JP2016507743A - 心血管系疾患発症リスクの予測的マーカーとしての成長ホルモンの空腹時レベル - Google Patents

Abstract

本発明の主題は、被験者における心血管系リスク、又は総死亡リスクを予測するための方法であって、前記被験者から得られた体液中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルを決定し、及び、該成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルと、心血管系リスク又は総死亡リスクとを関連付けることを含み、増強したレベルは増強したリスクとして予測される。

Description

本発明の主題は、被験者の心血管系リスク又は全体的な死亡リスクを予測するための方法であって、
・該被験者由来の体液中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルを決定し、及び
・該成長ホルモン及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルと、心血管系リスク又は全体的な死亡リスクとを関連付けて、増強されるレベルは増強されるリスクを予測する。

成長ホルモン（ｈＧＨ）は脳下垂体前葉から分泌され、全てではないが多くの代謝活動はＩＧＦ−１を介して行われる｛１｝。幼児期及び青年期の縦方向の骨の成長とは別に、ｈＧＨは生涯を通して代謝効果を発揮する。例えば、同化する状況において、代謝効果を発揮し、ＩＧＦ−１を刺激するためにインシュリンとともに働き、その結果としてタンパク合成やタンパク同化を行う。異化作用を行う状況において、ｈＧＨは脂肪分解を刺激し、それによりタンパク質の分解やグリコーゲン貯蔵の消耗を防いでいる｛１｝。最近の数十年において、主にｈＧＨ欠乏やｈＧＨ過剰の状況での成人心血管系システムにおけるｈＧＨの役割について関心が高まっている。

下垂体機能が低下した成人（ｈｙｐｏｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｕｌｔｓ）は、心血管疾患及び脳血管疾患における死亡率が上昇しており、これは、一部例外｛５｝はあるものの、多くの文献｛２｝、｛３｝、｛４｝により、成長ホルモン分泌不全（ＧＨＤ）が関連していると認識されている。ＧＨＤ患者と健常者を比較したとき、ＧＨＤ患者は、心血管系リスク特性と、低密度リポタンパクコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の増加｛６｝、｛７｝、肥満度指数（ＢＭＩ）の増加｛６｝、ウエスト・ヒップ比の増加｛６｝、｛８｝及び高密度リポタンパクコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の減少｛４｝との間には逆相関があることが示されている。これらの患者に対するｈＧＨ補充療法は、心血管系リスク特性のいくつかの側面において良好な効果を示している。例えば、ＣＲＰ、体脂肪、ウエスト・ヒップ比、体幹脂肪の減少、及びＨＤＬ−Ｃの増加｛９｝、｛６｝、｛１０｝並びにＬＤＬ−Ｃの減少、及び拡張期血圧の低下等である｛１１｝。グルコースの恒常性における効果は否定的であるかもしれないが｛１１｝、｛１｝、この背景において、ｈＧＨ補充療法が有益であるかどうかは仮説であり、しかしながら今のところ、心血管系疾病率又は死亡率に対するｈＧＨ補充療法の効果を証明するための大規模なプラセボ対照、ランダム化前向き（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）試験は存在しない。

一方において、成長ホルモンを過剰に分泌する症状を呈する先端巨大症の患者もまた、心血管系及び脳血管疾患における死亡率の上昇を示す｛１２｝。この死亡率に寄与する因子は、高血圧、糖尿病、不整脈及び心臓肥大を伴う心筋症において高頻度で見られる｛１３｝、｛１４｝。これらの患者において、ソマトスタチン同族体を用いたｈＧＨ分泌の抑制は、心臓の構造及びパフォーマンスに有益な効果を示している｛１５｝。さらに、ｈＧＨ過剰分泌の有害な効果の証明は、１９９９年にＴａｋａｌａらの研究によって示されており、それによると、集中治療室の重症患者に対するｈＧＨの大量投与が、プラセボ群と比較して死亡率を２倍にすることを報告している｛１６｝。

ほとんどの文献は、ｈＧＨの過剰又は欠乏する患者に関するものである。しかしながら、１９６０年度後半及び１９７０年代前半に開始された１８年間追跡を行うフランスの警察官に対する前向き（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）試験は、ｈＧＨの空腹時レベル及び若年死亡率を調査した。これらの発見は、２時間の経口ブドウ糖負荷試験後のｈＧＨの高レベルは、全原因での若年性死亡率のリスク上昇、及び心血管系疾患を有する人の空腹時ｈＧＨのリスク上昇と関連していることを示すものである（標準ｈＧＨテストで測定したものは、死亡率の予測に対して有意差は無かった）｛１７｝。０．５ｎｇ／ｍＬのカットオフ値を用い、Ｍａｉｓｏｎらは、ハザードリスクが１．７９で、１８年心臓死亡率が増加することを見出した。

ｈＧＨが日中の大部分にわたりパルスで放出されているという事実や、血漿濃度が比較的安定する朝の時間帯に、従来のｈＧＨアッセイを使った測定を行っても、ｈＧＨ濃度が低く、時々検出限界以下であるという事実により、血漿中のｈＧＨ濃度の正確な判断が阻害されている｛３２｝、｛３３｝、｛３４｝。

本発明の主題は、血漿ｈＧＨ測定（ｈＧＨ）に対する新規な超感度アッセイであり、低ｈＧＨ血漿濃度であっても正確な測定を提供する（例えば、アッセイ感度２ｐｇ／ｍｌ）。本発明の主題は、心血管系罹患率及び死亡率の発生と、被験者の空腹時血漿中のｈＧＨとの関連付けである。本発明の主題は、被験者の空腹時血漿におけるｈＧＨと、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、全ての原因の死亡率（総死亡率）及び心血管系（ＣＶＤ）死亡率の関連性に関する。

本発明の主題は、被験者における心血管系リスク又は総死亡率リスクの予測を行うための方法であって、
・該被験者から得られた体液中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルを決定し、及び
・該成長ホルモン及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルと、心血管系リスク又は総死亡リスクとを関連付け、増強されるレベルは、増強されるリスクを予測すること、を含んでいる。

典型的なｕｓ−ｈＧＨアッセイの投薬量（ｄｏｓｅ）／シグナル曲線を示す。 男性のＣＶＤ死亡率予測のｈＧＨ四分位数のカプラン・マイヤー生存分析（Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（表３参照）。Ｙ軸：１−生存時間関数（％事象／１００）、Ｘ軸：ベースラインから移住、死亡、又は最後のフォローアップ日（２００９年６月３０日）までのフォローアップ期間（年）。

心血管系リスク又は総死亡率リスクとは、心血管系の原因により引き起こされる事象で得るリスク、又は、ある一定期間中に全てが原因で死亡するリスクを意味する。具体的な実施形態においては、該期間とは、２０年以内、１５年以内、１０年以内、５年以内、又は２．５年以内である。

本発明の主題は、被験者の１０年以内、５年以内、又は２．５年以内における血管系リスク又は総死亡リスクを予測するための方法であって、
・該被験者から得られた体液中の成長ホルモン（ｈＧＨ）、及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルを決定し、及び
・該成長ホルモン（ｈＧＨ）、及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルと、心血管系リスク又は総死亡リスクとを関連付けことを含み、増強されるレベルは、増強されるリスクを予測し、
ここで、心血管系リスクが、有害事象又は総死亡リスクと定義されるものであって、該有害事象リスク又は総死亡リスクが、該被験者から該体液を採取後の１０年以内、５年以内、又は２．５年以内に予測される。

一実施形態において、該被験者とは、測定時において健康な被験者、又は測定時において心血管系疾患を有していない被験者である。一実施形態において、該被験者とは、測定時において脳卒中、心筋梗塞、及び／又は急性心不全の既往歴が無い者である。一実施形態において、該被験者とは、測定時において、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、及び／又は虚血性心疾患、及び／又は経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）、又は冠状動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）を受けたことが無い者である。

総死亡リスクとは、全ての原因により死亡するリスクであって、ある期間中に死亡するリスクのことをいう。

発明の特定の実施形態において、心血管系リスクとは、脳卒中、ＣＶＤ（心血管疾患）による死、及び冠状動脈疾患（ＣＡＤ）を含む群から選択される事象として定義されるものであって、後者は、致命的又は非致命的な心筋梗塞、虚血性心疾患、経皮冠動脈形成術又は冠状動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）による死を含んでいる。一実施形態において、ＣＶＤ（心血管疾患）による死とは、心筋梗塞、急性心不全又は脳卒中を原因とする死のことをいう。ＣＶＤ（心血管疾患）による死とは、心血管疾患による死を意味している。特定の実施形態において、ＣＶＤ（心血管疾患）による死とは、心筋梗塞、急性心不全及び脳卒中が含まれる群から選択される。

特定の実施形態において、心血管系リスク又は総死亡リスクの予測とは、該リスクの短期間予測のことである。

特定の実施形態において、短期間中に、心血管リスクに関連した事象を有する被験者のリスク、又は、全ての原因（総死亡率）によって死亡する被験者のリスクが予測されるものであって、該短期間とは、１０年以内、さらに具体的には５年以内、さらに具体的には２．５年以内を意味している。

心血管系リスク又は総死亡リスクの短期間予測が、体液中の成長ホルモン（ｈＧＨ）、又は／及びそのアイソフォームの空腹時レベルの測定により可能であるということは、本発明における驚くべき発見である。短期間とは、該被験者の該体液を採取後、１０年以内、５年以内、又は２．５年以内を意味する。

さらに特定の実施形態において、ＣＶＤによる死の予測とは、短期間予測である。これは、さらに特定の実施形態において、短期間における心筋梗塞、急性心不全、又は脳卒中による被験者の死亡リスクが予測されることを意味しており、該短期間とは、１０年以内、さらに具体的には５年以内、さらに具体的には２．５年以内を意味している。

さらに特定の実施形態において、ＣＶＤによる死の予測とは、男性被験者に対する短期間予測のことである。これは、さらに特定の実施形態において、短期間における心筋梗塞、急性心不全又は脳卒中による男性被験者の死亡リスクが予測されることを意味しており、該短期間とは、１０年以内、さらに具体的には５年以内、さらに具体的には２．５年以内であることを意味している。

成長ホルモン（ｈＧＨ）のアイソフォームは、ｈＧＨアイソフォーム１（２２ＫＤ）、ｈＧＨアイソフォーム２、ｈＧＨアイソフォーム３及びｈＧＨアイソフォーム４が含まれる群から選択されてもよい。

アイソフォームの配列：
配列番号１：ｈＧＨ アイソフォーム１（２２ＫＤ）
ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ

配列番号２：ｈＧＨ アイソフォーム２
ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ

配列番号３：ｈＧＨ アイソフォーム３
ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ

配列番号４：ｈＧＨ アイソフォーム４
ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ

成長ホルモン（ｈＧＨ）の空腹時レベルとは、絶食した被験者（サンプル採取前１２時間の絶食）の血液、血清又は血漿中で決定される成長ホルモン（ｈＧＨ）レベルを意味する。絶食した被験者とは、サンプル採取前１２時間絶食した被験者を意味する。

本明細書で使われる用語「被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、生存しているヒト又は非ヒト生物を意味している。本明細書では好ましくは、該被験者とはヒト被験者である。被験者とは、他で言及されていなければ、健康又は疾患を有する被験者であってもよい。用語「上昇したレベル（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌ）」とは、ある閾値レベルを超えたレベルを意味する。

体液とは、血液、血漿、血清、唾液、尿及び髄液を含む群から選択されるものであってもよい。特定の実施形態において、該体液とは、血液、血漿及び血清を含む群から選択される。

アッセイ感度は「分析的（ａｌａｌｙｔｉｃａｌ）」アッセイ感度により決定されるものであってもよく、例えば、２０のｈＧＨ除去サンプル＋２標準偏差（ＳＤ）の測定結果の平均値におけるｈＧＨ濃度（標準曲線読み取り）として定義されるものであってよい。

あるいは、アッセイ感度は、臨床で日常的に用いられている検出限界を超えるものを反映する「機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」アッセイ感度によって定義されてもよい。機能的アッセイ感度とは、異なるｈＧＨ濃度を有する多様な個別サンプル中における、血漿（患者サンプル）のアッセイ間の変動係数（ＣＶ）を測定することで定義される。機能的アッセイ感度は、２０％未満のアッセイ間ＣＶとなる最も低いｈＧＨ濃度である。

アッセイ感度は、キャリブレーションで使用した方法及びｈＧＨ測定で使用した方法によるものであってもよい。異なるｈＧＨアッセイは、ｈＧＨアイソフォームの異なるセットを検出してもよく、これにより異なる量的結果を導く。これは、使用されるアッセイやキャリブレーション方法によって、異なった閾値や感度が必要となることを意味する。

異なるｈＧＨアッセイのこの可能な不均質性を克服するために、アッセイキャリブレーションは、個々の被験者の血漿ｈＧＨ値の相関によって補正されるものであってもよい。もし、相関曲線の傾きが１と異なる場合、ｈＧＨ値（キャリブレーション）は、相当するキャリブレーション、相当する感度解析及び相当する閾値に導く異なる因子によって補正されることが出来る。

上述の補正は、異なったアッセイで得られた結果と比較するために行われてもよい。

実施例１に記載されているアッセイは、主にｈＧＨ１アイソフォーム１を認識するものであり、組換えヒト成長ホルモン（ＮＩＢＳＣコード ９８／５７４、国立生物製品基準規制機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＮＩＢＳＣ、ハートフォードシャー、英国）でキャリブレーションされる。

本発明の特定の方法において、体液中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの該空腹時レベルは、分析的アッセイ感度（２０のｈＧＨ除去サンプル＋２標準偏差（ＳＤ）の測定結果の平均値におけるｈＧＨ濃度として定義される）を備えた超高感度解析法によって決定されるものであって、その感度は、１００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは５０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは３０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは５ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２ｐｇ／ｍＬ未満である。ｈＧＨの測定は、ｎｇ／ｍＬとして表現される（１ｎｇ／ｍＬ＝２．６ｍＵ／Ｌ）。

あるいは、４００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１２０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは８０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ未満、最も好ましくは８．５ｐｇ／ｍＬ未満である機能的アッセイ感度（上述参照）を備えた超高感度アッセイである。ｈＧＨの測定はｎｇ／ｍＬとして表現される。

免疫とキャリブレーションのために、本発明者らは、組換えヒト成長ホルモン（ＮＩＢＳＣ コード９８／５７４、国立生物製品基準規制機構、ハートフォードシャー、英国）を使用した。

本発明の一実施形態において、該アッセイは実施例１において記述するように行われる。

該アッセイは、１つの特異的ｈＧＨに対して選択されるものであってもよく、該体液中のｈＧＨアイソフォーム１、アイソフォーム２、アイソフォーム３及びアイソフォーム４（配列番号１−４参照）を含む群から選択される１以上、又は全ての分泌されるｈＧＨアアイソフォームに特異的であり、決定するものであってもよい。

本発明による方法の一実施形態において、該方法は、被験者における心血管系リスクを監視するため、又は治療の経過を監視するために２度以上実施される。

本発明による方法の一実施形態において、該監視とは、採用される予防的及び／又は治療的手段に対する、該被験者の反応を評価するために実施される。

本発明による方法の一実施形態において、該方法は、該被験者をリスク群に階級化するため、及び／又は古典的なリスクマーカーの頂点の該被験者を再分類するために用いられる。

本発明の一実施形態において、該被験者は男性であって、その閾値は４００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは３４０ｐｇ／ｍＬ、から１００ｐｇ／ｍＬ、好ましくは６０ｐｇ／ｍＬであって、４００ｐｇ／ｍＬ以上、好ましくは３４０ｐｇ／ｍＬ以上の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルは、高リスクと予測され、空腹時レベルが１００ｐｇ／ｍＬの閾値以下、好ましく６０ｐｇ／ｍＬ未満であると低リスクであると予測される。

本発明の他の実施形態において、該被験者は女性であって、その閾値は３１５０ｐｇ／ｍＬから好ましくは４００ｐｇ／ｍＬであって、成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルが３１５０ｐｇ／ｍＬの閾値以上の場合は高リスクと予測され、好ましくは４００ｐｇ／ｍＬの閾値未満であると低リスクであると予測される。

本発明の一実施形態において、該心血管系リスクは心筋梗塞、急性心不全及び脳卒中から選択される。

他の実施形態において、少なくとも１つの臨床パラメーターは付加的に決定され、該臨床パラメーターは、年齢、糖尿病の有無及び現在の喫煙を含む群から選択される。

本発明の方法の特定の実施形態において、該被験者の体液中で付加的に少なくとも１つのさらなるバイオマーカーが決定され、該心血管系リスクと関連付けられるものであって、該付加的なバイオマーカーは、プロニューロテンシン１−１１７（ＰＮＴ１−１１７）、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド１−１０８（ｐｒｏ−ＢＮＰ１−１０８）、プロＢＮＰ、ＢＮＰ、プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド１−９８（ｐｒｏＡＮＰ−Ｎ−末端フラグメント）、Ｐｒｏ−ＡＮＰ、アドレノメデュリン、プロアドレノメデュリン２４−７１（ｐｒｏＡＤＭ）２４−７１）、プロＡＤＭ１２７−１６４、プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏ−ＡＮＰ）及び少なくとも５アミノ酸長を有するそのフラグメント、ＳＴ−２、ＧＤＦ１５、ガレクチン−３、コペプチンを含む群から選択される。

本発明による主題は方法であって、成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルは、成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームに対するバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）を使用することにより決定される。追加的な上述のバイオマーカーは、上述されているような該バイオマーカー又はそれらのフラグメントに対するバインダーによって決定されるものであってもよい。

本発明の一実施形態において、該バインダーは、成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームに結合する抗体、抗体フラグメント又は非イムノグロブリン―スキャフォールド（ｎｏｎ−Ｉｇ−Ｓｃａｆｆｏｌｄ）を含む群から選択される。

本発明によれば、診断バインダーとは、以下からなる群から選択される：抗体、例えばＩｇＧ、典型的な全長イムノグロブリン、又は少なくとも重鎖及び／又は軽鎖のＦ−可変領域を含む抗体フラグメント、例えば、限定されないが、Ｆａｂ ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）などのＦａｂフラグメントを含む化学的に結合された抗体（フラグメント抗原結合）、単鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する単価Ｆａｂ抗体、例えばＦａｂ−Ｖ５Ｓｘ２；ＣＨ３ドメインと二量体を形成した二価Ｆａｂ（ｍｉｎｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）；二価Ｆａｂ又は多価Ｆａｂ、例えば、ｄＨＬＸドメインの二量体化を介するもの、例えばＦａｂ−ｄＨＫＸ−ＦＳｘ２、Ｆ（ａｂ’）２−フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、多量体した多価又は／及び多特異的ｓｃＦｖフラグメント、二価及び／又は二重特異的抗体、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異的Ｔ細胞誘導）、三重機能性抗体、多価抗体、例えばＧ以外の他のクラス、シングルドメイン抗体、例えば、ラクダ科又は魚類の免疫グロブリン由来ナノボディー。

特定の実施形態において、上記バイオマーカー又はそのフラグメントのレベルは、ｈＧＨ又はそのフラグメントと結合する、後述するアプタマー、非免疫グロブリンスキャフォールド（ｎｏｎ−ＩｇＧ ｓｃａｆｆｏｌｄ）を含む群から選択されるバインダーを用いたアッセイにより測定される。

上述のバイオマーカー又はそれらのフラグメントのレベルを決定するために用いられてもよいバインダーは、上述のバイオマーカーのいずれかの結合領域に対する親和定数として、少なくとも１０⁷Ｍ^-1、好ましくは１０⁸Ｍ^-1を示し、好ましい親和定数は１０⁹Ｍ^-1超、最も好ましくは１０¹⁰Ｍ^-1超である。当業者であれば、低親和力は、高濃度の化合物を加えることで補正することは当然であることを知っており、この方法は、本発明の範囲外に導くものではない。結合親和力は、例えば、ドイツ カッセルのビアフィン社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｆｆｉｎ．ｃｏｍ／ｄｅ／）において解析サービスとして提供されるビアコアメソッド（Ｂｉａｃｏｒｅ ｍｅｔｈｏｄ）を利用して決定されるものであってもよい。

（親和定数）
抗体の親和性を決定するために、固定化された抗体に対するｈＧＨの結合の反応速度論をＢｉａｃｏａ２０００システム（ＧＥヘルスケア ヨーロッパ有限会社、フレイバーグ、ドイツ）を用い、無標識の表面プラズモン共鳴法により決定した。製造業者の使用説明書に従い、ＣＭ５センサー表面に高密度に共有結合された抗マウスＦｃ抗体（マウス抗体捕捉キット；ＧＥヘルスケ）を用いて、抗体の可逆的固定を行った｛５９｝。

抗体に加え、他の生体高分子スキャフォールドは、当該技術分野において、標的分子を複合化することが周知であり、より標的特異性に優れた生体高分子の生産に用いられている。例としては、アプタマー、スピエゲルマー、アンチカリン、及びコノトキシンである。非イムノグロブリン（ｎｏｎ−Ｉｇ）スキャフォールドは、タンパク質スキャフォールドであってもよく、リガンド又は抗原と結合できるような抗体模倣体として使用されるものであってもよい。非免疫グロブリンスキャフォールドは、テトラネクチンを基にした非免疫グロブリン（ｎｏｎ−Ｉｇ）スキャフォールド（例えば、ＵＳ２０１０／００２８９９５の記述）、フィブロネクチンスキャフォールド（例えば、ＥＰ１２６６ ０２５の記述）、リポカリンを基にしたスキャフォールド（例えば、ＷＯ２０１１／１５４４２０の記述）、ユビキチンスキャフォールド（例えば、ＷＯ２０１１／０７３２１４の記述）、トランスフェリンスキャフォールド（例えば、ＵＳ２００４／００２３３３４の記述）、プロテインＡスキャフォールド（例えば、ＥＰ２２３１８６０の記述）、アンキリンリピートを基にしたスキャフォールド（例えば、ＷＯ２０１０／０６０７４８の記述）、マイクロプロテイン、好ましくはシスチンノットを形成するマイクロプロテインスキャフォールド（例えば、ＥＰ２３１４３０８の記述）、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインを基にしたスキャフォールド（例えば、ＷＯ ２０１１／０２３６８５の記述）、ＥＧＦＲ−Ａ−ドメインを基にしたスキャフォールド（例えば、ＷＯ２００５／０４０２２９の記述）、クニッツドメイン（Ｋｕｎｉｔｓ ｄｏｍａｉｎ）を基にしたスキャフォールド（例えば、ＥＰ１９４１８６７の記述）を含む群から選択されてもよい。

本発明の主題は、先行する実施形態のいずれかによる、被験者の心血管系リスク、心血管系事象を原因とする死、又は総死亡リスクを予測するための方法でもあって、該被験者から得られた体液中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームのレベルは、単独、又は予後的に役立つ実験的若しくは臨床のパラメーターと共に使用されるものであって、以下の選択肢から選択されるものであってもよい：

・「健康」又は「見かけ上健康」な被験者集団で所定のサンプル母集団中における、該被験者から得られた体液中のｈＧＨ、又はその少なくとも５アミノ酸のフラグメントのレベルの中央値の比較、

・「健康」又は「見かけ上健康」な被験者集団で所定のサンプル母集団中における、該被験者から得られた体液中のｈＧＨ、又はその少なくとも５アミノ酸のフラグメントのレベルの分位点の比較、

・コックス比例ハザード解析を基礎とした計算、又はリスクインデックス算出法、例えばＮＲＩ（総再分類インデックス（Ｎｅｔ Ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ））若しくはＩＤＡ（統合識別インデックス（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ））等を使用した計算。

本発明による方法の特定の実施形態において、該被験者は女性であり、１つのさらなるバイオマーカーは、該女性被験者の体液中のｈＧＨ及びそのアイソマーの他に決定されて、該心血管系リスクと関連付けられるものであって、該追加的なバイオマーカーとは、プロニューロテンシン（ＰＮＴ）、及び少なくとも５アミノ酸の長さを有したそのフラグメントである。

本発明の一実施形態において、いわゆるＰＯＣテスト（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）であってもよく、ＰＯＣテストとは完全自動化された解析システムの必要がなく、患者の近くで１時間以内にテストを実行することが可能なテスト技術である。本技術の一例が免疫クロマトグラフィーテスト技術である。

本発明の一実施形態において、このようなアッセイとは、何等かの検出技術を有したサンドイッチ免疫アッセイであって、それらは酵素標識、化学発光標識、電気化学発光標識を含んだアッセイであるがこれに限定されず、完全自動化アッセイであることが好ましい。本発明の一実施形態において、そのアッセイは酵素標識サンドイッチアッセイである。自動化又は完全自動化アッセイの例としては、以下に挙げるシステムをその１つとして使用することができるものであってもよい。ロッシュ社のＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、アボット社のＡｒｃｈｉｔｅｓｔ（登録商標）、シーメンス社のＣｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、Ｂｒａｈｍ社のＫｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社のＶｉｄａｓ（登録商標）及び、Ａｌｅｒｅ社のＴｒｉａｇｅ（登録商標）。

多様な免疫アッセイが知られており、本発明におけるアッセイや方法として使用されるものであってもよく、以下のものを含む：放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、同種酵素増幅免疫アッセイ（ＥＭＩＴ）、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、アポ酵素再活性化免疫アッセイ（ＡＲＩＳ）、ディップスティック免疫アッセイ及び免疫クロマトグラフィーアッセイ。

本発明の一実施形態において、該２つのバインダーの少なくとも１つは検出されるために標識されている。

好ましい検出方法とは、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、化学発光及び蛍光発光免疫アッセイ、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ルミネックス系ビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイのような様々な形式における免疫アッセイや、例えば免疫クロマトグラフィーストリップ試験のような迅速テスト形式を含む免疫アッセイである。

好ましい実施形態において、該標識とは、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。

アッセイは、同種又は異種アッセイであってもよく、競合的及び非競合的アッセイであってもよい。一実施形態において、アッセイはサンドイッチアッセイの形式であって、非競合的免疫アッセイであり、検出及び／又は定量される分子は、一次抗体及び二次抗体に結合するものである。一次抗体は、固相、例えばビーズ、ウェルや他の容器の表面、チップ又は小片（ｓｔｒｉｐ）に結合されるものであってもよく、二次抗体は、例えば色素や、放射性同位体で標識されたものや、反応性又は触媒的に活性する成分で標識されている抗体である。分析対象に結合する標識抗体の量は適切な方法によって測定される。「サンドイッチアッセイ」に関わる一般的な構成や手順は確立されており、当業者に知られているものである｛２３｝。

他の実施形態において、アッセイとは、２つの捕捉分子を含むものであって、溶液反応混合物中において両者とも拡散して存在する抗体であることが好ましく、第一の標識した構成成分は第一の捕捉分子に結合するものであって、該第一の標識した構成成分は、蛍光、若しくは化学発光−消光、又は増幅する標識システムの一部であって、該標識システムの第二の標識した構成成分は、第二の捕捉分子に結合するものであって、その結果、分析対象への両方の捕捉分子の結合により、測定可能なシグナルが検出され、サンプルを含む溶液中において形成されたサンドイッチ複合体を検出することが出来るようになる。

他の実施形態において、該標識システムとは、蛍光色素又は化学発光色素、特にシアニンタイプ色素と共に、希土類クリプテート又は希土類キレートを含むものである。

本発明の文脈では、蛍光発光を基礎としたアッセイは、色素の利用を含むものであって、例えば、ＦＡＭ（５−又は６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、フルオロセインチオイソシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、シアン染料、例えばＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、ＢＯＤＩＰＹ染料、例えばＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ等、オレゴングリーン、クマリン、例えばウンベリフェロン等、ベンズイジド、例えばＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８等、フェナントリジン、例えばテキサスレッド等、ヤキマイエロー、アレクサフルオール（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）、ＰＥＴ、臭化エチジウム、アクリジニウム染料、カルバゾール染料、フェノキサジン染料、ポルフィリン染料、ポリメチン染料等が含まれる群から選択されるものであってもよい。

本発明の文脈において、化学発光を基礎としたアッセイとしては、色素を使用した方法を含むものであって、｛２４｝中の化学発光材料として記述されている物理学的原理に基づいたものである。好ましい蛍光発光色素はアクリジニウムである。

ここで言及されるように、「アッセイ」又は「診断アッセイ」とは、診断領域において適用されるいずれの種類のものであってもよい。このようなアッセイとは、ある親和性を有する１以上の捕捉プローブに対して結合する分析物の結合を基にするものであってもよい。捕捉分子及び標的分子又は目的の分子間の相互作用に関して、親和定数としては、好ましくは１０⁸Ｍ^-1以上である。

本発明の文脈において、「バインダー分子」とは、対象分子、又は関心がある分子、つまり、サンプル由来の分析物（つまり、本発明の文脈においては、ＰＣＴ及びそのフラグメント）に結合するために使用される分子をいう。バインダー分子は、標的分子又は目的の分子に特異的に結合するために、空間的及び、表面特徴の観点、例えば表面電荷、疎水性、親水性、ルイス供与体及び／又は受容体の有無の両方から、適切に形成されなければならない。これによって、結合は、例えばイオン結合、ファンでルワールス結合、ｐｉ−ｐｉ結合、シグマーｐｉ結合、疎水結合又は水素結合の相互作用、或いは捕捉分子及び標的分子又は目的の分子間の２以上の前述の相互作用の組み合わせによって媒介されてもよい。本発明の文脈において、バインダー分子は、例えば、核酸分子、炭水化物分子、ＰＮＡ分子、タンパク質、抗体、ペプチド、又は糖タンパクを含む群から選択されるものであって良い。好ましくは、バインダー分子は抗体であり、標的又は目的の分子と十分に親和性がある抗体のフラグメントが含まれるものであり、さらに組換え抗体又は組換え抗体フラグメント、並びに化学的に及び／又は生化学的に改変した該抗体の誘導体、又は該抗体の少なくとも１２アミノ酸長を有する変異鎖（ｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ）由来のフラグメントが含まれる。

化学発光標識は、アクリジニウムエステル標識、イソルミノール標識を含むステロイド標識等であってもよい。

酵素標識は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）、アルカリフォスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、酸性フォスファターゼ、グルコース―６―リン酸デヒドロゲナーゼ等であってよい。

本発明の一実施形態において、該２つのバインダーの少なくとも１つは、磁気粒子やポリスチレン表面のような固相に結合する。

本発明によるサンプル中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームのレベルを決定するために行われるアッセイの一実施形態において、このようなアッセイはサンドイッチアッセイであって、好ましくは完全に自動化されたアッセイである。それは完全に自動化された又は手動で行われるＥＬＩＳＡであってよい。それは、いわゆるＰＯＣテスト（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）であってもよい。自動又は完全自動化したアッセイの例としては、以下に挙げられるシステムの１つを利用するようなシステムを含む：ロッシュ社 Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）、アボット社 Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）、シーメンス社Ｃｅｎｔａｕｅｒ（登録商標）、ブラハムズ社Ｋｒｙｐｔｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社 Ｖｉｄａｓ（登録商標）、Ａｌｅｒｅ社 Ｔｒｉａｇｅ（登録商標）。テストフォーマットの例は上述されている。

本発明によるサンプル中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームのレベルを決定するためのアッセイの一実施形態において、該２つのバインダーの少なくとも１つは検出されるために標識されている。標識の例は上述されている。

本発明によるサンプル中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームのレベルを決定するためのアッセイの一実施形態において、該２つのバインダーの少なくとも１つは固相に結合されている。固相の例は上述されている。

本発明によるサンプル中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームのレベルを決定するためのアッセイの一実施形態において、該標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。

本発明のさらなる主題は、本発明によるアッセイを含むキットであって、該アッセイの構成要素は、１以上の容器に含まれてもよい。

本発明によれば、該被験者は合併症を有していてもよく、それは疾患、又はアテローム性動脈硬化症、高血圧、心不全、心筋梗塞を含む群より選択される事象であってよい。

本発明の好ましい実施形態において、成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時のレベルは免疫アッセイで測定される。さらに好ましい実施形態において、該免疫アッセイは、少なくとも１つの抗体、好ましくは２つの抗体を含み、が１０^-8Ｍ以下の結合親和性を有する。

本発明の主題は、少なくとも１つの単一特異的なバインダー、好ましくは２つの単一特異的バインダーを含む超高感度（ｕｓ−ｈＧＨ）アッセイでもあって、ｈＧＨ及び／又はそのアイソフォームに対する１０^-8Ｍ以下の結合親和性を有し、該超高感度アッセイは１００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは５０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは３０ｐｇ／未満、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは５ｐｇ／未満、好ましくは２ｐｇ／ｍＬ以未満の分析的アッセイ感度を備える。

超高感度ｈＧＨアッセイの１つの特定の実施形態において、該単一特異的バインダーはモノクローナル抗体である。

本発明による超高感度ｈＧＨアッセイは、本発明による方法として使用される。

実施例１、ｕｓ−ｈＧＨアッセイ

試薬
他に言及がなければ、試薬はメルク社（ダルムシュタット、ドイツ）よりｐ．ａグレードで購入されてものである。

抗原
免疫とキャリブレーションのために、組換えヒト成長ホルモン（ＮＩＢＣコード ９８／５７４、国立生物製品基準規制機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ハートフォードシャー、英国）を使用した。

抗体開発
ｈＧＨに対するマウスモノクローナル抗体はＵＮＩＣＵにより開発された（カールスブルグ、ドイツ）。

抗体は以下の方法によって作製された：
０日目及び１４日目において、ＢＡＬＢ／ｃマウスは１００μｇのｈＧＨが免疫され（完全フロイトアジュバント１００μＬ中に乳化）、２１日目及び２８日に５０μｇのｈＧＨ（完全フロイトアジュバント１００μＬ中）が免疫された。細胞融合実験を行う３日前、当該動物には１００μＬ生理食塩中に溶解された５０μｇの抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が腹腔内及び静脈に注射で投与された。

免疫したマウス由来の脾臓細胞、及びミエローマ細胞株ＳＰ２／０の細胞は、１ｍＬの５０％ポリエチレングリコールを用いて３０秒間、３７℃にて融合された。洗浄後、細胞は９６ウェル細胞培養皿に播種された。融合クローンはＨＴＡ培地（２０％ウシ胎児血清及びＨＡＴサプリメント含有ＲＰＭＩ１６４０培養液）にて生育することで選択された。２週間後、ＨＡＴ培地はＨＴ培地と交換されて３回継代され、続いて通常の細胞培養液へと交換された。

３週間後、細胞培養上清は、抗原特異的ＩｇＧ抗体のための最初のスクリーニングが行われた。陽性となった微小培養液は、増殖のために２４ウェル細胞培養皿へと移された。再度確認後、選択された培養物は、限界希釈法を使用したクローン化及び再クローン化が行われ、アイソタイプが決定された｛６０｝、｛６１｝。

モノクローナル抗体作製
本発明者らはさらなる探索のために５つの抗体を選択した。

抗体は、標準的な抗体作製法により作製され（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ （１９９７）、 ＡＴＬＡ ２５、 １２１）、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製された。ＳＤＳゲル電気泳動解析によれば、抗体純度は９５％以上であった。

抗体の標識及びコーティング
全ての抗体は、以下の手順に沿って、アクリジニウムエステルで標識された：

標識された化合物（トレーサー）：１００μｇ（１００μＬ）抗体（１ｍｇ／ｍＬ ｐＨ７．４ ＰＢＳ中）は１０μＬ アクリジウム ＮＨＳ−エステル（１ｍｇ／ｍＬ アセトニトリル（インベント社、ドイツ）中）（ＥＰ０３５３９７１）と混合され、室温で２０分間保温された。標識された抗体は、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＳＥＣ４００−５（バイオ ラッド ラボラトリー社、米国）を使用したゲル濾過ＨＰＬＣで精製された。精製された抗体は、（３００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／Ｌ 牛血清アルブミン、ｐＨ７．０）中で希釈された。最終濃度は、２００μＬあたり、標識化合物（約２０ｎｇ 標識抗体）約８００．０００相対発光ユニット（ＲＬＵ）だった。アクリジウムエステル化学発光はＡｕｔｏＬｕｍａｔ ＬＢ９５３（ベルトールテクノロジー社）にて測定された。

固相抗体（コートされた抗体）：
固相：ポリスチレンチューブ（グライナー バイオ―ワン インターナショナル社、オーストリア）は、抗体（１．５μｇ抗体／０．３ｍＬ １００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）でコートされた（１８時間、室温）。５％ウシ血清アルブミンでブロッキング後、チューブはＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄され、真空乾燥された。

ｈＧＨイッムノアッセイ：
５０μＬサンプル（又はキャリブレーター）はコートしたチューブへピペットにて添加され、標識抗体（２００μＬ）を加え、チューブは２時間、１８−２５℃で保温された。結合されなかったトレーサーは、洗浄液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で５回洗浄されることで除かれた。チューブに結合された標識抗体はＬＢ９５３で測定された。濃度が１ｎｇ／ｍＬに固定されているｈＧＨが使用された。異なった抗体の組み合わせにおけるノイズ（ｕｓ−ｈＧＨ非含有のＲＬＵ）に対するシグナル（１ｎｇ／ｍＬにおけるＲＬＵ）の比を表１に示す。全ての抗体は他の抗体と伴にサンドイッチ複合体を形成可能であった。ノイズに対する強力なシグナルを伴った抗体ペア（ベスト感度）は、続いて行うｕｓ−ｈＧＨ−イッムノアッセイを実施するために使用された：ｈＧＨ Ｇ１２抗体はチューブコート抗体として使用され、ｈＧＨ Ｈ４抗体は標識抗体として使用された。

キャリブレーション：
アッセイは、２０ｍＭ Ｋ₂ＰＯ₄、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、５０μＭアマスタチン（Ａｍａｓｔａｔｉｎ）、１００μＭ ロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、ｐＨ８．５中に溶解された組換えｈＧＨ（ＷＨＯ国際標準、ＮＩＢＳＣ コード９８／５７４）の希釈物によりキャリブレーションが行われた（図１）。

アッセイの詳細
分析的アッセイ感度（ｈＧＨ非含有サンプルの２０検体のＲＬＵの平均値＋２ＳＤ）はｈＧＨ ２ｐｇ／ｍＬであって、機能的アッセイ感度（上述参照）は８．５ｐｇ／ｍＬであった。復元率と希釈率は、５−１０，０００ｐｇ／ｍＬ ｈＧＨの内部測定範囲の＞８５％であった。組換えｈＧＨ（２２ＫＤ）特異的ｕｓ−ｈＧＨアッセイ及びｈＧＨアッセイ間のＮ＝９９７サンプルの相関関数はｒ＝０．９８であって、０．９５のｒは、脳下垂体から天然に産生するｈＧＨアイソフォームを優先的に認識するアッセイで見られる｛２０｝。これらデータは、本発明中で、全てのｈＧＨアイソフォーム測定の適合性を示している。

実施例２ 集団研究
対象及び方法
研究集団
マルメダイエットアンドキャンサースタディー（ＭＤＣ）は、１９９１年から１９９６年の間に実施された２８４９９人の母集団によるプロペクティブ（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ）疫学的コホートである｛１８｝。このコホート由来のランダムサンプルには、１９９１年１１月から１９９４年２月（ｎ＝６１０３）に調べられたＭＤＣ心血管系コホート（ＭＤＣ−ＣＣ）が含まれており、ＭＤＣ−ＣＣは、当初、頸動脈疾患の疫学調査を目的とするものであった｛１９｝。空腹時の血漿サンプルの値が欠けているものや、糖尿病の罹患率又は空腹時ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ若しくはｈＧＨの値のデータが無い被験者を除外すると、４４５４人が残り、一次研究コホートを構成する。

全ての参加者は書面による同意書を提供し、本研究はランド大学（ランド、スウェーデン）の倫理委員会で承認された。

臨床試験及びアッセイ
参加者は既往歴、健康診断及び研究所事前評価を受けた。血圧は、仰向きの姿勢にて１０分間休んだ後、水銀コラム血圧計にて測定した。ウエスト周りはへその位置で測定した。現在のタバコの喫煙は、過去１年以内に喫煙していたかどうかで定義し、自己管理アンケートによって調査された。ベースラインにおける降圧薬服用の普及を記録するために、日記と組み合わせた同様のアンケートが使用された。糖尿病は、医者が行った診断の自己申告、糖尿病薬の使用、又は空腹時の全血グルコースが６．０ｍｍｏｌ／Ｌ（１０９ｍｇ／ｄＬ）より高い場合のいずれかとして定義された。

血漿及び全血の全てのサンプルは、一晩の絶食後に採取されたものであり、仰向けで１５分間休憩後、午前７時３０分〜９時の間に採取された。ＨＤＬ−Ｃ及び総コレステロールのレベルは、マルメ大学病院 臨床化学部門の標準的手順に沿って測定された。ＬＤＬ−Ｃのレベルは、フライドワルド法則（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ ｆｏｒｍｕｌａ）に従って算出された。

ｈＧＨレベルは、ＭＤＣ−ＣＣベースライン試験において―８０℃で即座に凍結し、保存された空腹時の血漿サンプルで測定された。測定は、超高感度化学発光イムノアッセイ（実施例１ ｕｓ−ｈＧＨアッセイ参照）を用いて行われた。検出限界は２ｐｇ／ｍＬ、機能的アッセイ感度は８．５ｎｇ／ｍＬであった。ｈＧＨの測定結果はｎｇ／ｍＬ（１ｎｇ／ｍＬ＝２．６ｍＵ／Ｌ）で表現される。

男性及び女性におけるｈＧＨの分布

観察された最も低いｈＧＨ濃度は、男性においては０．０２ｎｇ／ｍＬ、女性においては０．０１ｎｇ／ｍＬであって、これは、全ての被験者における空腹時ｈＧＨ検出ために用いられたｕｓ−ｈＧＨテスト（分析的感度：０．００２ｎｇ／ｍＬ（２ｐｇ／ｍＬ）、機能的アッセイ感度：０．００８５ｎｇ／ｍＬ（８．５ｐｇ／ｍＬ））が適合することを示している。男性のＣＶＤによる死に対するカットオフ値は、高リスク被験者の場合は０．３４ｎｇ／ｍＬより高くてもよく、低リスクの場合は０．０６ｎｇ／ｍＬ未満であってもよい。

臨床エンドポイント
本発明者らは４つの主要な結果、冠状動脈疾患、脳卒中、心臓血管系死亡率、総死亡率を調べた。それぞれのスウェーデン人個別ＩＤ番号と、スウェーデン人病院退院記録（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ （ＳＨＤＲ））、スウェーデン人死因記録（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｃａｕｓｅ ｏｆ Ｄｅａｔｈ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ（ＳＣＤＲ））、マルメ脳卒中記録（ｔｈｅ Ｓｔｒｏｋｅ ｉｎ Ｍａｌｍｏ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ）及び、心臓病における推奨された治療法により評価された根拠に基づく治療の強化及び開発のためのスウェーデンウェブシステム（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｗｅｂ−ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｃａｒｅ ｉｎ Ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｅｄ Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ （ＳＷＥＤＥＨＥＡＲＴ））の記録の関連付けを通してエンドポイントが検索された。結果を分類するためのこれらの記録の使用は、以前有効性が確認されており、心筋梗塞のような事象を検出するための感度は９０％を超えることが示されている｛２１｝、｛２２｝、｛２３｝。ＣＡＤは、致命的又は非致命的な心筋梗塞、虚血性心疾患による死、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）又は冠動脈バイパス術のうち、いずれか早い方と定義されており、ＳＨＤＲ、又はＳＣＤＲのそれぞれにおいて、国際疾病分類 第９版及び１０版（ＩＣＤ−９、ＩＣＤ−１０）コード４１０及びＩ２１、ＳＣＤＲのコード４１２及び４１４（ＩＣＤ−９）又はＩ２２、Ｉ２３及びＩ２５（ＩＣＤ−１０）に基づいている。脳卒中は、コード４３０、４３１、４３４及び４３６（ＩＣＤ−９）、又はＩ６０、Ｉ６１、Ｉ６３及びＩ６４（ＩＣＤ−１０）に基づき、致命的又は非致命的脳卒中と定義された。心血管系の死はＳＣＤＲにおいて、コード３９０−４５９（ＩＣＤ−９）又はＩ００−Ｉ９９（ＩＣＤ−１０）に基づき定義された。結果に対するフォローアップは２００９年６月３０日まで延長した。

統計解析
空腹時のｈＧＨの値は、右歪曲分布（ｒｉｇｈｔ−ｓｋｅｗｅｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示し、解析前に自然対数へと変換された。ｈＧＨが、従前の心血管系リスク因子｛２４｝と相関があるかどうか確かめるために、ベースラインにおいて線形回帰モデルを用い、従属変数としてのｈＧＨと、非従属変数としての年齢、性別、現在の喫煙状況、降圧剤摂取、糖尿病、並びに、収縮期血圧、ＢＭＩ、ＨＤＬ−Ｃ及びＬＤＬ−Ｃのための標準化された値を、独立（未処理（ｃｌｕｄｅ））又は同時（多変量補正）に導入した横断的解析（ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ）を実施した。

多変量コックス比例ハザードモデル（Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ Ｃｏｘ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｈａｚａｒｄ ｍｏｄｅｌ）は、ｈＧＨと、心血管系事象及び死亡のインシデントとの間の関連性を調べるために用いられた。ＣＡＤ及び脳卒中の解析において、本発明者らは、それぞれの解析におけるベースラインの前に、ＣＡＤ（ｎ＝９４）又は脳卒中（ｎ＝３５）の既往歴がある個人を除いた。全てのモデルは、年齢、性別、収縮期血圧、降圧剤の使用、現在の喫煙、糖尿病、ＬＤＬ−Ｃのレベル、ＨＤＬ−Ｃのレベルで補正された。本発明者らは、比較ハザード仮説が、使用するショーンフィールド残差（Ｓｃｏｈｅｎｆｅｌｄ ｒｅｓｉｄｕａｌｓ）（時間におけるショーンフィールド残差の一般化された線形回帰の非ゼロ傾きテスト）と適合することを確認した。ｈＧＨに対するハザード比率（ＨＲ）は、ｈＧＨの自然対数の１−ＳＤ増加ごとに示された。性別の違いに有意差があるかどうか証明するために、性別相互作用テストが実施された。

カプラン・マイヤー曲線（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ ｃｕｒｖｅｓ）を得るために、コホートは性別特異的な四分位値へと分割された。

表３は、男性及び女性における異なった四分位のカットオフ濃度を示す。１以上のｈＧＨアイソフォームの異なったセットを認識するｈＧＨアッセイが使用されれば、カットオフ濃度は適合するかもしれない。

ｈＧＨアイソフォームの異なったセットを認識する異なるアッセイを使用することにより、異なる結果が得られる可能性を評価するために、本発明者らはアッセイ（実施例１中に記載された組換えｈＧＨ（アイソフォーム１）に結合するために作製された抗体）と、アイソフォーム２−４を主に認識するアッセイ（Ｐｉｔ−ｈＧＨアッセイ）｛２９｝とを比較した。９９７名の健康な被験者のｈＧＨの結果は相関しており、相関係数は０．９５（ｒ＝０．９５）であって、異なるｈＧＨアイソフォームに結合するアッセイを使用してもほとんど同一の結果であることを示している。

ｈＧＨは、リスクを再分類するために使用できるかどうか評価するために、本発明者らは以前報告された方法に従って、総再分類改善度（ｎｅｔ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、ＮＲＩ）を算出した｛２５｝。本発明者らは、心血管系事象の１０年間の上昇リスクを見積もり、参加者を５％未満、５％以上１０％未満、１０％以上２０％未満、２０％以上のグループに分類するために、上述したパラメーターとともに多変数リスクスコア（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｓｋ ｓｃｏｒｅ）を用いた。ｈＨＧの値を追加することにより、参加者は異なるグループへと再分類されることができた。本発明者らは被験者の再分類を評価し、モデルの成功性の評価として、ＮＲＩを算出した。モデル判別は、Ｃ−統計（ハレル（Ｈａｒｒｅｌｌ’ｓ））を算出することで評価した。Ｃ統計とは、異なったモデルに対し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の下部の領域を示す｛２５｝。

ＮＲＩ及びＣ−統計を除く全ての解析はＳＰＳＳ統計ソフトウエア（バージョン２０．０．２、ＳＰＳＳ社、シカゴ、イリノイ州）を使用して行われた。ＮＲＩ及びＣ―統計解析は、ステートソフトウエア バージョン１１（ステート社、カレッジステーション、テキサス州）を用いて行われた。０．０５未満の２−サイドＰ値は、統計的に有意差があるものとみなした。

結果
横断的解析（Ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）
コホートのベースライン特性は表２に示している。期待された通り、女性は、男性よりもｈＧＨの空腹時の値が有意に高かった（表３）。クルード回帰モデルにおいて、女性の年齢を除き、全ての変数は、両方の性別におけるｈＧＨレベルの重要な決定要因であった（表４）。補正したモデルにおいては、年齢、現在の喫煙及びＨＤＬ−Ｃは、ｈＧＨと有意な正の相関関係があり、一方で、ＬＤＬ−Ｃ及びＢＭＩは男女ともに有意に負の相関関係があった（表４）。収縮期血圧は女性において、有意に負の相関関係があったが、男性ではなかった。女性において、糖尿病は、単純な解析ではｈＧＨと強い負の相関関係があったが、補正した解析においては、有意差はないボーダーラインであった。逆に、男性におけるｈＧＨと糖尿病との間の相関関係は、いずれのモデルを用いた場合においても正であり、有意であった。重回帰モデルでは、男性に対しては９．５％のＲ²値、女性に対しては１１．８％であった。全コホートを解析し、性別で補正すると、Ｒ²値は３９％であった。ｈＧＨに関連した変数、ウエスト、インシュリン（自然対数）及び体脂肪率の追加は、男性に対しては１０．４％、女性に対しては１２．６％のＲ²値を与えた。これらの追加変数を含んだクルード回帰モデルは、全て空腹時ｈＧＨレベルと有意な負の相関関係を示した。

成長ホルモン及びＣＡＤのリスク
フォローアップ期間の中央値が１６．１年（ＩＱＲ、１５．４−１６．７）の期間中、ＣＡＤの既往歴が無い４３５８人（男性１７９９人、女性２５５９人）のうち、４０１人（男性２４９人、女性１５２人）はＣＡＤ事象を経験した。全コホートにおいて、ベースラインｈＧＨのそれぞれのＳＤ増加は、１．１４（Ｐ＝０．０８）の多変量補正（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ―ａｄｊｕｓｔｅｄ）ＨＲと関連性があった（表５）。ＨＲは、男性の独立した解析結果と同様であったが（ＨＲ、１．１７；ｐ＝．０１）、女性では有意な上昇はなかった。ＣＡＤの結果において、有意な性別間相互作用はなかった（ｐ＝．３７）。ｈＧＨの最高四分位 対 最低四分位数は、総合解析においてＨＲが１．３３（９５％ＣＩ、０．９９−１．７８；ｐ＝．０５）、男性では１．４９（９５％ＣＩ、１．０１−２．０９；ｐ＝．０４）と関連していたが、女性では有意差がなかった（ｐ＝．９１）（表６）。

成長ホルモン及び脳卒中リスク（表５及び６）
コホート中の４４１７人（男性１８４９人、女性２５６８人）は脳卒中の既往歴が無かった。フォローアップ期間の中央値が１６．２年（ＩＱＲ、１５．５−１６．７）の間、２６５人（男性１５２人、女性１２３人）が脳卒中を罹患した。ベースラインにおけるそれぞれの空腹時ｈＧＨのＳＤ増加は、全体コホートにおける多変量補正したＨＲが１．１９と関連性があり、性別特異的解析では、男性においてＨＲが１．１８であり、女性では有意差は無かった。結果において性別間相互作用に有意差は無かった（ｐ＝．８１）。ｈＧＨの最高四分位数 対 最低四分位数は、総合解析において、ＨＲが１．４７（９５％ＣＩ、１．０３−２．１１；ｐ＝．０４）と関連しており、男性では１．４８（９５％ＣＩ、０．９１−２．４２；ｐ＝．１１）、女性では１．４６（９５％ＣＩ、０．８３−２．５８；ｐ＝．１９）であった。

成長ホルモン及び総死亡率（表５及び６）
コホート中の４４５２人（男性１８７２人、女性２５６８人）のうち、６９８人（男性３８３人、女性３１５人）はフォローアップ期間の中央値１６．２年（ＩＱＲ、１５．６−１６．７）の後、死亡した。ベースラインにおける空腹時ｈＧＨのそれぞれのＳＤ増加は、全体コホートにおいて、多変量補正したＨＲが１．２１と関連しており、男性のＨＲ１．２６と一致していたが、女性では有意差は無かった。性別の相互作用の解析は、結果における性別間の有意な差を示した（ｐ＝．０１）。ｈＧＨの最高四分位数 対 最低四分位数は、総合解析におけるＨＲが１．４６（９５％ＣＩ、１．１７−１．８４；ｐ＜．００１）、男性におけるＨＲが２．０５（９５％ＣＩ、１．４７−２．８６；ｐ＜．００１）と関連していたが、女性では有意差が無かった（ｐ＝．９６）

成長因子及び心血管系死亡率（表５及び６）
コホートにおいて、ベースライン時およびフォローアップ期間中において、４４５２人は解析可能であって、総死亡率におけるコホートと一致しており、これらのうち２１５人（男性１２６人、女性８９人）は主要な死因として心血管系事象により死亡した。ベースラインにおけるそれぞれの空腹時ｈＧＨのＳＤ増加は、全コホートにおける、多変量補正したＨＲ １．５１と関連していた。性別特異的なＨＲは、男性では１．４１、女性では１．３８であった。この結果においては、性別間相互作用には有意差は無かった（ｐ＝．８１）。ｈＧＨの最高四分位数 対 最低四分位数は、総合解析においてＨＲが２．６８（９５％ＣＩ、１．７０−４．２３；ｐ＜．００１）、男性では３．４１（９５％ＣＩ、１．７６−６．６１；ｐ＜．００１）と関連しており、女性では、１．９８（９５％ＣＩ、０．９８−３．８１；ｐ＝．０６）であった。図２は、男性におけるＣＶＤ死亡事象の時間依存的な発生を示す。

成長ホルモンはＣＶＤ死亡率の短期間予想因子である
ＣＶＤによる死の時間依存的発生は図２に記載されている。

驚くことに、観察期間が短くされると、低リスク者と高リスク者の間の予測判別がより強くなった（表７）。
男性のＣＶＤによる死の短期間リスク予測において、ｈＧＨは特に強く示す。事象の相対的リスク（ベースラインにおける四分位数 ４ 対 四分位数 １）は、男性のＣＶＤによる死の２．５年リスク予測に対しては＞１５、５年リスク予測に対しては、９．１、１０年リクス予測に対しては７．９、１５年リスク予測に対しては４．２である。これらのデータは、ｈＧＨの強力な短期間予測能力及びｈＧＨの連続測定の適合性を示す。

判別とリスク再分類
総合ＣＡＤ解析及び脳卒中解析においては、ＮＲＩ解析は、ＣＡＤ及び脳卒中に対しては有意差が無かったが、改善傾向が確認できた。総死亡率の結果において、ＮＲＩは男性では有意であったが（４．５％；ｐ＝０．００５）、女性では有意ではなかった。改善の大部分は、無事象の下位分類から生じた（８．６％）。心血管系の死において、ＮＲＩは全ての被験者において１１．１％（ｐ＜．００１）であり、女性コホートでは１０．２％（ｐ＝．０５）であり、インシデント事象の上位分類で特に改善が見られた（総合サンプルでは、イベントの１４．４％が向上、女性では１６．９％）。

ベーシックモデルに対するｈＧＨの追加は、ＣＡＤ、脳卒中、ＣＶＤによる死及び総死亡率に対し、全てのＣ−統計を改善した。男性の総死亡率に対し、７０．５％から７１．４％への改善が見られた。最も大きな改善がＣＶＤによる死で見られ、Ｃ−統計が全コホートでは７８．１％から７９．８％へ増加、男性では７５．７％から７７．１％へ増加、女性では８０．４％から８１．２％へ増加した。

Claims (24)

1. 被験者における１０年以内の心血管系リスク又は総死亡リスクを予測するための方法であって、
   ・前記被験者から得られた体液中の成長ホルモン（ｈＧＨ）、及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルを決定し；及び
   ・前記成長ホルモン（ｈＧＨ）、及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルと、心血管系リスク又は総死亡リスクとを関連付け、ここで、増強されるレベルは、増強されるリスクを予測し、
   ここで、前記血管系リスクは、有害事象又は総死亡リスクとして定義され、前記有害事象リスク又は前記総死亡リスクは１０年以内に予測される方法。
2. 心血管系リスクが、脳卒中、ＣＶＤ（心血管系疾患）による死、及び冠状動脈疾患（ＣＡＤ）を含む群から選択される有害事象として定義され、ここで、後者は、致命的若しくは非致命的な心筋梗塞、虚血性心疾患による死、経皮冠動脈形成術（ＰＣＩ）又は冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記心血管系リスク又は総死亡リスクが５年又は２．５年の期間に予測される、請求項１又は２に記載の方法。
4. ＣＶＤによる死のリスクが予測され、ここで、ＣＶＤによる死が、心筋梗塞、心不全、又は脳梗塞による死である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記被験者が男性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 体液中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの前記空腹時レベルが、１００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは５０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは３０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは５ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２ｐｇ／ｍＬ未満の分析的アッセイ感度を有する超高感度アッセイによって決定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 体液中の成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの前記空腹時レベルが、４００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１２０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは８０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ未満、最も好ましくは８．５ｐｇ／ｍＬ未満の機能的アッセイ感度を有する超高感度アッセイによって決定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記アッセイが、前記体液中の分泌型ｈＧＨアイソマーの１つ若しくは２以上のいずれかに対して特異的であり、又は前記体液中の、アイソマー１、アイソマー２、アイソマー３及びアイソマー４（配列番号１〜４）を含む群から選択される、ｈＧＨの全ての分泌型アイソマーに特異的であり、かつ、決定する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記方法は、被験者における心血管系リスク若しくは総死亡リスクを監視するために、又は治療経過を監視するために、２度以上実施される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記監視は、採用される予防的及び／又は治療的手段に対する、前記被験者の反応を評価するために実施される、請求項９に記載の方法。
11. 前記被験者をリスクグループへ階級化するため、及び／又は心血管系リスク若しくは総死亡リスクのために前記被験者を再分類するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記体液は血液、血漿、又は血清である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記被験者は男性であり、閾値は３４０ｐｇ／ｍＬ〜６０ｐｇ／ｍＬであって、３４０ｐｇ／ｍＬを超える成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルを高リスクと予測し、６０ｐｇ／ｍＬ未満の空腹時レベルを低リスクと予測する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記被験者は女性であり、閾値は３１５０ｐｇ／ｍＬ〜４００ｐｇ／ｍＬであって、３１５０ｐｇ／ｍＬを超える成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルを高リスクと予測し、４００ｐｇ／ｍＬ未満の空腹時レベルを低リスクと予測する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記ＣＶＤ（心血管系疾患）が、心筋梗塞、心不全、及び脳卒中から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 付加的に、年齢、糖尿病の存在、現在の喫煙を含む群から選択される、少なくとも１つの臨床パラメーターが決定される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 付加的に、前記被験者の体液中の少なくとも１つのさらなるバイオマーカーが決定され、前記心血管系リスク又は前記総死亡リスクと関連付けられ、ここで、前記付加的なバイオマーカーは、プロニューロテンシン（ＰＮＴ）１−１１７及び少なくとも５アミノ酸長を有するそのフラグメント、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏ−ＢＮＰ)１−１０８、プロＢＮＰ、ＢＮＰ、プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド１−９８（ｐｒｏＡＮＰ−Ｎ−末端フラグメント）、Ｐｒｏ−ＡＮＰ、アドレノメデュリン、プロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）２４−７１、プロＡＤＭ１２７−１６４、プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（ｐｒｏ−ＡＮＰ）及び少なくとも５アミノ酸長を有するそのフラグメント、ＳＴ−２、ＧＤＦ１５、ガレクチン−３及びコペプチンを含む群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記被験者は女性であり、付加的に、前記女性被験者の体液中の１つのさらなるバイオマーカーが決定され、前記心血管系リスク又は前記総死亡リスクと関連付けられ、前記付加的バイオマーカーがプロニューロテンシン（ＰＮＴ）及び少なくとも５アミノ酸長を有するそのフラグメントである、請求項１〜４及び請求項６〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記被験者は疾病を有する、又はアテローム性動脈硬化、高血圧、心不全、心筋梗塞を含む群から選択される事象を有していた、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記成長ホルモン（ｈＧＨ）及び／又はそのアイソフォームの空腹時レベルが、免疫アッセイで測定される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記免疫アッセイが、１０^-8Ｍ以下の結合親和性を有する、少なくとも１つの抗体、好ましくは２つの抗体を含む、請求項２０に記載の方法。
22. ｈＧＨ及びそのアイソフォームに対する結合親和性が１０^-8Ｍ以下である、少なくとも１つの単一特異的バインダー、好ましくは２つの単一特異的バインダーを含む超高感度ｈＧＨアッセイであって、ここで、前記バインダー（単数又は複数）は、分泌型ｈＧＨアイソマーの１つ若しくは２以上に対して特異的であり、又はアイソマー１、アイソマー２、アイソマー３及びアイソマー４（配列１〜４）を含む群から選択されるｈＧＨの全ての分泌型アイソマーに対して特異的であり、かつ、結合し、超高感度アッセイが、１００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは５０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは３０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは５ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２ｐｇ／ｍＬ未満の分析的アッセイ感度を有し、又は４００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１２０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは８０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは４０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ未満、最も好ましくは８．５ｐｇ／ｍＬ未満の機能的アッセイ感度を有する超高感度ｈＧＨアッセイ。
23. 前記単一特異的バインダーがモノクローナル抗体である、請求項２２に記載の超高感度ｈＧＨアッセイ。
24. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法における、請求項２２又は２３に記載の超高感度ｈＧＨアッセイの使用。

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