from the same species (3) expressed by cells from different species; or (4) refers to an antibody or binding molecule that does not occur in nature. Examples of isolated antibodies include anti-CD134 antibodies affinity purified using CD134, anti-CD134 antibodies generated by hybridomas or other cell lines in vitro, humanized anti-CD134 antibodies, and transgenic animals Human anti-CD134 antibody.

「アゴニスト」という用語は、CD134と結合した際に、（1）CD134を刺激または活性化する、（2）CD134の活性、存在もしくは機能を強化する、促進する、誘導する、増大させる、もしくは延長する、または（3）CD134の発現を強化する、促進する、増大させる、もしくは誘導する、本明細書に定義した結合性分子のことを指す。「アンタゴニスト」という用語は、CD134と結合した際に、（1）CD134を阻害もしくは抑制する、（2） CD134の活性、存在または機能を阻害もしくは抑制する、または（3）CD134の発現を阻害もしくは抑制する、本明細書に定義した結合性分子のことを指す。   The term “agonist” refers to (1) stimulates or activates CD134, (2) enhances, promotes, induces, increases or prolongs the activity, presence or function of CD134 when bound to CD134. Or (3) a binding molecule as defined herein that enhances, promotes, increases or induces the expression of CD134. The term “antagonist”, when bound to CD134, (1) inhibits or suppresses CD134, (2) inhibits or suppresses the activity, presence or function of CD134, or (3) inhibits or inhibits expression of CD134. Refers to a binding molecule as defined herein that inhibits.

「抗体」という用語は、典型的には2つの同一なポリペプチド鎖の対で構成され、それぞれの対が1つの「重」（H）鎖および1つの「軽」（L）鎖を有する、免疫グロブリン分子のことを指す。ヒト軽鎖はカッパ（κ）およびラムダ（λ）に分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンに分類され、これによってそれぞれIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEという抗体のアイソタイプが規定される。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではHCVRまたはVHと略記）および重鎖定常領域で構成される。IgD、IgGおよびIgAの重鎖定常領域はCH1、CH2およびCH3という3つのドメインで構成され、IgMおよびIgEの重鎖定常領域はCH1、CH2、CH3およびCH4という4つのドメインで構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではLCVRまたはVLと略記）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域はCLという1つのドメインで構成される。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞）を含む宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介しうる。VH領域およびVL領域は、相補性決定領域（CDR）と名づけられた超可変性領域と、その間に散在する、フレームワーク領域（FR）と呼ばれるより保存性の高い領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された3つのCDRおよび4つのFRで構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。各重鎖／軽鎖対（VHおよびVL）の可変領域がそれぞれ、典型的には抗体結合部位を形成する。各領域またはドメインに対するアミノ酸の指定は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987および1991)）の定義、またはChothia et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions (Nature 1989; 342(6252):877-83）の定義に従う。「抗体」という用語は、マウス、ヒト化、ヒト、およびキメラ抗体、ならびに、単量体抗体の二量体、三量体またはより高次の多量体といった、多量体型の抗体である抗体を範囲に含む。抗体はまた、単一特異的、二重特異的、または多特異的な抗体、および所望の特異性用の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変形態を含む。また、非抗体性部分と連結されるかまたは結びつけられた抗体も範囲に含む。さらに、「抗体」という用語は、いかなる特定の抗体生産法にも限定されない。例えば、それには、モノクローナル抗体、組換え抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。   The term “antibody” is typically composed of two identical pairs of polypeptide chains, each pair having one “heavy” (H) chain and one “light” (L) chain. Refers to an immunoglobulin molecule. Human light chains are classified as kappa (κ) and lambda (λ). Heavy chains are classified as mu, delta, gamma, alpha, or epsilon, which define the antibody isotypes IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, respectively. Each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as HCVR or VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant regions of IgD, IgG and IgA are composed of three domains, CH1, CH2 and CH3, and the heavy chain constant regions of IgM and IgE are composed of four domains, CH1, CH2, CH3 and CH4. Each light chain is comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as LCVR or VL) and a light chain constant region. The light chain constant region is comprised of one domain, CL. The constant region of an antibody can mediate the binding of immunoglobulins to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells). The VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions termed complementarity determining regions (CDRs) and more conserved regions called framework regions (FRs) interspersed between them. . Each VH and VL is composed of three CDRs and four FRs arranged in the following order from the amino terminus to the carboxy terminus: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Each variable region of each heavy / light chain pair (VH and VL) typically forms an antibody binding site. Amino acid designations for each region or domain are defined in the Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), or Chothia et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions (Nature 1989; 342 (6252): 877-83). The term “antibody” covers antibodies that are multimeric antibodies, such as mouse, humanized, human, and chimeric antibodies, as well as monomeric antibody dimers, trimers, or higher multimers. Included. Antibodies also include monospecific, bispecific, or multispecific antibodies, and any other modified form of an immunoglobulin molecule that contains an antigen recognition site for the desired specificity. Also included in the scope are antibodies linked or associated with non-antibody portions. Further, the term “antibody” is not limited to any particular antibody production method. For example, it includes monoclonal antibodies, recombinant antibodies and polyclonal antibodies.

「抗体誘導体」または抗体の「誘導体」という用語は、その抗体が結合するのと同じ抗原（すなわち、ヒトCD134）と結合することができて、かつ追加的な分子的実体が連結した抗体のアミノ酸配列を含む分子のことを指す。抗体誘導体の中に含まれる抗体のアミノ酸配列は、完全長抗体であってよく、または完全長抗体の任意の部分であってもよい。追加的な分子的実体は、生体分子または化学分子であってよい。追加的な分子的実体の例には、化学基、ペプチド、タンパク質（酵素、抗体など）、アミノ酸および化合物が含まれる。追加的な分子的実体は、検出薬、マーカー標識、治療剤または薬学的な剤として用いるためであってよい。抗体のアミノ酸配列は、非共有結合性の会合、化学的カップリング、遺伝子融合によって、または他の様式で、抗体と結びつけるかまたは連結させることができる。「抗体誘導体」という用語はまた、CD134抗体のアミノ酸配列の改変に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体および分子、例えば保存的なアミノ酸置換物、挿入物および付加物も範囲に含む。   The term “antibody derivative” or “derivative” of an antibody refers to the amino acid of an antibody that can bind to the same antigen to which it binds (ie, human CD134) and that is linked to additional molecular entities. Refers to a molecule that contains a sequence. The amino acid sequence of the antibody contained within the antibody derivative may be a full length antibody or any portion of a full length antibody. The additional molecular entity may be a biomolecule or a chemical molecule. Examples of additional molecular entities include chemical groups, peptides, proteins (enzymes, antibodies, etc.), amino acids and compounds. The additional molecular entity may be for use as a detection agent, marker label, therapeutic agent or pharmaceutical agent. The amino acid sequence of the antibody can be linked or linked to the antibody by non-covalent association, chemical coupling, gene fusion, or otherwise. The term “antibody derivative” also covers chimeric antibodies, humanized antibodies and molecules derived from modification of the amino acid sequence of the CD134 antibody, such as conservative amino acid substitutions, insertions and additions.

抗体の「抗原結合性断片」という用語は、抗体が結合するのと同じ抗原（すなわち、ヒトCD134）と結合する能力を保っている、完全長抗体の1つまたは複数の部分のことを指す。「抗原結合性断片」という用語はまた、非共有結合性もしくは共有結合性会合によって形成されたより大型の分子の一部である抗体の一部分、または1つもしくは複数の追加的な分子的実体を伴う抗体部分も範囲に含む。追加的な分子的実体の例には、四量体scFv分子を作るために用いうる、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質、例えばストレプトアビジンのコア領域などが含まれる（Kipriyanov et al. Hum Antibodies Hybridomas 1995; 6(3): 93-101）。例示的な抗原結合断片は、抗体のVHおよび／またはVLである。   The term “antigen-binding fragment” of an antibody refers to one or more portions of a full-length antibody that retain the ability to bind to the same antigen to which the antibody binds (ie, human CD134). The term “antigen-binding fragment” also involves a portion of an antibody that is part of a larger molecule formed by non-covalent or covalent association, or one or more additional molecular entities The antibody portion is also included in the scope. Examples of additional molecular entities include amino acids, peptides or proteins that can be used to make tetrameric scFv molecules, such as the core region of streptavidin (Kipriyanov et al. Hum Antibodies Hybridomas 1995; 6 (3): 93-101). Exemplary antigen binding fragments are VH and / or VL of an antibody.

「キメラ抗体」という用語は、ヒトおよびマウス、典型的にはマウス（重鎖および軽鎖由来）可変領域およびヒト（重鎖および軽鎖由来）定常領域などの、2つの異なる種に由来するアミノ酸配列を含む抗体のことを指す。   The term “chimeric antibody” refers to amino acids from two different species, such as human and mouse, typically mouse (from heavy and light chain) variable regions and human (from heavy and light chain) constant regions. Refers to an antibody comprising a sequence.

「エピトープ」という用語は、抗体、またはT細胞と特異的結合を行うこと、または他の様式で分子と相互作用することのできる、抗原の一部のことを指す。「エピトープ」はまた、当技術分野において、「抗原決定基」のことも指す。エピトープは一般に、アミノ酸または糖質または糖側鎖といった、化学的活性のある表面分子群からなる。エピトープは「直鎖状」であってもよく、または「非直鎖状／高次構造性」であってもよい。ひとたび所望のエピトープが決定されれば（例えば、エピトープマッピングによって）、そのエピトープに対する抗体を作製することができる。抗体の作製および特性決定により、望ましいエピトープに関する情報も得られる。続いて、この情報から、例えば、互いに競合的に結合する抗体、すなわち、その抗原に対する結合に関して競合する抗体を見いだすための交差競合試験を実施することによって、抗体を同じエピトープと結合するものに関してスクリーニングすることも可能である。   The term “epitope” refers to a portion of an antigen that can specifically bind to an antibody, or T cell, or otherwise interact with a molecule. “Epitope” also refers to “antigenic determinants” in the art. Epitopes generally consist of a group of chemically active surface molecules such as amino acids or carbohydrates or sugar side chains. The epitope may be “linear” or “non-linear / conformal”. Once the desired epitope is determined (eg, by epitope mapping), antibodies against that epitope can be generated. Antibody production and characterization also provides information on the desired epitope. This information is then screened for those that bind the same epitope, for example, by performing a cross-competition test to find antibodies that competitively bind to each other, ie, antibodies that compete for binding to that antigen. It is also possible to do.

「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞のことを指す。この用語は、特定の対象細胞のみではなく、そのような細胞の子孫も範囲に含む。環境的影響または突然変異のいずれかが原因で、後続世代にある種の改変が起こることがあるため、そのような子孫は親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも「宿主細胞」という用語の範囲には含まれる。   The term “host cell” refers to a cell into which an expression vector has been introduced. The term covers not only the particular subject cell, but also the progeny of such a cell. Such progeny may not be identical to the parental cell because some alterations may occur in subsequent generations, either due to environmental effects or mutations, but are still referred to as "host cells" Included within the scope of terms.

「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列のアミノ酸配列のみからなる抗体のことを指す。ヒト抗体は、マウス、マウス細胞またはマウス細胞に由来するハイブリドーマで産生される場合には、マウス糖鎖を含んでもよい。ヒト抗体は、当技術分野において周知の種々のやり方で調製することができる。   The term “human antibody” refers to an antibody consisting only of the amino acid sequence of human immunoglobulin sequences. A human antibody may contain a mouse sugar chain when produced by a mouse, a mouse cell or a hybridoma derived from a mouse cell. Human antibodies can be prepared in a variety of ways well known in the art.

「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト動物抗体由来のCDRの一部またはすべてを含む抗体であって、フレームワーク領域および定常領域がヒト抗体配列由来のアミノ酸残基を含む抗体のことを指す。ヒト化抗体は典型的には、マウス抗体由来のCDRをヒトフレームワーク配列中に移植し、その後に特定のヒトフレームワーク残基を供給源抗体由来の対応するマウス残基により、復帰置換（back substitution）することによって作製される。「ヒト化抗体」という用語はまた、典型的には1つまたは複数の可変領域において、ヒトのT細胞および／またはB細胞エピトープを構成する傾向が強い1つまたは複数のエピトープが、免疫原性を低下させる目的で除去されている非ヒト起源の抗体のことも指す。エピトープのアミノ酸配列は全体または一部を除去することができる。しかし、典型的には、アミノ酸配列は、エピトープを構成するアミノ酸の1つまたは複数を1つまたは複数の他のアミノ酸で置換し、それにより、アミノ酸配列を、ヒトのT細胞および／またはB細胞エピトープを構成しない配列に変化させることによって改変される。アミノ酸は、状況次第で、対応するヒト可変重鎖または可変軽鎖において対応する位置に存在するアミノ酸によって置換される。   The term “humanized antibody” refers to an antibody that comprises part or all of a CDR from a non-human animal antibody, wherein the framework and constant regions contain amino acid residues from a human antibody sequence. . A humanized antibody typically transplants a mouse antibody-derived CDR into a human framework sequence, after which specific human framework residues are back-substituted by the corresponding mouse residues from the source antibody. substitution). The term "humanized antibody" also typically refers to one or more epitopes that are likely to constitute human T cell and / or B cell epitopes in one or more variable regions. It also refers to an antibody of non-human origin that has been removed for the purpose of lowering. The amino acid sequence of the epitope can be removed in whole or in part. Typically, however, the amino acid sequence replaces one or more of the amino acids that make up the epitope with one or more other amino acids, thereby replacing the amino acid sequence with human T cells and / or B cells. It is modified by changing to a sequence that does not constitute an epitope. Amino acids are replaced by the amino acid present at the corresponding position in the corresponding human variable heavy or variable light chain, depending on the circumstances.

「哺乳動物」という用語は、哺乳類のあらゆる動物種のことを指す。哺乳動物の例には、以下が含まれる：ヒト；ラット、マウス、サルおよびモルモットなどの実験動物；ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウマおよびブタなどの飼育動物。   The term “mammal” refers to any animal species of a mammal. Examples of mammals include: humans; laboratory animals such as rats, mice, monkeys and guinea pigs; domestic animals such as rabbits, cows, sheep, goats, cats, dogs, horses and pigs.

「単離された核酸」という用語は、その核酸の天然の供給源の中に存在する他の核酸分子から分離されている、cDNAもしくは合成物に由来する核酸分子、またはそれらの組み合わせのことを指す。   The term “isolated nucleic acid” refers to a nucleic acid molecule derived from cDNA or a composite, or a combination thereof, that is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid. Point to.

「K_d」という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の平衡解離定数のことを指し、リガンド（抗体など）とタンパク質（CD134など）との間の結合親和性を記述するために用いられる。平衡解離定数が小さいほど、リガンドの結合はより強固である、またはリガンドとタンパク質との間の親和性は高い。K_dは、例えばBIACORE 1またはOctetシステムを用いる表面プラズモン共鳴によって測定することができる。「抗CD134抗体」という用語は、ヒトCD134と結合しうる、本明細書で定義した抗体のことを指す。 The term “K _d ” refers to the equilibrium dissociation constant of a particular antibody-antigen interaction and is used to describe the binding affinity between a ligand (such as an antibody) and a protein (such as CD134). The smaller the equilibrium dissociation constant, the stronger the ligand binding, or the higher the affinity between the ligand and the protein. K _d can be measured, for example, by surface plasmon resonance using a BIACORE 1 or Octet system. The term “anti-CD134 antibody” refers to an antibody as defined herein that is capable of binding to human CD134.

「OX40受容体」、「CD134受容体」および「CD134」という用語は、本出願において互換的に用いられ、ヒトCD134、ならびにその変異体、アイソフォームおよび種相同体を含む。したがって、本明細書で開示されるヒトCD134結合性分子は、場合によっては、ヒト以外の種に由来するCD134とも結合しうる。例えば、本発明の結合性分子は、他の関連する抗原、例えば他の種、例えばヒト、またはカニクイザル（Macaca fascicularis）（カニクイザル（cynomolgus）、cyno）、もしくはチンパンジー（Pan troglodytes）（チンパンジー（chimpanzee）、chimp）などのサル、に由来するCD134と交差反応性を有していてもよい。また別の場合には、結合性分子がヒトCD134に対して完全に特異的であって、種交差反応性も他の種類の交差反応性も示さなくてもよい。例えば、それらはマウスまたはラットのCD134と結合しないと考えられる。   The terms “OX40 receptor”, “CD134 receptor” and “CD134” are used interchangeably in this application and include human CD134, as well as variants, isoforms and species homologues thereof. Accordingly, the human CD134 binding molecules disclosed herein can also bind to CD134 derived from species other than humans in some cases. For example, the binding molecules of the present invention may include other related antigens, such as other species such as humans, or Macaca fascicularis (cynomolgus, cyno), or pan troglodytes (chimpanzee). , Chimp) and the like, and may have cross-reactivity with CD134 derived from monkeys. In other cases, the binding molecule may be completely specific for human CD134 and exhibit neither species cross-reactivity nor other types of cross-reactivity. For example, they are believed not to bind to mouse or rat CD134.

「ヒトCD134と特異的に結合する」という用語は、ヒトCD134との結合に関する結合性分子のK_dが、本明細書に記載の、または当業者に公知のアッセイ（例えば、BIAcoreアッセイ）を用いた判定で、例えばヒトCD40に対するその結合に関するK_dの、約10倍未満、50倍未満、または100倍未満であることを意味する。 The term “specifically binds to human CD134” refers to the assay described herein or known to those skilled in the art (eg, BIAcore assay) for the K _d of the binding molecule for binding to human CD134. Means that the K _d for its binding to human CD40, for example, is less than about 10 fold, less than 50 fold, or less than 100 fold.

または、特定の作用物質がOX40受容体と特異的に結合するという判定を、慣行的な手順を用いること、または適合化することによって容易に行うこともできる。適したインビトロアッセイの1つでは、ウエスタンブロット手順（Harlow and Laneによる"Antibodies, A Laboratory Manual"を含む、多くの標準的な教科書に記載されている）を利用する。ある所与のOX40受容体結合剤がヒトOX40タンパク質と特異的に結合することを判定するためには、全細胞タンパク質を、OX40抗原を発現しない哺乳動物細胞、例えば非リンパ球性細胞（例えば、COS細胞またはCHO細胞）などを、OX40をコードする核酸分子によって形質転換させたものから抽出する。陰性対照として、全細胞タンパク質を、対応する非形質転換細胞からも抽出する。続いて、これらのタンパク質調製物を、非変性または変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動（PAGE）にかける。その後に、タンパク質をウエスタンブロット法によって膜（例えば、ニトロセルロース）に移行させ、試験しようとする作用物質を膜とともにインキュベートする。非特異的に結合した作用物質を除去するために膜を洗浄した後に、結合した作用物質の存在を、被験作用物質に対して産生させた抗体に酵素アルカリホスファターゼなどの検出薬をコンジュゲートさせたものを用いることによって検出する；基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウムの適用により、免疫局在性のアルカリホスファターゼによって濃青色の化合物の生成がもたらされる。ヒトOX40と特異的に結合する作用物質は、この手法によって、OX40形質転換細胞からの抽出物では、ヒトOX40バンド（その分子質量によって決まるゲル上の所定の位置に局在すると考えられる）と結合することが示されると考えられ、一方、非形質転換細胞からの抽出物では結合がほとんどまたは全く観察されないと考えられる。作用物質の他のタンパク質との非特異的結合も起こる可能性があり、これはウエスタンブロット上で弱いシグナルとして検出されると考えられる。この結合が非特異的な性質であることは、ウエスタンブロット上で得られたシグナルが、特異的な作用物質／ヒトOX40タンパク質の結合によって生じる強い主シグナルよりも弱いことによって、当業者には認識されるであろう。理想的には、OX40受容体結合剤は、非形質転換細胞から抽出されたタンパク質とは結合しないと考えられる。抽出されたタンパク質を用いる結合アッセイに加えて、OX40受容体結合剤と推定されるものを、作用物質を蛍光性タグ（FITCなど）とコンジュゲートさせて、抗原で活性化されたCD4+ T細胞および非活性化T細胞の集団に対するその結合を蛍光活性化細胞分取法（FACS）によって分析することにより、それらがインビボで実質的にOX40受容体のみと結合しうることを確認するために試験することもできる。実質的にOX40受容体のみと結合する作用物質は、活性化されたCD4+ T細胞のみを染色すると考えられる。   Alternatively, the determination that a particular agent specifically binds to the OX40 receptor can be readily made by using or adapting routine procedures. One suitable in vitro assay utilizes the Western blot procedure (described in many standard textbooks, including “Antibodies, A Laboratory Manual” by Harlow and Lane). To determine that a given OX40 receptor binding agent specifically binds to human OX40 protein, total cellular protein can be expressed in mammalian cells that do not express OX40 antigen, such as non-lymphocytic cells (e.g., COS cells or CHO cells) are extracted from those transformed with a nucleic acid molecule encoding OX40. As a negative control, total cellular protein is also extracted from the corresponding non-transformed cells. These protein preparations are then subjected to electrophoresis (PAGE) on non-denaturing or denaturing polyacrylamide gels. Thereafter, the protein is transferred to the membrane (eg nitrocellulose) by Western blotting and the agent to be tested is incubated with the membrane. After washing the membrane to remove non-specifically bound agents, the presence of the bound agent was conjugated to a detection agent such as the enzyme alkaline phosphatase to the antibody produced against the test agent. The application of the substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate / nitroblue tetrazolium results in the formation of a dark blue compound by immunolocalized alkaline phosphatase. Agents that specifically bind to human OX40 bind to human OX40 band (which is thought to be localized at a predetermined position on the gel determined by its molecular mass) in extracts from OX40 transformed cells by this technique. While it is believed that little or no binding is observed in extracts from non-transformed cells. Non-specific binding of the agent to other proteins may also occur, which will be detected as a weak signal on the Western blot. The non-specific nature of this binding is recognized by those skilled in the art because the signal obtained on Western blots is weaker than the strong main signal generated by the specific agent / human OX40 protein binding. Will be done. Ideally, the OX40 receptor binding agent will not bind to proteins extracted from non-transformed cells. In addition to binding assays using extracted proteins, the putative OX40 receptor binding agent is conjugated to an agent with a fluorescent tag (such as FITC) to activate antigen-activated CD4 + T cells and To test that their binding to a population of non-activated T cells is analyzed by fluorescence activated cell sorting (FACS) to confirm that they can bind substantially only to the OX40 receptor in vivo You can also. Agents that bind substantially only to the OX40 receptor are thought to stain only activated CD4 + T cells.

「ベクター」という用語は、別の核酸分子を宿主細胞内に輸送することのできる核酸分子のことを指す。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、コスミドもしくはファージベクター、および裸のDNAまたはRNA発現ベクターが含まれる。いくつかのベクターは、それが導入された宿主細胞内で自律複製を行うことができる。いくつかのベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、その結果、宿主ゲノムとともに複製されることが可能である。ある種のベクターは、それと機能的に連結された遺伝子の発現を導くことができ、それ故に「発現ベクター」と称することができる。   The term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid molecule into a host cell. Examples of vectors include plasmids, viral vectors, cosmid or phage vectors, and naked DNA or RNA expression vectors. Some vectors are capable of autonomous replication in a host cell into which they are introduced. Some vectors integrate into the genome of a host cell when introduced into the host cell, and as a result are capable of replicating along with the host genome. Certain types of vectors are capable of directing the expression of genes operably linked therewith and can therefore be referred to as “expression vectors”.

本明細書で用いる場合、従来の20種のアミノ酸およびそれらの略号は、従来の用法に従う。   As used herein, the twenty conventional amino acids and their abbreviations follow conventional usage.

本発明は、ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：100の軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：100のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体を提供する。   The invention relates to an isolated antibody that binds human CD134, comprising the light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 100 and the heavy chain complementarity determining region (HCDR) HCDR1, HCDR2, and HCDR3. An antibody is provided that comprises a variable region (VH) and optionally has one, two or three amino acid substitutions in the VL of SEQ ID NO: 100.

SEQ ID NO：100：

；
ここで、X₁₁はDまたはSであり；かつ
X₁₂はGまたはSである。 SEQ ID NO: 100:

;
Where X ₁₁ is D or S; and
X ₁₂ is G or S.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：152のアミノ酸配列を含むVHを含み、任意でSEQ ID NO：152のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 152, optionally one, two or in the VH of SEQ ID NO: 152 Has three amino acid substitutions.

SEQ ID NO：152：

；
ここで、X₁はVまたはLであり；
X₂はMまたはIであり；
X₃はN、Q、AまたはEであり；
X₄はVまたはAであり；
X₅はIまたはLであり；
X₆はAまたはVであり；かつ
X₇はM、LまたはIである。 SEQ ID NO: 152:

;
Where X ₁ is V or L;
X ₂ is M or I;
X ₃ is N, Q, A or E;
X ₄ is V or A;
X ₅ is I or L;
X ₆ is A or V; and
X ₇ is M, L or I.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：99のアミノ酸配列を含むVHを含み、任意でSEQ ID NO：99のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99, optionally one, two or two in the VH of SEQ ID NO: 99 Has three amino acid substitutions.

SEQ ID NO：99：

；
ここで、X₇はIまたはMであり；
X₈はAまたはVであり；
X₉はLまたはIであり；かつ
X₁₀はVまたはAである。 SEQ ID NO: 99:

;
Where X ₇ is I or M;
X ₈ is A or V;
X ₉ is L or I; and
X ₁₀ is V or A.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：100のVLおよびSEQ ID NO：152のVHを含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises a VL of SEQ ID NO: 100 and a VH of SEQ ID NO: 152.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：16、144または145のアミノ酸配列を含むHCDR3を含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 144, or 145.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：15、141、142または143のアミノ酸配列を含むHCDR2を含む。本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含むHCDR1を含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 141, 142, or 143. In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、
a）SEQ ID NO：67もしくは68のアミノ酸配列を含むVL；および、SEQ ID NO：69、70、71、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、146、147もしくは148のアミノ酸配列を含み、任意でVH直鎖状アミノ酸残基位置11、55もしくは99に1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するVH；または
b）以下のアミノ酸配列を含むVLおよびVH：
i．それぞれSEQ ID NO：67および69；
ii．それぞれSEQ ID NO：67および70；
iii．それぞれSEQ ID NO：67および71；
iv．それぞれSEQ ID NO：68および69；
v．それぞれSEQ ID NO：68および70；もしくは
vi．それぞれSEQ ID NO：68および71
を含む。 In some embodiments described herein, the isolated antibody is
a) VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 or 68; and SEQ ID NOs: 69, 70, 71, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, VH comprising an amino acid sequence of 130, 131, 132, 133, 146, 147 or 148 and optionally having one, two or three amino acid substitutions at the VH linear amino acid residue position 11, 55 or 99; or
b) VL and VH containing the following amino acid sequences:
i. SEQ ID NO: 67 and 69, respectively;
ii. SEQ ID NO: 67 and 70, respectively;
iii. SEQ ID NO: 67 and 71, respectively;
iv. SEQ ID NO: 68 and 69, respectively;
v. SEQ ID NO: 68 and 70, respectively; or
vi. SEQ ID NO: 68 and 71, respectively
including.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、それぞれSEQ ID NO：67および119、67および120、67および121、67および122、67および123、67および124、67および125、67および126、67および127、67および128、67および129、67および130、67および131、67および132、67および133、67および146、67および147、67および148、68および119、68および120、68および121、68および122、68および123、68および124、68および125、68および126、68および127、68および128、68および129、68および130、68および131、68および132、68および133、68および146、68および147、または68および148の、VLおよびVHを含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibodies are SEQ ID NOs: 67 and 119, 67 and 120, 67 and 121, 67 and 122, 67 and 123, 67 and 124, 67 and 125, 67 and 126, 67 and 127, 67 and 128, 67 and 129, 67 and 130, 67 and 131, 67 and 132, 67 and 133, 67 and 146, 67 and 147, 67 and 148, 68 and 119, 68 and 120, 68 and 121, 68 and 122, 68 and 123, 68 and 124, 68 and 125, 68 and 126, 68 and 127, 68 and 128, 68 and 129, 68 and 130, 68 and 131, 68 and 132, 68 and 133, 68 and 146, 68 and 147, or 68 and 148, including VL and VH.

本明細書に記載のいくつかの態様において、抗体はCD134のアゴニストである。   In some embodiments described herein, the antibody is an agonist of CD134.

本明細書に記載のいくつかの態様において、抗体はFc領域に置換を含む。   In some embodiments described herein, the antibody comprises a substitution in the Fc region.

本明細書に記載のいくつかの態様において、置換は、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、ここで残基の番号付けはEUインデックスによる。   In some embodiments described herein, the substitution is an S267E / L328F substitution, an E233D / G237D / H268D / P271G / A330R substitution, a V234A / G237A / P238S / H268A / V309L / A330S / P331S substitution, or an M252Y / S254T substitution. / T256E substitution, where residue numbering is according to EU index.

重鎖、軽鎖、VHまたはVLのアミノ酸配列が、本明細書に記載されるものと実質的でない程度に異なる抗体は、本発明の範囲に含まれる。実質的でない違いとは、抗体特性に悪影響を及ぼさない、抗体可変領域配列における1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸の置換のことである。本明細書に開示される可変領域配列と実質的に同一なアミノ酸配列は、本発明の範囲に含まれる。いくつかの態様において、配列同一性は、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％であるか、またはそれよりも高い。パーセントの同一性は、例えば、ベクターNTI v.9.0.0（Invitrogen, Carlsbad, CA）のAlignXモジュールのデフォルト設定を用いるペアワイズアラインメントによって決定することができる。本発明のタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するために、公開データベースまたは特許データベースに対して検索を行うためのクエリー配列として用いることができる。そのような検索を行うために用いられる例示的なプログラムには、デフォルトの設定を用いる、XBLASTもしくはBLASTPプログラム（http_//www_ncbi_nlm/nih_gov）、またはGenomeQuest（商標）（GenomeQuest, Westborough, MA）スイートがある。   Antibodies that differ in the heavy chain, light chain, VH or VL amino acid sequence to an extent not substantially different from those described herein are within the scope of the present invention. Substantive differences are 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acids in the antibody variable region sequence that do not adversely affect antibody properties It is a replacement. Amino acid sequences that are substantially identical to the variable region sequences disclosed herein are within the scope of the invention. In some embodiments, the sequence identity is about 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher. . Percent identity can be determined, for example, by pairwise alignment using the default settings of the AlignX module of vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). The protein sequences of the present invention can be used, for example, as query sequences for searching public databases or patent databases to identify related sequences. Exemplary programs used to perform such searches include the XBLAST or BLASTP program (http _ // www_ncbi_nlm / nih_gov), or the GenomeQuest ™ (GenomeQuest, Westborough, MA) suite, using default settings. is there.

典型的には、これは、抗体の特性を悪い方向に改変することのない、抗原結合部位またはフレームワークにおける、類似の電荷、疎水性、または立体化学特性を有するアミノ酸による1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含む。また、保存的置換が、抗体特性、例えば、安定性または親和性を向上させるためになされてもよい。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個のアミノ酸置換が、VH配列またはVL配列に対してなされうる。いくつかの態様においては、1つ、2つまたは3つの置換が、本明細書に記載の抗体のVHまたはVLに対してなされる。例示的な保存的アミノ酸置換を表1に示している。その上、ポリペプチド中の任意の未変異残基を、アラニンスキャニング突然変異誘発に関して以前に記載されているように、アラニンで置換することもできる（MacLennan et al (1998) Act Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al (l998) Adv. Biopsy's. 35:1-24）。   Typically, this is one or more conservation by amino acids with similar charge, hydrophobicity, or stereochemical properties at the antigen binding site or framework without adversely altering the properties of the antibody. Including general amino acid substitutions. Conservative substitutions may also be made to improve antibody properties, such as stability or affinity. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acid substitutions can be made to the VH or VL sequences. In some embodiments, one, two or three substitutions are made to the VH or VL of the antibodies described herein. Exemplary conservative amino acid substitutions are shown in Table 1. In addition, any unmutated residue in the polypeptide can be substituted with alanine as previously described for alanine scanning mutagenesis (MacLennan et al (1998) Act Physiol. Scand. Suppl 643: 55-67; Sasaki et al (l998) Adv. Biopsy's. 35: 1-24).

安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性または他の望ましい生物学的もしくは生物物理学的な特性を向上させるために改変された本明細書に記載の抗CD134抗体は、本発明の範囲内にある。抗体の安定性は、（1）個々のドメインの固有安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、（2）HCおよびLCの対合に強い影響を与えるタンパク質／タンパク質境界面相互作用、（3）極性残基および荷電残基の埋没、（4）極性残基および荷電残基の水素結合ネットワーク；ならびに（5）他の分子内力および分子間力の中での表面電荷および極性残基の分布（Worn et al., J. Mol. Biol., 305:989-1010, 2001）を含む、いくつかの要因によって影響される。可能性のある構造不安定化残基を抗体の結晶構造に基づいて同定し、抗体安定性に対する残基の影響を、同定された残基に突然変異を有する変異体を作製して評価することによって試験することができる。   The anti-CD134 antibodies described herein that are modified to improve stability, selectivity, cross-reactivity, affinity, immunogenicity or other desirable biological or biophysical properties are Within the scope of the invention. Antibody stability consists of (1) core packing of individual domains that affect the intrinsic stability of individual domains, (2) protein / protein interface interactions that strongly influence HC and LC pairing, ( 3) Buried polar and charged residues; (4) Hydrogen-bonded networks of polar and charged residues; and (5) Surface charge and polar residues among other intramolecular and intermolecular forces. It is influenced by several factors, including the distribution (Worn et al., J. Mol. Biol., 305: 989-1010, 2001). Identify potential structural destabilizing residues based on the crystal structure of the antibody, and evaluate the effect of residues on antibody stability by creating variants with mutations in the identified residues Can be tested.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、VH直鎖状残基位置11、55または99に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises one, two or three amino acid substitutions at VH linear residue position 11, 55 or 99.

本明細書に記載のいくつかの態様において、VH直鎖状残基位置にある1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換は、V11L、N55Q、N55A、N55E、M99LまたはM99Iである。   In some embodiments described herein, the 1, 2 or 3 amino acid substitution at the VH linear residue position is V11L, N55Q, N55A, N55E, M99L or M99I.

VH直鎖状残基位置11、55または99での置換は、抗体の安定性を向上させ、かつ／またはそのアゴニスト活性を強化することができる。   Substitution at the VH linear residue position 11, 55 or 99 can improve the stability of the antibody and / or enhance its agonist activity.

アミノ酸置換は、例えば、PCR突然変異誘発（米国特許第4,683,195号）によって行うことができる。変異体のライブラリーを、周知の方法を用いて、例えば、ランダムコドン（NNK）または非ランダムコドン、例えば、11個のアミノ酸（Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp）をコードするDVKコドンを用いて作製し、そのライブラリーを所望の特性を有する変異体に関してスクリーニングすることができる。   Amino acid substitutions can be made, for example, by PCR mutagenesis (US Pat. No. 4,683,195). A library of variants can be generated using well-known methods, for example, random codons (NNK) or non-random codons such as 11 amino acids (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser , Tyr, Trp) can be generated using a DVK codon and the library can be screened for variants having the desired properties.

実施例において例証されている態様は、一方が重鎖由来でもう一方が軽鎖由来である可変領域の対を含むものの、当業者は、代替的な態様が単一の重鎖または軽鎖可変領域を含みうることを認識しているであろう。単一の可変領域は、例えば、SEQ ID NO：1の配列を有するヒトCD134と結合することができる、2ドメイン特異的な抗原結合性断片を形成しうる可変ドメインをスクリーニングするために用いることができる。スクリーニングは、例えば、国際公開公報第WO1992／01047号に開示された段階的二重コンビナトリアルアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング法によって実現することができる。このアプローチでは、H鎖またはL鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを用いて、他方の鎖（LまたはH）をコードするクローンの完全ライブラリーを感染させ、その結果得られた2鎖特異的抗原結合ドメインを、記載された通りのファージディスプレイ手法に従って選択する。このように、個々のVHおよびVLポリペプチド鎖は、国際公開公報第WO1992／01047号に開示された方法を用いて、SEQ ID NO：1の配列を有する、ヒトCD134と特異的に結合するさらなる抗体を同定する上で有用である。   While the embodiments illustrated in the examples include pairs of variable regions, one derived from the heavy chain and the other from the light chain, those skilled in the art will recognize that an alternative embodiment is a single heavy chain or light chain variable. You will recognize that it can include regions. A single variable region can be used, for example, to screen for variable domains that can form a two-domain specific antigen-binding fragment that can bind to human CD134 having the sequence of SEQ ID NO: 1. it can. The screening can be realized by, for example, a phage display screening method using a stepwise double combinatorial approach disclosed in International Publication No. WO1992 / 01047. In this approach, individual colonies containing either heavy or light chain clones are used to infect a complete library of clones encoding the other chain (L or H) and the resulting two-strand specificity The antigen-binding domain is selected according to the phage display procedure as described. Thus, individual VH and VL polypeptide chains are further bound specifically to human CD134 having the sequence of SEQ ID NO: 1 using the method disclosed in International Publication No. WO1992 / 01047. Useful in identifying antibodies.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、
a．それぞれSEQ ID NO：14、15および144；
b．それぞれSEQ ID NO：14、15および145；
c．それぞれSEQ ID NO：14、141および16；
d．それぞれSEQ ID NO：14、141および144；
e．それぞれSEQ ID NO：14、141および145；
f．それぞれSEQ ID NO：14、142および16；
g．それぞれSEQ ID NO：14、142および144；
h．それぞれSEQ ID NO：14、142および145；
i．それぞれSEQ ID NO：14、143および16；
j．それぞれSEQ ID NO：14、143および144；または
k．それぞれSEQ ID NO：14、143および145
である、HCDR1、HCDR2およびHCDR3アミノ酸配列を含む。 In some embodiments described herein, the isolated antibody is
a. SEQ ID NOs: 14, 15 and 144, respectively;
b. SEQ ID NOs: 14, 15 and 145, respectively;
c. SEQ ID NO: 14, 141 and 16 respectively;
d. SEQ ID NOs: 14, 141 and 144, respectively;
e. SEQ ID NOs: 14, 141 and 145, respectively;
f. SEQ ID NOs: 14, 142 and 16 respectively;
g. SEQ ID NOs: 14, 142 and 144, respectively;
h. SEQ ID NOs: 14, 142 and 145, respectively;
i. SEQ ID NO: 14, 143 and 16 respectively;
j. SEQ ID NO: 14, 143 and 144, respectively; or
k. SEQ ID NO: 14, 143 and 145 respectively
HCDR1, HCDR2 and HCDR3 amino acid sequences.

本明細書に記載のいくつかの態様において、本明細書に記載される通りの重鎖および軽鎖CDR配列を含む抗体は、ヒト化抗体、ヒト抗体またはDeImmunized（商標）抗体である。   In some embodiments described herein, the antibody comprising heavy and light chain CDR sequences as described herein is a humanized antibody, human antibody or DeImmunized ™ antibody.

ヒト抗体またはdeImmunized（商標）抗体は、本明細書に記載される通りに作製することができる。ヒト化抗体とは、典型的には、抗原結合部位が非ヒト種に由来し、可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体のことを指す。ヒト化抗体はフレームワーク領域に置換を含んでもよく、その結果、フレームワークは、発現されるヒト免疫グロブリンまたは生殖細胞系列遺伝子配列の正確なコピーでなくてもよい。CD134に対するヒト化抗体は、例えば、Balb／cマウスにおいて、標準的な方法を用いて作製することができる。Balb／cマウスまたは他の非ヒト動物において作られた抗体を、さらなるヒト様配列を作製するために、さまざまな技術を用いてヒト化することができる。ヒトアクセプターフレームワークの選択を含む例示的なヒト化手法は当業者に公知であり、これには、CDRグラフティング（米国特許第5,225,539号）、SDRグラフティング（米国特許第6,818,749号）、リサーフェイシング（Palin, Mol Immunol 28:489-499, 1991）、特異性決定残基のリサーフェイシング（米国特許出願公開第2010／0261620号）、ヒトへの適合化（またはヒトフレームワークの適合化）（米国特許出願公開第US2009／0118127号）、スーパーヒト化（米国特許第7,709,226号）およびガイド下選択（Osborn et al., Methods 36:61-68, 2005；米国特許第5,565,332号）が含まれる。   Human antibodies or deImmunized ™ antibodies can be generated as described herein. A humanized antibody typically refers to an antibody in which the antigen binding site is derived from a non-human species and the variable region framework is derived from a human immunoglobulin sequence. Humanized antibodies may contain substitutions in the framework regions, so that the framework may not be an exact copy of the expressed human immunoglobulin or germline gene sequence. Humanized antibodies against CD134 can be generated using standard methods, for example, in Balb / c mice. Antibodies made in Balb / c mice or other non-human animals can be humanized using a variety of techniques to generate additional human-like sequences. Exemplary humanization techniques including selection of human acceptor frameworks are known to those skilled in the art, including CDR grafting (US Pat. No. 5,225,539), SDR grafting (US Pat. No. 6,818,749), Lisa Facing (Palin, Mol Immunol 28: 489-499, 1991), resurfacing of specificity-determining residues (US 2010/020620), human adaptation (or human framework adaptation) ) (US Patent Publication No. US2009 / 0118127), Superhumanization (US Patent No. 7,709,226) and guided selection (Osborn et al., Methods 36: 61-68, 2005; US Patent No. 5,565,332) It is.

ヒト化抗体は、国際特許出願第WO1990／007861号および国際特許出願第WO1992／22653号に記載された通りに開示されたものなどの手法によって、結合親和性を保つために改変されたフレームワーク支持残基を組み入れること（復帰突然変異）により、所望の抗原に対するその選択性または親和性が向上するようにさらに最適化することができる。   Humanized antibodies are supported by a framework that has been modified to maintain binding affinity by techniques such as those disclosed as described in International Patent Application No. WO1990 / 007861 and International Patent Application No. WO1992 / 22653. Incorporation of residues (backmutation) can be further optimized to improve its selectivity or affinity for the desired antigen.

本発明の抗体の免疫エフェクター特性は、当業者に公知の手法によるFc改変を通じてモジュレートすることができる。例えば、C1q結合、補体依存性細胞傷害作用（CDC）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）、食作用、細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えば、B細胞受容体；BCR）などのFcエフェクター機能を、これらの活性の原因となるFc内の残基を活性化Fcγ受容体（FcγR）FcγRI、FcγRIIaもしくはFcγRIII、または抑制性受容体FcγRIIbとの結合を通じて改変することによってモジュレートすることができる。また、Fcドメイン内の残基を突然変異させて、新生児Fc受容体FcRnに対するFc結合親和性をモジュレートすることによって抗体半減期を延長させることにより、薬物動態学的特性を強化することもできる。例示的なFc改変には、IgG4 S228P／L234A／L235A、IgG2 M252Y／S254T／T256E（Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281:23514-24, 2006）；またはIgG2 V234A／G237A／P238S、V234A／G237A／H268Q、H268A／V309L／A330S／P331またはV234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S（国際公開公報第WO2011／066501号）、または米国特許第6,737,056号に記載されたものが含まれる（残基の番号付けはEUインデックスによる）。抑制性FcγRIIbに対する抗体Fc親和性を、抗体架橋およびアゴニスト性シグナルを強化するために増強することもできる。FcγRIIbに対するFc結合を強化する例示的なFc改変には、S267E／L328FおよびE233D／G237D／H268D／P271G／A330Rがある（残基の番号付けはEUインデックスによる）。   The immune effector properties of the antibodies of the invention can be modulated through Fc modification by techniques known to those skilled in the art. For example, C1q binding, complement-dependent cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), phagocytosis, cell surface receptor down-regulation (eg, B cell receptor; BCR), etc. Modulate Fc effector function of Fc by altering residues in Fc responsible for these activities through binding to activated Fcγ receptor (FcγR) FcγRI, FcγRIIa or FcγRIII, or inhibitory receptor FcγRIIb be able to. Also, pharmacokinetic properties can be enhanced by mutating residues in the Fc domain to increase antibody half-life by modulating Fc binding affinity to the neonatal Fc receptor FcRn. . Exemplary Fc modifications include IgG4 S228P / L234A / L235A, IgG2 M252Y / S254T / T256E (Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281: 23514-24, 2006); or IgG2 V234A / G237A / P238S, V234A / G237A / H268Q, H268A / V309L / A330S / P331 or V234A / G237A / P238S / H268A / V309L / A330S / P331S (International Publication No. WO2011 / 066501) or those described in US Pat. No. 6,737,056 (Residue numbering according to EU index). Antibody Fc affinity for inhibitory FcγRIIb can also be enhanced to enhance antibody cross-linking and agonistic signals. Exemplary Fc modifications that enhance Fc binding to FcγRIIb include S267E / L328F and E233D / G237D / H268D / P271G / A330R (residue numbering by EU index).

本発明のもう1つの態様は、ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：98の軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：98のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体である。   Another aspect of the invention is an isolated antibody that binds human CD134, comprising the light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 98 and the heavy chain complementarity determining region (HCDR) HCDR1, HCDR2, and An antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising HCDR3, optionally having one, two or three amino acid substitutions in the VL of SEQ ID NO: 98.

SEQ ID NO：98：

；
ここで、X₅はVまたはPであり；かつ
X₆はFまたはYである。 SEQ ID NO: 98:

;
Where X ₅ is V or P; and
X ₆ is F or Y.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：134のアミノ酸配列を含むVHを含み、任意でSEQ ID NO：134のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134, optionally one, two or two in the VH of SEQ ID NO: 134 Has three amino acid substitutions.

SEQ ID NO：134

；
ここで、X1はVまたはLであり；
X2はMまたはIであり；
X3はD、G、A、SまたはEであり；
X4はVまたはAであり；
X5はLまたはIであり；
X6はTまたはKであり；かつ
X7はM、LまたはIである。 SEQ ID NO: 134

;
Where X1 is V or L;
X2 is M or I;
X3 is D, G, A, S or E;
X4 is V or A;
X5 is L or I;
X6 is T or K; and
X7 is M, L or I.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：97のアミノ酸配列を含むVHを含み、任意でSEQ ID NO：97のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97, optionally one, two or in the VH of SEQ ID NO: 97 Has three amino acid substitutions.

SEQ ID NO：97：

；
ここで、X₁はIまたはMであり；
X₂はAまたはVであり；
X₃はLまたはIであり；かつ
X₄はKまたはTである。 SEQ ID NO: 97:

;
Where X ₁ is I or M;
X ₂ is A or V;
X ₃ is L or I; and
X ₄ is K or T.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：99のVLおよびSEQ ID NO：134のVHを含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises the VL of SEQ ID NO: 99 and the VH of SEQ ID NO: 134.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：8、139または140のアミノ酸配列を含むHCDR3を含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 139, or 140.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：7、135、136、137または138のアミノ酸配列を含むHCDR2を含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 135, 136, 137, or 138.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含むHCDR1を含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、
a．SEQ ID NO：62もしくは63のアミノ酸配列を含むVL；および
SEQ ID NO：64、65、66、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、149、150もしくは151のアミノ酸配列を含み、任意でVH直鎖状アミノ酸残基位置11、56もしくは106に1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するVH；または
b．i．それぞれSEQ ID NO：62および64；
ii．それぞれSEQ ID NO：62および65；
iii．それぞれSEQ ID NO：62および66；
iv．それぞれSEQ ID NO：63および64；
v．それぞれSEQ ID NO：63および65；または
vi．それぞれSEQ ID NO：63および66
のアミノ酸配列を含むVLおよびVH
を含む。 In some embodiments described herein, the isolated antibody is
a. SEQ ID NO: VL comprising the amino acid sequence of 62 or 63; and
SEQ ID NO: 64, 65, 66, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 149, 150 or VH comprising 151 amino acid sequences and optionally having one, two or three amino acid substitutions at VH linear amino acid residue position 11, 56 or 106; or
b. i. SEQ ID NOs: 62 and 64, respectively;
ii. SEQ ID NOs: 62 and 65, respectively;
iii. SEQ ID NO: 62 and 66, respectively;
iv. SEQ ID NO: 63 and 64, respectively
v. SEQ ID NO: 63 and 65 respectively; or
vi. SEQ ID NO: 63 and 66, respectively
VL and VH containing the amino acid sequence of
including.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、SEQ ID NO：62および64、62および65、62および66、62および101、62および102、62および103、62および104、62および105、62および106、62および107、62および108、62および109、62および110、62および111、62および112、62および113、62および114、62および115、62および116、62および117、62および118、62および149、62および150、62および151、63および64、63および65、63および66、63および101、63および102、63および103、63および104、63および105、63および106、63および107、63および108、63および109、63および110、63および111、63および112、63および113、63および114、63および115、63および116、63および117、63および118、63および149、63および150、63および151のVLおよびVHを含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibodies are SEQ ID NOs: 62 and 64, 62 and 65, 62 and 66, 62 and 101, 62 and 102, 62 and 103, 62 and 104. 62 and 105, 62 and 106, 62 and 107, 62 and 108, 62 and 109, 62 and 110, 62 and 111, 62 and 112, 62 and 113, 62 and 114, 62 and 115, 62 and 116, 62 And 117, 62 and 118, 62 and 149, 62 and 150, 62 and 151, 63 and 64, 63 and 65, 63 and 66, 63 and 101, 63 and 102, 63 and 103, 63 and 104, 63 and 105 63 and 106, 63 and 107, 63 and 108, 63 and 109, 63 and 110, 63 and 111, 63 and 112, 63 and 113, 63 and 114, 63 and 115, 63 and 116, 63 and 117, 63 And 118, 63 and 149, 63 and 150, 63 and 151, including VL and VH.

本明細書に記載のいくつかの態様において、単離された抗体は、VH直鎖状残基位置11、56または106に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を含む。   In some embodiments described herein, the isolated antibody comprises one, two or three amino acid substitutions at VH linear residue position 11, 56 or 106.

本明細書に記載のいくつかの態様において、VH直鎖状残基位置にある1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換は、V11L、D56G、D56A、D56S、D56E、M106LまたはM106Iである。   In some embodiments described herein, the one, two or three amino acid substitutions at the VH linear residue position are V11L, D56G, D56A, D56S, D56E, M106L or M106I.

VH直鎖状残基位置11、55または99にある1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換は、抗体の安定性および／またはそのアゴニスト活性を強化しうる可能性がある。   It is possible that one, two or three amino acid substitutions at the VH linear residue position 11, 55 or 99 may enhance the stability of the antibody and / or its agonist activity.

本発明は、
（a）図27のアミノ酸配列（SEQ ID NO：99）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図27のアミノ酸配列（SEQ ID NO：100）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子を提供する。 The present invention
(A) the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of FIG. 27 (SEQ ID NO: 99) or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (b) the amino acid of FIG. A binding molecule comprising a light chain variable region comprising a sequence (SEQ ID NO: 100) or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions is provided.

本発明はまた、
（a）図26のアミノ酸配列（SEQ ID NO：97）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図26のアミノ酸配列（SEQ ID NO：98）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子も提供する。 The present invention also provides
(A) the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of FIG. 26 (SEQ ID NO: 97) or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (b) the amino acid of FIG. Also provided are binding molecules comprising a light chain variable region comprising a sequence (SEQ ID NO: 98) or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions.

いくつかの態様において、結合性分子はヒトCD134と結合する。いくつかの態様において、結合性分子は、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げない。   In some embodiments, the binding molecule binds to human CD134. In some embodiments, the binding molecule does not interfere with the binding of the human CD134 (OX40) receptor to the OX40 ligand (OX40L).

いくつかの態様において、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用は、前記CD134分子との結合が飽和する濃度またはそれを上回る濃度で、50％を超えては低下しない。   In some embodiments, the binding of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells is not reduced by more than 50% at concentrations above or above the saturation of binding to the CD134 molecule. .

いくつかの態様において、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用は、結合性分子の濃度が70nMで、70％を超えては低下しない。   In some embodiments, the binding of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells does not decrease beyond 70% at a concentration of binding molecule of 70 nM.

いくつかの態様において、結合性分子は、
SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38および／またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する。 In some embodiments, the binding molecule is
It binds to an epitope of the extracellular domain of human CD134 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 and / or SEQ ID NO: 92.

いくつかの態様において、結合性分子は、Fab断片、単鎖Fv（scFv）断片、または抗体である。   In some embodiments, the binding molecule is a Fab fragment, a single chain Fv (scFv) fragment, or an antibody.

いくつかの態様において、抗体は、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgM抗体、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4抗体などである。いくつかの態様において、抗体はIgG1またはIgG4抗体である。   In some embodiments, the antibody is an IgG, IgA, IgD, IgE or IgM antibody, such as an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody. In some embodiments, the antibody is an IgG1 or IgG4 antibody.

本発明はさらに、本発明による結合性分子または抗体をコードする核酸分子を提供する。さらに、本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域、重鎖、軽鎖可変領域、または軽鎖をコードする核酸分子も提供される。例示的なヒト化抗体には、本発明のヒト化12H3抗体またはヒト化20E5抗体がある。   The invention further provides a nucleic acid molecule encoding a binding molecule or antibody according to the invention. Further provided are nucleic acid molecules encoding the heavy chain variable region, heavy chain, light chain variable region, or light chain of the humanized antibody of the present invention. Exemplary humanized antibodies are humanized 12H3 antibodies or humanized 20E5 antibodies of the present invention.

いくつかの態様において、核酸分子は、
（a）図27のアミノ酸配列（SEQ ID NO：99）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図27のアミノ酸配列（SEQ ID NO：100）または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
をコードする。 In some embodiments, the nucleic acid molecule is
(A) the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of FIG. 27 (SEQ ID NO: 99) or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (b) the amino acid of FIG. It encodes a light chain variable region comprising a sequence (SEQ ID NO: 100) or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions.

もう1つの態様において、核酸分子は、12H3親マウス抗体のヒト化抗体の可変領域をコードする。可変領域は、抗体12H3_VL1VH1；12H3_VL1VH2；12H3_VL1VH3；12H3_VL2VH1；12H3_VL2VH2；または12H3_VL2VH3の可変領域から選択される。例示的な可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：67、68、69、70および71に示されている。   In another embodiment, the nucleic acid molecule encodes the variable region of a humanized antibody of the 12H3 parent mouse antibody. The variable region is selected from the variable regions of antibodies 12H3_VL1VH1; 12H3_VL1VH2; 12H3_VL1VH3; 12H3_VL2VH1; 12H3_VL2VH2; or 12H3_VL2VH3. Exemplary variable region amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 67, 68, 69, 70 and 71.

もう1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：69、70および71に示されたヒト化12H3重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。もう1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：67および68に示されたヒト化12H3軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。   In another embodiment, the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of the humanized 12H3 heavy chain variable region shown in SEQ ID NOs: 69, 70 and 71. In another embodiment, the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of the humanized 12H3 light chain variable region shown in SEQ ID NOs: 67 and 68.

もう1つの態様において、核酸分子は、20E5親マウス抗体のヒト化抗体の可変領域をコードする。例示的な可変領域には、抗体20E5_VL1VH1；20E5_VL1VH2；20E5_VL1VH3；20E5_VL2VH1；20E5_VL2VH2；および20E_VL2VH3の可変領域が含まれる。例示的な可変領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：62、63、64、65および66に示されている。   In another embodiment, the nucleic acid molecule encodes the variable region of a humanized antibody of the 20E5 parent mouse antibody. Exemplary variable regions include the variable regions of antibodies 20E5_VL1VH1; 20E5_VL1VH2; 20E5_VL1VH3; 20E5_VL2VH1; 20E5_VL2VH2; and 20E_VL2VH3. Exemplary variable region amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 62, 63, 64, 65 and 66.

もう1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：64、65および66に示されたヒト化20E5重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。もう1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：62または63に示されたヒト化20E5軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。   In another embodiment, the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of the humanized 20E5 heavy chain variable region shown in SEQ ID NOs: 64, 65 and 66. In another embodiment, the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of the humanized 20E5 light chain variable region shown in SEQ ID NO: 62 or 63.

本発明はまた、抗体12H3_VL1VH1；12H3_VL1VH2；12H3_VL1VH3；12H3_VL2VH1；12H3_VL2VH2；12H3_VL2VH3；20E5_VL1VH1；20E5_VL1VH2；20E5_VL1VH3；20E5_VL2VH1；20E5_VL2VH2；または20E_VL2VH3のヒト化可変領域（前の段落および実施例に示された通り）から選択されるヒト化可変領域を含む、抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする核酸分子も提供する。   The invention also includes antibodies 12H3_VL1VH1; 12H3_VL1VH2; 12H3_VL1VH3; 12H3_VL2VH1; 12H3_VL2VH2; 12H3_VL2VH3; 20E5_VL1VH1; 20E5_VL1VH2; 20E5_VL1VH; 20E5_VL1VH; 20E5_VL1VH; Also provided is a nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of an antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody, comprising a humanized variable region.

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：90のヒト化12H3抗体軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：87のヒト化重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 12H3 antibody light chain of SEQ ID NO: 90 (from N-terminal signal sequence

), Or humanized heavy chain of SEQ ID NO: 87 (from signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：90のヒト化12H3軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：88のヒト化重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 12H3 light chain (from N to SEQ ID NO: 90). Terminal signal sequence

), Or humanized heavy chain of SEQ ID NO: 88 (from signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：90のヒト化12H3軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：89の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 12H3 light chain (from N to SEQ ID NO: 90). Terminal signal sequence

Or the heavy chain of SEQ ID NO: 89 (from the signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：91のヒト化12H3軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：87の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 12H3 light chain of SEQ ID NO: 91 (from N Terminal signal sequence

), Or SEQ ID NO: 87 heavy chain (from signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：91のヒト化12H3軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：88の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 12H3 light chain of SEQ ID NO: 91 (from N Terminal signal sequence

) Or SEQ ID NO: 88 heavy chain (from signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：91のヒト化12H3軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：89の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 12H3 light chain of SEQ ID NO: 91 (from N Terminal signal sequence

Or the heavy chain of SEQ ID NO: 89 (from the signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：85のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：82の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 20E5 light chain (from N to SEQ ID NO: 85). Terminal signal sequence

), Or SEQ ID NO: 82 heavy chain (from signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：85のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：83の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 20E5 light chain (from N to SEQ ID NO: 85). Terminal signal sequence

), Or SEQ ID NO: 83 heavy chain (from signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：85のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：84の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 20E5 light chain (from N to SEQ ID NO: 85). Terminal signal sequence

), Or heavy chain of SEQ ID NO: 84 (from signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：86のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：82の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 20E5 light chain (from N to SEQ ID NO: 86). Terminal signal sequence

), Or SEQ ID NO: 82 heavy chain (from signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはヒト化抗体の重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：86のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：83の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the heavy or light chain of a humanized antibody or the heavy or light chain variable region of a humanized antibody is a humanized 20E5 light chain (from N to SEQ ID NO: 86). Terminal signal sequence

), Or SEQ ID NO: 83 heavy chain (from signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

いくつかの態様において、ヒト化重鎖または軽鎖またはヒト化抗体重鎖または軽鎖可変領域抗体をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：86のヒト化20E5軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）、またはSEQ ID NO：84の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）をコードする核酸分子である。 In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the humanized heavy or light chain or humanized antibody heavy or light chain variable region antibody comprises the humanized 20E5 light chain (from N-terminal signal sequence of SEQ ID NO: 86).

), Or heavy chain of SEQ ID NO: 84 (from signal sequence)

Is a nucleic acid molecule that encodes

SEQ ID NO：62〜71および／またはSEQ ID NO：82〜91に示されたアミノ酸配列をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：72〜81に示された配列を有する核酸分子である。   The nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62-71 and / or SEQ ID NO: 82-91 is a nucleic acid molecule having the sequence shown in SEQ ID NO: 72-81.

SEQ ID NO：72に示された核酸配列は、SEQ ID NO：82に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：72の核酸58〜414は、SEQ ID NO：64に示されたアミノ酸配列をコードする。   The nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 72 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 82. Nucleic acids 58-414 of SEQ ID NO: 72 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 64.

SEQ ID NO：73に示された核酸配列は、SEQ ID NO：83に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：73の核酸58〜414は、SEQ ID NO：65に示されたアミノ酸配列をコードする。   The nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 73 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 83. Nucleic acids 58-414 of SEQ ID NO: 73 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 65.

SEQ ID NO：74に示された核酸配列は、SEQ ID NO：84に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：74の核酸58〜414は、SEQ ID NO：66に示されたアミノ酸配列をコードする。   The nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 74 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 84. Nucleic acids 58-414 of SEQ ID NO: 74 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66.

SEQ ID NO：75に示された核酸配列は、SEQ ID NO：85に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：75の核酸58〜381は、SEQ ID NO：62に示されたアミノ酸配列をコードする。   The nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 75 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 85. Nucleic acids 58-381 of SEQ ID NO: 75 encode the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62.

SEQ ID NO：76に示された核酸配列は、SEQ ID NO：86に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：76の核酸58〜381は、SEQ ID NO：63に示されたアミノ酸配列をコードする。   The nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 76 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 86. Nucleic acids 58-381 of SEQ ID NO: 76 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 63.

SEQ ID NO：77に示された核酸配列は、SEQ ID NO：87に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：77の核酸58〜420は、SEQ ID NO：69に示されたアミノ酸配列をコードする。   The nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 77 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 87. Nucleic acids 58-420 of SEQ ID NO: 77 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69.

SEQ ID NO：78に示された核酸配列は、SEQ ID NO：88に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：78の核酸58〜420は、SEQ ID NO：70に示されたアミノ酸配列をコードする。   The nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 78 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 88. Nucleic acids 58-420 of SEQ ID NO: 78 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70.

SEQ ID NO：79に示された核酸配列は、SEQ ID NO：89に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：79の核酸58〜420は、SEQ ID NO：71に示されたアミノ酸配列をコードする。   The nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 79 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 89. Nucleic acids 58-420 of SEQ ID NO: 79 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71.

SEQ ID NO：80に示された核酸配列は、SEQ ID NO：90に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：80の核酸67〜390は、SEQ ID NO：67に示されたアミノ酸配列をコードする。   The nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 80 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 90. Nucleic acids 67-390 of SEQ ID NO: 80 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 67.

SEQ ID NO：81に示された核酸配列は、SEQ ID NO：91に示されたアミノ酸配列をコードする。SEQ ID NO：81の核酸67〜390は、SEQ ID NO：68に示されたアミノ酸配列をコードする。   The nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 81 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 91. Nucleic acids 67-390 of SEQ ID NO: 81 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68.

本発明のいくつかの態様は、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、および／またはSEQ ID NO：81に示された核酸配列を含む核酸分子を提供する。1つの好ましい態様において、核酸分子は、シグナルペプチドをコードする核酸配列を伴わない配列を含む。これは、多くの異なるシグナルペプチドを用いうることが理由である。本発明はしたがって、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、および／またはSEQ ID NO：81に示された核酸配列を含む核酸分子であって、シグナルペプチドをコードする核酸配列が、存在しないかまたはコードされるポリペプチドの分泌を導くのに適した異なるシグナルペプチドをコードする核酸配列によって置き換えられている核酸分子を提供する。   Some embodiments of the invention include SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 , SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, and / or a nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 81 is provided. In one preferred embodiment, the nucleic acid molecule comprises a sequence without a nucleic acid sequence encoding a signal peptide. This is because many different signal peptides can be used. The present invention therefore includes SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO : 79, SEQ ID NO: 80, and / or a nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 81, wherein the nucleic acid sequence encoding the signal peptide is absent or of the encoded polypeptide Nucleic acid molecules are provided that are replaced by nucleic acid sequences encoding different signal peptides suitable for directing secretion.

いくつかの態様において、本発明は、
SEQ ID NO：72の核酸残基58〜414；
SEQ ID NO：73の核酸残基58〜414；
SEQ ID NO：74の核酸残基58〜414；
SEQ ID NO：75の核酸残基58〜381；
SEQ ID NO：76の核酸残基58〜381；
SEQ ID NO：77の核酸残基58〜420；
SEQ ID NO：78の核酸残基58〜420；
SEQ ID NO：79の核酸残基58〜420；
SEQ ID NO：80の核酸残基67〜390；または
SEQ ID NO：81の核酸残基67〜390
を含む核酸分子を提供する。 In some embodiments, the present invention provides:
SEQ ID NO: 72 nucleic acid residues 58-414;
SEQ ID NO: 73 nucleic acid residues 58-414;
SEQ ID NO: 74 nucleic acid residues 58-414;
SEQ ID NO: 75 nucleic acid residues 58-381;
SEQ ID NO: 76 nucleic acid residues 58-381;
SEQ ID NO: 77 nucleic acid residues 58-420;
SEQ ID NO: 78 nucleic acid residues 58-420;
SEQ ID NO: 79 nucleic acid residues 58-420;
SEQ ID NO: 80 nucleic acid residues 67-390; or
Nucleic acid residues 67-390 of SEQ ID NO: 81
A nucleic acid molecule comprising

いくつかの態様において、本発明は、SEQ ID NO：101〜133または146〜148のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。   In some embodiments, the present invention provides a nucleic acid molecule encoding a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101-133 or 146-148.

本発明はさらに、本発明による核酸を含む遺伝子送達媒体またはベクターを提供する。   The present invention further provides a gene delivery vehicle or vector comprising a nucleic acid according to the present invention.

さらに、本発明による核酸またはベクターを含む、単離された細胞もしくは組換え細胞、またはインビトロ細胞培養細胞も提供される。細胞は好ましくは、本明細書において定義される通りの宿主細胞である。いくつかの態様において、細胞は、抗体の産生のために一般的に用いられる細胞、例えば、CHO細胞、CHO-K1SV細胞（Lonza Biologics, Walkersville, MD）、CHO-K1細胞（ATCC CRL-61）、NSO細胞（European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wilthsire, UK, ECACC N. 85110503）、SP2／0細胞（American Type Culture Collection（ATCC）, Manassas, VA, CRL-1581） HEK 293-F細胞、PER.C6細胞、FO細胞（ATCC CRL-1646）Ag653細胞（ATCC CRL-1580）、またはハイブリドーマなどである。もう1つの態様において、細胞は昆虫細胞である。   Further provided are isolated or recombinant cells or in vitro cell culture cells comprising a nucleic acid or vector according to the invention. The cell is preferably a host cell as defined herein. In some embodiments, the cells are cells commonly used for the production of antibodies, such as CHO cells, CHO-K1SV cells (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 cells (ATCC CRL-61). , NSO cells (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wilthsire, UK, ECACC N. 85110503), SP2 / 0 cells (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581) HEK 293-F Cells, PER.C6 cells, FO cells (ATCC CRL-1646), Ag653 cells (ATCC CRL-1580), or hybridomas. In another embodiment, the cell is an insect cell.

本発明はさらに、添付の特許請求の範囲に記載の結合性分子または特許請求の範囲に記載の抗体が作製されることを特徴とする、結合性分子を作製するための方法を提供する。産生された抗体を、細胞培養物、細胞培養上清／培地またはそれらの組み合わせから収集する。収集された抗体を精製して、容器、好ましくは貯蔵用または出荷用容器にパッケージングする。   The invention further provides a method for producing a binding molecule, characterized in that a binding molecule according to the appended claims or an antibody according to the claims is produced. The antibody produced is collected from the cell culture, cell culture supernatant / medium or a combination thereof. The collected antibody is purified and packaged in a container, preferably a storage or shipping container.

本発明はさらに、免疫応答の強化を必要とする個体の治療に用いるための、本発明による結合性分子または抗体を提供する。   The invention further provides a binding molecule or antibody according to the invention for use in the treatment of an individual in need of enhanced immune response.

また、それを必要とする個体において癌の予防または治療に用いるための、本発明による結合性分子または抗体も提供される。   Also provided is a binding molecule or antibody according to the present invention for use in the prevention or treatment of cancer in an individual in need thereof.

さらに、慢性ウイルス感染症および／または細胞内細菌感染症に罹患しているかまたは罹患するリスクのある個体の治療に用いるための、本発明による結合性分子または抗体も提供される。   Further provided are binding molecules or antibodies according to the invention for use in the treatment of individuals suffering from or at risk of suffering from chronic viral infections and / or intracellular bacterial infections.

本発明はさらに、本発明による結合性分子または抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。   The present invention further provides a pharmaceutical composition comprising a binding molecule or antibody according to the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明は、抗CD134抗体、抗CD134抗体の抗原結合性断片、および抗CD134抗体の誘導体を含む、ヒトCD134と結合する、単離された結合性分子を提供する。結合性分子は、以下の機能的特性のうち少なくとも1つによって特徴づけられる：（a）ヒトCD134と1×10^-6Mまたはそれ未満のK_dで結合する、ならびに（b）ヒトCD134（OX40）受容体のOX40リガンド（OX40L）との結合を妨げない；（c）エフェクターT細胞上のヒトCD134に対するアゴニスト活性、および／または調節性T細胞上のヒトCD134に対するアンタゴニスト活性を有する；（d）最大500nMまでの濃度でCD40受容体と結合しない；（e）最大500nMまでの濃度でCD137受容体と結合しない；（f）最大500nMまでの濃度でCD271受容体と結合しない；（g）単離されたヒトT細胞によるIL-2産生を強化することができる；（h）免疫応答を強化することができる；（i）腫瘍細胞増殖を阻害することができる；ならびに（j）癌に対する治療効果を有する。いくつかの態様において、結合性分子は、ヒトCD134と、1×10^-7Mもしくはそれ未満の、または1×10^-8Mもしくはそれ未満の、または5×1×10^-9Mもしくはそれ未満のK_dで結合する。 The present invention provides isolated binding molecules that bind to human CD134, including anti-CD134 antibodies, antigen-binding fragments of anti-CD134 antibodies, and derivatives of anti-CD134 antibodies. A binding molecule is characterized by at least one of the following functional properties: (a) binds human CD134 with a K _d of 1 × 10 ⁻⁶ M or less, and (b) human CD134 (OX40 ) Does not interfere with binding of the receptor to OX40 ligand (OX40L); (c) has agonist activity against human CD134 on effector T cells and / or antagonist activity against human CD134 on regulatory T cells; (d) Does not bind to CD40 receptor at concentrations up to 500 nM; (e) Does not bind to CD137 receptor at concentrations up to 500 nM; (f) Does not bind to CD271 receptor at concentrations up to 500 nM; (g) Isolation IL-2 production by cultured human T cells can be enhanced; (h) immune responses can be enhanced; (i) tumor cell proliferation can be inhibited; and (j) therapeutic effects on cancer Have In some embodiments, the binding molecule is human CD134 and 1 × 10 ⁻⁷ M or less, or 1 × 10 ⁻⁸ M or less, or 5 × 1 × 10 ⁻⁹ M or less. Bind with _Kd .

本発明の抗体および他の結合性分子は、従来の手法によって調製した上で、続いて、OX40LのCD134との結合を妨げない結合性分子を同定および入手する目的でスクリーニングすることができる。例えば、CD134を飽和濃度のOX40Lに曝露させた場合にもCD134と結合する結合性分子を選別することができる。   Antibodies and other binding molecules of the invention can be prepared by conventional techniques and subsequently screened for the purpose of identifying and obtaining binding molecules that do not interfere with the binding of OX40L to CD134. For example, even when CD134 is exposed to a saturated concentration of OX40L, a binding molecule that binds to CD134 can be selected.

本発明のいくつかの態様は、ヒトCD134と結合するマウス抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体を提供する。いくつかの態様において、マウス抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体は、100nMもしくはそれ未満、または10nMもしくはそれ未満のK_dでヒトCD134と特異的に結合する、かつ／またはヒトCD134に対するアゴニスト活性を有し、その結果、エフェクターT細胞の刺激および／または調節性T細胞の抑制をもたらすモノクローナル抗体である。そのような例示的な抗体の1つは、モノクローナル抗体クローン12H3である。抗体クローン12H3の重鎖可変領域全体のアミノ酸配列、および重鎖（VH）の可変領域の3つのCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：12および14〜16に示されている。抗体クローン12H3の軽鎖可変領域全体のアミノ酸配列、および軽鎖（VL）の可変領域の3つのCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：13および17〜19に示されている。もう1つの例示的な抗体は、モノクローナル抗体クローン20E5である。抗体クローン20E5の重鎖可変領域全体のアミノ酸配列、および重鎖（VH）の可変領域の3つのCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：4および6〜8に示されている。抗体クローン20E5の軽鎖可変領域全体のアミノ酸配列、および軽鎖（VL）の可変領域の3つのCDRのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：5および9〜11に示されている。さらに他の例示的な抗体には、ヒト化抗体12H3_VL1VH1、12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2、12H3_VL2VH3、およびヒト化抗体20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、20E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2、20E5_VL2VH3、ならびに実施例14に記載されている通りの重鎖可変領域を含むものの最適化された変異体がある。これらの抗体は、SEQ ID NO：67（12H3_VL1）、SEQ ID NO：68（12H3_VL2）、SEQ ID NO：69（12H3_VH1）、SEQ ID NO：70（12H3_VH2）、SEQ ID NO：71（12H3_VH3）、SEQ ID NO：62（20E5_VL1）、SEQ ID NO：63（20E5_VL2）、SEQ ID NO：64（20E5_VH1）、SEQ ID NO：65（20E5_VH2）、SEQ ID NO：66（20E5_VH3）の可変領域配列、ならびにSEQ ID NO：101〜133および146〜151に示されたアミノ酸配列を有する、表6および9に示された可変領域を含む。 Some embodiments of the invention provide mouse, human or humanized antibodies that bind to human CD134. In some embodiments, the murine, human, or humanized antibody specifically binds human CD134 with a _Kd of 100 nM or less, or 10 nM or less, and / or has agonist activity against human CD134. As a result, it is a monoclonal antibody that results in stimulation of effector T cells and / or suppression of regulatory T cells. One such exemplary antibody is monoclonal antibody clone 12H3. The amino acid sequence of the entire heavy chain variable region of antibody clone 12H3 and the amino acid sequences of the three CDRs of the variable region of the heavy chain (VH) are shown in SEQ ID NOs: 12 and 14-16, respectively. The amino acid sequence of the entire light chain variable region of antibody clone 12H3 and the amino acid sequences of the three CDRs of the light chain (VL) variable region are shown in SEQ ID NOs: 13 and 17-19, respectively. Another exemplary antibody is monoclonal antibody clone 20E5. The amino acid sequence of the entire heavy chain variable region of antibody clone 20E5 and the amino acid sequences of the three CDRs of the variable region of the heavy chain (VH) are shown in SEQ ID NOs: 4 and 6-8, respectively. The amino acid sequence of the entire light chain variable region of antibody clone 20E5 and the amino acid sequences of the three CDRs of the light chain (VL) variable region are shown in SEQ ID NOs: 5 and 9-11, respectively. Further exemplary antibodies include humanized antibodies 12H3_VL1VH1, 12H3_VL1VH2, 12H3_VL1VH3, 12H3_VL2VH1, 12H3_VL2VH2, 12H3_VL2VH3, and humanized antibodies 20E5_VL1VH1, 20E5_VL1 There are optimized variants of street heavy chain variable regions. These antibodies are SEQ ID NO: 67 (12H3_VL1), SEQ ID NO: 68 (12H3_VL2), SEQ ID NO: 69 (12H3_VH1), SEQ ID NO: 70 (12H3_VH2), SEQ ID NO: 71 (12H3_VH3), SEQ ID NO: 62 (20E5_VL1), SEQ ID NO: 63 (20E5_VL2), SEQ ID NO: 64 (20E5_VH1), SEQ ID NO: 65 (20E5_VH2), SEQ ID NO: 66 (20E5_VH3) variable region sequence, and It includes the variable regions shown in Tables 6 and 9, having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 101-133 and 146-151.

本発明はまた、抗体12H3_VL1VH1；12H3_VL1VH2；12H3_VL1VH3；12H3_VL2VH1；12H3_VL2VH2；12H3_VL2VH3；20E5_VL1VH1；20E5_VL1VH2；20E5_VL1VH3；20E5_VL2VH1；20E5_VL2VH2；または20E_VL2VH3のヒト化可変領域（前の段落および実施例に示された通り）から選択されるヒト化可変領域、またはSEQ ID NO：101〜133および146〜151の重鎖可変領域を含む抗体も提供する。   The invention also includes antibodies 12H3_VL1VH1; 12H3_VL1VH2; 12H3_VL1VH3; 12H3_VL2VH1; 12H3_VL2VH2; 12H3_VL2VH3; 20E5_VL1VH1; 20E5_VL1VH2; 20E5_VL1VH; 20E5_VL1VH; 20E5_VL1VH; Also provided are antibodies comprising the humanized variable regions or heavy chain variable regions of SEQ ID NOs: 101-133 and 146-151.

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：90の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：87の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody has the light chain of SEQ ID NO: 90 (from the N-terminal signal sequence).

) And SEQ ID NO: 87 heavy chain (from signal sequence)

Is a humanized 12H3 antibody.

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：90の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：88の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody has the light chain of SEQ ID NO: 90 (from the N-terminal signal sequence).

And the heavy chain of SEQ ID NO: 88 (from the signal sequence)

Is a humanized 12H3 antibody.

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：90の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：89の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody has the light chain of SEQ ID NO: 90 (from the N-terminal signal sequence).

And the heavy chain of SEQ ID NO: 89 (from the signal sequence)

Is a humanized 12H3 antibody.

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：91の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：87の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody comprises the light chain of SEQ ID NO: 91 (from the N-terminal signal sequence).

) And SEQ ID NO: 87 heavy chain (from signal sequence)

Is a humanized 12H3 antibody.

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：91の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：88の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody comprises the light chain of SEQ ID NO: 91 (from the N-terminal signal sequence).

And the heavy chain of SEQ ID NO: 88 (from the signal sequence)

Is a humanized 12H3 antibody.

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：91の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：89の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化12H3抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody comprises the light chain of SEQ ID NO: 91 (from the N-terminal signal sequence).

And the heavy chain of SEQ ID NO: 89 (from the signal sequence)

Is a humanized 12H3 antibody.

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：85の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：82の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody has the light chain (from N-terminal signal sequence of SEQ ID NO: 85).

And the heavy chain of SEQ ID NO: 82 (from the signal sequence)

Humanized 20E5 antibody, including

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：85の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：83の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody has the light chain (from N-terminal signal sequence of SEQ ID NO: 85).

And the heavy chain of SEQ ID NO: 83 (from the signal sequence)

Humanized 20E5 antibody, including

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：85の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：84の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody has the light chain (from N-terminal signal sequence of SEQ ID NO: 85).

And the heavy chain of SEQ ID NO: 84 (from the signal sequence)

Humanized 20E5 antibody, including

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：86の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：82の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody has the light chain of SEQ ID NO: 86 (from the N-terminal signal sequence).

And the heavy chain of SEQ ID NO: 82 (from the signal sequence)

Humanized 20E5 antibody, including

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：86の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：83の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody has the light chain of SEQ ID NO: 86 (from the N-terminal signal sequence).

And the heavy chain of SEQ ID NO: 83 (from the signal sequence)

Humanized 20E5 antibody, including

いくつかの態様において、ヒト化抗体は、SEQ ID NO：86の軽鎖（からN末端シグナル配列

を除いたもの）およびSEQ ID NO：84の重鎖（からシグナル配列

を除いたもの）を含むヒト化20E5抗体である。 In some embodiments, the humanized antibody has the light chain of SEQ ID NO: 86 (from the N-terminal signal sequence).

And the heavy chain of SEQ ID NO: 84 (from the signal sequence)

Humanized 20E5 antibody, including

本発明の抗体は、これらのCDRの1つもしくは複数、または1CDR当たり1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するこれらのCDRの1つもしくは複数を含みうる。置換は「保存的」置換であってよい。機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的置換は当技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO 2010／019702号の表1に記載されている。例示的な保存的置換は表1に示されている。アミノ酸は周知の3文字コードを用いて表される。   An antibody of the invention may comprise one or more of these CDRs, or one or more of these CDRs having one, two or three amino acid substitutions per CDR. The substitution may be a “conservative” substitution. Conservative substitutions leading to functionally similar amino acids are well known in the art and are described, for example, in Table 1 of WO 2010/019702, which is incorporated herein by reference. Exemplary conservative substitutions are shown in Table 1. Amino acids are represented using well-known three letter codes.

（表１）

(Table 1)

クローン12H3およびクローン20E5がヒトCD134と結合することを考えれば、それらのそれぞれのVH配列およびVL配列を、他の抗CD134抗体と「混合および適合させて」、さらなる抗体を作り出すことができる。そのような「混合および適合させた」抗体のヒトCD134との結合は、実施例に記載したアッセイを含む、当技術分野において公知の結合アッセイを用いて試験することができる。1つのケースでは、VH領域およびVL領域を混合および適合させる際に、特定のVH／VL対合によるVH配列を、構造的に類似したVH配列によって置き換える。同様に、別のケースでは、特定のVH／VL対合によるVL配列を、構造的に類似したVL配列によって置き換える。   Given that clone 12H3 and clone 20E5 bind to human CD134, their respective VH and VL sequences can be “mixed and matched” with other anti-CD134 antibodies to create additional antibodies. The binding of such “mixed and matched” antibodies to human CD134 can be tested using binding assays known in the art, including the assays described in the Examples. In one case, when mixing and matching the VH and VL regions, the VH sequence with a particular VH / VL pairing is replaced by a structurally similar VH sequence. Similarly, in another case, a VL sequence with a particular VH / VL pairing is replaced by a structurally similar VL sequence.

1つまたは2つのCDR領域のみを含む分子（場合によっては、さらに単一のCDRまたはその一部のみ、特にCDR3）は、そのCDRの由来となった抗体の抗原結合活性を保つことができる。例えば、Laune et al. JBC 1997; 272: 30937-44；Monnet et al. JBC 1999; 274:3789-96；Qiu et al. Nature Biotechnology 2007; 25: 921-9；Ladner et al. Nature Biotechnology 2007; 25: 875-7；Heap et al. J Gen Virol 2005; 86: 1791-1800；Nicaise et al. Protein Science 2004; 13: 1882-91；Vaughan and Sollazzo Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 2001; 4:417-430；Quiocho Nature 1993; 362: 293-4；Pessi et al. Nature 1993; 362: 367-9；Bianchi et al. J Mol Biol 1994; 236: 649-59；およびGao et al. J Biol Chem 1994; 269: 32389-93を参照。   Molecules containing only one or two CDR regions (possibly even a single CDR or a portion thereof, in particular CDR3) can retain the antigen-binding activity of the antibody from which the CDR was derived. For example, Laune et al. JBC 1997; 272: 30937-44; Monnet et al. JBC 1999; 274: 3789-96; Qiu et al. Nature Biotechnology 2007; 25: 921-9; Ladner et al. Nature Biotechnology 2007; 25: 875-7; Heap et al. J Gen Virol 2005; 86: 1791-1800; Nicaise et al. Protein Science 2004; 13: 1882-91; Vaughan and Sollazzo Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 2001; 4: 417- 430; Quiocho Nature 1993; 362: 293-4; Pessi et al. Nature 1993; 362: 367-9; Bianchi et al. J Mol Biol 1994; 236: 649-59; and Gao et al. J Biol Chem 1994; 269: See 32389-93.

したがって、本発明の1つの態様は、以下のものを含む、単離された抗ヒトCD134抗体である：（a）SEQ ID NO：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（b）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。   Accordingly, one embodiment of the invention is an isolated anti-human CD134 antibody comprising: (a) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; (b) SEQ ID NO: Light chain variable region comprising the amino acid sequence of 13.

本発明によるさらなる態様においては、以下のものを含む単離されたCD134結合性分子が提供される：（a）SEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1；および／または（b）SEQ ID NO：15のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2；および／または（c）SEQ ID NO：16のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3。   In a further embodiment according to the present invention there is provided an isolated CD134 binding molecule comprising: (a) a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; and / or (b) SEQ Heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of ID NO: 15; and / or (c) heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

本発明によるさらなる態様においては、以下のものを含む単離されたCD134結合性分子が提供される：（a）SEQ ID NO：17のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1；および／または（b）SEQ ID NO：18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2；および／または（c）SEQ ID NO：19のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3。   In a further embodiment according to the present invention there is provided an isolated CD134 binding molecule comprising: (a) a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; and / or (b) SEQ Light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of ID NO: 18; and / or (c) light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.

したがって、本発明の1つの態様は、以下のものを含む単離された抗ヒトCD134抗体である：（a）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；（b）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。   Accordingly, one embodiment of the invention is an isolated anti-human CD134 antibody comprising: (a) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; (b) SEQ ID NO : Light chain variable region comprising 5 amino acid sequences.

本発明によるさらなる態様においては、以下のものを含む単離されたCD134結合性分子が提供される：（a）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1；および／または（b）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2；および／または（c）SEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3。   In a further embodiment according to the present invention there is provided an isolated CD134 binding molecule comprising: (a) a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; and / or (b) SEQ Heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of ID NO: 7; and / or (c) heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

本発明による1つのさらなる態様においては、以下のものを含む単離されたCD134結合性分子が提供される：（a）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1；および／または（b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2；および／または（c）SEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3。   In one further embodiment according to the present invention there is provided an isolated CD134 binding molecule comprising: (a) a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9; and / or (b Light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and / or (c) light chain CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.

クローン12H3およびクローン20E5がヒトCD134と結合すること、ならびに抗原結合特異性が主としてCDR1、CDR2およびCDR3領域によって与えられることを考えれば、VH CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにVL CDR1、CDR2およびCDR3配列を「混合および適合させて」、さらなる抗CD134抗体を作り出すことができる。例えば、複数の異なる抗CD134抗体に由来するCDRを混合および適合させることができるが、各抗体は典型的にはVH CDR1、CDR2およびCDR3ならびにVL CDR1、CDR2およびCDR3を含むと考えられる。そのような「混合および適合させた」抗体のCD134との結合は、上記の、および実施例に記載した結合アッセイ（例えば、ELISA、Biacore分析）を用いて試験することができる。1つのケースでは、VH CDR配列を混合および適合させる際に、特定のVH配列に由来するCDR1、CDR2および／またはCDR3配列を、構造的に類似したCDR配列によって置き換える。同様に、VL CDR配列を混合および適合させる際に、特定のVL配列に由来するCDR1、CDR2および／またはCDR3配列を、典型的には、構造的に類似したCDR配列によって置き換える。1つまたは複数のVHおよび／またはVL CDR領域配列を、本明細書に開示されたCDR配列由来の構造的に類似した配列によって置き換えることにより、新規なVH配列およびVL配列を作り出しうることは、当業者には容易に明らかであろう。   Given that clone 12H3 and clone 20E5 bind to human CD134 and that antigen binding specificity is primarily conferred by the CDR1, CDR2 and CDR3 regions, the VH CDR1, CDR2 and CDR3 sequences and the VL CDR1, CDR2 and CDR3 sequences “Mixed and matched” can create additional anti-CD134 antibodies. For example, CDRs from multiple different anti-CD134 antibodies can be mixed and matched, but each antibody will typically include VH CDR1, CDR2 and CDR3 and VL CDR1, CDR2 and CDR3. The binding of such “mixed and matched” antibodies to CD134 can be tested using the binding assays described above and in the Examples (eg, ELISA, Biacore analysis). In one case, the CDR1, CDR2 and / or CDR3 sequences derived from a particular VH sequence are replaced by structurally similar CDR sequences when mixing and matching VH CDR sequences. Similarly, in mixing and matching VL CDR sequences, CDR1, CDR2 and / or CDR3 sequences derived from a particular VL sequence are typically replaced by structurally similar CDR sequences. By replacing one or more VH and / or VL CDR region sequences with structurally similar sequences derived from the CDR sequences disclosed herein, it is possible to create new VH and VL sequences. It will be readily apparent to those skilled in the art.

抗CD134抗体のクラス（例えば、IgG、IgM、IgE、IgAまたはIgD）およびサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4）は、ELISAまたはウエスタンブロット法ならびに他の手法などによる、任意の適した方法によって判定することができる。または、クラスおよびサブクラスを、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全体または一部分の配列を決定して、それらのアミノ酸配列をさまざまなクラスおよびサブクラスの免疫グロブリンの公知のアミノ酸配列と比較して、抗体のクラスおよびサブクラスを判定することによって判定することもできる。抗CD134抗体は、IgG、IgM、IgE、IgAまたはIgD分子であってよい。例えば、抗CD134抗体は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブクラスであるIgGであってよい。したがって、本発明の別の局面は、抗CD134抗体のクラスまたはサブクラスを別のクラスまたはサブクラスに転換させるための方法を提供する。   The class (eg, IgG, IgM, IgE, IgA or IgD) and subclass (eg, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4) of the anti-CD134 antibody is any suitable method, such as by ELISA or Western blotting and other techniques. Can be determined. Alternatively, the class and subclass can be sequenced in whole or in part of the antibody heavy and / or light chain constant domains and their amino acid sequences compared to known amino acid sequences of different classes and subclasses of immunoglobulins It can also be determined by determining the class and subclass of the antibody. The anti-CD134 antibody may be an IgG, IgM, IgE, IgA or IgD molecule. For example, the anti-CD134 antibody may be an IgG that is an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 subclass. Accordingly, another aspect of the invention provides a method for converting a class or subclass of an anti-CD134 antibody to another class or subclass.

いくつかの態様において、抗CD134抗体はIgG4アイソタイプのものである。本発明の態様による結合性分子には、モノクローナル抗体、その断片、ペプチドおよび他の化学的実体が含まれる。モノクローナル抗体は、哺乳動物に免疫処置を行って、その後に関心対象のモノクローナル抗体を産生するプラズマB細胞の単離、および骨髄腫細胞との融合を行う、従来の方法によって作製することができる。   In some embodiments, the anti-CD134 antibody is of the IgG4 isotype. Binding molecules according to aspects of the present invention include monoclonal antibodies, fragments thereof, peptides and other chemical entities. Monoclonal antibodies can be produced by conventional methods of immunizing a mammal followed by isolation of plasma B cells producing the monoclonal antibody of interest and fusion with myeloma cells.

さまざまな態様において、結合部分は、実際の抗体である代わりに、抗体模倣物（例えば、非抗体性スキャフォールドに基づくもの）、RNAアプタマー、小分子またはCovX-bodyであってよい。   In various embodiments, the binding moiety may be an antibody mimetic (eg, based on a non-antibody scaffold), RNA aptamer, small molecule or CovX-body instead of being an actual antibody.

抗体模倣物（例えば、高度の安定性を有しながらも、特定の位置に可変性を導入することを可能にする非抗体性スキャフォールド構造）を用いて、分子ライブラリーを作り出し、それを結合部分の由来としうることが理解されるであろう。生化学の当業者は、多くのそのような分子に精通しているであろう。そのような分子は、本発明の作用物質における結合部分として用いることができる。   Create and bind molecular libraries using antibody mimics (eg, non-antibody scaffold structures that allow for the introduction of variability at specific positions while having a high degree of stability) It will be understood that the part may be derived from. Those skilled in biochemistry will be familiar with many such molecules. Such molecules can be used as binding moieties in the agents of the present invention.

例示的な抗体模倣物は、Skerra et al.（2007, Curr. Opin. Biotech., 18: 295-304）で考察されており、これには以下のものが含まれる:アフィボディ（affibody）（トリネクチン（Trinectin）とも呼ばれる; Nygren et al., 2008, FEBS J, 275, 2668-2676）；CTLD（テトラネクチン（Tetranectin）とも呼ばれる；Thogersen st al., Innovations Pharmac. Technol. (2006), 27-30）；アドネクチン（adnectin）（モノボディ（monobody）とも呼ばれる；Koide et al., Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95-109）；アンチカリン（anticalin）（Schlehuber et al., Drug Discovery Today (2005), 10, 23-33）；DARPin（アンキリン；Binz et al., Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582）；アヴィマー（avimer）（Silverman et al., Nat. Biotechnol. (2005), 23, 1556-1561）；ミクロボディ（microbody）（Krause et al., FEBS J, (2007), 274, 86-95）；ペプチドアプタマー（Borghouts et al., Expert. Opin. Biol. Ther. (2005), 5, 783-797）；Kunitzドメイン（Attucci et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2006) 318, 803-809）；アフィリン（affilin）（Hey et al., Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522）。   Exemplary antibody mimetics are discussed in Skerra et al. (2007, Curr. Opin. Biotech., 18: 295-304), including: affibody ( Also called Trinectin; Nygren et al., 2008, FEBS J, 275, 2668-2676); CTLD (also called Tetranectin); Thogersen st al., Innovations Pharmac. Technol. (2006), 27- 30); adnectin (also called monobody; Koide et al., Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95-109); anticalin (Schlehuber et al., Drug) Discovery Today (2005), 10, 23-33); DARPin (Ankyrin; Binz et al., Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582); Avimer (Silverman et al., Nat. Biotechnol) (2005), 23, 1556-1561); microbody (Krause et al., FEBS J, (2007), 274, 86-95); peptide aptamer (Borghouts et al., Expert. Opin. Biol Ther (2005), 5, 783-797); Kunitz domain (Attucci et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2006) 318, 803-809); affilin (Hey et al., Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522).

従って、以下を含む群または以下からなる群より選択される抗体模倣体が好ましい：アフィボディ、テトラネクチン（CTLD）、アドネクチン（モノボディ）、アンチカリン、DARPin（アンキリン）、アヴィマー、iMab、ミクロボディ、ペプチドアプタマー、Kunitzドメイン、アプタマー、およびアフィリン。   Accordingly, an antibody mimetic selected from the group comprising or consisting of: Affibody, tetranectin (CTLD), adnectin (monobody), anticalin, DARPin (ankyrin), Avimer, iMab, microbody , Peptide aptamers, Kunitz domains, aptamers, and affilin.

「小分子」とは、900ダルトンまたはそれ未満の低分子量有機化合物のことを意味する。核酸、タンパク質および多糖類（デンプンまたはセルロース）などの大型の生体高分子は、「小分子」としては含まれないが、それらの構成要素である単量体（それぞれ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、アミノ酸および単糖類）およびオリゴマー（すなわち、ジヌクレオチドなどの短い重合体、抗酸化物質グルタチオンなどのペプチド、およびスクロースなどの二糖類）は含まれる。小分子の生成については、Mayes & Whitcombe, 2005, Adv. Drug Deliv. Rev. 57.1742-78およびRoot-Bernstein & Dillon, 2008, Curr. Pharm. Des. 14:55-62に記載されている。   “Small molecule” means a low molecular weight organic compound of 900 daltons or less. Large biopolymers such as nucleic acids, proteins and polysaccharides (starch or cellulose) are not included as “small molecules” but are constituent monomers (ribonucleotides or deoxyribonucleotides, amino acids, respectively) And monosaccharides) and oligomers (ie short polymers such as dinucleotides, peptides such as the antioxidant glutathione, and disaccharides such as sucrose). The generation of small molecules is described in Mayes & Whitcombe, 2005, Adv. Drug Deliv. Rev. 57.1742-78 and Root-Bernstein & Dillon, 2008, Curr. Pharm. Des. 14: 55-62.

CovX-Bodyは、ファルマコフォアを、リンカーを介して、特別に設計された抗体の結合部位と共有結合性に接合させて、抗体を効果的にリプログラミングすることによって作り出される（Tryder et al., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17:501-6）。 その結果得られるのは、各構成要素が無傷のCovX-Bodyの望ましい特色に寄与する、新たなクラスの化学的実体であり、特に、この実体は、ペプチドの生物学的作用および長期間にわたる抗体半減期を有する。   CovX-Body is created by effectively reprogramming an antibody by covalently conjugating a pharmacophore with a specifically designed antibody binding site via a linker (Tryder et al. , 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17: 501-6). The result is a new class of chemical entities where each component contributes to the desired characteristics of intact CovX-Body, in particular, this entity is the biological action of peptides and long-lasting antibodies. Has a half-life.

ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン発現ライブラリー（Stratagene Corp., La Jolla, California；Cambridge Antibody Technology Ltd., London, England）を用いてヒト抗体断片（VH、VL、Fv、Fd、Fab、または(Fab')₂）を作製した上で、キメラ抗体を作製するためのものに類似した手法を用いて、これらの断片をそれらに対する適切な部分の融合によってヒト抗体全体を構築するために用いることを含む、いくつかの異なる方法によって作製することができる。例えば、ヒト抗体を、Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397:385-96およびPCT国際公開公報第WO09／085462号）に記載されたように、抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域をバクテリオファージpIXコートタンパク質との融合タンパク質として発現するファージディスプレイライブラリーから単離することもできる。また、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウスにおいて産生させることもできる。そのようなマウスは、例えば、Abgenix, Inc., Fremont, Regeneron（http://_www_regeneron_com）、Harbour Antibodies（http://_www_harbourantibodies_com）、Open Monoclonal Technology, Inc.（OMT）（http://_www_omtinc_net）、KyMab（http://_www_kymab_com）、Trianni（http://_www.trianni_com）およびAblexis（http:_//_www_ablexis.com）から入手可能である。重鎖および軽鎖のFv領域を連結して単鎖ペプチドを形成することに加えて、類似の手段によってFabを構築して発現させることもできる（M.J. Evans et al. J Immunol Meth 1995；184：123-138）。 Human antibodies can be obtained from human antibody fragments (VH, VL, Fv, Fd, Fab, or (Fab) using a human immunoglobulin expression library (Stratagene Corp., La Jolla, California; Cambridge Antibody Technology Ltd., London, England). ') Including ₂ ) and using these fragments to construct whole human antibodies by fusion of appropriate parts to them using techniques similar to those for making chimeric antibodies Can be made by several different methods. For example, human antibodies can be prepared using antibody heavy chain variable region and light chain variable as described in Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397: 385-96 and PCT International Publication No. WO09 / 085462). The region can also be isolated from a phage display library that expresses as a fusion protein with the bacteriophage pIX coat protein. Human antibodies can also be produced in transgenic mice having a human immunoglobulin genome. Such mice include, for example, Abgenix, Inc., Fremont, Regeneron (http: // _ www_regeneron_com), Harbor Antibodies (http: // _ www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http: // _ www_omtinc_net) , KyMab (http: // _ www_kymab_com), Trianni (http: //_www.trianni_com) and Ablexis (http: _ // _ www_ablexis.com). In addition to linking the heavy and light chain Fv regions to form a single chain peptide, Fabs can also be constructed and expressed by similar means (MJ Evans et al. J Immunol Meth 1995; 184: 123-138).

DeImmunized（商標）抗体は、国際特許出願PCT/GB98/01473号に記載されているように、免疫原性の可能性のあるT細胞エピトープが削除された抗体である。このため、それらがインビボで適用された際に、ヒトにおける免疫原性は消失しているかまたは大幅に低下していると予想される。本発明の免疫グロブリンを基にした結合性分子で、それらの免疫原性T細胞エピトープ（存在すれば）が、そのような方法によって削除されていてもよい。   The DeImmunized ™ antibody is an antibody from which potentially immunogenic T cell epitopes have been deleted, as described in International Patent Application PCT / GB98 / 01473. Thus, it is expected that the immunogenicity in humans has disappeared or has been greatly reduced when they are applied in vivo. In the immunoglobulin-based binding molecules of the invention, their immunogenic T cell epitopes (if present) may be deleted by such methods.

上記の完全ヒト抗体および部分的ヒト抗体はすべて、完全マウス抗体または非ヒト由来抗体よりも免疫原性が低い。断片および単鎖抗体についても同様である。このため、これらの分子（またはそれらの誘導体）はすべて、免疫応答またはアレルギー性応答を誘発する可能性が低いと考えられる。その結果として、それらは完全非ヒト抗体よりもヒトにおけるインビボ投与により好適であり、反復投与または長期投与が必要な場合には特にそうである。   All of the above fully human antibodies and partially human antibodies are less immunogenic than fully mouse antibodies or non-human antibodies. The same applies to fragments and single chain antibodies. Thus, all of these molecules (or their derivatives) are considered unlikely to elicit an immune or allergic response. Consequently, they are more suitable for in vivo administration in humans than fully non-human antibodies, especially when repeated or long-term administration is required.

二重特異性抗体は、同一のヒト標的細胞のヒトCD134の間の、または2種類のヒト標的細胞上のヒトCD134の間の架橋剤として用いることができる。そのような二重特異性抗体は、ヒトCD134上の2種類のエピトープのそれぞれに対して1つの特異性を有する。これらの抗体およびそれらを作製する方法は、米国特許第5,534,254号（Creative Biomolecules, Inc.）に記載されている。この特許に記載された二重特異性抗体の種々の態様は、単鎖Fvを、Ser-Cys、(Gly)₄-Cys、(His)₆-(Gly)₄-Cysを含むペプチド連結剤（peptide coupler）、キレート剤、ならびにビスマレイミドヘキサンおよびビスマレイミドカプロイルを含む化学的またはジスルフィド性連結物によって連結させることを含む。 Bispecific antibodies can be used as crosslinkers between human CD134 of the same human target cell or between human CD134 on two types of human target cells. Such bispecific antibodies have one specificity for each of the two epitopes on human CD134. These antibodies and methods for making them are described in US Pat. No. 5,534,254 (Creative Biomolecules, Inc.). Various embodiments of the bispecific antibody described in this patent include a peptide linking agent comprising a single chain Fv comprising Ser-Cys, (Gly) ₄ -Cys, (His) _6- (Gly) ₄ -Cys ( peptide couplers), chelating agents, and linking by chemical or disulfide conjugates including bismaleimidohexane and bismaleimidocaproyl.

本発明の抗体のVL領域および／またはVH領域は、各抗体アームが別個の抗原またはエピトープと結合する二重特異性完全長抗体の他の態様の中に人工的に組み込むことができる。そのような二重特異性抗体は、例えば、米国特許第7,695,936号；国際公開公報第WO2004／111233号；米国特許出願公開第US2010／0015133号；米国特許出願公開第US2007／0287170号；国際公開公報第WO2008／119353号；米国特許出願公開第US2009／0182127号；米国特許出願公開第US2010／0286374号；米国特許出願公開第US2011／0123532号；国際特許出願公開第WO2011／131746号；国際公開公報第WO2011／143545号；または米国特許出願公開第US2012／0149876号などに記載されたものなどの技術を用いて、2つの抗体重鎖間のCH3相互作用をモジュレートして二重特異性抗体を形成させることによって作製することができる。本発明の抗体のVL領域および／またはVH領域を組み入れることができる、そのほかの二重特異性構造には、例えば、二重可変ドメイン免疫グロブリン（国際公開公報第WO2009／134776号）、または特異性の異なる2つの抗体アームを接続するさまざまな二量体化ドメイン、例えばロイシンジッパードメインもしくはコラーゲン二量体化ドメインなどを含む構造がある（国際公開公報第WO2012／022811号、米国特許第5,932,448号；米国特許第6,833,441号）。   The VL and / or VH regions of the antibodies of the invention can be artificially incorporated into other embodiments of bispecific full-length antibodies in which each antibody arm binds to a separate antigen or epitope. Such bispecific antibodies are described, for example, in US Pat. No. 7,695,936; International Publication No. WO2004 / 111233; US Patent Application Publication No. US2010 / 0015133; US Patent Application Publication No. US2007 / 0287170; WO2008 / 119353; US Patent Application Publication No. US2009 / 0182127; US Patent Application Publication No. US2010 / 0286374; US Patent Application Publication No. US2011 / 0123532; International Patent Application Publication No. WO2011 / 131746; International Publication No. Using techniques such as those described in WO2011 / 143545; or US Patent Application Publication No. US2012 / 0149876, etc., the CH3 interaction between two antibody heavy chains is modulated to form a bispecific antibody Can be produced. Other bispecific structures that can incorporate the VL and / or VH regions of the antibodies of the invention include, for example, dual variable domain immunoglobulins (International Publication No. WO2009 / 134776) or specificity There are structures containing various dimerization domains that connect two different antibody arms, such as leucine zipper domains or collagen dimerization domains (WO 2012/0222811, US Pat. No. 5,932,448; US Pat. No. 6,833,441).

非抗体分子は、化合物ライブラリーから従来の手段によって単離またはスクリーニングすることができる。化合物ライブラリーの作製およびスクリーニングのための自動システムは、米国特許第5,901,069号および第5,463,564号に記載されている。目標をより明確にした1つのアプローチは、結合部位を三次元モデル化し、続いてそのモデルに適合する分子のファミリーを作製することを伴う。続いて、最適な結合特性を有するものに関して、それらをスクリーニングする。   Non-antibody molecules can be isolated or screened from compound libraries by conventional means. Automated systems for the generation and screening of compound libraries are described in US Pat. Nos. 5,901,069 and 5,463,564. One approach that makes the goal clearer involves modeling the binding site in a three-dimensional model and then creating a family of molecules that fit that model. Subsequently, they are screened for those with optimal binding properties.

別のアプローチは、組換えペプチドライブラリーを作製し、続いて、関心対象のヒトCD134のエピトープと結合するものに関してそれらをスクリーニングすることである。例えば、米国特許第5,723,322号を参照。このエピトープは、以下の実施例に記載したモノクローナル抗体による結合を受けるものと同一である。ひとたびエピトープが判明すれば、当技術分野において周知の手法に従って、分子を、比較的容易に作製または単離することができる。   Another approach is to create a recombinant peptide library and then screen them for those that bind to an epitope of human CD134 of interest. See, for example, US Pat. No. 5,723,322. This epitope is identical to that undergoing binding by the monoclonal antibody described in the examples below. Once the epitope is known, the molecule can be made or isolated relatively easily according to techniques well known in the art.

さらなる態様は、上記の抗CD134抗体のいずれかの誘導体を提供する。1つの特定の局面において、抗体誘導体は、クローン12H3および／またはクローン20E5のアミノ酸配列の改変によって導き出される。フレームワーク領域、CDR領域または定常領域といった、抗体鎖の任意の領域のアミノ酸配列を改変することができる。改変は、当技術分野において公知の標準的な手法、例えば部位指定突然変異誘発およびランダムPCR媒介性突然変異誘発などによって導入することができ、天然アミノ酸のほかに非天然アミノ酸を含めることもできる。改変の種類には、抗CD134抗体の1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、抗体誘導体は、重鎖CDRにおける1つ、2つ、3つもしくは4つのアミノ酸置換、および／または軽鎖CDRにおける1つのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、抗CD134抗体の誘導体は、ヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列と比して1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。特定の態様において、生殖系列由来のそのような置換の1つまたは複数は、重鎖のCDR2領域にある。別の特定の態様において、生殖系列と比してのアミノ酸置換は、抗体クローン12H3およびクローン20E5における生殖系列と比しての置換と同じ位置のうち1つまたは複数にある。別の態様において、アミノ酸置換は、抗体における1つまたは複数のシステインを別の残基、例えば、限定的ではないがアラニンまたはセリンなどに変化させるものである。システインは標準（canonical）システインでも非標準システインでもよい。置換は、抗体の可変ドメインのCDR領域もしくはフレームワーク領域内に、または定常ドメイン内に作製することができる。別の種類のアミノ酸置換は、脱アミド部位となる可能性のある部位を形成するアスパラギン酸-グリシン対を、残基の一方または両方を変更することによって消失させるものである。さらに他の態様において、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。1つの態様において、抗体誘導体は、クローン12H3および／またはクローン20E5のアミノ酸配列と比して、重鎖CDR領域における1つ、2つ、3つまたは4つの保存的アミノ酸置換を有する。抗CD134抗体の別の種類の改変は、抗体の元のグリコシル化パターンの変更である。「変更」という用語は、抗体に認められる1つもしくは複数の糖質部分の欠失、および／または抗体に存在しない1つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを指す。   Further embodiments provide derivatives of any of the above anti-CD134 antibodies. In one particular aspect, the antibody derivative is derived by modification of the amino acid sequence of clone 12H3 and / or clone 20E5. The amino acid sequence of any region of the antibody chain, such as a framework region, CDR region or constant region, can be altered. Modifications can be introduced by standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and random PCR-mediated mutagenesis, and can include non-natural amino acids in addition to natural amino acids. Types of modifications include insertions, deletions, substitutions or combinations of one or more amino acids of the anti-CD134 antibody. In some embodiments, the antibody derivative comprises one, two, three or four amino acid substitutions in the heavy chain CDR and / or one amino acid substitution in the light chain CDR. In some embodiments, the derivative of the anti-CD134 antibody comprises one or more amino acid substitutions relative to the germline amino acid sequence of the human gene. In certain embodiments, one or more of such substitutions from germline are in the CDR2 region of the heavy chain. In another specific embodiment, the amino acid substitution relative to germline is in one or more of the same positions as the substitution relative to germline in antibody clone 12H3 and clone 20E5. In another embodiment, an amino acid substitution is one that changes one or more cysteines in the antibody to another residue, such as but not limited to alanine or serine. The cysteine can be a canonical cysteine or a non-standard cysteine. Substitutions can be made in the CDR or framework regions of an antibody variable domain, or in a constant domain. Another type of amino acid substitution is to eliminate the aspartate-glycine pair that forms a potential deamidation site by changing one or both of the residues. In yet other embodiments, the amino acid substitution is a conservative amino acid substitution. In one embodiment, the antibody derivative has one, two, three or four conservative amino acid substitutions in the heavy chain CDR regions as compared to the amino acid sequence of clone 12H3 and / or clone 20E5. Another type of modification of the anti-CD134 antibody is a change in the original glycosylation pattern of the antibody. The term “altered” refers to the deletion of one or more carbohydrate moieties found in the antibody and / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the antibody.

抗体のグリコシル化は、典型的にはN結合型である。N結合型とは、アスパラギン酸残基の側鎖に対する糖質部分の結びつきのことを指す。他の改変の例には、アシル化、アミド化、アセチル化、架橋、環化、ホルミル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有結合性架橋の形成、システインの形成、酸化、リン酸化、プレニル化、ペグ化、タンパク質分解性プロセシングおよび硫酸化が含まれる。   Antibody glycosylation is typically N-linked. N-linked refers to the binding of a carbohydrate moiety to the side chain of an aspartic acid residue. Examples of other modifications include acylation, amidation, acetylation, crosslinking, cyclization, formylation, hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, disulfide bond formation, demethylation, formation of covalent bridges , Cysteine formation, oxidation, phosphorylation, prenylation, pegylation, proteolytic processing and sulfation.

さらなる態様は、本明細書に記載の抗CD134抗体またはその抗原結合性断片に、追加的な分子的実体が連結されたものを含む抗体誘導体を提供する。追加的な分子的実体の例には、薬学的な剤、ペプチドまたはタンパク質、および検出薬または標識が含まれる。抗CD134抗体と連結させうる薬学的な剤の具体的な例には、細胞傷害性薬剤または他の癌療法薬、および放射性同位体が含まれる。抗CD134抗体と連結させうるペプチドまたはタンパク質の具体的な例には抗体が含まれ、それは同一の抗CD134抗体であっても異なる抗体であってもよい。抗CD134抗体と連結させうる検出薬または標識の具体的な例には、（1）蛍光性化合物、例えばフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルフォニルクロリドおよびランタニド蛍光体など；（2）酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびグルコース酸化酵素など；（3）ビオチン；（4）ロイシンジッパー対配列、金属結合ドメイン、エピトープタグおよび二次抗体の結合部位といった二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープが含まれる。さらなる態様は、単量体抗体の抗体二量体、三量体またはより高次の多量体といった、抗CD134抗体の多量体形態である抗体誘導体を提供する。抗体多量体の中の個々の単量体は同一であっても異なってもよく、すなわち、それらはヘテロマー性またはホモマー性の抗体多量体であってよい。抗体の多量体化は自然凝集によって実現させうる。例えば、精製された抗体調製物（例えば、精製IgG1分子）のある程度の割合は、抗体ホモ二量体および他のより高次の抗体多量体を含むタンパク質凝集物を自然発生的に形成する。または、抗体ホモ二量体を、当技術分野において公知の化学連結手法を通じて形成させることもできる。適した架橋剤には、ヘテロ二機能性であるもの、例えばm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、N-スクシンイミジルS-アセチルチオ-アセテート、およびスクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート）など、またはホモ二機能性であるもの（ジスクシンイミジルスベレートなど）が含まれる。そのようなリンカーは市販されている。また、当技術分野において公知の組換えDNA手法を通じて抗体を多量体化することもできる。   A further aspect provides an antibody derivative comprising an anti-CD134 antibody or antigen-binding fragment thereof described herein linked to an additional molecular entity. Examples of additional molecular entities include pharmaceutical agents, peptides or proteins, and detection agents or labels. Specific examples of pharmaceutical agents that can be linked to anti-CD134 antibodies include cytotoxic agents or other cancer therapeutic agents, and radioisotopes. Specific examples of peptides or proteins that can be linked to anti-CD134 antibodies include antibodies, which may be the same anti-CD134 antibody or different antibodies. Specific examples of detection agents or labels that can be linked to anti-CD134 antibodies include (1) fluorescent compounds such as fluorescein, fluorescein isothiocyanate, phycoerythrin, rhodamine, 5-dimethylamine-1-naphthalenesulfonyl chloride and lanthanide fluorescence (2) enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase and glucose oxidase; (3) biotin; (4) leucine zipper pair sequences, metal binding domains, epitope tags and secondary antibody binding sites, etc. A given polypeptide epitope recognized by the secondary reporter is included. Further embodiments provide antibody derivatives that are multimeric forms of anti-CD134 antibodies, such as antibody dimers, trimers or higher multimers of monomeric antibodies. Individual monomers within an antibody multimer may be the same or different, i.e., they may be heteromeric or homomeric antibody multimers. Multimerization of antibodies can be achieved by spontaneous aggregation. For example, a certain percentage of purified antibody preparation (eg, purified IgG1 molecule) spontaneously forms protein aggregates containing antibody homodimers and other higher order antibody multimers. Alternatively, antibody homodimers can be formed through chemical ligation techniques known in the art. Suitable crosslinkers include those that are heterobifunctional, such as m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, N-succinimidyl S-acetylthio-acetate, and succinimidyl 4- (maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate ), Or those that are homobifunctional (such as disuccinimidyl suberate). Such linkers are commercially available. Alternatively, antibodies can be multimerized through recombinant DNA techniques known in the art.

さらなる態様は、本明細書において上述した抗ヒトCD134抗体のアミノ酸配列を含むキメラ抗体である抗体誘導体も提供する。別の例では、キメラ抗体のCDRはすべて、抗ヒトCD134抗体に由来する。別の例では、複数の抗ヒトCD134抗体由来のCDRがキメラ抗体の中で組み合わされる。さらに、キメラ抗体が、1つの抗ヒトCD134抗体に由来するフレームワーク領域、および1つまたは複数の異なるヒト抗体由来の1つまたは複数のCDRを含んでもよい。キメラ抗体は、当技術分野において公知の従来の方法を用いて作製することができる。いくつかの特定の態様において、キメラ抗体は、抗体クローン12H3および／またはクローン20E5から選択される抗体の重鎖可変領域由来の、または軽鎖可変領域由来の、1つ、2つもしくは3つのCDRを含む。   A further aspect also provides an antibody derivative that is a chimeric antibody comprising the amino acid sequence of the anti-human CD134 antibody described herein above. In another example, all chimeric antibody CDRs are derived from anti-human CD134 antibodies. In another example, CDRs from multiple anti-human CD134 antibodies are combined in a chimeric antibody. In addition, the chimeric antibody may comprise a framework region derived from one anti-human CD134 antibody and one or more CDRs from one or more different human antibodies. Chimeric antibodies can be made using conventional methods known in the art. In some specific embodiments, the chimeric antibody is one, two or three CDRs from the heavy chain variable region or from the light chain variable region of an antibody selected from antibody clone 12H3 and / or clone 20E5 including.

本発明によって提供される他の抗体誘導体の例には、単鎖抗体、ダイアボディ、ドメイン抗体、ナノボディおよびユニボディ（unibody）が含まれる。いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、DeImmunized（商標）抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体、Fab、F(ab')₂、Fv、または親抗体の抗原結合機能を保っている他の断片を含む断片であってよい。単鎖抗体（「ScFv」）およびそれらの構築の方法は、米国特許第4,946,778号に記載されている。 Examples of other antibody derivatives provided by the present invention include single chain antibodies, diabodies, domain antibodies, nanobodies and unibodies. In some embodiments, the monoclonal antibody is a chimeric antibody, humanized antibody, human antibody, DeImmunized ™ antibody, bispecific antibody, single chain antibody, Fab, F (ab ′) ₂ , Fv, or parent antibody It may be a fragment containing other fragments that retain the antigen-binding function. Single chain antibodies (“ScFv”) and methods of their construction are described in US Pat. No. 4,946,778.

「単鎖抗体」（scFv）は、VLドメインがVHドメインと連結したものを含む単一のポリペプチド鎖からなり、VLドメインおよびVHドメインが対合して一価分子を形成している。単鎖抗体は、当技術分野において公知の方法（例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）によって調製することができる。「ダイアボディ」は2つの鎖からなり、各鎖は短いペプチドリンカーによって接続された同一のポリペプチド鎖上で重鎖可変領域に軽鎖可変領域が接続されたものを含み、同一鎖上の2つの領域は互いに対合せず、もう一方の鎖上の相補的ドメインと対合して二重特異性分子を形成する。ダイアボディを調製する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448、およびPoljak R. J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123）。ドメイン抗体（dAb）は、抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変領域に対応する、抗体の小型の機能的結合単位である。ドメイン抗体は、細菌細胞系、酵母細胞系および哺乳動物細胞系において良好に発現される。ドメイン抗体およびその作製方法のさらなる詳細は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第6,291,158号；第6,582,915号；第6,593,081号；WO04/003019およびWO03/002609を参照）。ナノボディは抗体の重鎖に由来する。ナノボディは典型的には、単一の可変ドメインおよび2つの定常ドメイン（CH2およびCH3）を含み、元の抗体の抗原結合能力を保っている。ナノボディは、当技術分野において公知の方法によって調製することができる（例えば、米国特許第6,765,087号、米国特許第6,838,254号、WO 06/079372を参照）。ユニボディは、IgG4抗体の1つの軽鎖および1つの重鎖からなる。ユニボディは、IgG4抗体のヒンジ領域の除去によって作製しうる。ユニボディおよびそれらの調製の方法のさらなる詳細は、WO2007/059782に記載がある。   A “single chain antibody” (scFv) consists of a single polypeptide chain containing a VL domain linked to a VH domain, and the VL domain and VH domain pair to form a monovalent molecule. Single chain antibodies can be obtained by methods known in the art (eg, Bird et al., (1988) Science 242: 423-426 and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879. -5883). A “diabody” consists of two chains, each chain comprising a heavy chain variable region connected to a light chain variable region on the same polypeptide chain connected by a short peptide linker. One region does not pair with each other and pair with a complementary domain on the other strand to form a bispecific molecule. Methods for preparing diabodies are known in the art (eg, Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, and Poljak RJ et al., (1994) Structure 2: 1121-1123). A domain antibody (dAb) is a small functional binding unit of an antibody that corresponds to the variable region of either the heavy or light chain of the antibody. Domain antibodies are well expressed in bacterial, yeast and mammalian cell lines. Further details of domain antibodies and methods for making them are known in the art (see, eg, US Pat. Nos. 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; WO04 / 003019 and WO03 / 002609). Nanobodies are derived from antibody heavy chains. Nanobodies typically contain a single variable domain and two constant domains (CH2 and CH3), retaining the antigen-binding ability of the original antibody. Nanobodies can be prepared by methods known in the art (see, eg, US Pat. No. 6,765,087, US Pat. No. 6,838,254, WO 06/079372). Unibody consists of one light chain and one heavy chain of an IgG4 antibody. Unibodies can be made by removing the hinge region of an IgG4 antibody. Further details of unibodies and methods of their preparation are described in WO2007 / 059782.

本発明の分子は、結合部分に加えて、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸およびデキストランなどの、ただしこれらには限定されない、分子のインビボ半減期を延長させるための部分をさらに含むことができる。そのようなさらなる部分は、当技術分野において周知の方法を用いて、結合部分とコンジュゲートさせるか、または他の様式で組み合わせることができる。   In addition to binding moieties, the molecules of the invention include moieties for extending the in vivo half-life of the molecule such as, but not limited to, polyethylene glycol (PEG), human serum albumin, glycosylated groups, fatty acids and dextran. Can further be included. Such additional moieties can be conjugated to or otherwise combined with the binding moiety using methods well known in the art.

本発明のさらなる局面は、本発明の第1の局面によるCD134結合性の結合性分子のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。核酸分子によってコードされるアミノ酸配列は、無傷の抗体の任意の部分、例えばCDR、1つ、2つもしくは3つのCDRを含む配列、または重鎖もしくは軽鎖の可変領域であってもよく、または完全長重鎖もしくは軽鎖であってもよい。いくつかの態様において、核酸分子は、以下のものを含むアミノ酸配列をコードする：（1）抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5のCDR3領域、特に重鎖CDR3領域；（2）抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5の重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域；または（3）抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5の重鎖もしくは軽鎖。他の態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17、18もしくは19からなる群より選択される、またはSEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10もしくは11からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。   A further aspect of the invention provides a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of a CD134 binding binding molecule according to the first aspect of the invention. The amino acid sequence encoded by the nucleic acid molecule can be any part of an intact antibody, such as a CDR, a sequence comprising one, two or three CDRs, or a heavy or light chain variable region, or It may be a full length heavy chain or a light chain. In some embodiments, the nucleic acid molecule encodes an amino acid sequence comprising: (1) antibody clone 12H3 and / or CDR3 region of clone 20E5, particularly heavy chain CDR3 region; (2) antibody clone 12H3 and / or Or variable region of heavy chain or light chain of clone 20E5; or (3) heavy or light chain of antibody clone 12H3 and / or clone 20E5. In other embodiments, the nucleic acid molecule is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 or 19, or SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10 or 11 encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of.

本開示によって提供される核酸分子は、本発明によるCD134抗体を産生する任意の供給源から入手しうる。抗CD134抗体産生細胞からのmRNAを標準的な手法によって単離し、クローニングして、かつ／または、PCRおよびライブラリー構築手法を用いて増幅した上で、標準的なプロトコールを用いてスクリーニングして、抗CD134抗体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を入手する。mRNAを、抗体遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはcDNAクローニングに用いるためのcDNAを作製するために用いてもよい。1つの態様において、核酸分子は、上記の抗CD134抗体を発現するハイブリドーマ、好ましくは、その融合パートナーの一方がヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物細胞であるハイブリドーマから入手しうる。別の態様において、ハイブリドーマは、非ヒト非トランスジェニック動物に由来する。   Nucleic acid molecules provided by the present disclosure may be obtained from any source that produces CD134 antibodies according to the present invention. MRNA from anti-CD134 antibody-producing cells is isolated by standard techniques, cloned and / or amplified using PCR and library construction techniques, and screened using standard protocols, Obtain a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of the anti-CD134 antibody. The mRNA may be used to generate cDNA for use in polymerase chain reaction (PCR) or cDNA cloning of antibody genes. In one embodiment, the nucleic acid molecule is obtainable from a hybridoma that expresses the anti-CD134 antibody described above, preferably a hybridoma in which one of its fusion partners is a non-human transgenic animal cell that expresses a human immunoglobulin gene. In another embodiment, the hybridoma is derived from a non-human non-transgenic animal.

抗CD134抗体の重鎖をコードする核酸分子は、重鎖可変領域をコードする核酸分子を、重鎖の定常領域をコードする核酸分子と融合させることによって構築しうる。同様に、抗CD134抗体の軽鎖をコードする核酸分子は、軽鎖可変領域をコードする核酸分子を、軽鎖の定常領域をコードする核酸分子と融合させることによって構築しうる。VH鎖およびVL鎖をコードする核酸分子は、それぞれ重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター中にそれらを挿入して、VHセグメントをベクター内部の重鎖定常領域（CH）セグメントと機能的に結合させ、VLセグメントをベクター内部の軽鎖定常領域（CL）セグメントと機能的に結合させることにより、完全長抗体遺伝子へと転換させうる。または、標準的な分子生物学の手法を用いて、VH鎖をコードする核酸分子をCH鎖をコードする核酸分子と連結させること、例えばライゲートすることにより、VH鎖またはVL鎖をコードする核酸分子を完全長抗体遺伝子へと転換させる。同じことを、VL鎖およびCL鎖をコードする核酸分子を用いて達成することもできる。続いて、完全長重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子を、それらが導入された細胞から発現させて、抗CD134抗体を単離することができる。   A nucleic acid molecule encoding the heavy chain of an anti-CD134 antibody can be constructed by fusing a nucleic acid molecule encoding the heavy chain variable region with a nucleic acid molecule encoding the constant region of the heavy chain. Similarly, a nucleic acid molecule encoding the light chain of an anti-CD134 antibody can be constructed by fusing a nucleic acid molecule encoding the light chain variable region with a nucleic acid molecule encoding the constant region of the light chain. Nucleic acid molecules encoding the VH and VL chains are inserted into expression vectors already encoding the heavy and light chain constant regions, respectively, and the VH segment is inserted into the heavy chain constant region (CH ) Can be converted into a full-length antibody gene by operably linking the segment and operably linking the VL segment to the light chain constant region (CL) segment within the vector. Alternatively, using standard molecular biology techniques, a nucleic acid molecule encoding a VH chain or a VL chain by linking, for example, ligating, a nucleic acid molecule encoding a VH chain with a nucleic acid molecule encoding a CH chain Into a full-length antibody gene. The same can be achieved using nucleic acid molecules encoding VL and CL chains. Subsequently, nucleic acid molecules encoding full-length heavy chains and / or light chains can be expressed from cells into which they have been introduced to isolate anti-CD134 antibodies.

本核酸分子は、以下に述べるように、大量の抗CD134抗体を組換え法によって発現させるために用いることができる。また、本明細書の他所に記載したように、核酸分子を、本開示によって提供される他の結合性分子、例えばキメラ抗体、単鎖抗体、イムノアドヘシン、ダイアボディ、突然変異型抗体、二重特異性抗体、および抗体誘導体などを作製するために用いることもできる。1つの態様において、核酸分子は、特定の抗体配列に対するプローブまたはPCRプライマーとして用いられる。例えば、核酸分子プローブを診断方法に用いてもよく、または核酸分子PCRプライマーを、とりわけ、抗CD134抗体の可変領域の作製に用いるための核酸配列を単離するために用いうると考えられるDNAの領域を増幅するために用いることもできる。   The nucleic acid molecule can be used to express large amounts of anti-CD134 antibodies by recombinant methods, as described below. In addition, as described elsewhere herein, the nucleic acid molecule may be converted to other binding molecules provided by the present disclosure, such as chimeric antibodies, single chain antibodies, immunoadhesins, diabodies, mutant antibodies, It can also be used to produce bispecific antibodies, antibody derivatives, and the like. In one embodiment, the nucleic acid molecule is used as a probe or PCR primer for a particular antibody sequence. For example, nucleic acid molecule probes may be used in diagnostic methods, or nucleic acid molecule PCR primers may be used to isolate nucleic acid sequences for use, inter alia, in the production of variable regions of anti-CD134 antibodies. It can also be used to amplify a region.

抗CD134抗体のVHセグメントおよびVLセグメントをコードするDNA分子をひとたび入手すれば、これらのDNA分子を、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Fab断片遺伝子、scFv遺伝子に転換させるために、あるいは二重特異性抗体に組み込むことが出来るように、組換えDNA手法によってさらに操作することができる。   Once the DNA molecules encoding the VH and VL segments of the anti-CD134 antibody are obtained, these DNA molecules can be converted into, for example, variable region genes into full-length antibody chain genes, Fab fragment genes, scFv genes. Alternatively, it can be further manipulated by recombinant DNA techniques so that it can be incorporated into bispecific antibodies.

本発明のさらなる局面は、本明細書に上述した核酸分子を含むベクターを提供する。核酸分子は、軽鎖もしくは重鎖の一部分（CDRもしくは可変領域など）、完全長軽鎖もしくは重鎖、重鎖もしくは軽鎖の一部分もしくは完全長を含むポリペプチド、または抗体誘導体もしくは抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードすることができる。   A further aspect of the invention provides a vector comprising a nucleic acid molecule as described herein above. A nucleic acid molecule is a light chain or a portion of a heavy chain (such as a CDR or variable region), a full length light chain or heavy chain, a polypeptide comprising a heavy chain or a portion or full length of a light chain, or an antibody derivative or antigen-binding fragment Can be encoded.

適した発現ベクターの一例は、機能的に完全なヒトCHまたはCL免疫グロブリン配列をコードし、任意のVH配列またはVL配列を挿入して発現させることが可能なように操作された適切な制限部位を備えたものである。発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖のアミノ酸配列の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖のアミノ酸配列をコードするDNAを、シグナルペプチドが抗体鎖のアミノ酸配列のアミノ末端に対してインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングするとよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドでもよく、または異種シグナルペプチド（すなわち、免疫グロブリンでないタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。発現ベクターは、抗CD134抗体（抗体のVH、VL、全長重鎖、および／または全長軽鎖遺伝子）のアミノ酸配列をコードする核酸配列に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列も保有する。発現調節配列の選択を含め、ベクターのデザインは、形質転換させる宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベルなどの要因に依存しうる。哺乳動物宿主細胞での発現のための調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルス因子、例えば、レトロウイルスLTR、サイトメガロウイルス（CMV）（CMVプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス40（SV40）（SV40プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP））、ポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびに天然の免疫グロブリンおよびアクチンのプロモーターなどの強力な哺乳動物プロモーターが含まれる。   An example of a suitable expression vector is a suitable restriction site that encodes a functionally complete human CH or CL immunoglobulin sequence and is engineered to allow any VH or VL sequence to be inserted and expressed. It is equipped with. The expression vector can encode a signal peptide that facilitates secretion of the amino acid sequence of the antibody chain from the host cell. DNA encoding the antibody chain amino acid sequence may be cloned into the vector such that the signal peptide is linked in-frame to the amino terminus of the antibody chain amino acid sequence. The signal peptide may be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (ie, a signal peptide derived from a non-immunoglobulin protein). In addition to the nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of an anti-CD134 antibody (antibody VH, VL, full length heavy chain, and / or full length light chain gene), the expression vector regulates the expression of the antibody chain gene in the host cell It also has an array. Vector design, including the selection of expression control sequences, may depend on factors such as the choice of host cells to be transformed and the desired level of expression of the protein. Regulatory sequences for expression in mammalian host cells include viral factors that lead to high levels of protein expression in mammalian cells, such as retroviral LTR, cytomegalovirus (CMV) (CMV promoter / enhancer, etc.), simian Strong mammals such as virus 40 (SV40) (SV40 promoter / enhancer), adenovirus (eg, adenovirus major late promoter (AdMLP)), polyoma-derived promoters and / or enhancers, and native immunoglobulin and actin promoters An animal promoter is included.

宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌細胞または酵母細胞であってよい。宿主細胞として適している哺乳動物細胞株の例には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、NSO細胞、PER-C6細胞、SP2/0細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Hep G2）、ヒト肺細胞、A549細胞、および他の多くの細胞株が含まれる。昆虫細胞株の例には、Sf9細胞またはSf21細胞が含まれる。   The host cell may be a mammalian cell, insect cell, plant cell, bacterial cell or yeast cell. Examples of mammalian cell lines suitable as host cells include Chinese hamster ovary (CHO) cells, NSO cells, PER-C6 cells, SP2 / 0 cells, HEK-293T cells, NIH-3T3 cells, HeLa cells, baby Hamster kidney (BHK) cells, African green monkey kidney cells (COS), human hepatocellular carcinoma cells (eg, Hep G2), human lung cells, A549 cells, and many other cell lines. Examples of insect cell lines include Sf9 cells or Sf21 cells.

植物宿主細胞の例には、タバコ属（Nicotiana）、アラビドプシス属（Arabidopsis）、アオウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどが含まれる。細菌宿主細胞には、大腸菌（E. coli）およびストレプトミセス属（Streptomyces）種が含まれる。   Examples of plant host cells include Nicotiana, Arabidopsis, duckweed, corn, wheat, potato and the like. Bacterial host cells include E. coli and Streptomyces species.

酵母宿主細胞の例には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）が含まれる。   Examples of yeast host cells include Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris.

種々の細胞株によって、またはトランスジェニック動物において発現される結合性分子のアミノ酸配列は、異なるグリコシル化を有する可能性がある。しかし、本明細書で提供される核酸分子によってコードされるか、または本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む結合性分子はすべて、結合性分子のグリコシル化にかかわらず、本発明の一部である。   The amino acid sequences of binding molecules expressed by various cell lines or in transgenic animals may have different glycosylation. However, any binding molecule encoded by a nucleic acid molecule provided herein or comprising an amino acid sequence provided herein is part of the invention regardless of the glycosylation of the binding molecule. It is.

本発明の別の局面は、上記に定義したCD134結合性分子を、ファージディスプレイを用いて作製するための方法を提供する。本方法は、（a）ファージ上にヒト抗体のライブラリーを合成する段階、（b）ライブラリーをCD134またはその一部分によってスクリーニングする段階、（c）CD134またはその一部分と結合するファージを単離する段階、および（d）ファージから抗体を入手する段階を含む。抗体のライブラリーを調製するための1つの例示的な方法は、以下の段階を含む：（a）ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物に対して、CD134またはその抗原性部分による免疫処置を行って、免疫応答を生じさせる段階；（b）免疫処置を受けた動物から抗体産生細胞を抽出する段階；（c）抽出した細胞から、抗CD134抗体の重鎖および軽鎖をコードするRNAを単離する段階；（d）RNAを逆転写させてcDNAを生成させる段階；（e）cDNAを増幅する段階；ならびに（f）cDNAをファージディスプレイベクターに挿入して、抗体をファージ上で発現させる段階。組換え抗ヒトCD134抗体またはその抗原結合性断片は、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。ライブラリーは、B細胞から単離したmRNAから調製したヒトVLおよびVHのcDNAを用いて作製したscFvファージディスプレイライブラリーであってよい。そのようなライブラリーの調製およびスクリーニングのための方法は、当技術分野において公知である。ファージディスプレイライブラリーを作製するためのキットは市販されている。   Another aspect of the present invention provides a method for producing a CD134 binding molecule as defined above using phage display. The method comprises (a) synthesizing a library of human antibodies on phage, (b) screening the library with CD134 or a portion thereof, and (c) isolating a phage that binds to CD134 or a portion thereof. And (d) obtaining the antibody from the phage. One exemplary method for preparing a library of antibodies includes the following steps: (a) immunizing a non-human animal containing a human immunoglobulin locus with CD134 or an antigenic portion thereof. Performing an immune response; (b) extracting antibody producing cells from the immunized animal; (c) RNA encoding the heavy and light chains of the anti-CD134 antibody from the extracted cells. Isolating; (d) reverse transcription of RNA to generate cDNA; (e) amplifying cDNA; and (f) inserting the cDNA into a phage display vector to express the antibody on the phage. Stage. Recombinant anti-human CD134 antibody or antigen-binding fragment thereof can be isolated by screening a recombinant combinatorial antibody library. The library may be an scFv phage display library generated using human VL and VH cDNA prepared from mRNA isolated from B cells. Methods for the preparation and screening of such libraries are known in the art. Kits for preparing phage display libraries are commercially available.

本発明のいくつかの態様においては、本明細書に記載の結合性分子の1つまたは組み合わせと、任意で薬学的に許容される担体とを含む組成物、例えば、薬学的組成物が提供される。組成物は、当技術分野において公知の従来の方法によって調製することができる。いくつかの態様において、組成物は、抗CD134抗体またはその抗原結合性断片を含む。特定の態様において、組成物は、抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5、またはいずれかの抗体の抗原結合性断片を含む。さらに他の態様において、組成物は、抗体クローン12H3および／またはクローン20E5の誘導体を含む。他の態様においては、薬学的組成物は，ヒト化抗体12H3_VL1VH1、 12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2、12H3_VL2VH3、20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、20E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2、または 20E5_VL2VH3を含む。他の態様においては、薬学的組成物は、SEQ ID NO: 101〜133、または146〜151の重鎖可変領域を含む上述のヒト化抗体の変異体を含む。「薬学的に許容される担体」という用語は、結合性分子の送達のための製剤中に用いるのに適している任意の不活性物質のことを指す。担体は、抗付着剤（antiadherent）、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、増量剤または希釈剤、保存料（酸化防止剤、抗菌薬または抗真菌薬）、甘味料、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などであってよい。   In some embodiments of the invention, there are provided compositions, eg, pharmaceutical compositions, comprising one or a combination of binding molecules described herein and optionally a pharmaceutically acceptable carrier. The The composition can be prepared by conventional methods known in the art. In some embodiments, the composition comprises an anti-CD134 antibody or antigen-binding fragment thereof. In certain embodiments, the composition comprises antibody clone 12H3 and / or clone 20E5, or an antigen-binding fragment of any antibody. In yet other embodiments, the composition comprises a derivative of antibody clone 12H3 and / or clone 20E5. In other embodiments, the pharmaceutical composition comprises humanized antibodies 12H3_VL1VH1, 12H3_VL1VH2, 12H3_VL1VH3, 12H3_VL2VH1, 12H3_VL2VH2, 12H3_VL2VH3, 20E5_VL1VH1, 20E5_VL1, 20E5_VL1, 20E5_VL In other embodiments, the pharmaceutical composition comprises a variant of the above humanized antibody comprising a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 101-133, or 146-151. The term “pharmaceutically acceptable carrier” refers to any inert substance suitable for use in a formulation for delivery of a binding molecule. Carriers include antiadherents, binders, coatings, disintegrants, bulking agents or diluents, preservatives (antioxidants, antibacterial or antifungal agents), sweeteners, absorption delaying agents, wetting agents, It may be an emulsifier, a buffer or the like.

本発明の非ペプチド分子は、懸濁剤、錠剤などを含め、経口的に投与しうると考えられる。液体製剤は、凍結乾燥またはエアロゾル化されたマイクロカプセルの吸入によって投与しうると考えられる。坐薬を用いることもできると考えられる。そのほかの薬学的媒体を、本発明の分子の作用持続時間を制御するために用いることもできると考えられる。製剤に関して選択される投与量およびスケジュールは、当技術分野において周知の標準的な手順によって決定しうる。そのような手順は、動物モデルから推定された投薬スケジュールを外挿し、続いてヒトの臨床用量設定試験において最適な投与量を決定することを伴う。   It is contemplated that the non-peptide molecules of the present invention can be administered orally, including suspensions, tablets and the like. Liquid formulations could be administered by inhalation of lyophilized or aerosolized microcapsules. Suppositories could also be used. It is contemplated that other pharmaceutical media can be used to control the duration of action of the molecules of the invention. The dosage and schedule selected for the formulation can be determined by standard procedures well known in the art. Such a procedure involves extrapolating the dosing schedule estimated from the animal model, followed by determining the optimal dose in human clinical dose setting studies.

組成物は、液体、半固体および固体の剤形といった、任意の適した形態にあってよい。組成物のさまざまな剤形は、当技術分野において公知の従来の手法によって調製することができる。   The composition may be in any suitable form, such as liquid, semi-solid and solid dosage forms. Various dosage forms of the composition can be prepared by conventional techniques known in the art.

組成物中に含められる結合性分子の相対量は、所望の放出特性および薬力学的特性、用いる具体的な結合性分子および担体、ならびに剤形といった、いくつかの要因に応じて異なると考えられる。単一の剤形中の結合性分子の量は一般に、治療効果を生じる量であると考えられるが、それよりも少ない量であってもよい。一般に、この量は剤形の総重量に対し約0.001％〜約99％、約0.1％〜約70％、または約1％〜約30％であると考えられる。   The relative amount of binding molecules included in the composition will vary depending on several factors, such as the desired release and pharmacodynamic properties, the specific binding molecules and carriers used, and the dosage form. . The amount of binding molecule in a single dosage form is generally considered to be an amount that produces a therapeutic effect, but may be less. Generally, this amount will be from about 0.001% to about 99%, from about 0.1% to about 70%, or from about 1% to about 30%, based on the total weight of the dosage form.

結合性分子に加えて、1つまたは複数の追加的な治療剤を、組成物中に、または同一の治療レジメンの一部として別に含めることもできる。追加的な治療剤の例は、本明細書で以下に記載されている。組成物中に含める追加的な治療剤の適した量は、当業者によって容易に選択され、用いる具体的な作用物質および担体、剤形、ならびに所望の放出特性および薬力学特性といった、いくつかの要因に応じて異なると考えられる。単一の剤形中に含められる追加的な治療剤の量は一般に、治療効果を生じる量であると考えられるが、それよりも少ない量であってもよい。   In addition to the binding molecule, one or more additional therapeutic agents can also be included separately in the composition or as part of the same treatment regimen. Examples of additional therapeutic agents are described herein below. Appropriate amounts of additional therapeutic agents to include in the composition are readily selected by those skilled in the art and include several agents and carriers to be used, dosage forms, and desired release and pharmacodynamic properties. It seems to be different depending on factors. The amount of additional therapeutic agent included in a single dosage form is generally considered to be an amount that produces a therapeutic effect, but may be less.

本開示によって提供される結合性分子および結合性分子を含む薬学的組成物は、治療目的、診断目的、または免疫応答の強化、癌の治療、他の癌治療法の有効性の強化もしくはワクチン有効性の強化といった他の目的に有用であり、医薬または診断薬として用いるといった、いくつかの用途がある。したがって、本発明の好ましい局面においては、結合性分子または薬学的組成物を用いる方法が提供される。   Binding molecules and pharmaceutical compositions comprising binding molecules provided by the present disclosure are useful for therapeutic purposes, diagnostic purposes, or enhancing immune responses, treating cancer, enhancing the effectiveness of other cancer therapies, or vaccine efficacy. It is useful for other purposes such as enhancing sex and has several uses, such as for use as a pharmaceutical or diagnostic agent. Accordingly, in a preferred aspect of the invention, methods are provided that use binding molecules or pharmaceutical compositions.

本発明のさらなる局面は、ヒトCD134媒介性の抗腫瘍免疫応答のモジュレーションのための方法であって、（1）天然型ヒトOX40LのヒトCD134受容体との相互作用を回避させる、かつ／または（2）ヒトCD134媒介性の細胞シグナル伝達を、天然型ヒトOX40Lによるその占有後に遮断しない、抗ヒトCD134抗体を含む、ヒトCD134と結合する結合性分子を用いた、ヒトCD134発現性ヒトTeffエフェクター機能の強化および／またはヒトCD134発現性ヒトTreg抑制機能の減弱化を含む方法を提供する。   A further aspect of the invention is a method for the modulation of a human CD134-mediated anti-tumor immune response, which (1) avoids the interaction of native human OX40L with the human CD134 receptor and / or ( 2) Human CD134-expressing human Teff effector functions using binding molecules that bind human CD134, including anti-human CD134 antibodies, that do not block human CD134-mediated cell signaling after its occupation by native human OX40L And / or a method comprising attenuating human CD134-expressing human Treg inhibitory function.

本発明のさらなる局面は、CD134媒介性の抗腫瘍免疫応答のモジュレーションのための方法であって、ヒトCD134と結合する結合性分子を用いた、ヒトCD134発現性ヒトTeffエフェクター機能の強化および／またはヒトCD134発現性ヒトTreg抑制機能の減弱化を含む方法を提供する。   A further aspect of the present invention is a method for the modulation of CD134-mediated anti-tumor immune response, comprising enhancing human CD134-expressing human Teff effector function using a binding molecule that binds human CD134 and / or Methods comprising attenuation of human CD134-expressing human Treg inhibitory function are provided.

本発明の別の局面は、ヒトCD134媒介性の抗腫瘍免疫応答のモジュレーションの方法であって、ヒトCD134受容体上のヒトOX40L結合ドメインと相互作用する、かつ／またはヒトOX40L-ヒトCD134細胞シグナル伝達を遮断する、ヒトOX40L模倣体などの抗ヒトCD134抗体を含む、ヒトCD134と結合する結合性分子を含まない方法を提供する。   Another aspect of the present invention is a method of modulation of a human CD134-mediated anti-tumor immune response that interacts with a human OX40L binding domain on the human CD134 receptor and / or a human OX40L-human CD134 cell signal Methods are provided that do not include binding molecules that bind to human CD134, including anti-human CD134 antibodies, such as human OX40L mimics, that block transmission.

本発明は、抗腫瘍治療を目的とする、抗ヒトCD134抗体を含む、ヒトCD134と結合する結合性分子を開示する。この抗ヒトCD134抗体は、ヒトCD134の細胞外ドメインと結合する。いくつかの態様において、抗ヒトCD134抗体は、活性化されたヒトTeffおよびヒトTreg上のヒトCD134の細胞外ドメイン上の、OX40L結合領域でない領域と結合する（すなわち、抗ヒトCD134抗体は、ヒトOX40LのヒトCD134との結合を完全には遮断しない）。   The present invention discloses binding molecules that bind human CD134, including anti-human CD134 antibodies, for anti-tumor therapy. This anti-human CD134 antibody binds to the extracellular domain of human CD134. In some embodiments, the anti-human CD134 antibody binds to a region on the extracellular domain of human CD134 on activated human Teff and human Treg that is not the OX40L binding region (ie, the anti-human CD134 antibody is human It does not completely block the binding of OX40L to human CD134).

1つの特定の局面においては、哺乳動物における免疫応答の強化のための方法であって、本明細書に記載された結合性分子の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む方法が提供される。いくつかの態様において、結合性分子は抗CD134抗体またはその抗原結合性断片であり、哺乳動物はヒトである。さらなる態様において、結合性分子は抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5、またはヒト化12H3抗体もしくはヒト化20E5抗体のいずれかの抗体の抗原結合性断片である。「免疫応答の強化」という用語は、哺乳動物の免疫系の任意の応答を刺激すること、誘発すること、増大させること、向上させること、または増強させることを意味する。免疫応答は細胞性応答（すなわち、細胞媒介性の、例えば細胞傷害性Tリンパ球媒介性の）であっても体液性応答（すなわち、抗体媒介性応答）であってもよく、一次免疫応答であっても二次免疫応答であってもよい。免疫応答の強化の例には、CD4+ ヘルパーT細胞活性の増大および細胞溶解性T細胞の生成が含まれる。免疫応答の強化は、細胞傷害性Tリンパ球アッセイ、サイトカインの放出（例えばIL-2産生）、腫瘍の退縮、担癌動物の生存、抗体産生、免疫細胞の増殖、細胞表面マーカーの発現、および細胞傷害作用を非限定的に含む、当業者に公知のいくつかのインビトロまたはインビボ測定を用いて評価することができる。1つの態様において、本方法は、細胞性免疫応答、特に細胞傷害性T細胞応答を強化する。   In one particular aspect, a method is provided for enhancing an immune response in a mammal comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of a binding molecule described herein. Is done. In some embodiments, the binding molecule is an anti-CD134 antibody or antigen-binding fragment thereof and the mammal is a human. In a further embodiment, the binding molecule is antibody clone 12H3 and / or clone 20E5, or an antigen-binding fragment of either a humanized 12H3 antibody or a humanized 20E5 antibody. The term “enhanced immune response” means stimulating, inducing, increasing, improving or enhancing any response of the mammalian immune system. The immune response can be a cellular response (ie, cell-mediated, eg, cytotoxic T lymphocyte-mediated) or a humoral response (ie, antibody-mediated response), Or a secondary immune response. Examples of enhanced immune responses include increased CD4 + helper T cell activity and generation of cytolytic T cells. Enhancement of immune response includes cytotoxic T lymphocyte assay, cytokine release (eg IL-2 production), tumor regression, survival of tumor-bearing animals, antibody production, immune cell proliferation, cell surface marker expression, and Several in vitro or in vivo measurements known to those skilled in the art can be assessed, including but not limited to cytotoxic effects. In one embodiment, the method enhances a cellular immune response, particularly a cytotoxic T cell response.

本発明の1つの局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、該結合性分子の飽和濃度またはそれを上回る濃度で、実施例2（f）に記載したように、蛍光ベースのフローサイトメトリーアッセイによる測定で、ヒトCD134発現性T細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を70％を超えては低下させない結合性分子を提供する。より好ましくは、OX40LのCD134との結合作用は約60％、または約50％、または約40％、または約30％、または約20％、または約10％を超えては低下しないか、またはそれ未満しか低下せず、または好ましくは結合の低下は全くない。   One aspect of the invention is a binding molecule that binds to human CD134, at a saturating concentration of the binding molecule or above, as described in Example 2 (f). Provided is a binding molecule that does not reduce the binding effect of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells by more than 70% as measured by cytometry assay. More preferably, the binding of OX40L to CD134 does not decrease or exceeds about 60%, or about 50%, or about 40%, or about 30%, or about 20%, or about 10%. Less than or preferably no reduction in binding.

本発明の別の局面は、該結合性分子の70nMの濃度で、実施例2（f）に記載したように、蛍光ベースのフローサイトメトリーアッセイによる測定で、ヒトCD134発現性T細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を70％を超えては低下させない結合性分子を提供する。より好ましくは、OX40LのCD134との結合作用は、約60％、または約50％、または約40％、または約30％、または約20％、または約10％を超えては低下しないか、またはそれ未満しか低下せず、または好ましくは結合の低下は全くない。   Another aspect of the invention is that the concentration of the binding molecule on human CD134-expressing T cells, as measured in a fluorescence-based flow cytometric assay, as described in Example 2 (f), at a concentration of 70 nM. Provided is a binding molecule that does not reduce the binding action of OX40L to CD134 by more than 70%. More preferably, the binding action of OX40L with CD134 does not decrease more than about 60%, or about 50%, or about 40%, or about 30%, or about 20%, or more than about 10%, or Less than that, or preferably no reduction in binding.

本発明の別の局面は、フローサイトメトリーによる測定で（実施例2（e）にさらに記載）、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での非標識前記結合性分子と蛍光標識された前記抗体との間の交差競合によって示されるように、ヒトCD134結合との結合に関して、（1）SEQ ID NO：12を含む重鎖可変領域のアミノ酸配列、および（2）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する結合性分子を提供する。前記抗体の結合は、前記結合性分子に対する交差競合によってアッセイした際に、その飽和濃度またはそれを上回る濃度で、少なくとも約50％または約60％または約70％または約80％または約90％またはそれ以上低下するか、あるいは消失する。   Another aspect of the present invention is that the unlabeled binding molecule and fluorescent label on human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA, as measured by flow cytometry (further described in Example 2 (e)) (1) the amino acid sequence of the heavy chain variable region comprising SEQ ID NO: 12, and (2) SEQ ID NO: for binding to human CD134 binding, as shown by cross-competing with said antibody Provided is a binding molecule that competes with an antibody comprising a light chain variable region comprising 13 amino acid sequences. Binding of the antibody is at least about 50% or about 60% or about 70% or about 80% or about 90% or more at its saturating concentration or higher when assayed by cross-competition for the binding molecule. Decrease or disappear further.

本発明の別の局面は、フローサイトメトリーによる測定で（実施例2（e）にさらに記載）、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での非標識前記結合性分子と蛍光標識された前記抗体との間の交差競合によって示されるように、ヒトCD134結合との結合に関して、（1）SEQ ID NO：4を含む重鎖可変領域のアミノ酸配列、および（2）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する結合性分子を提供する。前記抗体の結合は、前記結合性分子に対する交差競合によってアッセイした際に、その飽和濃度またはそれを上回る濃度で、少なくとも約50％または約60％または約70％または約80％または約90％またはそれ以上低下するか、あるいは消失する。   Another aspect of the present invention is that the unlabeled binding molecule and fluorescent label on human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA, as measured by flow cytometry (further described in Example 2 (e)) (1) the amino acid sequence of the heavy chain variable region comprising SEQ ID NO: 4, and (2) SEQ ID NO: Binding molecules that compete with antibodies comprising a light chain variable region comprising 5 amino acid sequences are provided. Binding of the antibody is at least about 50% or about 60% or about 70% or about 80% or about 90% or more at its saturating concentration or higher when assayed by cross-competition for the binding molecule. Decrease or disappear further.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性T細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、さらにヒトCD134発現性エフェクターT細胞上でのヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を妨害しない結合性分子を提供する。   Another aspect of the present invention is a binding molecule that binds to human CD134, wherein the binding action of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells is reduced by about 70% or about 60% depending on the binding molecule. Or less than or less than about 50% or about 40% or about 30% or about 20% or about 10% and further human on human CD134-expressing effector T cells Provided are binding molecules that do not interfere with the immunostimulatory and / or proliferative response of OX40L.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げず、かつ、さらにヒトCD134発現性エフェクターT細胞上でのヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を妨害しない結合性分子を提供する。   Another aspect of the invention is a binding molecule that binds to human CD134, does not interfere with the binding of the human CD134 (OX40) receptor to OX40 ligand (OX40L), and further on human CD134-expressing effector T cells. Binding molecules that do not interfere with the immunostimulatory and / or proliferative responses of human OX40L in

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性T細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、ヒトCD134発現性エフェクターT細胞上のヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を強化する結合性分子を提供する。   Another aspect of the present invention is a binding molecule that binds to human CD134, wherein the binding action of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells is reduced by about 70% or about 60% depending on the binding molecule. Or less than or less than about 50% or about 40% or about 30% or about 20% or about 10% and of human OX40L on human CD134-expressing effector T cells Binding molecules that enhance immunostimulatory and / or proliferative responses are provided.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げず、かつヒトCD134発現性エフェクターT細胞上でのヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を強化する結合性分子を提供する。   Another aspect of the invention is a binding molecule that binds to human CD134, does not interfere with the binding of the human CD134 (OX40) receptor to the OX40 ligand (OX40L), and on human CD134-expressing effector T cells. Binding molecules that enhance the immunostimulatory and / or proliferative response of human OX40L are provided.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性ヒトT細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、さらにヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を妨害しない結合性分子を提供する。   Another aspect of the present invention is a binding molecule that binds to human CD134, wherein the binding action of OX40L to CD134 on human CD134-expressing human T cells is about 70% or about 60% depending on the binding molecule. % Or about 50% or about 40% or about 30% or about 20% or about 10% or less, and further on human CD134-expressing regulatory T cells A binding molecule that does not interfere with the suppressor function response of human OX40L.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げず、かつ、さらにヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を妨害しない結合性分子を提供する。   Another aspect of the present invention is a binding molecule that binds to human CD134, does not interfere with the binding of the human CD134 (OX40) receptor to OX40 ligand (OX40L), and further regulates human CD134-expressing regulatory T cells. Provided is a binding molecule that does not interfere with the suppressor function response of human OX40L above.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性ヒトT細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、ヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を強化する結合性分子を提供する。   Another aspect of the present invention is a binding molecule that binds to human CD134, wherein the binding action of OX40L to CD134 on human CD134-expressing human T cells is about 70% or about 60% depending on the binding molecule. % Or about 50% or about 40% or about 30% or about 20% or about 10% or less, and less than that, and on human CD134-expressing regulatory T cells Provided is a binding molecule that enhances the suppressor function response of human OX40L.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134（OX40）受容体の結合を妨げず、かつヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を強化する結合性分子を提供する。   Another aspect of the invention is a binding molecule that binds to human CD134, does not interfere with the binding of the human CD134 (OX40) receptor to the OX40 ligand (OX40L), and on human CD134-expressing regulatory T cells. Provides a binding molecule that enhances the suppressor function response of human OX40L.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性T細胞上でのOX40LのCD134との結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、さらにヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lの増殖性応答を妨害しない結合性分子を提供する。   Another aspect of the present invention is a binding molecule that binds to human CD134, wherein the binding action of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells is reduced by about 70% or about 60% depending on the binding molecule. Or less than or less than about 50% or about 40% or about 30% or about 20% or about 10% and further on human CD134-expressing regulatory T cells Provided are binding molecules that do not interfere with the proliferative response of human OX40L.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134（OX40）受容体のOX40リガンド（OX40L）との結合を阻害も阻止もせず、かつ、さらにヒトCD134発現性T調節細胞上でのヒトOX40Lの増殖性応答を妨害しない結合性分子を提供する。   Another aspect of the present invention is a binding molecule that binds to human CD134, which does not inhibit or block the binding of the human CD134 (OX40) receptor to the OX40 ligand (OX40L), and is further capable of expressing human CD134. Provided are binding molecules that do not interfere with the proliferative response of human OX40L on T regulatory cells.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性T細胞上のCD134に対するOX40Lの結合作用を、結合性分子によって、約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えては低下させないか、またはそれ未満しか低下させず、かつ、ヒトCD134発現性調節性T細胞上でのヒトOX40Lの増殖性応答を阻害する結合性分子を提供する。   Another aspect of the present invention is a binding molecule that binds to human CD134, wherein the binding action of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells is reduced by about 70% or about 60% or about 50% or about 40% or about 30% or about 20% or less than about 10%, or less than that, and human OX40L on human CD134-expressing regulatory T cells Binding molecules that inhibit proliferative responses are provided.

本発明の別の局面は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134（OX40）受容体のOX40リガンド（OX40L）との結合を阻害も阻止もせず、かつ、ヒトCD134発現性T調節細胞上でのヒトOX40Lの増殖性応答を阻害する結合性分子を提供する。   Another aspect of the present invention is a binding molecule that binds to human CD134, which does not inhibit or block the binding of the human CD134 (OX40) receptor to the OX40 ligand (OX40L), and human CD134-expressing T Provided are binding molecules that inhibit the proliferative response of human OX40L on regulatory cells.

OX40Lと抗CD134抗体との同時結合を測定するために適した方法について以下に述べる。抗ヒトCD134抗体の非存在下における、PHAで刺激されたヒトCD134発現性PBMC上でのヒトOX40L結合のFITC蛍光性シグナル（幾何平均（geomean）または平均蛍光強度（MFI））を100％に設定する。ヒトOX40Lの非存在下における、PHAで刺激されたヒトCD134発現性PBMC上での抗ヒトCD134抗体結合のPE蛍光シグナル（MFI）を100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、PHAで刺激されたヒトCD134発現性PBMCに対して同時に添加した時の、このFITC蛍光シグナルおよびPE蛍光シグナルの減少は、好ましくは約70％または約60％または約50％または約40％または約30％または約20％または約10％を超えず、またはそれ未満である。   A suitable method for measuring the simultaneous binding of OX40L and anti-CD134 antibody is described below. Set FITC fluorescence signal (geometric mean or mean fluorescence intensity (MFI)) of human OX40L binding on PHA-stimulated human CD134-expressing PBMC in the absence of anti-human CD134 antibody to 100% To do. The PE fluorescence signal (MFI) for anti-human CD134 antibody binding on PHA-stimulated human CD134-expressing PBMC in the absence of human OX40L is set to 100%. This reduction in FITC and PE fluorescence signals when both human OX40L and anti-human CD134 antibodies are added simultaneously to PHA-stimulated human CD134-expressing PBMC is preferably about 70% or about 60%. % Or about 50% or about 40% or about 30% or about 20% or about 10%.

TeffのOX40L媒介性の増殖性応答の妨害がないことを測定するために適した方法は、以下の通りである。ヒトOX40L処置後のヒトCD134発現性Teffにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdUの取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、活性化された（例えば、PHAで刺激された、または抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Teffに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの変化（すなわち、減分または増分）は、好ましくは約30％または約20％または約10％を超えないか、またはそれ未満である。   A suitable method for measuring the absence of interference with Teff's OX40L-mediated proliferative response is as follows. Tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation in human CD134-expressing Teff after human OX40L treatment is set to 100%. When both human OX40L and anti-human CD134 antibody were added simultaneously to activated (eg, stimulated with PHA or stimulated with anti-CD3 / anti-CD28 beads) human CD134-expressing Teff, This change in tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation (ie, decrement or increment) is preferably not more than or less than about 30% or about 20% or about 10%.

TeffのOX40L媒介性の増殖性応答に対する強化を測定するために適した方法は以下の通りである。ヒトOX40L処置後のヒトCD134発現性Teffにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、活性化された（例えば、PHAで刺激されたまたは抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Teffに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの強化は、好ましくは約30％または約40％または約50％または約60％または約70％を上回るか、またはそれ以上である。   A suitable method to measure Teff's enhancement to the OX40L-mediated proliferative response is as follows. Tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation in human CD134 expressing Teff after human OX40L treatment is set to 100%. This was when both human OX40L and anti-human CD134 antibody were added simultaneously to activated human CD134-expressing Teff (eg, stimulated with PHA or stimulated with anti-CD3 / anti-CD28 beads). The enhancement of tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation is preferably greater than or greater than about 30% or about 40% or about 50% or about 60% or about 70%.

TregのOX40L媒介性の抑制機能の妨害がないことを測定するために適した方法は以下の通りである。ヒトOX40L処置後にヒトCD134発現性Tregと共培養した（例えば、Teff／Treg比＝1：1）ヒトCD134発現性Teffにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、ヒトCD134発現性Tregと共培養した（例えば、Teff／Treg比＝1：1）、活性化された（例えば、PHAで刺激されたまたは抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Teffに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの変化（すなわち、減分または増分）は、好ましくは約30％または約20％または約10％を超えないか、またはそれ未満である。   A suitable method for measuring the absence of interference with Treg's OX40L-mediated inhibitory function is as follows. Tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation in human CD134-expressing Teff is set to 100% after human OX40L treatment and co-cultured with human CD134-expressing Treg (eg, Teff / Treg ratio = 1: 1). Both human OX40L and anti-human CD134 antibody were co-cultured with human CD134-expressing Treg (eg, Teff / Treg ratio = 1: 1), activated (eg, stimulated with PHA or anti-CD3 / anti-antibody). This change in tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation (ie, decrement or increment) when added simultaneously to human CD134-expressing Teff (stimulated with CD28 beads) is preferably about 30% or about 20% or Not more than about 10% or less.

TregのOX40L媒介性の抑制機能に対する強化を測定するために適した方法は以下の通りである。ヒトOX40L処置後にヒトCD134発現性Tregと共培養した（例えば、Teff／Treg比＝1：1）、ヒトCD134発現性Teffにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、ヒトCD134発現性Tregと共培養した（例えば、Teff／Treg比＝1：1）、活性化された（例えば、PHAで刺激されたまたは抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Teffに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの強化は、好ましくは約30％または約40％または約50％または約60％または約70％を上回るか、またはそれ以上である。   A suitable method for measuring the enhancement of Treg to OX40L-mediated inhibitory function is as follows. Tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation in human CD134-expressing Teff is set to 100% after human OX40L treatment and co-cultured with human CD134-expressing Treg (eg, Teff / Treg ratio = 1: 1). Both human OX40L and anti-human CD134 antibody were co-cultured with human CD134-expressing Treg (eg, Teff / Treg ratio = 1: 1), activated (eg, stimulated with PHA or anti-CD3 / anti-antibody). This enhanced tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation when added simultaneously to human CD134-expressing Teff (stimulated with CD28 beads) is preferably about 30% or about 40% or about 50% or about 60% or Greater than or equal to about 70%.

TregのOX40L媒介性の増殖性応答に対する妨害がないことを測定するために適した方法は以下の通りである。ヒトOX40L処置後のヒトCD134発現性Tregにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、活性化された（例えば、PHAで刺激されたまたは抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Tregに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの変化（すなわち、減分または増分）は、好ましくは約30％または約20％または約10％を超えないか、またはそれ未満である。   A suitable method for measuring the absence of interference with Treg's OX40L-mediated proliferative response is as follows. Tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation in human CD134-expressing Treg after human OX40L treatment is set to 100%. When both human OX40L and anti-human CD134 antibody were added simultaneously to activated human CD134-expressing Treg (eg stimulated with PHA or stimulated with anti-CD3 / anti-CD28 beads) The change in tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation (ie, decrement or increment) is preferably not more than or less than about 30% or about 20% or about 10%.

TregのOX40L媒介性の増殖性応答の阻害を測定するために適した方法は以下の通りである。ヒトOX40L処置後のヒトCD134発現性Tregにおけるトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みを100％に設定する。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の両方を、活性化された（例えば、PHAで刺激されたまたは抗CD3／抗CD28ビーズで刺激された）ヒトCD134発現性Tregに対して同時に添加した時の、このトリチウム標識チミジンまたはBrdU取込みの減少は、好ましくは約30％または約40％または約50％または約60％または約70％を上回る、またはそれ以上である。   A suitable method for measuring inhibition of Treg's OX40L-mediated proliferative response is as follows. Tritium-labeled thymidine or BrdU incorporation in human CD134-expressing Treg after human OX40L treatment is set to 100%. When both human OX40L and anti-human CD134 antibody were added simultaneously to activated human CD134-expressing Treg (eg stimulated with PHA or stimulated with anti-CD3 / anti-CD28 beads) The reduction in tritium labeled thymidine or BrdU incorporation is preferably greater than or greater than about 30% or about 40% or about 50% or about 60% or about 70%.

本発明の別の局面は、哺乳動物における癌を治療する方法であって、本明細書に記載された結合性分子の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む方法を提供する。   Another aspect of the invention provides a method of treating cancer in a mammal, comprising administering to the mammal a therapeutically effective amount of a binding molecule described herein.

本発明のいくつかの態様において、結合性分子は、抗体クローン12H3および/もしくはクローン20E5、またはいずれかの抗体の抗原結合性断片である。さらなる態様において、哺乳動物はヒトである。   In some embodiments of the invention, the binding molecule is antibody clone 12H3 and / or clone 20E5, or an antigen-binding fragment of any antibody. In a further embodiment, the mammal is a human.

本発明のいくつかの態様において、結合性分子は、SEQ ID NO：69のVHおよびSEQ ID NO：67のVLを有する抗体12H3_VL1VH1である。   In some embodiments of the invention, the binding molecule is antibody 12H3_VL1VH1 having a VH of SEQ ID NO: 69 and a VL of SEQ ID NO: 67.

本発明のいくつかの態様において、結合性分子は、SEQ ID NO：70のVHおよびSEQ ID NO：67のVLを有する抗体12H3_VL1VH2である。   In some embodiments of the invention, the binding molecule is antibody 12H3_VL1VH2 having a VH of SEQ ID NO: 70 and a VL of SEQ ID NO: 67.

本発明のもう1つの好ましい態様においては、哺乳動物における癌を予防する方法であって、本明細書に記載の通りの結合性分子の治療的有効量を哺乳動物に投与する段階を含む方法が提供される。   In another preferred embodiment of the present invention, a method for preventing cancer in a mammal comprising the step of administering to the mammal a therapeutically effective amount of a binding molecule as described herein. Provided.

「癌を予防する」または「癌の予防」という用語は、発癌または腫瘍発生の開始が立証されてはいないものの、癌の素因が例えば遺伝子スクリーニングによる判定で、または他の様式で特定されている哺乳動物における癌の発生を遅らせる、阻害する、または予防することを指す。この用語はまた、前悪性状態を有する哺乳動物を、前悪性状態の悪性腫瘍への進行を停止させるか、またはその退縮を引き起こすために治療することも範囲に含む。前悪性状態の例には、過形成、異形成および化生が含まれる。いくつかの態様において、結合性分子は本明細書に記載された抗CD134抗体またはその断片である。本発明のさらなる態様においては、抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5、またはいずれかの抗体の抗原結合性断片から選択される結合性分子が提供される。さらなる態様において、哺乳動物はヒトである。   The term “preventing cancer” or “preventing cancer” has not been demonstrated to initiate carcinogenesis or tumor development, but a predisposition to cancer has been identified, for example, as determined by genetic screening, or otherwise Refers to delaying, inhibiting or preventing the development of cancer in a mammal. The term also includes treatment of a mammal having a pre-malignant condition to stop progression to or cause regression of a pre-malignant malignancy. Examples of premalignant conditions include hyperplasia, dysplasia and metaplasia. In some embodiments, the binding molecule is an anti-CD134 antibody or fragment thereof described herein. In a further aspect of the invention there is provided a binding molecule selected from antibody clone 12H3 and / or clone 20E5, or an antigen-binding fragment of any antibody. In a further embodiment, the mammal is a human.

「治療する」または「治療」という用語は、その目的が、望まれない生理的変化または障害、例えば、腫瘍または腫瘍細胞の発生または広がりなどを予防すること、または緩徐にすること（少なくすること）である、治療的処置および予防処置的または予防的な手段の両方のことを指す。有益な、または所望の臨床的結果には、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらない、症状の軽減、疾患の程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化しない）疾患状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または完全な）が含まれる。「治療」はまた、対象が治療を受けなかった場合の予想生存期間と比較して生存期間が延長することも意味しうる。治療を必要とするものには、病状もしくは障害をすでに有するもののほかに、病状もしくは障害を有しやすいもの、または病状もしくは障害を予防しようとするものが含まれる。任意の本発明の抗体を、本発明の方法に用いうる。   The terms “treat” or “treatment” are intended to prevent or slow (reduce) an undesirable physiological change or disorder, such as the development or spread of a tumor or tumor cells. ), Both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures. Beneficial or desired clinical outcome, whether detectable or undetectable, relief of symptoms, diminished degree of disease, stabilized (ie, does not worsen) disease state, disease progression Delayed or slowed, improved or alleviated disease state, and remission (partial or complete). “Treatment” can also mean prolonging survival as compared to expected survival if the subject has not received treatment. Those in need of treatment include those already having the medical condition or disorder, as well as those prone to have the medical condition or disorder, or those seeking to prevent the medical condition or disorder. Any antibody of the invention can be used in the methods of the invention.

本発明のもう1つの態様は、癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に対して、SEQ ID NO：152のVHおよびSEQ ID NO：100のVLを含む抗CD134抗体を、癌を治療するのに十分な期間にわたって投与する段階を含む方法である。   Another aspect of the present invention is a method of treating cancer, wherein a patient in need thereof is treated with an anti-CD134 antibody comprising a VH of SEQ ID NO: 152 and a VL of SEQ ID NO: 100. Administering for a period of time sufficient to treat the cancer.

本発明のもう1つの態様は、癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に対して、SEQ ID NO：134のVHおよびSEQ ID NO：98のVLを含む抗CD134抗体を、癌を治療するのに十分な期間にわたって投与する段階を含む方法である。   Another embodiment of the present invention is a method of treating cancer, wherein a patient in need thereof is treated with an anti-CD134 antibody comprising a VH of SEQ ID NO: 134 and a VL of SEQ ID NO: 98. Administering for a period of time sufficient to treat the cancer.

本発明のもう1つの態様は、癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に対して、
SEQ ID NO：67のVHおよびSEQ ID NO：69のVL；
SEQ ID NO：67のVHおよびSEQ ID NO：70のVL；
SEQ ID NO：67のVHおよびSEQ ID NO：71のVL；
SEQ ID NO：68のVHおよびSEQ ID NO：69のVL；
SEQ ID NO：68のVHおよびSEQ ID NO：70のVL；または
SEQ ID NO：68のVHおよびSEQ ID NO：71のVL
を含む抗CD134抗体を、癌を治療するのに十分な期間にわたって投与する段階を含む方法である。 Another aspect of the invention is a method of treating cancer for a patient in need thereof.
SEQ ID NO: 67 VH and SEQ ID NO: 69 VL;
SEQ ID NO: 67 VH and SEQ ID NO: 70 VL;
SEQ ID NO: 67 VH and SEQ ID NO: 71 VL;
SEQ ID NO: 68 VH and SEQ ID NO: 69 VL;
SEQ ID NO: 68 VH and SEQ ID NO: 70 VL; or
SEQ ID NO: 68 VH and SEQ ID NO: 71 VL
Administering an anti-CD134 antibody comprising: for a period of time sufficient to treat cancer.

悪性もしくは良性および／または原発性もしくは続発性を含む種々の癌を、本発明による方法によって治療または予防することができる。そのような癌の例は当業者に公知であり、Merck Manual of Diagnosis and Therapy（Merckにより刊行）などの標準的な教科書に列記されている。いくつかの態様において、癌は、典型的には免疫療法に反応する癌であるが、これまで免疫療法と結びつけられていない癌でもよい。例示的な癌は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、および他の新生物性悪性腫瘍がある。癌が、不応性または再発性の悪性癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病、扁平上皮癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（gastric or stomach cancer）（消化器癌を含む）、膵癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、およびさまざまな種類の頭頸部癌、ならびにB細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）；小リンパ球性（SL）NHL；中悪性度／濾胞性NHL；中悪性度びまん性NHL；高悪性度免疫芽球性NHL；高悪性度リンパ芽球性NHL；高悪性度小非分割細胞NHL；巨大病変NHL；マントル細胞リンパ腫；AIDS関連リンパ腫；およびワルデンストローム・マクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（CLL）；急性リンパ芽球性白血病（ALL）；毛様細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；多発性骨髄腫、および移植後リンパ増殖性障害（PTLD）である。   Various cancers, including malignant or benign and / or primary or secondary, can be treated or prevented by the method according to the present invention. Examples of such cancers are known to those skilled in the art and are listed in standard textbooks such as the Merck Manual of Diagnosis and Therapy (published by Merck). In some embodiments, the cancer is typically a cancer that responds to immunotherapy, but may be a cancer that has not previously been linked to immunotherapy. Exemplary cancers are melanoma (eg, metastatic malignant melanoma), renal cancer (eg, clear cell carcinoma), prostate cancer (eg, hormone refractory prostate adenocarcinoma), pancreatic adenocarcinoma, breast cancer, colon cancer, Lung cancer (eg, non-small cell lung cancer), esophageal cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, liver cancer, ovarian cancer, cervical cancer, thyroid cancer, glioblastoma, glioma, leukemia, lymphoma, and other new There is a biological malignancy. Cancer is refractory or recurrent malignant cancer, lymphoma, blastoma, sarcoma and leukemia, squamous cell carcinoma, lung cancer (including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, and lung squamous cell carcinoma), Peritoneal cancer, hepatocellular carcinoma, gastric or stomach cancer (including gastrointestinal cancer), pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, liver cancer, breast cancer, colon cancer, Colorectal cancer, endometrial cancer or uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer or kidney cancer, liver cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver cancer, and various types of head and neck cancer, and B cell lymphoma ( Low-grade / follicular non-Hodgkin lymphoma (NHL); Small lymphocytic (SL) NHL; Medium-grade / follicular NHL; Medium-grade diffuse NHL; High-grade immunoblastic NHL; High-grade lymph Blastic NHL; high-grade small undivided cell NHL; giant lesion NHL; mantle cell lymphoma; AIDS Lymphoma; and Waldenstrom's macroglobulinemia); chronic lymphocytic leukemia (CLL); acute lymphoblastic leukemia (ALL); ciliary cell leukemia; chronic myeloblastic leukemia; And post-transplant lymphoproliferative disorder (PTLD).

本発明の別の態様において、結合性分子は単剤療法として単独で投与することもでき、または1つもしくは複数の追加的な治療剤もしくは治療法と組み合わせて投与することもできる。したがって、本発明の別の態様においては、併用療法によって癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示された結合性分子を1つまたは複数の追加的な治療法または治療剤と組み合わせて投与する段階を含む方法が提供される。「追加的な治療法」という用語は、本開示によって提供される結合性分子を治療剤として使用しない治療法のことを指す。「追加的な治療剤」という用語は、本開示によって提供される結合性分子以外の任意の治療剤のことを指す。いくつかの態様において、結合性分子は、抗ヒトCD134抗体クローン12H3および／もしくはクローン20E5、いずれかの抗体の抗原結合性断片、またはヒト化12H3抗体もしくはヒト化20E5抗体である。1つの特定の局面において、本開示は、哺乳動物に対して本開示によって提供される結合性分子の治療的有効量を1つまたは複数の追加的な治療剤と組み合わせて投与する段階を含む、哺乳動物における癌を治療するための併用療法を提供する。さらなる態様において、哺乳動物はヒトである。   In another embodiment of the invention, the binding molecule can be administered alone as a monotherapy or can be administered in combination with one or more additional therapeutic agents or therapies. Accordingly, in another aspect of the invention, a method of treating or preventing cancer by combination therapy, wherein the binding molecule disclosed herein is combined with one or more additional treatments or therapeutic agents. A method is provided that includes administering in combination. The term “additional therapy” refers to a therapy that does not use the binding molecule provided by the present disclosure as a therapeutic agent. The term “additional therapeutic agent” refers to any therapeutic agent other than the binding molecule provided by the present disclosure. In some embodiments, the binding molecule is an anti-human CD134 antibody clone 12H3 and / or clone 20E5, an antigen-binding fragment of either antibody, or a humanized 12H3 antibody or a humanized 20E5 antibody. In one particular aspect, the disclosure includes administering to a mammal a therapeutically effective amount of a binding molecule provided by the disclosure in combination with one or more additional therapeutic agents. Combination therapy is provided for treating cancer in a mammal. In a further embodiment, the mammal is a human.

いくつかの態様において、癌は、前立腺癌、結腸癌、肺癌、血液悪性腫瘍、黒色腫または膀胱癌である。   In some embodiments, the cancer is prostate cancer, colon cancer, lung cancer, hematological malignancy, melanoma or bladder cancer.

いくつかの態様において、癌は前立腺癌である。   In some embodiments, the cancer is prostate cancer.

いくつかの態様において、癌は結腸癌である。   In some embodiments, the cancer is colon cancer.

いくつかの態様において、癌は肺癌である。   In some embodiments, the cancer is lung cancer.

いくつかの態様において、癌は血液悪性腫瘍である。   In some embodiments, the cancer is a hematological malignancy.

いくつかの態様において、癌は黒色腫である。   In some embodiments, the cancer is melanoma.

いくつかの態様において、癌は膀胱癌である。   In some embodiments, the cancer is bladder cancer.

いくつかの態様において、肺癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、または肺扁平上皮癌である。   In some embodiments, the lung cancer is small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, or lung squamous cell carcinoma.

非常にさまざまな癌治療剤を、結合性分子と組み合わせて用いることができる。当業者は、本開示の方法および結合性分子と組み合わせて用いうる他の癌治療法の存在および開発について認識していると考えられ、それらは本明細書に明記された形態の治療法には限定されないと考えられる。癌を治療するための併用療法に用いうる追加的な治療剤のカテゴリーの例には、（1）化学療法剤、（2）免疫治療剤、および（3）ホルモン治療剤が含まれる。   A wide variety of cancer therapeutic agents can be used in combination with binding molecules. Those skilled in the art will be aware of the existence and development of other cancer therapies that can be used in combination with the disclosed methods and binding molecules, and these include the forms of treatment specified herein. It is thought that it is not limited. Examples of additional therapeutic agent categories that may be used in combination therapy to treat cancer include (1) chemotherapeutic agents, (2) immunotherapeutic agents, and (3) hormone therapeutic agents.

「化学療法剤」という用語は、癌細胞の死滅を引き起こしうる、または癌細胞の***、修復、増殖および／もしくは機能に干渉しうる、化学物質または生体物質のことを指す。化学療法剤の例には、WO2006/088639、WO2006/129163およびUS 20060153808号に開示されたものが含まれ、それらの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。   The term “chemotherapeutic agent” refers to a chemical or biological substance that can cause cancer cell death or interfere with cancer cell division, repair, growth and / or function. Examples of chemotherapeutic agents include those disclosed in WO2006 / 088639, WO2006 / 129163 and US 20060153808, the disclosures of which are incorporated herein by reference.

「免疫治療剤」という用語は、哺乳動物の免疫応答を強化しうる化学物質または生体物質のことを指す。免疫治療剤の例には以下のものが含まれる：カルメット・ゲラン菌（bacillus Calmette-Guerin）（BCG）；インターフェロンなどのサイトカイン；ワクチン、例えば、MyVax個別化免疫療法、Onyvax-P、オンコファージ（Oncophage）、GRNVACI、Favld、プロベンジ（Provenge）、GVAX、Lovaxin C、BiovaxID、GMXXおよびNeuVaxなど；ならびに抗体、例えばアレムツズマブ（キャンパス（CAMPATH）（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（AVASTIN）（登録商標））、セツキシマブ（エルビタックス（ERBITUX）（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（gemtuzunab ozogamicin）（マイロターグ（MYLOTARG）（登録商標））、イブリツモマブチウキセタン（ゼヴァリン（ZEVALIN）（登録商標））、パニツムマブ（ベクチビックス（VECTIBIX）（登録商標））、リツキシマブ（リツキサン（RITUXAN）（登録商標）、マブセラ（MABTHERA）（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（HERCEPTIN）（登録商標））、トシツモマブ（ベキサール（BEXXAR）（登録商標））、トレメリムマブ、CAT-3888、およびWO2003/040170に開示されているCD40受容体に対するアゴニスト抗体など。   The term “immunotherapeutic agent” refers to a chemical or biological substance that can enhance the immune response of a mammal. Examples of immunotherapeutic agents include: bacillus Calmette-Guerin (BCG); cytokines such as interferon; vaccines such as MyVax personalized immunotherapy, Onyvax-P, oncophage ( Oncophage), GRNVACI, Favld, Provenge, GVAX, Lovaxin C, BiovaxID, GMXX, and NeuVax; and antibodies such as alemtuzumab (CAMPATH®), bevacizumab (AVASTIN®) ), Cetuximab (ERBITUX (registered trademark)), gemtuzunab ozogamicin (MYLOTARG (registered trademark)), ibritumomab chiuxetane (ZEVALIN (registered trademark)) )), Panitumumab (VECTIBIX®), rituximab (RITU XAN), MABTHERA®, trastuzumab (HERCEPTIN®), tositumomab (BEXXAR®), tremelimumab, CAT-3888, and WO2003 / Agonist antibodies to the CD40 receptor disclosed in 040170.

「ホルモン治療剤」という用語は、ホルモンの産生を阻害するかもしくは消失させる、または癌性細胞の増殖および／もしくは生存に対するホルモンの効果を阻害するかもしくはそれに拮抗する、化学物質または生体物質のことを指す。本明細書における方法に適している、そのような作用物質の例には、US20070117809に開示されているものが含まれる。具体的なホルモン治療剤の例には、タモキシフェン（ノルバデックス（NOLVADEX）（登録商標））、トレミフェン（フェアストン（Fareston））、フルベストラント（ファスロデックス（FASLODEX）（登録商標））、アナストロゾール（アリミデックス（ARIMIDEX）（登録商標））、エキセメスタン（アロマシン（AROMASIN）（登録商標））、レトロゾール（フェマーラ（FEMARA）（登録商標））、酢酸メゲストロール（メゲース（MEGACE）（登録商標））、ゴセレリン（ゾラデックス（ZOLADEX）（登録商標））およびリュープロリド（リュープロン（LUPRON）（登録商標））が含まれる。また、本開示の結合性分子を、（1）ホルモンの産生に関与する臓器または腺、例えば卵巣、睾丸、副腎および下垂体などの全体または一部を除去する外科的方法、ならびに（2）患者の臓器または腺に対して、標的とするホルモンの産生を阻害するかまたは消失させるのに十分な量の放射線照射を行う放射線治療といった、非薬物性ホルモン療法と組み合わせて用いることもできる。   The term “hormone therapeutic agent” refers to a chemical or biological substance that inhibits or eliminates the production of hormones or inhibits or antagonizes the effects of hormones on the growth and / or survival of cancerous cells. Point to. Examples of such agents that are suitable for the methods herein include those disclosed in US20070117809. Examples of specific hormonal treatments include tamoxifen (NOLVADEX®), toremifene (Fareston), fulvestrant (FASLODEX®), anastros Zole (ARIMIDEX (registered trademark)), Exemestane (AROMASIN (registered trademark)), letrozole (FEMARA (registered trademark)), megestrol acetate (MEGACE (registered trademark)) ), Goserelin (ZOLADEX®) and leuprolide (LUPRON®). In addition, the binding molecules of the present disclosure can be used to (1) surgical methods to remove all or part of organs or glands involved in hormone production, such as ovary, testis, adrenal gland and pituitary gland, and (2) patients Can also be used in combination with non-drug hormone therapy, such as radiation therapy in which a sufficient amount of radiation is applied to the organ or gland of the subject to inhibit or eliminate the production of the target hormone.

本発明の別の態様においては、併用療法によって癌を治療または予防する方法であって、本明細書に開示された結合性分子を投与する段階、および腫瘍を除去するための外科手術を含む方法が提供される。結合性分子は、前記外科手術の前、最中または後に、哺乳動物に対して投与することができる。   In another aspect of the invention, a method of treating or preventing cancer by combination therapy comprising administering a binding molecule disclosed herein, and surgery to remove a tumor Is provided. The binding molecule can be administered to the mammal before, during or after the surgery.

癌を治療するための併用療法は、本開示によって提供される結合性分子と、電離（電磁）放射線療法（例えば、X線またはγ線）および粒子線放射線療法（例えば、直線型高エネルギー放射線）などの放射線療法との組み合わせも範囲に含む。放射線源は、哺乳動物の外部にあっても内部にあってもよい。結合性分子は、放射線療法の前、最中または後に、哺乳動物に対して投与することができる。   Combination therapies for treating cancer include binding molecules provided by the present disclosure and ionizing (electromagnetic) radiation therapy (eg, X-rays or γ-rays) and particle beam radiation therapy (eg, linear high-energy radiation). Combinations with such radiation therapy are also included in the scope. The radiation source may be external or internal to the mammal. The binding molecule can be administered to the mammal before, during or after radiation therapy.

本開示によって提供される結合性分子および組成物は、任意の適した、投与の経腸的経路または非経口的経路を介して投与することができる。投与の「経腸的経路」という用語は、胃腸管のいずれかの部分を介した投与のことを指す。経腸的経路の例には、経口経路、粘膜経路、頬側経路および経直腸経路、または胃内経路が含まれる。投与の「非経口的経路」とは、経腸的経路以外の投与経路のことを指す。投与の適した経路および方法は、用いる具体的な抗体、所望の吸収速度、用いる具体的な製剤または剤形、治療される障害の種類または重症度、具体的な作用部位、および患者の病状といったいくつかの要因に応じて異なると考えられ、当業者によって容易に選択されうる。   The binding molecules and compositions provided by the present disclosure can be administered via any suitable enteral or parenteral route of administration. The term “enteral route” of administration refers to administration via any part of the gastrointestinal tract. Examples of enteral routes include oral, mucosal, buccal and rectal routes, or intragastric routes. “Parenteral route of administration” refers to routes of administration other than enteral routes. Suitable routes and methods of administration include the specific antibody used, the desired absorption rate, the specific formulation or dosage form used, the type or severity of the disorder being treated, the specific site of action, and the patient's condition It will vary depending on several factors and can be easily selected by one skilled in the art.

結合性分子の「治療的有効量」という用語は、意図する治療目的にとって有効な量のことを指す。例えば、免疫応答の強化という状況において、「治療的有効量」とは、哺乳動物の免疫系の任意の応答を刺激する、誘発する、増大させる、向上させる、または増強させるのに有効な任意の量のことである。癌を治療するという状況において、「治療的有効量」とは、治療される哺乳動物において任意の望ましいまたは有益な効果、例えば、癌細胞のさらなる増殖もしくは伝播の阻害、癌細胞の死滅、癌の再発の阻害、癌に伴う疼痛の軽減、または哺乳動物の生存性の改善などを引き起こすのに十分な任意の量のことである。癌を予防する方法において、「治療的有効量」とは、結合性分子が投与された哺乳動物における癌の発生を遅らせる、阻害する、または予防するのに有効な任意の量のことである。   The term “therapeutically effective amount” of a binding molecule refers to an amount effective for the intended therapeutic purpose. For example, in the context of enhancing an immune response, a “therapeutically effective amount” is any effective in stimulating, inducing, increasing, improving, or enhancing any response of the mammalian immune system. It is a quantity. In the context of treating cancer, a “therapeutically effective amount” is any desired or beneficial effect in the mammal being treated, such as inhibiting further growth or spread of cancer cells, killing cancer cells, cancer Any amount sufficient to cause inhibition of recurrence, alleviation of pain associated with cancer, or improved survival of a mammal. In a method for preventing cancer, a “therapeutically effective amount” is any amount effective to delay, inhibit or prevent the development of cancer in a mammal to which a binding molecule has been administered.

結合性分子の治療的有効量は通常、哺乳動物の体重当たりで、約0.001〜約500mg／kg、より一般的には約0.05〜約100mg／kgの範囲にわたる。例えば、量は、哺乳動物の体重当たりで、約0.3mg／kg、1mg／kg、3mg／kg、5mg／kg、10mg／kg、50mg／kgまたは100mg／kgであってよい。いくつかの態様において、抗ヒトCD134抗体の治療的有効量は、哺乳動物の体重当たりで約0.1〜30mg／kgの範囲にある。投与すべき正確な投与量レベルは当業者によって容易に決定可能であり、それは、治療しようとする障害の種類および重症度、使用する具体的な結合性分子、投与経路、投与の時間、治療の持続時間、使用する具体的な追加的治療法、治療される患者の年齢、性別、体重、病状、全般的健康状態および病歴、ならびに当技術分野において周知の同様の要因といった、いくつかの要因に依存すると考えられる。   A therapeutically effective amount of the binding molecule usually ranges from about 0.001 to about 500 mg / kg, more usually from about 0.05 to about 100 mg / kg, based on the weight of the mammal. For example, the amount may be about 0.3 mg / kg, 1 mg / kg, 3 mg / kg, 5 mg / kg, 10 mg / kg, 50 mg / kg or 100 mg / kg per body weight of the mammal. In some embodiments, the therapeutically effective amount of the anti-human CD134 antibody is in the range of about 0.1-30 mg / kg per mammal body weight. The exact dosage level to be administered can be readily determined by one skilled in the art and includes the type and severity of the disorder to be treated, the specific binding molecule used, the route of administration, the time of administration, the Several factors such as duration, specific additional treatment used, age of patient to be treated, gender, weight, medical condition, general health and history, and similar factors well known in the art It is thought that it depends.

結合性分子または組成物は通常、複数の機会に投与される。個々の投薬間の間隔は、例えば、毎週、毎月、3カ月毎または毎年であってよい。例示的な治療レジメンは、毎週1回、2週毎に1回、3週毎に1回、4週毎に1回、毎月1回、3カ月毎に1回、または3カ月〜6カ月毎に1回の投与を必要とする。抗ヒトCD134抗体の典型的な投薬レジメンは、以下の投薬スケジュールのうち1つを用いた、1mg／kg体重または3mg／kg体重での静脈内投与を介するものを含む：（i）4週毎に6回投薬し、その後は3カ月毎とする；（ii）3週毎；（iii）3mg／kg体重を1回、その後は3週毎に1mg／kg体重とする。   A binding molecule or composition is usually administered on multiple occasions. The interval between individual doses can be, for example, weekly, monthly, every three months or yearly. Exemplary treatment regimens are once a week, once every two weeks, once every three weeks, once every four weeks, once every month, once every three months, or every three to six months Requires one dose. Exemplary dosing regimens for anti-human CD134 antibodies include via intravenous administration at 1 mg / kg body weight or 3 mg / kg body weight using one of the following dosing schedules: (i) Every 4 weeks 6 doses, then every 3 months; (ii) every 3 weeks; (iii) 3 mg / kg body weight once and then every 3 weeks at 1 mg / kg body weight.

本発明は、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134（OX40）受容体とのOX40リガンド（OX40L）の結合を妨げない結合性分子を提供する。いくつかの態様において、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用は、該分子の飽和濃度またはそれを上回る濃度で、50％を超えては低下しない。いくつかの態様において、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用は、結合性分子の濃度が70nMで、70％を超えては低下しない。本発明はさらに、
（a）SEQ ID NO：12のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子を提供する。 The present invention provides binding molecules that bind to human CD134 and do not interfere with the binding of OX40 ligand (OX40L) to human CD134 (OX40) receptor. In some embodiments, the binding of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells is not reduced by more than 50% at or above the saturating concentration of the molecule. In some embodiments, the binding of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells does not decrease beyond 70% at a concentration of binding molecule of 70 nM. The present invention further includes
(A) the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 Alternatively, a binding molecule comprising a light chain variable region comprising a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions is provided.

いくつかの態様において、結合性分子は、
（a）SEQ ID NO：14のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：15のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR2；および／または
（c）SEQ ID NO：16のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR3
を含む。 In some embodiments, the binding molecule is
(A) the heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions;
(B) a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or Heavy chain CDR3 containing variants of that sequence with one, two or three amino acid substitutions
including.

1つの好ましい態様において、結合性分子は、
（a）SEQ ID NO：17のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：18のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR2；および／または
（c）SEQ ID NO：19のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR3
を含む。 In one preferred embodiment, the binding molecule is
(A) a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions;
(B) a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or Light chain CDR3 containing variants of that sequence with one, two or three amino acid substitutions
including.

本発明はさらに、ヒトCD134との結合に関して、
（a）SEQ ID NO：12のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）SEQ ID NO：13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体と競合する結合性分子を提供する。 The invention further relates to binding to human CD134,
Provided is a binding molecule that competes with an antibody comprising (a) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; and (b) a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.

また、
（a）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体；および／または
（b）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体
を含む結合性分子も提供される。 Also,
(A) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 Also provided are binding molecules comprising a light chain variable region comprising or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions.

1つの態様において、本発明による結合性分子は、
（a）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：7のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR2；および／または
（c）SEQ ID NO：8のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖CDR3
を含む。 In one embodiment, the binding molecule according to the invention is
(A) a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions;
(B) a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or Heavy chain CDR3 containing variants of that sequence with one, two or three amino acid substitutions
including.

1つの態様において、本発明による結合性分子は、
（a）SEQ ID NO：9のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR1；
（b）SEQ ID NO：10のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR2；および／または
（c）SEQ ID NO：11のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖CDR3
を含む。 In one embodiment, the binding molecule according to the invention is
(A) a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions;
(B) a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or Light chain CDR3 containing variants of that sequence with one, two or three amino acid substitutions
including.

1つの態様において、結合性分子は、ヒトCD134との結合に関して、
（a）SEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（b）SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体と競合する。 In one embodiment, the binding molecule is for binding to human CD134,
(A) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; and (b) competing with an antibody comprising a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.

1つの態様において、結合性分子は、ヒトCD134の細胞外ドメインのアミノ酸配列中のエピトープと特異的に結合する。いくつかの態様において、結合性分子は、
（a）SEQ ID NO：34；
（b）SEQ ID NO：35
（c）SEQ ID NO：36；
（d）SEQ ID NO：38；および／または
（d）SEQ ID NO：92
のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する。 In one embodiment, the binding molecule specifically binds to an epitope in the amino acid sequence of the extracellular domain of human CD134. In some embodiments, the binding molecule is
(A) SEQ ID NO: 34;
(B) SEQ ID NO: 35
(C) SEQ ID NO: 36;
(D) SEQ ID NO: 38; and / or (d) SEQ ID NO: 92
It binds to an epitope of the extracellular domain of human CD134 containing the amino acid sequence of

いくつかの態様において、結合性分子は、ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するのに関与する、ヒトCD134発現性ヒト免疫担当細胞（例えば、活性化Teffおよび／または活性化Treg）上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134受容体の結合を妨げない。   In some embodiments, the binding molecule is OX40 on human CD134-expressing human immunocompetent cells (eg, activated Teff and / or activated Treg) that are involved in inhibiting the growth of human tumor cells. Does not interfere with the binding of the human CD134 receptor to the ligand (OX40L).

いくつかの態様において、結合性分子は、ヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するのに関与するヒトCD134発現性ヒト免疫担当細胞（例えば、活性化Teffおよび／または活性化Treg）上での、ヒトOX40リガンド（OX40L）の結合性および／または免疫賦活性応答を強化する。   In some embodiments, the binding molecule is human OX40 on human CD134-expressing human immunocompetent cells (eg, activated Teff and / or activated Treg) involved in inhibiting the growth of human tumor cells. Enhance ligand (OX40L) binding and / or immunostimulatory responses.

いくつかの態様において、結合性分子は、ヒトCD134発現性エフェクターT細胞上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げず、かつヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を妨害しない。   In some embodiments, the binding molecule does not interfere with binding of human CD134 to OX40 ligand (OX40L) on human CD134-expressing effector T cells and provides an immunostimulatory and / or proliferative response of human OX40L. Do not disturb.

本発明はまた、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性エフェクターT細胞上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げず、かつヒトOX40Lの免疫賦活性および／または増殖性応答を強化する結合性分子も提供する。   The present invention also relates to a binding molecule that binds to human CD134, which does not interfere with the binding of human CD134 to OX40 ligand (OX40L) on human CD134-expressing effector T cells, and immunostimulatory activity of human OX40L and Also provided are binding molecules that enhance the proliferative response.

本発明はさらに、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性調節性T細胞上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げず、かつヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を妨害しない結合性分子を提供する。   The present invention further relates to a binding molecule that binds to human CD134, which does not interfere with binding of human CD134 to OX40 ligand (OX40L) on human CD134-expressing regulatory T cells, and suppresses human OX40L suppressor function. Provided is a binding molecule that does not interfere with.

また、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性調節性T細胞での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げず、かつヒトOX40Lのサプレッサー機能応答を強化する結合性分子も提供される。   In addition, it is a binding molecule that binds to human CD134 and does not interfere with the binding of human CD134 to OX40 ligand (OX40L) in human CD134-expressing regulatory T cells and enhances the suppressor function response of human OX40L Sex molecules are also provided.

また、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性調節性T細胞上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げないが、ヒトOX40Lの増殖性応答を妨害しない結合性分子も提供される。   It is also a binding molecule that binds to human CD134 and does not prevent human CD134 binding to OX40 ligand (OX40L) on human CD134-expressing regulatory T cells, but does not interfere with the proliferative response of human OX40L. Binding molecules are also provided.

さらにまた、ヒトCD134と結合する結合性分子であって、ヒトCD134発現性調節性T細胞上での、OX40リガンド（OX40L）に対するヒトCD134の結合を妨げないが、ヒトOX40Lの増殖性応答は阻害する結合性分子も提供される。   Furthermore, it is a binding molecule that binds to human CD134 and does not prevent human CD134 binding to OX40 ligand (OX40L) on human CD134-expressing regulatory T cells, but inhibits the proliferative response of human OX40L A binding molecule is also provided.

本発明の結合性分子は、好ましくは、該分子の飽和濃度またはそれを上回る濃度で、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用を50％を超えては低下させない結合性分子である。   The binding molecule of the present invention preferably does not reduce the binding action of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells by more than 50% at a saturation concentration of the molecule or above. Sex molecule.

本発明の結合性分子は、好ましくは、結合性分子の濃度が70nMで、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用を70％を超えては低下させない結合性分子である。   The binding molecule of the present invention is preferably a binding molecule that has a binding molecule concentration of 70 nM and does not reduce the binding effect of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells by more than 70%. is there.

1つの態様において、本発明による結合性分子はヒト化抗体である。もう1つの態様において、本発明による結合性分子はキメラ抗体、ヒト化抗体もしくはDeImmunized（商標）抗体、またはそれらの断片である。   In one embodiment, the binding molecule according to the invention is a humanized antibody. In another embodiment, the binding molecule according to the invention is a chimeric antibody, a humanized antibody or a DeImmunized ™ antibody, or a fragment thereof.

さらにもう1つの態様において、本発明による結合性分子は、抗体、抗体模倣物（例えば、非抗体性スキャフォールドに基づくもの）、RNAアプタマー、小分子またはCovX-bodyである。   In yet another embodiment, a binding molecule according to the invention is an antibody, antibody mimetic (eg, based on a non-antibody scaffold), RNA aptamer, small molecule or CovX-body.

いくつかの態様において、本発明による結合性分子は、IgG、IgA、IgD、IgEまたはIgM抗体、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4抗体などである。   In some embodiments, a binding molecule according to the invention is an IgG, IgA, IgD, IgE or IgM antibody, such as an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody.

いくつかの態様において、結合性分子はIgG4抗体である。   In some embodiments, the binding molecule is an IgG4 antibody.

いくつかの態様において、抗体は、例えば以下のものからなる群より選択される、抗体の抗原結合性断片である：Fv断片（例えば、単鎖Fvおよびジスルフィド結合したFv）；Fab様断片（例えば、Fab断片、Fab'断片およびF(ab')2断片）；ならびにドメイン抗体。いくつかの態様において、抗原結合性断片または結合部分はscFvである。いくつかの態様において、結合モイエティーは組換え抗体である。いくつかの態様において、結合部分はモノクローナル抗体である。   In some embodiments, the antibody is an antigen-binding fragment of an antibody, eg, selected from the group consisting of: Fv fragments (eg, single chain Fv and disulfide linked Fv); Fab-like fragments (eg, , Fab fragments, Fab ′ fragments and F (ab ′) 2 fragments); and domain antibodies. In some embodiments, the antigen-binding fragment or binding moiety is scFv. In some embodiments, the binding moiety is a recombinant antibody. In some embodiments, the binding moiety is a monoclonal antibody.

本発明はまた、結合部分がポリペプチドであることを条件とする、前記の特許請求の範囲のいずれか1つに記載の結合性分子をコードする核酸分子も提供する。   The invention also provides a nucleic acid molecule encoding a binding molecule according to any one of the preceding claims, provided that the binding moiety is a polypeptide.

また、本発明による少なくとも1つの核酸分子を含むベクターも提供される。   Also provided is a vector comprising at least one nucleic acid molecule according to the present invention.

さらに、本発明によるベクターまたは核酸を含む宿主細胞も提供される。宿主細胞は好ましくは、哺乳動物または昆虫に由来する。   Further provided are host cells comprising a vector or nucleic acid according to the present invention. The host cell is preferably derived from a mammal or an insect.

本発明はさらに、本発明による結合性分子を調製するための方法であって、（i）CD134結合性分子を調製する段階、および（ii）OX40LのCD134との結合を妨げない結合性分子の同定および入手のために該分子をスクリーニングする段階を含む方法を提供する。段階（ii）は、好ましくは、飽和濃度のOX40LへのCD134の曝露後に、CD134と結合する結合性分子を同定する段階を含む。結合性分子がモノクローナル抗体である場合には、結合性分子を調製するための方法は、動物にヒトCD134による免疫処置を行う段階、抗CD134抗体を分泌するハイブリドーマを調製する段階、および抗CD134抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする段階を含む。本発明はさらに、必要とする対象において癌の予防または治療に用いるための、本発明による、または本発明に従って作製された結合性分子も提供する。いくつかの態様において、癌は、肺癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、血液のがん、黒色腫、または制御不能な細胞増殖によって特徴づけられる他の任意の疾患もしくは障害である。   The present invention further provides a method for preparing a binding molecule according to the present invention comprising: (i) preparing a CD134 binding molecule; and (ii) a binding molecule that does not interfere with the binding of OX40L to CD134. Methods are provided that include screening the molecule for identification and availability. Step (ii) preferably comprises identifying a binding molecule that binds to CD134 after exposure of CD134 to a saturating concentration of OX40L. When the binding molecule is a monoclonal antibody, the method for preparing the binding molecule comprises immunizing an animal with human CD134, preparing a hybridoma that secretes anti-CD134 antibody, and anti-CD134 antibody. Screening for hybridomas producing. The invention further provides binding molecules according to or made in accordance with the invention for use in the prevention or treatment of cancer in a subject in need thereof. In some embodiments, the cancer is lung cancer, prostate cancer, breast cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, colorectal cancer, bladder cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer, liver cancer, blood Cancer, melanoma, or any other disease or disorder characterized by uncontrolled cell growth.

さらに、ヒト対象における免疫応答を強化する方法であって、本発明による、または本発明に従って作製された結合性分子の治療的有効量、および任意で薬学的に許容される担体を、ヒト対象に投与する段階を含む方法も提供される。強化される免疫応答には、エフェクターT細胞の、任意でそれらの細胞の増殖の結果としての、免疫賦活／エフェクター機能の増大、および／または調節性T細胞の、任意でそれらの細胞の数の増大を伴わない、免疫抑制機能のダウンレギュレーションが含まれうる。   Further, a method for enhancing an immune response in a human subject comprising the therapeutically effective amount of a binding molecule according to or made in accordance with the present invention, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier, to the human subject. Also provided is a method comprising the step of administering. An enhanced immune response may include an increase in immunostimulatory / effector function, and / or the number of regulatory T cells, optionally as a result of proliferation of the effector T cells, and optionally the number of those cells. It may include down-regulation of immunosuppressive function without an increase.

また、癌の治療を、それを必要とするヒト対象において行う方法であって、本発明による、または本発明に従って作製された結合性分子の治療的有効量をヒト対象に投与する段階を含む方法も提供される。いくつかの態様において、癌は、肺癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、血液のがん、黒色腫、または制御不能な細胞増殖によって特徴づけられる他の任意の疾患もしくは障害である。   A method of treating cancer in a human subject in need thereof, comprising the step of administering to the human subject a therapeutically effective amount of a binding molecule according to or made in accordance with the present invention. Is also provided. In some embodiments, the cancer is lung cancer, prostate cancer, breast cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, colorectal cancer, bladder cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer, liver cancer, blood Cancer, melanoma, or any other disease or disorder characterized by uncontrolled cell growth.

また、対象における腫瘍のサイズを縮小させるか、もしくは癌細胞の増殖を阻害する、または癌に罹患した対象における転移性癌の発症を減少させるかもしくは阻害する方法であって、本発明による、または本発明に従って作製された結合性分子をヒト対象に投与する段階を含む方法も提供される。   Also, a method of reducing the size of a tumor in a subject or inhibiting the growth of cancer cells, or reducing or inhibiting the development of metastatic cancer in a subject suffering from cancer, according to the present invention, or Also provided is a method comprising administering to a human subject a binding molecule made in accordance with the present invention.

本発明はさらに、癌の治療または予防のための医薬の調製における、本発明による、または本発明に従って作製された結合性分子の使用を提供する。   The invention further provides the use of a binding molecule according to or made in accordance with the invention in the preparation of a medicament for the treatment or prevention of cancer.

また、本発明による、または本発明に従って作製された結合部分を、1種または複数種の薬学的に許容される希釈剤または添加剤とともに含む、薬学的組成物も提供される。組成物は好ましくは、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、膀胱内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、経気管的、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内または皮下投与による、ヒト体内への非経口的投与に適している。   Also provided are pharmaceutical compositions comprising a binding moiety according to or made in accordance with the present invention together with one or more pharmaceutically acceptable diluents or additives. The composition is preferably, for example, intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intratumoral, intravesical, intraarterial, intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, transtracheal, intraarticular, subcapsular Suitable for parenteral administration into the human body by intrathecal, intrathecal, intraspinal, epidural, intrasternal or subcutaneous administration.

発明のさらなる態様
以下に示されるのは、本明細書中の他所での開示による、本発明のいくつかの特定のさらなる番号付きの態様である。本明細書において開示される発明に関係すると上記に示された本発明の態様による特徴は、これらのさらなる番号付きの態様のあらゆるそれぞれのものにも関する。
1．ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：100の軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：100のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体。
2．VHがSEQ ID NO：152のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：152のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、態様1記載の抗体。
3．VHがSEQ ID NO：99のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：99のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、態様1または2記載の抗体。
4．HCDR3がSEQ ID NO：16、144または145のアミノ酸配列を含む、態様1〜3のいずれか1つに記載の抗体。
5．HCDR2がSEQ ID NO：15、141、142または143のアミノ酸配列を含む、態様4記載の抗体。
6．HCDR1がSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含む、態様5記載の抗体。
7．a．VLがSEQ ID NO：67もしくは68のアミノ酸配列を含み；かつ
b．VHが、SEQ ID NO：69、70、71、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、146、147もしくは148のアミノ酸配列を含み、任意で直鎖状アミノ酸残基位置11、55もしくは99に置換を有する；または
c．VLおよびVHが、
i．それぞれSEQ ID NO：67および69；
ii．それぞれSEQ ID NO：67および70；
iii．それぞれSEQ ID NO：67および71；
iv．それぞれSEQ ID NO：68および69；
v．それぞれSEQ ID NO：68および70；もしくは
vi．それぞれSEQ ID NO：68および71
のアミノ酸配列を含む、態様1〜6のいずれか1つに記載の抗体。
8．直鎖状アミノ酸残基位置にある置換がV11L、N55Q、N55A、N55E、M99LまたはM99Iである、態様1〜7のいずれか1つに記載の抗体。
9．結合性分子が、
SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する、態様1〜8のいずれか1つに記載の抗体。
10．ヒト化またはDeImmunized（商標）されている、態様1〜9のいずれか1つに記載の抗体。
11．CD134のアゴニストである、態様1〜10のいずれか1つに記載の抗体。
12．IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、態様1〜11のいずれか1つに記載の抗体。
13．Fc領域に置換を含む、態様1〜12のいずれか1つに記載の抗体。
14．置換が、Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする、態様13記載の抗体。
15．置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、態様14記載の抗体。
16．態様1〜3または7のいずれか1つに記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。
17．態様16記載の核酸分子を含むベクター。
18．態様17記載のベクターを含む宿主細胞。
19．免疫応答の強化を必要とする対象の治療に用いるための、態様1〜15、23〜37、41〜45または49のいずれか1つに記載の抗体。
20．癌の治療に用いるための、態様1〜15、23〜37、41〜45または49のいずれか1つに記載の抗体。
21．癌が前立腺癌、結腸癌、肺癌、血液悪性腫瘍、黒色腫または膀胱癌である、癌の治療に用いるための態様20記載の抗体。
22．態様1〜15、23〜37または41〜45のいずれか1つに記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
23．ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：98の軽鎖可変領域（VL）ならびに鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：98のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体。
24．VHがSEQ ID NO：134のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：134のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、態様23記載の抗体。
25．VHがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：97のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、態様23または24記載の抗体。
26．HCDR3がSEQ ID NO：8、139または140のアミノ酸配列を含む、態様23〜25のいずれか1つに記載の抗体。
27．HCDR2がSEQ ID NO：7、135、136、137または138のアミノ酸配列を含む、態様26記載の抗体。
28．HCDR1がSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む、態様27記載の抗体。
29．a．VLがSEQ ID NO：62もしくは63のアミノ酸配列を含み；かつ
b．VHが、SEQ ID NO：64、65、66、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、149、150もしくは151のアミノ酸配列を含み、任意で直鎖状アミノ酸残基位置11、56もしくは106に置換を有する；または
c．VLおよびVHが、
i．それぞれSEQ ID NO：62および64；
ii．それぞれSEQ ID NO：62および65；
iii．それぞれSEQ ID NO：62および66；
iv．それぞれSEQ ID NO：63および64；
v．それぞれSEQ ID NO：63および65；もしくは
vi．それぞれSEQ ID NO：63および66
のアミノ酸配列を含む、態様23〜29のいずれか1つに記載の抗体。
30．直鎖状アミノ酸残基位置にある置換が、V11L、D56G、D56A、D56S、D56E、M106LまたはM106Iである、態様23〜29のいずれか1つに記載の抗体。
31．SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する、態様23〜30のいずれか1つに記載の抗体。
32．ヒト化またはDeImmunized（商標）されている、態様23〜31のいずれか1つに記載の抗体。
33．CD134のアゴニストである、態様23〜32のいずれか1つに記載の抗体。
34．IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、態様23〜33のいずれか1つに記載の抗体。
35．Fc領域に置換を含む、態様23〜34のいずれか1つに記載の抗体。
36．置換が、Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする、態様35記載の抗体。
37．置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、態様36記載の抗体。
38．態様23〜37のいずれか1つに記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。
39．態様38記載の核酸分子を含むベクター。
40．態様39記載のベクターを含む宿主細胞。
41．ヒトCD134と結合する単離されたアゴニスト抗体であって、軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）、ならびに軽鎖相補性決定領域（LCDR）LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、
a．HCDR1がSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含み；
b．HCDR2がSEQ ID NO：15、141、142または143のアミノ酸配列を含み；
c．HCDR3がSEQ ID NO：16、144または145のアミノ酸配列を含み；
d．LCDR1がSEQ ID NO：17のアミノ酸配列を含み；
e．LCDR2がSEQ ID NO：18のアミノ酸配列を含み；かつ
f．LCDR3がSEQ ID NO：19のアミノ酸配列を含み；
ただし、SEQ ID NO：14、15および16のHCDR1、HCDR2およびHCDR3アミノ酸配列を含むVH、ならびにSEQ ID NO：17、18および19のLCDR1、LCDR2およびLCDR3アミノ酸配列を含むVLを含まないことを条件とする、抗体。
42．a．それぞれSEQ ID NO：14、15、144；
b．それぞれSEQ ID NO：14、141、16；
c．それぞれSEQ ID NO：14、142、16；
d．それぞれSEQ ID NO：14、141、144；または
e．それぞれSEQ ID NO：14、142、144
である、HCDR1、HCDR2およびHCDR3配列を含む、態様41記載の単離された抗体。
43．ヒト化、DeImmunized（商標）されているか、またはヒト型である、態様41または42記載の単離された抗体。
44．IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、態様41〜43のいずれか1つに記載の単離された抗体。
45．Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする置換をFc領域に含み、置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、態様41〜44のいずれか1つに記載の単離された抗体。
46．態様41記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。
47．態様46記載の核酸分子を含むベクター。
48．態様47記載のベクターを含む宿主細胞。
49．ヒトCD134と結合する単離されたアゴニスト抗体であって、軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）、ならびに軽鎖相補性決定領域（LCDR）LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、
a．HCDR1がSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含み；
b．HCDR2がSEQ ID NO：7、135、136、137または138のアミノ酸配列を含み；
c．HCDR3がSEQ ID NO：8、139または140のアミノ酸配列を含み；
d．LCDR1がSEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含み；
e．LCDR2がSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含み；かつ
f．LCDR3がSEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含み；
g．ただし、SEQ ID NO：6、7および8のHCDR1、HCDR2およびHCDR3アミノ酸配列を含むVH、ならびにSEQ ID NO：9、10および11のLCDR1、LCDR2およびLCDR3アミノ酸配列を含むVLを含まないことを条件とする、抗体。 Further Aspects of the Invention Shown below are some specific additional numbered aspects of the invention, according to disclosure elsewhere herein. The features according to aspects of the invention set forth above in relation to the invention disclosed herein relate to each and every one of these further numbered aspects.
1． An isolated antibody that binds human CD134, comprising a heavy chain variable region (VH) comprising a light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 100 and a heavy chain complementarity determining region (HCDR) HCDR1, HCDR2, and HCDR3 And optionally having one, two or three amino acid substitutions in the VL of SEQ ID NO: 100.
2． The antibody of embodiment 1, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 152, and optionally has one, two or three amino acid substitutions in the VH of SEQ ID NO: 152.
3． The antibody of embodiment 1 or 2, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99, and optionally has one, two or three amino acid substitutions in the VH of SEQ ID NO: 99.
Four. The antibody of any one of embodiments 1-3, wherein the HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 144, or 145.
Five. The antibody of embodiment 4, wherein HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 141, 142, or 143.
6． The antibody of embodiment 5, wherein HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
7． a. VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 or 68; and
b. VH is an amino acid of SEQ ID NO: 69, 70, 71, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 146, 147 or 148 Comprising a sequence and optionally having a substitution at linear amino acid residue position 11, 55 or 99; or
c. VL and VH are
i. SEQ ID NO: 67 and 69, respectively;
ii. SEQ ID NO: 67 and 70, respectively;
iii. SEQ ID NO: 67 and 71, respectively;
iv. SEQ ID NO: 68 and 69, respectively;
v. SEQ ID NO: 68 and 70, respectively; or
vi. SEQ ID NO: 68 and 71, respectively
The antibody according to any one of embodiments 1 to 6, comprising the amino acid sequence of
8． The antibody according to any one of aspects 1 to 7, wherein the substitution at the linear amino acid residue position is V11L, N55Q, N55A, N55E, M99L or M99I.
9． The binding molecule is
Aspect 1 to Bind to an epitope of the extracellular domain of human CD134 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 92 9. The antibody according to any one of 8.
Ten. The antibody of any one of embodiments 1-9, which is humanized or DeImmunized ™.
11． The antibody according to any one of embodiments 1 to 10, which is an agonist of CD134.
12． The antibody according to any one of embodiments 1 to 11, which is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype.
13. The antibody of any one of embodiments 1-12, comprising a substitution in the Fc region.
14. The antibody of embodiment 13, wherein the substitution modulates the binding of the antibody to the Fcγ receptor (FcγR) or the neonatal Fc receptor (FcRn).
15． Substitution includes S267E / L328F substitution, E233D / G237D / H268D / P271G / A330R substitution, V234A / G237A / P238S / H268A / V309L / A330S / P331S substitution, or M252Y / S254T / T256E substitution, and numbering of residues The antibody according to embodiment 14, according to the EU index.
16． An isolated nucleic acid molecule encoding a VH or VL according to any one of embodiments 1-3 or 7.
17． A vector comprising the nucleic acid molecule of embodiment 16.
18． A host cell comprising the vector of embodiment 17.
19. 50. The antibody according to any one of embodiments 1-15, 23-37, 41-45 or 49 for use in the treatment of a subject in need of enhanced immune response.
20． 50. The antibody according to any one of embodiments 1-15, 23-37, 41-45 or 49 for use in the treatment of cancer.
twenty one. The antibody according to embodiment 20, for use in the treatment of cancer, wherein the cancer is prostate cancer, colon cancer, lung cancer, hematological malignancy, melanoma or bladder cancer.
twenty two. A pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of embodiments 1 to 15, 23 to 37, or 41 to 45, and a pharmaceutically acceptable carrier.
twenty three. An isolated antibody that binds human CD134, comprising the light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 98 and the heavy chain variable region (VH) comprising the chain complementarity determining regions (HCDR) HCDR1, HCDR2, and HCDR3 And optionally having one, two or three amino acid substitutions in the VL of SEQ ID NO: 98.
twenty four. Embodiment 24. The antibody of embodiment 23, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134 and optionally has one, two or three amino acid substitutions in the VH of SEQ ID NO: 134.
twenty five. Embodiment 25. The antibody of embodiment 23 or 24, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97, and optionally has one, two or three amino acid substitutions in the VH of SEQ ID NO: 97.
26. The antibody of any one of embodiments 23-25, wherein HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 139, or 140.
27. The antibody of embodiment 26, wherein HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 135, 136, 137, or 138.
28. The antibody of embodiment 27, wherein HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
29. a. VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 or 63; and
b. VH is SEQ ID NO: 64, 65, 66, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 149 , 150 or 151 amino acid sequences, optionally with substitutions at linear amino acid residue positions 11, 56 or 106; or
c. VL and VH are
i. SEQ ID NOs: 62 and 64, respectively;
ii. SEQ ID NOs: 62 and 65, respectively;
iii. SEQ ID NO: 62 and 66, respectively;
iv. SEQ ID NO: 63 and 64, respectively
v. SEQ ID NO: 63 and 65, respectively; or
vi. SEQ ID NO: 63 and 66, respectively
30. The antibody according to any one of embodiments 23-29, comprising the amino acid sequence of
30. 30. The antibody of any one of aspects 23 to 29, wherein the substitution at the linear amino acid residue position is V11L, D56G, D56A, D56S, D56E, M106L or M106I.
31. Binds to an epitope of the extracellular domain of human CD134 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 92, Embodiments 23- 30. The antibody according to any one of 30.
32. 32. The antibody of any one of embodiments 23-31, which is humanized or DeImmunized ™.
33. The antibody according to any one of embodiments 23 to 32, which is an agonist of CD134.
34. The antibody according to any one of aspects 23 to 33, which is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype.
35. 35. The antibody according to any one of aspects 23 to 34, comprising a substitution in the Fc region.
36. 36. The antibody of embodiment 35, wherein the substitution modulates the binding of the antibody to an Fcγ receptor (FcγR) or a neonatal Fc receptor (FcRn).
37. Substitution includes S267E / L328F substitution, E233D / G237D / H268D / P271G / A330R substitution, V234A / G237A / P238S / H268A / V309L / A330S / P331S substitution, or M252Y / S254T / T256E substitution, and numbering of residues The antibody according to embodiment 36, according to the EU index.
38. 38. An isolated nucleic acid molecule encoding a VH or VL according to any one of embodiments 23-37.
39. A vector comprising the nucleic acid molecule of embodiment 38.
40. A host cell comprising the vector of embodiment 39.
41. An isolated agonist antibody that binds human CD134, comprising a light chain variable region (VL) and a heavy chain variable region (VH) comprising heavy chain complementarity determining regions (HCDR) HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain Complementarity determining region (LCDR) including LCDR1, LCDR2 and LCDR3,
a. HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
b. HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 141, 142 or 143;
c. HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 144 or 145;
d. LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17;
e. LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; and
f. LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;
Provided that the VH containing the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 amino acid sequences of SEQ ID NO: 14, 15 and 16 and the VL containing the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 amino acid sequences of SEQ ID NOs: 17, 18 and 19 are excluded. An antibody.
42. a. SEQ ID NO: 14, 15, 144 respectively
b. SEQ ID NO: 14, 141, 16 respectively;
c. SEQ ID NO: 14, 142, 16 respectively;
d. SEQ ID NO: 14, 141, 144 respectively; or
e. SEQ ID NO: 14, 142, 144 respectively
42. The isolated antibody of embodiment 41, comprising the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 sequences.
43. 43. An isolated antibody according to embodiment 41 or 42, which is humanized, DeImmunized ™ or human.
44. 44. The isolated antibody according to any one of aspects 41-43, which is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype.
45. The Fc region contains a substitution that modulates antibody binding to Fcγ receptor (FcγR) or neonatal Fc receptor (FcRn), wherein the substitution is a S267E / L328F substitution, an E233D / G237D / H268D / P271G / A330R substitution, V234A / 45. The isolated antibody according to any one of aspects 41-44, comprising a G237A / P238S / H268A / V309L / A330S / P331S substitution, or an M252Y / S254T / T256E substitution, wherein the residue numbering is by EU index .
46. 45. An isolated nucleic acid molecule encoding the VH or VL of embodiment 41.
47. A vector comprising the nucleic acid molecule according to embodiment 46.
48. A host cell comprising the vector of embodiment 47.
49. An isolated agonist antibody that binds human CD134, comprising a light chain variable region (VL) and a heavy chain variable region (VH) comprising heavy chain complementarity determining regions (HCDR) HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain Complementarity determining region (LCDR) including LCDR1, LCDR2 and LCDR3,
a. HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
b. HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 135, 136, 137 or 138;
c. HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 139 or 140;
d. LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
e. LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and
f. LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
g. Provided that VH containing HCDR1, HCDR2 and HCDR3 amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, 7 and 8 and VL containing LCDR1, LCDR2 and LCDR3 amino acid sequences of SEQ ID NOs: 9, 10 and 11 are excluded. An antibody.

本発明はさらに、諸態様を提供する。
Z1．（a）図27のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図27のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子。
Z2．（a）図26のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む重鎖可変領域；および／または
（b）図26のアミノ酸配列または1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有するその配列の変異体を含む軽鎖可変領域
を含む結合性分子。
Z3．ヒトCD134と結合する、態様Z1または態様Z2記載の結合性分子。
Z4．ヒトCD134（OX40）受容体のOX40リガンド（OX40L）との結合を妨げない、態様Z1〜Z3のいずれか1つに記載の結合性分子。
Z5．前記CD134分子に対する結合が飽和する濃度またはそれを上回る濃度で、ヒトCD134発現性T細胞上での、OX40LのCD134との結合作用を50％を超えては低下させない、態様Z1〜Z4のいずれか1つに記載の結合性分子。
Z6．結合性分子の濃度が70nMで、ヒトCD134発現性T細胞上でのCD134に対するOX40Lの結合作用を70％を超えては低下させない、態様Z1〜Z5のいずれか1つに記載の結合性分子。
Z7．SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38および／またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する、態様Z1〜Z6のいずれか1つに記載の結合性分子。
Z8．Fab断片、単鎖Fv（scFv）断片または抗体である、態様Z1〜Z7のいずれか1つに記載の結合性分子。
Z9．ヒト化またはDeImmunized（商標）されたIgG、IgA、IgD、IgEまたはIgM抗体、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4抗体などである、態様Z8記載の抗体。
Z10．態様Z1〜Z9のいずれか1つに記載の結合性分子または抗体をコードする核酸分子。
Z11．態様Z10記載の核酸を含む、遺伝子送達媒体またはベクター。
Z12．態様Z10またはZ11記載の核酸またはベクターを含む、単離された細胞もしくは組換え細胞、またはインビトロ細胞培養細胞。
Z13．態様Z1〜Z8のいずれか1つに記載の結合性分子、または態様Z9記載の抗体が作製されることを特徴とする、結合性分子を作製するための方法。
Z14．免疫応答の強化を必要とする個体の治療に用いるための、態様Z1〜Z9のいずれか1つに記載の結合性分子または抗体。
Z15．それを必要とする個体において癌の予防または治療に用いるための、態様Z1〜Z9のいずれか1つに記載の結合性分子または抗体。
Z16．態様Z1〜Z9のいずれか1つに記載の結合性分子または抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。 The present invention further provides aspects.
Z1. (A) the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of FIG. 27 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (b) the amino acid sequence of FIG. 27 or one, two Or a binding molecule comprising a light chain variable region comprising a variant of that sequence having three amino acid substitutions.
Z2. (A) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of FIG. 26 or a variant of that sequence having one, two or three amino acid substitutions; and / or (b) the amino acid sequence of FIG. 26 or one, two Or a binding molecule comprising a light chain variable region comprising a variant of that sequence having three amino acid substitutions.
Z3. A binding molecule according to embodiment Z1 or embodiment Z2, which binds human CD134.
Z4. The binding molecule according to any one of embodiments Z1-Z3, which does not interfere with the binding of the human CD134 (OX40) receptor to an OX40 ligand (OX40L).
Z5. Any of aspects Z1-Z4, wherein the binding of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells is not reduced by more than 50% at a concentration at which the binding to said CD134 molecule is saturated or above. The binding molecule according to one.
Z6. The binding molecule according to any one of embodiments Z1-Z5, wherein the concentration of the binding molecule is 70 nM and does not reduce the binding effect of OX40L to CD134 on human CD134-expressing T cells by more than 70%.
Z7. An embodiment that binds to an epitope of the extracellular domain of human CD134 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 and / or SEQ ID NO: 92 The binding molecule according to any one of Z1 to Z6.
Z8. The binding molecule according to any one of embodiments Z1 to Z7, which is a Fab fragment, a single chain Fv (scFv) fragment or an antibody.
Z9. The antibody of embodiment Z8, which is a humanized or DeImmunized ™ IgG, IgA, IgD, IgE or IgM antibody, such as an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody.
Z10. A nucleic acid molecule encoding a binding molecule or antibody according to any one of embodiments Z1-Z9.
Z11. A gene delivery vehicle or vector comprising a nucleic acid according to embodiment Z10.
Z12. An isolated or recombinant cell or in vitro cell culture cell comprising a nucleic acid or vector according to embodiment Z10 or Z11.
Z13. A method for producing a binding molecule, characterized in that a binding molecule according to any one of embodiments Z1-Z8 or an antibody according to embodiment Z9 is produced.
Z14. The binding molecule or antibody according to any one of embodiments Z1-Z9 for use in the treatment of an individual in need of enhanced immune response.
Z15. The binding molecule or antibody according to any one of embodiments Z1-Z9 for use in the prevention or treatment of cancer in an individual in need thereof.
Z16. A pharmaceutical composition comprising a binding molecule or antibody according to any one of embodiments Z1-Z9 and a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、それらはその範囲に限定を課すものとは全く見なされるべきでない。その反対に、本明細書中の説明を読んだ後に、本発明の趣旨および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく当業者に想起されるであろう、本発明のさまざまな他の態様、改変物および同等物も使用しうることが明確に理解されるべきである。   The invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting the scope thereof in any way. On the contrary, after reading the description herein, various other aspects of the invention will occur to those skilled in the art without departing from the spirit of the invention and / or the appended claims. It should be clearly understood that embodiments, modifications and equivalents may also be used.

実施例1．マウス抗ヒトCD134（＝OX40）モノクローナル抗体の作製
（a）．表面CD134を発現するSf9昆虫細胞の作製
ヒトCD134タンパク質をコードするcDNA（GenBank ref CAB96543.1；SEQ ID NO.1参照）を、Sf9昆虫細胞（ヨトウガ（Spodotera frugiperda））での発現用に最適化した上で、GENEART（Regensburg, Germany）によって合成した（SEQ ID NO.2参照；カタログ番号0904551(BC internal code V076)）。このcDNAを、バキュロウイルス移入プラスミドpVL1393（BDトランスフェクションキット、カタログ番号560129；BD Biosciences）中にサブクローニングした。その後に、Sf9昆虫細胞（ATCC）に対して、ヒトCD134をコードするcDNAを含む移入プラスミドpVL1393をBaculoGold Baculovirus DNA（BDトランスフェクションキット）とともに同時形質移入し、続いて27℃で4〜5日間インキュベートした。この同時形質移入段階の後に、上清を収集し、4℃で貯蔵した上で、ウイルス増幅のためにさらに多くのSf9昆虫細胞を感染させるために用いた。これを目的として、Sf9昆虫細胞に対して増幅した組換えバキュロウイルスを形質移入し、続いて27℃で3〜5日間インキュベートした。これらのSf9昆虫細胞を採取し、滅菌PBSで洗浄して、PBS中、細胞約2×10⁶個／250μlのアリコートとし、-80℃で貯蔵して、細胞溶解物を調製した。貯蔵の前に、形質移入されたSf9昆虫細胞上でのヒトCD134表面発現を、1：10フィコエリトリン（PE）結合マウス抗ヒトCD134（クローンACT35；BD Biosciences）およびフローサイトメトリーを用いて確認した。 Example 1. Production of mouse anti-human CD134 (= OX40) monoclonal antibody (a). Generation of Sf9 insect cells expressing surface CD134 Optimized cDNA for human CD134 protein (GenBank ref CAB96543.1; see SEQ ID NO.1) for expression in Sf9 insect cells (Spodotera frugiperda) After that, it was synthesized by GENEART (Regensburg, Germany) (see SEQ ID NO. 2; catalog number 009551 (BC internal code V076)). This cDNA was subcloned into the baculovirus transfer plasmid pVL1393 (BD transfection kit, catalog number 560129; BD Biosciences). Subsequently, Sf9 insect cells (ATCC) were co-transfected with BaculoGold Baculovirus DNA (BD transfection kit) containing the transfer plasmid pVL1393 containing cDNA encoding human CD134, followed by incubation at 27 ° C. for 4-5 days did. After this co-transfection step, the supernatant was collected and stored at 4 ° C. and used to infect more Sf9 insect cells for virus amplification. For this purpose, the amplified recombinant baculovirus was transfected into Sf9 insect cells and subsequently incubated at 27 ° C. for 3-5 days. These Sf9 insect cells were harvested, washed with sterile PBS, made into aliquots of approximately 2 × 10 ⁶ cells / 250 μl in PBS, and stored at −80 ° C. to prepare cell lysates. Prior to storage, human CD134 surface expression on transfected Sf9 insect cells was confirmed using 1:10 phycoerythrin (PE) -conjugated mouse anti-human CD134 (clone ACT35; BD Biosciences) and flow cytometry.

（b）．免疫処置およびマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体の作製
BALB／cマウス（雌性、6週齡；Charles River Laboratories）に対して、第0日に、ヒトCD134を形質移入したSf9昆虫細胞溶解物の約400μL（250μlの細胞溶解物アリコート＋250μlの完全フロイントアジュバント；Sigma）を皮下注射した。ヒトCD134を形質移入したSf9昆虫細胞溶解物および不完全フロイントアジュバント（Sigma）を用いる同様の皮下注射を第21日および第42日に行った。ヒトCD134を形質移入したSf9昆虫細胞溶解物（250μl／匹）をアジュバントなしに、第61日および第62日に腹腔内への追加免疫注射を行った。第65日に、Kohler and Milstein (Nature 1975; 256: p495-497）によって最初に記載された標準的なハイブリドーマ技術を用いて、免疫処置マウスからの脾細胞をSP2／0骨髄腫細胞（DSMZ）と融合させた。手短に述べると、免疫処置マウスを屠殺した。脾臓を切り裂いて脾細胞を取り出し、GlutaMax培地を含むOpti-MEM I（SF培地；Invitrogen）中で洗浄した。対数増殖期にあるSP2／0-Ag14骨髄腫細胞をSF培地中で洗浄し、脾細胞に添加して、脾細胞と骨髄腫細胞との比を5：1とした。続いて細胞をペレット化し、上清を除去した。続いて、ポリエチレングリコール4000（Merck）の37％（v／v）溶液の1mlを60秒の期間をかけて滴加し、その後に細胞を37℃でさらに60秒間インキュベートした。続いて、8mlのSF培地、その後にGlutaMax／10％（v／v）ウシ胎仔血清（FCS；Bodinco）を含む5mlのopti-MEM Iを、穏やかに撹拌しながらゆっくりと添加した。室温で30分おいた後、細胞をペレット化し、GlutaMax／10％ FCSを含むopti-MEM I中で洗浄して残留ポリエチレングリコールを除去し、最後に、1ウェル当たり細胞10⁵個／200μlの濃度で、GlutaMax／10％ FCS／50×Hybri-Max（商標）アミノプテリン（デノボDNA合成阻害薬；Sigma）を含むopti-MEM I中にてプレーティングした。第7日以後は、アミノプテリン選択培地を2〜3日毎に補充し、第14日にGlutaMax／10％ FCSを含むopti-MEM Iと入れ替えた。ヒトCD134に対する抗体（マウスIgGクラス）を産生するハイブリドーマ（組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質（R&D Systems；以下の実施例11（a）参照）およびヒトCD134発現性PHA（Roche）で刺激したCD4 T細胞芽球（以下の実施例2（a）参照）をそれぞれ標的として用いる従来のELISAおよびフローサイトメトリー手法によってスクリーニングした）を増殖させ、凍結保存して、限界希釈によってサブクローニングを行った。プロテインGカラム（GE Healthcare）を用いて抗ヒトCD134特異的モノクローナル抗体を精製し、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびクローン20E5を得た。 (B). Immunization and production of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody
Approximately 400 μL of Sf9 insect cell lysate transfected with human CD134 (250 μl cell lysate aliquot + 250 μl complete Freund's adjuvant for BALB / c mice (female, 6 weeks old; Charles River Laboratories) Sigma) was injected subcutaneously. Similar subcutaneous injections using Sf9 insect cell lysates transfected with human CD134 and incomplete Freund's adjuvant (Sigma) were performed on days 21 and 42. Sf9 insect cell lysates (250 μl / mouse) transfected with human CD134 were boosted intraperitoneally on days 61 and 62 without adjuvant. On day 65, splenocytes from immunized mice were treated with SP2 / 0 myeloma cells (DSMZ) using standard hybridoma technology first described by Kohler and Milstein (Nature 1975; 256: p495-497). And fused. Briefly, immunized mice were sacrificed. The spleen was dissected and splenocytes were removed and washed in Opti-MEM I (SF medium; Invitrogen) containing GlutaMax medium. SP2 / 0-Ag14 myeloma cells in logarithmic growth phase were washed in SF medium and added to splenocytes to give a 5: 1 ratio of splenocytes to myeloma cells. Cells were subsequently pelleted and the supernatant removed. Subsequently, 1 ml of a 37% (v / v) solution of polyethylene glycol 4000 (Merck) was added dropwise over a period of 60 seconds, after which the cells were incubated at 37 ° C. for an additional 60 seconds. Subsequently, 8 ml SF medium followed by 5 ml opti-MEM I containing GlutaMax / 10% (v / v) fetal calf serum (FCS; Bodinco) was added slowly with gentle agitation. After 30 minutes at room temperature, the cells are pelleted and washed in opti-MEM I containing GlutaMax / 10% FCS to remove residual polyethylene glycol and finally a concentration of 10 ⁵ cells / 200 μl per well Were plated in opti-MEM I containing GlutaMax / 10% FCS / 50 × Hybri-Max ™ aminopterin (a de novo DNA synthesis inhibitor; Sigma). From day 7 onwards, aminopterin selective medium was replenished every 2-3 days, and on day 14 it was replaced with opti-MEM I containing GlutaMax / 10% FCS. CD4 stimulated with a hybridoma (recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein (R & D Systems; see Example 11 (a) below)) and human CD134-expressing PHA (Roche) that produces antibodies against human CD134 (mouse IgG class) T cell blasts (screened by conventional ELISA and flow cytometry techniques, each using T cell blasts as targets below) were grown, cryopreserved and subcloned by limiting dilution. The anti-human CD134-specific monoclonal antibody was purified using a protein G column (GE Healthcare) to obtain mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and clone 20E5.

実施例2．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5のフローサイトメトリーによる特性決定
（a）．PHAで刺激されたヒトTリンパ球上でのCD134発現
健常ドナー（インフォームドコンセントを得た）由来のヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、Lymphoprep（1.077g／mL；Nycomed）での密度勾配遠心法によって単離した。その後、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI-1640培地（Gibco）中の1〜2×10⁶個のPBMC／mLを、0、0.1、1.0または10.0μg／mLのフィトヘマグルチニン-M（PHA-M；Roche）で刺激し、37℃、5％ CO₂にて1〜3日おいた。培養後にPBMCを採取し、10％ヒトプール血清（HPS；Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた0.1％ウシ血清アルブミン（Sigma）／0.05％ NaN₃を含む氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS／BSA／NaN₃）中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、10μg／mLの市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35（マウスIgG1アイソタイプ；BD Biosciences, Alphen aan de Rijn, Netherlands）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、続いて細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、Tリンパ球の検出用の1：20希釈したフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合マウス抗ヒトCD3抗体（BD Biosciences）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN₃中に4℃で30分間おいて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 Example 2 Characterization of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 by flow cytometry (a). CD134 expression on PHA-stimulated human T lymphocytes Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors (informed consent was obtained), density gradient in Lymphoprep (1.077 g / mL; Nycomed) Isolated by centrifugation. Then 1-2 × 10 ⁶ PBMC / mL in RPMI-1640 medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum (Bodinco) and 50 μg / mL gentamicin (Gibco), 0, 0.1, 1.0 or 10.0 μg / ML phytohemagglutinin-M (PHA-M; Roche) and kept at 37 ° C., 5% CO _{2 for} 1 to 3 days. After incubation, PBMCs were collected and ice-cold phosphate buffered saline (PBS / PBS) containing 0.1% bovine serum albumin (Sigma) /0.05% NaN ₃ supplemented with 10% human pooled serum (HPS; blocked Fcγ receptor; BioWhittaker). BSA / NaN ₃ ) was added at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL. The cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C. with 10 μg / mL of the commercially available mouse anti-human CD134 antibody clone ACT35 (mouse IgG1 isotype; BD Biosciences, Alphen aan de Rijn, Netherlands). Following extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were then incubated with PE-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 200 for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were incubated with 1:20 diluted fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated mouse anti-human CD3 antibody (BD Biosciences) for detection of T lymphocytes for 30 minutes at 4 ° C. Incubated. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formamide for 30 minutes at 4 ° C. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図1に示されているように（n＝各ドナーから1件）、末梢血由来の非刺激／休止ヒトTリンパ球はCD134を全く発現しなかったが、PHAは表面CD134を発現するようにヒトCD3^陽性 Tリンパ球を用量依存的に刺激した。10μg／mL PHAに曝露させた場合に、活性化されたヒトCD3^陽性 Tリンパ球上のCD134発現レベルは「第1日」と「第2日」との間にプラトーに達したと考えられたが、ヒトCD134^陽性／CD3^陽性Tリンパ球のパーセンテージは実験の間に時間依存的に増加した。 As shown in FIG. 1 (n = one from each donor), unstimulated / resting human T lymphocytes from peripheral blood did not express CD134 at all, while PHA expresses surface CD134 Human CD3- ^positive T lymphocytes were stimulated in a dose-dependent manner. When exposed to 10 μg / mL PHA, CD134 expression levels on activated human CD3- ^positive T lymphocytes seemed to reach a plateau between “Day 1” and “Day 2” However, the percentage of human CD134 ^positive / CD3 ^positive T lymphocytes increased in a time-dependent manner during the experiment.

（b）．PHAで刺激されたヒトCD4 Tリンパ球部分集団でのCD134発現
PHAで刺激された（0および10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ HPS（Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（BD Biosciences）または1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD8抗体（BD Biosciences）とともに、1：10希釈した市販のPE結合マウス抗ヒトCD134クローンACT35（BD Biosciences）と組み合わせて、4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN₃中に4℃で30分間おいて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 (B). CD134 expression in a subpopulation of human CD4 T lymphocytes stimulated with PHA
Human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (0 and 10 μg / mL for 1 day; see above) were generated. Cells were harvested and placed at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ supplemented with 10% HPS (Fcγ receptor blocked; BioWhittaker). Cells were commercially available PE-conjugated mouse anti-human diluted 1:10 with 1:10 diluted FITC-conjugated mouse anti-human CD4 antibody (BD Biosciences) or 1:10 diluted FITC-conjugated mouse anti-human CD8 antibody (BD Biosciences). Combined with CD134 clone ACT35 (BD Biosciences) and incubated at 4 ° C. for 30 minutes. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formamide for 30 minutes at 4 ° C. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図2に示されているように、CD134発現は、PHAで刺激されたヒトCD4^陽性 Tリンパ球で観察され、休止ヒトCD4^陽性 Tリンパ球では観察されなかった。PHAで活性化されたヒトCD8^陽性 Tリンパ球では低度のCD134発現が見いだされたが、休止ヒトCD8^陽性 Tリンパ球では見いだされなかった（データは提示せず）。 As shown in FIG. 2, CD134 expression was observed in PHA stimulated human CD4 ^positive T lymphocytes and not in resting human CD4 ^positive T lymphocytes. Low CD134 expression was found in PHA activated human CD8 ⁺ T lymphocytes, but not in resting human CD8 ⁺ T lymphocytes (data not shown).

（c）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の結合
PHAで刺激された（10μg／mLで2日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ HPS（Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、0、0.007、0.02、0.07、0.2、0.6、1.9、5.6、16.7、50.0μg／mLの市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35（マウスIgG1アイソタイプ；BD Biosciences）およびマウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3またはクローン20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、Tリンパ球を検出するための1：20希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD3抗体（BD Biosciences）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN₃中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 (C). Binding of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 on human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA
Human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (2 days at 10 μg / mL; see above) were generated. Cells were harvested and placed at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ supplemented with 10% HPS (Fcγ receptor blocked; BioWhittaker). Cells were treated with commercially available mouse anti-human CD134 antibody clone ACT35 (mouse IgG1 isotype; BD Biosciences) and mouse anti-human CD134 antibody clone at 0, 0.007, 0.02, 0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6, 16.7, 50.0 μg / mL. Incubated with 12H3 or clone 20E5 for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing in PBS / BSA / NaN _3, the cells, 1: and incubated for 30 min at 4 ° C. with 200 diluted PE-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Jackson ImmunoResearch). After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C. with a 1:20 diluted FITC-conjugated mouse anti-human CD3 antibody (BD Biosciences) to detect T lymphocytes. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formamide for 30 minutes at 4 ° C. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図3に示されているように（平均±SD；2件のドナーで観察された結果）、マウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35、クローン12H3およびクローン20H5は、PHAで刺激されたCD3^陽性 Tリンパ球上のヒトCD134表面分子をおよそ5.0〜10.0μg／mLで飽和させた。これらの2件のドナーを用いたところ、結合の最大半量は、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3では約0.5μg／mLであり、マウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35およびクローン20E5では約2.5μg／mLであった。 As shown in FIG. 3 (mean ± SD; results observed with two donors), mouse anti-human CD134 antibody clone ACT35, clone 12H3 and clone 20H5 are CD3- ^positive T lymphocytes stimulated with PHA. The upper human CD134 surface molecule was saturated at approximately 5.0 to 10.0 μg / mL. Using these two donors, half-maximal binding was approximately 0.5 μg / mL for mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and approximately 2.5 μg / mL for mouse anti-human CD134 antibody clone ACT35 and clone 20E5. there were.

（d）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性CD4陽性およびCD8陽性Tリンパ球上での、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の結合
PHAで刺激された（20μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ HPS（Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、20.0μg／mLマウスIgG1κアイソタイプ対照（BD Biosciences）または20.0μg／mLマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3またはクローン20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、1：100希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、Tリンパ球部分集団を検出するために、細胞を、1：20希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（BD Biosciences）または1：20希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD8抗体（BD Biosciences）ともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN₃中に4℃で30分間おいて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 (D). Binding of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 on PHA-stimulated human CD134-expressing CD4 + and CD8 + T lymphocytes
Human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (20 μg / mL for 1 day; see above) were generated. Cells were harvested and placed at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ supplemented with 10% HPS (Fcγ receptor blocked; BioWhittaker). Cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C. with 20.0 μg / mL mouse IgG1κ isotype control (BD Biosciences) or 20.0 μg / mL mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 or clone 20E5. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were incubated with PE-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 100 for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were detected with a 1:20 diluted FITC-conjugated mouse anti-human CD4 antibody (BD Biosciences) or 1:20 diluted FITC to detect T lymphocyte subpopulations. Both mouse anti-human CD8 antibodies (BD Biosciences) were incubated at 4 ° C. for 30 minutes. After extensive washing with PBS / BSA NaN ₃ , the cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formamide at 4 ° C. for 30 minutes. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図4に示されているように、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびクローン20E5は、活性化されたヒトCD4^陽性 Tリンパ球部分集団では明らかな陽性染色が示され、活性化されたヒトCD8^陽性 Tリンパ球部分集団では軽度の陽性染色が示された。 As shown in FIG. 4, mouse anti-human CD134 monoclonal antibodies clone 12H3 and clone 20E5 showed clear positive staining in the activated human CD4- ^positive T lymphocyte subpopulation, and activated human CD8 Mild positive staining was shown in the ^positive T lymphocyte subpopulation.

（e）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、非標識マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5の、市販のPE結合マウス抗CD134抗体との交差競合
PHA（10μg／mLまたは20μg／mLでそれぞれ4日間または1日間；上記参照）で刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ HPS（Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を20μg／mLの非標識マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3または10μg／mLの非標識クローン20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。細胞をその後、1：20希釈したPE結合市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35（BD Biosciences）またはクローンL106（BD Biosciences；Godfrey特許も参照）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA NaN₃中にて4℃で30分間かけて固定した。市販のPE結合抗CD134抗体の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 (E). Cross-competition of unlabeled mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 with commercially available PE-conjugated mouse anti-CD134 antibody on PHA-stimulated human CD134-expressing T lymphocytes
Human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (10 μg / mL or 20 μg / mL for 4 days or 1 day, respectively; see above) were generated. Cells were harvested and placed at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ supplemented with 10% HPS (Fcγ receptor blocked; BioWhittaker). Cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C. with 20 μg / mL unlabeled mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 or 10 μg / mL unlabeled clone 20E5. Cells were then incubated for 30 minutes at 4 ° C. with PE-conjugated commercial mouse anti-human CD134 antibody clone ACT35 (BD Biosciences) or clone L106 (BD Biosciences; see also Godfrey patent) diluted 1:20. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were fixed in PBS / BSA NaN ₃ containing 2% formamide for 30 minutes at 4 ° C. The binding of a commercially available PE-conjugated anti-CD134 antibody was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図5に示されているように、非標識マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3とのプレインキュベーションにより、PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134に対する市販のPE結合マウス抗ヒトCD134抗体クローンL106の結合は部分的に遮断された。非標識マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5とのプレインキュベーションにより、PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134に対する市販のPE結合マウス抗ヒトCD134抗体クローンL106の結合はわずかに遮断された。非標識マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5とのプレインキュベーションでは、ACT35 PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134に対する市販のPE結合マウス抗ヒトCD134抗体クローンの結合作用は示されなかった。   As shown in FIG. 5, commercial PE-conjugated mouse anti-human CD134 antibody clone L106 against human CD134 on PHA-stimulated T lymphocytes by preincubation with unlabeled mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3. The binding was partially blocked. Preincubation with unlabeled mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 slightly blocked the binding of the commercially available PE-conjugated mouse anti-human CD134 antibody clone L106 to human CD134 on PHA-stimulated T lymphocytes. Preincubation with unlabeled mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 did not show the binding effect of a commercial PE-conjugated mouse anti-human CD134 antibody clone to human CD134 on T lymphocytes stimulated with ACT35 PHA .

これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3が、PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134を特異的に認識し（クローンL106の結合を部分的に遮断）、かつ（ii）市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンL106によって認識されるものとは同一ではないヒトCD134のエピトープと結合することが実証された。また、これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5が（i）PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134を特異的に認識し（クローンL106結合を軽微に遮断）、かつ（ii）市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンL106によって認識される非同一エピトープと結合することも実証された。さらに、これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5が、PHAで刺激されたTリンパ球上のヒトCD134エピトープを認識していると考えられ、それは市販のマウス抗ヒトCD134抗体クローンACT35によって認識されるエピトープとは異なることも実証された。加えて、これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5が、PHAで刺激されたTリンパ球上の類似性のないヒトCD134エピトープ（L106結合の部分的遮断と軽微な遮断の対比により立証）を認識していると考えられることも実証された。   These results indicate that mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 specifically recognizes human CD134 on PHA-stimulated T lymphocytes (partially blocks the binding of clone L106), and (ii) a commercially available It was demonstrated to bind to an epitope of human CD134 that is not identical to that recognized by mouse anti-human CD134 antibody clone L106. These results also indicate that mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 (i) specifically recognizes human CD134 on PHA-stimulated T lymphocytes (slightly blocks clone L106 binding), and (ii) It has also been demonstrated to bind to a non-identical epitope recognized by the commercially available mouse anti-human CD134 antibody clone L106. Furthermore, these results suggest that mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 recognize the human CD134 epitope on PHA-stimulated T lymphocytes, which is a commercially available mouse anti-human CD134 antibody clone. It was also demonstrated that it differs from the epitope recognized by ACT35. In addition, these results indicate that mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 contrasted the similar human CD134 epitope on THA lymphocytes stimulated with PHA (partial and minor blockade of L106 binding). It has also been proved that it is considered to be recognized.

（f）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上での、組換えヒトOX40リガンドとマウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5との同時結合
PHAで刺激された（10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ HPS（Fcγ受容体を遮断；BioWhittaker）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、10.0μg／mLポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40リガンド（OX40L；R&D Systems）と50.0μg／mL抗ポリヒスチジン抗体（マウスIgG1、クローンAD1.1.10；R&D Systems）との組み合わせとともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、1：100希釈したFITC結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を10.0μg／mLのビオチン化（PierceによるN-ヒドロキシスクシンイミド-ビオチンを使用）マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3またはクローン20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、1：100希釈したPE結合ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN₃中にて4℃で30分間かけて固定した。ヒトOX40Lおよび抗ヒトCD134抗体の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 (F). Simultaneous binding of recombinant human OX40 ligand and mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 on human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA
Human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (10 μg / mL for 1 day; see above) were generated. Cells were harvested and placed at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ supplemented with 10% HPS (Fcγ receptor blocked; BioWhittaker). Cells were combined with 10.0 μg / mL polyhistidine-tagged recombinant human OX40 ligand (OX40L; R & D Systems) and 50.0 μg / mL anti-polyhistidine antibody (mouse IgG1, clone AD1.1.10; R & D Systems) at 4 ° C. Incubated for 30 minutes. After extensive washing in PBS / BSA / NaN _3, the cells, 1: and incubated for 30 min at 4 ° C. with 100 diluted FITC-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Jackson ImmunoResearch). After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ cells were biotinylated at 10.0 μg / mL (using N-hydroxysuccinimide-biotin by Pierce) with mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 or clone 20E5 at 4 ° C. Incubated for minutes. After extensive washing with PBS / BSA NaN ₃ , the cells were incubated with PE-conjugated streptavidin (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 100 for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formamide for 30 minutes at 4 ° C. The binding of human OX40L and anti-human CD134 antibody was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図6に示されているように、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5はいずれも、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上でヒトOX40Lと同時に結合した。このことから、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびクローン20E5が、ヒトCD134受容体上のOX40L結合領域内部のエピトープとは相互作用しないことが示された。この所見は、ヒトCD134受容体のヒトOX40L結合領域内部のエピトープを認識した市販のマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローンL106（Stanford University／Godfrey特許EP 0 726 952 B1）とは対照的である（Taylor and Schwarz. J Immunol Methods 2001; 255: 67-72；Kirin & La Jolla Institute/Croft特許WO 2007/062235 A2）。   As shown in FIG. 6, both mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 bind simultaneously with human OX40L on PHA-stimulated human CD134-expressing T lymphocytes did. This indicates that mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and clone 20E5 do not interact with the epitope within the OX40L binding region on the human CD134 receptor. This finding is in contrast to the commercially available mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone L106 (Stanford University / Godfrey patent EP 0 726 952 B1) that recognized an epitope within the human OX40L binding region of the human CD134 receptor (Taylor and Schwarz. J Immunol Methods 2001; 255: 67-72; Kirin & La Jolla Institute / Croft patent WO 2007/062235 A2).

（g）．抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズによる刺激後のヒトエフェクターTリンパ球および調節性Tリンパ球上でのCD134発現
ヒトCD4 Tリンパ球を、マイクロビーズ結合マウス抗ヒトCD4抗体（Miltenyi Biotec）を用いる陽性選択およびVarioMACS（商標）Magnet／LSカラム（Miltenyi Biotec）によって、PBMCから精製した。その後に、これらのCD4 Tリンパ球をFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（Dako）およびPE結合マウス抗ヒトCD25抗体（BD Biosciences）によって染色した。CD4^陽性／CD25^陰性の従来のエフェクターTリンパ球（Teff）およびCD4^陽性／CD25^highの調節性Tリンパ球（Treg）を、Altraフローサイトメトリー細胞分取装置（Beckman-Coulter）を用いて分取した。これにより、95％超のTeffおよび95％超のTregの濃縮物が得られた。TeffおよびTregを、0.02mMピルビン酸塩（Gibco）、100U／mL ペニシリン（Gibco）、100μg／mLストレプトマイシン（Gibco）および10％非働化HPS（HPSi；LMIによる）を加えたRPMI-1640／glutamax培地（Gibco）中に2.5×10⁵個／mLで入れた。続いて、細胞を96ウェル丸底プレート（Greiner）に2.5×10⁴個／200μL／ウェルで播種した上で、25U／mL組換えヒトインターロイキン-2（Novartis Pharmaceuticals UK LtdによるProleukin（登録商標））の存在下で、マウス抗ヒトCD3／マウス抗ヒトCD28抗体刺激ビーズ（CD3／CD28ビーズ；Invitrogen）により、ビーズ1個／細胞2個として37℃、5％ CO₂で2〜8日間刺激した。培養後に、細胞を採取して、氷冷PBS／0.2％BSA中に1〜2×10⁶個／mLで入れ、1：50希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（Dako）、1：10希釈したPE結合マウス抗ヒトCD25抗体（BD Biosciences）、1：50希釈したECD（商標）結合マウス抗ヒトCD3抗体（Beckman-Coulter）、1：10希釈したPE-Cy（商標）5結合マウス抗ヒトCD134抗体（クローンATC35；BD Biosciences）および1：10希釈したPE-Cy（商標）7結合マウス抗ヒトCD127抗体（eBiosciences）により同時に染色した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 (G). CD134 expression on human effector T lymphocytes and regulatory T lymphocytes after stimulation with anti-human CD3 / anti-human CD28 antibody-stimulated beads Human CD4 T lymphocytes were microbead-conjugated mouse anti-human CD4 antibody (Miltenyi Biotec) Purified from PBMC by positive selection used and VarioMACS ™ Magnet / LS column (Miltenyi Biotec). Subsequently, these CD4 T lymphocytes were stained with FITC-conjugated mouse anti-human CD4 antibody (Dako) and PE-conjugated mouse anti-human CD25 antibody (BD Biosciences). CD4 ^positive / CD25 ^negative conventional effector T lymphocytes (Teff) and CD4 ^positive / CD25 ^high regulatory T lymphocytes (Treg) are sorted using an Altra flow cytometry cell sorter (Beckman-Coulter) did. This resulted in a concentrate of> 95% Teff and> 95% Treg. RPMI-1640 / glutamax medium with Teff and Treg plus 0.02 mM pyruvate (Gibco), 100 U / mL penicillin (Gibco), 100 μg / mL streptomycin (Gibco) and 10% inactivated HPS (HPSi; by LMI) (Gibco) was placed at 2.5 × 10 ⁵ cells / mL. Subsequently, the cells were seeded in a 96-well round bottom plate (Greiner) at 2.5 × 10 ⁴ cells / 200 μL / well, and then 25 U / mL recombinant human interleukin-2 (Proleukin® by Novartis Pharmaceuticals UK Ltd) ) In the presence of mouse anti-human CD3 / mouse anti-human CD28 antibody-stimulated beads (CD3 / CD28 beads; Invitrogen) for 2-8 days at 37 ° C. and 5% CO ₂ as 2 beads / cell . After culture, cells were harvested and placed in ice-cold PBS / 0.2% BSA at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL and diluted 1:50 with FITC-conjugated mouse anti-human CD4 antibody (Dako), diluted 1:10 PE-conjugated mouse anti-human CD25 antibody (BD Biosciences), 1:50 diluted ECD ™ -conjugated mouse anti-human CD3 antibody (Beckman-Coulter), 1:10 diluted PE-Cy ™ 5-conjugated mouse anti-human CD134 antibody (clone ATC35; BD Biosciences) and 1:10 diluted PE-Cy ™ 7 conjugated mouse anti-human CD127 antibody (eBiosciences) were stained simultaneously. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図7に示されているように（n＝各ドナーから1件）、末梢血で精製した非刺激／休止（第0日）ヒトTeffおよびヒトTregはCD134を全く発現しなかったが、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトTeffおよびヒトTregは表面CD134を発現した。活性化されたヒトTeffおよびヒトTreg上でのCD134発現は培養下で2日後にピークに達し、培養下で5日後および8日後には減弱した。   As shown in FIG. 7 (n = one from each donor), peripheral blood purified unstimulated / rested (day 0) human Teff and human Treg did not express CD134 at all, but CD3 / Human Teff and human Treg stimulated with CD28 beads expressed surface CD134. CD134 expression on activated human Teff and human Treg peaked after 2 days in culture and was attenuated after 5 and 8 days in culture.

実施例3．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の生物学的特性決定
（a）．マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5による処置後の、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖
PHAで刺激された（0および10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取して、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI培地（Gibco）中に2×10⁶個／mLで懸濁させた。細胞を96ウェル平底プレート（Corning）中に0.1×10⁶個／100μL／ウェル（すなわち、1×10⁶個／mL）で播種した上で、0、0.025、0.25、2.5もしくは25.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3もしくはマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5に対して、または／および、0、0.01、0.1もしくは1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体；R&D Systemsの存在下）との組み合わせに対して、37℃、5％ CO₂で6日間曝露させた。6日後に、比色定量（BrdU取込み）細胞増殖ELISA（商標）（Roche）およびELISAリーダー（BioRad）をA450nmで用いて細胞増殖を測定した。 Example 3 Biological characterization of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 (a). Proliferation of PHA-stimulated human CD134-expressing T lymphocytes after treatment with mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5
Human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (0 and 10 μg / mL for 1 day; see above) were generated. Cells were harvested and suspended at 2 × 10 ⁶ cells / mL in RPMI medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum (Bodinco) and 50 μg / mL gentamicin (Gibco). Cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates (Corning) at 0.1 × 10 ⁶ cells / 100 μL / well (ie, 1 × 10 ⁶ cells / mL) and then 0, 0.025, 0.25, 2.5, or 25.0 μg / mL. Polyhistidine tag-labeled recombinant human OX40L (molar ratio 1: 5) against mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 or mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 or / and 0, 0.01, 0.1 or 1.0 μg / mL In combination with a mouse anti-polyhistidine antibody (in the presence of R & D Systems) at 37 ° C., 5% CO ₂ for 6 days. After 6 days, cell proliferation was measured using a colorimetric (BrdU incorporation) cell proliferation ELISA ™ (Roche) and ELISA reader (BioRad) at A450 nm.

図8に示されているように（平均±SD、n＝4、1件のドナーを使用）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5は、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖を用量依存的に誘導した。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3は、0.25、2.5および25μg／mLで増殖を誘導した。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3は、2.5および25μg／mLで増殖を誘導した。加えて、ヒトOX40Lも、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖を用量依存的に誘導した。ヒトOX40Lは、0.1および1.0μg／mLで増殖を誘導した。休止（PHA刺激を伴わない）ヒトCD134^陰性 Tリンパ球は、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5またはヒトOX40Lによる処置後に、増殖性応答を全く示さなかった（データは提示せず）。 Mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 were stimulated with PHA as shown in FIG. 8 (mean ± SD, n = 4, using one donor) The proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes was induced in a dose-dependent manner. Mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 induced proliferation at 0.25, 2.5 and 25 μg / mL. Mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 induced proliferation at 2.5 and 25 μg / mL. In addition, human OX40L also induced proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA in a dose-dependent manner. Human OX40L induced proliferation at 0.1 and 1.0 μg / mL. Resting (without PHA stimulation) human CD134 ^negative T lymphocytes showed no proliferative response after treatment with mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3, mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 or human OX40L (data) Not shown).

図9に示されているように（平均±SD、n＝2、1件のドナーを使用）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3（2.5および25μg／mL）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5（2.5および25μg／mL）およびヒトOX40L（1.0μg／mL）は、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖を誘導した。非処置（媒質のみ）またはマウスIgG1κアイソタイプ対照（2.5および25μg／mL；BD Biosciences）による処置は、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球増殖に対して何ら効果を示さなかった。2.5および25μg／mL（またはより低濃度；データは提示せず））でのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3、または2.5および25μg／mL（またはより低濃度；データは提示せず）でのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5と、1.0μg／mL（またはより低濃度；データは提示せず）でのヒトOX40Lとの組み合わせは、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖に対して、いかなる相互的（すなわち、相乗的もしくは相加的な、またはさらには阻害的な）効果も示さなかった。   Mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 (2.5 and 25 μg / mL), mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 as shown in FIG. 9 (mean ± SD, n = 2, using one donor) (2.5 and 25 μg / mL) and human OX40L (1.0 μg / mL) induced proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA. Treatment with untreated (vehicle only) or mouse IgG1κ isotype control (2.5 and 25 μg / mL; BD Biosciences) did not show any effect on PHA-stimulated human CD134-expressing T lymphocyte proliferation. Mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 at 2.5 and 25 μg / mL (or lower concentrations; data not shown), or mice at 2.5 and 25 μg / mL (or lower concentrations; data not shown) The combination of anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 with human OX40L at 1.0 μg / mL (or lower concentration; data not shown) against proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA And did not show any reciprocal (ie synergistic or additive or even inhibitory) effects.

（b）．マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5による処置後の、抗ヒトCD3／抗CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性エフェクターTリンパ球および調節性Tリンパ球の増殖
ヒトCD4 Tリンパ球を、ヒトCD8（クローンRPA-T8）、CD14（クローンM5E2）、CD16（クローン3G8）、CD19（クローン4G7）、CD33（クローンP67.6）、CD56（クローンB159）およびCD235a（HIR2）を対象とするマウス抗体の混合物（BD BioSciences）を用いる陰性選択によって、PBMCから精製した。Dynabeads（登録商標）結合ヒツジ抗マウスIgG（Invitrogen）とのインキュベーション後に、非結合CD4 Tリンパ球を、Dynal Magnetic Particle Concentrator、MPC（商標）-6（Invitrogen）によって収集した。これらの濃縮されたCD4 Tリンパ球から、CD25^high TregおよびCD25^陰性 Teffを、10μlのマイクロビーズ結合マウス抗ヒトCD25抗体（Miltenyi Biotec）／細胞10⁷個およびMiniMACS（商標）Magnet／MSカラム（Miltenyi Biotec VarioMACS（商標）Magnet／LSカラム（Miltenyi Biotec）を用いるMACS分取法によって分離した。これにより、90％超のTeffおよび90％超のTregの濃縮物が得られた。TeffおよびTregを、0.02mMピルビン酸塩（Gibco）、100U／mLペニシリン（Gibco）、100μg／mLストレプトマイシン（Gibco）および10％ HPSiを加えたRPMI-1640／glutamax培地（Gibco）中に、0.25×10⁶個／mLで入れた。続いて、TeffおよびTregを、96ウェル丸底プレート（Greiner）中に2.5×10⁴個／200μL／ウェル（すなわち、0.125×10⁶個／mL）で播種した上で、5.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3、5.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5、1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体；R&D Systemsの存在下）、5.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3と1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体の存在下）の組み合わせ、または5.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5と1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体の存在下）の組み合わせを伴うかまたは伴わずに、ビーズ1個／細胞5個のCD3／CD28ビーズ（Invitrogen）により、37℃／5％ CO₂で4日間または5日間刺激した。4日後または5日後に、細胞増殖を、0.5μCiのトリチウム標識チミジン（Perkin & Elmer）の取込みおよびβ-計数器（Canberra-Packard）を用いて測定した。 (B). Proliferation of human CD134-expressing effector and regulatory T lymphocytes stimulated with anti-human CD3 / anti-CD28 beads after treatment with mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5. (Clone RPA-T8), CD14 (clone M5E2), CD16 (clone 3G8), CD19 (clone 4G7), CD33 (clone P67.6), CD56 (clone B159) and CD235a (HIR2) Purified from PBMC by negative selection using the mixture (BD BioSciences). After incubation with Dynabeads®-conjugated sheep anti-mouse IgG (Invitrogen), unbound CD4 T lymphocytes were collected by Dynal Magnetic Particle Concentrator, MPC ™ -6 (Invitrogen). These enriched CD4 T lymphocytes, CD25 ^high Treg and CD25 ^negative Teff, 10 [mu] l of microbeads conjugated mouse anti-human CD25 antibody (Miltenyi Biotec) / 10 ⁷ cells and MiniMACS (TM) Magnet / MS column (Miltenyi Separation by MACS preparative method using a Biotec VarioMACS ™ Magnet / LS column (Miltenyi Biotec), resulting in a concentrate of> 90% Teff and> 90% Treg. 0.25 × 10 ⁶ cells / mL in RPMI-1640 / glutamax medium (Gibco) supplemented with mM pyruvate (Gibco), 100 U / mL penicillin (Gibco), 100 μg / mL streptomycin (Gibco) and 10% HPSi Subsequently, Teff and Treg were seeded in 96-well round bottom plates (Greiner) at 2.5 × 10 ⁴ cells / 200 μL / well (ie, 0.125 × 10 ⁶ cells / mL), and then 5.0 μg / mL of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3, 5.0 μg / mL Mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5, 1.0 μg / mL polyhistidine-tagged recombinant human OX40L (1: 5 mouse anti-polyhistidine antibody in the presence of R & D Systems), 5.0 μg / mL mouse anti-human Combination of CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and 1.0 μg / mL polyhistidine-tagged recombinant human OX40L (in the presence of a mouse anti-polyhistidine antibody at a molar ratio of 1: 5) or 5.0 μg / mL mouse anti-human CD134 monoclonal antibody 1 bead / 5 cells with or without the combination of clone 20E5 and 1.0 μg / mL polyhistidine-tagged recombinant human OX40L (in the presence of a mouse anti-polyhistidine antibody at a molar ratio of 1: 5) CD3 / CD28 beads (Invitrogen) were stimulated for 4 or 5 days at 37 ° C./5% CO _{2. After} 4 or 5 days, cell proliferation was increased to 0.5 μCi of tritium labeled thymidine (Perkin & Elmer ) And β-counter (Canberra-Packard).

図10に示されているように（平均±SD）、CD3／CD28刺激ビーズは単独でも、ヒトCD134発現性Teffのかなりの増殖を誘導したが（すなわち、「培地」）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3またはヒトOX40Lは、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Teffにおけるさらなる増殖を誘導した。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5は、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Teffにおけるさらなる増殖を誘導しなかった。   As shown in FIG. 10 (mean ± SD), CD3 / CD28 stimulated beads alone induced significant proliferation of human CD134-expressing Teff (ie, “medium”), but mouse anti-human CD134 monoclonal Antibody clone 12H3 or human OX40L induced further proliferation in human CD134 expressing Teff stimulated with CD3 / CD28 beads. Mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 did not induce further proliferation in human CD134-expressing Teff stimulated with CD3 / CD28 beads.

図11に示されているように（5件のドナーによる平均±SEM）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5は、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tregにおける増殖を誘導しないか、わずかな増殖しか誘導しなかったが、一方、ヒトOX40LはCD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tregにおける極めて強い増殖を誘導した。   As shown in FIG. 11 (mean ± SEM from 5 donors), mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 were stimulated with CD3 / CD28 beads to express human CD134. Human OX40L induced very strong proliferation in human CD134-expressing Tregs stimulated with CD3 / CD28 beads, while inducing little or no proliferation in sex Tregs.

図12Aに示されているように（平均±SD）、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3とヒトOX40Lとの組み合わせは、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Teffにおけるいかなる相互的（すなわち、阻害的、相乗的または相加的）効果も示さなかった。その上、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5とヒトOX40Lとの組み合わせは、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Teffにおいても、いかなる相互的（すなわち、阻害的、相乗的または相加的）効果も示さなかった（データは提示せず）。   As shown in FIG. 12A (mean ± SD), the combination of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and human OX40L showed any reciprocal (i.e., human CD134-expressing Teff stimulated with CD3 / CD28 beads). No inhibitory, synergistic or additive) effects. Moreover, the combination of murine anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 and human OX40L can be any reciprocal (ie, inhibitory, synergistic or additive) in human CD134-expressing Teff stimulated with CD3 / CD28 beads. ) Not effective (data not shown).

図12Bに示されているように（平均±SD）、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性TeffにおいてヒトOX40L媒介性の増殖性応答での効果（が認められなかったこと）とは対照的に、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3は、 CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性TregにおけるヒトOX40L媒介性の増殖性応答を強く抑制した。   As shown in FIG. 12B (mean ± SD), the effect on human OX40L-mediated proliferative response in human CD134-expressing Teff stimulated with CD3 / CD28 beads (has not been observed) In contrast, mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 strongly suppressed the human OX40L-mediated proliferative response in human CD134-expressing Tregs stimulated with CD3 / CD28 beads.

（c）．マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5による処置後の、抗ヒトCD3／抗CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性調節性Tリンパ球の抑制機能
ヒトCD4 Tリンパ球をPBMCから精製し、上記の実施例3（b）に記載した通りにTeffおよびTregを濃縮した。TeffおよびTregを、0.02mMピルビン酸塩（Gibco）、100U／mLペニシリン（Gibco）、100μg／mLストレプトマイシン（Gibco）および10％ HPSiを加えたRPMI-1640／glutamax培地（Gibco）中に、0.25×10⁶個／mLで入れた。続いて、Teffを96ウェル丸底プレート（Greiner）に2.5×10⁴個／200μL／ウェル（すなわち、0.125×10⁶個のTeff／mL）で播種し、2.5×10⁴個の抑制性Treg／200μL／ウェル（すなわち、0.125×10⁶個のTreg／mL；Teff／Treg比＝1：1）と共培養した。これらのTeff／Treg共培養物を、5.0μg／mLマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3、5.0μg／mLマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および1.0μg／mLポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体；R&D Systems）を伴うかまたは伴わずに、ビーズ1個／細胞10個のCD3／CD28ビーズ（Invitrogen）により、37℃、5％ CO₂で5日間刺激した。5日後に、0.5μCiトリチウム標識チミジン（Perkin & Elmer）取込みおよびβ-計数器（Canberra-Packard）を用いて細胞増殖を測定した。 (C). Inhibitory function of human CD134-expressing regulatory T lymphocytes stimulated with anti-human CD3 / anti-CD28 beads after treatment with mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 Human CD4 T lymphocytes were purified from PBMC Teff and Treg were concentrated as described in Example 3 (b). Teff and Treg were added at 0.25 × in RPMI-1640 / glutamax medium (Gibco) supplemented with 0.02 mM pyruvate (Gibco), 100 U / mL penicillin (Gibco), 100 μg / mL streptomycin (Gibco) and 10% HPSi. 10 ⁶ pieces / mL were added. Subsequently, Teff was seeded in a 96-well round bottom plate (Greiner) at 2.5 × 10 ⁴ cells / 200 μL / well (ie, 0.125 × 10 ⁶ Teff / mL), and 2.5 × 10 ⁴ inhibitory Treg / Co-cultured with 200 μL / well (ie 0.125 × 10 ⁶ Treg / mL; Teff / Treg ratio = 1: 1). These Teff / Treg co-cultures were mixed with 5.0 μg / mL mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3, 5.0 μg / mL mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 and 1.0 μg / mL polyhistidine-tagged recombinant human OX40L (molar Stimulated for 5 days at 37 ° C, 5% CO ₂ with 1 bead / 10 cells CD3 / CD28 beads (Invitrogen) with or without 1: 5 mouse anti-polyhistidine antibody (R & D Systems) did. Five days later, cell proliferation was measured using 0.5 μCi tritium labeled thymidine (Perkin & Elmer) incorporation and β-counter (Canberra-Packard).

図13に示されているように（平均±SD）、ヒトTregは、CD3／CD28ビーズ誘導性のヒトTeff増殖性応答を抑制した（すなわち、「培地」）。ヒトTregのこの抑制機能は、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の存在下またはヒトOX40Lの存在下では弱まった。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5は、ヒトTreg抑制機能に対して何ら効果を示さなかった。   As shown in FIG. 13 (mean ± SD), human Treg suppressed the CD3 / CD28 bead-induced human Teff proliferative response (ie, “medium”). This inhibitory function of human Treg was weakened in the presence of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 or in the presence of human OX40L. Mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 had no effect on human Treg inhibitory function.

実施例4．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の分子遺伝学的特性決定
（a）．アイソタイプ判定およびエドマン分解
プロテインGで精製したマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3のマウス免疫グロブリンのクラス、アイソタイプおよび軽鎖の型を、IsoStrip（商標）マウスモノクローナル抗体アイソタイプキット（Roche）を用いて判定したところ、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3はいずれも、重鎖およびκ軽鎖を有するIgG1からなった。 Example 4 Molecular genetic characterization of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 20E5 and 12H3 (a). Isotyping and Edman degradation Protein immunoglobulin-purified mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 20E5 and 12H3 mouse immunoglobulin classes, isotypes and light chain types using the IsoStrip ™ mouse monoclonal antibody isotype kit (Roche) As determined, both mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 20E5 and 12H3 consisted of IgG1 with a heavy chain and a kappa light chain.

プレキャストゲルNuPage（登録商標）Novex（登録商標）システム（Invitrogen）を還元（DTTおよび70℃加熱）条件下で用いる標準的なSDS-PAGE電気泳動の後に、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5を、ポリビニリデンフロリド（PDVF／Immobilon-P）転写膜（Millipore）に対してエレクトロブロットし、クーマシーブリリアントブルー（BioRad）で染色した。続いて、重鎖バンドおよび軽鎖バンド（それぞれ50kDaおよび25kDa）をPVDF膜から切り出して、N末端アミノ酸配列を決定するためのエドマン分解分析に用いた（EuroSequence, Groningen, Netherlandsにより実施）。その結果は、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5についてSEQ ID NO.3およびSEQ ID NO.61に示されている。重鎖からのN末端の11個のアミノ酸、および軽鎖からのN末端の11個のアミノ酸を決定した。   After standard SDS-PAGE electrophoresis using the precast gel NuPage® Novex® system (Invitrogen) under reducing (DTT and 70 ° C. heating) conditions, the mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 Electroblotted to polyvinylidene fluoride (PDVF / Immobilon-P) transfer membrane (Millipore) and stained with Coomassie Brilliant Blue (BioRad). Subsequently, the heavy and light chain bands (50 kDa and 25 kDa, respectively) were excised from the PVDF membrane and used for Edman degradation analysis to determine the N-terminal amino acid sequence (performed by EuroSequence, Groningen, Netherlands). The results are shown in SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.61 for mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5. The N-terminal 11 amino acids from the heavy chain and the N-terminal 11 amino acids from the light chain were determined.

（b）．RT PCR
クローン20E5および12H3のハイブリドーマ細胞を細胞培養物から採取した。細胞をPBSで洗浄し、細胞5×10⁶個を含むようにバイアルに分注した上で、ペレットとして-80℃で貯蔵した。細胞ペレットを、RNeasy Mini Isolation Kit（QIAGEN）を用いることによってRNAを単離するために用いた。RNA濃度を決定し（A260nm）、RNAを-80℃で貯蔵した。単離されたRNAの総収量は、クローン20E5およびクローン12H3についてそれぞれ27.3μgおよび58.4μgであった（A260／A280比はいずれも1.9）。逆転写酵素により、RevertAid（商標）H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）を用いて1μgのRNAからcDNAを合成し、-20℃で貯蔵した。 (B). RT PCR
Clone 20E5 and 12H3 hybridoma cells were harvested from the cell culture. Cells were washed with PBS, dispensed into vials containing 5 × 10 ⁶ cells, and stored as pellets at −80 ° C. The cell pellet was used to isolate RNA by using the RNeasy Mini Isolation Kit (QIAGEN). RNA concentration was determined (A260nm) and RNA was stored at -80 ° C. The total yield of isolated RNA was 27.3 μg and 58.4 μg for clone 20E5 and clone 12H3, respectively (A260 / A280 ratio of 1.9). A reverse transcriptase was used to synthesize cDNA from 1 μg of RNA using the RevertAid ™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) and stored at −20 ° C.

マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5のアイソタイプ（マウスκ／IgG1）およびエドマン分解分析に基づき、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5のV領域を増幅するための以下のプライマーを設計した。

* 番号はBioceros社の内部符号方式による
** 縮重プライマー：N＝A、C、GまたはT、Y＝CまたはT、R＝AまたはG、W＝AまたはT、およびS＝GまたはC。 Based on the isotype of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 (mouse κ / IgG1) and Edman degradation analysis, the following primers were designed to amplify the V region of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5.

* Numbers are based on Bioceros' internal code system
** Degenerate primers: N = A, C, G or T, Y = C or T, R = A or G, W = A or T, and S = G or C.

マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のアイソタイプ（マウスκ／IgG1）、およびマウスシグナルペプチド（Antibody Engineering Volume 1 Kontermann, Roland E.; Dubel, Stefan (Eds.), Springer Lab Manuals, 2nd ed., 2010に一部基づく）をコードするcDNAとのセンスプライマーのアニーリングに基づき、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のV領域を増幅するための以下のプライマーを設計した。

* 番号はBioceros社の内部符号方式による
** 縮重プライマー：N＝A、C、GまたはT、Y＝CまたはT、R＝AまたはG、W＝AまたはT、およびS＝GまたはC、M＝CまたはA、およびK＝GまたはT。 Mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 isotype (mouse κ / IgG1) and mouse signal peptide (Antibody Engineering Volume 1 Kontermann, Roland E .; Dubel, Stefan (Eds.), Springer Lab Manuals, 2nd ed., 2010 Based on annealing of the sense primer with cDNA encoding (based in part), the following primers were designed to amplify the V region of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3.

* Numbers are based on Bioceros' internal code system
** Degenerate primers: N = A, C, G or T, Y = C or T, R = A or G, W = A or T, and S = G or C, M = C or A, and K = G or T.

プライマー201および266は、それぞれマウスκ遺伝子の定常領域内の位置214〜232および236〜255でアニーリングするように設計されたアンチセンスである（アクセッション番号V00807［バージョンV00807.1］に基づく）。   Primers 201 and 266 are antisense designed to anneal at positions 214-232 and 236-255, respectively, in the constant region of the mouse kappa gene (based on accession number V00807 [version V00807.1]).

プライマー203および204は、それぞれマウスIgG1の定常領域内の位置115〜134および221〜240でアニーリングするように設計されたアンチセンスである（アクセッション番号J00453［バージョンJ00453.1］に基づく）。   Primers 203 and 204 are antisense designed to anneal at positions 115-134 and 221-240, respectively, in the constant region of mouse IgG1 (based on accession number J00453 [version J00453.1]).

プライマー259および260は、エドマン分解に基づく、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5の重鎖のN末端（それぞれアミノ酸1〜8および2〜9）でアニーリングするセンス縮重プライマー（縮重はそれぞれ512および256種類）である。   Primers 259 and 260 are sense degenerate primers based on Edman degradation, annealing at the N-terminus of the heavy chain of mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 (amino acids 1-8 and 2-9, respectively) (degenerates are 512 and 256, respectively). Type).

プライマー265は、エドマン分解に基づく、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5の軽鎖のN末端（アミノ酸1〜7）でアニーリングするセンス縮重プライマー（縮重は16種類）である。   Primer 265 is a sense degenerate primer based on Edman degradation that anneals at the N-terminus (amino acids 1-7) of the light chain of mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 (16 types of degeneracy).

プライマー416は、マウスIgG1の定常領域内の位置111〜131でアニーリングするように設計されたアンチセンスである（アクセッション番号J00453［バージョンJ00453.1］に基づく）。   Primer 416 is an antisense designed to anneal at positions 111-131 within the constant region of mouse IgG1 (based on accession number J00453 [version J00453.1]).

プライマー394は、マウスκ遺伝子の定常領域内の位置235〜254でアニーリングするように設計されたアンチセンスである（アクセッション番号V00807［バージョンV00807.1］に基づく）。   Primer 394 is an antisense designed to anneal at positions 235-254 within the constant region of the mouse κ gene (based on accession number V00807 [version V00807.1]).

プライマー389、405および410は、マウス抗体のシグナルペプチド配列とアニーリングする縮重プライマー（縮重はそれぞれ2、8および8種類）である。プライマー389は軽鎖用に、プライマー405および410は重鎖用に設計されている。   Primers 389, 405 and 410 are degenerate primers that anneal to the signal peptide sequence of the mouse antibody (degenerates are 2, 8 and 8 types, respectively). Primer 389 is designed for the light chain and primers 405 and 410 are designed for the heavy chain.

プライマー201、266、203、204、259、260および265を、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5の可変領域を増幅するためにさまざまな組み合わせで用い、プライマー416、394、405、410および389を、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の可変領域を増幅するためにさまざまな組み合わせで用いた。生成された両方のクローンのcDNAをテンプレートとして用いて、種々のさまざまなPCRを行った。   Primers 201, 266, 203, 204, 259, 260 and 265 were used in various combinations to amplify the variable region of mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5, while primers 416, 394, 405, 410 and 389 were used in mice It was used in various combinations to amplify the variable region of anti-human CD134 antibody clone 12H3. A variety of different PCRs were performed using the cDNAs of both generated clones as templates.

Accuprime（商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を用いて、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5およびクローン12H3の両方の重鎖および軽鎖の可変領域を増幅した。PCR産物を1％アガロースゲルにて分析した。PCR反応の産物をゲル精製して、配列分析のためにpCR-Blunt II-TOPO（登録商標）ベクター中にクローニングした。PCRインサートを含むプラスミドから、クローニングされたインサートを、T7を用いるDNAシークエンシングによって分析して（ServicXS B.V., Leiden, NetherlandsまたはMacrogen, Amsterdam, Netherlandsにより実施）、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5および12H3のV領域に関するコンセンサス配列を入手した。マウス抗CD134抗体クローン20E5については、情報的価値のある11種の配列重鎖反応および情報的価値のある3種の軽鎖配列反応が得られた。マウス抗CD134抗体クローン12H3については、情報的価値のある5種の配列重鎖反応および情報的価値のある3種の軽鎖配列反応が得られた。この情報に基づき、両方の抗体のV領域のコンセンサス配列を決定した（SEQ ID NO. 4、5、12および13を参照）。   Accuprime ™ Pfx DNA polymerase (Invitrogen) was used to amplify the heavy and light chain variable regions of both mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 and clone 12H3. PCR products were analyzed on a 1% agarose gel. The product of the PCR reaction was gel purified and cloned into pCR-Blunt II-TOPO® vector for sequence analysis. From plasmids containing PCR inserts, the cloned inserts were analyzed by DNA sequencing using T7 (performed by ServicXS BV, Leiden, Netherlands or Macrogen, Amsterdam, Netherlands) to obtain mouse anti-human CD134 antibody clones 20E5 and 12H3. A consensus sequence for the V region was obtained. For mouse anti-CD134 antibody clone 20E5, 11 information heavy chain reactions with information value and 3 light chain sequence reactions with information value were obtained. For mouse anti-CD134 antibody clone 12H3, 5 sequence heavy chain reactions with information value and 3 light chain sequence reactions with information value were obtained. Based on this information, consensus sequences for the V regions of both antibodies were determined (see SEQ ID NOs. 4, 5, 12, and 13).

実施例5．キメラ型ヒトIgG4／κおよび／またはヒトIgG1／κ（すなわち、定常ヒトIgG／κドメインによるマウス定常ドメインの入れ替え）抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の作製
マウス抗CD134抗体クローン20E5および12H3の決定されたマウスV領域（上記の実施例4（b）を参照）に基づき、キメラ型ヒト抗体バージョンを作製するための設計を行った。この目的に向けて、CHO細胞に最適化されたcDNA配列（SEQ ID NO. 20（キメラ型ヒトIgG4重鎖クローン20E5をコード）、SEQ ID NO. 21（キメラ型ヒトκ軽鎖クローン20E5をコード）、SEQ ID NO. 22（キメラ型ヒトIgG1重鎖クローン20E5をコード）、SEQ ID NO. 23（キメラ型ヒトIgG4重鎖クローン12H3をコード）およびSEQ ID NO. 24（キメラ型ヒトκ軽鎖クローン12H3をコード）を参照）をGENEART（Regensburg, Germany）に対して発注し、マウスシグナルペプチドの後に、ヒトκ定常領域と連結した可変軽鎖、またはヒトIgG定常領域と連結した可変重鎖のいずれかが続くようにコード化を行った。この設計を両方の抗体に対して行った；クローン20E5については、可変重鎖をヒトIgG4またはヒトIgG1定常領域と連結させた；クローン12H3については、可変重鎖領域をヒトIgG4定常領域と連結させた。適した制限酵素を用いて、作製されたcDNAをpcDNA3.1由来の発現プラスミド中にサブクローニングした。キメラ抗体は、FreeStyle（商標）MAX CHO（CHO-S細胞）Expression System（Invitrogen）を用いて発現させた。発現された抗体を、プロテインAカラム（GE Healthcare）によるアフィニィークロマトグラフィーを用いて精製した。キメラ型アミノ酸配列については、SEQ ID NO. 25、26、27、28および29を参照。 Example 5. Generation of chimeric human IgG4 / κ and / or human IgG1 / κ (ie, replacement of mouse constant domains with constant human IgG / κ domains) anti-human CD134 monoclonal antibody clones 20E5 and 12H3 Determination of mouse anti-CD134 antibody clones 20E5 and 12H3 Based on the mouse V region (see Example 4 (b) above), a design for making a chimeric human antibody version was made. To this end, cDNA sequences optimized for CHO cells (SEQ ID NO. 20 (encoding chimeric human IgG4 heavy chain clone 20E5), SEQ ID NO. 21 (encoding chimeric human κ light chain clone 20E5) ), SEQ ID NO. 22 (encoding chimeric human IgG1 heavy chain clone 20E5), SEQ ID NO. 23 (encoding chimeric human IgG4 heavy chain clone 12H3) and SEQ ID NO. 24 (chimeric human κ light chain) (See clone 12H3)) to GENEART (Regensburg, Germany) and after the mouse signal peptide, the variable light chain linked to the human kappa constant region or the variable heavy chain linked to the human IgG constant region Encoding was done so that either would continue. This design was done for both antibodies; for clone 20E5, the variable heavy chain was linked to a human IgG4 or human IgG1 constant region; for clone 12H3, the variable heavy chain region was linked to a human IgG4 constant region It was. Using a suitable restriction enzyme, the prepared cDNA was subcloned into an expression plasmid derived from pcDNA3.1. The chimeric antibody was expressed using the FreeStyle ™ MAX CHO (CHO-S cell) Expression System (Invitrogen). The expressed antibody was purified using affinity chromatography on a protein A column (GE Healthcare). See SEQ ID NOs. 25, 26, 27, 28 and 29 for chimeric amino acid sequences.

実施例6．キメラ型ヒトIgG4／κおよび／またはIgG1／κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5の結合特性決定
（a）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性CD4陽性Tリンパ球上でのヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5の結合特性
PHAで刺激された（10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取して、氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、0、0.007、0.02、0.07、0.2、0.6、1.9、5.6、16.7、50.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、1：50希釈したFITC結合マウス抗ヒトIgG4抗体（Sigma）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、1：10希釈したPE結合マウス抗ヒトCD4抗体（BD Biosciences）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN₃中で、4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 Example 6 Binding characterization of chimeric human IgG4 / κ and / or IgG1 / κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 (a). Binding characteristics of human IgG4.KAPPA. Anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 on PHA-stimulated human CD134-expressing CD4-positive T lymphocytes
Human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (10 μg / mL for 1 day; see above) were generated. Cells were harvested and placed in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL. The cells were incubated with 0, 0.007, 0.02, 0.07, 0.2, 0.6, 1.9, 5.6, 16.7, 50.0 μg / mL chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C. with FITC-conjugated mouse anti-human IgG4 antibody (Sigma) diluted 1:50. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C. with PE-conjugated mouse anti-human CD4 antibody (BD Biosciences) diluted 1:10. After extensive washing with PBS / BSA NaN ₃ , cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formamide for 30 minutes at 4 ° C. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、PHAで刺激されたCD4^陽性 Tリンパ球上のヒトCD134表面分子を、およそ5.0〜10.0μg／mLで飽和させた（データは提示せず）。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5について、結合の最大半量は約1.0μg／mLであった（データは提示せず）。 Chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 saturated human CD134 surface molecules on CD4 ^positive T lymphocytes stimulated with PHA at approximately 5.0 to 10.0 μg / mL (data not shown). For the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5, half-maximal binding was approximately 1.0 μg / mL (data not shown).

（b）．PHAで刺激されたヒトCD134発現性CD4陽性およびCD8陽性Tリンパ球上でのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5の結合
PHAで刺激された（10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取して、氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、20.0μg／mLキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5を伴うかまたは伴わずに、4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗ヒトIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、Tリンパ球部分集団を検出するために、細胞を、1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（BD Biosciences）または1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD8抗体（BD Biosciences）とともにインキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN₃にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 (B). Binding of chimeric human IgG4.KAPPA. Anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 on PHA-stimulated human CD134-expressing CD4-positive and CD8-positive T lymphocytes
Human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (10 μg / mL for 1 day; see above) were generated. Cells were harvested and placed in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL. Cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C. with or without 20.0 μg / mL chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were incubated with PE-conjugated goat anti-human IgG (Fcγ specific) antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 200 for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were either 1:10 diluted FITC-conjugated mouse anti-human CD4 antibody (BD Biosciences) or 1:10 diluted FITC to detect T lymphocyte subpopulations. Incubated with conjugated mouse anti-human CD8 antibody (BD Biosciences). After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were fixed with PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formamide at 4 ° C. for 30 minutes. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、PHAで活性化されたヒトCD4^陽性 Tリンパ球部分集団では明らかな陽性染色が示され、PHAで活性化されたヒトCD8^陽性 Tリンパ球部分集団では軽度の陽性染色が示された（データは提示せず）。 The chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 showed clear positive staining in the human CD4 ^positive T lymphocyte subpopulation activated with PHA, and in the human CD8 ^positive T lymphocyte subpopulation activated with PHA Mild positive staining was shown (data not shown).

（c）．抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性CD4陽性およびCD8陽性Tリンパ球上での、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5の結合
健常ドナー（インフォームドコンセントを得た）由来のヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、Lymphoprep（1.077g／mL；Nycomed）での密度勾配遠心法によって単離した。その後に、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI-1640培地（Gibco）中の1×10⁶個のPBMC／mLを、ビーズ1個／細胞4個でのマウス抗ヒトCD3／マウス抗ヒトCD28抗体刺激ビーズ（CD3／CD28ビーズ；Invitrogen）により、25U／mL組換えヒトインターロイキン-2（PeproTech）の非存在下または存在下において、37℃、5％ CO₂で1日間刺激した。培養後にPBMCを採取して、氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、20.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5を伴うかまたは伴わずに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗ヒトIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、Tリンパ球部分集団を検出するために、細胞を、1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD4抗体（BD Biosciences）または1：10希釈したFITC結合マウス抗ヒトCD8抗体（BD Biosciences）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN₃中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 (C). Binding of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 on human CD134-expressing CD4-positive and CD8-positive T lymphocytes stimulated with anti-human CD3 / anti-human CD28 antibody-stimulated beads Healthy donor (with informed consent) Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from (obtained) were isolated by density gradient centrifugation with Lymphoprep (1.077 g / mL; Nycomed). Thereafter, 1 × 10 ⁶ PBMC / mL in RPMI-1640 medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum (Bodinco) and 50 μg / mL gentamicin (Gibco) at 1 bead / 4 cells. Mouse anti-human CD3 / mouse anti-human CD28 antibody-stimulated beads (CD3 / CD28 beads; Invitrogen) in the absence or presence of 25 U / mL recombinant human interleukin-2 (PeproTech) at 37 ° C., 5% CO Stimulated with ₂ for 1 day. After incubation, PBMCs were collected and placed in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL. Cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C. with or without 20.0 μg / mL chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were incubated with PE-conjugated goat anti-human IgG (Fcγ specific) antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 200 for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were either 1:10 diluted FITC-conjugated mouse anti-human CD4 antibody (BD Biosciences) or 1:10 diluted FITC to detect T lymphocyte subpopulations. Incubated with conjugated mouse anti-human CD8 antibody (BD Biosciences) at 4 ° C. for 30 minutes. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formamide for 30 minutes at 4 ° C. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図14に示されているように、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、CD3／CD28ビーズで活性化されたヒトCD4^陽性 Tリンパ球部分集団では明らかな陽性染色が示され、CD3／CD28ビーズで活性化されたヒトCD8^陽性 Tリンパ球部分集団では軽度の陽性染色が示された。組換えヒトIL-2の補充による明らかな効果は観察されなかった。 As shown in FIG. 14, the chimeric human IgG4 kappa anti-human CD134 antibody clone 20E5 showed clear positive staining in the human CD4 ^positive T lymphocyte subpopulation activated with CD3 / CD28 beads, and CD3 / Mild positive staining was shown in a subpopulation of human CD8 ^positive T lymphocytes activated with CD28 beads. No obvious effect was observed with the supplementation of recombinant human IL-2.

実施例7．キメラ型ヒトIgG4／κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5の生物学的特性決定
（a）．キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5による処置後の、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖
PHAで刺激された（10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI培地（Gibco）中に2×10⁶個／mLで懸濁させた。細胞を96ウェル平底プレート（Corning）に0.1×10⁶個／100μL／ウェル（すなわち、1×10⁶個／mL）で播種した上で、25.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または25.0μg／mLの対照ヒトIgG4κ抗ヒトCD40抗体（PG102；Pangenetics）または1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体の存在下；R&D Systems）に対して、37℃、5％ CO₂で6日間曝露させた。6日後に、比色定量（BrdU取込み）細胞増殖ELISA（商標）（Roche）およびELISAリーダー（BioRad）をA450nmで用いて細胞増殖を測定した。 Example 7. Biological characterization of chimeric human IgG4 / κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 (a). Proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA after treatment with chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5
Human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (10 μg / mL for 1 day; see above) were generated. Cells were harvested and suspended at 2 × 10 ⁶ cells / mL in RPMI medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum (Bodinco) and 50 μg / mL gentamicin (Gibco). Cells were seeded in 96-well flat-bottom plates (Corning) at 0.1 × 10 ⁶ cells / 100 μL / well (ie, 1 × 10 ⁶ cells / mL), and then 25.0 μg / mL chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone In the presence of 20E5 or 25.0 μg / mL control human IgG4κ anti-human CD40 antibody (PG102; Pangenetics) or 1.0 μg / mL polyhistidine-tagged recombinant human OX40L (molar ratio 1: 5 mouse anti-polyhistidine antibody; R & D Systems) for 6 days at 37 ° C., 5% CO ₂ . After 6 days, cell proliferation was measured using a colorimetric (BrdU incorporation) cell proliferation ELISA ™ (Roche) and ELISA reader (BioRad) at A450 nm.

図15に示されているように（平均±SD）、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5（hu20E5）およびヒトOX40Lは、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖を誘導した。非処置（媒質のみ）または対照ヒトIgG4κ抗ヒトCD40抗体（huIgG4）による処置では、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球増殖に対する効果は示されなかった。   As shown in FIG. 15 (mean ± SD), chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 (hu20E5) and human OX40L induced proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA . Treatment with untreated (vehicle only) or control human IgG4κ anti-human CD40 antibody (huIgG4) showed no effect on PHA stimulated human CD134-expressing T lymphocyte proliferation.

（b）．キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5と組換えヒトOX40Lとの組み合わせによる処置後の、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖
PHAで刺激された（10μg／mLで1日間；上記参照）ヒトCD134発現性Tリンパ球を作製した。細胞を採取し、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI培地（Gibco）中に2×10⁶個／mLで懸濁させた。細胞を96ウェル平底プレート（Corning）に0.1×10⁶個／100μL／ウェル（すなわち、1×10⁶個／mL）で播種した上で、0、0.025、0.25、2.5もしくは25.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、および／または0、0.01、0.1または1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体の存在下；R&D Systems）との組み合わせに対して、37℃、5％ CO₂で6日間曝露させた。6日後に、比色定量（BrdU取込み）細胞増殖ELISA（商標）（Roche）およびELISAリーダー（BioRad）をA450nmで用いて細胞増殖を測定した。 (B). Proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA after treatment with a combination of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 and recombinant human OX40L
Human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (10 μg / mL for 1 day; see above) were generated. Cells were harvested and suspended at 2 × 10 ⁶ cells / mL in RPMI medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum (Bodinco) and 50 μg / mL gentamicin (Gibco). Cells are seeded in 96-well flat-bottom plates (Corning) at 0.1 × 10 ⁶ cells / 100 μL / well (ie, 1 × 10 ⁶ cells / mL) and then 0, 0.025, 0.25, 2.5, or 25.0 μg / mL chimera Type human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 and / or 0, 0.01, 0.1 or 1.0 μg / mL polyhistidine-tagged recombinant human OX40L (molar ratio 1: 5 in the presence of mouse anti-polyhistidine antibody; R & D Systems ) For 6 days at 37 ° C. and 5% CO ₂ . After 6 days, cell proliferation was measured using a colorimetric (BrdU incorporation) cell proliferation ELISA ™ (Roche) and ELISA reader (BioRad) at A450 nm.

図16に示されているように（平均±SD）、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5（hu20E5）およびヒトOX40Lは、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球における増殖を用量依存的に誘導した。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、2.5および25μg／mL（ドナー1）、または0.25、2.5および25μg／mL（ドナー2）のいずれかとしてドナー依存的に増殖を誘導した。さらに、ヒトOX40Lも、0.1および1.0μg／mL（ドナー1）または0.01、0.1および1.0μg／mL（ドナー2）のいずれかとしてドナー依存的に増殖を誘導した。   As shown in Figure 16 (mean ± SD), chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 (hu20E5) and human OX40L dose-dependently proliferate in human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA Induced. Chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 induced proliferation in a donor-dependent manner as either 2.5 and 25 μg / mL (donor 1) or 0.25, 2.5 and 25 μg / mL (donor 2). Furthermore, human OX40L also induced proliferation in a donor-dependent manner as either 0.1 and 1.0 μg / mL (donor 1) or 0.01, 0.1 and 1.0 μg / mL (donor 2).

図17に示されているように（平均±SD）、2.5および25μg／mL（またはより低濃度；データは提示せず）のキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5（hu20E5）と、0.1および1.0μg／mL（またはより低濃度；データは提示せず）のヒトOX40Lとの組み合わせは、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球における増殖に対して、相互の（すなわち、相乗的または相加的、またはさらには阻害性）効果を示さなかった。   As shown in FIG. 17 (mean ± SD), 2.5 and 25 μg / mL (or lower concentrations; data not shown) of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 (hu20E5), 0.1 and A combination of 1.0 μg / mL (or lower concentration; data not shown) with human OX40L is reciprocal (ie, synergistic or proliferating) in human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA (Additive or even inhibitory) effect.

（c）．キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5による処置後の、抗ヒトCD3／抗ヒトCD28抗体刺激ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球の増殖
健常ドナー（インフォームドコンセントを得た）由来のヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、Lymphoprep（1.077g／mL；Nycomed）での密度勾配遠心法によって単離した。その後に、PBMCを、96ウェル平底プレート（Corning）に、10％ウシ胎仔血清（Bodinco）および50μg／mLゲンタマイシン（Gibco）を含むRPMI-1640培地（Gibco）中にて0.1×10⁶個／100μL／ウェル（すなわち、1×10⁶個／mL）として播種した上で、ビーズ1個／細胞2個のマウス抗ヒトCD3／マウス抗ヒトCD28抗体刺激ビーズ（CD3／CD28ビーズ；Invitrogen）により、25U／mLの組換えヒトインターロイキン-2（PeproTech）の非存在下または存在下において、37℃、5％ CO₂で刺激した。1日後または2日後に、これらの（インターロイキン-2を加えないか、または加えた）CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球を、25.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または1.0μg／mLのポリヒスチジンタグ標識組換えヒトOX40L（モル比1：5のマウス抗ポリヒスチジン抗体の存在下；R&D Systems）に対して、37℃、5％ CO₂でそれぞれ6日間または5日間曝露させた。CD3／CD28ビーズ＋組換えヒトインターロイキン-2の組み合わせによって最初に刺激した細胞を、細胞増殖測定の1日前に、25U／mLの組換えヒトインターロイキン-2で再び刺激した。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5またはヒトOX40Lに対する6日間または5日間の曝露後に、比色定量（BrdU取込み）細胞増殖ELISA（商標）（Roche）およびELISA（商標）リーダー（BioRad）をA450nmで用いて細胞増殖を測定した。 (C). Proliferation of human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with anti-human CD3 / anti-human CD28 antibody-stimulated beads after treatment with chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 From healthy donor (obtained informed consent) Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated by density gradient centrifugation with Lymphoprep (1.077 g / mL; Nycomed). Thereafter, PBMCs were added to a 96-well flat bottom plate (Corning) in RPMI-1640 medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum (Bodinco) and 50 μg / mL gentamicin (Gibco) at 0.1 × 10 ⁶ cells / 100 μL. / Well (ie, 1 × 10 ⁶ cells / mL) and then 1U / cell 2 mouse anti-human CD3 / mouse anti-human CD28 antibody-stimulated beads (CD3 / CD28 beads; Invitrogen) Stimulation was carried out at 37 ° C. and 5% CO ₂ in the absence or presence of / mL recombinant human interleukin-2 (PeproTech). One or two days later, these CD3 / CD28 bead-stimulated human CD134-expressing T lymphocytes (with or without interleukin-2 added) were challenged with 25.0 μg / mL of chimeric human IgG4κ Human CD134 antibody clone 20E5 or 1.0 μg / mL polyhistidine-tagged recombinant human OX40L (in the presence of mouse anti-polyhistidine antibody at a molar ratio of 1: 5; R & D Systems) at 37 ° C., 5% CO ₂ Each was exposed for 6 or 5 days. Cells initially stimulated with the combination of CD3 / CD28 beads + recombinant human interleukin-2 were re-stimulated with 25 U / mL recombinant human interleukin-2 one day prior to measuring cell proliferation. After 6 or 5 days exposure to chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 or human OX40L, a colorimetric (BrdU incorporation) cell proliferation ELISA ™ (Roche) and ELISA ™ reader (BioRad) were A450nm Was used to measure cell proliferation.

図18に示されているように（平均±SD、n＝3、1件のドナーを使用）、CD3／CD28刺激ビーズは単独で、ヒトCD134発現性Tリンパ球におけるかなりの増殖を誘導したが（すなわち、「培地」）、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5（hu20E5）およびヒトOX40Lは、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球におけるさらなる増殖を誘導した。インターロイキン-2のみの添加は、CD3／CD28ビーズで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球における基礎的（すなわち、「培地」での）増殖を強化すると考えられた。   As shown in FIG. 18 (mean ± SD, n = 3, using one donor), CD3 / CD28 stimulated beads alone induced significant proliferation in human CD134-expressing T lymphocytes. (Ie, “medium”), chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 (hu20E5) and human OX40L induced further proliferation in human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with CD3 / CD28 beads. The addition of interleukin-2 alone was thought to enhance basal (ie, “in medium”) proliferation in human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with CD3 / CD28 beads.

（d）．ヒト（キメラ型）抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5による処置後のアカゲザルにおける免疫賦活性応答
非ヒト霊長動物であるアカゲザルに対して、Weinberg et al.（J Immunother 2006; 29: 575-585）に記載されたように、サル免疫不全ウイルスタンパク質gp130による免疫処置を行うことができる。 (D). Immunostimulatory response in rhesus monkeys after treatment with human (chimeric) anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 Weinberg et al. (J Immunother 2006; 29: 575-585) Immunization with the simian immunodeficiency virus protein gp130 can be performed as described.

ヒト（例えば、キメラ型またはヒト化または免疫原性低下型（deimmunized）；例えば、サブクラスヒトIgG1またはIgG4）抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5による処置を行った免疫処置サルの流入領域リンパ節は、対照免疫処置サルと比較して、肥大したリンパ節を示すと予想される。マウスまたはヒト化12H3抗体または20E5抗体による処置を受けた動物は、対照と比較して、gp130特異的抗体価の増大および持続的なT細胞応答を示すと予想される。処置を受けたサルでは、顕性な毒性徴候はみられないはずである。   The draining lymph nodes of immunized monkeys treated with human (eg, chimeric or humanized or deimmunized; eg, subclass human IgG1 or IgG4) anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 are: It is expected to show enlarged lymph nodes compared to control immunized monkeys. Animals treated with mouse or humanized 12H3 antibody or 20E5 antibody are expected to show increased gp130-specific antibody titers and sustained T cell responses compared to controls. In monkeys treated, there should be no overt signs of toxicity.

実施例8．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5によって認識されるヒトCD134ドメインおよびエピトープの特性決定
（a）．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5と、非還元性および還元性の組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合（ウエスタンブロット法）
プレキャストLDS-PAGE変性電気泳動NuPage（登録商標）Novex（登録商標）システムにて、1300または650ng／レーン（クーマシーブリリアントブルー染色用）または250ng／レーン（ウエスタンブロット法用）の組換えヒトCD134：ヒトFcγ（IgG1）融合タンパク質（R&D Systems）を、種々の非還元条件下および還元条件下（図19-A参照）で、4〜12％ Tris-BisゲルおよびMOPS泳動緩衝液（Invitrogen）を用いて電気泳動した。続いて、組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質をクーマシーブリリアントブルー（BioRad）で染色するか、またはポリビニリデンフロリド（PDVF）転写膜（Millipore）に対してエレクトロブロットした。PBS／0.05％ Tween 20／1％ BSA画分V（Roche）により室温で20分間ブロックした後に、PDVF膜を100ng／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3または20E5とともに室温で1時間インキュベートした。並行して、100ng／mLのマウスIgG1κアイソタイプ対照抗体（BD Biosciences）を陰性対照として用いた。PBS／0.05％ Tween 20での十分な洗浄後に、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3または20E5の結合を、1：5000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスFcγ特異的抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに室温で1時間おいた後に、比色定量検出用のTMB基質（Sigma）の使用準備済み溶液によって判定した。 Example 8. Characterization of human CD134 domains and epitopes recognized by mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 (a). Binding of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 to non-reducing and reducing recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein (Western blotting)
Recombinant human CD134 at 1300 or 650 ng / lane (for Coomassie brilliant blue staining) or 250 ng / lane (for western blotting) on a precast LDS-PAGE denaturing electrophoresis NuPage® Novex® system: Human Fcγ (IgG1) fusion protein (R & D Systems) using 4-12% Tris-Bis gel and MOPS running buffer (Invitrogen) under various non-reducing and reducing conditions (see Figure 19-A) Electrophoresis. Subsequently, recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein was stained with Coomassie Brilliant Blue (BioRad) or electroblotted to a polyvinylidene fluoride (PDVF) transfer membrane (Millipore). After blocking with PBS / 0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 20 minutes at room temperature, the PDVF membrane was incubated with 100 ng / mL mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 or 20E5 for 1 hour at room temperature. In parallel, 100 ng / mL mouse IgG1κ isotype control antibody (BD Biosciences) was used as a negative control. After extensive washing with PBS / 0.05% Tween 20, binding of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 or 20E5 was performed at room temperature with horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse Fcγ specific antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 5000. 1 hour later, determined by ready-to-use solution of TMB substrate (Sigma) for colorimetric detection.

図19-Bに示されているように、非還元性（かつ熱変性を伴わないかまたは伴うLDS変性、それぞれ条件aおよびb）条件下での組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質は、約130〜140kDaの分子質量を示した。加熱を伴わない非還元（条件a）では、近接する2本のバンドが示され、このことから組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質の画分が不完全に変性／アンフォールディングしていることが示唆された。加熱を伴う非還元（条件b）では1本のバンドが示され、このことから組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質が完全に変性／アンフォールディングしていることが示唆された。還元性（かつ熱変性を伴わないかまたは伴うLDS変性、それぞれ条件cおよびd）条件下での組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質では、約110kDa（条件c）および約60〜65kDa（条件d）のバンドが得られた。前者の観察所見からは組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質の不完全な還元が示唆され、後者の観察所見からは、完全な還元／各組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質分子における2つのヒトIgG1由来Fcγ断片を接続するジスルフィド架橋の分断が示唆された。   As shown in FIG. 19-B, recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein under non-reducing (and LDS denaturation with or without heat denaturation, conditions a and b, respectively) is approximately It showed a molecular mass of 130-140 kDa. Non-reduction without heating (condition a) shows two adjacent bands, indicating that the fraction of recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein is incompletely denatured / unfolded. It was suggested. Non-reduction with heating (condition b) showed a single band, suggesting that the recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein was completely denatured / unfolded. Recombinant human CD134 under reducing conditions (and LDS denaturation with or without heat denaturation, conditions c and d respectively): about 110 kDa (condition c) and about 60-65 kDa (condition d) for the human Fcγ fusion protein ) Band was obtained. The former observation suggests incomplete reduction of recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein, and the latter observation indicates complete reduction / two humans in each recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein molecule. It was suggested that the disulfide bridge connecting the IgG1-derived Fcγ fragments was broken.

図19-Cに示されているように、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5はいずれも、非還元性（かつ熱変性を伴わないかまたは伴うLDS変性、それぞれ条件aおよびb）条件下にある組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質を、主として約130kDaで認識した。対照的に、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3は、還元性（かつ熱変性を伴わないかまたは伴うLDS変性、それぞれ条件cおよびd）条件下にある組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質とはごくわずかな結合しか示さなかったが、一方、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、還元性（かつ熱変性を伴わないかまたは伴うLDS変性、それぞれ条件cおよびd）条件下にある組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との強い結合を示した。   As shown in Figure 19-C, mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 are both non-reducing (and LDS denaturation with or without heat denaturation, conditions a and b, respectively). Recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein was recognized primarily at about 130 kDa. In contrast, the mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 is very unlike recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein under reducing (and LDS denaturation with or without heat denaturation, conditions c and d, respectively) conditions. The mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 showed little binding, whereas the recombinant human CD134 under reducing (and LDS denaturation with or without heat denaturation, conditions c and d, respectively): It showed strong binding with human Fcγ fusion protein.

これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5はヒトCD134を認識することが実証された。その上、これらの結果から、還元（かつ熱変性を伴うかまたは伴わないLDS変性）条件下にある組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質に対するそれぞれの軽微な結合（クローン12H3）および強い結合（クローン20E5）によって立証されたように、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびクローン20E5は類似性のないヒトCD134エピトープも認識していると考えられることも実証された。これらの結果から、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3が、変性（LDSおよび熱処理）に対する感受性はないが還元（すなわち、DTTによる、システインリッチドメイン（CRD）関連のジスルフィド架橋の分断による可能性が高い）に対しては感受性のある、ヒトCD134上のエピトープを認識したことが示唆された。これらの結果から、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、変性（LDSおよび熱処理）に対する感受性がなく、しかも還元（すなわち、DTTによる、CRD関連のジスルフィド架橋の分断による可能性が高い）に対しても感受性のない、ヒトCD134上のエピトープを認識したことが示唆された。   These results demonstrated that mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 recognize human CD134. In addition, these results indicate that the respective minor binding (clone 12H3) and strong binding (clone to the recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein under reducing (and LDS denaturation with or without heat denaturation) conditions. It was also demonstrated that mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and clone 20E5 are thought to also recognize dissimilar human CD134 epitopes, as demonstrated by 20E5). These results indicate that mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 is not sensitive to denaturation (LDS and heat treatment) but is reduced (ie, likely due to disruption of cysteine-rich domain (CRD) -related disulfide bridges by DTT). It was suggested that they recognized a sensitive epitope on human CD134. These results indicate that mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 is not sensitive to denaturation (LDS and heat treatment) and is also likely to be reduced (ie, likely due to disruption of CRD-related disulfide bridges by DTT). It was suggested that an insensitive epitope on human CD134 was recognized.

（b）．マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5と、293-F細胞株上で発現される完全長ヒトCD134構築物およびさまざまな短縮型ヒトCD134構築物との結合（ドメインマッピング）
マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の詳細な特異性を分析する目的で、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5によって認識されるエピトープの位置を、ドメインマッピングによって決定した。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5が、（HEK由来）297-F細胞の表面上に発現された短縮型ヒトCD134構築物と結合する能力を、FACS分析によって判定した。 (B). Binding of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 to full-length human CD134 constructs and various truncated human CD134 constructs expressed on the 293-F cell line (domain mapping)
In order to analyze the detailed specificity of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5, the location of the epitope recognized by mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 was determined by domain mapping. The ability of the mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 to bind to the truncated human CD134 construct expressed on the surface of (HEK-derived) 297-F cells was determined by FACS analysis.

文献（Swiss-Prot: P43489.1；Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683；Bodmer et al. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26；Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330；米国特許出願第2011/0028688 A1号）に基づき、ヒトCD134の細胞外領域におけるシステインリッチドメイン（CRD）およびヒンジ様構造を同定した。CRDは、CRD1、CRD2、（短縮型）CRD3、（短縮型）CRD4と符号化されている（図20参照）。CRDは、A-モジュールおよびB-モジュールと呼ばれる、位相幾何学的に異なる種類のモジュールを有する（図20も参照）。A-モジュールはC字状構造であり、B-モジュールはS字状構造である。典型的なCRDは通常、6個の保存的なシステイン残基を有するA1-B2-モジュールまたはA2-B1-モジュール（または、頻度は低いが、A1-B1のような異なるモジュールの対）で構成され、ここで数字は各モジュール内のジスルフィド架橋の数を表している（図20も参照）。図20に示されているように、5種の異なるヒトCD134構築物を作製して、発現させた：（1）完全長ヒトCD134構築物、これはN末端CRD1に始まり（すなわち、CRD1 A1-B2-モジュールはアミノ酸29〜65をカバーする）、このため「CRD1」と表記され、アミノ酸1〜277で構成される（SEQ ID NO. 1参照）、（2）「CRD2」構築物、これはN末端CRD2で始まり（すなわち、CRD2 A1-B2-モジュールはアミノ酸66〜107をカバーする）、アミノ酸66〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO. 30参照）、（3）「CRD3」構築物、これはN末端CRD3で始まり（すなわち、CRD3 A1-B1-モジュールはアミノ酸108〜146をカバーする（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330による）か、または短縮型CRD3 A1-モジュールはアミノ酸108〜126をカバーし（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683）による）、アミノ酸108〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO. 31参照）、（4）「CRD4」構築物、これはN末端CRD4またはCRD3サブドメインB1-モジュール／短縮型CRD4 A1-モジュールからなる（すなわち、CRD4 A1-B1-モジュールはアミノ酸127〜167をカバーする（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683）か、またはCRD3サブドメインB1-モジュールと短縮型CRD4 A1-モジュールとの組み合わせ（図20には示されていない）がそれぞれアミノ酸127〜146およびアミノ酸147〜167をカバーし（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330））、アミノ酸127〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO. 32参照）、および（5）「短縮型（tc）CRD4」構築物、これはN末端短縮型CRD4またはCRD4サブドメインB1-モジュール（すなわち、短縮型CRD4 A1-モジュールがアミノ酸147〜167をカバーする（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330）またはCRD4サブドメインB1-モジュール（図20には示されていない；Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683）がアミノ酸147〜167をカバーする）からなり、アミノ酸147〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO. 33参照）。Accuprime（商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を用いたアセンブリPCRにより、これらの5種のヒトCD134構築物を、以下の表に示したプライマーを用いて作製した。

* プライマー番号はBioceros社の内部符号方式による Literature (Swiss-Prot: P43489.1; Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683; Bodmer et al. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26; Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321 -1330; US Patent Application No. 2011/0028688 A1), cysteine-rich domains (CRD) and hinge-like structures in the extracellular region of human CD134 were identified. CRD is encoded as CRD1, CRD2, (shortened) CRD3, and (shortened) CRD4 (see FIG. 20). The CRD has topologically different types of modules called A-modules and B-modules (see also FIG. 20). The A-module has a C-shaped structure, and the B-module has an S-shaped structure. A typical CRD usually consists of an A1-B2-module or A2-B1-module (or a lesser pair of different modules like A1-B1) with 6 conserved cysteine residues Where the numbers represent the number of disulfide bridges within each module (see also FIG. 20). As shown in FIG. 20, five different human CD134 constructs were generated and expressed: (1) full-length human CD134 construct, which begins at the N-terminal CRD1 (ie, CRD1 A1-B2- Module covers amino acids 29-65) and is therefore designated as “CRD1” and is composed of amino acids 1-277 (see SEQ ID NO. 1), (2) “CRD2” construct, which is N-terminal CRD2 (Ie, the CRD2 A1-B2-module covers amino acids 66-107) and consists of amino acid 66-277 linked to signal peptide amino acids 1-28 (see SEQ ID NO. 30), (3) “CRD3” construct, which begins with an N-terminal CRD3 (ie, the CRD3 A1-B1-module covers amino acids 108-146 (Compaan et al. Structure 2006; according to 14: 1321-1330)), or The truncated CRD3 A1-module covers amino acids 108-126 (Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-68 3)), consisting of amino acid 108-277 linked to signal peptide amino acid 1-28 (see SEQ ID NO. 31), (4) “CRD4” construct, which is N-terminal CRD4 or CRD3 sub Consists of domain B1-module / shortened CRD4 A1-module (ie, CRD4 A1-B1-module covers amino acids 127-167 (Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) or CRD3 The combination of subdomain B1-module and truncated CRD4 A1-module (not shown in FIG. 20) covers amino acids 127-146 and amino acids 147-167, respectively (Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321 -1330)), consisting of amino acid 127-277 linked to signal peptide amino acids 1-28 (see SEQ ID NO. 32), and (5) “truncated (tc) CRD4” construct, N-terminal truncated CRD4 or CRD4 subdomain B1-module That is, the truncated CRD4 A1-module covers amino acids 147-167 (Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330) or the CRD4 subdomain B1-module (not shown in FIG. 20; Latza et al. al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) covers amino acids 147 to 167), and is composed of amino acid 147 to 277 and signal peptide amino acids 1 to 28 linked (SEQ ID NO. 33). These five human CD134 constructs were generated by assembly PCR using Accuprime ™ Pfx DNA polymerase (Invitrogen) using the primers shown in the table below.

* Primer numbers are based on Bioceros' internal code system

手短に述べると、シグナルペプチドのアミノ酸1〜28をコードするcDNAおよびヒトCD134のアミノ酸66〜277をコードするcDNAを、それぞれプライマー対362／365および364／363を用い、完全長ヒトCD134をテンプレートとして用いるPCR反応において増幅させた。その後に、これらの2種のPCR産物を、プライマー対362／363を用いるアセンブリPCRにおいて、「CRD2」構築物を作製した。「CRD2」構築物をコードするcDNAを、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中に、適した制限部位を用いてサブクローニングした。同様に、「CRD3」構築物（シグナルペプチドのアミノ酸1〜28にヒトCD134のアミノ酸108〜277が連結されたもの）、「CRD4」構築物（シグナルペプチドのアミノ酸1〜28にアミノ酸127〜277が連結されたもの）および「短縮型CRD4」構築物（シグナルペプチドのアミノ酸1〜28にアミノ酸147〜277が連結されたもの）を作製し、上述の表に示された対応するプライマーを用いて、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中にサブクローニングした。さらに、完全長ヒトCD134（SEQ ID NO. 1）も、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中に再びクローニングした。   Briefly, a cDNA encoding amino acids 1-28 of the signal peptide and a cDNA encoding amino acids 66-277 of human CD134 were used with primer pairs 362/365 and 364/363, respectively, using full-length human CD134 as a template. Amplified in the PCR reaction used. Subsequently, these two PCR products were assembled into a “CRD2” construct in assembly PCR using primer pair 362/363. The cDNA encoding the “CRD2” construct was subcloned into the expression plasmid from pcDNA3.1 using the appropriate restriction sites. Similarly, "CRD3" construct (amino acids 108-277 of human CD134 linked to amino acids 1-28 of the signal peptide), "CRD4" construct (amino acids 127-277 linked to amino acids 1-28 of the signal peptide) And a “shortened CRD4” construct (amino acids 147 to 277 linked to amino acids 1 to 28 of the signal peptide) and pcDNA3.1 using the corresponding primers shown in the table above Subcloned into the derived expression plasmid. In addition, full-length human CD134 (SEQ ID NO. 1) was also cloned again into an expression plasmid derived from pcDNA3.1.

FreeStyle（商標）293 Expression System（Invitrogen）を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞（Invitrogen）に対して、作製したヒトCD134の5種類の変異体を一過性に形質移入した。48〜72時間後に、形質移入細胞上での表面ヒトCD134発現をFACS分析によって分析した。この目的に向けて、形質移入細胞を採取し、氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を20.0μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5とともに4℃で30分間インキュベートした。並行して、20.0μg／mLのマウスIgG1κアイソタイプ対照抗体（BD Biosciences）を陰性対照として用いた。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN₃中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 Using the FreeStyle (trademark) 293 Expression System (Invitrogen), FreeStyle (trademark) 293-F cells (Invitrogen) were transiently transfected with the prepared five human CD134 mutants. After 48-72 hours, surface human CD134 expression on transfected cells was analyzed by FACS analysis. For this purpose, transfected cells were harvested and placed at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ . The cells were incubated with 20.0 μg / mL mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 at 4 ° C. for 30 minutes. In parallel, 20.0 μg / mL mouse IgG1κ isotype control antibody (BD Biosciences) was used as a negative control. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were incubated with PE-conjugated goat anti-mouse IgG (Fcγ specific) antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 200 for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formamide for 30 minutes at 4 ° C. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図21に示されているように、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5は両方とも、形質移入された293-F細胞上の完全長（「CRD1」構築物と表記）ヒトCD134を認識したが、一方、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5は両方とも、モックプラスミドを形質移入した293-F細胞上では結合を示さなかった。さらに、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5は、形質移入した293-F細胞上の、CRD1およびCRD1-CRD2を欠く短縮型ヒトCD134変異体（それぞれ「CRD2」構築物および「CRD3」構築物と表記）も認識した。対照的に、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）に対するマウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の結合は極めて弱く、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）を欠くか、または代替的にCRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による；「tcCRD4」構築物と表記）を欠く短縮型ヒトCD134変異体に対するマウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3の結合は全く存在しなかったが、一方、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）、およびCRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）または代替的にCRD 1-CRD2-CRD3 A1-B1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による；「tcCRD4」構築物と表記）を欠く短縮型ヒトCD134変異体に対して強い結合を示した。   As shown in FIG. 21, both mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 recognized full-length (denoted “CRD1” construct) human CD134 on transfected 293-F cells, On the other hand, both mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 showed no binding on 293-F cells transfected with the mock plasmid. In addition, mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 are truncated human CD134 mutants lacking CRD1 and CRD1-CRD2 on the transfected 293-F cells (referred to as “CRD2” and “CRD3” constructs, respectively). Also recognized. In contrast, the mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 binds very weakly to the truncated human CD134 mutant lacking the CRD1-CRD2-shortened CRD3 A1-module (denoted as “CRD4” construct) and the CRD1-CRD2-shortened form Lacks CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (as defined by Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) or alternatively CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-module (Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330 as defined; labeled as “tcCRD4” construct), but there was no binding of mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 to a truncated human CD134 variant, Mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 is a truncated human CD134 variant lacking the CRD1-CRD2-shortened CRD3 A1-module (designated as “CRD4” construct), and the CRD1-CRD2-shortened CRD3 A1-module-CRD4 sub Domain A1-module (Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683 Abbreviated human CD134 variants lacking CRD 1-CRD2-CRD3 A1-B1-module (as defined by Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330; labeled “tcCRD4” construct) Strong bond to

これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5が、ヒトCD134を特異的に認識することが実証された（完全長ヒトCD134形質移入とモックプラスミド形質移入との比較）。さらに、これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5は、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）を欠くか、または代替的にCRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による；「tcCRD4」構築物と表記）を欠く短縮型ヒトCD134変異体に対する、それぞれの結合の欠如（クローン12H3を用いた場合）と強い結合（クローン20E5を用いた場合）との対比によって立証されるように、類似性のないヒトCD134エピトープを認識していると考えられることも実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3がCRD1およびCRD2におけるヒトCD134エピトープを認識しないと考えられること、ならびにマウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5が、CRD1、CRD2および短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）または代替的にCRD 1-CRD2-CRD3 A1-B1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による）におけるヒトCD134エピトープを認識しないと考えられることも実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3は、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108〜126（すなわち、19-merペプチド

；SEQ ID NO. 34参照）有する短縮型CRD3 A1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）における直鎖状もしくは非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられること、あるいは、アミノ酸配列108〜126（すなわち、19-merペプチド

；SEQ ID NO. 34参照）が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108-214（SEQ ID NO. 35参照）を有する、短縮型CRD3 A1-モジュール／CRD4 A1-B1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）そしておそらくはヒンジ様構造における非直鎖状／高次構造性エピトープとの結合のための一部を形成していることが実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列147-214（SEQ ID NO. 36）を有する、短縮型CRD4 A1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による）そしておそらくはヒンジ様構造における直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられることが実証された。 These results demonstrated that mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 specifically recognize human CD134 (comparison between full-length human CD134 transfection and mock plasmid transfection). Furthermore, these results indicate that mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 are a truncated human CD134 mutant lacking the CRD1-CRD2-shortened CRD3 A1-module (denoted as “CRD4” construct), CRD1-CRD2-shortened Lacks type CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (as defined by Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) or alternatively CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-module ( Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330 as defined; labeled “tcCRD4” construct) and lack of their respective binding (when using clone 12H3) and strong binding (denoted with clone 12H3) It was also demonstrated that it is believed to recognize a dissimilar human CD134 epitope, as demonstrated by contrast with clone 20E5). These results indicate that mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 does not recognize the human CD134 epitope in CRD1 and CRD2, and that mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 is CRD1, CRD2 and truncated CRD3 A1-module-CRD4 Subdomain A1-module (as defined by Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) or alternatively CRD 1-CRD2-CRD3 A1-B1-module (Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321 It has also been demonstrated that it does not appear to recognize the human CD134 epitope (as defined by -1330). These results indicate that mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 has amino acid sequence 108-126 (ie, 19-mer peptide) on extracellular human CD134.

; See SEQ ID NO. 34) a linear or non-linear / conformational epitope in a truncated CRD3 A1-module (as defined by Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) The amino acid sequence 108-126 (ie 19-mer peptide)

; SEQ ID NO. 34) has the amino acid sequence 108-214 on extracellular human CD134 (see SEQ ID NO. 35), a truncated CRD3 A1-module / CRD4 A1-B1-module (Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: as defined by 677-683) and possibly forming part of the hinge-like structure for binding to non-linear / conformal epitopes. These results indicate that mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 has a truncated CRD4 A1-module (Compaan et al. Structure 2006; 14) having the amino acid sequence 147-214 (SEQ ID NO. 36) on extracellular human CD134. : According to the definition of 1321-1330) and possibly proved to recognize linear or non-linear / conformational epitopes in hinge-like structures.

最近、Compaan et al.（Structure 2006; 14: 1321-1330）は、結晶学を利用して、OX40リガンド（CD252）／CD134（＝OX40）相互作用に際しての、ヒトCD134上のCRD1、CRD2（特にA1ループおよびその直後の残基）およびCRD3（主としてA1ループ）の決定的な関与を明らかにした。この発見は、（1、上記参照）マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、細胞外ヒトCD134上の、CRD1、CRD2および短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: 677-683の定義による）におけるヒトCD134エピトープも、または代替的にCRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-モジュール（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330の定義による）も認識しないと考えられること、ならびに（2、上記参照）マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上でヒトOX40Lと同時に結合したという、本発明者らの知見とよく一致する。このことにより、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、ヒトCD134とヒトOX40Lとの相互作用に決定的には関与しないヒトCD134上のエピトープを認識することが示唆された。さらに、（1、上記参照）マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3は、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108-126（すなわち、19-merペプチド

；SEQ ID NO. 34参照）を有する短縮型CRD3 A1-モジュール（Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: 677-683の定義による）における直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられること、あるいは、アミノ酸配列108〜126（すなわち、19-merペプチド

；SEQ ID NO. 34参照）が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108-214（SEQ ID NO. 35参照）を有する、短縮型CRD3 A1-モジュール／CRD4 A1-B1-モジュール（Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: 677-683の定義による）そしておそらくはヒンジ様構造における、非直鎖状／高次構造性エピトープとの結合のための一部を形成していること、ならびに（2、上記参照）マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3は、PHAで刺激されたヒトCD134発現性Tリンパ球上でヒトOX40Lと同時に結合したという本発明者らの知見は、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3によって認識されるヒトCD134上のエピトープ（上記の通り）が、ヒトCD134とヒトOX40Lとの相互作用に決定的には関与しないという考え方を裏づけるものである。 Recently, Compaan et al. (Structure 2006; 14: 1321-1330), using crystallography, CRD1, CRD2 (particularly on human CD134) during the OX40 ligand (CD252) / CD134 (= OX40) interaction. The critical involvement of the A1 loop and the immediate residues) and CRD3 (mainly the A1 loop) was revealed. This finding is based on (1, see above) mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5, CRD1, CRD2 and truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (Latza et al. Eur JImmunol) on extracellular human CD134 1994; 24: as defined by 24: 677-683) or alternatively CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-module (as defined by Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330) And (2; see above) Our findings that mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 bound simultaneously with human OX40L on human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA Matches well. This suggested that mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 recognizes an epitope on human CD134 that is not critically involved in the interaction between human CD134 and human OX40L. In addition, (1, see above) the mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 has the amino acid sequence 108-126 (ie, 19-mer peptide) on extracellular human CD134.

A linear or non-linear / conformational epitope in a truncated CRD3 A1-module (see definition of Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: 677-683) with SEQ ID NO. 34) The amino acid sequence 108-126 (ie 19-mer peptide)

; SEQ ID NO. 34) has the amino acid sequence 108-214 on extracellular human CD134 (see SEQ ID NO. 35), a truncated CRD3 A1-module / CRD4 A1-B1-module (Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: as defined by 677-683) and possibly forming part of the hinge-like structure for binding to non-linear / conformal epitopes, and (2, above Reference) Our finding that mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 bound simultaneously with human OX40L on human CD134-expressing T lymphocytes stimulated with PHA was recognized by mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 This supports the idea that the epitope on human CD134 (as described above) is not critically involved in the interaction between human CD134 and human OX40L.

（c）．ヒトCD134由来ペプチドELISAを用いたマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のエピトープマッピング（1）
マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の詳細な特異性をさらに分析する目的で、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3によって認識されるエピトープの位置をエピトープマッピングによって決定した。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3が、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: 677-683の定義による）のアミノ酸配列に対応するヒトCD134由来ペプチドと結合する能力を、ELISAによって判定した。 (C). Epitope mapping of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 using human CD134-derived peptide ELISA (1)
In order to further analyze the detailed specificity of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3, the location of the epitope recognized by mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 was determined by epitope mapping. Mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 is derived from human CD134 corresponding to the amino acid sequence of truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (as defined by Latza et al. Eur JImmunol 1994; 24: 677-683) The ability to bind to the peptide was determined by ELISA.

96ウェル平底ELISAプレート（Corning）に、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュールのアミノ酸配列（SEQ ID NO. 38参照）に対応するヒトCD134由来ペプチド（Pepscan Presto, Lelystad, Netherlandsにより合成）を10ng／ウェルで、またはエキストラIII型構造ドメインのアミノ酸配列（SEQ ID NO. 37参照）に対応するヒトフィブロネクチン由来対照ペプチド（Pepscan Presto, Lelystad, Netherlandsにより合成）を10ng／ウェルで、PBS中にて4℃で終夜コーティングした。PBS／0.05％ Tween 20での十分な洗浄後に、プレートをPBS／0.05％ Tween 20／1％ BSA画分V（Roche）により室温で1時間かけてブロックした。その後に、プレートを0、0.00005〜50.0（ブロック用緩衝液中での10倍希釈系列）μg／mLのマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3またはマウスIgG1κアイソタイプ対照抗体（BD Biosciences）とともに室温で1時間インキュベートした。PBS／0.05％ Tween 20での十分な洗浄後に、抗体の結合を、1：5000希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG Fcγ特異的抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに室温で1時間おいた後に、比色定量検出用のTMB基質（Invitrogen）の使用準備済み溶液によって判定した。1M H₂SO₄を添加した後に、波長450nm（参照波長655nm）での光学密度を、マイクロプレートリーダー（BioRad）を用いて測定した。 Synthesized by human CD134 peptide (Pepscan Presto, Lelystad, Netherlands) corresponding to the amino acid sequence of the truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (see SEQ ID NO. 38) on a 96-well flat bottom ELISA plate (Corning) ) At 10 ng / well or human fibronectin-derived control peptide (synthesized by Pepscan Presto, Lelystad, Netherlands) corresponding to the amino acid sequence of the extra type III structural domain (see SEQ ID NO. 37) in PBS at 10 ng / well At 4 ° C overnight. After extensive washing with PBS / 0.05% Tween 20, the plates were blocked with PBS / 0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 1 hour at room temperature. The plate is then placed with 0, 0.00005-50.0 (10-fold dilution series in blocking buffer) μg / mL mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 or mouse IgG1κ isotype control antibody (BD Biosciences) for 1 hour at room temperature. Incubated. After extensive washing with PBS / 0.05% Tween 20, antibody binding was followed by colorimetry after 1 hour at room temperature with horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG Fcγ specific antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 5000. Judged by ready-to-use solution of TMB substrate (Invitrogen) for quantitative detection. After adding 1M H ₂ SO ₄ , the optical density at a wavelength of 450 nm (reference wavelength 655 nm) was measured using a microplate reader (BioRad).

図23-A（n＝1）に示されているように、マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3はヒトCD134由来ペプチドと用量依存的かつ特異的に結合したが、一方、マウスIgG1κアイソタイプ対照抗体はヒトCD134由来ペプチドとの結合を示さなかった。マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3およびIgG1κアイソタイプ対照抗体はいずれも、ヒトフィブロネクチン由来対照ペプチドとの結合を示さなかった。   As shown in FIG. 23-A (n = 1), mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 bound to human CD134-derived peptide in a dose-dependent and specific manner, whereas mouse IgG1κ isotype control antibody No binding to human CD134-derived peptide was shown. Neither the mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 nor the IgG1κ isotype control antibody showed binding to the human fibronectin-derived control peptide.

これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3がヒトCD134上のエピトープを特異的に認識したことが実証された（ヒトCD134由来ペプチドとヒトフィブロネクチン由来対照ペプチドとの比較）。さらに、これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108〜146（すなわち、39-merペプチド

；SEQ ID NO. 38参照）を有する、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）における直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられることも実証された。 These results demonstrated that mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 specifically recognized an epitope on human CD134 (comparison between human CD134-derived peptide and human fibronectin-derived control peptide). Furthermore, these results indicate that the mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 has an amino acid sequence of 108-146 (ie, a 39-mer peptide on extracellular human CD134).

Linear or indirect in the truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (as defined in Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) with SEQ ID NO. 38) It has also been demonstrated that it is believed to recognize chain / conformational epitopes.

（d）．PepscanによるCLIPSエピトープマッピング技術を用いたマウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5のエピトープマッピング（2）
Pepscan（Lelystad, Netherlands）によるCLIPSエピトープマッピング技術を、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5によって認識されるエピトープの決定に用いることができる。このCLIPS技術は、二量体性または多量体性タンパク質複合体に含まれる直鎖状の、高次構造性の、不連続的な、および複雑なエピトープの決定を可能にする。これを目的として、ヒトCD134の直鎖状アミノ酸配列＝OX40（SEQ ID NO. 1）を標的タンパク質として用いた。 (D). Epitope mapping of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 using CLIP epitope mapping technology by Pepscan (2)
The CLIPS epitope mapping technique by Pepscan (Lelystad, Netherlands) can be used to determine the epitope recognized by mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5. This CLIPS technology allows the determination of linear, conformational, discontinuous and complex epitopes contained in dimeric or multimeric protein complexes. For this purpose, the linear amino acid sequence of human CD134 = OX40 (SEQ ID NO. 1) was used as the target protein.

実施例9．キメラ型ヒトIgG4／κおよび／またはIgG1／κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5によって認識されるヒトCD134ドメインおよびエピトープの特性決定
（a）．キメラ型ヒトIgG4κおよび／またはIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5と、293-F細胞株上で発現される完全長ヒトCD134構築物およびさまざまな短縮型ヒトCD134構築物との結合（ドメインマッピング）
キメラ型ヒトIgG4κおよび／またはIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の詳細な特異性を分析する目的で、キメラ型ヒトIgG4κおよび／またはIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5によって認識されるエピトープの位置を、ドメインマッピングによって決定した。キメラ型ヒトIgG4κおよび／またはIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5が、（HEK由来）297-F細胞の表面上に発現された短縮型ヒトCD134構築物（上記の実施例8（b）参照）と結合する能力を、FACS分析によって判定した。 Example 9 Characterization of human CD134 domains and epitopes recognized by chimeric human IgG4 / κ and / or IgG1 / κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 (a). Binding of chimeric human IgG4κ and / or IgG1κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 to full-length human CD134 constructs and various truncated human CD134 constructs expressed on the 293-F cell line (domain mapping)
Epitope recognized by chimeric human IgG4κ and / or IgG1κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 for the purpose of analyzing the detailed specificity of chimeric human IgG4κ and / or IgG1κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 The position of was determined by domain mapping. A truncated human CD134 construct in which chimeric human IgG4κ and / or IgG1κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 were expressed on the surface of 297-F cells (from HEK) (see Example 8 (b) above) The ability to bind to was determined by FACS analysis.

FreeStyle（商標）293 Expression System（Invitrogen）を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞（Invitrogen）に対して、作製したヒトCD134の5種類の変異体を一過性に形質移入した（上記参照）。48〜72時間後に、形質移入細胞上での表面ヒトCD134発現をFACS分析によって分析した。この目的に向けて、形質移入細胞を採取し、氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、20.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κならびに／またはIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5を伴うかまたは伴わずに、4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、1：200希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃での十分な洗浄後に、細胞を、2％ホルムアミドを含むPBS／BSA／NaN₃中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合はフローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 Using FreeStyle (TM) 293 Expression System (Invitrogen), FreeStyle (TM) 293-F cells (Invitrogen) were transiently transfected with the five human CD134 variants produced (see above) ). After 48-72 hours, surface human CD134 expression on transfected cells was analyzed by FACS analysis. For this purpose, transfected cells were harvested and placed at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ . Cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C. with or without 20.0 μg / mL chimeric human IgG4κ and / or IgG1κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were incubated with PE-conjugated goat anti-mouse IgG (Fcγ specific) antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 200 for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing with PBS / BSA / NaN ₃ , cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formamide for 30 minutes at 4 ° C. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図22に示されているように、キメラ型ヒトIgG4κおよびIgG1κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3ならびにキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5は、形質移入細胞上のさまざまな短縮型ヒトCD134構築物に対する結合特性を示し、それらの結合特性はそれらの対応する親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5対応物と同一であった（上記の実施例8（b）参照；比較については、図22と図21と対比して参照されたい）。   As shown in FIG. 22, chimeric human IgG4κ and IgG1κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 20E5 are against various truncated human CD134 constructs on transfected cells. The binding properties were identical and their binding properties were identical to their corresponding parent mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 counterparts (see Example 8 (b) above; see FIG. 22 and FIG. (Refer to 21).

（b）．ヒトCD134由来ペプチドELISAを用いたキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のエピトープマッピング
キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の詳細な特異性をさらに分析する目的で、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3によって認識されるエピトープの位置をエピトープマッピングによって決定した。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3が、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）のアミノ酸配列に対応するヒトCD134由来ペプチドと結合する能力を、ELISAによって判定した。 (B). Epitope mapping of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 using human CD134-derived peptide ELISA In order to further analyze the detailed specificity of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3, chimeric human IgG4κ anti-antibody The location of the epitope recognized by human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 was determined by epitope mapping. The chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 corresponds to the amino acid sequence of the truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (as defined by Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) The ability to bind to human CD134-derived peptides was determined by ELISA.

96ウェル平底ELISAプレート（Corning）に、短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュールのアミノ酸配列（SEQ ID NO. 38参照）に対応するヒトCD134由来ペプチド（Pepscan Presto, Lelystad, Netherlandsにより合成）を10ng／ウェルで、またはエキストラIII型構造ドメインのアミノ酸配列（SEQ ID NO. 37参照）に対応するヒトフィブロネクチン由来対照ペプチド（Pepscan Presto, Lelystad, Netherlandsにより合成）を10ng／ウェルで、PBS中にて4℃で終夜コーティングした。PBS／0.05％ Tween 20での十分な洗浄後に、プレートをPBS／0.05％ Tween 20／1％ BSA画分V（Roche）により室温で1時間かけてブロックした。その後に、プレートを0、0.00005〜50.0（ブロック用緩衝液中での10倍希釈系列）μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3または対照ヒトIgG4κ抗ヒトCD40抗体（Biocult）とともに室温で1時間インキュベートした。PBS／0.05％ Tween 20での十分な洗浄後に、抗体の結合を、1：5000希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG Fcγ特異的抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに室温で1時間おいた後に、比色定量検出用のTMB基質（Invitrogen）の使用準備済み溶液によって判定した。1M H₂SO₄を添加した後に、波長450nm（参照波長655nm）での光学密度をマイクロプレートリーダー（BioRad）を用いて測定した。 Synthesized by human CD134 peptide (Pepscan Presto, Lelystad, Netherlands) corresponding to the amino acid sequence of the truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (see SEQ ID NO. 38) on a 96-well flat bottom ELISA plate (Corning) ) At 10 ng / well or human fibronectin-derived control peptide (synthesized by Pepscan Presto, Lelystad, Netherlands) corresponding to the amino acid sequence of the extra type III structural domain (see SEQ ID NO. 37) in PBS at 10 ng / well At 4 ° C overnight. After extensive washing with PBS / 0.05% Tween 20, the plates were blocked with PBS / 0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 1 hour at room temperature. Then plate with 0, 0.00005-50.0 (10-fold dilution series in blocking buffer) μg / mL of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 or control human IgG4κ anti-human CD40 antibody (Biocult) Incubated for 1 hour at room temperature. After extensive washing with PBS / 0.05% Tween 20, antibody binding was followed by colorimetry after 1 hour at room temperature with horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG Fcγ specific antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 5000. Judged by ready-to-use solution of TMB substrate (Invitrogen) for quantitative detection. After adding 1M H ₂ SO ₄ , the optical density at a wavelength of 450 nm (reference wavelength 655 nm) was measured using a microplate reader (BioRad).

図23B（n＝1）に示されているように、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3はヒトCD134由来ペプチドと用量依存的かつ特異的に結合したが、一方、対照ヒトIgG4κ抗ヒトCD40抗体はヒトCD134由来ペプチドとの結合を示さなかった。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および対照ヒトIgG4κ抗ヒトCD40抗体はいずれも、ヒトフィブロネクチン由来対照ペプチドとの結合を示さなかった。   As shown in FIG. 23B (n = 1), the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 bound to the human CD134-derived peptide in a dose-dependent and specific manner, whereas the control human IgG4κ anti-human The CD40 antibody did not show binding to human CD134-derived peptide. Neither the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 nor the control human IgG4κ anti-human CD40 antibody showed binding to the human fibronectin-derived control peptide.

これらの結果により、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3がヒトCD134上のエピトープを特異的に認識したことが実証された（ヒトCD134由来ペプチドとヒトフィブロネクチン由来対照ペプチドとの比較）。さらに、これらの結果により、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108〜146（すなわち、39-merペプチド

；SEQ ID NO. 38参照）を有する短縮型CRD3 A1-モジュール-CRD4サブドメインA1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683の定義による）における直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられることも実証された。 These results demonstrated that the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 specifically recognized the epitope on human CD134 (comparison between human CD134-derived peptide and human fibronectin-derived control peptide). Furthermore, these results indicate that the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 has an amino acid sequence of 108 to 146 (ie, 39-mer peptide) on extracellular human CD134.

Linear or non-linear in the truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain A1-module (as defined in Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) with SEQ ID NO. 38) It has also been demonstrated that it is believed to recognize a planar / conformal epitope.

実施例10．ヒト化IgG4／κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の作製
マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5および12H3の決定されたマウスV領域（上記の実施例2（b）参照）に基づき、ヒト化抗体バージョンを作製した。 Example 10 Generation of humanized IgG4 / κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 20E5 and 12H3 Humanized antibody version based on the determined mouse V region of mouse anti-human CD134 antibody clones 20E5 and 12H3 (see Example 2 (b) above) Was made.

マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5および12H3のヒト化可変軽鎖配列およびヒト化可変重鎖配列を、PDL技術（Panaroma ResearchInstitute, Sunnyvale, CA, USAにより実施）を用いて入手した。ヒト化可変軽鎖および可変重鎖のアミノ酸配列については、SEQ ID NO：62（20E5-VL1）、63（20E5-VL2）、64（20E5-VH1）、65（20E5-VH2）、66（20E5-VH3）、およびSEQ ID NO. 67（12H3-VL1）、68（12H3-VL2）、69（12H3-VH1）、70（12H3-VH2）、71（12H3-VH3）を参照されたい。   Humanized variable light chain and humanized variable heavy chain sequences of mouse anti-human CD134 antibody clones 20E5 and 12H3 were obtained using PDL technology (performed by Panaroma Research Institute, Sunnyvale, CA, USA). For the amino acid sequences of the humanized variable light chain and variable heavy chain, see SEQ ID NO: 62 (20E5-VL1), 63 (20E5-VL2), 64 (20E5-VH1), 65 (20E5-VH2), 66 (20E5 -VH3), and SEQ ID NO. 67 (12H3-VL1), 68 (12H3-VL2), 69 (12H3-VH1), 70 (12H3-VH2), 71 (12H3-VH3).

この設計の後に、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）用に最適化されたcDNA配列（SEQ ID NO：72、73、74（完全長ヒト化IgG4重鎖クローン20E5バージョン、すなわち、それぞれVH1、VH2、VH3をコードする）、SEQ ID NO. 75、76（完全長ヒト化κ軽鎖クローン20E5バージョン、すなわち、それぞれ20E5_VL1、20E5_VL2をコードする）、SEQ ID NO：77、78、79（完全長ヒト化IgG4重鎖クローン12H3バージョン、すなわち、それぞれVH1、VH2、VH3をコードする）、およびSEQ ID NO. 80、81（完全長ヒト化κ軽鎖クローン12H3バージョン、すなわち、それぞれVL1、VL2をコードする）を参照）を、GENEART（Regensburg, Germany）に発注した。これは、シグナルペプチドの後に続くヒトIgG4定常領域と連結されたヒト化可変重鎖またはヒトκ定常領域と連結されたヒト化可変軽鎖のいずれかをコードした：（1）ヒト化抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンの発現用には、マウス免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドをヒト化重鎖および軽鎖の両方のために用い、ならびに（2）ヒト化抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンの発現用には、ヒト免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドをヒト化重鎖のために用い、ヒト免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチドをヒト化軽鎖のために用いた。さらに、ヒト化抗体はすべて、Angal et al.（Mol. Immunol., Vol. 30, No. 1, pp. 105-108, 1993）に従って、安定化されたヒトIgG4分子として発現させた。適した制限酵素を用いて、作製されたcDNAをpcDNA3.1由来の発現プラスミド中にサブクローニングした。   After this design, cDNA sequences optimized for Chinese hamsters (Cricetulus griseus) (SEQ ID NO: 72, 73, 74 (full-length humanized IgG4 heavy chain clone 20E5 version, ie VH1, VH2, VH3 respectively) Encoding), SEQ ID NO. 75, 76 (encoding the full-length humanized kappa light chain clone 20E5 version, ie, 20E5_VL1, 20E5_VL2 respectively), SEQ ID NO: 77, 78, 79 (full-length humanized IgG4 heavy) See chain clone 12H3 version, ie, VH1, VH2, VH3, respectively, and SEQ ID NO. 80, 81 (full length humanized kappa light chain clone 12H3 version, ie, VL1, VL2 respectively) ) Was ordered from GENEART (Regensburg, Germany). This encoded either a humanized variable heavy chain linked to a human IgG4 constant region following the signal peptide or a humanized variable light chain linked to a human kappa constant region: (1) humanized anti-human CD134 For expression of antibody clone 20E5 version, mouse immunoglobulin heavy chain signal peptide is used for both humanized heavy chain and light chain, and (2) for expression of humanized anti-human CD134 antibody clone 12H3 version The human immunoglobulin heavy chain signal peptide was used for the humanized heavy chain and the human immunoglobulin kappa chain signal peptide was used for the humanized light chain. Furthermore, all humanized antibodies were expressed as stabilized human IgG4 molecules according to Angal et al. (Mol. Immunol., Vol. 30, No. 1, pp. 105-108, 1993). Using a suitable restriction enzyme, the prepared cDNA was subcloned into an expression plasmid derived from pcDNA3.1.

ヒト化抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンは、FreeStyle（商標）MAX CHO Expression System（Life Technologies）を用いて発現させた。ヒト化抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンは、FreeStyle（商標）293 Expression System（Life Technologies）を用いて発現させた。作製されたヒト化抗体を、プロテインAカラム（GE Healthcare）によるアフィニィークロマトグラフィーを用いて精製した。このようにして、抗体クローン20E5の6種の精製ヒト化バージョン、すなわち、20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、2-E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2および20E5_VL2VH3、ならびに抗体クローン12H3の6種の精製ヒト化バージョン、すなわち、12H3_VL1VH1、12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2および12H3_VL2VH3を作製した。   Humanized anti-human CD134 antibody clone 20E5 version was expressed using the FreeStyle ™ MAX CHO Expression System (Life Technologies). Humanized anti-human CD134 antibody clone 12H3 version was expressed using the FreeStyle ™ 293 Expression System (Life Technologies). The prepared humanized antibody was purified using affinity chromatography on a protein A column (GE Healthcare). In this way, six purified humanized versions of antibody clone 20E5, i.e. 12H3_VL1VH2, 12H3_VL1VH3, 12H3_VL2VH1, 12H3_VL2VH2, and 12H3_VL2VH3 were prepared.

ヒト化アミノ酸配列については、SEQ ID NO：82、83、84（完全長ヒト化IgG4重鎖クローン20E5バージョン、すなわち、それぞれVH1、VH2、VH3をコードする）、SEQ ID NO. 85、86（完全長ヒト化κ軽鎖クローン20E5バージョン、すなわち、それぞれVL1、VL2をコードする）、SEQ ID NO. 87、88、89（完全長ヒト化IgG4重鎖クローン12H3バージョン、すなわち、それぞれVH1、VH2、VH3をコードする）、およびSEQ ID NO. 90、91（完全長ヒト化κ軽鎖クローン12H3バージョン、すなわち、それぞれVL1、VL2をコードする）を参照されたい。   For humanized amino acid sequences, see SEQ ID NO: 82, 83, 84 (full length humanized IgG4 heavy chain clone 20E5 version, ie, encoding VH1, VH2, VH3 respectively), SEQ ID NO. 85, 86 (complete Long humanized kappa light chain clone 20E5 version, ie encoding VL1, VL2 respectively, SEQ ID NO. 87, 88, 89 (full length humanized IgG4 heavy chain clone 12H3 version, ie VH1, VH2, VH3 respectively And SEQ ID NOs. 90, 91 (full length humanized kappa light chain clone 12H3 version, ie, encoding VL1, VL2 respectively).

実施例11．ヒト化IgG4／κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の結合特性決定
（a）．ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合（ELISA）
96ウェル平底ELISAプレート（Corning）に、50ng／ウェルの組換えヒトCD134：ヒトFcγ（IgG1）融合タンパク質（R&D Systems）をPBS中にて、4℃で一晩かけてコーティングした。PBS／0.05％ Tween 20中で十分に洗浄した後に、プレートをPBS／0.05％ Tween 20／1％ BSA画分V（Roche）により室温で1時間かけてブロックした。その後に、プレートを0、0.0003〜20.0（ブロック用緩衝液中での3倍希釈系列）μg／mLの親マウス抗ヒトCD134抗体クローン120E5または12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または12H3、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または12H3の6種のバージョンとともに、室温で1時間インキュベートした。PBS／0.05％ Tween 20中で十分に洗浄した後に、抗体の結合を、1：5000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）または1：4000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトκ特異的抗体（Southern Biotech）とともに室温で1時間おいた後に、比色定量検出用のTMB基質（Invitrogen）の使用準備済み溶液によって測定した。1M H₂SO₄を添加した後に、波長450nm（参照波長655nm）での光学密度を、マイクロプレートリーダー（BioRad）を用いて測定した。 Example 11 Binding characterization of humanized IgG4 / κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 20E5 and 12H3 (a). Binding of humanized IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 20E5 and 12H3 to recombinant human CD134: human Fcγ fusion protein (ELISA)
A 96-well flat bottom ELISA plate (Corning) was coated with 50 ng / well of recombinant human CD134: human Fcγ (IgG1) fusion protein (R & D Systems) in PBS at 4 ° C. overnight. After extensive washing in PBS / 0.05% Tween 20, the plates were blocked with PBS / 0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 1 hour at room temperature. Thereafter, the plate was washed with 0, 0.0003-20.0 (3-fold dilution series in blocking buffer) μg / mL parent mouse anti-human CD134 antibody clone 120E5 or 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 or 12H3 , And 6 versions of humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 or 12H3 and incubated for 1 hour at room temperature. After extensive washing in PBS / 0.05% Tween 20, antibody binding was determined using horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse (Fcγ specific) antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 5000 or western diluted 1: 4000. Measurements were made with a ready-to-use solution of TMB substrate for colorimetric detection (Invitrogen) after 1 hour at room temperature with horseradish peroxidase-conjugated goat anti-human kappa specific antibody (Southern Biotech). After adding 1M H ₂ SO ₄ , the optical density at a wavelength of 450 nm (reference wavelength 655 nm) was measured using a microplate reader (BioRad).

図28（n＝2）に示されているように、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5の6種のバージョンのすべてが、組換えヒトCD134と用量依存的かつ特異的に結合した。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、ならびにヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_VL1H3、20E5_VL2H1、20E5_VL2VH2および20E5_VL2VH3は、同一の滴定曲線を示し、このことからそれらのCD134抗原結合親和性が同一であることが示された（最大半値結合EC₅₀がほぼ100ng／mL）が、一方、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5のバージョン20E5_VL1H1および20E5_VL1H2は、幾分低い結合親和性（EC₅₀がほぼ150ng／mL）を示すと考えられた。異なる免疫グロブリン鎖特異的二次抗体を用いた（すなわち、マウス抗体は抗Fcγ鎖特異的抗体を用いて検出し、一方、キメラ型ヒト抗体およびヒト化抗体は抗κ鎖特異的抗体を用いて検出した）ため、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5による滴定曲線（データは提示せず）と、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョンによる滴定曲線との比較は行えなかった。 As shown in FIG. 28 (n = 2), all six versions of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 were identified as recombinant human CD134. Dose-dependent and specific binding. Chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 versions 20E5_VL1H3, 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2 and 20E5_VL2VH3 show the same titration curves, thus their CD134 antigen binding affinity is the same it was shown at (half-maximal binding EC ₅₀ approximately 100 ng / mL), whereas, version 20E5_VL1H1 and 20E5_VL1H2 humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 is somewhat lower binding affinity (EC ₅₀ approximately 150 ng / mL). Different immunoglobulin chain specific secondary antibodies were used (ie, mouse antibodies were detected using anti-Fcγ chain specific antibodies, while chimeric human antibodies and humanized antibodies were used using anti-κ chain specific antibodies. Titration curves with parent mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 (data not shown) and titration curves with chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 version Comparison could not be made.

図29（n＝2）に示されているように、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3の6種のバージョンのすべてが、組換えヒトCD134と用量依存的かつ特異的に結合した。キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、ならびにヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3‐6種のバージョン12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2および12H3_VL2VH3のすべて‐は、同一でない滴定曲線を示し、このことから、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3（EC₅₀がほぼ100ng／mL）よりも幾分高いCD134抗原結合親和性（EC₅₀がほぼ50ng／mL）を示すことが示された。異なる免疫グロブリン鎖特異的二次抗体を用いた（すなわち、マウス抗体は抗Fcγ鎖特異的抗体を用いて検出し、一方、キメラ型ヒト抗体およびヒト化抗体は抗κ鎖特異的抗体を用いて検出した）ため、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3による滴定曲線（データは提示せず）と、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンによる滴定曲線との比較は行えなかった。 As shown in FIG. 29 (n = 2), all six versions of chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 were identified as recombinant human CD134. Dose-dependent and specific binding. The chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 and the humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3-6 versions 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 and 12H3_VL2VH3 Thus, all six humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 versions have a somewhat higher CD134 antigen binding affinity than the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 (EC _{50 of} approximately 100 ng / mL) ( EC ₅₀ was shown to be approximately 50 ng / mL). Different immunoglobulin chain specific secondary antibodies were used (ie, mouse antibodies were detected using anti-Fcγ chain specific antibodies, while chimeric human antibodies and humanized antibodies were used using anti-κ chain specific antibodies. Titration curves with parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 (data not shown) and titration curves with chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 version Comparison could not be made.

（b）．組換えヒトCD134：ヒトFcγ融合タンパク質との結合に関する、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3とビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3との競合（ELISA）
競合ELISA測定を行う前に、ビオチン化（PierceによるN-ヒドロキシスクシンイミド-ビオチンを使用）親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のEC₅₀を決定し（方法については以下を参照）、それが約20ng／mLであることを同定した（図30、n＝3を参照）。非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3による、同定されたEC₅₀濃度でのビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の置換について、その後に調べた。 (B). Recombinant human CD134: Competition between humanized IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and biotinylated parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 for binding to human Fcγ fusion protein (ELISA)
Before performing a competitive ELISA measurement, determine the EC ₅₀ of the biotinylated (using N-hydroxysuccinimide-biotin by Pierce) parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 (see below for methods), which is approximately 20 ng / ML (see FIG. 30, n = 3). Biotinylated parent at the identified EC ₅₀ concentration with unlabeled parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3, and six versions of humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 Substitution of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 was subsequently investigated.

96ウェル平底ELISAプレート（Corning）に、50ng／ウェルの組換えヒトCD134：ヒトFcγ（IgG1）融合タンパク質（R&D Systems）をPBS中にて、4℃で一晩かけてコーティングした。PBS／0.05％ Tween 20中で十分に洗浄した後に、プレートをPBS／0.05％ Tween 20／1％ BSA画分V（Roche）により室温で1時間かけてブロックした。その後に、プレートを0、0.001〜60.0（ブロック緩衝液中での3倍希釈系列）μg／mLの非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3とともに、20ng／mL（EC₅₀）のビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3と組み合わせて、室温で1時間インキュベートした。PBS／0.05％ Tween 20中で十分に洗浄した後に、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の結合を、1：5000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch）とともに室温で1時間おいた後に、比色定量検出用のTMB基質（Invitrogen）の使用準備済み溶液によって測定した。1M H₂SO₄を添加した後に、波長450nm（参照波長655nm）での光学密度を、マイクロプレートリーダー（BioRad）を用いて測定した。 A 96-well flat bottom ELISA plate (Corning) was coated with 50 ng / well of recombinant human CD134: human Fcγ (IgG1) fusion protein (R & D Systems) in PBS at 4 ° C. overnight. After extensive washing in PBS / 0.05% Tween 20, the plates were blocked with PBS / 0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 1 hour at room temperature. Thereafter, the plates were labeled 0, 0.001-60.0 (3-fold dilution series in block buffer) μg / mL unlabeled parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3, and 6 A version of humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 was combined with 20 ng / mL (EC ₅₀ ) of biotinylated parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and incubated for 1 hour at room temperature. After extensive washing in PBS / 0.05% Tween 20, binding of the biotinylated parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 was performed with horseradish peroxidase-conjugated streptavidin (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 5000 for 1 hour at room temperature. After placing, measurements were made with a ready-to-use solution of TMB substrate (Invitrogen) for colorimetric detection. After adding 1M H ₂ SO ₄ , the optical density at a wavelength of 450 nm (reference wavelength 655 nm) was measured using a microplate reader (BioRad).

図31（n＝2）に示されているように、非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および非標識キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3により、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の同一の置換が実証され、このことから、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3が同一のCD134抗原結合親和性（ほぼ750ng／mLでのビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の最大半値置換または阻害（IC₅₀））を呈することが示された。6種の非標識ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべて‐12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2および12H3_VL2VH3‐により、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の同程度の置換が実証され、このことから、6種の非標識ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、同程度のCD134抗原結合親和性（IC₅₀がほぼ250〜300ng／mL）を呈することが示された。 As shown in FIG. 31 (n = 2), an unlabeled parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and an unlabeled chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 The same substitution of 12H3 was demonstrated, which indicates that the parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 have the same CD134 antigen binding affinity (biotinylated parent at approximately 750 ng / mL). The mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 was shown to exhibit half-maximal displacement or inhibition (IC ₅₀ )). All six unlabeled humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clones 12H3 versions -12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 and 12H3_VL2VH3- This indicates that all six unlabeled humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 versions exhibit similar CD134 antigen binding affinity (IC _{50 of} approximately 250-300 ng / mL). It was.

これらの結果により、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3よりも高いCD134抗原結合親和性を示すことが実証された。   These results indicate that all six humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 versions have higher CD134 antigen binding affinity than the parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3. It was demonstrated to show.

（c）．ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3と、293-F細胞株上で発現された完全長ヒトCD134構築物との結合（FACS）
ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の結合を詳細に分析する目的で、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン20E5および12H3の、（安定なトランスフェクト体である）293-F細胞株上の表面ヒト完全長CD134との結合能をフローサイトメトリーによって判定し、さらに、それらの対応する親マウス抗ヒトCD134抗体対応物の結合特性と比較した。 (C). Binding of humanized IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 20E5 and 12H3 to full-length human CD134 construct expressed on the 293-F cell line (FACS)
293-F cell line (which is a stable transfectant) of humanized IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 20E5 and 12H3 for detailed analysis of the binding of humanized IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 20E5 and 12H3 The ability to bind to the upper surface human full-length CD134 was determined by flow cytometry and further compared to the binding properties of their corresponding parent mouse anti-human CD134 antibody counterparts.

完全長ヒトCD134（SEQ ID NO. 1）を、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中に再クローニングした（以下の実施例11（d）を参照）。この完全長ヒトCD134プラスミドを、FreeStyle（商標）293 Expression System（Life Technologies）を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞（Life Technologies）に形質移入した。安定なヒト完全長CD134形質移入細胞（表面CD134発現レベルが高いクローンno.5、および表面CD134発現レベルが中程度であるクローンno.23；図32参照）を、125μg／mLのG418（Gibco）を用いて選択し、採取した上で、50μg／mLの精製ヒトIgG（Sigma；Fcγ受容体をブロックする）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、0、0.005〜50μg／mL（PBS／BSA／NaN₃中での10倍希釈系列；すべてのクローン20E5バージョン）または0.002〜20μg／mL（PBS／BSA／NaN₃中での10倍希釈系列；すべてのクローン12H3バージョン）の親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5または12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または12H3、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5または12H3の6種のバージョンとともに4℃で30分間インキュベートした。並行して、マウスIgG1κアイソタイプ対照（BD Biosciences；50.0または20.0μg／mL）およびキメラ型ヒトIgG4κアイソタイプ対照（PanGeneticsによるクローンch5D12；50.0または20.0μg／mL）を陰性対照として用いた。PBS／BSA／NaN₃中で十分に洗浄した後、細胞を続いて、1：200に希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）または1：200に希釈したPE結合ヤギ抗ヒトIgG（Fcγ特異的）抗体（JacksonImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃中で十分に洗浄した後に、細胞を、2％ホルムアルデヒドを含むPBS／BSA／NaN₃中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 Full-length human CD134 (SEQ ID NO. 1) was recloned into an expression plasmid derived from pcDNA3.1 (see Example 11 (d) below). This full-length human CD134 plasmid was transfected into FreeStyle ™ 293-F cells (Life Technologies) using the FreeStyle ™ 293 Expression System (Life Technologies). Stable human full-length CD134-transfected cells (clone no.5 with high surface CD134 expression level and clone no.23 with moderate surface CD134 expression level; see FIG. 32) were obtained with 125 μg / mL G418 (Gibco) 1-2 × 10 ⁶ cells / mL in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ supplemented with 50 μg / mL purified human IgG (Sigma; blocking Fcγ receptor) I put it in. Cells are 0, 0.005-50 μg / mL (10-fold dilution series in PBS / BSA / NaN ₃ ; all clone 20E5 versions) or 0.002-20 μg / mL (10-fold dilution in PBS / BSA / NaN ₃ ) 6 versions of the parent mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 or 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 or 12H3, and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 or 12H3 And incubated at 4 ° C. for 30 minutes. In parallel, mouse IgG1κ isotype control (BD Biosciences; 50.0 or 20.0 μg / mL) and chimeric human IgG4κ isotype control (clone ch5D12 by PanGenetics; 50.0 or 20.0 μg / mL) were used as negative controls. After extensive washing in PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were then subjected to PE-conjugated goat anti-mouse IgG (Fcγ specific) antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 200 or PE-conjugated diluted 1: 200. Incubated with goat anti-human IgG (Fcγ specific) antibody (Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing in PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formaldehyde at 4 ° C. for 30 minutes. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図33（ヒト完全長CD134を形質移入した、表面CD134発現レベルが高い細胞クローンno.5；n＝1）に示されているように、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5のすべてが、細胞表面に発現されたヒトCD134と用量依存的かつ特異的に結合した。親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、ならびにヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5のバージョン20E5_VL1H3、20E5_VL2H1、20E5_VL2VH2および20E5_VL2VH3は、類似した滴定曲線を示し、このことから、それらのCD134抗原結合親和性は極めて類似しているが、一方、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5のバージョンVL1H1およびVL1H2は、幾分低い結合親和性を示していると考えられたことが示された。   As shown in FIG. 33 (cell clone no.5; n = 1 with high surface CD134 expression level transfected with human full-length CD134), parental mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5, chimeric human IgG4κ anti-antibody Human CD134 antibody clone 20E5 and all six versions of the humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 bound dose-dependently and specifically to human CD134 expressed on the cell surface. Parental mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5, and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 versions 20E5_VL1H3, 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2 and 20E5_VL2VH3 show similar titration curves. From the results, their CD134 antigen binding affinities were very similar, whereas humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 versions VL1H1 and VL1H2 were considered to show somewhat lower binding affinity. It has been shown.

図34（ヒト完全長CD134を形質移入した、表面CD134発現レベルが高い細胞クローンno.5；n＝2）、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、細胞表面に発現されたヒトCD134と用量依存的かつ特異的に結合した。親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、ならびにヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のバージョン12H3_VL2H1および12H3_VL2VH3は、同一の滴定曲線を示し、このことから、それらのCD134抗原結合親和性は同一であるが、一方、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のバージョン12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3および12H3_VL2H2は幾分高い結合親和性を示していると考えられたことが示された。   FIG. 34 (cell clone no.5 with high surface CD134 expression level transfected with human full-length CD134, n = 2), parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3, and All six versions of the humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 bound dose-dependently and specifically to human CD134 expressed on the cell surface. The parental mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3, and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 versions 12H3_VL2H1 and 12H3_VL2VH3 show identical titration curves, which CD134 antigen binding affinities were identical, whereas humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 versions 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3 and 12H3_VL2H2 were shown to show somewhat higher binding affinity. It was.

図35（ヒト完全長CD134を形質移入した、表面CD134発現レベルが中程度である細胞クローンno.23；n＝2）に示されているように、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、細胞表面に発現されたヒトCD134と用量依存的かつ特異的に結合した。親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3は類似した滴定曲線を示し、このことから、それらのCD134抗原結合親和性は同程度である（EC₅₀が200ng／mLを上回る）が、一方、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべて‐12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2および12H3_VL2VH3‐が、より高い結合親和性（EC₅₀が200ng／mL未満）を示していると考えられたことが示された。 Parental mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, chimeric type, as shown in FIG. 35 (cell clone no.23 transfected with human full-length CD134 and medium CD134 expression level no.23; n = 2) Human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 and all six versions of humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 bound human CD134 expressed on the cell surface in a dose-dependent and specific manner. The parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 show similar titration curves, indicating that their CD134 antigen binding affinities are similar (EC ₅₀ is 200 ng / mL). On the other hand, all 6 humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clones 12H3 versions-12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 and 12H3_VL2VH3- have a higher binding affinity (EC ₅₀ <200 ng ).

以上を総合すると、これらのフローサイトメトリー結果により、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_VL1H3、20E5_VL2H1、20E5_VL2VH2、20E5_VL2VH3、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5は同程度のCD134抗原結合親和性を示すが、一方、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_VL1H1および20E5_VL1H2は幾分低いCD134抗原結合親和性を示すことが実証された。加えて、これらの結果により、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3よりも高いCD134抗原結合親和性を示すことも実証された。   Taken together, these flow cytometry results show that humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 version 20E5_VL1H3, 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2, 20E5_VL2VH3, parent mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5, and chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone It has been demonstrated that 20E5 shows comparable CD134 antigen binding affinity, whereas humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clones 20E5 versions 20E5_VL1H1 and 20E5_VL1H2 show somewhat lower CD134 antigen binding affinity. In addition, these results indicate that all six humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 versions have higher CD134 antigen binding than the parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3. It has also been demonstrated to show affinity.

（d）．ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5と、293-F細胞株上に発現された完全長ヒトCD134構築物およびさまざまな短縮型ヒトCD134構築物との結合（FACSドメインマッピング）
ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5の微細特異性を分析する目的で、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5によって認識されるエピトープの位置を、ドメインマッピングによって決定した。ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5が、（HEK由来）297-F細胞の表面上に発現された短縮型ヒトCD134構築物と結合する能力を、フローサイトメトリー分析によって判定した。 (D). Binding of humanized IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 to full-length human CD134 constructs and various truncated human CD134 constructs expressed on the 293-F cell line (FACS domain mapping)
In order to analyze the fine specificity of humanized IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5, the location of the epitope recognized by humanized IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 was determined by domain mapping. The ability of humanized IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5 to bind to the truncated human CD134 construct expressed on the surface of (HEK-derived) 297-F cells was determined by flow cytometry analysis.

文献（Swiss-Prot：P43489.1；Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683；Bodmer et al. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26；Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330；米国特許出願公開第2011／0028688号）に基づき、ヒトCD134の細胞外領域におけるシステインリッチドメイン（CRD）およびヒンジ様構造を同定した。CRDは、CRD1、CRD2、（短縮型）CRD3、（短縮型）CRD4と符号化されている（図20参照）。CRDは、A-モジュールおよびB-モジュールと称される位相幾何学的に異なる種類のモジュールを含む（図20も参照）。A-モジュールはC字状構造であり、B-モジュールはS字状構造である。典型的なCRDは通常、6個の保存的なシステイン残基を有するA1-B2-モジュールまたはA2-B1-モジュール（または、頻度は低いが、A1-B1のような異なるモジュールの対）で構成され、ここで数字は各モジュール内のジスルフィド架橋の数を表している（図20も参照）。図20に示されているように、3種の異なるヒトCD134構築物を作製して発現させた：（1）完全長ヒトCD134構築物、これはN末端CRD1に始まり（すなわち、CRD1 A1-B2-モジュールはアミノ酸29〜65をカバーする）、このため「CRD1」と表わされ、アミノ酸1〜277で構成される（SEQ ID NO. 1参照）、（2）「CRD3」構築物、これはN末端CRD3で始まり（すなわち、CRD3 A1-B1-モジュールはアミノ酸108〜146をカバーする（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330による）か、または短縮型CRD3 A1-モジュールはアミノ酸108〜126をカバーし（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683）による）、アミノ酸108〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO：31参照）、（3）「CRD4」構築物、これはN末端CRD4またはCRD3サブドメインB1-モジュール／短縮型CRD4 A1-モジュールからなる（すなわち、CRD4 A1-B1-モジュールはアミノ酸127〜167をカバーする（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683）か、またはCRD3サブドメインB1-モジュールと短縮型CRD4 A1-モジュールとの組み合わせ（図20には示されていない）がそれぞれアミノ酸127〜146およびアミノ酸147〜167をカバーし（Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330））、アミノ酸127〜277にシグナルペプチドアミノ酸1〜28が連結されたもので構成される（SEQ ID NO：32参照）。Accuprime（商標）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を用いるアセンブリPCRにより、これらの3種のヒトCD134構築物を、以下の表2に示したプライマーを用いて作製した。   Literature (Swiss-Prot: P43489.1; Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683; Bodmer et al. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26; Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321 -1330; US Patent Application Publication No. 2011/0028688), cysteine-rich domains (CRD) and hinge-like structures in the extracellular region of human CD134 were identified. CRD is encoded as CRD1, CRD2, (shortened) CRD3, and (shortened) CRD4 (see FIG. 20). The CRD includes topologically different types of modules called A-modules and B-modules (see also FIG. 20). The A-module has a C-shaped structure, and the B-module has an S-shaped structure. A typical CRD usually consists of an A1-B2-module or A2-B1-module (or a lesser pair of different modules like A1-B1) with 6 conserved cysteine residues Where the numbers represent the number of disulfide bridges within each module (see also FIG. 20). As shown in FIG. 20, three different human CD134 constructs were generated and expressed: (1) full-length human CD134 construct, starting at the N-terminal CRD1 (ie, CRD1 A1-B2-module) Covers amino acids 29-65) and is therefore designated “CRD1” and is composed of amino acids 1-277 (see SEQ ID NO. 1), (2) “CRD3” construct, which is N-terminal CRD3 (Ie, CRD3 A1-B1-module covers amino acids 108-146 (according to Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330) or a truncated CRD3 A1-module covers amino acids 108-126) (According to Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683), consisting of amino acid 108-277 and signal peptide amino acid 1-28 (see SEQ ID NO: 31), 3) “CRD4” construct, which is N-terminal CRD4 or CRD3 subdomain B1-module / short CRD4 A1-module (Ie, the CRD4 A1-B1-module covers amino acids 127-167 (Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) or the CRD3 subdomain B1-module and the truncated CRD4 A1- The combination with the module (not shown in FIG. 20) covers amino acids 127-146 and amino acids 147-167, respectively (Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330)) and signals to amino acids 127-277 It consists of peptide amino acids 1-28 linked (see SEQ ID NO: 32). These three human CD134 constructs were made using the primers shown in Table 2 below by assembly PCR using Accuprime ™ Pfx DNA polymerase (Invitrogen).

（表２）

* プライマー番号はBioceros社の内部符号方式による (Table 2)

* Primer numbers are based on Bioceros' internal code system

手短に述べると、シグナルペプチドのアミノ酸1〜28をコードするcDNAおよびヒトCD134のアミノ酸66〜277をコードするcDNAを、それぞれプライマー対362／367および366／363を用い、完全長ヒトCD134をテンプレートとして用いるPCR反応において増幅させた。その後に、これらの2種のPCR産物を、プライマー対362／363を用いるアセンブリPCRに用いることによって、「CRD3」構築物を作製した。「CRD3」構築物をコードするcDNAを、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中に、適した制限部位を用いてサブクローニングした。同様に、「CRD4」構築物（シグナルペプチドのアミノ酸1〜28にアミノ酸127〜277が連結されたもの）を作製し、上述の表に示された対応するプライマーを用いて、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中にサブクローニングした。さらに、完全長ヒトCD134（SEQ ID NO：1）は、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中にも再びクローニングした。   Briefly, a cDNA encoding amino acids 1-28 of the signal peptide and a cDNA encoding amino acids 66-277 of human CD134 were used with primer pairs 362/367 and 366/363, respectively, using full-length human CD134 as a template. Amplified in the PCR reaction used. The “CRD3” construct was then made by using these two PCR products in assembly PCR using primer pair 362/363. The cDNA encoding the “CRD3” construct was subcloned into the expression plasmid from pcDNA3.1 using the appropriate restriction sites. Similarly, a “CRD4” construct (amino acids 127 to 277 linked to amino acids 1 to 28 of the signal peptide) was prepared and expressed from pcDNA3.1 using the corresponding primers shown in the table above. Subcloned into the plasmid. In addition, full-length human CD134 (SEQ ID NO: 1) was recloned into an expression plasmid derived from pcDNA3.1.

FreeStyle（商標）293 Expression System（Life Technologies）を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞（Life Technologies）に対して、作製したヒトCD134の3種の変異体を一過性に形質移入した。48時間後に、形質移入細胞上での表面ヒトCD134発現をFACS分析によって分析した。この目的に向けて、形質移入細胞を採取し、50μg／mLの精製ヒトIgG（Sigma；Fcγ受容体をブロックする）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、20.0μg／mLの親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3および20E5、20.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5、20.0μg／mLの6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、ならびに20.0μg／mLのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_VL1VH1とともに、4℃で30分間インキュベートした。並行して、20.0μg／mLのマウスIgG1κアイソタイプ対照（BD Biosciences）および20.0μg／mLのキメラ型ヒトIgG4κアイソタイプ対照（PanGeneticsによるクローンch5D12）を陰性対照として用いた。PBS／BSA／NaN₃中で十分に洗浄した後、細胞を続いて、1：200に希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）または1：200に希釈したPE結合ヤギ抗ヒトIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃中で十分に洗浄した後、細胞を続いて、1：200に希釈したPE結合ヤギ抗マウスIgG（Fcγ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃中で十分に洗浄した後に、細胞を、2％ホルムアルデヒドを含むPBS／BSA／NaN₃中にて4℃で30分間かけて固定した。抗体の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 Using FreeStyle (trademark) 293 Expression System (Life Technologies), FreeStyle (trademark) 293-F cells (Life Technologies) were transiently transfected with the prepared three variants of human CD134. After 48 hours, surface human CD134 expression on the transfected cells was analyzed by FACS analysis. To this end, transfected cells are harvested and 1-2 × 10 ^{6 in} ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ supplemented with 50 μg / mL purified human IgG (Sigma; blocking Fcγ receptor) / ML. Cells were humanized in 6 versions of 20.0 μg / mL parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clones 12H3 and 20E5, 20.0 μg / mL chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5, 20.0 μg / mL Incubated with IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 and 20.0 μg / mL humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 version 20E5_VL1VH1 at 4 ° C. for 30 minutes. In parallel, 20.0 μg / mL mouse IgG1κ isotype control (BD Biosciences) and 20.0 μg / mL chimeric human IgG4κ isotype control (clone ch5D12 by PanGenetics) were used as negative controls. After extensive washing in PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were then subjected to PE-conjugated goat anti-mouse IgG (Fcγ specific) antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 200 or PE-conjugated diluted 1: 200. Incubated with goat anti-human IgG (Fcγ specific) antibody (Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes at 4 ° C. After extensive washing in PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were subsequently incubated for 30 minutes at 4 ° C. with PE-conjugated goat anti-mouse IgG (Fcγ specific) antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 200. After extensive washing in PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formaldehyde at 4 ° C. for 30 minutes. Antibody binding was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図36に示されているように、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、形質移入した293-F細胞上の、完全長（「CRD1」構築物と表記）ヒトCD134、およびCRD1-CRD2を欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD3」構築物と表記）を認識し、一方、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、モックプラスミドを形質移入した293-F細胞上での結合を示さなかった。対照的に、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）に対する、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3すべての結合は極めて弱いかまたは陰性であるが、一方、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5は、形質移入した293-F細胞上の、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュール（「CRD4」構築物と表記）を欠くこの短縮型ヒトCD134変異体に対して強い結合を示し、このことからこれらの後者の293-F細胞がこの表面短縮型CD134バージョンを発現したことが裏づけられた。   As shown in FIG. 36, the parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3, and all six humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 were transfected. Recognizes full-length (designated “CRD1” construct) human CD134 and a truncated human CD134 mutant lacking CRD1-CRD2 (designated “CRD3” construct) on 293-F cells, while parental mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3, and all six humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 do not show binding on 293-F cells transfected with mock plasmids It was. In contrast, parental mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone against a truncated human CD134 mutant lacking the CRD1-CRD2-shortened CRD3 A1-module (denoted as “CRD4” construct) Binding of 12H3 and all six versions of the humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 is very weak or negative, whereas the parental mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5 is on transfected 293-F cells. Show strong binding to this truncated human CD134 mutant lacking the CRD1-CRD2-shortened CRD3 A1-module (denoted as “CRD4” construct), which indicates that these latter 293-F cells It was confirmed that the surface shortened CD134 version was expressed.

図37に示されているように、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_VL1VH1は、トランスフェクトされた293-F細胞上の、完全長（「CRD1」構築物と表記）ヒトCD134、CRD1-CRD2を欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD3」構築物と表記）、およびCRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）を認識し、一方、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5バージョン20E5_ VL1VH1は、モックプラスミドを形質移入した293-F細胞上での結合を全く示さなかった。   As shown in FIG. 37, parental mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5, and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 version 20E5_VL1VH1 were transfected 293- Full length (denoted as “CRD1” construct) human CD134, a truncated human CD134 variant lacking CRD1-CRD2 (denoted as “CRD3” construct), and CRD1-CRD2-shortened CRD3 A1-module on F cells Recognizes a truncated human CD134 variant lacking (denoted as “CRD4” construct), while parental mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5, and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 version 20E5_VL1VH1 did not show any binding on 293-F cells transfected with the mock plasmid.

これらの結果により、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべて、ならびにヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5_VL1VH1が、ヒトCD134を特異的に認識することが実証された（完全長ヒトCD134形質移入とモックプラスミド形質移入との比較）。さらに、これらの結果により、抗ヒトCD134抗体クローン12H3および20E5が、CRD1-CRD2-短縮型CRD3 A1-モジュールを欠く短縮型ヒトCD134変異体（「CRD4」構築物と表記）に対する、それぞれの結合の欠如（クローン12H3を用いた場合）と強い結合（クローン20E5を用いた場合）との対比によって立証されるように、類似性のないヒトCD134エピトープを認識していると考えられたことも実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、CRD1およびCRD2におけるヒトCD134エピトープを認識しないと考えられたことが実証された。マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5 VL1VH1は、CRD1、CRD2および短縮型CRD3 A1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)の定義による）におけるヒトCD134エピトープを認識しないと考えられたことが実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3のすべてが、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108〜126（すなわち、19-mericペプチド

；SEQ ID NO：34を参照）を有する短縮型CRD3 A1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)の定義による）における直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識していると考えられること、あるいは、アミノ酸配列108〜126（すなわち、19-mericペプチド

；SEQ ID NO：34を参照）が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列108〜214（SEQ ID NO：35を参照）を有する、短縮型CRD3 A1-モジュール／CRD4 A1-B1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)の定義による）そしておそらくはヒンジ様構造における非直鎖状／高次構造性エピトープとの結合のための一部を形成していることが実証された。これらの結果により、マウス抗ヒトCD134抗体クローン20E5、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5、およびヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン20E5_VL1VH1が、細胞外ヒトCD134上のアミノ酸配列127〜214（SEQ ID NO：92）を有する、CRD4 A1-B1-モジュール（Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)の定義による）そしておそらくはヒンジ様構造における、直鎖状または非直鎖状／高次構造性エピトープを認識すると考えられることが実証された。 These results indicate that parental mouse anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5, all six humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clones 12H3, and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5_VL1VH1 was demonstrated to specifically recognize human CD134 (comparison between full-length human CD134 transfection and mock plasmid transfection). Furthermore, these results indicate that anti-human CD134 antibody clones 12H3 and 20E5 lack their respective binding to a truncated human CD134 mutant lacking the CRD1-CRD2-shortened CRD3 A1-module (denoted as “CRD4” construct). It was also demonstrated that it was believed to recognize a dissimilar human CD134 epitope, as evidenced by contrast between strong binding (with clone 12H3) and strong binding (with clone 20E5). . These results indicate that mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3, and six humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 all recognize human CD134 epitopes in CRD1 and CRD2. It was proved that it was thought not to. Mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5, and humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5 VL1VH1 are CRD1, CRD2 and truncated CRD3 A1-modules (Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)) was demonstrated to be considered not to recognize the human CD134 epitope. These results indicate that the murine anti-human CD134 antibody clone 12H3, the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3, and the six humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 all have the amino acid sequence 108 on extracellular human CD134. ~ 126 (ie 19-meric peptide

Linear or non-linear / higher order structure in a truncated CRD3 A1-module (as defined by Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) with SEQ ID NO: 34) The amino acid sequence 108-126 (ie 19-meric peptide)

A short CRD3 A1-module / CRD4 A1-B1-module (Latza et al .; SEQ ID NO: 34) having the amino acid sequence 108-214 (see SEQ ID NO: 35) on extracellular human CD134; al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)) and possibly forming part of the hinge-like structure for binding to non-linear / conformal epitopes It was. These results indicate that the mouse anti-human CD134 antibody clone 20E5, the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5, and the humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 20E5_VL1VH1 have amino acid sequences 127-214 (SEQ ID NO: 92), as defined by CRD4 A1-B1-module (as defined by Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) and possibly in a hinge-like structure, linear or non-linear / high It has been demonstrated that it is thought to recognize secondary structural epitopes.

（e）．安定に形質移入した293-F細胞株クローンno.5上の表面ヒトCD134との結合に関する、ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3とビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3との競合（FACS）
競合フローサイトメトリー測定を行う前に、ビオチン化（PierceによるN-ヒドロキシスクシンイミド-ビオチンを使用）親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3のEC₅₀を決定し（方法については以下を参照）、それが約700ng／mLであることを同定した（図38、n＝2を参照）。非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3による、同定されたEC₅₀濃度でのビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の置換について、その後に調べた。 (E). Competition of humanized IgG4κ anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 with biotinylated parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 for binding to surface human CD134 on stably transfected 293-F cell line clone no.5 ( FACS)
Before performing competitive flow cytometry measurements, determine the EC ₅₀ of the biotinylated (using N-hydroxysuccinimide-biotin by Pierce) parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 (see below for methods) Identified to be about 700 ng / mL (see FIG. 38, n = 2). Biotinylated parent at the identified EC ₅₀ concentration with unlabeled parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3, and six versions of humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 Substitution of mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 was subsequently investigated.

完全長ヒトCD134（SEQ ID NO1）を、pcDNA3.1由来の発現プラスミド中に再クローニングした（上記の実施例11（c）を参照）。この完全長ヒトCD134プラスミドを、FreeStyle（商標）293 Expression System（Life Technologies）を用いて、FreeStyle（商標）293-F細胞（Life Technologies）に形質移入した。安定なヒト完全長CD134形質移入細胞（表面CD134発現レベルが高いクローンno.5、図32参照）を、125μg／mLのG418（Gibco）を用いて選択し、採取した上で、50μg／mLの精製ヒトIgG（Sigma；Fcγ受容体をブロックする）を加えた氷冷PBS／BSA／NaN₃中に1〜2×10⁶個／mLで入れた。細胞を、0.003〜50.0（PBS／BSA／NaN₃中での5倍希釈系列）の非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3、キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3、および6種のバージョンのヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3とともに、700ng／mL（EC₅₀）のビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3と組み合わせて、4℃で30分間インキュベートした。PBS／BSA／NaN₃中で十分に洗浄した後に、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の結合を、1：200に希釈したPE結合ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch）とともに4℃で30分間おいた後に判定した。PBS／BSA／NaN₃中で十分に洗浄した後に、細胞を、2％ホルムアルデヒドを含むPBS／BSA／NaN₃中にて4℃で30分間かけて固定した。ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の結合は、フローサイトメトリー（FACSCalibur；BD Biosciences）を用いて測定した。 Full-length human CD134 (SEQ ID NO1) was recloned into an expression plasmid derived from pcDNA3.1 (see Example 11 (c) above). This full-length human CD134 plasmid was transfected into FreeStyle ™ 293-F cells (Life Technologies) using the FreeStyle ™ 293 Expression System (Life Technologies). Stable human full-length CD134-transfected cells (clone no.5 with high surface CD134 expression level, see FIG. 32) were selected using 125 μg / mL G418 (Gibco), harvested, and 50 μg / mL It was placed at 1-2 × 10 ⁶ cells / mL in ice-cold PBS / BSA / NaN ₃ supplemented with purified human IgG (Sigma; blocking Fcγ receptor). Cells were isolated from 0.003 to 50.0 (5-fold dilution series in PBS / BSA / NaN ₃ ) unlabeled parental mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3, chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3, and six versions of Humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 was combined with 700 ng / mL (EC ₅₀ ) of biotinylated parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 and incubated at 4 ° C. for 30 minutes. After extensive washing in PBS / BSA / NaN ₃ , binding of biotinylated parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 was performed with PE-conjugated streptavidin (Jackson ImmunoResearch) diluted 1: 200 for 30 minutes at 4 ° C. Judgment after being. After extensive washing in PBS / BSA / NaN ₃ , the cells were fixed in PBS / BSA / NaN ₃ containing 2% formaldehyde at 4 ° C. for 30 minutes. Binding of biotinylated parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 was measured using flow cytometry (FACSCalibur; BD Biosciences).

図39（n＝2）に示されているように、非標識親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3および非標識キメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3により、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の同一の置換が実証され、このことから、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3が同一のCD134抗原結合親和性（ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の最大半値置換または阻害（IC₅₀）がほぼ3.5μg／mL）を呈することが示された。6種の非標識ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべて‐12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2および12H3_VL2VH3‐により、ビオチン化親マウス抗ヒトCD134モノクローナル抗体クローン12H3の同一の置換が実証され、このことから、6種の非標識ヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、同一のCD134抗原結合親和性（IC₅₀がほぼ1.5μg／mL）を呈することが示された。 As shown in FIG. 39 (n = 2), an unlabeled parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and an unlabeled chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 The same substitution of 12H3 was demonstrated, which indicates that the parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 have the same CD134 antigen binding affinity (biotinylated parent mouse anti-human CD134 monoclonal antibody Clone 12H3 was shown to exhibit half-maximal displacement or inhibition (IC ₅₀ ) of approximately 3.5 μg / mL). All six unlabeled humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clones 12H3 versions -12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 and 12H3_VL2VH3--identified biotinylated parental mouse anti-human CD134 monoclonal antibody clone 12H3 This indicated that all six unlabeled humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 versions exhibited the same CD134 antigen binding affinity (IC _{50 of} approximately 1.5 μg / mL).

これらの結果により、6種のヒト化IgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3バージョンのすべてが、親マウス抗ヒトCD134抗体クローン12H3およびキメラ型ヒトIgG4κ抗ヒトCD134抗体クローン12H3よりも高いCD134抗原結合親和性を示すことが実証された。   These results indicate that all six humanized IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3 versions have higher CD134 antigen binding affinity than the parent mouse anti-human CD134 antibody clone 12H3 and the chimeric human IgG4κ anti-human CD134 antibody clone 12H3. It was demonstrated to show.

実施例12．抗CD134抗体はTreg細胞におけるFOX3P発現を抑制する
Tregの単離および増大：白血球パック（leukopack）をBiological Specialties（Colamar, PA）から購入し、赤血球をACK緩衝液（Stemcell technologies, Vancouver, BC, Canada）により氷上で溶解させた。細胞を洗浄し、AutoMACS泳動緩衝液中に再懸濁させた。Tregは、いずれもMiltenyi Biotech（San Diego, CA）による、AutoMACS Proおよび／またはLDカラムとQuadroMACSとの両方にて、製造元の指示に従って、CD4+ CD25+ CD127dim/- Tregキットを用いて単離した。Tregを計数し、24ウェルプレート中にて、1×10⁶個のTreg／ウェルを、TexMACS培地中で、Treg増殖用ビーズ（CD3抗体およびCD28抗体をあらかじめ負荷したMACSiBead粒子；Miltenyi Biotech）を用いて製造元の指示に従って増殖させた。細胞を、ほぼ500IU／mLのIL-2およびラパマイシン（100nM）の存在下で、ビーズ4個／細胞1個の比率で培養した。単離から5日後に、細胞を6ウェル／プレートに移し、ビーズ40μl／ウェル、ならびにIL-2（500IU／ml）およびラパマイシン（100nM）を添加した。IL-2を含有する培地を必要に応じて添加し、細胞を10mm丸底ディッシュプレートに移して、さらに増殖させた。30日後に、MACSiMAGを用いてビーズを取り出し、その後に下流での用途に用いた。 Example 12 Anti-CD134 antibody suppresses FOX3P expression in Treg cells
Treg isolation and expansion: Leukopacks were purchased from Biological Specialties (Colamar, PA) and erythrocytes were lysed on ice with ACK buffer (Stemcell technologies, Vancouver, BC, Canada). Cells were washed and resuspended in AutoMACS running buffer. All Tregs were isolated using the CD4 + CD25 + CD127dim / -Treg kit according to the manufacturer's instructions, both with AutoMACS Pro and / or LD column and QuadroMACS, by Miltenyi Biotech (San Diego, CA). Count Treg and use 1 × 10 ⁶ Treg / well in TexMACS medium in a 24-well plate with Treg growth beads (MACSiBead particles pre-loaded with CD3 and CD28 antibodies; Miltenyi Biotech) And grown according to the manufacturer's instructions. Cells were cultured at a ratio of 4 beads / cell in the presence of approximately 500 IU / mL IL-2 and rapamycin (100 nM). Five days after isolation, cells were transferred to 6 wells / plate and 40 μl / well of beads and IL-2 (500 IU / ml) and rapamycin (100 nM) were added. Medium containing IL-2 was added as needed and the cells were transferred to 10 mm round bottom dish plates for further growth. After 30 days, the beads were removed using MACSiMAG and then used for downstream applications.

Tregの活性化：増殖させたTregを、Celltrace Violetにより、製造元の指示（Life Technologies, Grand Island, NY）に従って標識した。1.5×10⁵個の増殖させたTregおよび3×10⁵個のTreg増殖用ビーズ（CD3抗体およびCD28抗体をあらかじめ添加したMACSiBead粒子；Miltenyi Biotech）を丸底96ウェルプレートにプレーティングし、5％血清、1％ Pen-Strepおよびほぼ500IU／mLのIL-2を加えたX-VIVO 15培地中で、12H3（0.5および5μg／ml）および／またはヒトOX40L（1μg／ml、R&D Systems）および抗His mAb（1μg／ml、R&D Systems）を伴うかまたは伴わずに、37℃でインキュベートした。3日後に、細胞を白血球活性化カクテルおよびBD GolgiPlug（2μl／ml、BD Biosciences, San Jose, CA）で5時間にわたり再刺激し、洗浄した上で、LIVE／DEAD（登録商標）Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit（Life Technologies）を用いて製造元の指示に従って染色した。細胞を1回洗浄し、細胞内染色を、Foxp3／Transcription Factor Staining Buffer Set（eBioscience, San Diego, CA）を製造元のプロトコールに従って用いる固定／透過処理後に行った。以下の抗体を用いた：CD3 V500（クローンSP34-2、BD Biosciences）；FOXP3 PE（クローン206D、Biolegend）；CD4 PerCP（クローンOKT4、Biolegend）；およびOX40（クローンACT35、eBioscience）。細胞を4℃で30分間インキュベートして、洗浄した。細胞をBD Cantoフローサイトメーター（BD Biosciences）に投入し、生存状態のシングレットCD3+ CD4+に対するゲーティングを行った上で、FlowJo（Ashland、OR）を用いて分析した。抗FOXP3 PE（R-フィコエリトリン）に由来する幾何平均蛍光強度（geoMFI）を記録した。 Treg activation: Proliferated Tregs were labeled with Celltrace Violet according to manufacturer's instructions (Life Technologies, Grand Island, NY). 1.5 × 10 ⁵ expanded Treg and 3 × 10 ⁵ Treg growth beads (MACSiBead particles pre-loaded with CD3 and CD28 antibodies; Miltenyi Biotech) were plated on round bottom 96 well plates, 5% 12H3 (0.5 and 5 μg / ml) and / or human OX40L (1 μg / ml, R & D Systems) and anti-antigen in X-VIVO 15 medium supplemented with serum, 1% Pen-Strep and approximately 500 IU / mL IL-2 Incubated at 37 ° C. with or without His mAb (1 μg / ml, R & D Systems). After 3 days, cells were restimulated with leukocyte activation cocktail and BD GolgiPlug (2 μl / ml, BD Biosciences, San Jose, Calif.) For 5 hours, washed, and LIVE / DEAD® Fixable Near-IR Staining was performed using Dead Cell Stain Kit (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions. Cells were washed once and intracellular staining was performed after fixation / permeabilization using Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, San Diego, Calif.) According to the manufacturer's protocol. The following antibodies were used: CD3 V500 (clone SP34-2, BD Biosciences); FOXP3 PE (clone 206D, Biolegend); CD4 PerCP (clone OKT4, Biolegend); and OX40 (clone ACT35, eBioscience). Cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C. and washed. Cells were loaded into a BD Canto flow cytometer (BD Biosciences), gated on live singlet CD3 + CD4 + and analyzed using FlowJo (Ashland, OR). The geometric mean fluorescence intensity (geoMFI) derived from anti-FOXP3 PE (R-phycoerythrin) was recorded.

図40は、マウス抗ヒトCD134抗体12H3（IgG1）およびヒトOX40Lの両方が、増殖させたTreg（CD4+ CD25-CD127 dim/-）におけるFOXP3発現を低下させたことを示している。12H3およびOX40Lを併用したところ、FOXP3発現抑制に対する効果は相加的であった。これらの結果は、マウス抗ヒト抗体12H3が、エフェクターT細胞に対するその役割を通じてだけではなく、Treg機能に直接的に影響を及ぼすことを示唆する。データは、1人のドナーからの三重反復試料を表している。   FIG. 40 shows that both mouse anti-human CD134 antibody 12H3 (IgG1) and human OX40L reduced FOXP3 expression in expanded Treg (CD4 + CD25-CD127 dim / −). When 12H3 and OX40L were used in combination, the effect on FOXP3 expression suppression was additive. These results suggest that mouse anti-human antibody 12H3 directly affects Treg function, not just through its role on effector T cells. Data represent triplicate samples from one donor.

実施例13．プレートに結合したヒト化抗CD134抗体は、Teff細胞のTreg抑制を改善する
Teff機能のTreg抑制に対する、ヒト化抗CD134抗体12H3 VL1VH1または12H3 VL1VH2（いずれもIgG4／κ）の効果を評価した。 Example 13. Plated humanized anti-CD134 antibody improves Treg suppression of Teff cells
The effect of humanized anti-CD134 antibody 12H3 VL1VH1 or 12H3 VL1VH2 (both IgG4 / κ) on Treg suppression of Teff function was evaluated.

実施例12に記載した通りに、Tregを単離し、増殖させて、活性化させた。指定のある場合は、丸底96ウェルプレートに、PBS中に希釈した12H3 VL1VH1抗体または12H3 VL1VH2抗体またはアイソタイプ対照（10μg／ml）をコーティングした。プレートを37℃で2時間でインキュベートし、続いてすすぎ洗いして、抑制アッセイに用いた。 Tregと同じドナーから単離したCD4+ エフェクターT細胞（Teff）を、Miltenyi BiotechによるAutoMACS ProおよびCD4+ 単離キットを製造元の明細書に従って用いて、凍結PBMCから精製した。Teff細胞を続いて、Celltrace（商標）Violet色素を製造元の指示（Life Technologies, Grand Island, NY）に従って用いて標識した。Teff細胞を、5％血清、1％ Pen-Strepを加えたX-VIVO15培地中に再懸濁させた。1×10⁵個の細胞を各ウェルに添加した。Tregは、Treg：Teff比が0：1（Teffのみ）、1：2、1：4および1：8となるように添加した。Treg Suppression Inspectorビーズ（Miltenyi Biotech）を洗浄して、細胞（TeffまたはTreg）1個当たりビーズ1個の比率となるようにウェルに添加した。各ウェルの最終容量は200μlに調整した。プレートを37℃で4日間インキュベートした。細胞を、白血球活性化カクテルおよびBD GolgiPlug（2μl／ml、BD Biosciences, San Jose, CA）によって5時間かけて再刺激し、洗浄した上で、LIVE／DEAD（登録商標）Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit（Life Technologies）を製造元の指示に従って用いて染色した。細胞を洗浄し、表面染色をAPC結合抗OX40（アロフィコシアニン）（クローンACT35、eBioscience）で行い、その後に細胞内染色を行った。Foxp3／Transcription Factor Staining Buffer Set（eBioscience, San Diego, CA）による固定／透過処理は、製造元のプロトコールに従って行った。以下の抗体を用いた：CD3 V500（クローンSP34-2、BD Biosciences）；CD4 FITC（クローンRPA-T4、BioLegend）。細胞を4℃で30分間インキュベートして洗浄した。細胞をBD Cantoフローサイトメーター（BD Biosciences）に投入し、生存状態のシングレットCD3+ CD4+ Celltrace+に対するゲーティングを行った上で、FlowJo（Ashland、OR）を用いて分析した。 Treg was isolated, grown and activated as described in Example 12. Where indicated, round bottom 96-well plates were coated with 12H3 VL1VH1 antibody or 12H3 VL1VH2 antibody or isotype control (10 μg / ml) diluted in PBS. Plates were incubated for 2 hours at 37 ° C., followed by rinsing and used for inhibition assays. CD4 + effector T cells (Teff) isolated from the same donor as Treg were purified from frozen PBMCs using AutoMACS Pro and CD4 + isolation kit by Miltenyi Biotech according to the manufacturer's specifications. Teff cells were then labeled using Celltrace ™ Violet dye according to manufacturer's instructions (Life Technologies, Grand Island, NY). Teff cells were resuspended in X-VIVO15 medium supplemented with 5% serum, 1% Pen-Strep. 1 × 10 ⁵ cells were added to each well. Treg was added so that the Treg: Teff ratio was 0: 1 (Teff only), 1: 2, 1: 4, and 1: 8. Treg Suppression Inspector beads (Miltenyi Biotech) were washed and added to the wells at a ratio of 1 bead per cell (Teff or Treg). The final volume of each well was adjusted to 200 μl. Plates were incubated for 4 days at 37 ° C. Cells were restimulated with leukocyte activation cocktail and BD GolgiPlug (2 μl / ml, BD Biosciences, San Jose, Calif.) For 5 hours, washed, and LIVE / DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain using Stain Kit (Life Technologies) according to manufacturer's instructions. Cells were washed and surface staining was performed with APC-conjugated anti-OX40 (allophycocyanin) (clone ACT35, eBioscience) followed by intracellular staining. Fixation / permeabilization with Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, San Diego, Calif.) Was performed according to the manufacturer's protocol. The following antibodies were used: CD3 V500 (clone SP34-2, BD Biosciences); CD4 FITC (clone RPA-T4, BioLegend). The cells were incubated for 30 minutes at 4 ° C and washed. Cells were loaded into a BD Canto flow cytometer (BD Biosciences), gated on live singlet CD3 + CD4 + Celltrace + and analyzed using FlowJo (Ashland, OR).

プレートに結合したヒト化12H3抗体は、Teff増殖に対するTregの阻害を弱めた。図41は、Treg抑制inspectorビーズ（Miltenyi, San Diego, CA）で刺激して、プレートに結合した12H3 VL1VH1またはアイソタイプ対照IgG4で処理したTeff細胞の増殖を、Treg／Teff比1：2のTregの存在下で比較したFACS分析のヒストグラムを示している。アイソタイプ対照（hIgG4）と比較して、12H3 VL1VH1は、Celltrace（商標）Violet色素によって検出されるその後の細胞***を表す、後続ピーク（より低い蛍光強度）中の細胞数の増加によって示されるように、Teff増殖に対するTregの阻害効果を弱めた。Celltrace（商標）Violet色素は、細胞内の活性化アミン基と結合する。   Humanized 12H3 antibody bound to the plate attenuated Treg inhibition on Teff proliferation. FIG. 41 shows the growth of Teff cells stimulated with Treg-suppressed inspector beads (Miltenyi, San Diego, Calif.) And treated with 12H3 VL1VH1 bound to the plate or isotype control IgG4, with a Treg / Teff ratio of 1: 2. Shown are histograms of FACS analysis compared in the presence. Compared to the isotype control (hIgG4), 12H3 VL1VH1 shows subsequent cell division detected by Celltrace ™ Violet dye, as indicated by an increase in cell number in the subsequent peak (lower fluorescence intensity) Attenuated the inhibitory effect of Treg on Teff proliferation. Celltrace ™ Violet dye binds to activated amine groups in the cell.

図42は、1人のドナーから単離された細胞に対する、Treg：Teff比が0：1（図42A）または1：4（図42B）でのTeff細胞の複製に対する、キメラ型12H3（ヒトIgG4／κ）、ヒト化12H3 VL1VH1または12H3 VL1VH2（いずれもIgG4／κ）の単独での効果、またはOX40L（5μg／mL）／抗His mAb（5μg／mL）と組み合わせた効果を示している。Tregの非存在下（図42A）において、CD2／CD3／CD28刺激薬ビーズは単独で、ヒトCD134を発現するTeffにおける増殖を誘導した（すなわち、アイソタイプ対照）。キメラ抗CD134抗体およびヒト化抗CD134抗体ならびにOX40Lは、アイソタイプ対照と比較して、CD4+ T細胞の増殖を刺激した。増殖は、2H3 VL1VH2（SF2）とOX40Lの組み合わせを用いると幾分増加した。Tregの存在下において（図42B）、CD2／CD3／CD28刺激薬ビーズのみでは、Treg抑制を伴わないCD4 T細胞の増殖と比較して、誘導されるCD4 T細胞増殖は少なかった（複製指数が約3に対して約5）。Treg抑制は、キメラ型12H3、ヒト化12H3 VL1VH1および12H3 VL1VH2ならびにOX40Lの存在下では弱められた。12H3 VL1VH1または12H3 VL1VH2とOX40Lとの組み合わせの存在により、幾分の相乗効果が実証された。図中には、Teff細胞の増殖を、刺激に応答して少なくとも1回***したTeff細胞の増殖倍数の尺度である複製指数として表現している（例えば、少なくとも1つの***を経た培養の終了時の、100万個単位での細胞数）。   FIG. 42 shows chimeric 12H3 (human IgG4) versus Teff cell replication with Treg: Teff ratios of 0: 1 (FIG. 42A) or 1: 4 (FIG. 42B) for cells isolated from one donor. / Κ), humanized 12H3 VL1VH1 or 12H3 VL1VH2 (both IgG4 / κ) alone or combined with OX40L (5 μg / mL) / anti-His mAb (5 μg / mL). In the absence of Treg (FIG. 42A), CD2 / CD3 / CD28 stimulant beads alone induced proliferation in Teff expressing human CD134 (ie, isotype control). Chimeric and humanized anti-CD134 antibodies and OX40L stimulated CD4 + T cell proliferation compared to isotype controls. Proliferation increased somewhat with the combination of 2H3 VL1VH2 (SF2) and OX40L. In the presence of Treg (FIG. 42B), CD2 / CD3 / CD28 stimulant beads alone induced less CD4 T cell proliferation compared to CD4 T cell proliferation without Treg suppression (replication index was lower). About 3 to about 5). Treg suppression was attenuated in the presence of chimeric 12H3, humanized 12H3 VL1VH1 and 12H3 VL1VH2 and OX40L. The presence of the combination of 12H3 VL1VH1 or 12H3 VL1VH2 and OX40L demonstrated some synergy. In the figure, Teff cell proliferation is expressed as a replication index, which is a measure of the growth factor of Teff cells that have divided at least once in response to a stimulus (eg, at the end of a culture that has undergone at least one division). Of cells in millions).

表3は、5人のドナーから入手した細胞における、12H3 VL1VH2（IgG4κ）に関する、Treg／Teff比が0：1、1：2および1：4のTregの存在下での、Teff増殖に対する効果に対する12H3 VH1VH2 IgG4／κ）の効果をまとめている。増殖の度合いは、複製指数として表現している。Tregの非存在下では、12H3 VL1VH2は全ドナー由来細胞において、アイソタイプ対照（CD2／CD3／CD28ビーズを用いるTeff活性化を伴うもの）と比較して、Teff細胞増殖を刺激した。Treg／Teff比が1：2または1：4のいずれかであるTregの存在下では、12H3 VL1VH2の存在により、全ドナー由来細胞においてTreg抑制が弱められた。   Table 3 shows the effect on Teff proliferation in the presence of Tregs with Treg / Teff ratios of 0: 1, 1: 2, and 1: 4 for 12H3 VL1VH2 (IgG4κ) in cells obtained from 5 donors. 12H3 VH1VH2 IgG4 / κ) are summarized. The degree of proliferation is expressed as a replication index. In the absence of Treg, 12H3 VL1VH2 stimulated Teff cell proliferation in all donor-derived cells compared to isotype controls (with Teff activation using CD2 / CD3 / CD28 beads). In the presence of Treg with a Treg / Teff ratio of either 1: 2 or 1: 4, the presence of 12H3 VL1VH2 attenuated Treg suppression in all donor-derived cells.

これらの結果は、12H3 VL1VH1および12H3 VL1VH2が、CD4エフェクターT細胞に対してそれらの増殖を誘導する効果を有すること、ならびにこれらの抗体がTeffをTregに対してある程度耐性化すること、またはTregそれ自体が抗体の存在下では抑制性が弱くなることを指し示している。   These results indicate that 12H3 VL1VH1 and 12H3 VL1VH2 have the effect of inducing their proliferation against CD4 effector T cells, and that these antibodies tolerate Teff to Treg to some extent, It itself indicates that the inhibitory properties are weakened in the presence of the antibody.

（表３）

(Table 3)

実施例14．ヒト化抗体の最適化
ヒト化20E5抗体の最適化
ヒト化重鎖可変領域（VH）20E5_VH1、20E5_VH2および20E5_VH3のHCDR2は、VH残基位置56〜57に異性化モチーフを含有する（DG、D₅₆G₅₇）。位置56での置換の効果を検討するために、アスパラギン酸（D）残基を、グリシン（G）、アラニン（A）、セリン（S）またはグルタミン酸（E）に突然変異させる。 Example 14 Optimization of humanized antibody Optimization of humanized 20E5 antibody HCDR2 of humanized heavy chain variable region (VH) 20E5_VH1, 20E5_VH2 and 20E5_VH3 contains an isomerization motif at VH residue positions 56-57 (DG, D ₅₆ G ₅₇ ). To examine the effect of the substitution at position 56, the aspartic acid (D) residue is mutated to glycine (G), alanine (A), serine (S) or glutamic acid (E).

ヒト化重鎖可変領域20E5_VH1、20E5_VH2および20E5_VH3のHCDR3は、位置106にメチオニン（M）を含有する（M106）。このメチオニンは大部分が埋没している可能性が高いが、酸化リスクを減少させるために、位置106のメチオニンをロイシン（L）またはイソロイシン（I）に突然変異させる。   HCDR3 of the humanized heavy chain variable regions 20E5_VH1, 20E5_VH2 and 20E5_VH3 contains a methionine (M) at position 106 (M106). This methionine is most likely buried, but the methionine at position 106 is mutated to leucine (L) or isoleucine (I) to reduce the risk of oxidation.

ヒト化重鎖可変領域20E5_VH1、20E5_VH2および20E5_VH3における位置11は、バリン（V）を含有する。この位置での置換は抗体に対して強い構造的影響を及ぼす可能性があり、それ故にその機能にも強い影響を及ぼす可能性がある（Klein et al mAbs 5:22-33, 2013）。位置11での置換の効果を検討するために、バリン（V）残基をロイシン（L）に突然変異させる。   Position 11 in humanized heavy chain variable regions 20E5_VH1, 20E5_VH2 and 20E5_VH3 contains valine (V). Substitution at this position can have a strong structural effect on the antibody and therefore also its function (Klein et al mAbs 5: 22-33, 2013). To examine the effect of the substitution at position 11, the valine (V) residue is mutated to leucine (L).

突然変異は、標準的な方法を用いて、各重鎖可変領域20E5_VH1、20E5_VH2および20E5_VH3に組み入れる。突然変異型HCDR2配列は表4に示されており、突然変異型HCDR3配列は表5に示されている。単一の置換を含有する最適化されたヒト化20E5可変領域は、表6に示されている。親VH領域および最適化されたVH領域のアラインメントは、図43Aおよび図43Bに示されている。最適化されたVH領域の名称は、親VHおよび加えられた置換を示している。そのほかの最適化された可変領域は、標準的な方法を用いて、位置11、56および／または106に同時に置換を加えることによって作製することができる。   Mutations are incorporated into each heavy chain variable region 20E5_VH1, 20E5_VH2 and 20E5_VH3 using standard methods. Mutant HCDR2 sequences are shown in Table 4, and mutant HCDR3 sequences are shown in Table 5. Optimized humanized 20E5 variable regions containing a single substitution are shown in Table 6. The alignment of the parent VH region and the optimized VH region is shown in FIGS. 43A and 43B. The name of the optimized VH region indicates the parent VH and the added substitution. Other optimized variable regions can be made by making substitutions at positions 11, 56 and / or 106 simultaneously using standard methods.

標準的な方法を用いて、得られたVH領域を軽鎖可変領域20E5_VL1または20E5 VL2と対合させ、得られた抗体をIgG4／κとして発現させる。実施例11Aに記載されたプロトコールに従うELISAを用いて、抗体をCD134に対するその結合に関して試験する。実施例13に記載されたプロトコールを用いて、抗体を、Teff細胞の増殖を誘導するその能力、およびTeff増殖に対するTregの阻害効果を弱める能力に関してさらに試験する。親ヒト化20E5抗体に匹敵する特性を有する抗体を、さらなる試験のために選択する。   Using standard methods, the resulting VH region is paired with the light chain variable region 20E5_VL1 or 20E5 VL2 and the resulting antibody is expressed as IgG4 / κ. The antibody is tested for its binding to CD134 using an ELISA according to the protocol described in Example 11A. Using the protocol described in Example 13, the antibodies are further tested for their ability to induce Teff cell proliferation and to attenuate the inhibitory effect of Treg on Teff proliferation. Antibodies with properties comparable to the parent humanized 20E5 antibody are selected for further testing.

（表４）

(Table 4)

（表５）

(Table 5)

（表６）

(Table 6)

ヒト化12H3抗体の最適化
ヒト化重鎖可変領域（VH）12H3_VH1、12H3_VH2および12H3_VH3のHCDR2は、残基54〜56に脱アミドモチーフ（NNG）を含有する（N₅₄N₅₅G₅₆）。脱アミドのリスクを最小限に抑えるために、位置55のアスパラギン（N55）を、グルタミン（Q）、アラニン（A）またはグルタミン酸（E）に突然変異させる。 HCDR2 humanized 12H3 antibodies optimization humanized heavy chain variable region (VH) 12H3_VH1,12H3_VH2 and 12H3_VH3 contain deamidation motif residues _{54~56 (NNG) (N 54 N} 55 G 56). To minimize the risk of deamidation, asparagine at position 55 (N55) is mutated to glutamine (Q), alanine (A) or glutamic acid (E).

ヒト化重鎖可変領域12H3_VH1、12H3_VH2および12H3_VH3のHCDR3は、位置99にメチオニン（M）を含有する（M99）。このメチオニンは大部分が埋没している可能性が高いが、酸化リスクを減少させるために、位置99のメチオニンをロイシン（L）またはイソロイシン（I）に突然変異させる。   HCDR3 of humanized heavy chain variable regions 12H3_VH1, 12H3_VH2 and 12H3_VH3 contains a methionine (M) at position 99 (M99). This methionine is most likely buried, but the methionine at position 99 is mutated to leucine (L) or isoleucine (I) to reduce the risk of oxidation.

ヒト化重鎖可変領域12H3_VH1、12H3_VH2および12H3_VH3における位置11は、バリン（V）を含有する。この位置での置換は抗体に対して強い構造的影響を及ぼす可能性があり、それ故にその機能にも強い影響を及ぼす可能性がある（Klein et al mAbs 5:22-33, 2013）。位置11での置換の効果を検討するために、バリン（V）残基をロイシン（L）に突然変異させる。   Position 11 in humanized heavy chain variable regions 12H3_VH1, 12H3_VH2 and 12H3_VH3 contains valine (V). Substitution at this position can have a strong structural effect on the antibody and therefore also its function (Klein et al mAbs 5: 22-33, 2013). To examine the effect of the substitution at position 11, the valine (V) residue is mutated to leucine (L).

突然変異は、標準的な方法を用いて、各重鎖可変領域12H3_VH1、12H3_VH2および12H3_VH3に組み入れる。突然変異型HCDR2配列は表7に示されており、突然変異型HCDR3配列は表8に示されている。単一の置換を含有する最適化されたヒト化12H3可変領域は表9に示されている。親VH領域および最適化されたVH領域のアラインメントは、図44に示されている。最適化されたVH領域の名称は、親VHおよび加えられた置換を示している。そのほかの最適化された可変領域は、標準的な方法を用いて、位置11、55および／または99に同時に置換を加えることによって作製することができる。   Mutations are incorporated into each heavy chain variable region 12H3_VH1, 12H3_VH2 and 12H3_VH3 using standard methods. Mutant HCDR2 sequences are shown in Table 7, and mutant HCDR3 sequences are shown in Table 8. Optimized humanized 12H3 variable regions containing a single substitution are shown in Table 9. The alignment of the parent VH region and the optimized VH region is shown in FIG. The name of the optimized VH region indicates the parent VH and the added substitution. Other optimized variable regions can be created by making substitutions at positions 11, 55 and / or 99 simultaneously using standard methods.

標準的な方法を用いて、得られたVH領域を軽鎖可変領域12H3_VL1または12H3 VL2と対合させ、得られた抗体をIgG4／κとして発現させる。実施例11Aに記載されたプロトコールに従うELISAを用いて、抗体をCD134に対するその結合に関して試験する。実施例13に記載されたプロトコールを用いて、抗体を、Teff細胞の増殖を誘導するその能力、およびTeff増殖に対するTregの阻害効果を弱める能力に関してさらに試験する。親ヒト化12H3抗体に匹敵する特性を有する抗体を、さらなる試験のために選択する。   Using standard methods, the resulting VH region is paired with the light chain variable region 12H3_VL1 or 12H3 VL2 and the resulting antibody is expressed as IgG4 / κ. The antibody is tested for its binding to CD134 using an ELISA according to the protocol described in Example 11A. Using the protocol described in Example 13, the antibodies are further tested for their ability to induce Teff cell proliferation and to attenuate the inhibitory effect of Treg on Teff proliferation. Antibodies with properties comparable to the parent humanized 12H3 antibody are selected for further testing.

（表７）

(Table 7)

（表８）

(Table 8)

（表９）

(Table 9)

Claims (56)

ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：100の軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：100のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体。   An isolated antibody that binds human CD134, comprising a heavy chain variable region (VH) comprising a light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 100 and a heavy chain complementarity determining region (HCDR) HCDR1, HCDR2, and HCDR3 And optionally having one, two or three amino acid substitutions in the VL of SEQ ID NO: 100. VHがSEQ ID NO：152のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：152のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、請求項1記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 152, and optionally has one, two or three amino acid substitutions in the VH of SEQ ID NO: 152. VHがSEQ ID NO：99のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：99のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、請求項2記載の抗体。   3. The antibody of claim 2, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99, and optionally has one, two or three amino acid substitutions in the VH of SEQ ID NO: 99. HCDR3がSEQ ID NO：16、144または145のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, wherein HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 144, or 145. HCDR2がSEQ ID NO：15、141、142または143のアミノ酸配列を含む、請求項4記載の抗体。   5. The antibody of claim 4, wherein HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 141, 142, or 143. HCDR1がSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含む、請求項5記載の抗体。   6. The antibody of claim 5, wherein HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. a．VLがSEQ ID NO：67もしくは68のアミノ酸配列を含み；かつ
VHが、SEQ ID NO：69、70、71、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、146、147もしくは148のアミノ酸配列を含み、任意でVH直鎖状アミノ酸残基位置11、55もしくは99に1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有する；または
b．VLおよびVHが、
i．それぞれSEQ ID NO：67および69；
ii．それぞれSEQ ID NO：67および70；
iii．それぞれSEQ ID NO：67および71；
iv．それぞれSEQ ID NO：68および69；
v．それぞれSEQ ID NO：68および70；もしくは
vi．それぞれSEQ ID NO：68および71
のアミノ酸配列を含む、請求項2記載の抗体。 a. VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 or 68; and
VH is an amino acid of SEQ ID NO: 69, 70, 71, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 146, 147 or 148 Comprising a sequence and optionally having one, two or three amino acid substitutions at VH linear amino acid residue positions 11, 55 or 99; or
b. VL and VH are
i. SEQ ID NO: 67 and 69, respectively;
ii. SEQ ID NO: 67 and 70, respectively;
iii. SEQ ID NO: 67 and 71, respectively;
iv. SEQ ID NO: 68 and 69, respectively;
v. SEQ ID NO: 68 and 70, respectively; or
vi. SEQ ID NO: 68 and 71, respectively
The antibody according to claim 2, comprising the amino acid sequence of VH直鎖状アミノ酸残基位置にある1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換が、V11L、N55Q、N55A、N55E、M99LまたはM99Iである、請求項7記載の抗体。   8. The antibody of claim 7, wherein the one, two or three amino acid substitutions at the VH linear amino acid residue position are V11L, N55Q, N55A, N55E, M99L or M99I. 結合性分子が、
SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する、請求項8記載の抗体。 The binding molecule is
9. Binds to an extracellular domain epitope of human CD134 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 92. The antibody described. ヒト化またはDeImmunized（商標）されている、請求項1記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, which is humanized or DeImmunized ™. CD134のアゴニストである、請求項1記載の抗体。   2. The antibody of claim 1, which is an agonist of CD134. IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、請求項11記載の抗体。   12. The antibody of claim 11, which is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype. Fc領域に置換を含む、請求項12記載の抗体。   13. The antibody of claim 12, comprising a substitution in the Fc region. 置換が、Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする、請求項13記載の抗体。   14. The antibody of claim 13, wherein the substitution modulates the binding of the antibody to Fcγ receptor (FcγR) or neonatal Fc receptor (FcRn). 置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、請求項14記載の抗体。   Substitution includes S267E / L328F substitution, E233D / G237D / H268D / P271G / A330R substitution, V234A / G237A / P238S / H268A / V309L / A330S / P331S substitution, or M252Y / S254T / T256E substitution, and numbering of residues 15. The antibody of claim 14, according to EU index. 請求項2記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。   An isolated nucleic acid molecule encoding the VH or VL of claim 2. 請求項16記載の核酸分子を含むベクター。   A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 16. 請求項17記載のベクターを含む宿主細胞。   A host cell comprising the vector of claim 17. 対象における免疫応答を強化する方法であって、それを必要とする対象に対して、請求項2記載の抗体を、免疫応答を強化するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。   A method of enhancing an immune response in a subject comprising administering to a subject in need thereof the antibody of claim 2 for a time sufficient to enhance the immune response. 対象における癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、請求項2記載の抗体を、癌を治療するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。   A method of treating cancer in a subject, comprising administering to the subject in need thereof the antibody of claim 2 for a time sufficient to treat the cancer. 癌が、前立腺癌、結腸癌、肺癌、血液悪性腫瘍、黒色腫または膀胱癌である、請求項20記載の方法。   21. The method of claim 20, wherein the cancer is prostate cancer, colon cancer, lung cancer, hematological malignancy, melanoma or bladder cancer. 請求項2記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。   A pharmaceutical composition comprising the antibody according to claim 2 and a pharmaceutically acceptable carrier. ヒトCD134と結合する単離された抗体であって、SEQ ID NO：98の軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）を含み、任意でSEQ ID NO：98のVL中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、抗体。   An isolated antibody that binds human CD134, comprising a light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 98 and a heavy chain variable region (VH) comprising heavy chain complementarity determining regions (HCDR) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 And optionally having one, two or three amino acid substitutions in the VL of SEQ ID NO: 98. VHがSEQ ID NO：134のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：134のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、請求項23記載の抗体。   24. The antibody of claim 23, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 134, and optionally has one, two, or three amino acid substitutions in the VH of SEQ ID NO: 134. VHがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を含み、任意でSEQ ID NO：97のVH中に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を有する、請求項24記載の抗体。   25. The antibody of claim 24, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97, and optionally has one, two or three amino acid substitutions in the VH of SEQ ID NO: 97. HCDR3がSEQ ID NO：8、139または140のアミノ酸配列を含む、請求項23記載の抗体。   24. The antibody of claim 23, wherein HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 139, or 140. HCDR2がSEQ ID NO：7、135、136、137または138のアミノ酸配列を含む、請求項26記載の抗体。   27. The antibody of claim 26, wherein HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 135, 136, 137, or 138. HCDR1がSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む、請求項27記載の抗体。   28. The antibody of claim 27, wherein HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. a．VLがSEQ ID NO：62もしくは63のアミノ酸配列を含み；かつ
VHが、SEQ ID NO：64、65、66、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、149、150もしくは151のアミノ酸配列を含み、任意でVH直鎖状アミノ酸残基位置11、56もしくは106に1つ、2つもしくは3つのアミノ酸置換を有する；または
b．VLおよびVHが、
i．それぞれSEQ ID NO：62および64；
ii．それぞれSEQ ID NO：62および65；
iii．それぞれSEQ ID NO：62および66；
iv．それぞれSEQ ID NO：63および64；
v．それぞれSEQ ID NO：63および65；もしくは
vi．それぞれSEQ ID NO：63および66
のアミノ酸配列を含む、請求項24記載の抗体。 a. VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 or 63; and
VH is SEQ ID NO: 64, 65, 66, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 149 , 150 or 151 amino acid sequences, optionally with one, two or three amino acid substitutions at VH linear amino acid residue position 11, 56 or 106; or
b. VL and VH are
i. SEQ ID NOs: 62 and 64, respectively;
ii. SEQ ID NOs: 62 and 65, respectively;
iii. SEQ ID NO: 62 and 66, respectively;
iv. SEQ ID NO: 63 and 64, respectively
v. SEQ ID NO: 63 and 65, respectively; or
vi. SEQ ID NO: 63 and 66, respectively
25. The antibody of claim 24 comprising the amino acid sequence of VH直鎖状アミノ酸残基位置にある1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換が、V11L、D56G、D56A、D56S、D56E、M106LまたはM106Iである、請求項29記載の抗体。   30. The antibody of claim 29, wherein the one, two or three amino acid substitutions at the VH linear amino acid residue position are V11L, D56G, D56A, D56S, D56E, M106L or M106I. SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38またはSEQ ID NO：92のアミノ酸配列を含む、ヒトCD134の細胞外ドメインのエピトープ
と結合する、請求項30記載の抗体。 31. It binds to an epitope of the extracellular domain of human CD134 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 92. The antibody described. ヒト化またはDeImmunized（商標）されている、請求項23記載の抗体。   24. The antibody of claim 23, wherein the antibody is humanized or DeImmunized ™. CD134のアゴニストである、請求項23記載の抗体。   24. The antibody of claim 23, which is an agonist of CD134. IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、請求項33記載の抗体。   34. The antibody of claim 33, which is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype. Fc領域に置換を含む、請求項34記載の抗体。   35. The antibody of claim 34, comprising a substitution in the Fc region. 置換が、Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする、請求項35記載の抗体。   36. The antibody of claim 35, wherein the substitution modulates the binding of the antibody to Fcγ receptor (FcγR) or neonatal Fc receptor (FcRn). 置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、請求項36記載の抗体。   Substitution includes S267E / L328F substitution, E233D / G237D / H268D / P271G / A330R substitution, V234A / G237A / P238S / H268A / V309L / A330S / P331S substitution, or M252Y / S254T / T256E substitution, and numbering of residues 37. The antibody of claim 36, according to EU index. 請求項24記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。   25. An isolated nucleic acid molecule encoding the VH or VL of claim 24. 請求項38記載の核酸分子を含むベクター。   39. A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 38. 請求項39記載のベクターを含む宿主細胞。   40. A host cell comprising the vector of claim 39. 対象における免疫応答を強化する方法であって、それを必要とする対象に対して、請求項24記載の抗体を、免疫応答を強化するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。   25. A method of enhancing an immune response in a subject, comprising administering to a subject in need thereof the antibody of claim 24 for a time sufficient to enhance the immune response. 対象における癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に対して、請求項24記載の抗体を、癌を治療するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。   25. A method of treating cancer in a subject comprising administering to a subject in need thereof the antibody of claim 24 for a time sufficient to treat the cancer. 癌が、前立腺癌、結腸癌、肺癌、血液悪性腫瘍、黒色腫または膀胱癌である、請求項42記載の方法。   43. The method of claim 42, wherein the cancer is prostate cancer, colon cancer, lung cancer, hematological malignancy, melanoma or bladder cancer. 請求項24記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。   25. A pharmaceutical composition comprising the antibody of claim 24 and a pharmaceutically acceptable carrier. ヒトCD134と結合する単離されたアゴニスト抗体であって、軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）、ならびに軽鎖相補性決定領域（LCDR）LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、
a．HCDR1がSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含み；
b．HCDR2がSEQ ID NO：15、141、142または143のアミノ酸配列を含み；
c．HCDR3がSEQ ID NO：16、144または145のアミノ酸配列を含み；
d．LCDR1がSEQ ID NO：17のアミノ酸配列を含み、
e．LCDR2がSEQ ID NO：18のアミノ酸配列を含み；かつ
f．LCDR3がSEQ ID NO：19のアミノ酸配列を含み；
ただし、SEQ ID NO：14、15および16のHCDR1、HCDR2およびHCDR3アミノ酸配列を含むVH、ならびにSEQ ID NO：17、18および19のLCDR1、LCDR2およびLCDR3アミノ酸配列を含むVLを含まないことを条件とする、抗体。 An isolated agonist antibody that binds human CD134, comprising a light chain variable region (VL) and a heavy chain variable region (VH) comprising heavy chain complementarity determining regions (HCDR) HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain Complementarity determining region (LCDR) including LCDR1, LCDR2 and LCDR3,
a. HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
b. HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, 141, 142 or 143;
c. HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 144 or 145;
d. LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17,
e. LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; and
f. LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;
Provided that the VH containing the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 amino acid sequences of SEQ ID NO: 14, 15 and 16 and the VL containing the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 amino acid sequences of SEQ ID NOs: 17, 18 and 19 are excluded. An antibody. a．それぞれSEQ ID NO：14、15、144；
b．それぞれSEQ ID NO：14、141、16；
c．それぞれSEQ ID NO：14、142、16；
d．それぞれSEQ ID NO：14、141、144；または
e．それぞれSEQ ID NO：14、142、144
である、HCDR1、HCDR2およびHCDR3配列を含む、請求項45記載の単離された抗体。 a. SEQ ID NO: 14, 15, 144 respectively
b. SEQ ID NO: 14, 141, 16 respectively;
c. SEQ ID NO: 14, 142, 16 respectively;
d. SEQ ID NO: 14, 141, 144 respectively; or
e. SEQ ID NO: 14, 142, 144 respectively
46. The isolated antibody of claim 45, comprising the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 sequences, wherein ヒト化、DeImmunized（商標）されているか、またはヒト型である、請求項45記載の単離された抗体。   46. The isolated antibody of claim 45, wherein the antibody is humanized, DeImmunized ™, or human. IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプのものである、請求項47記載の単離された抗体。   48. The isolated antibody of claim 47, which is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype. Fcγ受容体（FcγR）または新生児Fc受容体（FcRn）に対する抗体の結合をモジュレートする置換をFc領域に含み、置換が、S267E／L328F置換、E233D／G237D／H268D／P271G／A330R置換、V234A／G237A／P238S／H268A／V309L／A330S／P331S置換、またはM252Y／S254T／T256E置換を含み、残基の番号付けがEUインデックスによる、請求項48記載の単離された抗体。   The Fc region contains a substitution that modulates antibody binding to Fcγ receptor (FcγR) or neonatal Fc receptor (FcRn), wherein the substitution is an S267E / L328F substitution, an E233D / G237D / H268D / P271G / A330R substitution, V234A / 49. The isolated antibody of claim 48, comprising a G237A / P238S / H268A / V309L / A330S / P331S substitution, or an M252Y / S254T / T256E substitution, wherein the residue numbering is by EU index. 請求項45記載のVHまたはVLをコードする、単離された核酸分子。   46. An isolated nucleic acid molecule encoding the VH or VL of claim 45. 請求項50記載の核酸分子を含むベクター。   51. A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 50. 請求項51記載のベクターを含む宿主細胞。   52. A host cell comprising the vector of claim 51. 個体における免疫応答を強化する方法であって、それを必要とする個体に対して、請求項45記載の抗体を、免疫応答を強化するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。   49. A method of enhancing an immune response in an individual comprising administering to an individual in need thereof the antibody of claim 45 for a time sufficient to enhance the immune response. 個体における癌を治療する方法であって、それを必要とする個体に対して、請求項45記載の抗体を、癌を治療するのに十分な時間にわたって投与する段階を含む、方法。   49. A method of treating cancer in an individual comprising administering to an individual in need thereof the antibody of claim 45 for a time sufficient to treat the cancer. 癌が、前立腺癌、結腸癌、肺癌、血液悪性腫瘍、黒色腫または膀胱癌である、請求項54記載の方法。   55. The method of claim 54, wherein the cancer is prostate cancer, colon cancer, lung cancer, hematological malignancy, melanoma or bladder cancer. ヒトCD134と結合する単離されたアゴニスト抗体であって、軽鎖可変領域（VL）ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR）HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む重鎖可変領域（VH）、ならびに軽鎖相補性決定領域（LCDR）LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含み、
a．HCDR1がSEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含み；
b．HCDR2がSEQ ID NO：7、135、136、137または138のアミノ酸配列を含み；
c．HCDR3がSEQ ID NO：8、139または140のアミノ酸配列を含み；
d．LCDR1がSEQ ID NO：9のアミノ酸配列を含み；
e．LCDR2がSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含み；かつ
f．LCDR3がSEQ ID NO：11のアミノ酸配列を含み；
g．ただし、SEQ ID NO：6、7および8のHCDR1、HCDR2およびHCDR3アミノ酸配列を含むVH、ならびにSEQ ID NO：9、10および11のLCDR1、LCDR2およびLCDR3アミノ酸配列を含むVLを含まないことを条件とする、抗体。 An isolated agonist antibody that binds human CD134, comprising a light chain variable region (VL) and a heavy chain variable region (VH) comprising heavy chain complementarity determining regions (HCDR) HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain Complementarity determining region (LCDR) including LCDR1, LCDR2 and LCDR3,
a. HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
b. HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 135, 136, 137 or 138;
c. HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 139 or 140;
d. LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
e. LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; and
f. LCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
g. Provided that VH containing HCDR1, HCDR2 and HCDR3 amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, 7 and 8 and VL containing LCDR1, LCDR2 and LCDR3 amino acid sequences of SEQ ID NOs: 9, 10 and 11 are excluded. An antibody.

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