JP2016508509A - 糖尿病を治療するための改変されたingapペプチド - Google Patents
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Abstract
糖尿病を予防または治療するための新規なINGAPペプチドならびにその組成物および使用方法が提供される。詳細には、β細胞新生活性およびインスリン強化活性を有し、インビボ使用のために十分に安定性であるINGAPの19アミノ酸ペプチドについて記載する。
Description
(優先権の主張)
本出願は、その内容が参照により明確に組み込まれる2013年2月15日に出願の米国仮特許出願第61/765203号明細書に対する優先権を主張するものである。
本出願は、その内容が参照により明確に組み込まれる2013年2月15日に出願の米国仮特許出願第61/765203号明細書に対する優先権を主張するものである。
(技術分野)
本発明は、糖尿病を治療および予防するための膵島β細胞の新生、または再生活性を備えるINGAPペプチド、ならびにそれらの組成物および方法に関する。
本発明は、糖尿病を治療および予防するための膵島β細胞の新生、または再生活性を備えるINGAPペプチド、ならびにそれらの組成物および方法に関する。
世界中で一億人を越える人々が真性糖尿病に罹患している。米国では、糖尿病に罹患した人々の推定医療費は年間およそ1,360億ドルである。真性糖尿病は、膵臓が十分な量のインスリンを分泌できないことを特徴とする代謝障害であり、血糖値の大きな変動を生じさせ、短期的および長期的両方の生理学的結果をもたらすことがある。1型糖尿病(インスリン依存性真性糖尿病、もしくはIDDM)を有する患者における血糖値上昇(高血糖症)から発生する長期的合併症には、網膜症、神経障害、腎症およびその他の血管合併症が含まれる。低血糖値(低血糖症)は、糖尿病性の昏睡、発作、偶発症候、無酸素症、脳損傷、認知機能低下および死亡を引き起こす可能性がある。
非インスリン依存性真性糖尿病もしくはNIDDMとしても公知である2型糖尿病は、結果として血糖値上昇を生じさせる損傷したグルコース代謝を特徴とする進行性疾患である。2型糖尿病の患者は、高血糖症性シグナルに応答して膵臓β細胞が適切な量のインスリンを分泌する障害を生じさせる膵臓β細胞機能の損傷および標的組織でのインスリン作用に対する耐性(インスリン耐性)を示す。
2型糖尿病の最新の治療は、インスリン耐性を反転させ、腸管グルコース吸収を制御し、肝グルコース産生を正常化し、β細胞のグルコース感知およびインスリン分泌を改善することを目指している。糖尿病に対する最新治療には欠点があるため、1型糖尿病および2型糖尿病のための新規な治療ならびに新規な診断法および予後診断法は高度に望ましい。
ますます多くの確証が、1型糖尿病および2型糖尿病の根底には不適正なβ細胞質量が存在することを指摘している。このため、糖尿病患者におけるβ細胞の再生は糖尿病研究の重要な目標である。近年、インサイチュ(in situ)でのβ細胞の再生および新規な膵島形成を誘導するための新規の戦略の開発にますます関心が高まってきた(Baggio,L.L.and Drucker,D.J.,2006,Annu Rev Med,57,265−281(非特許文献1))。このため、残存しているβ細胞質量の拡大を刺激する能力または膵島新生活性を備える生物活性分子の同定が、生来の膵臓の再生能を活用するために極めて重要である。
膵島新生関連タンパク質(INGAP)は、部分閉塞したハムスター膵臓由来の粗抽出物中で最初に同定された16.8kDaのタンパク質である(Rosenberg,L.,et al.,1988,Diabetes,37,334−341(非特許文献2);米国特許第5834590号明細書(特許文献1))。INGAPは膵臓および十二指腸で発現し、幾つかの種では膵島新生を誘導することが証明されている(Rosenberg,L.,et al.,1996,Diabetologia,39,256−262(非特許文献3);Rosenberg,L.,et al.,2004,Ann Surg 240,875−884(非特許文献4))。構造的には、INGAPは、一次配列に基づいて4サブファミリーに分類される、25を超えるメンバーを含む分泌C型レクチンのRegファミリーのメンバーである(Zhang,Y.W.,et al.,2003,World J Gastroenterol,9,2635−2641(非特許文献5);Okamoto,H.,1999,J Hepatobiliary Pancreat Surg 6:254−262(非特許文献6))。
INGAPは、ラット、マウス、ハムスターおよびヒトの主として消化管組織(膵臓、胃、肝臓)内で同定されている大きなReg3サブファミリーに属する(Rafaeloff,R,et al.,1997,J Clin Invest 99,2100−2109(非特許文献7))。Regタンパク質は遍在性であるにもかかわらず、Regタンパク質の機能もしくは作用機序について余り多くは知られていない。Reg1はβ細胞***誘発因子であると考えられるが、Reg3ファミリーの機能についてはほとんど知られていない。
多数の研究は、Regが特異的細胞表面受容体に結合し、複数のシグナル伝達経路を活性化できることを示唆している。この受容体仮説を支持する論拠は、INGAPの生物活性がこのタンパク質の15アミノ酸フラグメント(アミノ酸104〜118)、つまり高度に保存されたIGLHDPモチーフおよびRegファミリーの他のメンバー内では見いだされない固有の配列SHGTLPNGSからなるINGAPペプチド(INGAP−P)によって媒介されると思われることである(Rafaeloff,R.,et al.,1997,J Clin Invest 99,2100−2109(非特許文献8))。合成INGAPペプチドは、ハムスターおよびマウスにおいて新規の膵島形成を誘導し、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病を反転させることにおいてこのタンパク質と同等に有効であることが実証されているので(Rosenberg,L.,et al.,1996,Diabetologia,39,256−262(非特許文献9);Rosenberg,L.,et al.,2004,Ann Surg 240,875−884(非特許文献10))、このため受容体にとって可能性のあるリガンドである。合成INGAP−Pの生物学的作用は、インビトロおよびインビボの両方において広範に研究されてきた。現在までに、INGAP−Pは、1)脱分化膵島由来管様構造からの機能的ヒト膵島のインビトロ再生を誘導する(Jamal.,A.M.,et al.,2005,Cell Death Differ,12,702−712(非特許文献11)、2)齧歯類、イヌおよびカニクイザルにおいてβ細胞質量の拡大を用量依存性で刺激する(Lipsett,M.,et al.,2007,Cell Biochem Biophys,48,127−137(非特許文献12);Pittenger,G.L.,et al.,2007,Pancreas,34,103−111(非特許文献13))、および3)インスリン分泌およびβ細胞のサイズを増加させ、インビトロでラット新生児膵島におけるβ細胞機能に関連する数種の遺伝子の発現をアップレギュレートする(Barbosa,H.,et al.,2006,Regul Pept,136,78−84(非特許文献14);Borelli,M.I.,et al.,2005,Regul Pept,131,97−102(非特許文献15))ことが証明されている。これらの重要な結果が得られた後に、ヒトにおける有効性および安全性を調査するための臨床試験が実施され、INGAP−Pは2型糖尿病を有する患者における90日後のグリコシル化ヘモグロビン(HbAlC、もしくはAIC)の減少および1型糖尿病を有する患者におけるCペプチド分泌の有意な増加によって確証されたグルコース恒常性の改善を含むシグナル効果を有することが見いだされた(Dungan,K.M.,et al.,2009,Diabetes Metab Res Rev,25,558−565(非特許文献16))。
これらのデータがINGAP−Pは膵島新生活性およびインスリン分泌促進活性のどちらも有することを示唆しているにもかかわらず、動物実験およびヒト臨床試験から15−merのINGAP(INGAP−P)には安定性が欠如することは明白である。したがって、必要とされる血清中および組織中閾値レベルを研究するためには極めて大用量が投与されなければならない。不良な安定性は、さらに例えば薬物製剤、局所的注射部位反応についての患者の承諾および高額のコストに関する問題を引き起こす。このため、INGAP−Pに比較して、インビボでの匹敵する、もしくはより大きな生物活性および/またはより大きな安定性もしくはより長い半減期を備えるINGAPアナログが必要とされる。
Baggio,L.L.and Drucker,D.J.,2006,Annu Rev Med,57:265−281
Rosenberg,L.,et al.,1988,Diabetes,37,334−341
Rosenberg,L.,et al.,1996,Diabetologia,39,256−262
Rosenberg,L.,et al.,2004,Ann Surg 240,875−884
Zhang,Y.W.,et al.,2003,World J Gastroenterol,9,2635−2641
Okamoto,H.,1999,J Hepatobiliary Pancreat Surg 6:254−262
Rafaeloff,R,et al.,1997,J Clin Invest 99,2100−2109
Rafaeloff,R.,et al.,1997,J Clin Invest 99,2100−2109
Rosenberg,L.,et al.,1996,Diabetologia,39,256−262
Rosenberg,L.,et al.,2004,Ann Surg 240,875−884
Jamal.,A.M.,et al.,2005,Cell Death Differ,12,702−712
Lipsett,M.,et al.,2007,Cell Biochem Biophys,48,127−137
Pittenger,G.L.,et al.,2007,Pancreas,34,103−111
Barbosa,H.,et al.,2006,Regul Pept,136,78−84
Borelli,M.I.,et al.,2005,Regul Pept,131,97−102
Dungan,K.M.,et al.,2009,Diabetes Metab Res Rev,25,558−565
我々は以前に、REG3タンパク質の異種間哺乳動物ファミリーのメンバーであり(図19を参照)、膵島再生のハムスターモデルにおいて管細胞がβ膵島細胞へ分化するのを誘導できる、膵島新生関連タンパク質(INGAP)と呼ばれる膵臓タンパク質を同定した(Rosenberg,L.et al.,J Surg Res,1983,35:63−72;Rosenberg,L.et al.,Diabetes,1988,37:334−341;Rosenberg,L.et al.,Diabetologia,1996,39:256−262)。アミノ酸104〜118を含有するINGAPタンパク質の15−merペプチドフラグメント(INGAP−P)は、INGAPの生物活性の中心であると同定された。
INGAPおよびINGAP−Pはどちらも管細胞の膵島への分化を誘導することが証明されている。膵島再生のヒトインビトロモデルでは、INGAP−Pは膵臓発生転写因子であるPDX−1の発現増加および新規膵島の同時形成を誘導する(Jamal.,A.M.,et al.,Cell Death Differ.,2003,10:987−996;Jamal.,A.M.,et al.,Cell Death Differ.,2005,12:702−712)。動物モデルでは、INGAP−Pは、インビトロでの管細胞増殖および管上皮と関連する細胞からの膵島細胞再生を誘導し、正常成体のマウス、ハムスターおよびイヌの膵臓における新規な膵島形成を導く。糖尿病のSTZ処置C57BL/6Jマウスモデルでは、INGAP−Pは糖尿病状態を反転させた(Pittenger,G.L.,et al.,Pancreas,2007,34:103−111;Rosenberg,L.,et al.,Ann.Surg.,2004,240:875−884(2004);Kapur,R.et al.,INGAP Induces Duct Cell Proliferation In Vitro and beta Cell Formation in Normal Non Diabetic Mice,71st ADA Meeting,San Diego,2011)。確立された(非初発の)自己免疫TIDMのNODマウスモデルにおいて、免疫モジュレーターであるIL−12インヒビターのリソフィリン(lisofylline)と併用したINGAP−Pは高血糖症の寛解およびインスリンペレットの必要の排除を誘導した(Tersey,S.A.et al.,Unique Drug Combination for Reversal of Type 1 Diabetes,68th Scientific Sessions American Diabetes Association(ed.ADA),San Fransisco,CA,2008;Tersey,S.A.et al.,Journal of Diabetes Mellitus,2012、in press)。組織学的検査は、新規膵島の証拠を確認した。
ヒト臨床試験では、INGAP−PはT1DMおよびT2DM両方の患者を対象とする1相および2相臨床試験で評価されてきた(Dungan,K.M.et al.,Diabetes Metab Res Rev,2009,25:558−565)。3カ月間にわたるINGAP−Pの一日一回の注射は、T1DM患者における刺激されたCペプチド分泌の統計的有意な増加およびT2DM患者におけるCペプチドレベル上昇に向かう傾向を誘発した。グリコシル化ヘモグロビン(HbAlc)は、T2DM患者においては−0.6%(p<0.0125)減少し、T1DM患者においては−0.4%(p<0.06)減少した。
これらの高度に前途有望な結果が得られたにもかかわらず、INGAP−Pの相当に短い血漿半減期は、INGAP−Pを治療薬として使用することについての課題を依然として提示している。
したがって本明細書では、INGAP−Pの一つ以上の生物活性を維持している、治療薬として開発するために適切なINGAPペプチドが提供される。一つの実施形態では、本発明のペプチドは、INGAP−Pに比較して、インビボでの匹敵する、もしくはより大きな生物活性および/またはより大きな安定性もしくはより長い半減期を有する。
本明細書の一つの実施形態では、配列番号4または配列番号6に規定した配列を含むペプチドが提供される。
本明細書のまた別の実施形態では、配列番号4または配列番号6に規定した配列からなるペプチドが提供される。
一部の実施形態では、本発明のペプチドは、膵臓β細胞新生を誘導する、膵臓β細胞再生を誘導する、被験者におけるグルコース恒常性を改良する、および/または高血糖症を反転する。
本明細書では、本発明のペプチドのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体であって、前記ペプチドの生物活性を有するアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体もまた提供される。アナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体は、本発明のペプチドと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の配列同一性を有していてよい。生物活性は、例えば、前記ペプチドの細胞もしくは受容体結合特異性、膵臓β細胞新生を誘導する能力、膵島細胞再生を誘導する能力、被験者におけるグルコース恒常性を改良する能力および/または高血糖症を反転する能力であってよい。
本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体をコードする核酸配列を含む核酸分子もまた提供される。核酸分子は、発現ベクターを形成するために発現制御配列へ機能的に連結していてよいが、このとき上記発現ベクターは、適切な細胞内で増殖させられる。
本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体および医薬上許容される担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物もまた提供される。一つの実施形態では、組成物は経口投与に適合する。また別の実施形態では、組成物は注射による投与に適合する。
また別の実施形態では、膵臓の状態もしくは疾患を予防もしくは治療するための方法であって、それを必要とする被験者に本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体または組成物を投与する工程を含む方法が提供される。一つの実施形態では、状態もしくは疾患は、代謝障害である。また別の実施形態では、状態もしくは疾患は、β細胞関連障害である。また別の実施形態では、状態もしくは疾患は、1型糖尿病、2型糖尿病または糖尿病の合併症である。
一部の実施形態では、被験者におけるアポトーシスもしくはネクローシスによるβ細胞死は、本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体または組成物を投与する工程によって予防もしくは阻止される。他の実施形態では、被験者における膵臓細胞の機能性が改良もしくは回復させられる、被験者における血漿中インスリンレベルが増加させられる、被験者における膵臓β細胞の数もしくはサイズが増加させられる、被験者における膵臓管細胞からのβ細胞再生が刺激される、被験者におけるグルコース恒常性が回復もしくは改良させられる、および/または被験者における高血糖症が反転させられる。
本発明のペプチドおよび組成物は、注射、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下投与されてよい。一つの実施形態では、ペプチドおよび組成物は、一日一回経口投与される。
特定の実施形態では、被験者はヒトである。
一部の実施形態では、本発明のペプチドは、第二治療薬とともに投与される。第二治療薬は、本発明のペプチドと同時に投与されてよい、または第二治療薬およびペプチドは連続的に投与されてよい。一つの実施形態では、第二治療薬は、1型糖尿病または2型糖尿病のための治療薬である。また別の実施形態では、第二治療薬はアナキンラ(anakinra)である。
本発明のペプチドおよび医薬上許容される担体もしくは賦形剤を含む、膵機能不全症を治療するための医薬組成物もまた提供される。一つの実施形態では、ペプチドもしくは組成物は、膵臓管細胞からのβ細胞再生を刺激することができる。また別の実施形態では、ペプチドもしくは組成物は、哺乳動物INGAPタンパク質の生物活性を有する。一つの実施形態では、生物活性は、膵臓管様細胞もしくは管関連細胞が成長および増殖するのを刺激する能力である。
本明細書に記載した本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体をコードする核酸分子もまた提供される。核酸分子は、例えば、発現ベクターを形成するために発現制御配列へ連結されていてよいが、このとき上記発現ベクターは適切な細胞内で増殖させられる。
さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載したペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体および医薬上許容される担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
本明細書では、さらにまた膵臓の状態もしくは疾患を予防もしくは治療するための方法であって、それを必要とする被験者に本発明のペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体または組成物を投与する工程を含む方法が提供される。本明細書に提供した方法では、被験者は、例えば齧歯類、イヌ、ブタ、霊長類またはヒトであってよい。
一つの実施形態では、状態もしくは疾患は、代謝障害、例えばβ細胞関連障害である。状態もしくは疾患は、1型糖尿病、2型糖尿病または糖尿病の合併症であってよい。
他の実施形態では、被験者におけるβ細胞アポトーシスが予防または阻止される、被験者における膵臓細胞の機能性が改良または回復させられる、被験者における血漿中インスリンレベルが増加させられる、および/または被験者における膵臓細胞の数もしくはサイズが増加させられる。特定の実施形態では、膵臓細胞はβ細胞である。
さらにまた別の実施形態では、被験者におけるβ細胞新生が刺激される、および/またはグルコース恒常性が改良される、および/または被験者におけるインスリンが強化される。
以下では本発明の特定の実施形態について実施例および添付の図面を参照しながら説明する。
以下の詳細な説明から本発明の他の特徴および利点が明白になるであろう。しかし詳細な説明および本発明の特定の実施形態を示す特定の実施例は、例示する目的でのみ提示されることを理解されたい。本開示の精神および範囲内の様々な変化および改変は、当業者にはこの詳細な説明から明白になるであろう。
膵島新生関連タンパク質(INGAP)は、部分的に管が閉塞したハムスター膵臓内で新規な管関連膵島形成を誘導する因子として発見された。本発明者らは、以前に、INGAPの生物活性部分であるINGAP104−118ペプチド(本明細書では「INGAP−P」、「15−mer」もしくは配列番号1とも呼ぶ)がβ細胞新生活性およびインスリン強化活性を有することを証明している。近年の第2相臨床試験は、INGAP−Pが1型および2型両方の糖尿病患者において改良されたグルコース恒常性を生成することを証明したので、そこで糖尿病のための薬物療法としてのINGAPの潜在能力を支持している。しかし、不良な安定性および/または短い血漿半減期は、治療薬としてのINGAP−Pを開発する能力を妨害した。
本発明者らは本明細書で、糖尿病を治療もしくは予防するための医薬品としてのINGAP−Pの有効性を改良するため、およびその作用機序を理解するために、本発明者らが全長INGAPタンパク質(「rINGAP」および「r−INGAP」とも呼ばれる)における手がかりを探索したことを報告する。本発明者らは、rINGAPをクローニングし、rINGAPを使用してRIN−m5F細胞中でのこのタンパク質およびINGAP−Pペプチドによって誘導されたシグナル伝達事象を調査した。RIN−m5F細胞は、INGAPに増殖の増加で応答するラットインスリノーマ細胞系である。全長組み換えタンパク質(r−INGAP)は15−merペプチドよりはるかに(細胞培養中で5日間まで)安定性であり、6Hisタグ付けされる。データは、rINGAPがラットインスリノーマRIN−m5F細胞の増殖を刺激することにモルベースでINGAP−Pよりも少なくとも100倍効率的であること、およびそれらがどちらもRas−Raf−Erk経路の活性化を介してシグナル伝達するにもかかわらず、上流シグナル伝達事象は異なる可能性があることを示した。本発明者らはさらに、蛍光標識rINGAPの結合は細胞表面に限定され、受容体結合および集団化と一致する方法で細胞表面上にパッチを形成するが、他方INGAP−Pは急速に内在化されることも示している。INGAP誘導性Erk1/2(MAPK42/44)活性化はrINGAPおよび15−mer両方について百日咳毒素(Ptx)によって有意に低下するが、これはrINGAPおよびこのペプチドがどちらもGタンパク質共役受容体によって作用することを示唆している。そこで、データは、rINGAPはインビトロおよびインビボのどちらにおいてもINGAP−Pに比較してはるかに大きな安定性(細胞培養中では5日間まで)および膵島再生において少なくとも100倍高いモル効率を有することを証明した(図23、24を参照)。
X線結晶解析法を使用して、rINGAPの三次元再構築体を生成した。この再構成物は、生理活性15−merペプチドであるINGAP−Pが分子のコアから外へ伸びるループの一部であることを証明した(図17B)。15−merのINGAP−Pが小さな線形化ペプチドであることは、注目すべきことである。本発明者らは、rINGAPタンパク質内のループがこのタンパク質とその標的細胞/受容体との相互作用を促進できる、およびこのためループ構造を保存することがINGAPペプチドの生物活性および安定性にとって極めて重要であるという仮説を立てた。タンパク質配列の解析(図17A)は、INGAP−Pがタンパク質コアを形成する高度に疎水性のアミノ酸配列に隣接されることを証明した。注目すべきことに、INGAP−P(アミノ酸103、120および122)のすぐ隣に位置する三個のトリプトファン残基(W)(図l7C)およびグリシン119(G)は、ヒトを含む種を越えてReg3タンパク質内で高度に保存されている。
このため本発明者らは、このペプチドのいずれかの片側または両側に保存アミノ酸を含む、INGAP−Pの三つの拡張アナログを設計および生成した(表1、図18を参照)。溶解性を侵害しないように、拡張は19−merペプチドを生じさせる4アミノ酸に限定した。拡張INGAPペプチドは、INGAPの天然三次元ループ構造を保存する可能性がある。理論によって拘束されることを望まなくても、19−merのいずれかの末端にある二つの疎水性トリプトファン残基はこのペプチドのループ構造を安定化させられると考えられる。そこで19−merペプチドは、rINGAPタンパク質の生物活性を保持し(おそらく強化された活性さえ示す)、INGAP−P 15−merに比較して増加した安定性および/または血漿半減期を有する。
19−merペプチドの構造は表1に示した。拡張19−merINGAPペプチドを生成するために、INGAPタンパク質配列中のINGAP−P 15−merペプチドに隣接する4アミノ酸を、表1に示したようにINGAP−P 15−merに加えた(15−merに加えられた隣接アミノ酸には下線を付した。さらに図17、18も参照されたい)。
INGAP−P 15‐merおよびrINGAPと比較した19‐merの生物活性について調査した。本明細書に示したように、培養RIN−m5F細胞内のINGAP102−120誘導性Erk1/2(MAPK42/44)活性化は、INGAP104−118により生成された活性化より3倍超およびrINGAPにより生成された活性化のおよそ2倍であった(図18)。さらに、本発明者らは、蛍光標識19‐mer(INGAP102−120)の結合が細胞表面に限定され、rINGAPについて視認された方法に類似する方法での受容体集団化に似ているが、細胞表面に結合するとは思われないINGAP104−118(図19)とは顕著に異なることを証明する。
FBS中での比較ペプチド安定性の分析は、INGAP−Pに比したINGAP−19の利点を証明しなかったが、これはどちらのペプチドも類似速度で分解したためである(図20)。
INGAP−19の効率がその安定性を増加させることによってさらに増大させられるかどうかを研究するために、環化(ジスルフィド、末端システインの添加による頭−尾)を選択したが、それは環化がペプチド安定性を増加させるために広範に使用されるアプローチであるからである(Adessi,C.and Soto,C,Curr Med Chem,2002,9:963−978)。INGAP−Pを同様に環化させ、新規アナログをINGAP−19CおよびINGAP−PC(環化についての「C」)と名付けた。
INGAP−P、INGAP−PC、INGAP−19およびINGAP−19Cの安定性をFBS中でのインビトロインキュベーションにおける時間経過試験において比較した。データは、INGAP−19Cが直鎖15‐mer(INGAP−P)ペプチドまたは19‐mer(INGAP−19)ペプチドより安定性であると思われることを示した(図20、21)。重要なことに、RINm5F細胞内でのErk1/2活性化の試験に基づくと、INGAP−19Cは直鎖19‐mer(INGAP−19)とは効力が同等であったが、INGAP−P(図22)より高モル有効性を有していた。さらに、本発明者らは、環化単独ではINGAP−Pの活性を増加させないことを証明した(図22A)。
そこで、これらの結果は、19‐merのrINGAP、INGAP102−120(配列番号4)および環化された19‐merのrINGAP、環化INGAP102−120は、INGAP−P 15‐merより生物活性が高かった。環化INGAP102−120は、INGAP−Pより大きな安定性を示す。
したがって、本明細書ではINGAPの19‐merペプチド、INGAP102−120(本明細書では、「INGAP−19」、「19‐mer」、「19‐mer seq3」および配列番号4と呼ばれる)が提供される。さらに本明細書ではINGAPの環化19‐merペプチド、INGAP102−120(本明細書では、「INGAP−19C」および配列番号6と呼ばれる)が提供される。本明細書では、19‐merペプチドがINGAPのβ細胞新生活性およびインスリン増強活性および/または改良された安定性を、INGAP−Pとの比較で、有することが証明され、19‐merのINGAPペプチドが糖尿病にとって強力な新規治療薬であることを示している。
本明細書の一つの実施形態では、配列番号4または配列番号6に規定した配列を含むINGAPペプチドが提供される。本明細書のまた別の実施形態では、配列番号4または配列番号6に規定した配列からなるINGAPペプチドが提供される。組成物およびその使用方法もまた提供される。
本明細書で使用する用語「β細胞」は、膵臓内のランゲルハンス島の完全に分化したインスリン産生β細胞を意味する。膵臓β細胞は、それらのインスリン分泌および典型的には膵島アミロイドポリペプチド(IAPP)の細胞表面発現を特徴とする。
さらに、INGAPの生物活性を保持する本発明の19‐mer15−merペプチドのアナログ、ホモログ、フラグメントおよび変異体が本発明のペプチドにより包含されることも理解すべきである。一つの実施形態では、配列番号4および配列番号6と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列番号4および配列番号6の変異体が提供される。また別の実施形態では、変異体は、配列番号4および配列番号6と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の同一性を有し、INGAPの103位および120位でトリプトファン残基を保持する(言い換えると、INGAPの103位および120位でのトリプトファン残基は除去されない、置換されない、または変化させられない)。さらに他の実施形態では、変異体は、トリプトファン残基の103位および120位の少なくとも一つまたは両方のトリプトファン残基を保持する。
本発明のペプチドおよび組成物は、膵臓の状態または疾患を治療または予防するために使用できる。そのような状態もしくは疾患の非限定的例には、代謝障害、または状態、例えば1型および2型真性糖尿病、糖尿病の合併症(例えば、網膜症、腎症もしくは神経障害、糖尿病足、糖尿病性潰瘍、糖尿病性大血管障害)、代謝性アシドーシスもしくはケトーシス、反応性低血糖、高インスリン血症、グルコース代謝障害、インスリン耐性、代謝症候群、様々な起源の脂質異常症、アテローム硬化症および関連疾患、肥満症、高血圧、慢性心不全、水腫および高尿酸血症が含まれる。
β細胞質量の拡大は、既存膵島細胞の増殖、管関連前駆体からの新生または分化エンドクリン細胞からの膵島細胞の再生を含むいくつかのプロセスを含む可能性がある。本発明者らは、本明細書において、INGAP−Pが、(1)正常ヒト膵臓管細胞(HPDE)の増殖およびエンドクリン分化(図25〜29、34)、(2)脱分化ヒト膵島由来管様構造からの機能的膵島様構造(DLS)の再生(図23、30〜33)、および(3)インスリン産生ラット細胞系であるRINm5F細胞の増殖(図1、8、18、22)を誘導することを証明する。動物モデルにおいては、INGAP−Pが膵島細胞の数の有意な増加およびより多くのインスリンの産生を導くことができる(米国特許出願公開第2004/0132644号明細書)ことも証明されている。新規に形成されたβ細胞は膵管の壁内に出現し、膵管から出芽すると思われた。これらのインスリン陽性細胞は管上皮細胞分化および膵島細胞増殖から生じ、それらの出現はINGAP−Pを用いた処置の用量および期間に比例していた。長い治療期間にわたって、これらの細胞は管から離れて移動し、膵臓の実質内で膵島を形成した。INGAP−Pの連続10日間の投与後、膵島数の30%増加が生じ、30日後には、組織内の膵島数の倍増が生じた。本明細書に開示したペプチドについても類似の作用が予想される。
したがって、一つの実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、β細胞新生を促進、強化または誘導する。例えば、本発明のペプチドおよび組成物は、膵臓細胞の機能性を改良もしくは回復させる、および/または膵臓β細胞の数もしくは大きさを増加させることができる。また別の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、膵臓β細胞の再生を促進、強化または誘導する。また別の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、膵臓β細胞の増殖を促進、強化または誘導する。さらにまた別の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、インスリン強化活性を有する。さらに別の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、1型もしくは2型糖尿病を有する被験者におけるグルコース恒常性を改良する。
本明細書で使用する「インスリン強化活性」および「インスリン強化」は、インスリンが本発明のペプチドおよび組成物と組み合わせて投与されると、インスリン単独の投与と比較して、低用量のインスリンで治療成績を達成できる能力を意味する。これを言い換えると、インスリンが本発明のペプチドおよび組成物と組み合わせて投与されると、所定の治療成績を達成するために必要とされる外部から提供されるインスリン量が少なくなる。本発明のペプチドおよび組成物の存在下では、より高用量のインスリン単独を用いた場合と類似の治療成績が低用量のインスリンで達成される。
また別の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、例えば、膵臓β細胞のアポトーシスもしくはネクローシスによるβ細胞死を予防する、脱分化成体膵島に由来する始原管様構造(DLS)からの新規な機能的膵島の分化を誘導する、エンドクリン分化を増強する、管上皮と関連する細胞からの膵島細胞再生を誘導して新規の膵島形成をもたらす、および/または高血糖症の反転をもたらす。特定の実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、膵臓管細胞の分化を誘導する、および/またはそのような細胞がアポトーシス経路を回避することを可能にする。
さらにまた別の実施形態では、本発明のペプチドは、INGAP−P 15−merペプチドに比較して、より優れたインビトロ安定性、循環中でのより優れた安定性および/またはインビボでのより長い半減期を有する。
一つの実施形態では、β細胞関連障害は、本発明のペプチドおよび組成物によって治療または予防される。特定の実施形態では、糖尿病、特に1型糖尿病、2型糖尿病、発症前1型糖尿病および/または糖尿病合併症が本発明のペプチドおよび組成物によって治療または予防される。
そこで、一つの態様では、本明細書ではそれを必要とする被験者において代謝障害を治療または予防するための方法であって、被験者に治療有効量の本発明のペプチドおよび組成物を投与する工程を含む方法が提供される。また別の態様では、本明細書ではそれを必要とする被験者において糖尿病を治療または予防するための方法であって、被験者に治療有効量の本発明のペプチドもしくは組成物、例えば配列番号4を投与する工程を含む方法が提供される。
さらにまた別の態様では、それを必要とする被験者における膵臓β細胞の変性を予防するため、および/または膵臓β細胞の機能性を改良および/または回復させるための方法であって、被験者に治療有効量の本発明のペプチドおよび組成物を投与する工程を含む方法が提供される。一つの態様では、膵臓細胞、例えばβ細胞の数もしくはサイズが被験者において増加させられる、および/または血漿中インスリンレベルが被験者において増加させられる、および/または被験者においてグルコース恒常性が回復もしくは改良させられる。
また別の態様では、インビトロおよび/またはインビボでの糖尿病誘発物質から膵島細胞を保護する方法であって、真核細胞を本発明のペプチドおよび組成物と接触させる工程、または被験者に投与する工程を含む方法が提供される。一つの実施形態では本発明のペプチドおよび組成物の投与後には、被験者において膵島生存能が改良される、および/または膵島機能不全が遮断される、および/またはβ細胞質量が維持される。
本発明のまた別の実施形態によると、β細胞前駆体の分化を誘導する方法であって、上記β細胞前駆体の分化を誘導するために、β細胞前駆体を含む膵臓管細胞の培養を本発明のペプチドの調製物と接触させる工程を含む方法が提供される。一つの実施形態では、膵臓エンドクリン不全を備える哺乳動物の膵臓管細胞は、身体から除去してインビトロで処置することができる。管細胞は、典型的にはβ細胞前駆体を含む。そこで本発明のペプチドの調製物を用いる治療は、β細胞前駆体の分化を誘導するであろう。本発明のペプチドを用いて処置した細胞は、次にそれらが由来する哺乳動物の体内への自己移植片として使用することができる。そのような自己治療は、移植片に含まれる有害な宿主対移植片拒絶反応を最小限に抑える。
一つの実施形態では、被験者は、齧歯類、イヌ、ブタ、霊長類またはヒトであってよい。本発明の方法は任意の哺乳動物において使用できるが、被験者は、好ましくはヒトである。
用語「ホモログ」は、ホモログ配列が元の配列と実質的に同一方法で機能するように、本明細書に記載のペプチドの配列からわずかな、もしくは取るに足らない配列変化を有するアミノ酸もしくは核酸配列を意味するために使用される。配列変化は、局所的突然変異もしくは構造的改変に帰せることができる。実質的な配列同一性を有する配列には、本明細書に提供したようなペプチドをコードする配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する核酸配列、または本明細書に提供するペプチドと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列(例えば配列番号4もしくは配列番号6)が含まれる。配列同一性は、当分野において公知の方法によって計算できる。核酸配列同一性は、最も好ましくはBLASTバージョン2.1の詳細検索のアルゴリズムによって評価される。一連のプログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTから入手できる。
用語「アナログ」は、本明細書に記載したペプチドの配列と比較して改変されているアミノ酸もしくは核酸配列であって、この改変が本明細書に記載した配列(例えば、膵臓β細胞新生の誘導、膵臓β細胞再生の誘導、グルコース恒常性の改良または高血糖症の反転)の生物活性を変化させないアミノ酸もしくは核酸配列を意味するために使用される。改変された配列もしくはアナログは、本明細書に記載したペプチド、例えば配列番号4もしくは配列番号6に比較して改良された特性を有していてよい。
さらに包含されるのは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、および配列番号4または配列番号6の生物活性、例えばβ細胞新生活性、インビボ安定性などを維持するペプチドをコードするヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする配列である。用語「ハイブリダイズする配列」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列にハイブリダイズできる核酸配列を意味する。DNAハイブリダイゼーションを促進する適切な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当業者には公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1−6.3.6の中に見いだすことができる。本明細書で使用する用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、溶液中の二つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全部または一部分に発生する場合がある。ハイブリダイズする部分は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の1つに対して長さが少なくとも50%である。これに関連して、核酸二本鎖、もしくはハイブリッドの安定性は、ナトリウム含有バッファー中でナトリウムイオン濃度、標識核酸のG/C含量、核酸プローブ(1)および温度の関数であるTmによって決定される(Tm=81.5℃−16.6(Log10[Na+])+0.41(%(G+C)−600/L)。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件におけるパラメーターは、ナトリウムイオン濃度および温度である。公知の核酸分子と類似であるが同一ではない分子を同定するためには、1%ミスマッチはTmの約1℃減少を生じさせると推定することができ、例えば95%超の同一性を有する核酸分子が追求される場合は、最終洗浄は5℃低下させられる。これらの考察に基づいて、一つの実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、−5℃のTm(上記の方程式に基づいて)での5×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)/5×デンハルト(Denhardt)溶液/1.0%のSDSでのハイブリダイゼーション、その後に60℃での0.2×のSSC/0.1%のSDSの洗浄であると規定される。
ペプチドは、ペプチドの生物活性を変化させないアミノ酸の置換、挿入および/または欠失を含有するように改変されてよい。保存的アミノ酸置換は、ペプチドの一つ以上のアミノ酸を類似の電荷、サイズおよび/または親水性特徴を備えるアミノ酸と置換することを含んでいる。保存的置換だけが行われる場合は、結果として生じるアナログは未置換ペプチドと機能的に同等であろうと予想される。非保存的アミノ酸置換は、ペプチドの一つ以上のアミノ酸を異なる電荷、サイズおよび/または親水性特徴を有する一つ以上のアミノ酸と置換することを含んでいる。
ペプチドは、ペプチドを治療的により有効に、またはより適切に、例えばより安定性にするために改変されてよい。例えば、本発明のペプチドは、無機酸、例えば塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸などと、または有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸およびトルエンスルホン酸と反応させることによって医薬上許容される塩に変換させられてよい。医薬上許容される塩は当分野において周知であり、ペプチドおよびそれらのアナログ、ホモログ、フラグメントおよび変異体の医薬上許容される塩は本明細書に包含される。
さらに、ペプチドは、例えばペプチドの循環中半減期を増加させるためにポリマーへの共有結合によって化学的に改変されてよい。典型的なポリマーおよびポリマーをペプチドに付着させる方法は、米国特許第4766106号明細書、同第4179337号明細書、同第4495285号明細書および同第4609546号明細書に示されている。ポリマーの非限定的例は、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール(PEG)である。PEGは室温で水溶性であり、一般式:R(O−−CH2−−CH2)nO−−R(式中、Rは水素、または例えばアルキルもしくはアルカノール基などの保護基であってよい)を有する。一つの実施形態では、保護基は、一〜八個の炭素を有する、またはメチルである。記号nは、正の整数、例えば1〜1,000または2〜500である。一つの実施形態では、PEGは、1,000〜40,000、2000〜20,000または3,000〜12,000の平均分子量を有する。PEGは、少なくとも一個のヒドロキシ基または一個の末端ヒドロキシ基を有していてよい。このヒドロキシ基は、インヒビターにおける遊離アミノ基と反応するために活性化されてよい。
本発明はさらに、本発明のペプチドまたはそのフラグメントもしくはアナログをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
可能性のある発現ベクターには、ベクターが使用される宿主細胞と適合する限り、コスミド、プラスミド、人工染色体、ウイルスベクターもしくは改変ウイルス(例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス)が含まれるがそれらに限定されない。発現ベクターは「宿主細胞を変換させるために適合する」が、これは発現ベクターが、本発明の核酸分子および本発明の核酸分子に機能的に連結している発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される調節配列を含有することを意味する。「機能的に連結した」は、核酸が核酸の発現を可能にする方法で調節配列に連結していることを意味することが意図されている。
本明細書では、本発明の核酸分子、またはそのフラグメントもしくはアナログを含有する組み換え発現ベクターならびに挿入されたペプチドをコードする配列の転写および翻訳のために必要な調節配列が提供される。
適切な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物もしくは昆虫の遺伝子を含む様々な起源から引き出すことができる(例えば、Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)に記載された調節配列を参照されたい。適切な調節配列の選択は宿主細胞に依存しており、当業者であれば容易に実施することができる。そのような調節配列の例には、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはRNAポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が含まれる。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに依存して、例えば複製起源、追加のDNA制限部位、エンハンサー、ならびに転写の誘導能力を付与する配列、などの他の配列を発現ベクター内に組み込むことができる。
本発明の組み換え発現ベクターは、さらに本開示のペプチドを用いて形質転換もしくは形質導入された宿主細胞の選択を促進する選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。選択可能なマーカー遺伝子の例は、所定の薬物に対する耐性を付与する例えばG418およびハイグロマイシンなどのタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼまたは免疫グロブリンもしくはその部分、例えば免疫グロブリン、例えばIgG、のFc部分をコードする遺伝子である。選択可能なマーカー遺伝子の転写は、例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼなどの選択可能なマーカータンパク質の濃度における変化によって監視される。選択可能なマーカー遺伝子が例えばネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合は、G418を備える形質転換細胞を選択できる。選択可能なマーカー遺伝子を組み込んでいる細胞は生残するであろうが、他の細胞は死滅する。これは、本開示の組み換え発現ベクターの発現について視認およびアッセイすることを、および特に突然変異が発現および表現型に及ぼす作用を決定することを可能にする。選択的マーカーは、対象の核酸からの別個のベクター上に導入できることは理解されるであろう。
本明細書に提供した組み換え発現ベクターは、さらにまたペプチドの発現増加、組み換えペプチドの可溶性の向上を供する成分をコードする、および/または親和性精製におけるリガンドとして作用することによって標的組み換えペプチドの精製に役立つ遺伝子を含有していてよい。例えば、タンパク質分解性開裂部位は、融合タンパク質の精製に引き続いて融合成分から組み換えタンパク質の分離を可能にするために標的組み換えペプチドに添加されてよい。典型的な融合発現ベクターには、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質もしくはプロテインAを各々組み換えペプチドに融合させるpGEX(Amrad Corp.社、オーストラリア国メルボルン)、pMal(New England Biolabs社、マサチューセッツ州ビバリー)およびpRIT5(Pharmacia社、ニュージャージー州ピスカタウェイ)が含まれる。
組み換え発現ベクターは、形質転換宿主細胞を生成するために宿主細胞内へ導入できる。用語「形質転換宿主細胞」は、本発明の組み換え発現ベクターを用いて形質転換または形質導入できる細胞を含むことが企図されている。用語「変換された」、「〜を用いて形質転換された」、「〜を用いて形質導入された」、「形質転換」および「形質導入」は、当分野において公知の多数の可能な技術の一つによって細胞内への核酸(例えば、ベクターまたは裸のRNAもしくはDNA)の導入を含むことが企図されている。原核細胞は、核酸を用いて、例えばエレクトロポレーションもしくは塩化カルシウム媒介形質転換によって転換させることができる。例えば、核酸は、哺乳動物細胞内へ従来型技術、例えばリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈降、DEAE−デキストラン媒介形質導入、リポフェクチン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、RNA移入、DNA移入、人工染色体、ウイルスベクターおよび任意の新生遺伝子移入テクノロジーによって導入することができる。宿主細胞を形質転換および形質導入するための適切な方法は、Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))およびその他の実験テキストの中に見いだすことができる。
適切な宿主細胞には、極めて様々な真核宿主細胞および原核細胞が含まれる。例えば、本開示のペプチドは、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現することができる。その他の適切な宿主細胞は、Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1991)の中に見いだすことができる。さらに、本開示のペプチドは、原核細胞内、例えば大腸菌(Escherichia coli)内で発現させることができる(Zhang et al.,Science 303(5656):371−3(2004))。
本明細書に記載した方法において使用するために適切な哺乳動物細胞には、特に、COS(例えば、ATCC番号CRL1650もしくは1651)、BHK(例えば、ATCC番号CRL6281)、CHO(ATCC番号CCL61)ならびにHeLa(例えば、ATCC番号CCL2)および3T3マウス線維芽細胞(例えば、ATCC番号CCL92)が含まれる。
哺乳動物細胞における発現を指令するために適切な発現ベクターには、一般にプロモーター(例えば、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40などのウイルス物質に由来する)ならびに他の転写および翻訳制御配列が含まれる。哺乳動物発現ベクターの例には、制限なくpCDM8(Seed,B.,Nature 329:840(1987))、pMT2PC(Kaufman et al.,EMBO J.6:187−195(1987))およびpCMV(Clontech社、米国カリフォルニア州)が含まれる。
または、本発明のペプチドは、さらに非ヒトトランスジェニック動物、例えばラット、マウス、ウサギ、ヒツジおよびブタにおいて発現させることもできる(Hammer et al.Nature 315:680−683(1985);Palmiter et al.Science 222:809−814(1983);Brinster et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4438−4442(1985);Palmiter and Brinster Cell 41:343−345(1985)および米国特許第4736866号明細書)。本発明は、さらにそのような動物に由来する、またはそのような動物から単離された組織および細胞も包含する。
上述したアナログおよびホモログに加えて、所定の実施形態では、本発明のペプチドは、さらに異種ポリペプチドにN末端もしくはC末端で組み換え融合させられてよい、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合(共有結合および非共有結合を含む)させられてよい。例えば、ペプチドは、検出アッセイにおいて標識として有用な分子、及び、例えば異種ポリペプチド、ヒスチジン(HIS)タグ、薬物、放射性核種もしくは毒素などのエフェクター分子に組み換えにより融合もしくは結合させられてよい。例えば、国際公開第92/08495号パンフレット、国際公開第91/14438号パンフレット、国際公開第89/12624号パンフレット、米国特許第5314995号明細書、および欧州特許第396387号明細書を参照されたい。あらゆるタイプの分子は、その分子が本発明のペプチドの生物活性を阻害しない限り、本発明のペプチドに共有結合させられてよい。例えば、しかし決して限定することなく、ペプチド誘導体には、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化(phosphylation)、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性開裂、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への結合によって改変されているペプチドが含まれる。極めて多数のあらゆる化学的改変は、特異的化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがそれらに限定されない公知の技術によって実施されてよい。
ペプチドが融合させられる異種ポリペプチドは、例えばペプチドのインビボ半減期を増加させるため、または当分野において公知の方法を使用してイムノアッセイにおいて使用するために有用な可能性がある。本発明のペプチドは、精製または検出を促進するために例えばポリペプチドなどのマーカー配列に融合させることができる。一般に、本発明のペプチドは非結合形態で使用されてよい、または例えば分子の治療特性を改良するため、分子の薬理学的特性を改良するなどのために、様々な分子の少なくとも一つに結合させられてよい。
所定の実施形態では、本発明のペプチドは、追加のアミノ酸配列または一つ以上の成分を含む。以下では、典型的な改変についてより詳細に説明する。例えば、ペプチドは、追加の機能的成分(例えば、PEG、薬物、毒素、画像撮影剤もしくは標識)を加えるために改変されてよい。
さらに、「非必須アミノ酸領域」で保存的置換もしくは変化をもたらすヌクレオチドもしくはアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入が実施されてよい。例えば、ペプチドは、一つ以上の個別アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を除いて、出発配列と同一であってよく、例えば一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つまたは十以上の個別アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失が作成されてよい。他の実施形態では、出発ペプチドに由来するペプチドは、出発配列と、一つ、二つ以下、三つ以下、四つ以下、五つ以下、六つ以下、七つ以下、八つ以下、九つ以下または十以下の個別アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を除いて同一であってよい。所定の実施形態では、出発ペプチドに由来するペプチドは、出発配列と比較して、一つ、二つ、三つ、一つから二つ、一つから三つ、一つから五つまたは一つ〜十の個別アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を有する。特定の実施形態では、配列番号4の第2位および第19位でのトリプトファン残基の少なくとも一つもしくは両方は誘導体ペプチド内で維持される、つまり第2位および第19位でのトリプトファン残基の少なくとも一つもしくは両方で維持される。
さらに本発明には、本明細書に記載したペプチドのフラグメント、誘導体、改変体もしくは変異体ならびに上述したアナログおよびホモログさらにそれらにいずれかの組み合わせが包含される。本発明のペプチドに関する場合の用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、「改変体」、「ホモログ」および「アナログ」には、対応する出発ペプチド配列の生物活性の少なくとも一部を維持するあらゆるポリペプチドが含まれる。用語「変異体」、「誘導体」および「改変体」は、本明細書では互換的に使用される。
本発明のペプチドの変異体には、本明細書に記載したアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入および本明細書に記載した改変に起因する変化したアミノ酸配列を備えるポリペプチドであるフラグメントが含まれる。変異体ポリペプチドは、本明細書に記載した保存的もしくは非保存的アミノ酸の置換、欠失もしくは付加を含んでいてよい。変異体はさらに、官能性側鎖基の反応によって化学的誘導された一つ以上の残基を有していてよい。さらに変異体として含まれるのは、20個の標準アミノ酸の一つ以上の天然発生のアミノ酸誘導体を含有するペプチドである。例えば、4−ヒドロキシプロピンは、プロリンと置換されてよい、5−ヒドロキシリシンはリシンと置換されてよい、3−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換されてよい、ホモセリンはセリンと置換されてよい、およびオルニチンはリシンと置換されてよい。さらに、変異体は一つ以上の非古典的アミノ酸を含有していてよい。
そこで一つの実施形態では、本明細書に開示したペプチドのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体は本発明に包含される。一つの実施形態では、アナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体は、出発ペプチドの一つ以上の生物活性、例えば、β細胞新生活性、インスリン強化活性、被験者におけるグルコース恒常性を回復もしくは改良する能力、細胞受容体に結合して高血糖症を反転する能力、安定性などを維持する。ペプチドの一つ以上の生物活性は、アナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体によって維持されてよい。一つの実施形態では、アナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体は、出発ペプチドの少なくとも一つの生物活性もしくは特性を維持する。
一つの実施形態では、本発明のペプチドは、精製される、または実質的に純粋である。また別の実施形態では、本発明のペプチドは、化学的に合成される。
医薬組成物および投与方法
本発明のペプチドを包含する医薬組成物は、本明細書に包含される。本発明のペプチドは、被験者に本発明のペプチドを公知の技術にしたがって従来型医薬上許容される担体もしくは希釈剤と組み合わせることによって調製された従来型投与形で投与することができる。当業者であれば、医薬上許容される担体もしくは希釈剤の形態および特性は、それが結び付けられる有効成分の量、投与経路および他の周知の変量によって決定付けられることを認識できるであろう。
本発明のペプチドを包含する医薬組成物は、本明細書に包含される。本発明のペプチドは、被験者に本発明のペプチドを公知の技術にしたがって従来型医薬上許容される担体もしくは希釈剤と組み合わせることによって調製された従来型投与形で投与することができる。当業者であれば、医薬上許容される担体もしくは希釈剤の形態および特性は、それが結び付けられる有効成分の量、投与経路および他の周知の変量によって決定付けられることを認識できるであろう。
ペプチドまたはそのアナログ、ホモログ、フラグメントもしくは変異体を調製および被験者に投与する方法は、当分野において周知である、または当業者によって容易に決定される。本発明のペプチドおよび組成物の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入もしくは局所であってよい。本明細書で使用する用語「非経口」には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経直腸もしくは経膣投与が含まれる。特定の実施形態では、本発明のペプチドもしくは組成物は、注射によって投与される。一つの実施形態では、投与経路は静脈内である。また別の実施形態では、本発明のペプチドもしくは組成物は、経口で、例えば一日一回、一日二回または一日三回投与される。
通常は、注射のために適切な医薬組成物は、緩衝液(例えば、酢酸、リン酸もしくはクエン酸緩衝液)、界面活性剤(例えば、ポリソルベート)および場合により安定剤(例えば、ヒトアルブミン)を含んでいてよい。非経口投与のための製剤には、無菌の水性もしくは非水性液剤、懸濁剤およびエマルジョン剤が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、水、アルコール溶液/水溶液、食塩液および緩衝媒質を含むエマルジョンもしくは懸濁液が含まれる。本発明では、医薬上許容される担体には、0.01〜0.1Mおよび好ましくは0.05Mのリン酸緩衝液もしくは0.8%食塩液が含まれる。他の一般的な非経口ビヒクルには、リン酸ナトリウム溶液、リンゲル(Ringer)デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液もしくは不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、体液補給剤および栄養補給剤、例えばリンゲルデキストロースをベースとする電解質補給剤などが含まれる。保存料および他の添加物、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスなどもまた存在してよい。
より特別には、注射に使用するために適切な医薬組成物には、無菌注射用溶液もしくは分散液の即時調製物のための無菌水溶液(水溶性の場合)もしくは分散液および無菌粉末が含まれる。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易なシリンジ通過性が存在する程度まで流体でなければならない。組成物は、製造および保存条件下で安定性でなければならず、好ましくは、例えば細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒もしくは分散媒であってよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。本明細書に開示した治療方法において使用するために適切な製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,16th ed.(1980)に記載されている。
微生物の作用の防止は、様々な抗菌性および抗真菌性物質、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合に、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールもしくは塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。注射用組成物の長期間吸収は、組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによって引き起こすことができる。
あらゆる場合に、無菌注射用溶液は、本発明のペプチド(単独で、または他の活性物質と組み合わせて)を、必要に応じて一つの成分もしくは成分の組み合わせを備える適切な溶媒中において、当業者によって容易に決定することができる必要とされる量で組み込むことによって調製し、その後にろ過殺菌することによって調製できる。一般に、分散液は活性化合物を、塩基性分散媒および上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合は、好ましい調製方法は、有効成分の粉末に以前に殺菌ろ過されたその溶液からの任意の追加の望ましい成分の粉末を産生する、真空乾燥法およびフリーズドライ法である。注射用調製物は、加工処理され、例えばアンブル、バッグ、ボトル、シリンジもしくはバイアルなどの容器に充填され、当分野において公知の方法にしたがって無菌条件下で密封される。
液体医薬組成物が調製された後、液体医薬組成物は、分解を防止するため、および無菌性を失わないようにするために凍結乾燥されてよい。液体組成物を凍結乾燥するための方法は、当業者には公知である。使用直前に、組成物は追加の成分を含むことができる無菌希釈剤(例えば、リンゲル液、蒸留水または無菌食塩液)を用いて再構成することができる。再構成すると、組成物は、当業者には公知のそれらの方法を使用して被験者に投与される。
さらに、調製物は、キットの形態に包装して販売されてよい。そのような製造品は、好ましくは使用取扱説明書を提供するラベルもしくは包装添付文書を有し、調製物を使用するために必要とされる追加の成分を有することができる。
当業者であれば、例えば糖尿病を予防または治療するための有効量の本発明のペプチドおよび組成物は、投与の手段、被験者の特徴もしくは生理学的状態(例えば健康状態)、投与される他の医薬品、治療が診断的、予後的、予防的または治療的などのいずれであるかを含む多数の様々な因子に依存して変動することを理解できるであろう。用量は、安全性および有効性を最適化するために当業者には公知のルーチン方法を使用して決定されてよい。
明白に、投与すべき融合ペプチドの量もまた、それが投与される被験者に依存するであろう。被験者がヒトである場合には、投与されるペプチドの量は、患者の年齢、状態の重症度および患者の過去の病歴を含む多数の因子に依存し、常に投与する医師の堅実な裁量の範囲内に含まれる。一般に、ヒトまたは他の哺乳動物に単回用量もしくは分割用量で投与される本発明のペプチドの総一日量は、例えば、単回もしくは複数回用量で、0.1mg/Kg/日〜30mg/Kg/日のペプチド、0.1mg/Kg/日〜20mg/Kg/日のペプチド、または2mg/Kg/日〜10mg/Kg/日のペプチドの量にあってよい。単回用量組成物は、そのような量または一日量を作り上げるためのその約数を含有していてよい。一つの実施形態では、一日に5mg/kgが腹腔内(IP)投与される。
INGAPペプチドの用法・用量および製剤は記載されている(例えば、米国特許出願公開第2004/0132644号明細書を参照されたい)。
一つの実施形態では、本発明のペプチドは、医薬上許容される塩の形態で調製される、または使用される。特定の実施形態では、医薬上許容される塩は酢酸塩である。
一つの実施形態では、本発明のペプチドは、精製される、または実質的に純粋である。
安定性は、当分野において公知の方法を使用して決定されてよい。例えば、ペプチドの安定性は、純度、不純物の総パーセンテージ、個別不純物のパーセンテージ(HPLCまたは他の適切な定量的方法によって決定される)、サンプルの外観および含水量を含むがそれらに限定されない様々なパラメーターを比較することによって決定される。HPLC法を使用すると、治療用ペプチドのレベルに比較して分解生成物のレベルにおける何らかの増加を決定することができる。
ペプチドサンプルは、溶液中であろうと凍結乾燥粉末であろうと、様々な温度で、水分の存在下もしくは非存在下で、および明色もしくは暗色のバイアル中に保存することができる。様々な保管条件中の分解は、不純物の増加および治療用ペプチド含量の減少をもたらすことがある。一部の実施形態では、サンプル調製物は、80%超純粋、90%超純粋、95%超純粋または97%超純粋である。
本発明のペプチドは、さらにまた医薬的に投与可能な組成物の成分として投与されてもよい。言い換えると、ペプチドは、それを必要とする被験者に投与するための製剤中に存在してよい。本発明のペプチドは、例えば、糖尿病を治療するための単独有効成分であってよい。または、組成物は、さらに一つ以上の追加の化合物、例えば同一状態もしくは関連状態を治療するために使用されてよい第二薬を含有していてよい。
本発明のペプチドは、場合により、治療を必要とする障害もしくは状態を治療する際に有効である他の物質と組み合わせて投与できることを理解されたい。本開示の範囲と調和して、本発明のペプチドおよび組成物は、他の治療薬もしくは予防薬とともに使用されてよい。本発明のペプチドは、第二薬と同時に、または連続して投与されてよい。1型糖尿病もしくは2型糖尿病または関連障害のための任意の治療薬は、本発明のペプチドと組み合わせて使用するために企図されていることを理解されたい。そのような治療薬もしくは予防薬の例には、制限なく、抗糖尿病薬、例えばメトホルミン、スルホニルウレア(例えば、グリベンクラミド、トルブタミド、グリメピリド)、ナテグリニド、レパグリニド、チアゾリジンジオン(例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン)、PPAR−γ−アゴニスト(例えば、GI262570)およびアンタゴニスト、PPAR−γ/αモジュレーター(例えば、KRP297)、α−グルコシダーゼインヒビター(例えば、アカルボース、ボグリボース)、DPPIVインヒビター(例えば、LAF237、MK−431)、α2−アンタゴニスト、血糖値を下げるための薬剤、コレステロール吸収インヒビター、HMGCoAレダクターゼインヒビター(例えば、スタチン)、インスリンおよびインスリンアナログ、GLP−1およびGLP−1アナログ(例えば、エキセンジン−4)および/またはアミリンが含まれる。一つの実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、関節リウマチの治療のために承認されているが糖尿病における有効性の確証を有するIL−1インヒビターである免疫モジュレーターのアナキンラと組み合わせて使用される。
一つの実施形態では、第二治療薬は、例えば、細胞死もしくはβ細胞のアポトーシスを遮断する、IL−1、例えばIL−1βの有害作用から膵島を保護する、例えば糖尿病原性薬から保護する、および/またはさもなければ膵島生育能力および/または機能を保護もしくは改良することによってβ細胞質量を維持する薬物である。第二治療藥は、インスリン耐性を反転させる、腸管グルコース吸収を制御する、肝グルコース産生を正常化する、および/またはβ細胞のグルコース感知およびインスリン分泌を改善することもできる。一つの実施形態では、第二治療薬は、転写因子NF−κΒのインヒビター、または転写因子NF−κΒのサイトカイン誘導性活性化のインヒビターであってよい。一つの実施形態では、第二治療薬はアナキンラである。他の実施形態では、第二治療薬は、インスリン、インスリンアナログ、SGLT2インヒビター、新規の膵島形成誘発剤、幹細胞療法薬、Tリンパ球インヒビター、IL12活性化因子、STAT4アクチベーター、免疫モジュレーター、膵島インプラント、抗炎症薬、抗CD3モノクローナル抗体および/またはインターロイキン−1(IL−1)受容体アンタゴニストである。
本発明は、本発明を具体的に示すために提供され、決して本発明の範囲を限定すると見なすべきではない下記の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
(実施例1)
INGAP−Pおよびr−INGAPはRIN−m5F細胞の増殖を用量依存性で増加させる。
膵臓管細胞はINGAPの特定標的であると理解されてきたが(Rosenberg,L.,et al.,1988,Diabetes,37:334−341;Pittenger,G.L.,et al.,2007,Pancreas,34:103−111)、臨床試験の結果を含む多数の試験は、β細胞もまたINGAP刺激に応答性であると提言している。INGAPがβ細胞に及ぼす作用について試験するために、本発明者らはラットインスリノーマ細胞系であり、一般にインビトロでのβ細胞の代理として使用されるRIN−m5Fを使用した(Cozar−Castellano,I.,et al.,2008,Diabetes,57:3056−3068)。本発明者らの実験ではインスリン発現への有意な作用は観察されなかったが、データはINGAP−Pおよびr−INGAPがどちらも用量依存性で24時間後にRIN−m5F細胞内へのBrdU組み込みを誘導し(図1A)、最も効果的な濃度はr−INGAPについては1nM(PBS(1に等しい)を用いた処置であった陰性コントロールに比較して1.5倍の増加)であり、INGAP−Pについては835nM(陰性コントロールに比較して1.8倍の増加)であることを証明した。これらをまとめると、この倍率変化はハムスター管外植片およびARIP細胞に関する以前のデータと一致していた(Rafaeloff,R.,et al.,1997,J Clin Invest,99:2100−2109)。類似の有糸***促進作用は、陽性コントロールとして使用されたEGF(10ng/mL、1.49倍の増加)およびエキセンジン4(10μΜ、1.56倍の増加)を用いた場合に観察された(図1A)。
INGAP−Pおよびr−INGAPはRIN−m5F細胞の増殖を用量依存性で増加させる。
膵臓管細胞はINGAPの特定標的であると理解されてきたが(Rosenberg,L.,et al.,1988,Diabetes,37:334−341;Pittenger,G.L.,et al.,2007,Pancreas,34:103−111)、臨床試験の結果を含む多数の試験は、β細胞もまたINGAP刺激に応答性であると提言している。INGAPがβ細胞に及ぼす作用について試験するために、本発明者らはラットインスリノーマ細胞系であり、一般にインビトロでのβ細胞の代理として使用されるRIN−m5Fを使用した(Cozar−Castellano,I.,et al.,2008,Diabetes,57:3056−3068)。本発明者らの実験ではインスリン発現への有意な作用は観察されなかったが、データはINGAP−Pおよびr−INGAPがどちらも用量依存性で24時間後にRIN−m5F細胞内へのBrdU組み込みを誘導し(図1A)、最も効果的な濃度はr−INGAPについては1nM(PBS(1に等しい)を用いた処置であった陰性コントロールに比較して1.5倍の増加)であり、INGAP−Pについては835nM(陰性コントロールに比較して1.8倍の増加)であることを証明した。これらをまとめると、この倍率変化はハムスター管外植片およびARIP細胞に関する以前のデータと一致していた(Rafaeloff,R.,et al.,1997,J Clin Invest,99:2100−2109)。類似の有糸***促進作用は、陽性コントロールとして使用されたEGF(10ng/mL、1.49倍の増加)およびエキセンジン4(10μΜ、1.56倍の増加)を用いた場合に観察された(図1A)。
BrdU取り込みの増加は、r−INGAPもしくはINGAP−Pいずれかの添加1〜15分後に観察されたErk1/2の急速な一時的活性化と一致していた(図1B、C)。注目すべきことに、EGFおよびEx−4は、より長時間持続するErk1/2活性化を生成すると思われたが(図1C)、これはこれらの因子とINGAPにより活性化されるシグナル伝達経路に差があることを示唆している。これらの結果は、タンパク質およびペプチドが類似の方法で作用するが、モル効率には差(少なくとも167倍の差)があることを証明した。効率における類似の差は、分化した膵島由来管様構造から機能的ヒト膵島のインビトロ再生のモデルを使用した15−merペプチドとrINGAPタンパク質との間(Assouline−Thomas,B.,et al.,2010,Protein Expr Purif,69:1−8)およびHPDE細胞内(Beatrice,G.and Assouline−Thomas,L.R.,Islet neogenesis associated protein(INGAP) induces endocrine differentiation of human pancreatic ductal cells in vitro.70th American Diabetes Association Meeting.2009)で観察されたことに留意されたい。この現象についての最も可能性の高い説明は、INGAPタンパク質およびINGAP−Pは細胞表面と様々に相互作用する、および/または異なるシグナル伝達経路を活性化することにある。
INGAP−19およびINGAP−19CペプチドもまたRINm5F細胞内でのErk1/2活性化を誘導することが証明されており、どちらもINGAP−PもしくはINGAP−PCより有効であった(図23)。
(実施例2)
r−INGAPおよびINGAP102−120結合RIN−m5F細胞は細胞表面上でクラスター様複合体を形成するが、他方INGAP104−118は細胞質内へ急速に内在化する。
INGAPがどのようにしてRIN−m5F細胞に結合してその中に内在化するのかを決定するために、本発明者らは蛍光反応性色素であるDyLight488(緑色)および−594(赤色)ならびに5−FAM標識INGAP−Pで標識したr−INGAPを使用した。図10に示したように、50nMのDyLight488 r−INGAPはRIN−m5F細胞の細胞表面に数分間以内に結合し、細胞表面上で小さなクラスターおよびパッチを形成したが、これは他のリガンドについて記載された膜多重タンパク質複合体の架橋結合に似ている。これは37℃および氷上の両方で観察され、高親和性受容体結合を示唆している。これは、カベオリンおよびクラスリン媒介エンドサイトーシスについての陽性マーカーとして使用されたコレラ毒素(CTB、AlexaFluor 594)およびトランスフェリン(Texas Red、どちらもInvitrogen社)によって示された相同染色とは異なる(図2(A)、(B))。内在化の第1徴候は15分後に観察されたが(図10、11)、このタンパク質は、1時間以内に内在化するトランスフェリンおよびCTBとは異なり(図2(C)、(D))、数時間にわたり細胞表面上でクラスター化したままで留まると思われた(図2(C)〜(E)、図11)。5時間のインキュベーション後、蛍光標識の大部分は細胞の内側で見られ(図2(E))、部分的にリソソームマーカー(LysoTracker red)と共在していた。24時間後、全標識rINGAPは内在化して部分的ではあるがリソソームと結び付くと思われ、細胞表面へのそれ以上の結合を示さなかった(図2(F))。結果は、INGAP102−120についても類似であった(図19)。
r−INGAPおよびINGAP102−120結合RIN−m5F細胞は細胞表面上でクラスター様複合体を形成するが、他方INGAP104−118は細胞質内へ急速に内在化する。
INGAPがどのようにしてRIN−m5F細胞に結合してその中に内在化するのかを決定するために、本発明者らは蛍光反応性色素であるDyLight488(緑色)および−594(赤色)ならびに5−FAM標識INGAP−Pで標識したr−INGAPを使用した。図10に示したように、50nMのDyLight488 r−INGAPはRIN−m5F細胞の細胞表面に数分間以内に結合し、細胞表面上で小さなクラスターおよびパッチを形成したが、これは他のリガンドについて記載された膜多重タンパク質複合体の架橋結合に似ている。これは37℃および氷上の両方で観察され、高親和性受容体結合を示唆している。これは、カベオリンおよびクラスリン媒介エンドサイトーシスについての陽性マーカーとして使用されたコレラ毒素(CTB、AlexaFluor 594)およびトランスフェリン(Texas Red、どちらもInvitrogen社)によって示された相同染色とは異なる(図2(A)、(B))。内在化の第1徴候は15分後に観察されたが(図10、11)、このタンパク質は、1時間以内に内在化するトランスフェリンおよびCTBとは異なり(図2(C)、(D))、数時間にわたり細胞表面上でクラスター化したままで留まると思われた(図2(C)〜(E)、図11)。5時間のインキュベーション後、蛍光標識の大部分は細胞の内側で見られ(図2(E))、部分的にリソソームマーカー(LysoTracker red)と共在していた。24時間後、全標識rINGAPは内在化して部分的ではあるがリソソームと結び付くと思われ、細胞表面へのそれ以上の結合を示さなかった(図2(F))。結果は、INGAP102−120についても類似であった(図19)。
興味深いことに、追跡実験では、細胞を1時間だけDyLight488 rINGAPに曝露させ、続いて洗浄し、5もしくは24時間にわたりrINGAPを伴わずに培養を実施すると、内在化rINGAPの量は連続インキュベーション後より有意に低くはなかった(図12)。これは、大多数のINGAP受容体は1時間以内にむしろ急速にリガンド結合すること、および受容体代謝回転時間はおそらく24時間を越えることを示唆した。
rINGAPとCTBもしくはトランスフェリンとの間の共遊走の欠如は、rINGAPがクラスリン媒介もしくはカベオリン媒介経路のいずれによっても内在化されないことを示唆している。これは、rINGAPとの共局在を示していない(図11)、クラスリンおよびカベオリンについての免疫染色の結果と一致している。本発明者らは、これらのデータをrINGAP内在化より迅速に発生するクラスリン媒介(クロルプロマジン、ダンシルカダベリン)もしくはカベオリン媒介エンドサイトーシス(フィリピン、およびβ−メチルシクロデキストリン)ならびにダイナソア(Dynasore)(ダイナミンインヒビター)について観察された細胞毒性に起因するこれらの薬物の特定インヒビターを用いてこれらのデータを検証することはできなかった。しかし本発明者らは、rINGAP内在化はウォルトマンニン(液相ピノサイトーシスおよびPI3K)およびサイトカラシンD(アクチン重合のインヒビター)によって阻害されたことを証明しており、これはマクロピノサイトーシスがrINGAPエンドサイトーシスにとっての主要機序であることを示唆している。
r−INGAPおよびINGAP102−120とは対照的に、FAM標識INGAP104−118の蓄積もしくはクラスター化は細胞表面上で観察されなかった(図4)。これらの結果は、15−merペプチドは細胞膜に結合するとすぐに内在化されることを示した。標識ペプチドは、RIN−m5F細胞の細胞質内で5分間のインキュベーション後に視認でき、30分後にはプラトーに到達した(図4)。図4(C)から明らかなように、INGAP−Pは30分後に早期エンドソームと共局在し、その後は徐々にリソソーム区画内に移動し、LysoTracker redと共局在すると思われる(図4(D)、(F))。
細胞結合および内在化の動力学における差とは別に、タンパク質とペプチドと間の幾つかの他の差が観察されている。例えば、内在化INGAP−Pは、連続的および「追いかけ」インキュベーションを行う24時間実験において証明されたように、迅速に分解すると思われる(図13)。さらに、INGAP−Pの内在化は、氷上で、またはカベオラインヒビターフィリピンとのプレインキュベーションによって阻害されたが(図14)、これはこのプロセスがカベオラ/脂質ラフトエンドサイトーシスによって媒介される可能性があることを示唆している。クラスリン依存性エンドサイトーシスのインヒビター(クロルプロマジン、ダンシルカダベリン)は有意な作用を有していなかった(図示していない)。他方、INGAP−P内在化はサイトカラシンDとの15分間のプレインキュベーションによって阻害され、結果として細胞表面上の小クラスターの形成を生じさせた(図5(C))。これは、アクチン線維がINGAP−P内在化のプロセスに包含されることを示唆している。しかし、ウォルトマンニンはこのプロセスに阻害作用を有するとは思われなかったので、これはマクロピノサイトーシスである可能性は低い(図5(D))。
rINGAP、INGAP102−120およびINGAP104−118が同一受容体を介して作用するかどうかを調査するために、DyLight488−rINGAPおよびFAM−INGAP102−120もしくはINGAP104−118を20倍モル過剰の非標識タンパク質もしくはペプチドを用いた競合実験において使用した。結果は、タンパク質の内在化が未標識タンパク質によって部分的に阻害され、ペプチドの内在化は未標識ペプチドによって部分的に阻害されたが、それらは試験した濃度では相互に阻害するとは思われなかった(図6)。この結果は、タンパク質およびペプチドが同一受容体に結合できないことを示唆している。
(実施例3)
Erk1/2の活性化
19−merの拡張ペプチド(19−merのseq(配列番号)1、seq2およびseq3、表1を参照)および15−merのINGAP−Pペプチド(表1を参照)の効力を比較するために、Erk1/2活性化をRINm5F細胞において測定した。結果は図18に示した。図18に提示したデータは、19−merのseq3は、同一濃度で試験した場合に、15−merのINGAP−Pペプチドおよび二つの他の19−mer配列に比較して、RIN細胞内でErk1/2活性化において3倍以上強力であったことを示している。19−merのseq3は10倍濃度での15−merペプチドより1倍濃度で2.5倍以上強力であったが、これは19−merのseq3ペプチドがより高い効率を有することを示唆した。
Erk1/2の活性化
19−merの拡張ペプチド(19−merのseq(配列番号)1、seq2およびseq3、表1を参照)および15−merのINGAP−Pペプチド(表1を参照)の効力を比較するために、Erk1/2活性化をRINm5F細胞において測定した。結果は図18に示した。図18に提示したデータは、19−merのseq3は、同一濃度で試験した場合に、15−merのINGAP−Pペプチドおよび二つの他の19−mer配列に比較して、RIN細胞内でErk1/2活性化において3倍以上強力であったことを示している。19−merのseq3は10倍濃度での15−merペプチドより1倍濃度で2.5倍以上強力であったが、これは19−merのseq3ペプチドがより高い効率を有することを示唆した。
Erk1/2の活性化は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)または様々なクラスのGタンパク質共役受容体(GPCR)によって細胞膜レベルで開始された多数のシグナル伝達カスケードによって媒介される可能性がある。これらのシグナル伝達カスケードには、PKC、PKA、PI3KもしくはRas/Raf依存性経路が含まれる。INGAP受容体の性質は知られていないが、本発明者らは、RTKおよびGPCR開始シグナル伝達事象についてホスホ特異的抗体および上述の経路の薬理学的インヒビターを用いてスクリーニングした。比較のために、本発明者らは、指示した濃度でRIN−m5F細胞に対して有糸***促進性であると見いだされたEGF(10ng/mL)およびEx−4(10nΜ)を使用した(図1A)。EGFは古典的RTK経路を通してシグナル伝達し、Ex−4はGタンパク質共役GLP−1受容体のアゴニストであるので、そのような比較はINGAPがどのように機能するのかについての重要な手掛かりを提供する可能性がある。
低分子量RasファミリーGTPasesの活性化は、例えばEGFRなどのRTKを通してのシグナル伝達における最初の重要な事象である。しかし、GPCRによるMAPキナーゼ活性化の機序はさらにGPCRとRTKとの間のクロストーク、例えばGLP−1を含む数種のGPCRリガンドについて証明されたEGFRトランス活性化によるRas活性化も含む可能性がある。この考えと一致して、本発明者らの結果は、Ras−Raf−MAPK経路と関係しているErk1/2リン酸化(図1B、C)およびc−Raf(図7B)のタイムラインと一致して、INGAP−PおよびrINGAP両方による迅速なRas活性化を証明している(図7A)。
Ras活性化に加えて、本発明者らは、Erk1/2の活性化に比較して遅延した、INGAP−Pを用いた処置30分後のAktリン酸化の増加を観察した(図15)。これは、PI3K/Aktシグナル伝達の活性化は匹敵するがINGAP−PによるErk1/2リン酸化の原因ではないことを示唆した。rINGAPもまたAktリン酸化をわずかに上昇させると思われたが、この変化は有意ではなかった。図15に示したように、Aktの最強の活性化はEx−4によって誘導されたが、これは早期の時点に観察され、また別のラットインスリノーマ細胞系におけるGLP−1シグナル伝達に関するデータと一致していた(Buteau,J.,et al.,1999,Diabetologia,42,856−864)。Aktの早期の活性化もまたEGF処置後に観察されたが、明白な二次ピークは3時間後であった。まとめると、これらの結果は、Ras−Raf−Erk活性化の上流のシグナル伝達事象はINGAP−PとrINGAPとの間で変動する可能性があり、Ex−4およびEGFによって誘導されるシグナル伝達事象とは異なる可能性が高いことを示す。注目すべきことに、本発明者らは、タンパク質もしくはペプチドいずれかによるp38 MAPK(ウエスタンブロット)、またはPKA(ELISA)、またはPKC(ウエスタンブロットおよびELISA)いずれの有意な活性化も観察しなかった(図示していない)。
INGAP誘導性増殖に関係するシグナル伝達事象を調査するために、本発明者らは、Raf(Rafインヒビター1)、PI3K(ウォルトマンニン)、PKC(Bis)、PKA(H89、PKi)、アデニル酸シクラーゼ(SQ22536)、Src(PP2)およびEGFR(AG1478)の特異的薬理学的インヒビターを使用した。さらに、百日咳毒素(Ptx)を使用して、INGAP作用がGPCRによって媒介されたのかどうかを試験した。これらのインヒビターの有効性は、INGAPもしくはEGFもしくはEx−4を用いた処置10分後のErk1/2リン酸化および24時間後のBrdU組み込みによって判定した。
図8Aに示したように、Erk1/2のINGAP誘導性活性化はPtxへの24時間の曝露後に40%まで阻害されたが、AG1478による影響は受けなかった(図8B)。これは、INGAPがおそらくGPCRを通してシグナル伝達するが、GLP−1について以前に証明されているように、このシグナル伝達がEGF受容体を包含していないことを示唆している(Buteau,J.,et al.,2003,Diabetes,52,124−132)。PtxもまたINGAPもしくはEGFもしくはEx4により誘導される早期Ras活性化を阻害したが(図9)、これはさらにINGAPがGPCR−Ras経路を介してシグナル伝達するという見解を支持する。Ras−Rafシグナル伝達の以前の密接な関係付けと一致して、Rafキナーゼインヒビター1を用いた前処置は10分後のErk1/2活性化(図8B)および試験した全成長因子によって誘導された24時間後のBrdU取り込み(図16)のどちらも減少させた。興味深いことに、SrcインヒビターPP2は、r−INGAPによって刺激されたがINGAP−Pによっては刺激されなかったErk1/2リン酸化(図8B)および増殖(図16)の両方を阻害したが、これはさらにタンパク質とペプチドとの間のシグナル伝達における差を強調している。
Erk1/2の予想された阻害およびPD98059によるBrdUの取り込みとは別に、試験した他のインヒビター(PKC、PI3KまたはPKA)はいずれもErk1/2リン酸化を有意に減少させなかった。以下で考察する24時間後にrINGAP処置細胞におけるBrdU組み込みにおける減少を誘発するH89(PKAインヒビター)を除いて、他の群では増殖の阻害は観察されなかった(図16)。本発明者らの早期のデータは、PI3K/Aktシグナル伝達をヒト脱分化管様構造からのINGAP−P誘導性膵島新生に明白に関係付けている(Jamal.,A.M.,et al.,2005,Cell Death Differ,12,702−712)。この経路は、ラット新生児膵島にINGAP−Pが及ぼす作用も媒介すると思われる(Barbosa,H.C.,et al.,2008,J Endocrinol,199,299−306)。さらに、PI3K媒介シグナル伝達はRegタンパク質にとって最も一般的な経路であると思われる(Takasawa,S.,et al.,2006,FEBS Lett,580,585−591;Bishnupuri,K.S.,et al.,2006,Gastroenterology,130,137−149)。これに関連して、INGAP−PもしくはrINGAPいずれかの有糸***促進作用におけるPI3K/Akt経路の関与を全く示していない本発明者らのデータは、驚くべきことであるように見える。しかし本発明者らは、30分間にわたりINGAP−Pを用いて処置した細胞内での1〜15分間後のRas−Raf−Erk活性化におけるピークを追跡するAktリン酸化を観察した。
Erk1/2データとは対照的に、PKA(H89)のインヒビターはrINGAP処置細胞内へのBrdU取り込みを減少させた(図16)。GPCRシグナル伝達におけるcAMP依存性PKAが果たす公知の役割およびINGAP−Pが後根神経節における神経突起成長に及ぼす刺激作用にこの経路を関係付けた以前の結果(Tam,J.,et al.,2006,Neuroreport,17,189−193)を前提に、本発明者らは、INGAP誘導性増殖におけるこの経路の潜在的関係を試験するために追加の実験を実施した。本発明者らはさらに、より特異的なPKAインヒビターであるPKi(Murray,A.I,2008,Sci Signal.,1,re4)およびアデニル酸シクラーゼの特異的インヒビターであるSQ22536がErk1/2リン酸化に及ぼす作用を試験した。図8Aに示したように、PKi(100μΜ)は作用を有さず、SQ22536(200nM)はINGAP−PもしくはrINGAPいずれかによって誘導されたErk1/2リン酸化を減少させなかっただけではなく、わずかにそれを増加させさえした。
本発明者らの結果は、cAMP−PKA経路がINGAPシグナル伝達に関係していないことを示唆している。これに関連して、INGAPが実際にGPCRを通してシグナル伝達する場合は、この受容体は、アデニル酸シクラーゼを阻害する能力を有するGiタンパク質に結合する可能性が高い(Luttrell,L.M.,2002,Can J Physiol Pharmacol,80,375−382)。
これらをまとめると、本明細書に提示した結果は、INGAP−PおよびrINGAPの両方がRas−Raf−Erk経路を活性化することによりRIN−m5F細胞内での増殖を刺激することを証明している。INGAP−PおよびrINGAPはどちらも、cAMPの活性化を誘導しないGiタンパク質共役受容体を介して作用する可能性が高い。
(実施例4)
INGAPペプチドの安定性試験
血清の存在下でのINGAP−PおよびINGAP−19ペプチドの分解プロファイルを決定した(図20)。50μΜのペプチドは、指示した時間にわたり、25%のFBSを含むRPMI−1640培地中でインキュベートした。血清タンパク質のエタノール沈降後、サンプルをHPLCによって分析した。ペプチド分解の動力学を比較するために、HPLCプロファイルを図示したようにスーパーインポーズした。
INGAPペプチドの安定性試験
血清の存在下でのINGAP−PおよびINGAP−19ペプチドの分解プロファイルを決定した(図20)。50μΜのペプチドは、指示した時間にわたり、25%のFBSを含むRPMI−1640培地中でインキュベートした。血清タンパク質のエタノール沈降後、サンプルをHPLCによって分析した。ペプチド分解の動力学を比較するために、HPLCプロファイルを図示したようにスーパーインポーズした。
FBS中のINGAP−PCおよびINGAP−19Cペプチドのインビトロインキュベーションの時間的経過試験も実施した(図21)。50μΜのINGAP−PCおよびINGAP−19Cは、指示した時間にわたり、25%のFBSを含むRPMI−1640培地中でインキュベートした。血清タンパク質のエタノール沈降後、サンプルをHPLCによって分析した。ペプチド分解の動力学を比較するために、図示したようにHPLCプロファイルをスーパーインポーズした。血清の存在下では48時間にわたりINGAP−19Cについては分解が観察されないことを見て取ることができる(図21B)。試験したINGAPペプチド中、INGAP−19Cは最高安定性を示した。
実験方法
組み換えINGAPタンパク質およびINGAPペプチド
INGAPタンパク質の15アミノ酸フラグメント(アミノ酸104〜118)およびINGAPタンパク質の19アミノ酸フラグメント(アミノ酸102〜120)を合成し、Sheldonバイオテクノロジーセンター(McGill大学、モントリオール)でHPLC精製した。C末端6−Hisタグ(分子量17.6kDa)を含有する全長組み換えINGAP(r−INGAP)は、ハムスター膵臓組織から、Superscript III RTおよびPlatinum(商標)Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen社)のディレクショナルクローニングによってpcDNA3.1D/V5−His−TOPO(商標)発現ベクター(Invitrogen社)内へクローニングした。この構築体をレンチウイルスベクター内への再クローニングに使用し、H293細胞内で(Assouline−Thomas,B.,et al.,2010,Protein Expr Purif,69:1−8に記載されているように)発現させた。r−INGAPの精製はコバルト樹脂(BD TALON(商標)、BD Biosciences社、またはFractogel EMD Chelate(M)、Merck社)を使用して、(Assouline−Thomas,B.,et al.,2010,Protein Expr Purif,69:1−8)に記載されたように実施した。
組み換えINGAPタンパク質およびINGAPペプチド
INGAPタンパク質の15アミノ酸フラグメント(アミノ酸104〜118)およびINGAPタンパク質の19アミノ酸フラグメント(アミノ酸102〜120)を合成し、Sheldonバイオテクノロジーセンター(McGill大学、モントリオール)でHPLC精製した。C末端6−Hisタグ(分子量17.6kDa)を含有する全長組み換えINGAP(r−INGAP)は、ハムスター膵臓組織から、Superscript III RTおよびPlatinum(商標)Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen社)のディレクショナルクローニングによってpcDNA3.1D/V5−His−TOPO(商標)発現ベクター(Invitrogen社)内へクローニングした。この構築体をレンチウイルスベクター内への再クローニングに使用し、H293細胞内で(Assouline−Thomas,B.,et al.,2010,Protein Expr Purif,69:1−8に記載されているように)発現させた。r−INGAPの精製はコバルト樹脂(BD TALON(商標)、BD Biosciences社、またはFractogel EMD Chelate(M)、Merck社)を使用して、(Assouline−Thomas,B.,et al.,2010,Protein Expr Purif,69:1−8)に記載されたように実施した。
細胞培養
RIN−m5F細胞(第18継代)はATCCから購入し、25mMのグルコース、10%のFBS(Montreal Biotech社)および抗生物質/抗真菌薬(Invitrogen社)を含有するRPMI−1640培地(Invitrogen社)中、37℃/5%CO2で維持した。実験は第25〜31継代からの細胞上で実施した。細胞は60mm組織培養皿中に蒔種し(1×106細胞/培養皿)、24〜48時間増殖させ、その後にINGAPタンパク質もしくはペプチドを用いた処置に先立って、24時間にわたり血清を除去した。INGAP−P(15−merペプチド)、INGAP−P2(19−merペプチド)、rINGAPおよびEGF(10ng/mL、Sigma社)を指示した時間にわたり血清無含有培地中に投与した。
RIN−m5F細胞(第18継代)はATCCから購入し、25mMのグルコース、10%のFBS(Montreal Biotech社)および抗生物質/抗真菌薬(Invitrogen社)を含有するRPMI−1640培地(Invitrogen社)中、37℃/5%CO2で維持した。実験は第25〜31継代からの細胞上で実施した。細胞は60mm組織培養皿中に蒔種し(1×106細胞/培養皿)、24〜48時間増殖させ、その後にINGAPタンパク質もしくはペプチドを用いた処置に先立って、24時間にわたり血清を除去した。INGAP−P(15−merペプチド)、INGAP−P2(19−merペプチド)、rINGAPおよびEGF(10ng/mL、Sigma社)を指示した時間にわたり血清無含有培地中に投与した。
BrdU免疫染色による細胞増殖の評価
8ウエルもしくは4ウエルのチャンバースライド(5×104もしくは1×105細胞/ウエル)内に蒔種した細胞を24時間にわたりINGAP、EGFもしくはEx4を用いて上述したように処置し、50μΜのBrdUを処置の最後の3時間の間7に加えた。細胞をPBSで洗浄し、−20℃のメタノール中で10分間固定した。BrdUについての免疫染色は製造業者のプロトコールにしたがってマウス抗BrdU抗体(Roche社)を使用して実施した。これに続いて二次HRP結合抗体(広域スペクトル、Histostain(商標)−Plus)およびAEC色原体(どちらもZymed Laboratories社)を用いて検出を実施した。スライドはヘマトキシリンを用いて対比染色した。BrdU陽性核および陰性核を計数し(全200個/ウエル)BrdU陽性核のパーセンテージを計算した(図36)。
8ウエルもしくは4ウエルのチャンバースライド(5×104もしくは1×105細胞/ウエル)内に蒔種した細胞を24時間にわたりINGAP、EGFもしくはEx4を用いて上述したように処置し、50μΜのBrdUを処置の最後の3時間の間7に加えた。細胞をPBSで洗浄し、−20℃のメタノール中で10分間固定した。BrdUについての免疫染色は製造業者のプロトコールにしたがってマウス抗BrdU抗体(Roche社)を使用して実施した。これに続いて二次HRP結合抗体(広域スペクトル、Histostain(商標)−Plus)およびAEC色原体(どちらもZymed Laboratories社)を用いて検出を実施した。スライドはヘマトキシリンを用いて対比染色した。BrdU陽性核および陰性核を計数し(全200個/ウエル)BrdU陽性核のパーセンテージを計算した(図36)。
ウエスタンブロット分析
処置後、細胞を氷上に置き、PBSで洗浄し、2.5mMのNa4P2O7、1mMのNa3VO4および完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠(Roche社)を含有する溶解バッファー(Cell Signaling社、マサチューセッツ州ビバリー)中に溶解させた。同等量のタンパク質(20〜50μg、DC Proteinアッセイ(Bio−Rad社)を用いて測定)を10%のSDS−PAGEによって溶解させ、その後にニトロセルロース膜(Bio−Rad社)上に90分間かけて250mAでトランスファーさせ、様々な抗体を用いて分析した。抗Erk1/2(MAPK44/42)および抗ホスホErk1/2(Thr202/Tyr204)ウサギポリクローナル抗体は、Cell Signaling社から購入した。一次抗体インキュベーション後、ブロットを洗浄し、次に二次抗マウスもしくは抗ウサギHRP共役抗体(Cell Signaling社)中でインキュベートし、洗浄し、ECLシステム(GE Healthcare社)を使用して展開させた。同一プロット上での数種のタンパク質の発現を分析するために、膜を最初はホスホ抗体とともにインキュベートし、次にストリッピングし(0.2Mグリシン、0.1%のSDS、0.05%のTween20、pH2.2)その後に対応する非ホスホ一次抗体を用いてプロービングした。
処置後、細胞を氷上に置き、PBSで洗浄し、2.5mMのNa4P2O7、1mMのNa3VO4および完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠(Roche社)を含有する溶解バッファー(Cell Signaling社、マサチューセッツ州ビバリー)中に溶解させた。同等量のタンパク質(20〜50μg、DC Proteinアッセイ(Bio−Rad社)を用いて測定)を10%のSDS−PAGEによって溶解させ、その後にニトロセルロース膜(Bio−Rad社)上に90分間かけて250mAでトランスファーさせ、様々な抗体を用いて分析した。抗Erk1/2(MAPK44/42)および抗ホスホErk1/2(Thr202/Tyr204)ウサギポリクローナル抗体は、Cell Signaling社から購入した。一次抗体インキュベーション後、ブロットを洗浄し、次に二次抗マウスもしくは抗ウサギHRP共役抗体(Cell Signaling社)中でインキュベートし、洗浄し、ECLシステム(GE Healthcare社)を使用して展開させた。同一プロット上での数種のタンパク質の発現を分析するために、膜を最初はホスホ抗体とともにインキュベートし、次にストリッピングし(0.2Mグリシン、0.1%のSDS、0.05%のTween20、pH2.2)その後に対応する非ホスホ一次抗体を用いてプロービングした。
蛍光rINGAP、INGAP102−120およびINGAP104−118の視認
100μgのrINGAPを取扱説明書に規定されたようにDyLight488またはDyLight594(ThermoScientific社)を用いて標識した。INGAP102−120およびINGAP104−118は、Sheldonバイオテクノロジーセンター(McGill大学、モントリオール)またはCanpeptide社(ケベック州ポイント・クレア)での合成中に5−FAMまたはFITCのいずれかを用いて標識した。蛍光rINGAP(50nM)もしくはINGAP102−120およびINGAP104−118(8.35〜16.7μΜ)をガラス製チャンバースライド内で増殖させたRIN−m5F細胞に加え(Beckton−Dickinson社またはLab−Tek社)、その後に様々な間隔でPBSを用いて洗浄し、4%パラホルムアルデヒド中で固定した。スライドは、核の対比染色のためにVectaShield培地(Vector社)またはProlong Gold(Invitrogen社)を用いてProlong Goldを使用してマウントし、共焦点顕微鏡Zeiss LSM 510またはOlympus FV10i下で試験した。ライブ共焦点イメージングのために細胞はNunc(商標)チャンバーカバーグラススライド(ThermoScientific社)内で増殖させた。核は、INGAPとのインキュベーション前に0.01%のDAPIを用いて染色し、その後に洗浄した。ライブ画像撮影は37℃および5%のCO2で実施した。
100μgのrINGAPを取扱説明書に規定されたようにDyLight488またはDyLight594(ThermoScientific社)を用いて標識した。INGAP102−120およびINGAP104−118は、Sheldonバイオテクノロジーセンター(McGill大学、モントリオール)またはCanpeptide社(ケベック州ポイント・クレア)での合成中に5−FAMまたはFITCのいずれかを用いて標識した。蛍光rINGAP(50nM)もしくはINGAP102−120およびINGAP104−118(8.35〜16.7μΜ)をガラス製チャンバースライド内で増殖させたRIN−m5F細胞に加え(Beckton−Dickinson社またはLab−Tek社)、その後に様々な間隔でPBSを用いて洗浄し、4%パラホルムアルデヒド中で固定した。スライドは、核の対比染色のためにVectaShield培地(Vector社)またはProlong Gold(Invitrogen社)を用いてProlong Goldを使用してマウントし、共焦点顕微鏡Zeiss LSM 510またはOlympus FV10i下で試験した。ライブ共焦点イメージングのために細胞はNunc(商標)チャンバーカバーグラススライド(ThermoScientific社)内で増殖させた。核は、INGAPとのインキュベーション前に0.01%のDAPIを用いて染色し、その後に洗浄した。ライブ画像撮影は37℃および5%のCO2で実施した。
統計的分析
実験は、少なくとも三回繰り返した。結果は、平均値±SEMとして表示した。統計的分析は、対応のないStudentのt検定を用いて実施した。<0.05のp値を有意と見なした。
実験は、少なくとも三回繰り返した。結果は、平均値±SEMとして表示した。統計的分析は、対応のないStudentのt検定を用いて実施した。<0.05のp値を有意と見なした。
(実施例5)
15L INGAPと15C INGAPの比較
方法:細胞の蒔種および処置
全FBS含有培地をRINm5F細胞のプレートから吸引し、培地を洗い流すために、10mLのPBSをピペットでプレート内に注入する。PBSを吸引し、600μLのトリプシンをプレート内にピペットで注入する。トリプシンが全てを被覆するのを保証するためにプレートを傾ける。8mLのFBS含有培地をプレートに加え、次に培地と細胞の混合物を15mL試験管内に収集する。細胞密度を決定するために、顕微鏡下で血球計を使用して細胞とトリパンブルーの1:1希釈液を使用して細胞を計数する。5×105細胞/プレートの所望の細胞密度を得るために各プレート内で所望とされる細胞量を計算し、細胞を16〜35mmプレート内に蒔種する。細胞を3日間にわたり37℃、5%のCO2でインキュベートする。処置前24時間にわたり細胞を血清飢餓にさせるために培地を血清含有培地からFBS無含有培地へ切り換える。十六枚のプレートを処置する。
a. 15C INGAPを備える四枚のプレート
b. 15L INGAPを備える四枚のプレート
c. FBSを備える四枚のプレート
d. H2Oを備える四枚のプレート
プレートを48時間インキュベートし、細胞を各プレートからトリプシン処理により収集し、各サンプルを固有のエッペンドルフ(Eppendorf)チューブ内に入れる。
15L INGAPと15C INGAPの比較
方法:細胞の蒔種および処置
全FBS含有培地をRINm5F細胞のプレートから吸引し、培地を洗い流すために、10mLのPBSをピペットでプレート内に注入する。PBSを吸引し、600μLのトリプシンをプレート内にピペットで注入する。トリプシンが全てを被覆するのを保証するためにプレートを傾ける。8mLのFBS含有培地をプレートに加え、次に培地と細胞の混合物を15mL試験管内に収集する。細胞密度を決定するために、顕微鏡下で血球計を使用して細胞とトリパンブルーの1:1希釈液を使用して細胞を計数する。5×105細胞/プレートの所望の細胞密度を得るために各プレート内で所望とされる細胞量を計算し、細胞を16〜35mmプレート内に蒔種する。細胞を3日間にわたり37℃、5%のCO2でインキュベートする。処置前24時間にわたり細胞を血清飢餓にさせるために培地を血清含有培地からFBS無含有培地へ切り換える。十六枚のプレートを処置する。
a. 15C INGAPを備える四枚のプレート
b. 15L INGAPを備える四枚のプレート
c. FBSを備える四枚のプレート
d. H2Oを備える四枚のプレート
プレートを48時間インキュベートし、細胞を各プレートからトリプシン処理により収集し、各サンプルを固有のエッペンドルフ(Eppendorf)チューブ内に入れる。
細胞生存性アッセイ
細胞生存性アッセイは、1サンプルからの5μLの細胞を10mLの細胞計数機の塩溶液とバイアル内で混合することによって実施した。バイアルをプローブの内側に配置する。細胞計数機は、生細胞の数を計数する。他の細胞サンプル全部を用いて細胞計数を繰り返し、1サンプル当たり二回の個別計数を実施する。細胞計数を全タンパク質に正規化するために、以下に示すようなBradfordアッセイを実施する。結果は下記の表1A〜Cに示した。
細胞生存性アッセイは、1サンプルからの5μLの細胞を10mLの細胞計数機の塩溶液とバイアル内で混合することによって実施した。バイアルをプローブの内側に配置する。細胞計数機は、生細胞の数を計数する。他の細胞サンプル全部を用いて細胞計数を繰り返し、1サンプル当たり二回の個別計数を実施する。細胞計数を全タンパク質に正規化するために、以下に示すようなBradfordアッセイを実施する。結果は下記の表1A〜Cに示した。
Bradfordアッセイ
細胞計数を全タンパク質に正規化するために、Bradfordアッセイを実施した。サンプルを遠心分離し、培地を吸引し、試験管1本当たり1mLのPBSを用いて繰り返し、再度遠心した。PBSを吸引し、200μLのRIPA溶解バッファーと置換した。遠心分離を4℃の室内で繰り返した。RIPA溶解バッファー中に溶解させた5μLの8種の「標準」濃度のBSAをピペットで96ウエルの第1の三本のカラム内に注入したが(各濃度について三回ずつ)、最終濃度は溶解バッファーだけを含有するブランクであった。これらを後に計数目的に使用する。各タンパク質サンプル二本を遠心分離した。約2mLのBradford試薬は、Bio−Radタンパク質アッセイキットからの2mLの溶液Aおよび同様にこのキットからの40μL溶液Sと一緒に混合することによって調製した。25μLのBradford試薬をピペットによって各ウエル内に入れた。キットからの200μLの溶液Bを各ウエル内に入れた。これらの溶液を一緒に混合する(確実に気泡が存在しないようにする)ためにプレートを10分間撹拌し、各サンプルの吸光度を計算するためにリーダー内に入れる。結果として生じる数値をスプレッドシートに入力した。標準曲線は、既に公知の標準物質の濃度(x値)およびそれらの吸光度値(y値)を使用して作成した。最も適合する線の式を使用して、それらの吸光度値を当てはめることによってサンプルの濃度を代数的に計算した。
細胞計数を全タンパク質に正規化するために、Bradfordアッセイを実施した。サンプルを遠心分離し、培地を吸引し、試験管1本当たり1mLのPBSを用いて繰り返し、再度遠心した。PBSを吸引し、200μLのRIPA溶解バッファーと置換した。遠心分離を4℃の室内で繰り返した。RIPA溶解バッファー中に溶解させた5μLの8種の「標準」濃度のBSAをピペットで96ウエルの第1の三本のカラム内に注入したが(各濃度について三回ずつ)、最終濃度は溶解バッファーだけを含有するブランクであった。これらを後に計数目的に使用する。各タンパク質サンプル二本を遠心分離した。約2mLのBradford試薬は、Bio−Radタンパク質アッセイキットからの2mLの溶液Aおよび同様にこのキットからの40μL溶液Sと一緒に混合することによって調製した。25μLのBradford試薬をピペットによって各ウエル内に入れた。キットからの200μLの溶液Bを各ウエル内に入れた。これらの溶液を一緒に混合する(確実に気泡が存在しないようにする)ためにプレートを10分間撹拌し、各サンプルの吸光度を計算するためにリーダー内に入れる。結果として生じる数値をスプレッドシートに入力した。標準曲線は、既に公知の標準物質の濃度(x値)およびそれらの吸光度値(y値)を使用して作成した。最も適合する線の式を使用して、それらの吸光度値を当てはめることによってサンプルの濃度を代数的に計算した。
BrdU免疫染色による細胞増殖の評価
細胞を三枚の8ウエルチャンバースライド(1×105細胞/ウエル)内に蒔種し、15C INGAP、15L INGAP、水またはFBSを用いて処置し、一晩インキュベートし、50μΜのBrdUを処置の最後の3時間の間に加えた。細胞をPBSで洗浄し、−20℃で10分間、メタノール中で固定した。BrdUについての免疫染色は製造業者のプロトコールにしたがってマウス抗BrdU抗体(Roche社)を使用して実施した。これに続いて二次HRP共役抗体(広域スペクトル、Histostain(商標)−Plus)およびAEC色原体(どちらもZymed Laboratories社)を用いて検出を実施した。スライドはヘマトキシリンを用いて対比染色した。BrdU陽性核および陰性核を計数し(ウエルあたり総計200個)、BrdU陽性核のパーセンテージを計算した。結果は下記の表2A〜Cに示した。
細胞を三枚の8ウエルチャンバースライド(1×105細胞/ウエル)内に蒔種し、15C INGAP、15L INGAP、水またはFBSを用いて処置し、一晩インキュベートし、50μΜのBrdUを処置の最後の3時間の間に加えた。細胞をPBSで洗浄し、−20℃で10分間、メタノール中で固定した。BrdUについての免疫染色は製造業者のプロトコールにしたがってマウス抗BrdU抗体(Roche社)を使用して実施した。これに続いて二次HRP共役抗体(広域スペクトル、Histostain(商標)−Plus)およびAEC色原体(どちらもZymed Laboratories社)を用いて検出を実施した。スライドはヘマトキシリンを用いて対比染色した。BrdU陽性核および陰性核を計数し(ウエルあたり総計200個)、BrdU陽性核のパーセンテージを計算した。結果は下記の表2A〜Cに示した。
ウエスタンブロット分析
ホスホ−ERKついてのウエスタンブロット、続き
細胞の蒔種および処置工程後に、十六枚のプレートを様々な処置で様々な時間にわたり処置した。
a. 二枚のプレートの10×15C INGAPを5分間放置する。
b. 二枚のプレートの10×15C INGAPを10分間放置する。
c. 二枚のプレートの10×15C INGAPを30分間放置する。
d. 二枚のプレートの10×15C INGAPを60分間放置する。
e. 二枚のプレートの10×15L INGAPを5分間放置する。
f. 二枚のプレートの10×15L INGAPを10分間放置する。
g. 二枚のプレートの10×15L INGAPを30分間放置する。
h. 二枚のプレートの10×15L INGAPを60分間放置する。
ホスホ−ERKついてのウエスタンブロット、続き
細胞の蒔種および処置工程後に、十六枚のプレートを様々な処置で様々な時間にわたり処置した。
a. 二枚のプレートの10×15C INGAPを5分間放置する。
b. 二枚のプレートの10×15C INGAPを10分間放置する。
c. 二枚のプレートの10×15C INGAPを30分間放置する。
d. 二枚のプレートの10×15C INGAPを60分間放置する。
e. 二枚のプレートの10×15L INGAPを5分間放置する。
f. 二枚のプレートの10×15L INGAPを10分間放置する。
g. 二枚のプレートの10×15L INGAPを30分間放置する。
h. 二枚のプレートの10×15L INGAPを60分間放置する。
インキュベーション後、プレートから全てのINGAP処置が確実に除去されるように、低温PBSを用いてプレートを2回洗浄した。細胞は、200μLのRIPA溶解バッファーを各プレートに加えることによって溶解させ、確実に完全溶解させるためにおよそ20分間にわたり振とう機上に置いた。タンパク質サンプルは、ピペットを使用してエッペンドルフチューブ内に収集し、4℃の室内で20分間、16.1×1,000rpmで遠心した。結果生じた上清を新しい試験管に移し、各サンプル中のタンパク質の濃度を決定するためにBradfordアッセイを実施した。各ウエルのゲル内に計15μgをローディングする場合に必要とされる量のタンパク質を溶解させる。サンプルをローディングバッファーと組み合わせ、100℃で5分間で加熱し、ラダーに沿って10ウエルを2〜10%アクリルアミドゲル内に入れ、50分間、または青色タンパク質の最前部が底部から突出するまで200Vでランする。二重トランスファーサンドイッチを使用して、1時間にわたり0.3Aでトランスファーを実行することによってタンパク質をゲルから陽荷電ニトロセルロース膜上にトランスファーさせた。これは既にランしたタンパク質をゲル物質から膜上へトランスファーさせる。膜を透明容器に置き、5%のBSA TBSTバッファー中に1時間浸漬することにより非特異的タンパク質をブロッキングし、この時間T中はそれを振とう機上に配置した。
ブロッキング溶液を除去し、膜は一次抗体溶液(10mLの5%のBSA TBST中のリン酸化ERKに結合する10μLのウサギ抗ホスホーERK抗体)中に残留させ、4℃の室内で一晩攪拌し続けた。一次抗体を除去し、膜を〜10mLの1×TBSTバッファーを用いて洗浄し、10分間にわたり振とう機上に配置した。洗浄を三回繰り返した。膜は次に、室温の振とう機上で1時間、二次抗体溶液(1:1,000の希釈係数を生じさせる、10mLの5%のBSA TBST中で一次抗体に共役する10μLのヤギ抗ウサギ抗体)中に置いた。これはタンパク質が化学発光を発光することを誘発するので、機械を使用すると可視化できる。膜は、二次抗体を用いて二回処理した。膜を5分間にわたり1mLのECL溶液で被覆し、リン酸化ERKを視認できるchemi−doc機内へ配置した。コンピュータープログラムImage Labを使用して、ゲル上のホスホ−ERKのバンドを定量した。
phosphor−ERKの定量後、ECL溶液を除去するためにTBSTを用いて膜を洗浄し、抗体プロセスはウサギ抗ホスホ−ERKの代わりに一次抗体としてウサギ抗ERKを用いて、ホスホ−ERKの代わりに全ERKを定量することを目標に繰り返し、全三回のウエスタンブロット試験を実施した。結果は下記の表3A〜Cに示した。
本開示を特定実施形態と結び付けて記載してきたが、さらに改変することが可能であり、本出願は、本開示が関係する当該分野内の公知もしくは慣習的実践の範囲内に含まれ、本明細書の上記に規定した必須の特徴に適用できるように、および添付の特許請求の範囲内に含まれるように、一般に本開示の原理にしたがっている、本開示からの逸脱を含む本開示のあらゆる変化、使用または適応を含むことが意図されていることは理解されるであろう。
他に規定されない限り、または状況が明白に他のことを指令しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者であれば一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載した方法および材料と類似もしくは同等のあらゆる方法および材料が本発明の実践もしくは試験において使用できることを理解されたい。
本明細書で言及した全ての文献および参考文献の内容は、これにより全体として参照により組み込まれる。
Claims (32)
- 配列番号4、配列番号5、または配列番号6に規定した配列を含むペプチド。
- 前記ペプチドは、被験者における、膵臓β細胞新生を誘導する、膵臓β細胞再生を誘導する、グルコース恒常性を改良する、および/または高血糖症を反転する、請求項1に記載のペプチド。
- 請求項1に記載のペプチドのアナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体であって、前記アナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体は、前記ペプチドの生物活性を有する、アナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体。
- 前記アナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体は、前記ペプチドと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の配列同一性を有する請求項3に記載のアナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体。
- 前記生物活性は、前記ペプチドの細胞、または受容体結合特異性である請求項4に記載の融合タンパク質のアナログ、ホモログ、フラグメント、または変異体。
- 前記生物活性は、被験者における、膵臓β細胞新生を誘導する能力、膵島細胞再生を誘導する能力、グルコース恒常性を改良する能力、および/または高血糖症を反転する能力である請求項4に記載の融合タンパク質のアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体。
- 配列番号4、配列番号5、または配列番号6のペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体をコードする核酸配列を含む核酸分子。
- 発現ベクターを形成するために発現制御配列へ機能的に連結している請求項7に記載の核酸分子であって、前記発現ベクターは、適切な細胞内で増殖させられる請求項7に記載の核酸分子。
- 請求項1に記載のペプチド、または、アナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体、および医薬上許容される担体、または賦形剤を含む医薬組成物。
- 前記医薬組成物は、経口投与するために適合する請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物は、注射により投与するために適合する請求項9に記載の医薬組成物。
- 膵臓の状態または疾患を予防または治療するための方法であって、請求項9に記載の組成物のペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体を投与する工程を含む方法。
- 前記状態または疾患は、代謝障害である請求項12に記載の方法。
- 前記状態または疾患は、β細胞関連障害である請求項13に記載の方法。
- 前記状態または疾患は、1型糖尿病、2型糖尿病、または糖尿病の合併症である請求項14に記載の方法。
- アポトーシスまたはネクローシスによるβ細胞死が被験者において予防または阻止される請求項14に記載の方法。
- 膵臓細胞の機能性は、被験者において改善または回復される請求項12に記載の方法。
- 被験者において血漿中インスリンレベルが増加させられる請求項12に記載の方法。
- 前記被験者において膵臓β細胞の数もしくは大きさが増加させられる、および/または膵臓管細胞からのβ細胞再生が刺激される請求項14に記載の方法。
- 被験者においてグルコース恒常性が回復もしくは改善される、および/または高血糖症が反転される請求項14に記載の方法。
- 前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は、注射、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下で投与される請求項12に記載の方法。
- 前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は、一日一回経口投与される、請求項21に記載の方法。
- 前記被験者は、ヒトである請求項9に記載の方法。
- 前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は、第二治療薬とともに投与される請求項9に記載の方法。
- 前記第二治療薬は、前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体と同時に投与される請求項24に記載の方法。
- 前記第二治療薬、および、前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は連続的に投与される請求項24に記載の方法。
- 前記第二治療薬は、1型糖尿病または2型糖尿病のための治療薬である請求項24に記載の方法。
- 前記第二治療薬は、アナキンラである請求項24に記載の方法。
- 請求項1に記載のペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体、および、医薬上許容される担体もしくは賦形剤を含む膵臓機能不全症を治療するための医薬組成物。
- 前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は、膵臓管細胞からのβ細胞再生を刺激することができる請求項29に記載の医薬組成物。
- 前記ペプチド、または、そのアナログ、ホモログ、フラグメント、もしくは変異体は、哺乳動物INGAPタンパク質の生物活性を有する請求項29に記載の医薬組成物。
- 前記生物活性は、膵臓管様細胞または管関連細胞が成長および増殖するのを刺激する能力である請求項31に記載の医薬組成物。
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