JP2016501850A - ***(fmd)に対する合成ペプチドベースの緊急ワクチン - Google Patents
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Abstract
合成FMDペプチド免疫原及びそれを含む組成物を開示する。合成FMDペプチド免疫原を用いて動物のFMD感染を検出し、処置し、予防する方法も開示する。具体的な態様として、***に対するペプチドベースの緊急ワクチン及びその製剤を記述する。種々のワクチン製剤は、FMDV VP1タンパク質由来のペプチドの混合物を含み、各ペプチドは、人工的Thエピトープと結合するB細胞FMDV中和/受容体結合エピトープ配列を含み、各ペプチドの免疫原性を高める。ウイルス性免疫原を含む、開示するワクチン製剤は、任意に、FMDVタンパク質、及びそのホモログ並びに機能的な類似体由来のFMDV内因性Thエピトープを表すペプチドの混合物で、任意に補充されてもよい。そのようなウイルス性ペプチド組成物を、ワクチン製剤として、許容可能なデリバリシステム内で調製し、FMDV負荷による感染から、単回投与のみでブタ及びウシの保護をもたらすことができる。
Description
本開示は、***(FMD)の制御のための***ウイルス(FMDV)に対する合成ペプチドベースの緊急ワクチン及びその製剤に関する。
***(FMD)は、最も伝染性の強い、動物の疾病である。病原体である***ウイルス(FMDV)は、ピコルナウイルス科のアフトウイルスであり、4種のカプシドタンパク質(VP1〜VP4)及び非構造ポリペプチド(2A〜2Cおよび3A〜3D)をコードするプラスセンスRNAゲノムを有する(Carrillo,C.et al,2005による概説)。
FMDVは迅速に複製し、感染動物および接触感染性(in-contact susceptible)動物、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、およびヤギのような偶蹄類の間で空気を介して広がり得る(空気感染性)。FMDは、国際獣疫事務局(Office International des Epizooties:OIE)によるリストAの動物感染症であり、動物および動物製品の貿易で最も重要な制約として認識されている。現在、FMDは、感染及び曝露した動物を隔離および破棄することによって、及び多くの国では、化学的に不活化されたウイルス組成物を用いたワクチンを接種することによって、制御されている。FMDが存在することにより経済的な悪影響をもたらすため、この疾病が発生していない国では、この状態をワクチン接種なしで維持するために幾つかの手段を講じている。
FMDVの異なる7種の血清型が報告されており、それぞれの血清型はさらに複数の亜型に分類される。これらの血清型には、A、O、C、Asia、ならびに南アフリカ型SAT−1、2および3があり、A、OおよびAsiaが最も一般的である。ウイルスの遺伝的複雑性および遺伝的変異性に加え、FMDVは高率で無秩序に変異することができる。
FMDVのワクチンを処方する上で著しく困難なこととして、ウイルスの抗原性が非常に多様であり、血清型の間で交叉反応がないことが挙げられる。即ち、ある1種の血清型のウイルスに対するワクチンを接種したか、又はこのウイルス感染から回復した動物は、残り6種の血清型のウイルスに感染する可能性がある。また、血清型内での抗原変異の程度は、ある1種の亜型に対して有効なワクチンが、同じ血清型内での他の亜型を防御し得ないほどである。
現在のFMDワクチンは、各々関連性のある血清型または亜型それぞれの参照株を含む不活化ウイルスの混合物を含み、該血清型又は亜型は局所循環に存在するウイルス株をモニターすることにより測定される。新興FMD変異型の大流行を阻止するために、野生単離株(field isolates)を定期的にモニターし、現在産生されているワクチンと比較する必要がある。このように、ワクチンが最新かつ有効であることを保証するために、不活化FMDウイルスワクチンの産生には以下の事項が要求される。(1)ワクチンに含まれる幾つかのウイルス株を増殖させ、かつ不活化すること、(2)各不活化株の効力および有効性をモニターすること、および(3)ワクチン製品を定期的に再処方し、新興株が含まれるようにし、新しい変異型の出現によって保護効率が失われることを阻止すること。
FMDV血清型同士における著しい抗原変異を鑑みると、効果的な不活化ウイルスワクチンを産生かつ維持することは厄介で、複雑なことである。不活化FMDVワクチンに関する既知の幾つかの問題及び不都合として、バイオハザードリスク及びバイオセキュリティーリスク、製品の不安定性及びバラツキ、並びに処置される動物における意図されない有害な副作用が挙げられる。
例えば、不活化ウイルスワクチンの製造によってバイオハザードリスク/バイオセキュリティーリスクがもたらされることから、ウイルスは、周辺環境の汚染を阻止するための高度な封じ込め施設内で産生しなければならない。加えて、不活化ウイルス製品が完全に無害であるとは保証できない。事実、欧州における最近の幾つかのFMDVの事例は、完全に不活化されていないウイルスにまで突き詰められた。これらの潜在的なバイオハザードリスク/バイオセキュリティーリスクにより、正規のワクチン供給業者の数は少数に限定されている。このような制限は、ある地域での大流行に対する効果的かつ緊急な対応の妨げとなり得る。
現在のFMDワクチンは、製品の不安定性と共にロット間のバラツキにも、悩まされている。上述したように、FMDVの現在の株と新興株の両方を含むように、ワクチンをモニターし、定期的に再処方しなければならない。また、世界の各地域は、FMDVの異なる現在の株/新興株から、ある時間で、保護されることを要求するであろう。このように、不活化ウイルスワクチンの複雑かつ定義されていない組成物が世界中で産生されている。不活化ウイルスワクチンのこれらの複雑な混合物を、一定の間隔をおいて継続的に検査し、免疫効力(immunopotency)を確実化しなければならない。
上記の問題に加え、現在のFMDVワクチンは、処置される動物に意図されない有害な副作用を引き起こすことが知られている。例えば、現在のワクチンによって処置した動物における、アレルギー反応、アナフィラキシーショックおよび自然死についての報告がなされている。
現存する不活化ウイルスライセート(lysate)ベースの市販ワクチンに不都合な点があったため、安全で、より良く定義されたサブユニット製品を作り出すための研究が奨励された(Brown,F.1992)。しかしながら、このようなサブユニット製品が不活化ウイルスの代替として許容されるためには、不活化ウイルスワクチンと同等の免疫原性を有し、抗原変異体に対する広い防御スペクトルを提供しなければならない。最も重要なこととして、サブユニット製品がFMD緊急ワクチンに適するためには、ワクチン単回投与後に、負荷試験に対するOIEの指針を満たすことが挙げられる。
現存する市販のウイルスライセートベースのFMDワクチンにみられる幾つかの問題点を克服するために、本発明者とその研究チームは、過去15年間、合成ペプチドベースのFMDVワクチンの開発において大きな進歩を遂げ、FMDVを負荷したブタを保護している。特に本発明者は、最適化したVP1ループB細胞エピトープペプチドを含む製剤を用いて、FMDVに対する中和抗体を広範囲に誘発可能な、効果的なFMDVワクチンの開発に成功した。このVP1ループB細胞エピトープペプチドの免疫原性は、該ペプチドを人工のヘルパーTエピトープへ共有結合させることによってさらに増強可能である(Wang, CY and Shen, M, 2000;Wang, CY et al, 2001;Wang, CY, et al, 2002)。このワクチンは、製剤を複数回投与した後に、FMDV負荷からブタを効果的に保護することが示された(Wang, CY, et al. 2002)。VP1ループB細胞エピトープペプチド製剤は、古典的なFMDVウイルス株から動物を保護する上で重要なワクチンであることが証明されている。
製剤がOIEプロトコルに従った「緊急」FMDワクチンに適するためには、単回投与のみで、FMD血清型の抗原性を広くカバーする防御免疫を迅速に誘導しなければならない。VP1ループB細胞エピトープペプチド製剤の複数回投与によって古典的FMDVウイルス株からは効果的に保護されるが、該製剤の緊急時の単回投与では、ブタをFMDV負荷から保護することはできなかった。加えて、VP1ループB細胞エピトープペプチド製剤が、1回または2回の投与後に、ウシをFMDV負荷から保護することは示されていない(Rodriguez, LL. et al. 2003)。
FMDVに対する緊急的および一般的な防御のための、安全で有効な、ペプチドベースのFMDワクチンおよびその製剤が開発できるように、パブリックドメイン内の文献を広範囲に探索し、FMD緊急ワクチンに必要とされる防御免疫反応との関連を同定し、検証することが緊急に必要とされている。
FMDに対して現在利用可能なワクチンの不都合および制限に鑑みると、単回投与のみでブタおよびウシをFMDVから保護できる緊急ワクチン製剤がなお緊急に必要とされている。
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Wang, CY, et al., “Synthetic Peptide-based Vaccine and Diagnostic System for Effective Control of FMD.” Biologicals, 29:221-228. (2001)。
Wang, CY, et al., “Effective Synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine.” Vaccine, 20:2603-2610. (2002)。
発明の簡単な説明
本開示は、動物における***(FMD)の検出、処置、及び/又は予防に有用な合成ペプチドを対象とする。本開示の合成ペプチドは、動物におけるFMD感染を高感度かつ特異的に検出するために用いることのできるペプチド抗原を包含する。該合成ペプチドは、B細胞(B)およびヘルパーT細胞(Th)エピトープの双方を有するペプチド免疫原も含み、それらは共に作用してFMD感染に対する防御免疫反応の生成を刺激する。ある態様において、該合成ペプチドは、ペプチド抗原およびペプチド免疫原の双方である。幾つかの態様において、該合成ペプチドを用いて、動物におけるFMDウイルス(FMDV)に対する抗体の存在を検出する。他の態様において、該合成ペプチドを用いて、試験によってFMDV陽性であると判定された動物及び/又は試験によってFMDV陽性であると判定された動物に曝露された動物を処置する。また、他の態様において、該合成ペプチドを用いて、動物のFMD感染を予防する。
本開示は、動物における***(FMD)の検出、処置、及び/又は予防に有用な合成ペプチドを対象とする。本開示の合成ペプチドは、動物におけるFMD感染を高感度かつ特異的に検出するために用いることのできるペプチド抗原を包含する。該合成ペプチドは、B細胞(B)およびヘルパーT細胞(Th)エピトープの双方を有するペプチド免疫原も含み、それらは共に作用してFMD感染に対する防御免疫反応の生成を刺激する。ある態様において、該合成ペプチドは、ペプチド抗原およびペプチド免疫原の双方である。幾つかの態様において、該合成ペプチドを用いて、動物におけるFMDウイルス(FMDV)に対する抗体の存在を検出する。他の態様において、該合成ペプチドを用いて、試験によってFMDV陽性であると判定された動物及び/又は試験によってFMDV陽性であると判定された動物に曝露された動物を処置する。また、他の態様において、該合成ペプチドを用いて、動物のFMD感染を予防する。
本開示は、合成ペプチドを含む組成物も対象とする。このような組成物は、動物におけるFMDの検出、処置、及び/又は予防のために用いることができる。ある態様において、該合成ペプチドを含む組成物は、FMDVに対する抗体をサンプル中に検出するために用いられる。他の態様において、該合成ペプチドを含む組成物は、動物のFMD感染を処置及び/又は予防するための医薬組成物である。ある特定の態様において、該医薬組成物を用いて、動物におけるFMDVに対する免疫応答を誘発する。ある具体的な態様において、該医薬組成物は、ウイルスに曝露した動物のFMD感染を予防可能なワクチン組成物である。
本開示はまた、動物におけるFMD感染を検出し、処置し、かつ/または予防するための方法も含む。開示する方法は、本明細書に開示される合成ペプチドおよび合成ペプチドを含む組成物を利用する。
ある態様において、組成物の単回投与後に、該組成物は、FMD感染に対する十分かつ適切な防御を有する動物を提供するため、本開示はOIEの指針に従った緊急ワクチンに適する、ペプチドベースの医薬組成物を対象とする。これらの態様において、緊急ワクチンとして使用することができる該医薬組成物は、内在性T細胞エピトープに由来する、天然FMDタンパク質上および病原体タンパク質上の抗原部位を模倣したペプチド免疫原を含む。ここに記載する製剤は、標的となるFMDタンパク質に対する機能性抗体を効果的に誘発して、FMD負荷からの防御を有する動物を提供する。
様々な態様において、合成ペプチド免疫原は、FMDVに対する中和抗体を誘発可能なB細胞抗原部位を有するVP1ループペプチド(配列番号1および2)、そのホモログ(例えば配列番号3〜23、96〜99)およびそれらの組合せを含むことができる。
開示するVP1ループペプチドは、ヘルパーTエピトープ(配列番号24)も含むことができ、それは、ペプチド抗原のアミノ末端またはカルボキシル末端に共有結合してB細胞抗原ペプチド(例えば配列番号25〜33、100〜102)の免疫原性を増強する。ある変形として、ペプチド免疫原は、ヘルパーTエピトープを示すペプチドの混合物を追加され、宿主細胞介在性の免疫を提供する。このようなペプチドは、FMDV VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3Bおよび3Dタンパク質(例えば配列番号34〜63)に由来するヘルパーTエピトープ、そのホモログおよびその機能性類似体、ならびにライブラリーペプチド(例えば配列番号64〜87)およびUBITh(登録商標)増強カセット内に設計されたFMDV Thエピトープペプチド(例えば配列番号88〜95)に由来するコンビナトリアル配列を包含する。
本開示は、動物におけるFMDVに対する抗体および細胞介在性免疫応答の両方を誘発する方法も提供する。このような方法により、FMDV抗体フリーである動物に、FMDVウイルスを負荷した場合に、FMDの交差防御が提供される。具体的な態様として、開示する方法は、FMDV BエピトープクラスターペプチドとヘルパーTエピトープクラスターペプチドとの組み合わせを含む医薬組成物を動物に投与する工程を含む。
本開示は、FMD免疫原性ペプチド、これを含有する緊急ワクチン製剤およびワクチン製剤の単回投与のみによって動物をFMDV負荷から緊急に保護することが可能なデリバリ系の、低費用での製造および品質管理のための方法も提供する。
発明の詳細な説明
本開示は、動物における***(FMD)の検出、治療、及び/又は予防に有用な合成ペプチドを対象とする。本開示の該合成ペプチドはペプチド抗原を含み、該ペプチド抗原を用いて、動物におけるFMDウイルスに対する抗体を高感度かつ特異的に検出することができる。該合成ペプチドは、B細胞(B)およびヘルパーT細胞(Th)エピトープの両方を有するペプチド免疫原も含み、これらは共に作用してFMD感染に対する防御免疫反応を刺激する。ある態様において、該合成ペプチドはペプチド抗原およびペプチド免疫原の両方である。幾つかの態様において、該合成ペプチドを用いて、動物におけるFMDウイルス(FMDV)に対する抗体の存在を検出する。別の態様において、該合成ペプチドを用いて、試験によってFMDVの存在が陽性であると判定された動物を処置するか、及び/又は試験によってFMDV陽性であると判定された動物に曝露された動物を処置する。さらに別の態様において、該合成ペプチドを用いて、動物におけるFMD感染を予防する。
本開示は、動物における***(FMD)の検出、治療、及び/又は予防に有用な合成ペプチドを対象とする。本開示の該合成ペプチドはペプチド抗原を含み、該ペプチド抗原を用いて、動物におけるFMDウイルスに対する抗体を高感度かつ特異的に検出することができる。該合成ペプチドは、B細胞(B)およびヘルパーT細胞(Th)エピトープの両方を有するペプチド免疫原も含み、これらは共に作用してFMD感染に対する防御免疫反応を刺激する。ある態様において、該合成ペプチドはペプチド抗原およびペプチド免疫原の両方である。幾つかの態様において、該合成ペプチドを用いて、動物におけるFMDウイルス(FMDV)に対する抗体の存在を検出する。別の態様において、該合成ペプチドを用いて、試験によってFMDVの存在が陽性であると判定された動物を処置するか、及び/又は試験によってFMDV陽性であると判定された動物に曝露された動物を処置する。さらに別の態様において、該合成ペプチドを用いて、動物におけるFMD感染を予防する。
本開示は、合成ペプチドを含有する組成物も対象とする。このような組成物を、動物におけるFMDの検出、処置、及び/又は予防のために用いることができる。ある態様において、該合成ペプチドを含有する組成物は、サンプル中のFMDVの存在を検出するために用いられる。別の態様において、該合成ペプチドを含有する組成物は、動物におけるFMD感染を処置するか及び/又は予防するための医薬組成物である。ある特定の態様において、該医薬組成物を用いて、動物におけるFMDVに対する免疫応答を誘発する。ある具体的な態様において、該医薬組成物はワクチン組成物であり、該組成物はウイルスに曝露された動物におけるFMD感染を予防することができる。
本開示はまた、動物におけるFMD感染を検出するか、処置するか、及び/又は予防する方法も含む。開示する方法は、合成ペプチド及び本明細書に開示される合成ペプチドを含む組成物を利用する。
a.B細胞エピトープ−FMDV合成ペプチド免疫原
合成ペプチド免疫原のアミノ酸配列は、複数の相同的なFMDV血清型O株由来のVP1構造タンパク質におけるB細胞抗原部位を整列させ評価することによって得た。表2に示すアラインメントに基づき、完全長FMDV VP1構造タンパク質のアミノ酸残基134〜158に相当する25アミノ酸を抗原性の共通配列として得た(配列番号1)。(完全長VP1配列に対するアミノ酸番号の例はGenbank受託番号NP_740460に見出すことができる)。位置134及び158に対応するアミノ酸がシステイン残基によって置換されていることから、ペプチドは内部にジスルフィドループ構造を形成可能である。41アミノ酸を含む比較的長いFMDV抗原共通ペプチド(配列番号2)も、このアラインメントから得た。第2の共通配列は配列番号1を包含し、N末端及びC末端両方に隣接する配列もさらに含む。第2の共通配列は完全長FMDV VP1構造タンパク質のアミノ酸残基129ないし168に相当し、位置134および158のアミノ酸はシステイン残基によって置換されている。二つの共通配列は、表1に示すように同定される。
合成ペプチド免疫原のアミノ酸配列は、複数の相同的なFMDV血清型O株由来のVP1構造タンパク質におけるB細胞抗原部位を整列させ評価することによって得た。表2に示すアラインメントに基づき、完全長FMDV VP1構造タンパク質のアミノ酸残基134〜158に相当する25アミノ酸を抗原性の共通配列として得た(配列番号1)。(完全長VP1配列に対するアミノ酸番号の例はGenbank受託番号NP_740460に見出すことができる)。位置134及び158に対応するアミノ酸がシステイン残基によって置換されていることから、ペプチドは内部にジスルフィドループ構造を形成可能である。41アミノ酸を含む比較的長いFMDV抗原共通ペプチド(配列番号2)も、このアラインメントから得た。第2の共通配列は配列番号1を包含し、N末端及びC末端両方に隣接する配列もさらに含む。第2の共通配列は完全長FMDV VP1構造タンパク質のアミノ酸残基129ないし168に相当し、位置134および158のアミノ酸はシステイン残基によって置換されている。二つの共通配列は、表1に示すように同定される。
同様のホモログアラインメントによって得た血清型O、Asia 1およびAに由来するVP1 B細胞エピトープの共通配列を、表2の配列番号2、12および16に示す。各共通配列内の様々な位置のアミノ酸は、各血清型株におけるそれらの位置で最も高頻度にみられるアミノ酸に基づいて指定した。
合成ペプチド免疫原、配列番号1および2の効果的かつ許容可能な変異型として、FMDVの変異体および変異型株由来の対応する配列およびコンフォメーション要素を有する免疫機能性ホモログが挙げられる。相同的なFMDV抗原ペプチドは、最初の変異型であるFMDV OTaiwan株のVP1構造タンパク質の位置129〜168およびFMDV血清型Oの複数の株に由来する共通配列に密接に関連するアミノ酸残基を有する(Mason,PW et al,2003)。このようなホモログは、クラスタルW(Clustal W)(独国の欧州分子生物学研究所(European Molecular Biology Laboratory)のJulie D.Thompson及びToby Gibson、並びに英国ケンブリッジの欧州バイオインフォマティクス研究所(European Bioinformatics Institute)のDesmond Higginsによって開発されたアルゴリズム)のような配列アラインメントプログラムを用いて容易に同定できる。表2は、FMDV OConsensusの配列(2570a、配列番号2)およびOCampos、OTaiwan、OMyanmar、OOzk、OLanzou、Asia 1Yunnan、Asia 1Jiansu、A24、AGansu、AXinjiang、CIndaial、C3Belgium、C3Argentinaなど(配列番号3〜23)のような複数の血清型および多様な株から得たFMDV VP1構造タンパク質における22の抗原配列のクラスタルWアラインメントを示す。
本発明に含まれる、VP1の追加のホモログとして、すべてのFMDV株由来のVP1配列のループ構造に常に見出される、特徴的な“RGD”(Arg-Gly-Asp)細胞受容体結合配列を含むペプチドおよびタンパク質が挙げられる。このRGD配列は、VP1タンパク質のアミノ酸の位置145〜147に相当する。
表2に示すように、“RGD”配列の下流(C末端への方向)に見出されるアミノ酸の数は、異なるVP1配列の間で同じである。しかしながら、RGD配列よりも上流(N末端への方向)のアミノ酸の数は特定の血清型(例えばO、Asia 1、A、又はC)によって異なる。各血清型において、N末端配列は、その特定の血清型の共通配列に対して少なくとも75%同一である(例えば血清型Asia 1に関して配列番号12と比較したときの配列番号13〜15、血清型Aに関して配列番号16と比較したときの配列番号17〜19)。ある態様において、変異型OMyanmar/7/02株のホモログ(配列番号7)は、配列番号2に対して85%を超えて同一である(網掛けによって示した共通配列内の残基とは異なる残基を有する)。他の態様において、変異型株OOzk/93のホモログ(配列番号8)は、配列番号2に対しておおよそ90%同一である(網掛けによって示した共通配列内の残基とは異なる残基を有する)。
表2に示しかつ他所にも記載する相同的なVP1ペプチドは、ある組成物中で適切な比で組み合わせることができ、動物に投与して特定のFMDV株を標的とする中和抗体を効果的に誘発することができる。したがって、相同的なVP1ペプチドを含む医薬組成物はFMD感染を予防するために効果的なワクチンである。例えば油中水(w/o)乳剤(例えばISA50V2)または水中油中水(w/o/w)乳剤(例えばエマルシゲン(Emulsigen))として調製した、単数または複数の相同的なVP1ペプチドを含む製剤はFMD感染の予防に有効である。
複数のVP1配列ペプチドを含む組成物の効果を利用することについて考察した、様々な態様および実施例を以下に記載する。例えば実施例6、7、9及び10は、OConsensus、Oswine/cattle/O/Mya/7/02(OMyanmarと略称する)及びOOzk/93(OOzkと略称する)の配列に対応する、三つのFMDV血清型O VP1ペプチドの組み合わせを含む、多価FMDVブタ及び/又はウシワクチン組成物について記載する。このペプチド混合物を含む組成物は、複数の異なるO株による感染に対抗する、強力な三価のブタワクチンを産生することができる。同様に、OConsensus(2570a)、Asia 1JiangSu/China/2005(Asia 1JiangSuと略称する)およびAGansu/China/60Y(AGansuと略称する)を有するVP1ペプチドの組み合わせを用いた複数の血清型のワクチンを混合して三価の血清型のウシワクチンを形成し、中国における複数のFMDV血清型由来の株による感染に対抗することができる。なお、南アメリカに適応させた効果的な複数の血清型のウシワクチンは、OCampos/Brazii/58Y(OCamposと略称する)、A24 Cruzeiro California(A24と略称する)、及びCIndaial/Brazii/84Y(CIndaialと略称する)由来のVP1配列ペプチドの組み合わせを含有しており、これは南アメリカで最も流行している複数の血清型由来の株によるFMD感染に対抗する上で効果的である。
本発明の合成ペプチドに含まれるように選択したFMDV VP1タンパク質におけるB細胞エピトープの位置を、FMDVのその他の領域およびタンパク質に対して相対的に、図1に示す。タンパク質配列は、FMDV OTaiwan99ゲノム/コードされるアミノ酸配列(GenBank受託番号 AJ539137)に基づく。
合成ペプチド免疫原の免疫学的な機能性類似体もまた、動物における免疫応答を誘発するのに効果的であり、本発明の一部として含まれる。免疫学的な機能性類似体として、配列番号1、2、12、及び16の共通配列の変異型及び/又は配列番号3〜11、13〜15、及び17〜23のホモログが挙げられ、元のペプチドと実質的に同じ抗原性及び免疫原性を保持する。例えば、機能性類似体である変異型は、アミノ酸の位置における保存された置換、全体的な電荷の変化、別の部分への共有結合、またはアミノ酸の付加、挿入、もしくは欠失、及び/又はそれらのいずれかの組み合わせを有することができる。
保存された置換とは、一つのアミノ酸残基が、同様の化学的特性を有する別のアミノ酸残基によって置換される場合を指す。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、正電荷(塩基性)アミノ酸として、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられ、負電荷(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
ある態様において、ある特定のペプチドの免疫学的な機能性類似体は、元のペプチドと同じアミノ酸配列を含み、かつ該ペプチドのアミノ末端に付加された三つのリジン(Lys-Lys-Lys)をさらに含む。この態様において、元のペプチド配列に三つのリジンが含まれることによって元のペプチドの全体的な電荷が変化するが、元のペプチドの機能は変化しない。
ある特定の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一である。他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である。さらに他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも85%同一である。さらに他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一である。
b.FMDV内在性ヘルパーT(Th)エピトープ
合成免疫原ペプチドを含む組成物は、FMDV内在性Thエピトープペプチドを含むことができる。医薬品/ワクチン製剤中のThエピトープの存在は、FMDV防御に決定的に関連するものである、抗原特異的なT細胞の活性化を開始することによって、処置した動物における免疫応答を刺激する。加えて、FMDVタンパク質に存在する、注意深く選択された免疫優性のThエピトープを含む製剤は、広範な細胞介在性免疫をもたらすことができ、これによって、、ウシのような、多様な遺伝的構造を有する動物を処置し、保護するのに該製剤が効果的となる。
合成免疫原ペプチドを含む組成物は、FMDV内在性Thエピトープペプチドを含むことができる。医薬品/ワクチン製剤中のThエピトープの存在は、FMDV防御に決定的に関連するものである、抗原特異的なT細胞の活性化を開始することによって、処置した動物における免疫応答を刺激する。加えて、FMDVタンパク質に存在する、注意深く選択された免疫優性のThエピトープを含む製剤は、広範な細胞介在性免疫をもたらすことができ、これによって、、ウシのような、多様な遺伝的構造を有する動物を処置し、保護するのに該製剤が効果的となる。
FMDVタンパク質由来のヘルパーTエピトープと組み合わせたB細胞エピトープを有する免疫原ペプチドを含む製剤を単回投与することによって免疫化した動物は、自然感染またはFMDVの負荷試験のいずれかによってFMDV曝露後の、リンパ球増殖応答を引き起こすことができる。増殖応答によってIFN−γ産生を含むサイトカイン産生がもたらされ、動物における様々な細胞壊死性のウイルス感染に対する細胞介在性免疫応答が増強される。
配列番号34〜63のThエピトープペプチドを、インビトロT細胞増殖アッセイを用い、且つThエピトープを含むFMD製剤/ワクチンによって免疫化した宿主動物におけるサイトカインIFN−γのインビボ(in vivo)産生およびインビトロ産生を評価することによって、同定した。また、(a)FMDV BエピトープクラスターVP1ペプチドおよび(b)FMDV内在性Thペプチドの大規模なプールによる組み合わせを含む製剤を分析して、ウシのような、多様な遺伝的背景を有する様々な宿主動物において必要とされる細胞免疫を効果的且つ恒常的にもたらすことができる、適切な医薬組成物を決定した。免疫化した/ワクチン投与された宿主におけるインビトロIFN−γ産生をモニターすることに加え、中和抗体力価も評価し、これらの宿主が該製剤の単回投与のみでFMDVに対する中和抗体が増加し得るか否かを判定した。
様々な態様において、FMDV内在性Thエピトープペプチドは、FMDVタンパク質であるVP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、3A、3B及び3Dの抗原部分に由来する。表4は、本発明の製剤に用いた際に特に有用であることが見出された、具体的なFMDV内在性Thペプチド(配列番号34〜63)を同定する。具体的には、表4に挙げるFMDV内在性Thエピトープは、(a)FMDVウイルスライセート製剤/ワクチンおよび(b)候補となるFMDV Thペプチドを含むペプチド製剤によって免疫化した宿主から得たブタのT細胞及びウシのT細胞によって認識される。FMDV VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B、及び3Dタンパク質(表4に挙げる)上のThエピトープの分布および位置を、FMDVのその他の領域およびタンパク質に対して相対的に、図1に示す。タンパク質配列は、FMDV OTaiwan99ゲノム/コードされるアミノ酸配列(GenBank受託番号 AJ539137)に基づく。
表4で同定されたThエピトープのホモログもまた効果的であり、本発明に含まれる。例えば、配列番号64〜78は、FMDV OTAW/2/99(Genbank受託番号 AJ539137)に由来する相同Thエピトープ配列である。表5は、FMDV OTaiwan99由来のThエピトープを、FMDV OTAW/2/99由来の相同Thエピトープと比較した配列アラインメントを提供する。具体的には、表5は、FMDV 3Dタンパク質(配列番号61対64、62対65、63対66、60対71および72);FMDV 2Bタンパク質(配列番号48対67および68)、FMDV 3Aタンパク質(配列番号53対69および70)、FMDV VP4タンパク質(配列番号34対73および74)、FMDV VP2タンパク質(配列番号36対75および76)、およびFMDV VP3タンパク質(配列番号37対77および78)に由来する相同Thエピトープを整列する。
FMDV内在性Thエピトープペプチドの免疫学的な機能性類似体もまた効果的であり、本発明の一部として含まれる。免疫学的な機能性類似体として、配列番号34〜63の変異型及び/又は配列番号64〜78のホモログが挙げられ、これらは元のペプチドと実質的に同じ免疫原性を保持する。例えば機能性類似体である変異型は、アミノ酸の位置における保存された置換、全体的な電荷の変化、別の部分への共有結合、又はアミノ酸の付加、挿入、もしくは欠失及び/又はそれらのいずれかの組み合わせを有することができる。
保存された置換とは、一つのアミノ酸残基が、同様の化学的特性を有する別のアミノ酸残基によって置換される場合を指す。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、正電荷(塩基性)アミノ酸として、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ、負電荷(酸性)アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
ある特定の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも50%同一である。他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも80%同一である。さらに他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも85%同一である。さらに他の態様において、機能性類似体は、元のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一である。
ある態様において、ある特定のペプチドの免疫学的な機能性類似体は、元のペプチドと同じアミノ酸配列を含み、かつペプチドのアミノ末端に付加された三つのリジン(Lys-Lys-Lys)をさらに含む。この態様において、元のペプチド配列に三つのリジンが含まれることによって元のペプチドの全体的な電荷が変化するが、元のペプチドの機能は変化しない。
表6は、Thエピトープペプチドに対する機能性類似体の別の変異型を同定する。特に、配列番号39及び40は、それらがC末端の四つのアミノ酸を欠失しているか(配列番号39)または含んでいる(配列番号40)ことのみによって異なるため、互いに機能性類似体である。これら二つの類似配列の違いは、これらの配列内に含まれるThエピトープの機能に影響することはないであろう。
その他の変異型において、FMDV内在性Thエピトープペプチドはコンビナトリアル配列として存在することができ、該コンビナトリアル配列は、その特定のペプチドのホモログにおける可変性の残基に基いた、ペプチドフレーム構造内の特定の位置のアミノ酸残基の混合物を含む。コンビナトリアルペプチドの集合体は、合成過程の間に、ある具体的な位置において、ある特定のアミノ酸に代えて、指定した保護アミノ酸の混合物を加えることにより、一過程によって合成可能である。このようなコンビナトリアルFMDV内在性Thペプチド集合体により、Thエピトープは、多様な遺伝的背景を有する動物を広くカバーすることが可能となる。FMDV内在性Thペプチドの代表的なコンビナトリアル配列として、配列番号79〜87が挙げられ、表7に示す。これらのコンビナトリアル配列は、代表的なFMDV内在性Thエピトープに対する配列番号34〜63(表4に示す)に由来する。
様々な態様において、共に一つのペプチド内で、複数のFMDV内在性Thエピトープ配列を連結することによって、T細胞免疫原性を増強することができる。共に連結されたThエピトープ配列は、同じThエピトープ配列(反復したThエピトープ配列を有するペプチドを作製するため)、異なったThエピトープ配列(様々なThエピトープ配列を有するペプチドを作製するため)、またはそれらの組み合わせとすることができる。加えて、Thエピトープ配列を、スペーサと共に、またはスペーサなしで連結することができる。ある態様において、スペーサを用いて、複数のFMDV Thエピトープを適切な位置における単一配列として含むペプチドの、細胞内での切断を容易にする。幾つかの態様において、スペーサはアミノ酸を含む。好ましい態様において、スペーサはリジンである。
本発明のThエピトープペプチドは、標的とする動物種の遺伝的多様な集団に由来する動物に対して広範な反応性および免疫原性を提供する。本発明の製剤に特に有用であることが見出されたペプチドとして、配列番号34〜78のような、複数のFMDV Thエピトープのクラスターを含むペプチド、及び配列番号79〜87のような、Thエピトープ配列のコンビナトリアル配列を含むペプチドが挙げられる。ある態様において、FMDV内在性Thエピトープクラスターペプチドは、表7に示すように(配列番号88〜95)、Thエピトープを人工Th(UBITh(登録商標))(配列番号24)に連結することによって、T細胞免疫原性をさらに増強することができる。
c.スペーサ
合成FMDVペプチド免疫原は、そのホモログおよび類似体を含む。該合成FMDVペプチド免疫原は、スペーサと共にまたはスペーサなしで、Thエピトープを含むことが知られている配列を含むペプチドと共有結合することができる。連結したペプチドにより、Thエピトープペプチドに共有結合していない免疫原と同等以上に増強された免疫原性を提供することができる。
合成FMDVペプチド免疫原は、そのホモログおよび類似体を含む。該合成FMDVペプチド免疫原は、スペーサと共にまたはスペーサなしで、Thエピトープを含むことが知られている配列を含むペプチドと共有結合することができる。連結したペプチドにより、Thエピトープペプチドに共有結合していない免疫原と同等以上に増強された免疫原性を提供することができる。
幾つかの態様において、人工Thエピトープを含むペプチドは、合成FMDVペプチド免疫原のN末端に共有結合する。幾つかの変形において、スペーサは、二つの配列間に存在する。好ましくは、スペーサは、単一アミノ酸のεNLysである。ある具体的な態様において、配列番号24の人工Thエピトープペプチドは、配列番号2の合成FMDVペプチド免疫原のN末端に、εNLysスペーサ(配列番号25として表3にも示す)を介して共有結合する。合成FMDペプチド免疫原のアミノ末端に共有結合するThエピトープ配列を含む、さらなる例示的なペプチドを表3に示す。特に、配列番号24のThエピトープペプチドは、様々な合成FMDVペプチド免疫原のアミノ末端にεNLysスペーサを介して連結する(配列番号25〜33)。
d.組成物
本開示は、合成ペプチドを含有する組成物もまた対象とする。該組成物を、動物におけるFMDを検出、処置、及び/又は予防に用いることができる。ある態様において、FMDV B細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む組成物は、サンプル中のFMDVに対する抗体の存在を検出するために用いられる。別の態様において、FMDV B細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む組成物は、動物におけるFMD感染を処置するか及び/又は予防するための医薬組成物である。ある態様において、FMDV B細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む医薬組成物を用いて、動物におけるFMDVに対する免疫応答を誘発する。FMDV B細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む医薬組成物は、FMDVに対するワクチンとして使用することができる。
本開示は、合成ペプチドを含有する組成物もまた対象とする。該組成物を、動物におけるFMDを検出、処置、及び/又は予防に用いることができる。ある態様において、FMDV B細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む組成物は、サンプル中のFMDVに対する抗体の存在を検出するために用いられる。別の態様において、FMDV B細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む組成物は、動物におけるFMD感染を処置するか及び/又は予防するための医薬組成物である。ある態様において、FMDV B細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む医薬組成物を用いて、動物におけるFMDVに対する免疫応答を誘発する。FMDV B細胞エピトープを有する合成ペプチドを含む医薬組成物は、FMDVに対するワクチンとして使用することができる。
合成FMDVペプチド免疫原を含む医薬組成物は、標的となるFMDタンパク質に対する機能性抗体を効果的に誘発して、FMD負荷からの防御を有する動物を提供する。実際、これらの医薬組成物を単回投与された動物は、FMD感染から十分かつ適切に保護される。このように、動物がFMD感染から完全に保護されるために、複数回の投与および追加投与は必要とされない。したがって、合成FMDVペプチド免疫原を含有する医薬組成物は、OIEの指針に従った緊急ワクチンとして適格である。
本開示の組成物は、1つの又は2以上の合成FMDVペプチド免疫原を含むことができる。例えば、該組成物は、表1に示す共通配列(配列番号1又は2)を有する合成FMDVペプチド免疫原、及び/又は表2に示すそのホモログまたは類似体、及び/又はそれらの組み合わせを含むことができる。また、該組成物に用られるFMDVペプチド免疫原を人工コンビナトリアルヘルパーTエピトープと連結させ、該組成物のB細胞免疫原性を増強させることができる。好ましい態様において、合成FMDVペプチド免疫原は、配列番号24の人工コンビナトリアルヘルパーTエピトープと連結される。様々な血清型由来の代表的なFMDV VP1ペプチド免疫原を表3に同定する。
FMDVペプチド免疫原を含む組成物もまた、1つの又は2以上のFMDV内在性Thエピトープペプチドを含有することができる。例えば、該組成物は、FMDV VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B、及び3Dタンパク質由来のThエピトープペプチドを含むことができる。組成物において特に有用であることが見出されたThエピトープペプチドとして、表4、5、6、及び7(配列番号34〜95)ならびに実施例9および10に記載される、表18、19、25及び26に示すペプチドが挙げられる。ワクチン製剤を含む医薬組成物は、FMDV特異的な抗体反応を誘発し、かつ単回投与のみでブタおよびウシをFMDV感染から保護する、ペプチド抗原特異的なT細胞反応を開始することができる。
また、組成物は、薬剤的に許容可能なデリバリ系内にキャリア及び/又はその他の添加物を含むことができる。したがって、合成FMDVペプチド免疫原を含む組成物は、ワクチン製剤中に通常含まれる、アジュバント、薬剤的に許容可能なキャリア又はその他の成分を用いる医薬品ワクチン製剤として処方することができる。本発明において用いてもよい成分のうち、アジュバントまたは乳化剤として、ミョウバン、フロイント不完全アジュバント、リポシン、サポニン、スクアレン、L121、エマルシゲン、モノホスホリルリピドA(MPL)、QS21、ISA35、ISA206、ISA50V2およびISA720、ならびにその他の効果的なアジュバントおよび乳化剤が挙げられる。ある特定の態様において、デリバリビヒクルおよびアジュバントは、モンタニド(Montanide)(商標)ISA50V2(油中水乳剤とするために植物油とオレイン酸マンニドとから構成される、油性ワクチンアジュバント組成物)、Tween(登録商標)80(ポリソルベート80またはポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエートとしても知られる)、CpGオリゴヌクレオチド、及び/又はこれらのいずれかの組み合わせである。別の態様において、医薬組成物は、アジュバントとしてエマルシゲンまたはエマルシゲンDを用いた水中油中水(すなわちw/o/w)乳剤である(実施例9、表19のグループ27、28、31、及び32に記載される)。ワクチン製剤に通常取り込まれるその他の成分も提供され、単回投与のみでバランスの取れたB細胞およびT細胞免疫応答が増大し、ウイルス負荷から保護されるような投与量の指示も提供される(実施例9および10)。
医薬組成物は、即時放出型または持続放出型製剤として処方することができる。また、該医薬組成物は、免疫原の捕捉および微粒子との共投与を通して、全身性の、または局所粘膜の免疫を誘導するように処方することができる。このようなデリバリ系は、当業者によって容易に決定される。
本開示のペプチドを含む種々のワクチン製剤が、FMDVから有蹄動物を保護するために有効である。例えば、FMDVワクチン製剤として有用な医薬組成物は、合成FMDVペプチド免疫原および獣医学的に許容可能なデリバリビヒクルまたはアジュバントを含み、該合成FMDVペプチド免疫原は、
a)配列番号1〜2、
b)(a)のホモログ、
c)(a)または(b)の、抗原的および免疫学的な機能性類似体、
d)少なくとも1の保存されたアミノ酸置換、アミノ酸付加及び/又はアミノ酸欠失を有する(a)、(b)、または(c);及び
e)(a)〜(d)のいずれかの組み合わせ;
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
a)配列番号1〜2、
b)(a)のホモログ、
c)(a)または(b)の、抗原的および免疫学的な機能性類似体、
d)少なくとも1の保存されたアミノ酸置換、アミノ酸付加及び/又はアミノ酸欠失を有する(a)、(b)、または(c);及び
e)(a)〜(d)のいずれかの組み合わせ;
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
特定の製剤において、該合成FMDペプチド免疫原は、配列番号2、7および8からなる群より選択される。
別の製剤において、該組成物は、スペーサを介して人工コンビナトリアルThペプチドと連結する合成FMDVペプチド免疫原を含み、かつ配列番号25の配列を有する。
その他の製剤は、配列番号34〜63の、30のFMDV Thエピトープペプチドを、同じ重量比でさらに含み、投与あたりの量は約0.1μg〜約1mgである。ある具体的な製剤において、同じ重量比の配列番号34〜63の量は、投与あたり約1μg〜約100μgである。
さらに別の製剤において、該組成物は、配列番号25、27、及び28の合成FMDVペプチド抗原と、配列番号34〜63のFMDV内在性Thエピトープペプチドの同じ重量比によるプールとの混合物を、獣医学的に許容可能なデリバリビヒクルまたはアジュバント中に含み、該ペプチド抗原の量は投与あたり約10μg〜約1mgである。
e.投与
医薬組成物およびワクチン製剤は、皮下、経口、筋肉内、又はその他の非経口もしくは経腸経路を含む、いずれかの好都合な経路によって投与することができる。同様に、該ワクチンは、単回投与又は複数回投与とすることができる。免疫スケジュールは、当業者によって容易に決定される。
医薬組成物およびワクチン製剤は、皮下、経口、筋肉内、又はその他の非経口もしくは経腸経路を含む、いずれかの好都合な経路によって投与することができる。同様に、該ワクチンは、単回投与又は複数回投与とすることができる。免疫スケジュールは、当業者によって容易に決定される。
医薬組成物は、有効量の合成ペプチド免疫原および薬剤的に許容可能なキャリアを含有するように処方される。医薬組成物はまた、一般にkg体重あたり約0.5μg〜約1mgの免疫原を含む、適切な単位剤形として処方される。複数回投与によって送達される場合、該医薬組成物は、単位剤形あたりの適切な量に、都合よく分割されてもよい。投与量は、ワクチンおよび治療の技術分野において周知されているように、被験体の年齢、体重および全般的な健康に依存するであろう。
合成FMDVペプチド免疫原を含む医薬組成物、例えばワクチン製剤は、単回投与であっても効果的な応答をもたらすことができる。これらの医薬組成物の単回投与は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびその他の感受性の野生種を含む、ヘルパーT細胞の多様な集団を有する動物を抗原刺激するために十分である。特に、Thエピトープペプチドと組み合わせる合成FMDVペプチド免疫原を含む医薬組成物は、バランスの取れたB細胞免疫応答(中和抗体)およびT細胞免疫応答(サイトカイン放出など)を誘発して、それに続くウイルスへの曝露から動物を保護することができる。
Thエピトープペプチドと組み合わせる合成FMDVペプチド免疫原を含む製剤を用いた単回投与による免疫化を、OIE、台湾および中華人民共和国の指針に従って、広範に評価した(実施例9及び10においてさらに考察する)。これらの試験によって得られた結果は、これらの製剤がFMD感染に対する免疫付与を行った宿主を保護するために有効であることを、繰り返し、再現性をもって示してきた。したがって、これらの試験により、FMDV製剤の設計およびFMDV製剤を動物用の緊急FMDVワクチンとして使用した際の効能が検証された。
f.製造方法
本開示はまた、FMDV感染に対して免疫応答を誘発して動物を保護するための、合成FMDVペプチド免疫原、Thエピトープペプチド、組成物および医薬製剤/ワクチンの製造方法も対象とする。
本開示はまた、FMDV感染に対して免疫応答を誘発して動物を保護するための、合成FMDVペプチド免疫原、Thエピトープペプチド、組成物および医薬製剤/ワクチンの製造方法も対象とする。
合成FMDVペプチド免疫原を用いることによって、従来の不活化ウイルスワクチンを超えた、多くの重要な利点がもたらされる。例えば、従来の不活化ウイルスワクチンには高価な生物学的封じ込め用の機器が必要とされるが、封じ込め用の機器/プロトコルが機能しなかった場合には、研究室で作業する人々および公衆に深刻なバイオハザードリスクがもたらされる。一方、バイオハザード物質はペプチド抗原の製造に用いられないため、健康および安全のリスクが大幅に減少し、かつ高価な生物学的封じ込め用の機器を用いる必要もない。また、部位特異的な免疫原によって、選択されたエピトープが高いモル濃度で提示されるため、FMDV抗原ペプチドを用いたワクチンの安全性および免疫効力を確実なものにする助けとなる。
また、免疫原として既知のB細胞エピトープおよびThエピトープを有する規定の合成ペプチドをワクチンの免疫原性成分として用いると、FMDVもしくは組換えウイルスに感染した宿主細胞に由来するか、またはFMDV及び/又は組換えタンパク質と共に精製された可能性のある組換えタンパク質の発現系に由来する抗原物質によって引き起こされる望ましくない非FMDV特異的免疫応答が排除される。例えばブタから採取した血清は、宿主細胞に対する抗体、または組換え大腸菌、酵母、もしくはバキュロウイルスに対する抗体を有している可能性があり、これらの抗体は、生物学的な由来の抗原に基づいた診断検査において使用する抗原物質と交差反応を起こし得る。成分としてこれらの異質免疫原を有するワクチンによって誘導されたこのような免疫応答によって、保護はされ得ない。これとは対照的に、本明細書に記載する合成FMDVペプチドワクチンを投与されたブタまたはウシには目的の免疫応答が誘導され、宿主細胞または発現ベクターに由来するタンパク質に対する不都合な抗体またはその他の免疫応答は誘導されない。
さらに、不活化ウイルスの産生の間に導入され得る矛盾または誤りは、処置された動物における適切かつ/または望ましい免疫応答を阻止し得る。しかしながら、長い合成FMDVペプチド免疫原の合成中に導入され得る矛盾及び/又は誤りは、ほとんどの場合、処置された動物における望ましい免疫応答を妨害および阻止することはない。事実、ペプチドの合成中に導入され得る矛盾/誤りによって、標的となるペプチド合成と共に複数のペプチド類似体が産生される。これらの類似体には、アミノ酸の挿入、欠失、置換および中途終止が含まれ得る。上述したように、このようなペプチド類似体は、免疫診断のための固相抗原またはワクチン接種のための免疫原として免疫学的に応用する場合、抗原性および免疫原性に役立つため、ペプチドの調製には適したものである。
合成ペプチドの免疫学的応用における25年間の経験から、本出願者は、意図された免疫活性を保持するための構造的変異の範囲は、低分子薬物による特異的な薬物活性、または生物学的な由来の薬物によって同時にもたらされる、大分子中に見出される望ましい活性および望ましくない毒性を保持するための構造的変異の範囲よりもはるかに調整可能であることを見出した。このようにペプチド類似体は、意図的に設計されたか、または合成過程での誤りにより、欠失配列副生成物の混合物として必然的に生成したものであり、意図されたペプチドと同様のクロマトグラフィー特性および免疫学的特性を有し、しばしば所望のペプチドを精製した調製物と同等に効果的である。設計された類似体および意図されない類似体混合物は、識別のためのQC手順が開発されて製造過程および産物評価過程の両方がモニターされ、これらのペプチドを用いた最終産物の再現性および有効性が保証される限りにおいて有効である。
上述の利点に鑑みて、本開示に記載したペプチドは、合成の固相法およびこの方法に利用できる種々の改良のような標準的な技術を用いて容易に合成可能である(Moore, V, 1992)。ペプチドは、核酸分子、ベクター及び/又は宿主細胞を含む組換えDNA技術を用いても作製できる。このように、FMDV B細胞およびT細胞エピトープクラスター抗原ペプチドおよびFMDV B細胞エピトープクラスター抗原ペプチドの免疫学的な機能性類似体をコードする核酸分子ならびにそれらの相補体もまた、本発明の一部として本開示により包含される。同様に、核酸分子を含有する発現ベクターを含むベクターおよびベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の一部として本開示により包含される。
様々な代表的態様は、FMDV抗原ペプチドおよびFMDV抗原ペプチドの免疫学的な機能性類似体の産生方法も包含する。例えば方法は、FMDV抗原ペプチド及び/又はその免疫学的な機能性類似体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、該ペプチド及び/又は類似体が発現する条件下でインキュベートする工程を含んでよい。
また、ペプチドは固相合成によって産生することができる。この化学的方法によって産生されたペプチドの質は制御および規定することが可能であり、その結果、抗原性、免疫原性および収率の再現性を保証することができる。
g.具体的な態様
本発明の具体的な態様として、次のものを含むが、これらに限定されない。
(1) a)合成FMDV VP1ペプチド抗原;
b)合成FMDVヘルパーTエピトープペプチド;及び
c)獣医学上許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント;
を有する***(FMD)ワクチン組成物であって、
a)のFMDV VP1ペプチド抗原は、
i)配列番号1又は2;
ii) (a)のホモログ;及び
iii) (a)又は(b)の任意の組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
(b)の合成FMDVヘルパーTエピトープペプチドは、(a)のペプチド抗原と共有結合しない、上記組成物。
(2) (a)のペプチド抗原が、配列番号1のアミノ酸配列を有する、1のFMDワクチン。
(3) (a)のペプチド抗原が、配列番号2のアミノ酸配列を有する、1のFMDワクチン。
(4) (b)のホモログが、配列番号3〜23からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、配列番号2のホモログである、1のFMDワクチン。
(5) (a)のペプチド抗原が、Thエピトープ配列を有するペプチドにアミノ末端又はカルボキシ末端で共有結合する、1のFMDワクチン。
(6) Thエピトープ配列が、配列番号24である、5のFMDワクチン。
(7) ヘルパーTエピトープが、イプシロンリジン残基を有するスペーサを介してペプチド抗原と共有結合する、5のFMDワクチン。
(8) (b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号34〜95及びその組合せからなる群から選ばれる、1のFMDワクチン。
(9) (a)のペプチド抗原の全量が、投与当たり約10μg〜約1mgである、1のFMDワクチン。
(10) デリバリビヒクル又はアジュバントが、モンタニド(Montanide)ISA 50V、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート、エマルシゲン(Emulsigen)、エマルシゲンD(Emulsigen D)及びCpGオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる、1のFMDワクチン。
本発明の具体的な態様として、次のものを含むが、これらに限定されない。
(1) a)合成FMDV VP1ペプチド抗原;
b)合成FMDVヘルパーTエピトープペプチド;及び
c)獣医学上許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント;
を有する***(FMD)ワクチン組成物であって、
a)のFMDV VP1ペプチド抗原は、
i)配列番号1又は2;
ii) (a)のホモログ;及び
iii) (a)又は(b)の任意の組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
(b)の合成FMDVヘルパーTエピトープペプチドは、(a)のペプチド抗原と共有結合しない、上記組成物。
(2) (a)のペプチド抗原が、配列番号1のアミノ酸配列を有する、1のFMDワクチン。
(3) (a)のペプチド抗原が、配列番号2のアミノ酸配列を有する、1のFMDワクチン。
(4) (b)のホモログが、配列番号3〜23からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、配列番号2のホモログである、1のFMDワクチン。
(5) (a)のペプチド抗原が、Thエピトープ配列を有するペプチドにアミノ末端又はカルボキシ末端で共有結合する、1のFMDワクチン。
(6) Thエピトープ配列が、配列番号24である、5のFMDワクチン。
(7) ヘルパーTエピトープが、イプシロンリジン残基を有するスペーサを介してペプチド抗原と共有結合する、5のFMDワクチン。
(8) (b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号34〜95及びその組合せからなる群から選ばれる、1のFMDワクチン。
(9) (a)のペプチド抗原の全量が、投与当たり約10μg〜約1mgである、1のFMDワクチン。
(10) デリバリビヒクル又はアジュバントが、モンタニド(Montanide)ISA 50V、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート、エマルシゲン(Emulsigen)、エマルシゲンD(Emulsigen D)及びCpGオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる、1のFMDワクチン。
(11) a) 配列番号25〜33及びその組合せからなる群から選ばれる合成FMDV VP1ペプチド抗原;
b) 配列番号34〜95からなる群から選ばれる合成FMDVヘルパーTエピトープペプチド;及び
c) 獣医学上許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント;
を有する***(FMD)ワクチン組成物。
(12) (a)のペプチド抗原が、配列番号25、27、28、29及び/又はその組合せである、11のFMDワクチン。
(13) (b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号34〜63、90、及びその組合せである、11のFMDワクチン。
(14) (a)のペプチド抗原が、配列番号25、27、28、29及び/又はその組合せであり、(b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号34〜63、90、及びその組合せである、11のFMDワクチン。
(15) 医薬上有効量の14のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
(16) 動物がブタである、15の方法。
(17) 医薬上有効量の14のワクチンを動物に単回投与することを有する、FMD感染から動物を保護する方法。
(18) 動物がブタである、17の方法。
(19) (a)のペプチド抗原が、配列番号25、27、28、29及び/又はその組合せである、11のFMDワクチン。
(20) 医薬上有効量の19のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
(21) 動物が雌ウシである、20の方法。
(22) 医薬上有効量の19のワクチンを動物に単回投与することを有する、FMD感染から動物を保護する方法。
(23) 動物が雌ウシである、22の方法。
(24) (a)のペプチド抗原が、配列番号26、30、32、33、及び/又はその組合せである、11のFMDワクチン。
(25) (b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号91〜95、及びその組合せである、11のFMDワクチン。
(26) (a)のペプチド抗原が、配列番号26、30、32、33、及び/又はその組合せであり、(b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号91〜95、及びその組合せである、11のFMDワクチン。
(27) 医薬上有効量の26のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
(28) 動物が雌ウシである、27の方法。
(29) 医薬上有効量の26のワクチンを動物に単回投与することを有する、FMD感染から動物を保護する方法。
(30) 動物が雌ウシである、29の方法。
以下の実施例は、本発明を説明するために役立つものであり、本発明の範囲を限定するために用いられるべきでない。
b) 配列番号34〜95からなる群から選ばれる合成FMDVヘルパーTエピトープペプチド;及び
c) 獣医学上許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント;
を有する***(FMD)ワクチン組成物。
(12) (a)のペプチド抗原が、配列番号25、27、28、29及び/又はその組合せである、11のFMDワクチン。
(13) (b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号34〜63、90、及びその組合せである、11のFMDワクチン。
(14) (a)のペプチド抗原が、配列番号25、27、28、29及び/又はその組合せであり、(b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号34〜63、90、及びその組合せである、11のFMDワクチン。
(15) 医薬上有効量の14のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
(16) 動物がブタである、15の方法。
(17) 医薬上有効量の14のワクチンを動物に単回投与することを有する、FMD感染から動物を保護する方法。
(18) 動物がブタである、17の方法。
(19) (a)のペプチド抗原が、配列番号25、27、28、29及び/又はその組合せである、11のFMDワクチン。
(20) 医薬上有効量の19のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
(21) 動物が雌ウシである、20の方法。
(22) 医薬上有効量の19のワクチンを動物に単回投与することを有する、FMD感染から動物を保護する方法。
(23) 動物が雌ウシである、22の方法。
(24) (a)のペプチド抗原が、配列番号26、30、32、33、及び/又はその組合せである、11のFMDワクチン。
(25) (b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号91〜95、及びその組合せである、11のFMDワクチン。
(26) (a)のペプチド抗原が、配列番号26、30、32、33、及び/又はその組合せであり、(b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号91〜95、及びその組合せである、11のFMDワクチン。
(27) 医薬上有効量の26のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
(28) 動物が雌ウシである、27の方法。
(29) 医薬上有効量の26のワクチンを動物に単回投与することを有する、FMD感染から動物を保護する方法。
(30) 動物が雌ウシである、29の方法。
以下の実施例は、本発明を説明するために役立つものであり、本発明の範囲を限定するために用いられるべきでない。
実施例1
FMDVペプチドの合成
医薬組成物に含まれたFMDVペプチドを合成するための方法について記載する。該ペプチドは、実験室での試験および実地試験に有用であるように少量合成してもよく、ワクチンおよびアッセイ用製剤の工業的/商業的産生に有用であるように大量(キログラム)合成してもよい。
FMDVペプチドの合成
医薬組成物に含まれたFMDVペプチドを合成するための方法について記載する。該ペプチドは、実験室での試験および実地試験に有用であるように少量合成してもよく、ワクチンおよびアッセイ用製剤の工業的/商業的産生に有用であるように大量(キログラム)合成してもよい。
おおよそ10〜70アミノ酸長の配列を有するFMDV VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B、及び3Dタンパク質に由来するFMDV B細胞およびT細胞エピトープクラスター部位の双方を表すFMDV抗原ペプチドの多数のレパトアを設計した。幾つかのペプチドに対して、アミノ酸置換を適切な部位に施し、環状ペプチドが形成されるようにし、局所的構造を保存し、対応する天然タンパク質との交差反応が最大になるようにした(例えばシステイン残基への置換)。代表的なFMDV抗原ペプチドを表2に同定する(配列番号1〜23)。
各ペプチドそれぞれの免疫原性を増強するため、人工コンビナトリアルThペプチドに連結させた抗原ペプチドも合成した。配列番号24(UBITh(登録商標))のコンビナトリアルThペプチドに連結させた代表的なFMDV抗原ペプチドを、表3(配列番号24〜33)ならびに表7および8(配列番号89〜102)に同定する。
免疫原性試験のために用いられるすべてのペプチドは、Fmoc化学を用いて、アプライド・バイオシステムズペプチド合成機モデル(Applied BioSystems Peptide Synthesizer Models)430A、431および433により合成した。各ペプチドは、三官能性アミノ酸のN末端および側鎖保護基にFmoc保護を用いて、固相支持体上で個別に産生した。完成したペプチドを固相支持体から切断し、90%トリフルオロ酢酸によって側鎖保護基を除去した。正確なアミノ酸量を確実にするため、合成ペプチド調製物は、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間(Matrix-Assisted Laser Desorption Time-Of-Flight:MALDTOF)質量分析計(Mass Spectrometry)を用いて評価した。合成ペプチドはまた、合成プロファイルおよび調製物の濃度を確認するため、逆相HPLCによっても評価した。
合成過程の厳密な制御(カップリング効率のモニターを含む)にもかかわらず、ペプチド類似体は、アミノ酸の挿入、欠失、置換および中途終止のような、伸長サイクルの間の意図されない現象によって産生される。このように、合成された調製物は、標的となるペプチドと共に複数のペプチド類似体を典型的に含む。このような意図されないペプチド類似体が含まれているにもかかわらず、得られた合成ペプチド調製物は免疫診断(抗体捕捉用抗原として)およびワクチン接種(ペプチド免疫原として)のような免疫学的応用に適している。典型的には、このようなペプチド類似体は、意図的に設計されたかまたは合成過程の間に副生成物の混合物として生成したものであり、識別のためのQC手順が開発されて製造過程および産物評価過程の両方がモニターされ、これらのペプチドを用いた最終産物の再現性および有効性が保証される限りにおいて、しばしば所望のペプチドを精製した調製物と同等に効果的である。
すべてのペプチドを、労力を要し、かつ時間的な制約のある、血清学的スクリーニング過程またはインビトロIFN−γ産生に対するスクリーニング過程(ペプチド合成サイクルの反復、ワクチンの処方、動物の免疫を含む)並びに血清学的試験およびインビトロIFN−γ産生試験に供し、診断およびワクチンそれぞれへ応用するための、標的動物におけるさらなる試験を行うための候補ペプチドを得た。様々な実施例において用いた具体的な製剤について、以下に記載する。
実施例2
アッセイおよび試薬
本発明の合成ペプチドおよび製剤を評価するために開発したアッセイおよび試薬について、以下に記載する。
アッセイおよび試薬
本発明の合成ペプチドおよび製剤を評価するために開発したアッセイおよび試薬について、以下に記載する。
a.FMDV VP1(aa134〜168)またはVP1(aa129〜168)ペプチドベースのELISA
次の実施例に記載する様々なサンプルを評価するELISAアッセイを開発し、以下に記載する。
96ウェルプレートの各ウェルを、10mM NaHCO3緩衝液、pH9.5(他に記載のない限り)中の2μg/mL(特記しない限り)の各標的ペプチド100μLにより、37℃にて1時間コートした。
次の実施例に記載する様々なサンプルを評価するELISAアッセイを開発し、以下に記載する。
96ウェルプレートの各ウェルを、10mM NaHCO3緩衝液、pH9.5(他に記載のない限り)中の2μg/mL(特記しない限り)の各標的ペプチド100μLにより、37℃にて1時間コートした。
ペプチドによってコートされたウェルに3重量%ゼラチンを含むPBS溶液250μLを加え、37℃にて1時間インキュベートして非特異的なタンパク質結合部位をブロックした後、0.05容量%TWEEN(登録商標)20を含むPBSで3回洗浄し、乾燥した。分析する血清を、20容量%正常ヤギ血清、1重量%ゼラチンおよび0.05容量%TWEEN(登録商標)20を含むPBSによって、1:20(特記しない限り)に希釈した。各ウェルに100マイクロリットル(100μL)の希釈検体を加え、37℃にて60分間反応させた。
0.05容量%TWEEN(登録商標)20を含むPBSによってウェルを6回洗浄し、結合していない抗体を除去した。陽性ウェル内に形成された抗体/ペプチド抗原複合体に結合する標識トレーサーとして、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ブタIgGを用いた。予め用量設定を行い、1容量%正常ヤギ血清と0.05容量%TWEEN(登録商標)20とを含むPBSによって至適に希釈した100マイクロリットルのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ブタIgGを各ウェルに加え、37℃にて30分間インキュベートした。0.05容量%TWEEN(登録商標)20を含むPBSによってウェルを6回洗浄し、結合していない抗体を除去した後、3’,3’,5’,5’-テトラメチルベンジジン(3’,3’,5’,5’-tetramethylbenzidine:TMB)0.04重量%と過酸化水素0.12容量%を含むクエン酸ナトリウム緩衝液中の基質混合液100μLと共に、さらに15分間反応させた。この基質混合液を用いて、呈色産物の形成によるペルオキシダーゼ標識を検出した。1.0M H2SO4を100μL加えて反応を停止させ、450nmにおける吸光度(A450)を決定した。
血清希釈を、動物血清中にFMDV抗体を検出する目的に従って以下のように行った。(a)潜在的な自然感染を同定するために、1:20希釈を用い、A450の読み取りを記録し、カットオフ値算出のための固有のネガティブコントロールを用いた。または、(b)ペプチドベースのFMDVワクチン製剤を負荷されたブタの抗体力価を決定するために、1:10〜1:10,000まで10倍連続希釈を行った血清を試験し、Log10で表される試験血清の力価を、カットオフ値を0.5に設定したA450の線形回帰分析によって算出した。血清中のアイソタイプ特異的な抗FMDV抗体(例えばIgG1、IgG2およびIgA)の検出を、必要な場合には、セロテック(Serotec)で供給されるこれらのアイソタイプに特異的なモノクローナル抗体を用いて、測定した。抗体力価も上記と同様に測定した。
FMDV VP1 B細胞エピトープクラスターペプチド(配列番号1〜23)の10mL NaHCO3緩衝液、pH9.5の溶液を、2μg/mLで、ウェルあたり100μL用いて、それぞれのVP1 ELISAにおけるコート用抗原として、用いた。
FMDV VP1 B細胞エピトープクラスターペプチド(配列番号1〜23)の10mL NaHCO3緩衝液、pH9.5の溶液を、2μg/mLで、ウェルあたり100μL用いて、それぞれのVP1 ELISAにおけるコート用抗原として、用いた。
b.非構造タンパク質3BペプチドベースのELISA
FMDV非構造(non-structural:NS)タンパク質3Bでの血清抗体反応性についてのELISAを、1:21希釈により、以前の報告に従って行った(Wang, CY et al 2001)。各試験には、ペプチド免疫化したウシおよびネガティブコントロールのウシから採取した血清が含まれた。得られた結果を、カットオフOD値(一般には0.220 OD)を差し引いた後のOD単位によって報告する。
このFMDV NS 3BペプチドベースのELISAアッセイにより、ワクチン接種された動物を感染動物から区別することが可能である。具体的には、ワクチン接種された動物と感染動物とは、動物から得た血清が非構造FMDVタンパク質と反応するか否かによって区別される。特に、本開示のワクチン製剤で免疫化した動物から得た血清は、該ワクチン製剤が構造タンパク質であるVP1由来のエピトープのみを含むため、非構造FMDVタンパク質とは反応しない。このように、感染動物から得た血清サンプルのみが、非構造FMDVタンパク質と反応する。
FMDV非構造(non-structural:NS)タンパク質3Bでの血清抗体反応性についてのELISAを、1:21希釈により、以前の報告に従って行った(Wang, CY et al 2001)。各試験には、ペプチド免疫化したウシおよびネガティブコントロールのウシから採取した血清が含まれた。得られた結果を、カットオフOD値(一般には0.220 OD)を差し引いた後のOD単位によって報告する。
このFMDV NS 3BペプチドベースのELISAアッセイにより、ワクチン接種された動物を感染動物から区別することが可能である。具体的には、ワクチン接種された動物と感染動物とは、動物から得た血清が非構造FMDVタンパク質と反応するか否かによって区別される。特に、本開示のワクチン製剤で免疫化した動物から得た血清は、該ワクチン製剤が構造タンパク質であるVP1由来のエピトープのみを含むため、非構造FMDVタンパク質とは反応しない。このように、感染動物から得た血清サンプルのみが、非構造FMDVタンパク質と反応する。
c.感染動物をワクチン接種された動物から区別する(Differentiation of Infected from Vaccinated Animals:DIVA)診断システム
血清型特異的なFMDV VP1ペプチドベースのELISAと組み合わせてFMDV NS 3BペプチドベースのELISAを用いることにより、(1)感染動物をワクチン接種された動物から区別するため、および(2)動物が感染したか、またはそれに対してワクチン接種された、FMDVの特定の血清型を同定するための、有用かつ便利な手段が提供される。したがって、このELISAアッセイの組み合わせにより、ウイルス負荷に対するFMDVワクチンの有効性が、血清学的手段を通して便利かつ有用に評価される。
血清型特異的なFMDV VP1ペプチドベースのELISAと組み合わせてFMDV NS 3BペプチドベースのELISAを用いることにより、(1)感染動物をワクチン接種された動物から区別するため、および(2)動物が感染したか、またはそれに対してワクチン接種された、FMDVの特定の血清型を同定するための、有用かつ便利な手段が提供される。したがって、このELISAアッセイの組み合わせにより、ウイルス負荷に対するFMDVワクチンの有効性が、血清学的手段を通して便利かつ有用に評価される。
d.免疫原性の評価
以下の実施例に記載する方法に従って動物を免疫化した。ワクチン製剤投与後に血液サンプルを得て免疫原性を評価した。
具体的には、免疫化した動物からサンプルを、ウシの場合には初回免疫後0、3および5週目(weeks post initial immunization:wpi)に、ブタの場合には0、4および6wpiに、採取した。サンプルを56℃にて30分間加熱して、血清中の補体因子を不活化した。合成ペプチドを含む製剤の免疫原性を、上述したように、固相抗原として対応するFMDV VP1抗原ペプチドを用いるペプチドベースELISAによって評価した。連続希釈した実験動物の血清を試験し、陽性の場合の力価を希釈の逆数のLog10として表した。
血清陽性サンプルをグループごとにプールし、後述するようにFMDVの様々な単離株の中和活性を求めた。
以下の実施例に記載する方法に従って動物を免疫化した。ワクチン製剤投与後に血液サンプルを得て免疫原性を評価した。
具体的には、免疫化した動物からサンプルを、ウシの場合には初回免疫後0、3および5週目(weeks post initial immunization:wpi)に、ブタの場合には0、4および6wpiに、採取した。サンプルを56℃にて30分間加熱して、血清中の補体因子を不活化した。合成ペプチドを含む製剤の免疫原性を、上述したように、固相抗原として対応するFMDV VP1抗原ペプチドを用いるペプチドベースELISAによって評価した。連続希釈した実験動物の血清を試験し、陽性の場合の力価を希釈の逆数のLog10として表した。
血清陽性サンプルをグループごとにプールし、後述するようにFMDVの様々な単離株の中和活性を求めた。
e.FMDVウイルス
血清型AのFMDV A12およびA24;血清型OのO1、O2、OTaiwan、OOzkおよびOMyanmar;Asia 1xj株;などを含む、FMDVの様々な株を用いる負荷試験(以下の実施例で考察する)に、動物を供した。これらの実験で用いたFMDV株は、単層のベビーハムスター腎臓(baby hamster kidney:BHK)細胞内で増殖させ、USDAプラムアイランド動物疾病センター(Plum Island Animal Disease Center,USDA)(グリーンポート、ニューヨーク州)及び/又は台湾動物衛生研究所(National Institute of Animal Health,Taiwan:NIAHT)において、封じ込め環境下で精製した。ウイルスはまた、工業的使用のために、中華人民共和国農業部の基準検査所(reference laboratory)である中国農業科学院蘭州獣医学研究所(PRC’s Ministry of Agriculture reference laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute of the Chinese Academy of Agriculture Sciences)からも、ペレットを1%SDSまたは1%ノニデットP−40によって処理した後に15〜45%ショ糖勾配を通した遠心分離を行う、以前に記載された方法(Brown 1963)に基本的に従って得た。
各遠心管の内容物をポンピングによって260nmに設定した分光光度計のフローセルに通過させ、精製したウイルスのピークを同定して単離した。
血清型AのFMDV A12およびA24;血清型OのO1、O2、OTaiwan、OOzkおよびOMyanmar;Asia 1xj株;などを含む、FMDVの様々な株を用いる負荷試験(以下の実施例で考察する)に、動物を供した。これらの実験で用いたFMDV株は、単層のベビーハムスター腎臓(baby hamster kidney:BHK)細胞内で増殖させ、USDAプラムアイランド動物疾病センター(Plum Island Animal Disease Center,USDA)(グリーンポート、ニューヨーク州)及び/又は台湾動物衛生研究所(National Institute of Animal Health,Taiwan:NIAHT)において、封じ込め環境下で精製した。ウイルスはまた、工業的使用のために、中華人民共和国農業部の基準検査所(reference laboratory)である中国農業科学院蘭州獣医学研究所(PRC’s Ministry of Agriculture reference laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute of the Chinese Academy of Agriculture Sciences)からも、ペレットを1%SDSまたは1%ノニデットP−40によって処理した後に15〜45%ショ糖勾配を通した遠心分離を行う、以前に記載された方法(Brown 1963)に基本的に従って得た。
各遠心管の内容物をポンピングによって260nmに設定した分光光度計のフローセルに通過させ、精製したウイルスのピークを同定して単離した。
f.中和指数としてのFMDV中和活性の血清学的評価
動物から得た血液より血清サンプルを処理し、試験時まで−20℃で保存した。上述のように調製した様々な血清型の一定分量(10,000MPD50)を用いて、ウイルス量を段階的に増加させたインプットに対する中和を決定することにより、1:100に希釈した血清サンプルによって中和したウイルスの一覧を求めた。
血清サンプルを既述の方法(Morgan 1990)を用いて評価した。1:100希釈によってFMDVのマイクロプラークが2.5 Log10減少したサンプルは、FMDV感染に対して高い防御免疫を有するとみなされた。
動物から得た血液より血清サンプルを処理し、試験時まで−20℃で保存した。上述のように調製した様々な血清型の一定分量(10,000MPD50)を用いて、ウイルス量を段階的に増加させたインプットに対する中和を決定することにより、1:100に希釈した血清サンプルによって中和したウイルスの一覧を求めた。
血清サンプルを既述の方法(Morgan 1990)を用いて評価した。1:100希釈によってFMDVのマイクロプラークが2.5 Log10減少したサンプルは、FMDV感染に対して高い防御免疫を有するとみなされた。
g.FMDV特異性中和抗体アッセイ:標準的なベータ中和試験
標準的なベータ中和試験は、96ウェルプレート内で、2倍連続希釈した各血清を100または200 TCID50(50%組織培養感染量)のFMDVと共に37℃にて30分間インキュベートすることにより行った。残ったウイルス活性を、新しい単層のBHK−21細胞を含む96ウェルプレート内で測定した。血清中和力価を、接種したウイルスの50%を中和する血清希釈のlog10として測定した。
標準的なベータ中和試験は、96ウェルプレート内で、2倍連続希釈した各血清を100または200 TCID50(50%組織培養感染量)のFMDVと共に37℃にて30分間インキュベートすることにより行った。残ったウイルス活性を、新しい単層のBHK−21細胞を含む96ウェルプレート内で測定した。血清中和力価を、接種したウイルスの50%を中和する血清希釈のlog10として測定した。
例えば、FMDV O1 Taiwanを中和する抗体の定量アッセイは、BHK−21細胞に対して、同じ200μL量によって平底マイクロタイタープレート内で行った。個々の実験動物から、50マイクロリットル(50μL)の免疫前または免疫後の希釈血清を採取した。これらの血清を、200 TCID50のFMDV O1 Taiwanを含む50μLの一定分量と共に別々に混合した後、37℃にて1時間インキュベートした。次に、2.5×105BHK−21細胞を含む100マイクロリットル(100μL)の培地(10.0%ウシ胎仔血清を加えたMEM(Gibco))を各アッセイに加えた。48時間後に、培養中の細胞変性効果(cytopathic effect:CE)を鏡検した。力価は、200 TCID50のウイルスによって誘導されたCEを50%阻害する血清の最終希釈の逆数として表した。
h.免疫原性試験に用いた動物
モルモット:免疫原性試験は、成熟した、無処置の、成体の雄および雌のDuncan-Hartleyモルモット(300〜350g/体重)において行った。実験では、一群あたり3匹のモルモットを用いた。
特定病原体が除去された(specific pathogen-free:SPF)飼育場から入手した約4〜12週齢のブタを、免疫原性試験のために耳に印をつけ、試験プロトコルに従って3〜5頭の子ブタ/群となるように群分けをした。
モルモット:免疫原性試験は、成熟した、無処置の、成体の雄および雌のDuncan-Hartleyモルモット(300〜350g/体重)において行った。実験では、一群あたり3匹のモルモットを用いた。
特定病原体が除去された(specific pathogen-free:SPF)飼育場から入手した約4〜12週齢のブタを、免疫原性試験のために耳に印をつけ、試験プロトコルに従って3〜5頭の子ブタ/群となるように群分けをした。
ウシ:地元の供給業者から入手した2〜6か月齢の健康な去勢牛を、試験プロトコルに従って3〜5頭の雌ウシ/群となるように群分けを行い、免疫原性試験を行った。ウイルス負荷試験に用いた動物は、バイオセイフティーレベル3の農学用封じ込め施設に収容し、試験開始前の1週間順応させた。
ヤギ:地元の供給業者から入手した健康なヤギを用いて免疫原性試験を行った。
免疫前、個別の動物に由来する血清サンプルを、FMDV特異性中和抗体の存在について試験を行い、動物が予めFMDVのワクチンを接種されていないかまたはFMDVに感染していないことを確認した。これらの動物から採取した血清は、上記のNS 3BおよびFMDV VP1に対するELISAアッセイを用いて評価を行い、動物がこれらのタンパク質に対する抗体を有していないこともさらに確実にした。
各動物は、種およびプロトコルに依存するが、ワクチン1投与あたり25〜300μgで免疫化した。
免疫前、個別の動物に由来する血清サンプルを、FMDV特異性中和抗体の存在について試験を行い、動物が予めFMDVのワクチンを接種されていないかまたはFMDVに感染していないことを確認した。これらの動物から採取した血清は、上記のNS 3BおよびFMDV VP1に対するELISAアッセイを用いて評価を行い、動物がこれらのタンパク質に対する抗体を有していないこともさらに確実にした。
各動物は、種およびプロトコルに依存するが、ワクチン1投与あたり25〜300μgで免疫化した。
i.組成物
各実験で用いた医薬組成物およびワクチン製剤を、後述の実施例に詳細に記載する。簡単に述べると、各試験群において特定される製剤は一般に、(1)配列番号1〜23、25〜32から選択される単一のVP1 B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原;(2)配列番号1〜23、および25〜32から選択されるホモログを含む、VP1 B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の混合物;または(3)配列番号33〜92から選択されるFMDV内在性Thエピトープクラスターペプチドの混合物を追加した、配列番号1〜23および25〜32から選択されるVP1 B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の混合物;を含んだ。ペプチドは特定のアジュバント製剤中で乳化した。ワクチンは通常、合成FMDVペプチド免疫原を約25〜300μg/mLになるように水に溶解し、セピック・モンタニド(Seppic Montanide)ISA 50V2を用いて油中水(w/o)乳剤に処方(容量により1:1)することにより、調製した。ワクチン製剤を室温にて約30分間静置し、免疫前に約10〜15秒間渦流した(vortex)。
各実験で用いた医薬組成物およびワクチン製剤を、後述の実施例に詳細に記載する。簡単に述べると、各試験群において特定される製剤は一般に、(1)配列番号1〜23、25〜32から選択される単一のVP1 B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原;(2)配列番号1〜23、および25〜32から選択されるホモログを含む、VP1 B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の混合物;または(3)配列番号33〜92から選択されるFMDV内在性Thエピトープクラスターペプチドの混合物を追加した、配列番号1〜23および25〜32から選択されるVP1 B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の混合物;を含んだ。ペプチドは特定のアジュバント製剤中で乳化した。ワクチンは通常、合成FMDVペプチド免疫原を約25〜300μg/mLになるように水に溶解し、セピック・モンタニド(Seppic Montanide)ISA 50V2を用いて油中水(w/o)乳剤に処方(容量により1:1)することにより、調製した。ワクチン製剤を室温にて約30分間静置し、免疫前に約10〜15秒間渦流した(vortex)。
何頭かの動物は、特定のワクチン製剤の2用量を0(刺激)および3wpi(ブースター)に筋肉内(intramuscularly:IMO)投与することによって免疫化した。これらの免疫化動物を試験し、ワクチン製剤に存在する合成FMDVエピトープ免疫原の免疫原性を評価した。残りの動物を特定のワクチン製剤の単回投与によって免疫化し、該製剤に用いたペプチドが、FMDVに対する緊急ワクチンとして適格である、十分な中和抗体反応を効率的に増大させ得るか否かについて評価した。
実施例3
FMDV内在性THエピトープクラスターペプチドのスクリーニング用および同定用のT細胞機能アッセイ
T細胞機能実験の手順を、以下に詳しく述べる。
FMDV内在性THエピトープクラスターペプチドのスクリーニング用および同定用のT細胞機能アッセイ
T細胞機能実験の手順を、以下に詳しく述べる。
a.末梢血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells:PBMCs)の単離、凍結および解凍
ヘパリン処理した血液を回収し、Ficoll−Hypaqueを用いる密度勾配遠心分離によってPBMCを単離した。リン酸緩衝食塩水(phosphate-buffered saline:PBS)によって2回洗浄した後、10%FCSを添加したRPMI 1640から構成される細胞培養用培地にPBMCを再懸濁した。幾つかの実験のために、単離したPBMCを凍結して液体N2中に保存し、後にインビトロ培養のために解凍した。
ヘパリン処理した血液を回収し、Ficoll−Hypaqueを用いる密度勾配遠心分離によってPBMCを単離した。リン酸緩衝食塩水(phosphate-buffered saline:PBS)によって2回洗浄した後、10%FCSを添加したRPMI 1640から構成される細胞培養用培地にPBMCを再懸濁した。幾つかの実験のために、単離したPBMCを凍結して液体N2中に保存し、後にインビトロ培養のために解凍した。
b.血清IFN−γの定量
サンドイッチELISAを用いて、ブタ又はウシから採取した血清サンプル中のIFN−γを定量した。動物へのワクチン接種前およびFMDV負荷前21日目または28日目にIFN−γを定量した。まず、Maxisorb ELISAプレート(Nunc)の個別のウェルに、ウェルあたり0.5μgの捕捉抗体(PBL Biomedical Laboratories、米国から購入)をコートしてアッセイを行った。固定化抗体がコートされていない部位は、各アッセイウェルに200μLのELISAブロッキング緩衝液を加えてブロックした。0.025% Tween20を含むPBS(PBS−T20)を、各回200μL用いてプレートを4回洗浄した後、ELISA希釈緩衝液で個別に希釈(10、25および75中に1)した血清サンプルをアッセイウェルに加えた。プレートを37℃にて1時間インキュベートし、サイトカインを固相抗IFN−γ捕捉抗体に結合させた。次にプレートをPBSによって4回洗浄した後、アッセイウェルに、検出のための抗IFN−γ抗体をウェルあたり0.25μg加えた。37℃における1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、各試験ウェルにプロテインA複合物100μLを加えた。1時間のインキュベーション後に余剰の複合物を洗い流した後(PBSによって6回)、反応検出のために望ましい基質溶液を100μL加えた。30分後に、個々のアッセイウェルに1N H2SO4 50μLを加えて発色を停止させ、450nmにて吸光度を測定することによって色の強度を記録した。まず、各血清について得たA450の測定値を、希釈した組換えIFN−γ標準物質(PBL Biomedical Laboratories、米国)を同じ試験条件下でアッセイすることにより作成した検量線図と比較することにより、結果を算出した。ワクチン接種後28日目の各動物における血清中のIFN−γ応答を、免疫前の動物に対して測定した値を差し引くことによって表した。最終結果は、血清中のpg/mlとして表した。
サンドイッチELISAを用いて、ブタ又はウシから採取した血清サンプル中のIFN−γを定量した。動物へのワクチン接種前およびFMDV負荷前21日目または28日目にIFN−γを定量した。まず、Maxisorb ELISAプレート(Nunc)の個別のウェルに、ウェルあたり0.5μgの捕捉抗体(PBL Biomedical Laboratories、米国から購入)をコートしてアッセイを行った。固定化抗体がコートされていない部位は、各アッセイウェルに200μLのELISAブロッキング緩衝液を加えてブロックした。0.025% Tween20を含むPBS(PBS−T20)を、各回200μL用いてプレートを4回洗浄した後、ELISA希釈緩衝液で個別に希釈(10、25および75中に1)した血清サンプルをアッセイウェルに加えた。プレートを37℃にて1時間インキュベートし、サイトカインを固相抗IFN−γ捕捉抗体に結合させた。次にプレートをPBSによって4回洗浄した後、アッセイウェルに、検出のための抗IFN−γ抗体をウェルあたり0.25μg加えた。37℃における1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、各試験ウェルにプロテインA複合物100μLを加えた。1時間のインキュベーション後に余剰の複合物を洗い流した後(PBSによって6回)、反応検出のために望ましい基質溶液を100μL加えた。30分後に、個々のアッセイウェルに1N H2SO4 50μLを加えて発色を停止させ、450nmにて吸光度を測定することによって色の強度を記録した。まず、各血清について得たA450の測定値を、希釈した組換えIFN−γ標準物質(PBL Biomedical Laboratories、米国)を同じ試験条件下でアッセイすることにより作成した検量線図と比較することにより、結果を算出した。ワクチン接種後28日目の各動物における血清中のIFN−γ応答を、免疫前の動物に対して測定した値を差し引くことによって表した。最終結果は、血清中のpg/mlとして表した。
c.PBMCによるIFN−γ産生のアッセイ
ワクチン投与された動物のPBMCを、2.5×106細胞/mLにて、24ウェル培養プレート(Nunc)の個々のウェル内で、選択したワクチン免疫原組成物10.0μgの存在下で培養した。抗原刺激のないPBMCのみを含むネガティブコントロール培養も行った。すべての培養は、5.0% CO2インキュベーター内で37℃にて3日間維持した。培養開始後3日目に上清を回収し、IFN−γの含有量を上述した定量アッセイを用いて測定した。
ワクチン投与された動物のPBMCを、2.5×106細胞/mLにて、24ウェル培養プレート(Nunc)の個々のウェル内で、選択したワクチン免疫原組成物10.0μgの存在下で培養した。抗原刺激のないPBMCのみを含むネガティブコントロール培養も行った。すべての培養は、5.0% CO2インキュベーター内で37℃にて3日間維持した。培養開始後3日目に上清を回収し、IFN−γの含有量を上述した定量アッセイを用いて測定した。
実施例4
ブタおよびウシ動物におけるFMDV負荷の手順
負荷手順は、一般に、OIE標準マニュアル(Manual of Standards)の***の章に記載されるプロトコルに基づく。負荷手順に用いたFMDV株には、O−1Taiwan(99)、O−1Myanmar(02)、O−1Ozk(China,93)、O−1CamposおよびAsia 1(XJ or Jiansu,China,05)が含まれる。中国で行われたブタへの負荷試験の手順を、農業部の指針に従い、筋肉内経路を介してFMDVウイルスを投与するように改変した。
ブタおよびウシ動物におけるFMDV負荷の手順
負荷手順は、一般に、OIE標準マニュアル(Manual of Standards)の***の章に記載されるプロトコルに基づく。負荷手順に用いたFMDV株には、O−1Taiwan(99)、O−1Myanmar(02)、O−1Ozk(China,93)、O−1CamposおよびAsia 1(XJ or Jiansu,China,05)が含まれる。中国で行われたブタへの負荷試験の手順を、農業部の指針に従い、筋肉内経路を介してFMDVウイルスを投与するように改変した。
a.ブタ
動物において、標準化された感染防御用量(PD50)(すなわち試験動物の50%が保護された場合の投与量)を測定した。体重がほぼ40kgである15頭のブタ(各群が5頭のブタを含むように、無作為に3群へと分けた)を用いて効力試験を行い、ブタにおけるPD50を決定した。3群には、それぞれ1用量、1/3用量および1/9用量の試験用ワクチン製剤を投与した。特定の製剤の効力を評価するため、例えば投与量が2×、1×、0.5×および0.25×の用量となるように、投薬の改変も行った。加えて、1×用量による製剤の迅速なスクリーニングも頻繁に行った。
動物において、標準化された感染防御用量(PD50)(すなわち試験動物の50%が保護された場合の投与量)を測定した。体重がほぼ40kgである15頭のブタ(各群が5頭のブタを含むように、無作為に3群へと分けた)を用いて効力試験を行い、ブタにおけるPD50を決定した。3群には、それぞれ1用量、1/3用量および1/9用量の試験用ワクチン製剤を投与した。特定の製剤の効力を評価するため、例えば投与量が2×、1×、0.5×および0.25×の用量となるように、投薬の改変も行った。加えて、1×用量による製剤の迅速なスクリーニングも頻繁に行った。
ワクチン製剤の有効性を評価するため、実験計画および特定の試験時における動物の利用可能性に基づいて、1群あたり3頭(5頭の代わりに)のブタを含むように、ブタを群分けした。これら3群内のそれぞれのブタは、耳の後方に筋肉内(IM)経路を介してワクチンを接種した。記載するように、単回のワクチン接種から28日後に、ワクチン接種した15頭のブタおよび2頭のコントロールブタそれぞれに、ブタFMD O型株由来の病原ウイルスを1,000ID50接種することによって負荷を行った。
理想的な実験では、モニター開始後10日目のコントロールブタにおいて、少なくとも1の蹄に水疱性の病変部が見出されるはずである。また、ワクチン接種されたブタには、ワクチンによる防御が作用しなかった場合を除き、FMDの症状および徴候は観察されないはずである。負荷試験の結果に基づき、Reed−Muench法を用いてワクチン製品のPD50を算出した。発売のための品質試験に合格するためには、ワクチンの標的用量が最低でも3PD50を含むものでなければならない。
理想的な実験では、モニター開始後10日目のコントロールブタにおいて、少なくとも1の蹄に水疱性の病変部が見出されるはずである。また、ワクチン接種されたブタには、ワクチンによる防御が作用しなかった場合を除き、FMDの症状および徴候は観察されないはずである。負荷試験の結果に基づき、Reed−Muench法を用いてワクチン製品のPD50を算出した。発売のための品質試験に合格するためには、ワクチンの標的用量が最低でも3PD50を含むものでなければならない。
台湾では、台湾淡水区の動物衛生研究所(National Institute for Animal Health)のP3施設内部で、農業委員会(Council of Agriculture)の指針に従って、組織培養において予め力価を決定した1×105TCID50のFMDV O−1Taiwanウイルス(中華人民共和国の指針に従ったウイルスの投与量より、少なくとも約10倍多い)をブタ前脚の踵球内に接種することにより、ウイルス負荷を行った。14日にわたる観察期間に、FMDの臨床徴候について実験動物をモニターした。これらの観察には、(1)毎日の体温の記録、(2)動物の脚における跛行の発生をモニターすること、および(2)動物の脚の蹄冠帯および鼻部に発生した水疱性の病変部をモニターすることが含まれた。負荷試験の結果に基づき、Reed−Muench法を用いてワクチン製品のPD50を算出した。ワクチン発売のためには、ワクチンの標的用量が最低でも3PD50を含むものでなければならない。
b.ウシ
ウシでは、力価を決定し、総量1×104TCID50のFMDV(ウシ感染単位(Bovine Infectious Unit:BIU))を含むように調整した1mL(舌の10部位それぞれに100μL)のマセレート(macerate)の舌皮内(intradermolingual:IDL)接種によってウイルス負荷を行った。動物に対しては毎日直腸温を測定し、病変部の出現時期、数および重症度に基づいた防御スコアを求めた。
完全な防御は病変部の完全な欠如(スコア0)として定義し、8未満のスコア値は部分的な防御であるとみなした。以下のように臨床スコアを算出した。
ウシでは、力価を決定し、総量1×104TCID50のFMDV(ウシ感染単位(Bovine Infectious Unit:BIU))を含むように調整した1mL(舌の10部位それぞれに100μL)のマセレート(macerate)の舌皮内(intradermolingual:IDL)接種によってウイルス負荷を行った。動物に対しては毎日直腸温を測定し、病変部の出現時期、数および重症度に基づいた防御スコアを求めた。
完全な防御は病変部の完全な欠如(スコア0)として定義し、8未満のスコア値は部分的な防御であるとみなした。以下のように臨床スコアを算出した。
i)40℃(スコア1)、>40.5(スコア2)、または>41(スコア3)の体温上昇、
ii)食欲減退(1点)、または食物を摂取せず、前日からの食物が残っている状態(2点)、
iii)跛行(1点)、または立つことを嫌がる状態(2点)、
iv)蹄冠帯を触診により熱および疼痛をみとめる(1点)または冒された脚によって立てない状態(2点)、
v)冒された脚の数に依存し、最高4点である、脚にみられる小水疱、
vi)舌(1点)、歯茎もしくは唇(1点)、または鼻部(1点)により、最高3点である、目に見える口の病変部。
生きた動物を用いたすべての実験は、OIE標準マニュアル、中華人民共和国農業部、または台湾農業委員会の指針の下に行った。特定の製剤の効力を評価するため、例えば投与量が2×、1×、0.5×および0.25×の用量となるように、投薬の改変も行った。また、1×用量による製剤の迅速なスクリーニングも頻繁に行った。
ii)食欲減退(1点)、または食物を摂取せず、前日からの食物が残っている状態(2点)、
iii)跛行(1点)、または立つことを嫌がる状態(2点)、
iv)蹄冠帯を触診により熱および疼痛をみとめる(1点)または冒された脚によって立てない状態(2点)、
v)冒された脚の数に依存し、最高4点である、脚にみられる小水疱、
vi)舌(1点)、歯茎もしくは唇(1点)、または鼻部(1点)により、最高3点である、目に見える口の病変部。
生きた動物を用いたすべての実験は、OIE標準マニュアル、中華人民共和国農業部、または台湾農業委員会の指針の下に行った。特定の製剤の効力を評価するため、例えば投与量が2×、1×、0.5×および0.25×の用量となるように、投薬の改変も行った。また、1×用量による製剤の迅速なスクリーニングも頻繁に行った。
実施例5
ペプチド免疫原設計のための、アミノ酸フレーム構造として、ならびにFMDV Bエピトープおよび内在性THエピトープの位置としてOTAIWAN99単離株の配列を用いる、FMDV単離株の完全ゲノム配列の比較解析
FMDVゲノムの構成を通して概観した後、FMDV血清型OTaiwan99のポリタンパク質アミノ酸配列を、FMDV抗原ペプチドの同定および設計の基礎として用いた。フレーム構造がいったん確立されたこれらのペプチドは、地域的な応用のため、複数の血清型の配列を代表するように調整可能である。FMDV OTaiwan99の配列と、以前に記載されたように(Carrillo 2005)対応するGenBank受託番号によってアクセスした七種の血清型すべてを代表する103のFMDV単離株の完全ゲノム配列とのアラインメントにより、可変性および潜在的に生物学的関連のある新規なウイルスモチーフを機能的に制限する、高度に保存されたFMDVタンパク質領域を同定した。特に、FMDV VP1タンパク質“RGD”受容体結合部位周囲の配列およびそれらの血清型関連共通配列(すなわち、設計する特定の血清型のFMDV単離株の配列比較に基づいたそれぞれの位置に、最も頻繁に出現するアミノ酸)は、B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原設計のための青写真である一方で、高度に保存されたFMDVタンパク質領域は、FMDV内在性Thエピトープクラスターペプチド免疫原を設計する上での標的部位であった。実施例3に詳述する手順を用いた、血清学的アッセイおよび細胞学的アッセイの両方によるスクリーニング後、参照した一連のB細胞およびヘルパーT細胞エピトープクラスターペプチド(配列番号1〜102)を、図1および表1〜8に示す様々な株および血清型を代表するFMDVワクチン製剤への応用のために同定した。
ペプチド免疫原設計のための、アミノ酸フレーム構造として、ならびにFMDV Bエピトープおよび内在性THエピトープの位置としてOTAIWAN99単離株の配列を用いる、FMDV単離株の完全ゲノム配列の比較解析
FMDVゲノムの構成を通して概観した後、FMDV血清型OTaiwan99のポリタンパク質アミノ酸配列を、FMDV抗原ペプチドの同定および設計の基礎として用いた。フレーム構造がいったん確立されたこれらのペプチドは、地域的な応用のため、複数の血清型の配列を代表するように調整可能である。FMDV OTaiwan99の配列と、以前に記載されたように(Carrillo 2005)対応するGenBank受託番号によってアクセスした七種の血清型すべてを代表する103のFMDV単離株の完全ゲノム配列とのアラインメントにより、可変性および潜在的に生物学的関連のある新規なウイルスモチーフを機能的に制限する、高度に保存されたFMDVタンパク質領域を同定した。特に、FMDV VP1タンパク質“RGD”受容体結合部位周囲の配列およびそれらの血清型関連共通配列(すなわち、設計する特定の血清型のFMDV単離株の配列比較に基づいたそれぞれの位置に、最も頻繁に出現するアミノ酸)は、B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原設計のための青写真である一方で、高度に保存されたFMDVタンパク質領域は、FMDV内在性Thエピトープクラスターペプチド免疫原を設計する上での標的部位であった。実施例3に詳述する手順を用いた、血清学的アッセイおよび細胞学的アッセイの両方によるスクリーニング後、参照した一連のB細胞およびヘルパーT細胞エピトープクラスターペプチド(配列番号1〜102)を、図1および表1〜8に示す様々な株および血清型を代表するFMDVワクチン製剤への応用のために同定した。
実施例6
FMDVペプチドベースのワクチンの鍵となる成分であるFMDV B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の分析
a.設計の経緯
ワクチンまたは免疫治療用製品は、治療介入に必要な特定の疾病機構および単数または複数の標的タンパク質に基づいて、それら自身の設計の焦点およびアプローチを必要とする。設計は、疾病経路または幾つかのタンパク質が関連し得る感染病原体に関わる細胞タンパク質を含む可能性のある標的をモデルとして行われる。
FMDVペプチドベースのワクチンの鍵となる成分であるFMDV B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の分析
a.設計の経緯
ワクチンまたは免疫治療用製品は、治療介入に必要な特定の疾病機構および単数または複数の標的タンパク質に基づいて、それら自身の設計の焦点およびアプローチを必要とする。設計は、疾病経路または幾つかのタンパク質が関連し得る感染病原体に関わる細胞タンパク質を含む可能性のある標的をモデルとして行われる。
B細胞およびT細胞エピトープの同定および分布についてのこれまでの知識もまた、分子設計の過程に有益である。単数または複数の標的分子がいったん選択されると、詳細な血清学的検証が必要となる。続いて、小動物における連続的な免疫原性予備試験を行い、設計したペプチドのワクチン製剤によって誘発された抗体の機能的特性を評価する。その後、このような血清学的応用は、標的となる動物種において、ワクチンの免疫原性及び誘発された抗体の機能的特性のさらなる検証のために行われる。すべての試験は、免疫化宿主から評価のために採取した血清を用い、複数の並行群において行われる。標的種における早期の負荷試験もまた行い、設計の方向をさらに検証する。次に、様々に混合した標的ペプチドを調製し、それぞれの製剤設計のためにペプチドを組み合わせて用いる場合の、ペプチド構築物間の相互作用それぞれに関連する機能的特性のわずかな違いを評価する。さらなる評価の後に、最終的なペプチド構築物、ペプチド組成物およびその製剤を各製剤の物理的パラメータと共に確立して、最終的な製品開発過程へと進む。
広範な設計経験により、図2に示す発見から商品化までの、次世代ワクチン製品の開発が促進される。
広範な設計経験により、図2に示す発見から商品化までの、次世代ワクチン製品の開発が促進される。
特定のFMDVペプチドおよび組成物の開発中には、以下の開発目標が考慮された。1)中和抗体を広範に誘発するために十分なVP1ループドメイン標的部位を同定すること、2)免疫系に対して最適に提示されるペプチド標的部位を設計すること、3)ブタおよび反芻動物である標的種に免疫効力を与えるUBITh(登録商標)部位を選択すること、4)これらの重要な構成要素を、高いコスト効率で産生可能なペプチド免疫原の設計に取り入れること、および5)防御免疫のためのワクチン製剤、用量サイズ、および免疫プロトコルを開発すること。FMDVペプチド免疫原の分析および評価の全般的なゴールは、FMDV配列データベースおよび分子モデルの集中的かつ経験的な調査と、それに続く、動物免疫用ワクチン製剤のための多数の候補免疫原の合成を必要とした。ブタ及びウシに組成物および製剤を単回投与し、その後にウイルスを負荷した際にブタおよびウシが効果的に保護されるか否かを調べるため、総数831頭のブタおよび860頭のウシを免疫原性試験および中和抗体力価試験に供した。全部で、ブタには25試験、およびウシには32試験を行い、さらに本発明の発展に関わるモルモットおよびヤギに対する初期試験も行った。
b.最も潜在能力あるVP1ループドメインの標的の同定
FMDVに対して有効なペプチドワクチンに決定的な要素は、中和抗体の産生を誘発するB細胞エピトープが最適に提示される正確な配列をVP1のG−Hループドメインから選択することである。ペプチド免疫原によるドメインの提示に最適なフレームは、単一のアミノ酸の位置ほどの小さなシフトによって影響され得る。VP1カプシドタンパク質の立体構造の入手可能な分子モデルを調べ、この超可変領域内の配列の比較を評価することにより、合成免疫原がVP1との良好な交差反応性を示すためには、ループドメインの延長された部分を含まなければならないということが分かった。
FMDVに対して有効なペプチドワクチンに決定的な要素は、中和抗体の産生を誘発するB細胞エピトープが最適に提示される正確な配列をVP1のG−Hループドメインから選択することである。ペプチド免疫原によるドメインの提示に最適なフレームは、単一のアミノ酸の位置ほどの小さなシフトによって影響され得る。VP1カプシドタンパク質の立体構造の入手可能な分子モデルを調べ、この超可変領域内の配列の比較を評価することにより、合成免疫原がVP1との良好な交差反応性を示すためには、ループドメインの延長された部分を含まなければならないということが分かった。
表8に示すように、血清型AのFMDV A12の配列に基づき、aal34〜159又はaal34〜169をカバーする、VP1標的部位を有するペプチド免疫原を産生した。ペプチドの免疫原性を、ペプチドのみを含む組成物において、又はT細胞補助(help)を補足するためのFMDV内在性Thエピトープもしくは外来性のThエピトープを含んだ組成物において測定した。免疫原性アッセイは、ループ構造を安定化させるための環状構造をもつペプチドおよびもたないペプチドに対しても行った。ペプチドの環化は、特定の位置のアミノ酸残基をシステイン残基によって置換し、ジスルフィド結合を形成することによって促進された(例えばVP1の位置134(N−>C)および158(Q−>C))。
様々なペプチドを含む組成物を、モルモットの免疫効力に対して評価した。表9は、様々なペプチドの評価から得た実験結果を提供する。表9は次の事項を示す:
i.比較的長いペプチド構築物は、より良い中和応答を提供した。例えば、配列番号97は、配列番号96と比較して、より良い中和応答を提供した。また、標的部位を129残基に延長した場合にも(配列番号99)、一部の応用には有用であることが証明された。
ii.環化ペプチドは、この構造を持たないペプチドと比較して、より高い中和活性を提供した。例えば、環状ペプチド配列番号98は、配列番号97と比較して、より高い中和活性を提供した。
iii.FMDV VP1ドメインと連結した人工ThエピトープUBITh(登録商標)(配列番号24)由来のTh部位により提供された外来性Thは、このエピトープを含まない構築物よりも中和効率を上昇させた。例えば、配列番号100は、配列番号99、98、97及び96と比較して、より良い中和活性を提供した。
iv.免疫原性は、組成物中に外来性Thエピトープを加えることによって、さらに増強された。
これらの結果に鑑み、アミノ酸129から169までの延長されたVP1標的部位を含む環状ペプチド(例えば配列番号99)に最も免疫増強効果があると結論付けた。
i.比較的長いペプチド構築物は、より良い中和応答を提供した。例えば、配列番号97は、配列番号96と比較して、より良い中和応答を提供した。また、標的部位を129残基に延長した場合にも(配列番号99)、一部の応用には有用であることが証明された。
ii.環化ペプチドは、この構造を持たないペプチドと比較して、より高い中和活性を提供した。例えば、環状ペプチド配列番号98は、配列番号97と比較して、より高い中和活性を提供した。
iii.FMDV VP1ドメインと連結した人工ThエピトープUBITh(登録商標)(配列番号24)由来のTh部位により提供された外来性Thは、このエピトープを含まない構築物よりも中和効率を上昇させた。例えば、配列番号100は、配列番号99、98、97及び96と比較して、より良い中和活性を提供した。
iv.免疫原性は、組成物中に外来性Thエピトープを加えることによって、さらに増強された。
これらの結果に鑑み、アミノ酸129から169までの延長されたVP1標的部位を含む環状ペプチド(例えば配列番号99)に最も免疫増強効果があると結論付けた。
c.血清型特異的なVP1標的部位の設計
英国パーブライト(Pirbright, UK)の世界参考実験室(the world reference lab)により提供された、世界的なFMDVに対するFMDV配列データベースを検索して、血清型O、A、Asia、Cおよびその他に由来する亜型の様々なVP1ループドメイン(アミノ酸129〜169)を得た。その後、表2に示すように各位置の共通アミノ酸を設計した。一つの位置に複数のアミノ酸を有する、表8に示すようなコンビナトリアルライブラリー標的配列(配列番号101および102)も作製し、VP1ループドメインの抗原可変性がさらに広く包含された。
単一の共通配列(表11、配列番号25)を用いた免疫原性試験をコンビナトリアルライブラリーの標的(表10、配列番号98および99)を用いた免疫原性試験と比較すると、VP1ベースのELISAによる免疫原性の力価によって、およびそれぞれの血清型のFMDV株に対する中和指数によって判定されたように、共通配列は、これら二つのアプローチに対して、血清型がカバーする広さにわたって同じように有効であることがわかる(表10および11)。したがって、製造およびQCを容易にするため、標的のVP1部位を環化させた単一の共通配列と、地域的な必要性に基づいて特定の血清型から選択した幾つかの特定のVP1配列とを、配列番号2〜23および25〜33に示すように選択した。
英国パーブライト(Pirbright, UK)の世界参考実験室(the world reference lab)により提供された、世界的なFMDVに対するFMDV配列データベースを検索して、血清型O、A、Asia、Cおよびその他に由来する亜型の様々なVP1ループドメイン(アミノ酸129〜169)を得た。その後、表2に示すように各位置の共通アミノ酸を設計した。一つの位置に複数のアミノ酸を有する、表8に示すようなコンビナトリアルライブラリー標的配列(配列番号101および102)も作製し、VP1ループドメインの抗原可変性がさらに広く包含された。
単一の共通配列(表11、配列番号25)を用いた免疫原性試験をコンビナトリアルライブラリーの標的(表10、配列番号98および99)を用いた免疫原性試験と比較すると、VP1ベースのELISAによる免疫原性の力価によって、およびそれぞれの血清型のFMDV株に対する中和指数によって判定されたように、共通配列は、これら二つのアプローチに対して、血清型がカバーする広さにわたって同じように有効であることがわかる(表10および11)。したがって、製造およびQCを容易にするため、標的のVP1部位を環化させた単一の共通配列と、地域的な必要性に基づいて特定の血清型から選択した幾つかの特定のVP1配列とを、配列番号2〜23および25〜33に示すように選択した。
d.VP1の免疫原性を増強させるための潜在能力あるThエピトープの選択
以前の研究者たちは、VP121〜40エピトープのようなFMDV抗原内のTh部位を同定し、これらを合成VP1免疫原の設計に取り入れた。しかしながら、ブタおよびウシにおける免疫原性試験によれば、標的種ではこれらの***雑が制限されており、かつ遺伝的制限があるため、これらのFMDV内在性Th部位は、VP1免疫原性を増強させるために完全に有効ではないことがわかった。したがって、部分的に有効なFMDV Thエピトープを用いず、これをさらに潜在能力あるUBITh(登録商標)人工Thエピトープに置き換えて、FMDV VP1ループペプチド免疫原を増強させた。人工UBITh(登録商標)部位には、遺伝的に多様な集団の様々なT細胞応答性に適応するように設計されたコンビナトリアルライブラリーのThの位置のようなThモチーフが組み入れられている。このようなThエピトープの変更により、同種のFMDVに対する潜在的なメモリー応答(曝露された場合)は失われたが、より広く、さらに潜在能力ある免疫応答がもたらされた。人工UBITh(登録商標)配列(配列番号24)がもつ免疫効力は、ブタを含む複数の種において証明された。
以前の研究者たちは、VP121〜40エピトープのようなFMDV抗原内のTh部位を同定し、これらを合成VP1免疫原の設計に取り入れた。しかしながら、ブタおよびウシにおける免疫原性試験によれば、標的種ではこれらの***雑が制限されており、かつ遺伝的制限があるため、これらのFMDV内在性Th部位は、VP1免疫原性を増強させるために完全に有効ではないことがわかった。したがって、部分的に有効なFMDV Thエピトープを用いず、これをさらに潜在能力あるUBITh(登録商標)人工Thエピトープに置き換えて、FMDV VP1ループペプチド免疫原を増強させた。人工UBITh(登録商標)部位には、遺伝的に多様な集団の様々なT細胞応答性に適応するように設計されたコンビナトリアルライブラリーのThの位置のようなThモチーフが組み入れられている。このようなThエピトープの変更により、同種のFMDVに対する潜在的なメモリー応答(曝露された場合)は失われたが、より広く、さらに潜在能力ある免疫応答がもたらされた。人工UBITh(登録商標)配列(配列番号24)がもつ免疫効力は、ブタを含む複数の種において証明された。
表10に要約する、実験に用いた構築物として、人工UBITh(登録商標)部位(配列番号24)、スペーサとしてのイプシロンリジンおよびコンビナトリアルライブラリー(配列番号101および102)として設計された、血清型Oまたは血清型Asiaのいずれかのアミノ酸の位置134ないし169に由来する環状VP1標的部位が挙げられた。免疫化したモルモットの抗体および中和応答(中和指数として示す)によって示すように、両方の構築物は免疫原性であった。
表11は、共通O配列(配列番号25)と共に、イプシロンリジンスペーサを介してアミノ酸の位置129〜169由来の環状VP1標的部位に連結するUBITh(登録商標)部位(配列番号24)を有する、類似の血清型O免疫原に対するモルモットの応答性を示す。O共通配列を含むこのVP1構築物はまた、初回免疫後3週間という早期にみられる、潜在能力ある広範な中和抗体応答によって証明される、強い免疫原性も示した(表11)。
表11は、共通O配列(配列番号25)と共に、イプシロンリジンスペーサを介してアミノ酸の位置129〜169由来の環状VP1標的部位に連結するUBITh(登録商標)部位(配列番号24)を有する、類似の血清型O免疫原に対するモルモットの応答性を示す。O共通配列を含むこのVP1構築物はまた、初回免疫後3週間という早期にみられる、潜在能力ある広範な中和抗体応答によって証明される、強い免疫原性も示した(表11)。
e.予想外に広範囲の中和応答
表10および11に示すように、モルモット免疫血清の中和活性を分析すると、予想外に広範囲の中和が見られた。具体的には、配列番号101および25の血清型O免疫原によって二つのO亜型に対する中和抗体が誘発され、また、血清型AおよびAsiaに由来する亜型に対する中和もみられた。これらの結果は、UBITh(登録商標)FMDV免疫原では、個別の免疫原が複数の血清型に対して潜在的に広く有効であることを示唆している。
このように広範囲な血清型の中和は、表12に示す幾つかの免疫原(配列番号25、27、および28の三つのペプチド混合物を含むUBI FMDV Oワクチン)を単一のワクチン内に組み合わせた場合にもみられ、これによって免疫し、かつ負荷したブタの血清は、OTaiwan、OManisa、OCamposおよびOMyanmarに対する広い中和指数を呈した。
表10および11に示すように、モルモット免疫血清の中和活性を分析すると、予想外に広範囲の中和が見られた。具体的には、配列番号101および25の血清型O免疫原によって二つのO亜型に対する中和抗体が誘発され、また、血清型AおよびAsiaに由来する亜型に対する中和もみられた。これらの結果は、UBITh(登録商標)FMDV免疫原では、個別の免疫原が複数の血清型に対して潜在的に広く有効であることを示唆している。
このように広範囲な血清型の中和は、表12に示す幾つかの免疫原(配列番号25、27、および28の三つのペプチド混合物を含むUBI FMDV Oワクチン)を単一のワクチン内に組み合わせた場合にもみられ、これによって免疫し、かつ負荷したブタの血清は、OTaiwan、OManisa、OCamposおよびOMyanmarに対する広い中和指数を呈した。
f.ブタにおける免疫/負荷試験
標的種であるブタにおける別々の3回の免疫/負荷試験において、第1のユナイテッド・バイオメディカル社(UBI)FMDV用合成ペプチドワクチンであるUBITh(登録商標)FMDV−Oワクチンが、FMDV O1Taiwan株での感染負荷に対して防御的であることが証明された。試験は、台湾動物衛生研究所(National Institute of Animal Health,Taiwan:NIAHT)およびUSDAプラムアイランド動物疾病センター(Plum Island Animal Disease Center:PIADC)を含む別々の3施設で行われた。
これらの試験結果を表13にまとめる。第1群〜第4群は、UBITh(登録商標)FMDV−OConsensus(配列番号25、ペプチド2570)ワクチンを2回投与した。用量範囲は25、50、100ないし300μgであった(第1群〜第4群)。第5群〜第7群はプラセボコントロールとした。
標的種であるブタにおける別々の3回の免疫/負荷試験において、第1のユナイテッド・バイオメディカル社(UBI)FMDV用合成ペプチドワクチンであるUBITh(登録商標)FMDV−Oワクチンが、FMDV O1Taiwan株での感染負荷に対して防御的であることが証明された。試験は、台湾動物衛生研究所(National Institute of Animal Health,Taiwan:NIAHT)およびUSDAプラムアイランド動物疾病センター(Plum Island Animal Disease Center:PIADC)を含む別々の3施設で行われた。
これらの試験結果を表13にまとめる。第1群〜第4群は、UBITh(登録商標)FMDV−OConsensus(配列番号25、ペプチド2570)ワクチンを2回投与した。用量範囲は25、50、100ないし300μgであった(第1群〜第4群)。第5群〜第7群はプラセボコントロールとした。
すべてのブタの踵球内に、104.5TCID50のFMDV O1Taiwan(ウイルスは、ベビーハムスター腎臓細胞またはブタのいずれかにおいて増殖させた)を注射によって負荷した。ブタへの負荷は、最終免疫後、2〜10週間の間隔をおいて行った。UBITh(登録商標)によって免疫化した15頭のブタを含むすべてのブタは保護されていた。UBITh(登録商標)によって免疫化したブタの防御免疫は10週目まで持続した。中和抗体力価によって示されるように、実験的に免疫化したブタでは最終免疫後20週目まで防御免疫がみられるが、負荷していないブタではそうではないことも証明された。
ワクチン投与された動物はすべて中和抗体の血清濃度が高く、負荷から保護された。別々の3試験で用いたウイルス負荷用ストックの感染力は、プラセボを用いたブタの感染率が100%であることによって設定した。3試験すべての結果はこれに従って確認された。得られた結果に鑑みると、用量サイズ25μgのUBITh(登録商標)FMDV−OConsensus(配列番号25、ペプチド2570)ワクチンを用いてわずかに2回免疫化しただけで、完全な防御免疫が得られた(第1群)。
ワクチン投与された動物はすべて中和抗体の血清濃度が高く、負荷から保護された。別々の3試験で用いたウイルス負荷用ストックの感染力は、プラセボを用いたブタの感染率が100%であることによって設定した。3試験すべての結果はこれに従って確認された。得られた結果に鑑みると、用量サイズ25μgのUBITh(登録商標)FMDV−OConsensus(配列番号25、ペプチド2570)ワクチンを用いてわずかに2回免疫化しただけで、完全な防御免疫が得られた(第1群)。
g.負荷されたブタにおける防御免疫の範囲
別の負荷試験では、3種のVP1 O構築物(それぞれ配列番号25、27および28によって表される2570a 共通、Oozk/93、OMyanmar株由来の配列を含む)を同量で含むUBITh(登録商標)FMDV Oワクチンを投与あたり25μg用い、0週目および3週目において2回投与した。6頭のブタはすべてが同じようにFMDV O1Taiwanを負荷され、すべてが保護された。負荷試験のために免疫化した6頭のブタから血清を回収し、広く流行しているFMDV Oの亜型である、O1Taiwan、OManisa、OMyanmarおよびOcamposに対する中和抗体について調べた(表12)。すべてのブタは、OManisa、OMyanmarおよびOcamposに対しても強い中和応答を示す、安定した免疫(solid immunity)としてふさわしい程度のO1Taiwanに対する中和抗体を産生していることから、血清型Oの亜型全体に対する防御免疫の傾向が示唆される。
別の負荷試験では、3種のVP1 O構築物(それぞれ配列番号25、27および28によって表される2570a 共通、Oozk/93、OMyanmar株由来の配列を含む)を同量で含むUBITh(登録商標)FMDV Oワクチンを投与あたり25μg用い、0週目および3週目において2回投与した。6頭のブタはすべてが同じようにFMDV O1Taiwanを負荷され、すべてが保護された。負荷試験のために免疫化した6頭のブタから血清を回収し、広く流行しているFMDV Oの亜型である、O1Taiwan、OManisa、OMyanmarおよびOcamposに対する中和抗体について調べた(表12)。すべてのブタは、OManisa、OMyanmarおよびOcamposに対しても強い中和応答を示す、安定した免疫(solid immunity)としてふさわしい程度のO1Taiwanに対する中和抗体を産生していることから、血清型Oの亜型全体に対する防御免疫の傾向が示唆される。
h.反芻動物における免疫原性
UBITh(登録商標)FMDV−O OConsensus(配列番号25、ペプチド2570)ワクチンの免疫原性を、反芻動物種において、12頭のヤギに対する免疫原性試験によって示した。ヤギは、0週目及び8週目の2回投与、または0、4及び8週目の3回投与のいずれかで、免疫化した。用量は、30μg、100μg、又は300μgであった。有効性は、FMDV O1Taiwanに対する中和抗体の血清濃度を測定することによって評価した。防御効果が予想される中和抗体濃度は、8週目の最終免疫後12週間(すなわち試験期間の20週間を通して)得られた。2回投与および3回投与スケジュールの双方は同程度に有効であり、30μg用量は300μg用量と同様に有効であった。このように、ブタにおける防御免疫のために使用した用量サイズおよびワクチン製剤と同じものを用いて、2回投与又は3回投与のUBITh(登録商標)FMDV−Oワクチンを標的となる反芻動物種に投与した際に、免疫原性がみられた。
UBITh(登録商標)FMDV−O OConsensus(配列番号25、ペプチド2570)ワクチンの免疫原性を、反芻動物種において、12頭のヤギに対する免疫原性試験によって示した。ヤギは、0週目及び8週目の2回投与、または0、4及び8週目の3回投与のいずれかで、免疫化した。用量は、30μg、100μg、又は300μgであった。有効性は、FMDV O1Taiwanに対する中和抗体の血清濃度を測定することによって評価した。防御効果が予想される中和抗体濃度は、8週目の最終免疫後12週間(すなわち試験期間の20週間を通して)得られた。2回投与および3回投与スケジュールの双方は同程度に有効であり、30μg用量は300μg用量と同様に有効であった。このように、ブタにおける防御免疫のために使用した用量サイズおよびワクチン製剤と同じものを用いて、2回投与又は3回投与のUBITh(登録商標)FMDV−Oワクチンを標的となる反芻動物種に投与した際に、免疫原性がみられた。
i.知見についての結論および解釈
上述の実験から得られた結果は以下のように要約することができる:
3か所の国際的研究施設にて4実験群によって行われた試験によれば、UBITh(登録商標)FMDV VP1ベースのOワクチン(配列番号25)は、投与あたり25、50、100および300μg用いて2回免疫化した後で、このワクチンを投与されたブタを全て(15/15)、FMDV OTaiwanの負荷から効果的に保護した。コントロール動物は全て(10/10)、ウイルス負荷の2日目までに感染した。
VP1 O構築物の混合物を含むUBITh(登録商標)FMDV Oワクチン(同じ比率の配列番号25、27および28を、投与あたり25μg、初回免疫後0週目および3週目に2回投与した)は、ブタにおいて、OTaiwan、OCampos、OMyanmarおよびOManisaを含む複数のFMDV O単離株に対して広範な防御作用を示す中和抗体を誘発した。
上述の実験から得られた結果は以下のように要約することができる:
3か所の国際的研究施設にて4実験群によって行われた試験によれば、UBITh(登録商標)FMDV VP1ベースのOワクチン(配列番号25)は、投与あたり25、50、100および300μg用いて2回免疫化した後で、このワクチンを投与されたブタを全て(15/15)、FMDV OTaiwanの負荷から効果的に保護した。コントロール動物は全て(10/10)、ウイルス負荷の2日目までに感染した。
VP1 O構築物の混合物を含むUBITh(登録商標)FMDV Oワクチン(同じ比率の配列番号25、27および28を、投与あたり25μg、初回免疫後0週目および3週目に2回投与した)は、ブタにおいて、OTaiwan、OCampos、OMyanmarおよびOManisaを含む複数のFMDV O単離株に対して広範な防御作用を示す中和抗体を誘発した。
UBITh(登録商標)FMDV Oワクチンは、反芻動物種であるヤギにおいて、ブタと同等の免疫原性を示した。この結果は、本UBI製剤が、ブタにおける免疫原性の用量範囲と同程度の用量範囲においてウシにも有効であることを予想させるものである。
個々のUBITh(登録商標)合成FMDV免疫原は、モルモットにおいて、血清型A、OおよびAsia 1に対する中和抗体を同時に誘発した。これらから、複数の血清型にわたる予想外に広範囲の潜在的な有効性が示された。
血清型OConsensus配列を用いたUBITh(登録商標)FMDV Oペプチドは、中和指数により測定した、血清型A、Asia 1およびOに由来する亜型を含む複数の血清型に対する中和抗体を誘発することができる。
個々のUBITh(登録商標)合成FMDV免疫原は、モルモットにおいて、血清型A、OおよびAsia 1に対する中和抗体を同時に誘発した。これらから、複数の血清型にわたる予想外に広範囲の潜在的な有効性が示された。
血清型OConsensus配列を用いたUBITh(登録商標)FMDV Oペプチドは、中和指数により測定した、血清型A、Asia 1およびOに由来する亜型を含む複数の血清型に対する中和抗体を誘発することができる。
UBITh(登録商標)FMDVワクチン免疫原は、「機能的部位」を標的とした、事実上の合成品である。処方されたワクチンは安全、潜在能力があり、広範囲に中和可能、再現可能、かつ安定であるため、産生および品質管理に関連した困難および従来の死滅ウイルスによるワクチンにみられる不都合が回避される。
完璧に安全で化学的に規定されたワクチンが利用できることにより、FMDが発生していない状態に近い地域であっても、ワクチン接種の奨励によってFMDVの根絶が促進される。
完璧に安全で化学的に規定されたワクチンが利用できることにより、FMDが発生していない状態に近い地域であっても、ワクチン接種の奨励によってFMDVの根絶が促進される。
実施例7
FMDVペプチドベースの多価ワクチンを地域的な必要性に合わせるための鍵となる成分である、合成FMDVペプチド免疫原のペプチドホモログ
***ワクチンは、家畜に関する生物学的事業全体の売上げの26.4%と、伝統的に世界中の獣医学ワクチン市場の最も大きなシェアを占める。FMDV血清型および亜型の高い可変性のため、伝統的なウイルスライセートベースのFMDワクチンの抗原組成物は、世界の特定の地域、多くの場合にはその中の特定の国または地域に適合される。現在、FMD流行地におけるワクチンの使用には、(1)標的地域に広まっている単数または複数の株に対してワクチンが有効であるか否かを決定するため、および(2)ワクチンの実際の特性が制御と根絶に適していることを保証するために、疾病疫学の詳細な検討およびワクチンの協調性試験が必要とされる。
FMDVペプチドベースの多価ワクチンを地域的な必要性に合わせるための鍵となる成分である、合成FMDVペプチド免疫原のペプチドホモログ
***ワクチンは、家畜に関する生物学的事業全体の売上げの26.4%と、伝統的に世界中の獣医学ワクチン市場の最も大きなシェアを占める。FMDV血清型および亜型の高い可変性のため、伝統的なウイルスライセートベースのFMDワクチンの抗原組成物は、世界の特定の地域、多くの場合にはその中の特定の国または地域に適合される。現在、FMD流行地におけるワクチンの使用には、(1)標的地域に広まっている単数または複数の株に対してワクチンが有効であるか否かを決定するため、および(2)ワクチンの実際の特性が制御と根絶に適していることを保証するために、疾病疫学の詳細な検討およびワクチンの協調性試験が必要とされる。
分子ウイルス学の登場により、***ウイルスのカプシドタンパク質VP1配列の大部分は、全国的調査の実施に従って提出されたFMDの症例の組織サンプル、ならびにFMDVの大流行時に採取した複数の組織およびプロバング(probang)サンプルより得たウイルス単離株から、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって容易に増幅できる。同定されたVP1配列は、アラインメントに用いることができる。アラインメントには、指定されたその他の単離株に遺伝的関連をもつ血清型の配列が含まれる。標的地域に広まっている単数または複数の株のVP1配列は、本発明の開示において確立されたアミノ酸のフレーム構造(VP1 129〜168)、ならびにFMDVが大流行している地域で同定されたVP1配列を表す、このフレーム構造に対するペプチドホモログ(表2、配列番号2〜23)およびこのように設計されたVP1ペプチドホモログ(表3、配列番号25〜33)に基づいて容易に取得することができ、これらのVP1配列をワクチン製剤に含有させて特定地域の必要性に適合させることで、制御および根絶のために確実に適したものとすることができる。
2以上の投薬を投与した際に鍵となる成分である、合成FMDVペプチド免疫原に由来するペプチドホモログを含有する特定の製剤(VP1 aal29ないしaal68を有する)としては、表14に示す以下の例が挙げられる。
(a)ペプチドホモログ(配列番号25)を有する一価ブタFMDV血清型Oワクチン、
(b)2種のペプチドホモログ(配列番号25及び28)を等重量比で混合した二価ブタFMDV血清型Oワクチン、
(c)3種のペプチドホモログ(配列番号25、27及び28)を等重量比で混合した三価ブタFMDV血清型Oワクチン、
(d)アジアにおいて使用するため、2種のペプチドホモログ(配列番号25及び29)を等比で混合した二価ウシ/反芻動物FMDV血清型O及びAsia 1ワクチン、
(e)中国において使用するため、等比で混合した三価ウシ/反芻動物FMDV血清型O、Asia 1JiansuおよびAGansuワクチン(配列番号25、29及び31)、
(f)ブラジルにおいて使用するため、等比で混合した三価ウシ/反芻動物FMDV血清型OCampos、A24及びCIndaialワクチン(配列番号26、30及び32)、
(g)アルゼンチンにおいて使用するため、等比で混合した三価ウシ/反芻動物FMDV血清型OCampos、A24/Argentina 2001およびCIndaialワクチン(配列番号26、30、33及び32)。
(a)ペプチドホモログ(配列番号25)を有する一価ブタFMDV血清型Oワクチン、
(b)2種のペプチドホモログ(配列番号25及び28)を等重量比で混合した二価ブタFMDV血清型Oワクチン、
(c)3種のペプチドホモログ(配列番号25、27及び28)を等重量比で混合した三価ブタFMDV血清型Oワクチン、
(d)アジアにおいて使用するため、2種のペプチドホモログ(配列番号25及び29)を等比で混合した二価ウシ/反芻動物FMDV血清型O及びAsia 1ワクチン、
(e)中国において使用するため、等比で混合した三価ウシ/反芻動物FMDV血清型O、Asia 1JiansuおよびAGansuワクチン(配列番号25、29及び31)、
(f)ブラジルにおいて使用するため、等比で混合した三価ウシ/反芻動物FMDV血清型OCampos、A24及びCIndaialワクチン(配列番号26、30及び32)、
(g)アルゼンチンにおいて使用するため、等比で混合した三価ウシ/反芻動物FMDV血清型OCampos、A24/Argentina 2001およびCIndaialワクチン(配列番号26、30、33及び32)。
最終的なワクチン製剤に使用するために設計したペプチドホモログの適合性は、相対的な免疫原性および異なる単離株に由来するFMDV VP1抗原への交差反応性を、実施例1に記載するように特異的なFMDV VP1配列ベースのペプチドELISAを用いて検出することによって評価できる。
表15〜表17に示すように、VP1ホモログベースのワクチン製剤(a)〜(g)(配列番号25〜33のホモログを含有する)は、特定の地域的な必要性(例えば中国、東南アジア、ブラジルおよびアルゼンチン)を満たすものである。具体的には、これらの製剤によって、標的の血清型(例えばOTaiwan、OCampos、OOzk、OMyanmar、Asia 1、AGansu、A24、AArgentina 2001、CIndaial)のVP1配列に対する所望の免疫原性が提供される。また、限定はされないが血清型OTaiwanを含む標的の血清型に対する中和抗体の誘発能によって示されるように、これらのFMDVワクチン製剤には機能的な免疫原性も観察された(実施例6、表12に記載される)。ワクチン製剤中に使用された、FMDV中和抗体を誘導するVP1ベースのB細胞成分の総量は、免疫スケジュールにおいて2回投与を行う際、投与あたり25μgという低量であってよい。
表15〜表17に示すように、VP1ホモログベースのワクチン製剤(a)〜(g)(配列番号25〜33のホモログを含有する)は、特定の地域的な必要性(例えば中国、東南アジア、ブラジルおよびアルゼンチン)を満たすものである。具体的には、これらの製剤によって、標的の血清型(例えばOTaiwan、OCampos、OOzk、OMyanmar、Asia 1、AGansu、A24、AArgentina 2001、CIndaial)のVP1配列に対する所望の免疫原性が提供される。また、限定はされないが血清型OTaiwanを含む標的の血清型に対する中和抗体の誘発能によって示されるように、これらのFMDVワクチン製剤には機能的な免疫原性も観察された(実施例6、表12に記載される)。ワクチン製剤中に使用された、FMDV中和抗体を誘導するVP1ベースのB細胞成分の総量は、免疫スケジュールにおいて2回投与を行う際、投与あたり25μgという低量であってよい。
実施例8
VP1タンパク質に由来するB細胞エピトープクラスターペプチドのみを含むFMDVワクチン製剤は、FMDVウイルス負荷に対し、単回投与による緊急ワクチンとしては不適である。
実施例7に記載するように、合成FMDペプチドホモログを含む特定の製剤を調製した。これらの製剤は、ブタ及びウシ/反芻動物のFMDVワクチンにおいて2回以上を投与した後、FMDV中和免疫応答を誘発することができた。しかしながらこれらの製剤は、OIEのウイルス負荷手順によって要求されているように、製剤の単回投与によってFMDVウイルス負荷からブタおよびウシを一貫して保護することはできない。これらの製剤は、単回投与によってFMDV負荷から動物を完全に保護することができないため、VP1ペプチドホモログベースのFMDVワクチン製剤を商品化することへのハードルは高い。
VP1タンパク質に由来するB細胞エピトープクラスターペプチドのみを含むFMDVワクチン製剤は、FMDVウイルス負荷に対し、単回投与による緊急ワクチンとしては不適である。
実施例7に記載するように、合成FMDペプチドホモログを含む特定の製剤を調製した。これらの製剤は、ブタ及びウシ/反芻動物のFMDVワクチンにおいて2回以上を投与した後、FMDV中和免疫応答を誘発することができた。しかしながらこれらの製剤は、OIEのウイルス負荷手順によって要求されているように、製剤の単回投与によってFMDVウイルス負荷からブタおよびウシを一貫して保護することはできない。これらの製剤は、単回投与によってFMDV負荷から動物を完全に保護することができないため、VP1ペプチドホモログベースのFMDVワクチン製剤を商品化することへのハードルは高い。
すべてのVP1ホモログベースのワクチン製剤における中和抗体発生の動態についての詳細な検討により、中和抗体力価は、単回投与後4週目まで低いままであるか、またはバックグラウンド力価(<=3)に近いことが明らかになった(図3Aおよび3B)。ブタ及びウシの双方の中和抗体力価は、初回投与後4週目に行った2回目の投与後、6週目に著しく上昇した(図3A及び3B、並びに表15〜表17)。高力価の中和抗体の産生が遅延することにより、VP1ベースのペプチドワクチンにおいて特定の免疫応答要素が欠如(又は量が減少)していることが示唆される。このような要素の欠如/減少は、緊急ワクチンとしての防御作用を増大することが可能な、FMDVウイルスライセートベースのワクチンにみられると考えられる。
単回投与後の完全な防御免疫反応に必要とされる、ウイルスへの曝露後にウイルス複製を著しく減少させる刺激および迅速な想起応答は、VP1ホモログベースのワクチン製剤にはない要素であると考えられる。外来性のUBITh(登録商標)エピトープがVP1ペプチドホモログと連結している場合、図3A及び3B並びに表15〜表17に示す中和抗体力価の著しい上昇によって証明されるように、2回投与以上の使用後に強力なヘルパーT応答が引き起こされる。しかしながら、緊急ワクチンは、ワクチン製剤の単回投与後に動物の免疫系を迅速かつ十分に刺激して、ウイルス負荷後に素早く想起応答を起こすことに効果的でなければならない。
以下の実施例に、FMDVに由来するBおよびTエピトープの複数成分を含有するワクチン製剤の使用によって、即効型のT細胞応答を評価する実験について記載する。
実施例9
単回投与緊急ワクチンのための、BおよびTエピトープベースの複数成分FMDVワクチン製剤の原理、スクリーニング、同定および最適化
実施例8に記載したように、FMDV VP1由来のB細胞エピトープクラスターペプチドのみの組み合わせを用いた緊急FMDワクチン製剤の開発が繰り返し試みられてきたが、単回投与での初回免疫後3ないし4週目に、高力価の中和抗体を常に産生させることはできなかった。このように、これらの製剤によって、FMDVを負荷された動物を保護することはできなかった。高い効力をもつ緊急FMDワクチンの開発を成功させるために必要な免疫学的要素を同定するために、さらなる努力が為されてきた。
単回投与緊急ワクチンのための、BおよびTエピトープベースの複数成分FMDVワクチン製剤の原理、スクリーニング、同定および最適化
実施例8に記載したように、FMDV VP1由来のB細胞エピトープクラスターペプチドのみの組み合わせを用いた緊急FMDワクチン製剤の開発が繰り返し試みられてきたが、単回投与での初回免疫後3ないし4週目に、高力価の中和抗体を常に産生させることはできなかった。このように、これらの製剤によって、FMDVを負荷された動物を保護することはできなかった。高い効力をもつ緊急FMDワクチンの開発を成功させるために必要な免疫学的要素を同定するために、さらなる努力が為されてきた。
市販のFMDウイルスライセートベース緊急ワクチンは、ブタナイーブγδT細胞の増殖を誘導し、これらのブタナイーブγδT細胞は、FMDワクチンウイルス抗原への曝露後に様々なサイトカイン/ケモカインmRNAを発現する。効力の高い緊急FMDワクチンを投与された動物にみられる明らかな変化のひとつは、IFN−γを含むサイトカインの高濃度な全身的産生である(Cox 2003)。FMDウイルスの負荷から回復した直後の、FMDにより免疫されたブタ(ワクチン投与され、ウイルスを負荷された動物)から得たPBLをインビトロでFMDV抗原によって刺激すると、増殖している亜集団は主にγδT細胞であったことから、このようなγδT細胞の増殖が、特定のウイルス感染の特徴であることが示唆された。γδT細胞とMHCクラスII+CD4+T細胞との間の、細胞と細胞の直接の相互作用が、はっきりとしたシナプス形成を示す細胞クラスターとして観察され、このような相互作用によりもたらされるT細胞の増殖は、MHCクラスIIおよびCD4に対するモノクローナル抗体によって遮断できることから、MHCクラスIIを介したγδT細胞による抗原提示能が示唆される(Takamatsu 2002)。炎症および差次的なサイトカイン産生の誘導に対するγδT細胞の関与によって、自然免疫および獲得免疫応答の両方を免疫調節および制御する、γδT細胞の重要な役割が明らかになった。これらの細胞は、専門的な抗原提示細胞(Antigen Presenting Cells:APC)としての特色を有し得る。γδT細胞は、ウイルスライセートベースの、効力の高い緊急FMDワクチン中のFMDV抗原に対する迅速な免疫応答に関わることから重要であり、FMDV内在性Thエピトープクラスターペプチドを介したT細胞活性化の指標としてのIFN−γ産生をインビトロ測定することを通して、本発明者らによる合成ペプチドベースの、効力の高い緊急FMDワクチン中に1以上のFMDV内在性Tエピトープクラスターペプチドを含めるための設計、スクリーニングおよび選択について広く評価することが促される。
実施例3に詳述する特異的なT細胞機能アッセイは、(a)FMDVウイルスライセートワクチンおよび(b)候補となるFMDV Thペプチドを含むペプチド製剤によって免疫化した宿主に由来するブタおよびウシのT細胞によって認識される、FMDVタンパク質VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、3A、3Bおよび3Dの抗原性部分に由来するFMDV内在性Thエピトープクラスターペプチドをスクリーニングおよび同定するために用いた。
a.免疫T細胞活性化開始の指標としてのIFN−γ産生をインビトロ測定することによる、ブタおよびウシにおけるFMDV内在性Thクラスターペプチドの同定
インビトロ刺激の際、FMDV内在性Thエピトープペプチドを含む製剤で免疫化した動物から得たT細胞はIFN−γを放出し、FMDV中和抗体の産生を一貫して増大した。このようなアッセイの再現は非常に容易であるため、効力を評価するための確実なスクリーニングアッセイとして、かつ最終的なFMDVワクチン製剤中に含有させるFMDV内在性Thエピトープクラスターを同定するために用いられている。
インビトロ刺激の際、FMDV内在性Thエピトープペプチドを含む製剤で免疫化した動物から得たT細胞はIFN−γを放出し、FMDV中和抗体の産生を一貫して増大した。このようなアッセイの再現は非常に容易であるため、効力を評価するための確実なスクリーニングアッセイとして、かつ最終的なFMDVワクチン製剤中に含有させるFMDV内在性Thエピトープクラスターを同定するために用いられている。
T細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の設計は、最初に、FMDV OTaiwanウイルスライセートワクチンによって免疫し、後に負荷を行って回復したブタおよび雌ウシから得た末梢血単核細胞(PBMCs)を培養した際にIFN−γ応答を誘導する、MHCクラスII結合モチーフのクラスター配列を有するペプチドを試験することによって行った。このスクリーニングにより、低い、中程度のおよび高いIFN−γ産生を誘導するペプチドを、さらなるスクリーニングおよびこれを含有するワクチン製剤の設計のために群分けした。図1は、実施例1および3に記載する方法によって同定し、次にワクチン製剤へ応用したFMDV VP4、VP2、VP3、VP1、2B、2C、3A、3B、3Cおよび3Dタンパク質上の、選択したB細胞および内在性T細胞エピトープの分布/局在を示す。
FMDV OTaiwan99株に由来するT細胞エピトープクラスターペプチドそれぞれの配列を表4に同定した(配列番号34〜63)。FMDV Thペプチドを、表5に示すように(配列番号64〜78)、その他のFMDV株由来の相同なFMDVヘルパーTエピトープ配列とのアラインメントを行った。個々のヘルパーTペプチド免疫原のN末端に三つのリジン残基(KKK)を付加し、どちらかといえば疎水性であるこれらのペプチド抗原の溶解度を改善した。同定したThペプチド免疫原の幾つかまたはすべて(配列番号34〜87)を同じ重量比で含むT細胞クラスターペプチドのプールを、ワクチン製剤中のVP1ペプチドホモログの混合物に添加して、ブタおよびウシ両方における、FMDV B細胞クラスターペプチド免疫原の免疫原性をさらに増大させた。これらのワクチン製剤は、単回投与後のインビボ保護効率の目安として0週目および3週目の中和抗体力価をインビトロ測定/評価する、大規模な実験に用いた(表18、19)。これらのプールしたFMDV Thペプチドは、細胞介在性免疫のためのFMDV T細胞ペプチド免疫原としても作用することができる。
多様な遺伝的背景を有する動物に対してT細胞エピトープがカバーする範囲をさらに広げるため、9種のTエピトープ特異的な相同配列(表19、第7群、配列番号79〜87)それぞれに基づいたコンビナトリアルペプチドも設計した。同様に、三つのリジン残基(KKK)をコンビナトリアルTエピトープクラスターペプチド免疫原それぞれのN末端に付加し、さらなる製剤使用のために水溶性を改善した。これらのTエピトープクラスターコンビナトリアルペプチド免疫原のプールもまた、FMDV VP1 B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の免疫原性をさらに増強させるたためにワクチン製剤の補助剤(supplement)として用いるか、それ自体で細胞介在性免疫のためのFMDV T細胞ペプチド免疫原として用いた(表19)。
広範な試験を通して得た好ましいFMDV内在性Thクラスターペプチドのリストは、ブタに対しては配列番号61〜63、ウシに対しては配列番号34〜60である。これらの短いペプチドは、ThエピトープクラスターペプチドのN末端にリジン残基(例えばKKK)を付加して可溶性にすることができる。これらのペプチドの免疫原性は、コンビナトリアルライブラリー配列の設計に用いた単数または複数の血清型(例えばO、Asia 1、A、C、など)に基づく各Thエピトープを用いてコンビナトリアルペプチド配列を作製すること、およびFMDV Th構築物の結合体として、カセット型内にある選択した個々のFMDV Thクラスターペプチド(単一配列またはコンビナトリアル配列として)をUBITh(登録商標)エピトープ(配列番号24)へさらに連結させることによって増大させることができる。これらの特色を含む代表的な配列を、表7に配列番号88〜95として示す。
ウシの特に多様な遺伝的背景のため、最適化されたFMDV BエピトープクラスターVP1ペプチドを既に含んでいるワクチン製剤を投与された動物において、抗原特異的なT細胞応答を開始させることのできるペプチドの大きなプールに由来する予め選択したFMDV内在性Thペプチドの様々な組み合わせによる一般的な免疫原性を試験した(表19)。このようなワクチン製剤を単回投与された動物における抗原特異的なT細胞応答の開始能は、ブタおよびウシの両方において中和抗体の力価を著しく上昇させることの可能なワクチンによって例証される(表18及び表19)。FMDV内在性Thエピトープクラスターペプチドを含まない状態では、VP1ペプチド免疫原ホモログのみを含有する各ワクチン製剤による初回免疫後0週目および3週目に上昇する中和抗体の力価は無視できる程度のものである(すなわち<=3)(図3A及び表3B)。
(1)血清型O由来のFMDV VP1 B免疫原(配列番号25);(2)設計した10(重量)%のFMDV Thエピトープペプチド構築物(配列番号90);及び(3)UBITh(登録商標)に連結したカセット型内の、3種のブタFMDV Thエピトープ(配列番号24);を含む、単純なFMDVワクチン製剤を調製した、この製剤をブタに単回投与し、インビトロではPBMCに対し、インビボでは血清に対して、IFN−γの濃度を4週間、定量ELISAアッセイにより(実施例3に記載するように)測定した。図4Aおよび4Bに示すように、本試験では免疫後にIFNγの産生増大が観察された。
この知見により、選択したFMDV内在性Thエピトープクラスターペプチドが免疫直後の宿主のT細胞を刺激することをさらに確認した。自然感染または負荷試験のいずれかによってFMDVに曝露された後、曝露されたウイルス抗原は、以前にFMDVワクチンヘルパーTペプチド抗原によって刺激されたメモリーT細胞を介した抗原特異的T細胞応答を開始させる。FMDV VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3Bおよび3Dタンパク質上に存在する、注意深く選択されたこれらの免疫優性Thエピトープは、FMDVに関連したTh細胞を前もって刺激し(priming)、各ワクチン製剤の単回投与後に、免疫された宿主がFMDVに曝露された際に著しいリンパ球増殖応答を誘導して、IFN−γを含むサイトカインを産生する。サイトカインは、動物の様々な細胞壊死性のウイルス感染に対する細胞介在性免疫応答において重要な役割を果たすことが知られている。
b.中和アッセイにより測定した、ブタ及びウシの双方における緊急ワクチンとしての使用に最も最適化したワクチン製剤の同定
ワクチン化及び負荷した動物におけるFMDVに対するリンパ球増殖応答は一般に、FMDV内在性Thエピトープクラスターペプチドを含むワクチン製剤に対して、それを含まない製剤に対してよりも著しく高いことが見出された。特異的なT細胞エピトープをペプチド製剤に含ませることによって、ウイルスに遭遇した際に提示されるウイルスエピトープをさらに効率的に認識可能なT細胞を刺激する(priming)ことができる。
ワクチン化及び負荷した動物におけるFMDVに対するリンパ球増殖応答は一般に、FMDV内在性Thエピトープクラスターペプチドを含むワクチン製剤に対して、それを含まない製剤に対してよりも著しく高いことが見出された。特異的なT細胞エピトープをペプチド製剤に含ませることによって、ウイルスに遭遇した際に提示されるウイルスエピトープをさらに効率的に認識可能なT細胞を刺激する(priming)ことができる。
IFN−γはマクロファージの主要な活性化因子であり、その抗菌活性および抗原をプロセシングしてTリンパ球に提示する能力を増大させる。IFN−γは、抗原提示細胞のMHC発現を刺激して、FMDV複製を効果的に阻害することが報告されている。このように、これらの初期活性化の機構は、単回投与による緊急ワクチンに必要な、FMDVに対する防御免疫反応の誘導に関連するものである。FMDV内在性Thエピトープクラスターペプチドの存在によって、FMDV VP1反応性B細胞が活性化され、迅速なB細胞増殖および抗体の産生が誘導される。これらのFMDV内在性ThエピトープクラスターペプチドはヘルパーT細胞も活性化し、サイトカインを分泌させて環境をB細胞メモリーの生成に適したものとする。これらの知見により、FMDV VP1 Bペプチドおよび内在性Thペプチドの組み合わせがVP1 Bペプチド単独と比較してより良い臨床的防御をもたらすことは、さらに効率的なリンパ球増殖応答およびIFNγの放出によるものであり、初期現象の一部として、中和抗体も高い力価でより良く誘導されることが示唆される。
緊急ワクチンに必要とされる、インビボにおけるこのような初期の防御免疫反応の誘導に最も適したワクチン製剤をスクリーニングするために、標準的な中和アッセイを用いた。ワクチン投与したブタ(表18)およびウシ(表19)の、初回免疫から3週間後に採取した血清を評価した。中和抗体アッセイは、官公庁によっては緊急FMDVワクチンの発売基準の一部として要求される、高価で面倒な物理的負荷試験に代える代替アッセイとして用いられてきたため、FMDV VP1に由来するBおよび内在性Thエピトープクラスターペプチドの様々な組み合わせ及び様々な比を用いる多くのFMDVワクチン製剤での体系的試験を行い、実施例2に簡単に記載したこの代替中和抗体アッセイによる、それぞれの保護効率について評価した。
具体的には、それぞれ8〜12週齢および6〜12か月齢のブタおよびウシについて、1群あたり3頭〜5頭のFMDVフリーの動物を、0週目に複数成分のBおよびTエピトープペプチドベースのFMDVワクチン製剤の様々な組み合わせによって免疫化し、単回投与後に血清を採取して中和抗体力価を測定した。
1.ブタ
ブタにおける試験に用いた、13群の動物より得たデータを表18に示す。これらの実験に用いた製剤は、以下に記載するように調製した。すべてのブタは、ワクチン製剤として1mLの乳剤を用いて免疫化した。
第1群:プロトタイプFMDV VP1 OConsensusペプチド(配列番号25)のみを含んだ。
第2群〜第4群:等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド(例えば配列番号34〜63、配列番号61〜63、または配列番号90)を組み合わせたプロトタイプFMDV VP1 OConsensusペプチド(配列番号25)の、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤25+2.5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、調製した。
ブタにおける試験に用いた、13群の動物より得たデータを表18に示す。これらの実験に用いた製剤は、以下に記載するように調製した。すべてのブタは、ワクチン製剤として1mLの乳剤を用いて免疫化した。
第1群:プロトタイプFMDV VP1 OConsensusペプチド(配列番号25)のみを含んだ。
第2群〜第4群:等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド(例えば配列番号34〜63、配列番号61〜63、または配列番号90)を組み合わせたプロトタイプFMDV VP1 OConsensusペプチド(配列番号25)の、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤25+2.5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、調製した。
第5群〜第7群:FMDVワクチンB細胞成分として、等重量比で総量25μg/mLのFMDV VP1 OConsensus(配列番号25)およびOOzk(配列番号28)に、その各々に等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド(例えば配列番号34〜63、配列番号61〜63、または配列番号90)を追加し、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤25+2.5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、免疫化した。
第8群〜第10群:FMDVワクチンB細胞成分として、等重量比で総量25μg/mLのFMDV VP1 OConsensus(配列番号25)、OOzk(配列番号28)およびOMyanmar(配列番号27)に、その各々に等重量比の混合物である配列番号34〜63、配列番号61〜63および配列番号90の内在性FMDV Thペプチドを追加し、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤25+2.5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、免疫化した。
第11群〜第13群:FMDVワクチンB細胞成分として、等重量比で総量25μg/mLのFMDV VP1 OConsensus(配列番号25)、OOzk(配列番号28)、OMyanmar(配列番号27)、およびAsia 1Jiangsu(配列番号29)に、その各々に等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド(例えば配列番号34〜63、配列番号61〜63および配列番号90)を追加し、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤25+2.5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、免疫化した。
要約すると、それぞれの試験を様々な時点で開始する際、0週目においてすべてのブタはFMDV抗体を有していなかった。様々なFMDV VP1に由来するBおよび内在性Thエピトープクラスターペプチドを含有する複数成分のFMDVワクチン製剤の単回投与によって、標的ペプチド(または標的ペプチドの一つ)であるOConsensus(配列番号25)に対する著しい量の抗体産生が誘発され、ELISAによるLog10力価は2〜3(すなわち10E2〜10E3)であった。
2.ウシ
ウシにおける試験に用いた、1群あたり3頭、総数32群の動物より得たデータを表19に示す。これらの実験に用いた製剤は、以下に記載するように調製した。すべてのウシは、ワクチン製剤として2mLの乳剤を用いて免疫化した。
第1群〜第8群は、プロトタイプFMDV VP1 OConsensusペプチド(配列番号25)を、それぞれに等重量比の混合物である、内在性FMDV Thペプチド、例えば、すべて等重量比の配列番号34〜63(30種のTh);配列番号34〜39、44、46〜51、53〜63(24種のTh);配列番号34〜39、44、46〜51、53〜60(21種のTh);配列番号34、36、37、40〜43、45、48、52、53、60〜63(15種のTh);配列番号34、36、37、48、50、53(6種のTh);配列番号62〜78(17Thホモログ);配列番号79〜87(9Thの短いライブラリー);および配列番号88、89(2種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);を組み合わせて、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤50+5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、調製した。
ウシにおける試験に用いた、1群あたり3頭、総数32群の動物より得たデータを表19に示す。これらの実験に用いた製剤は、以下に記載するように調製した。すべてのウシは、ワクチン製剤として2mLの乳剤を用いて免疫化した。
第1群〜第8群は、プロトタイプFMDV VP1 OConsensusペプチド(配列番号25)を、それぞれに等重量比の混合物である、内在性FMDV Thペプチド、例えば、すべて等重量比の配列番号34〜63(30種のTh);配列番号34〜39、44、46〜51、53〜63(24種のTh);配列番号34〜39、44、46〜51、53〜60(21種のTh);配列番号34、36、37、40〜43、45、48、52、53、60〜63(15種のTh);配列番号34、36、37、48、50、53(6種のTh);配列番号62〜78(17Thホモログ);配列番号79〜87(9Thの短いライブラリー);および配列番号88、89(2種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);を組み合わせて、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤50+5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、調製した。
第9群〜第11群は、FMDVワクチンB細胞成分として等重量比で総量50μg/mLのFMDV VP1 OConsensus(配列番号25)、OOzk(配列番号28)およびOMyanmar(配列番号27)のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号88、89(2種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);配列番号91、92(2種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);配列番号91、93〜95(4種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);および配列番号34、36、37、40〜43、45、48、52、53、60〜63(15種のTh);を追加して、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤50+5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤2mLで免疫化した。
第12群〜第16群は、FMDVワクチンB細胞成分として、等重量比で総量50μg/mLのFMDV VP1 OConsensus(配列番号25)、OOzk(配列番号28)およびOMyanmar(配列番号27)のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号34、36、37、40〜43、45、48、52、53、60〜63(15種のTh)を追加し、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤、B:Thの重量比が1:1、5:1、10:1、50:1および100:1で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤2mLで免疫化した。
第17群〜第19群は、FMDVワクチンB細胞成分として、等重量比で総量50μg/mLのFMDV VP1 OConsensus(配列番号25)、OOzk(配列番号28)、OMyanmar(配列番号27)およびAsia 1Jiangsu(配列番号29)のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号34、36、37、40〜43、45、48、52、53、60〜63(15種のTh);配列番号88、89(2種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);配列番号91、92(2種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);配列番号91、93〜95(4種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);を追加して、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤50+5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤2mLで免疫化した。
第25群および第26群は、FMDVワクチンB細胞成分として、等重量比で総量50μg/mLのFMDV VP1 OCampos(配列番号26)、A24(配列番号30)およびCIndaial(配列番号32)のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号91、92(2種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);配列番号91、93〜95(4種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);を追加して、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤50+5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤2mLで免疫化した。
第27群および第28群は、FMDVワクチンB細胞成分として、等重量比で総量50μg/mLのFMDV VP1 OCampos(配列番号26)、A24(配列番号30)およびCIndaial(配列番号32)のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号91、92(2種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);配列番号91、93〜95(4種のUBITh(登録商標)増強Thカセット)を追加して、アジュバントとしてエマルシゲンD(12%)を用いる油中水乳剤50+5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤2mLで免疫化した。
第29群および第30群は、FMDVワクチンB細胞成分として、等重量比で総量50μg/mLのFMDV VP1 OCampos(配列番号26)、AArgentina2001(配列番号33)およびCIndaial(配列番号32)のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号91、92(2種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);配列番号91、93〜95(4種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);を追加し、アジュバントとして0.1%Tween80を含むISA50V2(Seppics社、仏国)を用いる油中水乳剤50+5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤2mLで免疫化した。
第31群および第32群は、FMDVワクチンB細胞成分として、等重量比で総量50μg/mLのFMDV VP1 OCampos(配列番号26)、AArgentina2001(配列番号33)およびCIndaial(配列番号32)のそれぞれに、等重量比の混合物である内在性FMDV Thペプチド、すなわちすべて等重量比の配列番号91、92(2種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);配列番号91、93〜95(4種のUBITh(登録商標)増強Thカセット);を追加して、アジュバントとしてエマルシゲンD(12%)を用いる油中水乳剤50+5μg/mL、B:Thの重量比が10:1で、免疫化した。すべてのウシは、ワクチン製剤として乳剤2mLで免疫化した。
要約すると、それぞれの試験を様々な時点で開始する際、0週目においてすべてのウシはFMDV抗体を有していなかった。様々なFMDV VP1に由来するBおよび内在性Thエピトープクラスターペプチドを含有する複数成分のFMDVワクチン製剤の単回投与によって、異なる血清型の、その他の関連するVP1 B免疫原が存在するため(主にこれらのVP1ペプチド免疫原の間の高い交差反応性のため)、標的ペプチド免疫原がB成分の画分に存在した場合でも、標的ペプチド(または標的ペプチドの一つ)であるOConsensus(配列番号25)に対する著しい量の抗体が産生され、通常のLog10力価は2ないし3の範囲であった。
予想外なことに、B:Thペプチドの比に幅のある製剤は、試験動物において免疫応答を効果的に誘発した。すなわち、動物の初回免疫後3週目に採取した血清中の中和抗体を著しく上昇させるのに有効な製剤では、このようなFMDV内在性Thクラスターペプチドを含有させる%範囲が、1%と同じ程低いところから(すなわちTh:Bの比が1:100)から50%と同じほど高いところ(すなわちTh:Bの比が1:1)まで変化してもよい(ウシ免疫試験の第12群ないし第16群を参照されたい)。
一般に、FMDV Thクラスターペプチド:FMDV VP1 Bエピトープクラスターペプチドが10%〜20%(すなわち1:5または1:10の比)であるものが選択され、最終的なペプチドベースのFMDVワクチン製剤に用いられて、筋肉内経路への注射を介してFMDVワクチン製剤を単回投与された動物に、安定したBおよびT免疫応答を開始させる。
実施例10
単回投与緊急ワクチンとして、BおよびTエピトープベースの複数成分のFMDVワクチン製剤を投与されたブタおよびウシの、FMDVウイルス負荷からの保護
a.ブタにおいて行われた負荷試験
単回投与緊急ワクチンとして設計された、初回免疫後3週目に採取した血清中の中和抗体力価を有意に上昇させる、最適化された複数成分のBおよびTエピトープベースのFMDVワクチン製剤を用いて、台湾淡水区にて6回の負荷試験をさらに行い、実施例9において前に試験し、選択した代表的製剤の保護効率を評価および確認した。
特に、FMDV OTaiwan株を用いるFMDV負荷試験を、ワクチン投与された動物に対して行った。負荷試験は、同様のプロトコル/方法に従って行った。この実施例(以下)では、一つの代表的な/典型的な負荷試験について詳述する。特に、表20に示す負荷試験(表25に示す試験IIの第5、6および7群、試験IVの第12、13および14群、ならびに試験Vの第15、16、17、18および19群に対応する)を、表20〜表24に詳細に記述/評価する。ブタおよびウシに対して行ったこのような負荷試験に関わるその他の群についての要約を、それぞれ表25及び表26に記載する。
単回投与緊急ワクチンとして、BおよびTエピトープベースの複数成分のFMDVワクチン製剤を投与されたブタおよびウシの、FMDVウイルス負荷からの保護
a.ブタにおいて行われた負荷試験
単回投与緊急ワクチンとして設計された、初回免疫後3週目に採取した血清中の中和抗体力価を有意に上昇させる、最適化された複数成分のBおよびTエピトープベースのFMDVワクチン製剤を用いて、台湾淡水区にて6回の負荷試験をさらに行い、実施例9において前に試験し、選択した代表的製剤の保護効率を評価および確認した。
特に、FMDV OTaiwan株を用いるFMDV負荷試験を、ワクチン投与された動物に対して行った。負荷試験は、同様のプロトコル/方法に従って行った。この実施例(以下)では、一つの代表的な/典型的な負荷試験について詳述する。特に、表20に示す負荷試験(表25に示す試験IIの第5、6および7群、試験IVの第12、13および14群、ならびに試験Vの第15、16、17、18および19群に対応する)を、表20〜表24に詳細に記述/評価する。ブタおよびウシに対して行ったこのような負荷試験に関わるその他の群についての要約を、それぞれ表25及び表26に記載する。
動物:8週齢(0wpiの時点で)のSPF交雑種ブタ32頭を負荷試験に用いた。ブタはFMDフリーであり、以前にFMDワクチンによって免疫化してはいなかった(すなわちナイーブ)。ブタは、行政院農業委員会家畜衛生試験所(Animal Health Research Institute (AHRI), Council of Agriculture, Executive Yuan)にて飼育した。試験は、初回免疫から負荷試験終了までAHRIにて行った。
特別な飼育条件:現実的条件に依存して、異なる群を共同ケージ内で飼育した。コントロール群は、個別の部屋で飼育した。感染の徴候を示した動物は別室へ移した。
特別な飼育条件:現実的条件に依存して、異なる群を共同ケージ内で飼育した。コントロール群は、個別の部屋で飼育した。感染の徴候を示した動物は別室へ移した。
ウイルス:FMDV OTAW/97 K株。
キット:FMDV非構造タンパク質ELISAキットおよびFMDペプチド2570a EIA用量設定キットを、実施例1に記載されるように用いた。
群分け:32頭のブタを無作為に11群に分けた。動物のID番号、投与の量(volume)、注射経路および注射部位について表20にまとめた。
採血スケジュール:ワクチン接種後0、2、4週目(week(s)post vaccination(WPV))および負荷後14日目(days post challenge(DPC))。
ワクチン接種:ワクチン接種は、指定のそれぞれの用量により0WPVに行った。
負荷スケジュール:免疫後4週目に、免疫したブタおよびコントロールのブタの右前脚の踵球内に、SC経路を介してFMDV O−Taiwan(ブタにおいて継代したウイルス)を負荷した。ウイルス量は0.5ml(105TCID50)であった。
キット:FMDV非構造タンパク質ELISAキットおよびFMDペプチド2570a EIA用量設定キットを、実施例1に記載されるように用いた。
群分け:32頭のブタを無作為に11群に分けた。動物のID番号、投与の量(volume)、注射経路および注射部位について表20にまとめた。
採血スケジュール:ワクチン接種後0、2、4週目(week(s)post vaccination(WPV))および負荷後14日目(days post challenge(DPC))。
ワクチン接種:ワクチン接種は、指定のそれぞれの用量により0WPVに行った。
負荷スケジュール:免疫後4週目に、免疫したブタおよびコントロールのブタの右前脚の踵球内に、SC経路を介してFMDV O−Taiwan(ブタにおいて継代したウイルス)を負荷した。ウイルス量は0.5ml(105TCID50)であった。
アッセイの単回または複数回のモニター:ウイルス負荷後、ブタにおけるFMDの臨床徴候および症候群の発生を、毎日体温を記録しながら14日間モニターした。
ウイルス負荷後のブタの体温を、表21に記録した。ブタの体温は、モニターした負荷後14日(days post challenge(DPC))の間わずかに上昇したが、ほとんどの場合40℃未満であった。
中和力価:ブタから、ワクチン接種後0、2、4週目(week(s)post vaccination(WPV))及び14DPCに採血した。各動物の凝固サンプルから遠心分離によって血清を回収し、ウイルス中和アッセイに供した。算出した中和力価及び幾何平均を表22に示す。すべての製剤において、用量依存性に著しい中和抗体(NA)力価が観察された。ある群では、4WPVにおけるNA力価の幾何平均が16未満であったが、14DPCではすべての実験群の動物が保護されていた(100%)。しかし、プラセボコントロール群またはネガティブコントロールの2動物のうちの2頭は共に、2日目には感染の臨床徴候を示していた。陽性コントロールとしてFMDVウイルスライセートベースの血清型Oワクチン(ロシアより入手)を用いた試験Vの第19群では、単回投与によって3動物のすべてが保護された。
ウイルス負荷後のブタの体温を、表21に記録した。ブタの体温は、モニターした負荷後14日(days post challenge(DPC))の間わずかに上昇したが、ほとんどの場合40℃未満であった。
中和力価:ブタから、ワクチン接種後0、2、4週目(week(s)post vaccination(WPV))及び14DPCに採血した。各動物の凝固サンプルから遠心分離によって血清を回収し、ウイルス中和アッセイに供した。算出した中和力価及び幾何平均を表22に示す。すべての製剤において、用量依存性に著しい中和抗体(NA)力価が観察された。ある群では、4WPVにおけるNA力価の幾何平均が16未満であったが、14DPCではすべての実験群の動物が保護されていた(100%)。しかし、プラセボコントロール群またはネガティブコントロールの2動物のうちの2頭は共に、2日目には感染の臨床徴候を示していた。陽性コントロールとしてFMDVウイルスライセートベースの血清型Oワクチン(ロシアより入手)を用いた試験Vの第19群では、単回投与によって3動物のすべてが保護された。
FMDV NS ELISA:血清サンプルは、AHRIにおいてFMDV非構造タンパク質ELISAによりアッセイを行い、その結果を表23に示す。試験したすべての群は負荷前にはナイーブであり、FMDV NSタンパク質に対する反応性を示さなかった。プラセボ・ネガティブコントロール群の動物のみが14DPCにおいてNSタンパク質に対する陽性の反応性を示したことから、それらの感染性が示唆される。
抗VP1(ペプチド2570a)ELISA用量設定:実施例1に記載するように、VP1ペプチド2570aベースのELISAによって抗VP1抗体の力価を試験し、その結果を表24に示す。ほとんどのブタは、免疫後2週目には著しい免疫応答を呈した。
FMDVペプチドワクチン製剤が、各製剤について示すように内在性FMDV Thペプチドを含有していた場合、ネガティブ・プラセボコントロール群を除く実験群のすべての動物は、そのNA力価に関わらず、FMDVによる負荷から保護された。
抗VP1(ペプチド2570a)ELISA用量設定:実施例1に記載するように、VP1ペプチド2570aベースのELISAによって抗VP1抗体の力価を試験し、その結果を表24に示す。ほとんどのブタは、免疫後2週目には著しい免疫応答を呈した。
FMDVペプチドワクチン製剤が、各製剤について示すように内在性FMDV Thペプチドを含有していた場合、ネガティブ・プラセボコントロール群を除く実験群のすべての動物は、そのNA力価に関わらず、FMDVによる負荷から保護された。
ある実験群では、4WPVにおける中和抗体力価の幾何平均が16未満であったが、すべてのブタは保護されていた。このことは、中和抗体に加え、ウイルス負荷から動物を保護するその他の因子が存在することをはっきりと示している。短いかまたは長いカセットフォーマットに含まれた内在性FMDV Thペプチドはすべて、ペプチドワクチン製剤の単回投与による細胞性免疫の誘発に決定的な役割を果たしていることが示された。単数または複数のVP1ループペプチドと組み合わせた際にこのような保護を可能にする細胞性免疫をブタに誘発するためには、30種ほどの多数のFMDV Th(配列番号34〜63)を用いてもよいか、または予め厳選した3種ほどの少数のTh(配列番号61〜63)を用いてもよい。FMDV VP1 Oホモログ由来の配列を組み合わせて含むワクチンは、OTaiwan株によるFMDV負荷からブタを保護するために、少なくとも同等に有効であった。各ワクチン製剤を投与された実験群では、モニターした期間を通してFMDV NSタンパク質に対する抗体は検出されなかったが、これらの動物は、高用量のFMDVウイルス負荷(OIEにより要求されるウイルス投与量の10×)にもかかわらず、FMDV感染から完全に保護されていることがさらに示された。試験したすべての製剤において、投与あたりわずかに0.5mLを投与されたブタは、投与あたり2mLを投与されたブタと比較して同等に保護された。
13群(第1〜3、5〜7、8〜10、12〜15群)は、FMDV VP1由来のBエピトープ免疫原として、FMDV OConsensus(配列番号25)を用いた。FMDV VP1由来のBエピトープ免疫原として、第16群はFMDV OConsensus、OOzk、OMyanmar(配列番号25、28、及び27)を用い、第17群はFMDV OConsensus、OOzk、OMyanmar及びAsia 1Jiangsu(配列番号25、28、27、及び29)をそれぞれ用いた(等重量比で)。残りの群はプラセボコントロールを用いた。
プラセボコントロール群を除くこれらの製剤すべてにおいて、表25に詳しく示すように、すべての群のFMDV VP1 Bエピトープ成分に内在性FMDV Thエピトープクラスターペプチドを加えた。試験IIおよびIVは、各試験において投与あたり2mL、1mL、0.5mLを投与する群によって実施し、それぞれのワクチン製剤の効力(PD50)を試験した。14日間にわたる観察期間に、FMDの臨床徴候についてすべての実験動物をモニターした。試験IIIの第8群〜第10群では、FMDV VP1 OConsensus(配列番号25)とUBITh(登録商標)増強FMDV Thカセットペプチド(配列番号90)との比を1:1、5:1および10:1に変化させて試験を行った。試験Vの第15群及び第16群では、FMDV VP1結合ペプチド免疫原とUBITh(登録商標)増強FMDV Thカセットペプチド(配列番号90)との比をそれぞれ5:1および10:1に変化させて、同様の試験を行った。
要約すると、すべてのプラセボコントロール群またはネガティブ(注射していない)群のすべての動物は、FMDV OTaiwan株の負荷後2日目にはこれに感染していたことから、すべての負荷試験は妥当であったことが示唆された。これらの負荷試験では、OIEによって要求される量よりも10×高い用量のFMDVウイルス単離株を用いたにもかかわらず、モニターした期間を通して臨床徴候が陰性であったこと、およびFMDV NS ELISAによって得たシグナルも陰性であったことによって示されるように、すべての実験群において、すべてのブタの完全な保護が観察された。投薬試験を通して算出したPD50は、IIおよびIVの両群において少なくともPD50>11.23であった。
FMDVウイルスの負荷からブタを効果的に保護するため、30種のFMDV Thエピトープペプチド(配列番号34〜63)のうち、3種のFMDV Thペプチド(配列番号61〜63)を選択した。配列番号90に示すように、これら3種のペプチドのN末端を、リジンスペーサを介してUBITh(登録商標)(配列番号24)にさらに連結するカセット様設計を用いて、これら3種のFMDVブタThエピトープペプチドの提示を増大させた。このようなFMDV Thエピトープペプチドを、FMDV VP1由来のBエピトープペプチド免疫原に対して様々な比率で加えることにより、FMDVウイルスの負荷からの保護が可能になる。負荷試験の試験Vにおいて、Bエピトープペプチド組成物が、一価のO血清型ペプチド(配列番号25、2570kb)、O血清型結合製剤(配列番号25、28および27)、または血清型OとAsia 1とを組み合わせた多価製剤(配列番号25、28、27および29)である場合、内在性Thエピトープペプチドが10%存在することによって完全な保護が達成されることから、VP1 Bエピトープペプチドの免疫原性の適応可能性が示される。
b.ウシにおける負荷試験
ウシでは、1×104TCID50のFMDV(ウシ感染単位(Bovine Infectious Unit:BIU))を、動物の首の後ろに改変型筋肉内注射することによって、ウイルスを負荷した。血清型Oの負荷にはOS/99株を用い、血清型Asia 1の負荷にはAsia 1強毒性株を用いた。それぞれのFMDVワクチン製剤を単回投与した後にウイルスを負荷した動物は、28日間毎日直腸温をモニターし、病変部の出現時期、数および重症度に基づいた保護スコアを決定した。生きた動物を用いたすべての実験は、中華人民共和国農業部の指針の下に行った。特定の製剤の効力を評価するため、例えば試験ワクチンの2×、1×、及び0.5×用量を用いるような、投薬の改変も行った。製剤の保護効率を迅速にスクリーニングするため、1×も用いた。ワクチン製剤の有効性を評価するため、実験計画および試験時における動物の利用可能性に基づいて、動物を1群あたり3〜5頭に群分けした。
ウシでは、1×104TCID50のFMDV(ウシ感染単位(Bovine Infectious Unit:BIU))を、動物の首の後ろに改変型筋肉内注射することによって、ウイルスを負荷した。血清型Oの負荷にはOS/99株を用い、血清型Asia 1の負荷にはAsia 1強毒性株を用いた。それぞれのFMDVワクチン製剤を単回投与した後にウイルスを負荷した動物は、28日間毎日直腸温をモニターし、病変部の出現時期、数および重症度に基づいた保護スコアを決定した。生きた動物を用いたすべての実験は、中華人民共和国農業部の指針の下に行った。特定の製剤の効力を評価するため、例えば試験ワクチンの2×、1×、及び0.5×用量を用いるような、投薬の改変も行った。製剤の保護効率を迅速にスクリーニングするため、1×も用いた。ワクチン製剤の有効性を評価するため、実験計画および試験時における動物の利用可能性に基づいて、動物を1群あたり3〜5頭に群分けした。
試験Iにおいて、内在性FMDV Thエピトープペプチドの不存在下の、又はDT、TT、及びPTトキソイドタンパク質由来の外来性Thエピトープペプチドの10%存在下の、ワクチン製剤の鍵となる成分として、最適化されたFMDV VP1由来のB細胞エピトープクラスターペプチド免疫原(配列番号25)を含むペプチドワクチン製剤を用いた第1群〜第4群(表26に示す)の動物は、FMDV血清型Oos/99株の負荷からは保護されなかった。表26に示すように、単回投与緊急ワクチンのために最適化された複数成分のBおよびTエピトープベースのFMDVワクチン製剤を用いて、さらに4回の負荷試験を行い、実施例9で前に試験し選択した代表的製剤の保護効率を評価した。
8つの群(試験II及びIIIの第6群〜第8群及び第10群〜第14群)は、FMDV VP1由来のBエピトープ免疫原としてFMDV OConsensus(配列番号25)を用いた。試験IV(第16群)は、FMDV VP1由来のBエピトープ免疫原としてFMDV OConsensus、OOzk、OMyanmar(配列番号25、28、及び27)を(等重量比で)用いた。試験V(第18群)は、FMDV VP1由来のBエピトープ免疫原としてFMDV OConsensus、Oozk、OMyanmar、Asia 1JiangSu、及びAGansu(配列番号25、28、27、29、及び31)を(等重量比で)用いた。
プラセボコントロール群および試験Iの実験群を除くこれらの製剤すべてにおいて、試験IIIの第10群における、配列番号34〜63(30種のTh)の内在性FMDV Thエピトープクラスターペプチド;試験IIIの第11群における、配列番号34〜39、44、46〜51および53〜60(21種のTh)のペプチド;試験IIの第6ないし8群における、配列番号88および89のUBITh(登録商標)増強FMDV Thカセットペプチドの混合物;および試験IVの第16群および試験Vの第18群における、配列番号91、93、94および95の、別の4種のカセットFMDV Thペプチドの混合物を、表26に詳しく示すように、FMDV VP1 Bエピトープ成分に加えた。
試験IIの第6、7および8群のそれぞれの動物に、投与あたり2mL、1mL、0.5mLのワクチン製剤を投与してワクチン製剤の効力を試験した際、それぞれの群において、5頭のうち4頭;5頭のうち4頭;および5頭のうち3頭の動物が保護された場合に、ワクチン製剤が著しい潜在能力を有することが示唆された。
要約すると、すべてのプラセボコントロール群のすべての動物は、負荷試験に用いたFMDV Oos/99またはAsia 1株の負荷後2日目と同じほど早期にこれらに感染していたことから、すべての負荷試験は妥当であったことが示唆される。保護された動物では、モニターした期間を通して臨床徴候が陰性であったことによって示されるように、すべての実験群で著しい保護(5頭中4頭、または5頭中3頭)または完全な保護が達成された。多様な遺伝的背景を有するウシを効果的に保護するため、30種のFMDV Thエピトープペプチド(配列番号34〜63)から、等重量比の21種(配列番号34〜39、44、46〜51、53〜60(21種のTh)、等重量比の15種のTh(配列番号34、36、37、40〜43、45、48、52、53、60〜63)(15種のTh)および最後に等重量比の6種のFMDV Thペプチド(配列番号34、36、37、48、50、53)(6種のTh)の選択が可能であった。これらの15種から6種までのFMDVウシThエピトープペプチドの提示は、3種のThペプチドをリジンスペーサを介して連結し、次にそのN末端をUBITh(登録商標)(配列番号24)に連結させてFMDV Thカセットペプチド(配列番号88、89、91、92、93、94、95)とすることによって作製したカセット様の構造によって増大される。このようなFMDV Thエピトープカセットペプチドは、FMDV VP1由来のBエピトープペプチド免疫原に10%または20%加えることによって、必要度の高い、FMDVに対するT細胞性免疫の開始を補助することができた。試験IVおよびVにおいて、4種のUBITh(登録商標)増強ペプチドによるカセット型に存在する12種のFMDV Thエピトープ(配列番号91、93、94、95)から選択された内在性Thエピトープペプチドの10%存在下で、第16および18群の5頭のうち4頭の動物が、FMDV血清型Oos/99株(試験IV)または強毒性FMDV Asia 1株(試験V)からそれぞれ保護された一方、Bエピトープペプチド組成物は、O血清型結合製剤(配列番号25、28および27)として、又はO、Asia 1およびAGansuの多価血清型製剤(配列番号25、28、27、29および31)として存在し、これにより、VP1 Bエピトープペプチドの免疫原性の適応可能性が示される。
実施例11
FMDブラジル型Oウイルス/A24/CINDAIALによるウシのウイルス感染を予防するための、UBITH(登録商標)FMDV多価ワクチンであるUBITH(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(ブラジル)の添付文書のサンプル製品添付文書
以下は、ブラジルおよび中国における、UBITH(登録商標)FMDV多価ワクチンであるUBITH(登録商標)***(FMD)合成ペプチドワクチンのサンプル製品の添付文書である。
FMDブラジル型Oウイルス/A24/CINDAIALによるウシのウイルス感染を予防するための、UBITH(登録商標)FMDV多価ワクチンであるUBITH(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(ブラジル)の添付文書のサンプル製品添付文書
以下は、ブラジルおよび中国における、UBITH(登録商標)FMDV多価ワクチンであるUBITH(登録商標)***(FMD)合成ペプチドワクチンのサンプル製品の添付文書である。
a.ブラジル
注射用無菌油中水乳剤
警告:獣医学専用。
詳細:UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(ブラジル)は、3種のUBITh(登録商標)FMD VP1合成ペプチド構築物を含む、油中水乳剤の三価ワクチンである。それぞれのペプチド構築物は、南アメリカ地域での需要に特化した血清型であるブラジルO、A24およびCIndaialの***ウイルス(FMDV)に由来する免疫優性のVP1エピトープを、人工のヘルパーT(Th)細胞ペプチドであるUBITh(登録商標)エピトープへ連結させた、抗原としての合成ペプチドから構成される。これら3種のFMDV血清型に対する細胞介在性免疫をさらに増強するため、4種のThペプチドが追加で含まれる。3種のUBITh(登録商標)FMD VP1構築物は等比で混合され、これに4種のTh構築物を混合した小画分を加えた。次にこのFMDV BおよびTエピトープ関連の合成構築物混合物を油性アジュバントと混合して油中水乳剤とした。
注射用無菌油中水乳剤
警告:獣医学専用。
詳細:UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(ブラジル)は、3種のUBITh(登録商標)FMD VP1合成ペプチド構築物を含む、油中水乳剤の三価ワクチンである。それぞれのペプチド構築物は、南アメリカ地域での需要に特化した血清型であるブラジルO、A24およびCIndaialの***ウイルス(FMDV)に由来する免疫優性のVP1エピトープを、人工のヘルパーT(Th)細胞ペプチドであるUBITh(登録商標)エピトープへ連結させた、抗原としての合成ペプチドから構成される。これら3種のFMDV血清型に対する細胞介在性免疫をさらに増強するため、4種のThペプチドが追加で含まれる。3種のUBITh(登録商標)FMD VP1構築物は等比で混合され、これに4種のTh構築物を混合した小画分を加えた。次にこのFMDV BおよびTエピトープ関連の合成構築物混合物を油性アジュバントと混合して油中水乳剤とした。
使用に際する指示:UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(ブラジル)は、ブラジルO、A24およびCIndaialの***ウイルス血清型によるウシの感染を予防するために用いられる。
用量及び投与:UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(ブラジル)。
本ワクチン製剤は、肩の前の首部分への筋肉内注射によって投与される。針と皮膚表面との角度をできるだけ45度に近い状態に維持して、針を抜いた際に針穴からワクチンが流れ落ちることを防ぐようにする。緊急用には単回投与することが望ましい。以前にFMDワクチンを接種されていないウシに対しては、免疫を増強させ、かつ免疫応答を延長させてFMDV感染からより効果的に保護されるように、4〜5週の間隔をあけて2mLの投与による免疫を2回行うべきである。その後の追加免疫は6か月ごとに実施してもよい。FMDVに感染した動物がいる領域では、6か月ごとの再ワクチン投与が望ましい。送達される投与量は2.0mLである。
用量及び投与:UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(ブラジル)。
本ワクチン製剤は、肩の前の首部分への筋肉内注射によって投与される。針と皮膚表面との角度をできるだけ45度に近い状態に維持して、針を抜いた際に針穴からワクチンが流れ落ちることを防ぐようにする。緊急用には単回投与することが望ましい。以前にFMDワクチンを接種されていないウシに対しては、免疫を増強させ、かつ免疫応答を延長させてFMDV感染からより効果的に保護されるように、4〜5週の間隔をあけて2mLの投与による免疫を2回行うべきである。その後の追加免疫は6か月ごとに実施してもよい。FMDVに感染した動物がいる領域では、6か月ごとの再ワクチン投与が望ましい。送達される投与量は2.0mLである。
使用法
・使用前にワクチン製品の温度を室温にすること。
・使用前にワクチンの内容物を完全に混合すること。
・内容物の取出しには滅菌された注射器および針を用いること。
・いったん開封した容器の内容物は、全部を直ちに使用すること。
コンテナーおよび未使用の内容物は、全部を政府の規制によって許可された手順で破棄すること。
・使用前にワクチン製品の温度を室温にすること。
・使用前にワクチンの内容物を完全に混合すること。
・内容物の取出しには滅菌された注射器および針を用いること。
・いったん開封した容器の内容物は、全部を直ちに使用すること。
コンテナーおよび未使用の内容物は、全部を政府の規制によって許可された手順で破棄すること。
b.中国
FMD中国型O/Asia 1/A Gansu ウイルスによるウシの感染を予防するための、UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(中国)
注射用無菌油中水乳剤
警告:獣医学専用。
詳細:UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(中国)は、3種のUBITh(登録商標)FMD VP1合成ペプチド構築物を含む、油中水乳剤の三価ワクチンである。それぞれのペプチド構築物は、中国およびアジア地域での需要に基づいた血清型である中国型O、Asia 1およびAGansuの***ウイルス(FMDV)に由来する免疫優性のVP1エピトープを、人工のヘルパーT(Th)細胞ペプチドであるUBITh(登録商標)エピトープへ連結させた、抗原としての合成ペプチドから構成される。これら3種のFMDV血清型に対する細胞介在性免疫をさらに増強するため、4種のThペプチドが追加で含まれる。3種のUBITh(登録商標)FMD VP1構築物は、等比で混合され、これに4種のTh構築物を混合した小画分を加えた。次にこのFMDV BおよびTエピトープ関連の合成構築物混合物を油性アジュバントと混合して油中水乳剤とした。
使用に際する指示:UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(中国)は、中国型O/Asia 1/AGansuウイルスの***血清型によるウシの感染を予防するために用いられる。
FMD中国型O/Asia 1/A Gansu ウイルスによるウシの感染を予防するための、UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(中国)
注射用無菌油中水乳剤
警告:獣医学専用。
詳細:UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(中国)は、3種のUBITh(登録商標)FMD VP1合成ペプチド構築物を含む、油中水乳剤の三価ワクチンである。それぞれのペプチド構築物は、中国およびアジア地域での需要に基づいた血清型である中国型O、Asia 1およびAGansuの***ウイルス(FMDV)に由来する免疫優性のVP1エピトープを、人工のヘルパーT(Th)細胞ペプチドであるUBITh(登録商標)エピトープへ連結させた、抗原としての合成ペプチドから構成される。これら3種のFMDV血清型に対する細胞介在性免疫をさらに増強するため、4種のThペプチドが追加で含まれる。3種のUBITh(登録商標)FMD VP1構築物は、等比で混合され、これに4種のTh構築物を混合した小画分を加えた。次にこのFMDV BおよびTエピトープ関連の合成構築物混合物を油性アジュバントと混合して油中水乳剤とした。
使用に際する指示:UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(中国)は、中国型O/Asia 1/AGansuウイルスの***血清型によるウシの感染を予防するために用いられる。
用量及び投与:UBITh(登録商標)***(FMD)合成ペプチド三価ワクチン(中国)は、肩の前の首部分への筋肉内注射によって投与される。針と皮膚表面との角度をできるだけ45度に近い状態に維持して、針を抜いた際に針穴からワクチンが流れ落ちることを防ぐようにする。緊急用には単回投与することが望ましい。以前にFMDワクチンを接種されていないウシに対しては、免疫を増強させ、かつ免疫応答を延長させてFMDV感染からより効果的に保護されるように、4〜5週の間隔をあけて2mLの投与による免疫を2回行うべきである。その後の追加免疫は6か月ごとに実施してもよい。FMDVに感染した動物がいる領域では、6か月ごとの再ワクチン投与が望ましい。送達される投与量は2.0mLである。
使用法
・使用前にワクチン製品の温度を室温にすること。
・使用前にワクチンの内容物を完全に混合すること。
・内容物の取出しには滅菌された注射器および針を用いること。
・いったん開封した容器の内容物は、全部を直ちに使用すること。
・コンテナーおよび未使用の内容物は、全部を政府の規制によって許可された手順で破棄すること。
・使用前にワクチン製品の温度を室温にすること。
・使用前にワクチンの内容物を完全に混合すること。
・内容物の取出しには滅菌された注射器および針を用いること。
・いったん開封した容器の内容物は、全部を直ちに使用すること。
・コンテナーおよび未使用の内容物は、全部を政府の規制によって許可された手順で破棄すること。
Claims (30)
- a)FMDV VP1ループ状B細胞エピトープ配列及びThエピトープ配列を有する合成免疫原性ペプチド;
b)合成FMDVヘルパーTエピトープ配列を有する別のペプチド;及び
c)獣医学上許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント;
を有する***(FMD)ワクチン組成物であって、
(a)の合成免疫原性ペプチドは、
i)配列番号1又は2;
ii) (a)のホモログ;及び
iii) (a)又は(b)の任意の組合せ;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上記組成物。 - (a)の合成免疫原性ペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を有する請求項1記載のFMDワクチン。
- (a)の合成免疫原性ペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を有する請求項1記載のFMDワクチン。
- (b)のホモログが、配列番号3〜23からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、配列番号2のホモログである請求項1記載のFMDワクチン。
- (a)の合成免疫原性ペプチドが、Thエピトープ配列のカルボキシ末端で共有結合する請求項1記載のFMDワクチン。
- Thエピトープ配列が配列番号24である請求項5記載のFMDワクチン。
- ヘルパーTエピトープが、イプシロンリジン残基を有するスペーサを介してペプチド抗原と共有結合する請求項5記載のFMDワクチン。
- (a)の合成免疫原性ペプチドが、配列番号25〜33及びその組合せからなる群から選ばれる請求項5記載のFMDワクチン。
- (b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号34〜95及びその組合せからなる群から選ばれる請求項5記載のFMDワクチン。
- (a)のペプチド抗原の全量が、投与当たり約10μg〜約1mgである請求項1記載のFMDワクチン。
- デリバリビヒクル又はアジュバントが、モンタニド(Montanide)ISA 50V、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート、エマルシゲン(Emulsigen)、エマルシゲンD(Emulsigen D)及びCpGオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる請求項1記載のFMDワクチン。
- (a)の合成免疫原性ペプチドが、配列番号25、27、28、29、及び/又はその組合せである請求項8記載のFMDワクチン。
- (b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号34〜63、90、及び/又はその組合せである請求項9記載のFMDワクチン。
- (a)の合成免疫原性ペプチドが、配列番号25、27、28、29及び/又はその組合せであり、(b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号34〜63、90、及び/又はその組合せである請求項1記載のFMDワクチン。
- 医薬上有効量の請求項14記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
- 動物がブタである請求項15記載の方法。
- 医薬上有効量の請求項14記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、FMD感染から動物を保護する方法。
- 動物がブタである請求項17記載の方法。
- (a)の合成免疫原性ペプチドが、配列番号25、27、28、29、31、及び/又はその組合せである請求項8記載のFMDワクチン。
- 医薬上有効量の請求項19記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
- 動物が雌ウシである請求項20記載の方法。
- 医薬上有効量の請求項19記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、FMD感染から動物を保護する方法。
- 動物が雌ウシである請求項22記載の方法。
- (a)の合成免疫原性ペプチドが、配列番号26、30、32、33、及び/又はその組合せである請求項8記載のFMDワクチン。
- (b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号91〜95、及びその組合せである請求項9記載のFMDワクチン。
- (a)の合成免疫原性ペプチドが、配列番号26、30、32、33、及び/又はその組合せであり、(b)のFMDVヘルパーTエピトープペプチドが、配列番号91〜95、及びその組合せである請求項1記載のFMDワクチン。
- 医薬上有効量の請求項26記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、動物の免疫反応を引き出す方法。
- 動物が雌ウシである請求項27記載の方法。
- 医薬上有効量の請求項26記載のワクチンを動物に単回投与することを有する、FMD感染から動物を保護する方法。
- 動物が雌ウシである請求項29記載の方法。
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