JP2016508510A - 肥満障害に対する機能性ペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する株の培養液上清の作用によるダイズグリシニンの加水分解にて得られる特定のペプチドに関する。これらのペプチド、これらを含有する抽出物、およびこれらを含有する食品は、肥満症および酸化ストレスの治療および/または予防に有用である。
Description
〔技術分野〕
本発明は、ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する株(菌株)の培養液上清の作用によるダイズグリシニンの加水分解にて得られる特定のペプチドに関連する。
本発明は、ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する株(菌株)の培養液上清の作用によるダイズグリシニンの加水分解にて得られる特定のペプチドに関連する。
これらのペプチド、これらを含有する抽出物およびこれらを含有する食品は、肥満症および酸化ストレスの治療および/または予防に有用である。
〔背景技術〕
肥満症は、複数の有害な病状の進行につながる現代社会における深刻な疫病である。肥満に関連する障害は、II型糖尿病、心血管疾患、いくつかの種類の癌、および他の多くの疾病と言った多数の長期的な合併症を引き起こし得る。食生活およびエネルギー消費における行動修正は、体重の減少をもたらし得るか、エネルギー摂取がエネルギー消費を越えた場合に肥満の原因となるか、は明らかである。これまでに、肥満症に対する潜在的な薬剤治療に多くの焦点が当てられており、特に、新しいアプローチとして、食物中の脂肪の消化を阻害することができる官能性化合物の調査に基づくものがある(Shi Y, Burn P; 2004; Lipid metabolic enzymes: emerging drug targets for the treatment of obesity; Nat. Rev. Drug Discover. 3: 695-710)。
肥満症は、複数の有害な病状の進行につながる現代社会における深刻な疫病である。肥満に関連する障害は、II型糖尿病、心血管疾患、いくつかの種類の癌、および他の多くの疾病と言った多数の長期的な合併症を引き起こし得る。食生活およびエネルギー消費における行動修正は、体重の減少をもたらし得るか、エネルギー摂取がエネルギー消費を越えた場合に肥満の原因となるか、は明らかである。これまでに、肥満症に対する潜在的な薬剤治療に多くの焦点が当てられており、特に、新しいアプローチとして、食物中の脂肪の消化を阻害することができる官能性化合物の調査に基づくものがある(Shi Y, Burn P; 2004; Lipid metabolic enzymes: emerging drug targets for the treatment of obesity; Nat. Rev. Drug Discover. 3: 695-710)。
過去数十年間において、脂質代謝に関与する酵素の大多数は、精製され、特徴付けられてきた。トリアシルグリセロールおよびリン脂質の両方の脂肪を消化するリパーゼが、肥満についての主要な関心事である。最も重要なリパーゼの1つは、食事性脂肪の加水分解の50〜70%を占める膵リパーゼ(PL)である(Mukherjee M; 2003; Human digestive and metabolic lipases: a brief review; J. Mol. Catal. Enzym. B 22: 369-376)。抗肥満化合物の調査においては、PL阻害が最も広く研究されているターゲット機構の1つとなっている(Birari RB, Bhutani KK; 2007; Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential; Drug Discover. Today 12: 879-889)。今日まで、オルリスタットがヨーロッパで認可されている唯一の薬剤であり、末梢機構の作用によって脂肪の吸収を減少させる(Lunder M, Bratkovic, T, Kreft, S and Strukelj, B; 2005; Peptide inhibitor of pancreatic lipase selected by phage display using different elution strategies; Journal of Lipid Research 46: 1512-1516)。
さらに、脂質の消化および吸収における膵ホスホリパーゼA2(PLA2)の重要性を示唆する細胞および動物の研究からの注目に値する証拠がある。ホスホリパーゼA2(PLA2)ファミリーは、膜リン脂質の加水分解を触媒し、アラキドン酸(AA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)、および他の多価不飽和脂肪酸(PUFA)を放出する。放出されたPUFAは、エイコサノイドの種々の前駆体、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンを含む20の炭素化合物、および炎症反応に応答可能なリポキシンである。PLA2およびその下流生成物が、脂肪組織中の重要な生物学的媒介物質として作用し得ることが実証されており、いくつかのサイトカインによるPLA2の活性化は、この酵素が、それによって肥満における重要な標的となる炎症経路と脂質代謝との間の細胞リンクとして機能する、ことを示唆している(Abbott M, Tang T mad Sul H; 2010; The role of phospholipase A2-derived mediators in obesity; Drug Discovery Today: Disease Mechanisms 7:3-4)。
一方、脂質代謝の酵素をコードする遺伝子の大部分は、クローン化され、ヒトを含む様々な生物から配列が決定された。系統学的研究により、脂質代謝は、抗肥満薬の研究におけるモデル生物の使用に道を開く非常によく保存された酵母からヒトまでの経路である、ことが明らかになった。この意味で、線虫カエノラブディティスエレガンスは、肥満の研究のための完璧なモデル生物である(Chiang SH, MacDougald OA; 2003; Will fatty worms help cure human obesity; Trends Genet. 19: 523-525)。実際に、干渉RNAを用いた脂肪減少遺伝子の不活性化についてのC.エレガンスでの分析により、体脂肪の減少に関与する305の遺伝子と増加した脂肪の蓄積に関連する112の遺伝子とが同定され、それらの多くは、哺乳類と相同していた(Ashrafi K et al.; 2003; Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes; Nature 421: 268-272)。また、C.エレガンスでは、リパーゼは肥満症に重要な因子である。C.エレガンスのリパーゼの研究グループの最近の報告では、この生物の脂肪代謝が、肥満症と、再生と、老化との間を予期せずリンクしていることを示唆している(Wang MC et al.; 2008; Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans; Science 232: 957-960; Xie T; 2008; Burn fat, live longer; Science 232: 865-866)。
肥満と関連する代謝性疾患との発症を予防する可能性のある天然化合物が研究されている。Gargouriと共同研究者は、いくつかのダイズタンパク質に膵リパーゼ阻害作用があることを報告した(Gragouri et al ; 1984; Studies on the inhibition of pancreatic and microbial lipases by soybean proteins; J Lipid Res., 25:1214-1221)。これらの分子は、酵素における直接的な影響を有しておらず、これらは、酵素と基質との間の接触を避けながら、脂肪エマルジョンを変更する。同様に、何人かの著者等は、リパーゼ活性の阻害特性を有するいくつかの種に存在する基本的なタンパク質を説明している。後に、宮崎等は、米国特許第5,411,956号において、肥満症の治療においてリパーゼの阻害剤として使用されるいくつかのタンパク質を開示した(Wang and Huang; 1984; Inhibitors of lipase activities in soybean and other oil seeds; Plant Physiol., 76:929-934; Tani et al ; 1994; Purification and characterization of proteinous inhibitor of lipase from wheat flour ; J Agri Food Chem., 42:2382-2385; Tsujita et al; 1996; Studies of the inhibition of pancreatic and carboxylester lipases by protamine; J Lipid Res., 37:1481-1487; Gragouri et al; 1984; Inhibition of pancreatic and microbial lipases by proteins; Biochim. Biophys. Acta., 795:326-331)。
同様に、これらおよび他の著者は、腸脂質吸収が、インビボでの消化リパーゼの阻害作用を引き起こすフェノール性物質(すなわち、クロロゲン酸、(+)カテキン、エピカテキン、フロリジン、ルチンおよびプロシアニジン(縮合型タンニン))によって減少したことを証明した(Wang et al; 2006; Green tea catechins inhibit pancreatic phospholipase A2 and intestinal absorption of lipids in ovariectomized rats; J Nutr Bioch., 17:492-498), Juhel et al (Juhel et al; 2000; Green tea extract (AR25) inhibits lipolysis of triglycerides in gastric and duodenal medium in vitro; J Nutr.Biochem., 11:45-51), Sugiyama et al (Sugiyama et al; 2007; Oligomeric Procyanidins in Apple Polyphenol Are Main Active Components for Inhibition of Pancreatic Lipase and Triglyceride Absorption; J Agric Food Chem., 55:4604-4609) and Rahul et al (Rahul et al; 2007; Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential “Drug Discovery” today., 12:19-20)。
化学的、生物工学的、またはタンパク質の酵素処理の手法により達成される、肥満症に関連する機能性ペプチドの研究について、関心が益々高まっているが、探究する領域は残されている。そこで、本発明は、乳酸菌株を用いたグリシニンの微生物消化から得られる、肥満および酸化的ストレスの治療に有用な機能性ペプチドに焦点を当てる。
〔発明の概要〕
第1の態様によれば、本発明は、ダイズのグリシニンの加水分解により取得可能な、PL(膵リパーゼ)および/またはPL2(膵臓のホスホリパーゼ)阻害活性を備えたペプチドに関する。
第1の態様によれば、本発明は、ダイズのグリシニンの加水分解により取得可能な、PL(膵リパーゼ)および/またはPL2(膵臓のホスホリパーゼ)阻害活性を備えたペプチドに関する。
好ましい態様において、本発明は、PL(膵リパーゼ)および/またはPLA2(ホスホリパーゼA2)阻害活性を有するペプチドであり、ストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−2776、および/またはストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−1630、および/またはラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイCNCM I−4270を用いた、ダイズグリシニンの加水分解により得られた、肥満症および/または酸化ストレスの治療または予防に使用するためのペプチド、に関する。
第2の態様によれば、本発明は、次の群から選択される、PLおよび/またはPL2阻害活性を備えたペプチドに関連する。すなわち、配列番号1:EEEGGSVLSG、配列番号2:SDNFEY、配列番号3:EEDQPRPDHPPQRP、配列番号4:SVIKPPTD、配列番号5:QGENEEEDSGAIVTVK、配列番号6:QGENEGEDKGAIVT、配列番号7:QDEDEDEDEDKPRPSRP、配列番号8:DEDEDEDEDKPRPSRP、配列番号9:DEDEDEDKPRPSRP、配列番号10:DEDEDKPRPSRPSQG、配列番号11:GKREQDEDEDEDEDKPRPSRP、配列番号12:HQQEEENEGGSILSG、配列番号13:QGENEGEDKGAIVTVK、配列番号14:SVIKPPTDE、配列番号15:IKPPTDE、配列番号16:NEGDVLV、配列番号17:YNTGDEPVVA、配列番号18:HGKHEDDEDEDEEEDQPRPDHPPQRP、配列番号19:GKHEDDEDEDEEEDQPRPDHPPQRP、配列番号20:DDEDEDEEEDQPRPDHPPQRP、配列番号21:HEDDEDEDEEEDQPRPDHPPQRP、および配列番号22:SGPLVNPから選択される。
好ましい態様において、上記ペプチドは、配列番号1:EEEGGSVLSG、配列番号2:SDNFEY、配列番号3:EEDQPRPDHPPQRP、配列番号4:SVIKPPTD、配列番号5:QGENEEEDSGAIVTVK、および配列番号6:QGENEGEDKGAIVTからなる群から選択され、単離された形態および/または抽出物の形態のいずれかにて、肥満症並びに酸化ストレスの治療および/または予防のために使用され得る。
第3の態様において、本発明は、PL(膵リパーゼ)および/またはPLA2(膵臓のホスホリパーゼ)阻害活性を有する以下の群から選択されるペプチドの少なくとも1つを含む食品に関する。このペプチドは、配列番号1:EEEGGSVLSG、配列番号2:SDNFEY、配列番号3:EEDQPRPDHPPQRP、配列番号4:SVIKPPTD、配列番号5:QGENEEEDSGAIVTVK、および配列番号6:QGENEGEDKGAIVTからなる群から選択される。または、本発明は、肥満症および酸化ストレスの治療および/または予防に有用な上記したペプチドの少なくとも1つを含む抽出物を含む食品に関する。
第4の態様において、本発明は、PL(膵リパーゼ)および/またはPLA2(膵臓のホスホリパーゼ)阻害活性を有する以下の群から選択されるペプチドの少なくとも1つを含む医薬組成物に関する。このペプチドは、配列番号1:EEEGGSVLSG、配列番号2:SDNFEY、配列番号3:EEDQPRPDHPPQRP、配列番号4:SVIKPPTD、配列番号5:QGENEEEDSGAIVTVK、および配列番号6:QGENEGEDKGAIVTからなる群から選択される。または、本発明は、肥満症および酸化ストレスの治療および/または予防に有用な上記したペプチドの少なくとも1つを含む抽出物を含む医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、ラクトバチルス属及びストレプトコッカス属由来のある種の細菌、特に、ストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−2776、および/またはストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−1630、および/またはラクトバチルス・パラカゼイCNCM I−4270、の使用に関し、また、上記ペプチドおよび/または、PL(膵リパーゼ)および/またはPLA2(膵臓のホスホリパーゼ)の阻害活性を有する以下の群から選択されるペプチド、を含有する抽出物を得るための上記株のプロテアーゼを含む上清または細胞、の使用に関する。このペプチドは、配列番号1:EEEGGSVLSG、配列番号2:SDNFEY、配列番号3:EEDQPRPDHPPQRP、配列番号4:SVIKPPTD、配列番号5:QGENEEEDSGAIVTVK、および配列番号6:QGENEGEDKGAIVTから選択される。
〔図面〕
図1は、ダイズグリシニンから得られ、PLA2阻害アッセイから選択された、ペプチド抽出物の、C.エレガンスでの体脂肪の減少における効果を表している。
図1は、ダイズグリシニンから得られ、PLA2阻害アッセイから選択された、ペプチド抽出物の、C.エレガンスでの体脂肪の減少における効果を表している。
図2は、C.エレガンスにおける異なるペプチド抽出物による急性の酸化ストレスに対する保護効果を表している。
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、肥満障害および酸化ストレスの治療および/または予防に使用するために、乳酸菌の異なる株を用いた加水分解によって得られる異なるグリシニンペプチドを提供する。これらのペプチドは、インビトロにて脂肪分解酵素(PLおよびPLA2)を阻害することができ、カエノラブディティスエレガンスを用いたインビボモデルにて、脂肪の蓄積を減少し、急性酸化ストレスから保護することができる。
本発明は、肥満障害および酸化ストレスの治療および/または予防に使用するために、乳酸菌の異なる株を用いた加水分解によって得られる異なるグリシニンペプチドを提供する。これらのペプチドは、インビトロにて脂肪分解酵素(PLおよびPLA2)を阻害することができ、カエノラブディティスエレガンスを用いたインビボモデルにて、脂肪の蓄積を減少し、急性酸化ストレスから保護することができる。
ダイズグリシニンから肥満障害に関連する酵素活性を阻害することが可能なペプチドを取り出すことができる乳酸菌のいくつかの株を選択するために、インビトロでの研究を実施した。ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する10の異なる株の上清培養によりダイズグリシニンを加水分解した72時間後に、ペプチド抽出物を得た。生成した抽出物を、PL酵素およびPLA2酵素を阻害するインビトロでの能力についてスクリーニングした。最後に、選択されたペプチド抽出物を、カエノラブディティスエレガンスのインビボモデルを使用して、脂肪蓄積を減少させる能力についてスクリーニングし、続いて、選択されたペプチド抽出物を、同じ動物系を使用して、急性酸化ストレスに対する保護能力についても試験した。
この研究の結果、いくつかの株の上清からのプロテアーゼを用いたグリシニンの加水分解後に得られたペプチド抽出物は、インビトロにてPLおよびPLA2を阻害することができ、C.エレガンスのインビボモデルを用いると、脂肪蓄積を減少させ、酸化的ストレスから保護することができることが判明した。インビトロでのPLおよびPLA2の阻害とインビボでの脂肪減少とを引き起こす抗酸化ペプチドを、その後、同定した。
これらの特定のペプチド抽出物の消費は、肥満症を患っている人において、または肥満症の家系の人や脂質代謝に問題を持つ人などの肥満に罹患するリスクのある人において、有益に働く。
(株の選択)
グリシニンに対するプロテアーゼ活性を有する最も効率的な乳酸菌を選択するために、ラクトバチルス属およびストレプトコッカス属の異なる株を、以下の加水分解アッセイに供した。
グリシニンに対するプロテアーゼ活性を有する最も効率的な乳酸菌を選択するために、ラクトバチルス属およびストレプトコッカス属の異なる株を、以下の加水分解アッセイに供した。
加水分解のプロセスを行うための基質として、ダイズグリシニンを用いた。Thanh V.H.等(Major proteins of soybean seeds: a straightforward fractionation and their characterization. 1976. J Agric Food Chem 24: 1117-1121)が述べているように、グリシニンは、メルカプトエタノールで処理した後に続く2回の遠心分離工程により大豆粉から抽出されるダイズの主要タンパク質である。グリシニンを分解するのに使用する酵素の供給源のうち10株を試験した。うち分けは、ストレプトコッカス属が6株(株2、3、4、5、6、7)およびラクトバチルス属が4株(株8、9、10および11)である。これらの株の全てを37℃で17時間、適切な培地(ラクトバチルス株に対してはMRS、および、ストレプトコッカス株にはBHI)にて培養し、両方の上清および細胞で約10KDaの分子量のプロテアーゼを、グリシニンの加水分解アッセイにおける酵素の供給源として使用するために、濃縮した。一方で、上清からのプロテアーゼを、4000rpmで15分間の遠心分離して得た。それから、上清を10kDaごとに限外濾過し、その上部を50mMのクエン酸リン酸バッファ(pH7)2mlに再懸濁した。他方で、異なる培養物から得られた細胞を、4000rpmで15分間、食塩水で洗浄し、細胞および上清中のプロテアーゼ活性を評価するために、50mMのクエン酸リン酸バッファ(pH7)に再懸濁した(表1)。
上記により、乳酸菌株の培養上清が、最も高いプロテアーゼ活性を提供するには、そしてそれゆえ、肥満症における機能性ペプチドを製造するには、最も効率的であるということが見出された、と考察される。
(ペプチド抽出物の取得)
50mMのクエン酸リン酸バッファ(pH7)および研究下で濃縮した各10kDの培養上清1.5ml中に、1%のグリシニン13.5mlを用いて、酵素加水分解を37℃で72時間実施した。反応を、3KDaのフィルターおよび低い画分にて限外濾過することにより停止させ、加水分解後に抽出された含有ペプチドについて、インビトロでPLやPLA2などの脂肪分解酵素を阻害する能力を試験するため、そして、C.エレガンスモデルにおける脂肪蓄積を減少させるインビボでの能力を研究するため、評価を行った。
50mMのクエン酸リン酸バッファ(pH7)および研究下で濃縮した各10kDの培養上清1.5ml中に、1%のグリシニン13.5mlを用いて、酵素加水分解を37℃で72時間実施した。反応を、3KDaのフィルターおよび低い画分にて限外濾過することにより停止させ、加水分解後に抽出された含有ペプチドについて、インビトロでPLやPLA2などの脂肪分解酵素を阻害する能力を試験するため、そして、C.エレガンスモデルにおける脂肪蓄積を減少させるインビボでの能力を研究するため、評価を行った。
(インビトロでのPLおよびPLA2の酵素活性を阻害する能力を対象としたペプチド抽出物のスクリーニング)
Sugiyama等(Oligomeric procyanidins in apple polyphenol are main active components for inhibition of pancreatic lipase and triglyceride absorption. J Agric Food Chem (2007); 55: 4604-4609)の記載のように基質として4−メチルウンベリフェリルオレエート(4MUO)を用いて、いくつかの変更を加えて、PL阻害を決定した。各ペプチド抽出物の25μlのアリコートを25μlのPL溶液(1mg/ml)とインキュベートし、500rpmで攪拌しながら26℃で10分間プレインキュベートした。反応を、ダルベッコバッファに溶解した50μlの4MUO(0.1mM)を添加することによって開始した。26℃にて一定の撹拌(500rpm)で20分間インキュベーションした後、反応を0.1Mのクエン酸ナトリウムバッファ(pH 4.2)を100μl添加することによって停止させた。酵素により放出された4−メチルウンベリフェロンの量を蛍光によって測定した。ペプチド抽出物を酵素アッセイでの阻害剤として使用したが、蛍光とおよびペプチドを含むバッファとの間の干渉により、1/20または1/50に希釈する必要があった。
Sugiyama等(Oligomeric procyanidins in apple polyphenol are main active components for inhibition of pancreatic lipase and triglyceride absorption. J Agric Food Chem (2007); 55: 4604-4609)の記載のように基質として4−メチルウンベリフェリルオレエート(4MUO)を用いて、いくつかの変更を加えて、PL阻害を決定した。各ペプチド抽出物の25μlのアリコートを25μlのPL溶液(1mg/ml)とインキュベートし、500rpmで攪拌しながら26℃で10分間プレインキュベートした。反応を、ダルベッコバッファに溶解した50μlの4MUO(0.1mM)を添加することによって開始した。26℃にて一定の撹拌(500rpm)で20分間インキュベーションした後、反応を0.1Mのクエン酸ナトリウムバッファ(pH 4.2)を100μl添加することによって停止させた。酵素により放出された4−メチルウンベリフェロンの量を蛍光によって測定した。ペプチド抽出物を酵素アッセイでの阻害剤として使用したが、蛍光とおよびペプチドを含むバッファとの間の干渉により、1/20または1/50に希釈する必要があった。
Shingh等(A rapid isocratic high-performance liquid chromatography method for determination of cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Journal of Chromatography (2005); 1073:347-353)によって記載されるように、基質として1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスフォコリン(DOPC)を用いて、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって、PLA2酵素阻害を決定した。ウォーターズ2996フォトダイオード検出器アレイとC8カラムハイパーシルBDS(250×4.mm、5 uM)とを用いたウォーターズ2996(HPLC)を、50mMのアンモニウムリン酸バッファ(pH2.7):メタノール(15:85、v/v)の混合物により形成された溶離液アイソクラティック法を実施するのに使用した。表2は、大豆グリシニンから得られたペプチドを抽出物によるPL阻害値を示している。表3は、ダイズグリシニンから得られたペプチドを抽出物によるPLA2阻害値を示している。
ダイズグリシニン由来の最も阻害能の高いペプチド抽出物を、C.エレガンスモデルを用いてインビボで試験するために選択した。これらのペプチド抽出物および割り当てられたコードを、表4に要約する。
(インビボでの脂肪の蓄積を減少させる能力を対象とするペプチド抽出物のスクリーニング)
線虫C.エレガンスでの体脂肪量の減少能力を、グリシニンから得られる上記5ペプチド抽出物のグループにおいて分析した(表4参照)。これらのサンプルは、PLおよびPLA2のインビトロでの阻害に対する高い効果によって選択した。具体的には、5つのペプチド抽出物は、PLA2阻害アッセイ(M20G、M5G、M31G、M27GおよびM29G)から選択した。体脂肪量を、C.エレガンスの野生型株N2において生きた線虫のナイルレッド染色により分析した。実験は、卵期から若齢成虫期(3日成虫)まで、年齢の同期集団で実施した。実験の間、線虫は、NGM寒天プレートにて培養した。制御条件として、対応するペプチド抽出物(100μL/プレート)を含有するNGM、および陽性対照としてオルリスタットを6μg/mL含有するNGMを用いた。ナイルレッドを0.05μg/mlの最終濃度になるように大腸菌OP50株を用いて播種NGMプレート上に既に添加していた。20℃でのインキュベーションの後、若齢成虫(1条件当たり60の線虫)を採取し、VersaFluor(登録商標)蛍光光度計システムを用いてインビボでの蛍光を測定した。処理した線虫にて得られた蛍光を、対照条件(参照サンプル)に供給され線虫の蛍光から算出した。実験は重複して実施した。
線虫C.エレガンスでの体脂肪量の減少能力を、グリシニンから得られる上記5ペプチド抽出物のグループにおいて分析した(表4参照)。これらのサンプルは、PLおよびPLA2のインビトロでの阻害に対する高い効果によって選択した。具体的には、5つのペプチド抽出物は、PLA2阻害アッセイ(M20G、M5G、M31G、M27GおよびM29G)から選択した。体脂肪量を、C.エレガンスの野生型株N2において生きた線虫のナイルレッド染色により分析した。実験は、卵期から若齢成虫期(3日成虫)まで、年齢の同期集団で実施した。実験の間、線虫は、NGM寒天プレートにて培養した。制御条件として、対応するペプチド抽出物(100μL/プレート)を含有するNGM、および陽性対照としてオルリスタットを6μg/mL含有するNGMを用いた。ナイルレッドを0.05μg/mlの最終濃度になるように大腸菌OP50株を用いて播種NGMプレート上に既に添加していた。20℃でのインキュベーションの後、若齢成虫(1条件当たり60の線虫)を採取し、VersaFluor(登録商標)蛍光光度計システムを用いてインビボでの蛍光を測定した。処理した線虫にて得られた蛍光を、対照条件(参照サンプル)に供給され線虫の蛍光から算出した。実験は重複して実施した。
5つのペプチド抽出物の評価から得られた全体的な結果として、PLA2阻害能を有する抽出物では体脂肪減少に高い効果を示した(表5および図1)。
そのPLA2阻害効果から選択されるペプチド抽出物は、全体的に、C.エレガンスにおける脂肪減少(表5)においてより有効であった。図1に示すように、蛍光の減少率は、16.2から37.7%であった。蛍光減少がそれぞれ37.7%31.6%および28.6%であったM5G、M27GおよびM31 Gでの効果が注目に値する際立った点である。
要約すると、インビトロでのPLA2阻害効果において有意なペプチド抽出物のグループは、インビボでの体脂肪減少の効果においても重要であることが見出された。
(急性酸化ストレスに対する保護能力を対象としたペプチド抽出物のスクリーニング)
選択した5つのペプチド抽出物の急性酸化ストレスに対する保護能力について、C.エレガンスのインビボモデルにて分析した。
選択した5つのペプチド抽出物の急性酸化ストレスに対する保護能力について、C.エレガンスのインビボモデルにて分析した。
実験は、C.エレガンスの野生型株N2の年齢同期集団を用いて行った。線虫に、異なるペプチド抽出物(100μL/プレート)を卵段階から5日成虫段階まで供給した。対照供給条件(NGM)、および陽性対照(ビタミンCを0.1μg/mL)を用いた。20℃でのインキュベーション後、線虫を、H2O2(2mM)の新しいプレートに移すことで、酸化ストレスにさらした。線虫集団の生存率を、それぞれの培養条件でのインキュベーションの5時間後に決定した。実験は重複して実施した。
5つの選択されたペプチド抽出物は、二つの異なる試験で分析した。1つ目は(図2参照)、インビトロでPLA2の最も高い阻害を引き起こすサンプル(これらは28.6〜39.1%の間のインビボでの体脂肪を減少する)を含んでいた。サンプルM5G、M31G、M27Gをグリシニン基質から取得し、それらのすべては、線虫において酸化ストレスに対する高い保護性を示した。我々は、対照条件(39.5%)と比較して、酸化ストレス後の高い生存率(53〜64%の間)を観測した。結果として、ペプチド抽出物M5G、M31Gy、M27Gについて、線虫での酸化ストレスに対する高い保護性および脂肪含有量の減少能力が示された(図2)。
要するに、St.サーモフィラスの6、L.パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイの10、およびSt.サーモフィラスの7を用いた加水分解によりグリシニンから得られたペプチド抽出物の3つのグループ、M5G、M31G、M27Gは、C.エレガンスのインビボモデルにおける脂肪減少における高い効果と酸化ストレスに対する有意な保護性とを有し、両方の機能における有益な効果を示す(表6)。
以下の株
株6:ストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−2776
株7:ストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−1630
株10:ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイCNCM I−4270
を、本発明の目的のために好適なものとして選択した。
株6:ストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−2776
株7:ストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−1630
株10:ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイCNCM I−4270
を、本発明の目的のために好適なものとして選択した。
本発明はまた、上記の株だけでなく、変異体株、または既にグリシニンに対するプロテアーゼ活性を有し、本発明の機能性ペプチドを産生するいずれかの親株由来の遺伝的形質転換株、の使用を含む。これらの変異株または遺伝的形質転換株は、例えば、その代謝特性の一部を変更するため、親株の1つ以上の内因性遺伝子(単数または複数)が変異されている株であってもよい。また、これらは、上記株に追加の生理学的特徴を与えることを目的として、例えば1つ以上の関連遺伝子(単数または複数)による親株の遺伝的形質転換から得られた株であってもよい。
(インビトロでのPLA2阻害能力、C.エレガンスモデルにおける脂肪減少能力および酸化ストレスからの保護能力を有する機能性ペプチドの同定)
インビトロでPLA2を阻害でき、インビボで脂肪を減少し、酸化的ストレスから保護できる3つのペプチド抽出物を選択し、それらに存在する機能性ペプチド配列を同定した。機能性ペプチドの同定は、サンプルM5G、M27GおよびM31Gを用いて実施し、nESI−MS/MSによって行った。
インビトロでPLA2を阻害でき、インビボで脂肪を減少し、酸化的ストレスから保護できる3つのペプチド抽出物を選択し、それらに存在する機能性ペプチド配列を同定した。機能性ペプチドの同定は、サンプルM5G、M27GおよびM31Gを用いて実施し、nESI−MS/MSによって行った。
表7には、グリシニン由来の同定されたペプチド配列および各評価試料中の出現回数が含まれている。表7に示される全てのペプチドは、St.サーモフィラスの株6、及びラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイの株10を用いて処理された試料中に存在し、加水分解処理の無い対照試料中では同定されていない。
St.サーモフィラスの株6、およびラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイの株10由来の加水分解物M5GおよびM27Gを選択し、さらにインビトロにて脂肪減少を引き起こすペプチドを同定するために、RPC(逆相クロマトグラフィー)によって精製した。RPC画分を、脂肪減少を研究し、St.サーモフィラスの株6、及びラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイの株10由来の陽性のものに存在するペプチドを同定するために、C.エレガンスについて分析した(表8)。
これらの精製画分から、ペプチドの総量は、インビボにてC.エレガンスの肥満モデルを用いて合成して評価するために、11のペプチドを選択した(表9)。全てのペプチドは、最終濃度1μg/mLにて評価した。
これらのうち30%以上の脂肪蓄積を減少させる能力を有するペプチドを、膵リパーゼ(PL)及びホスホリパーゼA2(PLA2)に関して、インビトロにて評価した。PLの場合には、IC50値を決定し(表10)、PLA2の研究では、各ペプチドの3つの異なる濃度について試験を行った(表11)。
(脂肪減少を潜在的に引き起こす最も耐性のあるペプチドの同定)
インビボでの消化管のインビトロでの酵素消化モデルを、生理学的条件を模倣するために開発し、選択した各ペプチドが、消化プロセスによって胃腸管全体を通して異なって消化されることを確認し証明した。ペプシン、パンクレアチン、および胆汁の濃度は、公開された実験計画(Granado-Lorencio et al(2007). J.Agri. Food. Chem., 55, 6387-6394)を使用して最適化した。
インビボでの消化管のインビトロでの酵素消化モデルを、生理学的条件を模倣するために開発し、選択した各ペプチドが、消化プロセスによって胃腸管全体を通して異なって消化されることを確認し証明した。ペプシン、パンクレアチン、および胆汁の濃度は、公開された実験計画(Granado-Lorencio et al(2007). J.Agri. Food. Chem., 55, 6387-6394)を使用して最適化した。
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって、 ペプチドP14cおよびP16fは、腸内段階の開始時に完全に分解し、一方で、P8aおよびP14bは、プロセスの終了時まで耐えていたが最終的には分解した、ということが観察された(表12)。
本発明のペプチドは、単離された形態でまたは抽出物の形態で食品マトリックスに添加することができる。本発明のペプチドは、単独でまたは混合物の形態で食品マトリックスに添加することができる。
好ましい実施形態において、上記ペプチドを当技術分野で公知の任意の方法によって取得しても製造してもよい。当技術分野で公知の任意の方法には、純粋ペプチドおよび本明細書に記載のように加水分解または発酵によって生成されたタンパク質画分(から単離された)の合成を含む。
本発明のペプチドは、自らのペプチド(例えば、純粋ペプチドの合成から)として、またはタンパク質画分(例えば、加水分解タンパク質または発酵タンパク質)の一部として、食品中に存在してもよい。
本発明の特定の実施形態において、本発明のペプチドは、ダイズグリシニンを含む食品マトリックス中に本発明の菌株を添加した結果として、食品中に存在してもよい。
好ましくは、上記食品は発酵製品である。発酵製品は、液体の形状であっても、発酵液を乾燥して得られた乾燥粉末の形態であってもよい。
上記発酵製品は、好ましくは新鮮な酪農製品であり、より好ましくは発酵乳および/または発酵大豆である。好ましくは、上記栄養組成物は、以下のような、低温殺菌および滅菌された、ミルク、ヨーグルト、および発酵乳である。
滅菌および/または低温殺菌された、ミルク、ヨーグルト、発酵乳、ミルクベースのデザートなどの乳製品。乳幼児およびそれに続く子供のための調乳およびベビーフード。新鮮なおよび/または低温殺菌されたチーズ。フルーツジュース製品、シロップおよび/またはフルーツエッセンス、マーマレード、コンポートおよび/またはジャムなどの、青果製品。豆乳および/または抽出物、タイガーナッツ、穀類、ナッツやドライフルーツ、大豆、果物、ナッツ、ドライフルーツや穀物を基にするミルクおよび発酵抽出物。ミルク、ミルク製品、果物、穀物、米、ベビーフード等を基にする乳幼児用調製乳。重量に問題があったり肥満症である一般の集団や人々のための食品および特別に用意されたものを、直接または間接的に供する、新鮮な、乾燥された、および/または冷凍された、栄養補助食品。濃縮されたおよび/または添加物を入れた水や飲料。発酵製品に由来する機能性ペプチドおよび/または機能性ペプチドの抽出物で機能強化される可能性のある、活性成分として食品マトリックスに添加される可能性のある、一般的な、主食および/または機能製品。
食品中の本発明のペプチドの量は、上記ペプチドの、好ましくは少なくとも0.01g/kg、より好ましくは0.1〜10g/kgであり、さらに好ましくは1〜7g/kg、最も好ましくは3〜7g/kg、例えば5g/kgといった量である。好ましくは、これらの食品中のペプチドの量は、次のように選択される。食品一食の合計量当たりのペプチドの量が、0.01〜1g/kg、好ましくは0.1〜1g、より好ましくは0.1〜0.7g、最も好ましくは0.2〜0.5gであるように選択される。
(実施例)
(1)ペプチドを用いた食品の構築および脂肪減少効果
本研究の目的は、食品マトリックスへの添加後の、グリシニンから得られたより効果的なペプチドの抗肥満効果を評価することであった。我々は、6つの株を用いたグリシニンの加水分解から得られた5つのペプチド(P8a、P6a、P14c、P16f、P14b)を選択した。このグリニシン由来のペプチドを、最終濃度1μg/mLにて単独でまたは混合で大豆発酵物(ダノン社のサビア(Savia)(登録商標))に添加した。線虫にこれらの生成物を与え、次いで、総脂質をナイルレッド染色によって定量した。
(1)ペプチドを用いた食品の構築および脂肪減少効果
本研究の目的は、食品マトリックスへの添加後の、グリシニンから得られたより効果的なペプチドの抗肥満効果を評価することであった。我々は、6つの株を用いたグリシニンの加水分解から得られた5つのペプチド(P8a、P6a、P14c、P16f、P14b)を選択した。このグリニシン由来のペプチドを、最終濃度1μg/mLにて単独でまたは混合で大豆発酵物(ダノン社のサビア(Savia)(登録商標))に添加した。線虫にこれらの生成物を与え、次いで、総脂質をナイルレッド染色によって定量した。
表13は、異なるグリシニンペプチドまたはそれらの組み合わせを含有する大豆発酵物を与えた線虫における蛍光の減少レベルを示している。結果は、大豆発酵物に追加された場合の、全てのグリシニンのペプチドのインビボでの有効性を示唆している。食品マトリックス中のこれらの5つのペプチドの組合せはまた、蛍光の有意な減少をもたらした。
Claims (9)
- PL(膵リパーゼ)阻害活性および/またはPLA2(ホスホリパーゼA2)阻害活性を有するペプチドであり、ストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−2776、および/またはストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−1630、および/またはラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイCNCM I−4270を用いた、ダイズグリシニンの加水分解により得られる、肥満症および/または酸化ストレスの治療または予防に使用するためのペプチド。
- 肥満症および/または酸化ストレスの治療または予防に使用するために、以下の群から選択されることを特徴とする請求項1に記載のペプチド。
配列番号1:EEEGGSVLSG、
配列番号2:SDNFEY、
配列番号3:EEDQPRPDHPPQRP、
配列番号4:SVIKPPTD、
配列番号5:QGENEEEDSGAIVTVK、
配列番号6:QGENEGEDKGAIVT、
配列番号7:QDEDEDEDEDKPRPSRP、
配列番号8:DEDEDEDEDKPRPSRP、
配列番号9:DEDEDEDKPRPSRP、
配列番号10:DEDEDKPRPSRPSQG、
配列番号11:GKREQDEDEDEDEDKPRPSRP、
配列番号12:HQQEEENEGGSILSG、
配列番号13:QGENEGEDKGAIVTVK、
配列番号14:SVIKPPTDE、
配列番号15:IKPPTDE、
配列番号16:NEGDVLV、
配列番号17:YNTGDEPVVA、
配列番号18:HGKHEDDEDEDEEEDQPRPDHPPQRP、
配列番号19:GKHEDDEDEDEEEDQPRPDHPPQRP、
配列番号20:DDEDEDEEEDQPRPDHPPQRP、
配列番号21:HEDDEDEDEEEDQPRPDHPPQRP、および、
配列番号22:SGPLVNP - 肥満症および/または酸化ストレスの治療または予防に使用するために、以下の群から選択されることを特徴とする請求項1または2に記載のペプチド。
配列番号1:EEEGGSVLSG、
配列番号2:SDNFEY、
配列番号3:EEDQPRPDHPPQRP、
配列番号4:SVIKPPTD、
配列番号5:QGENEEEDSGAIVTVK、および、
配列番号6:QGENEGEDKGAIVT - 請求項1から3に記載のペプチドを1つ以上含むことを特徴とする肥満症および/または酸化ストレスの治療に適した食品。
- 前記ペプチドは抽出物の形態であることを特徴とする請求項4に記載の食品。
- 前記ペプチドは単離された形態であることを特徴とする請求項4に記載の食品。
- 前記食品の一人分の合計量当たりの前記ペプチドの量は0.01〜1gであることを特徴とする請求項4から6のいずれか1項に記載の食品。
- 前記ペプチドを少なくとも0.01g/kg含むことを特徴とする請求項4から7のいずれか1項に記載の食品。
- 請求項1から3に記載のペプチドおよび抽出物の製造のための処理における、ダイズグリシニンの存在下でのストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−2776、および/またはストレプトコッカス・サーモフィラスCNCM I−1630、および/またはラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイCNCM I−4270の使用方法。
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