JP2016214138A - Trophoblast ectoderm-like structure, and method for producing the same - Google Patents

Trophoblast ectoderm-like structure, and method for producing the same Download PDF

Info

Publication number
JP2016214138A
JP2016214138A JP2015102260A JP2015102260A JP2016214138A JP 2016214138 A JP2016214138 A JP 2016214138A JP 2015102260 A JP2015102260 A JP 2015102260A JP 2015102260 A JP2015102260 A JP 2015102260A JP 2016214138 A JP2016214138 A JP 2016214138A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
trophoblast
cell
medium
ectoderm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2015102260A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
康秀 大日向
Yasuhide Ohinata
康秀 大日向
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Original Assignee
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RIKEN Institute of Physical and Chemical Research filed Critical RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority to JP2015102260A priority Critical patent/JP2016214138A/en
Publication of JP2016214138A publication Critical patent/JP2016214138A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a technique for reconstructing an early embryo from a pluripotent stem cell and a TS cell.SOLUTION: A method for producing a trophoblast ectoderm-like alveolar structure of the present invention includes performing suspension culture of a mammal trophoblast stem cell in a culture medium containing FGF, a Wnt signal inhibitor, and non-gel water-soluble component of a basement membrane preparation. When a pluripotent stem cell is implanted into the trophoblast ectoderm-like alveolar structure obtained by the method for producing of the present invention, and the structure including the implanted pluripotent stem cell is transplanted into a uterus of a pseudopregnant non-human mammal, it nidates to generate an embryo.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、栄養膜外胚葉様構造体及びその製造方法に関する。また、本発明は、当該栄養膜外胚葉様構造体を利用した胚の製造方法に関する。   The present invention relates to a trophoblast ectoderm-like structure and a method for producing the same. The present invention also relates to a method for producing an embryo using the trophoblast-like germ layer-like structure.

哺乳動物において、胎盤は、子宮における胎仔発生のために重要な臓器（vital organ）である。胎盤は、胎仔と母体環境との間の接合部分として機能し、ガス、栄養、及び***産物の交換を促進するのみならず、妊娠関連ホルモン産生及び胎仔の免疫防御を促進している。この組織の主要な構造的及び機能的構成因子は、栄養膜系列の細胞からなる。この系列は、子宮内への着床前に、胚体を形成する内部細胞塊（ICM）系列から分離し、胎盤の胎仔部分の形成に制限される(非特許文献1)。過去数十年にわたり、ICM由来の胚性幹（ES）細胞及び栄養外胚葉（TE）由来の栄養膜幹（TS）細胞は、初期胚及び胎盤発生の分子メカニズムの我々の理解を実質的に進展させてきた。ES細胞が最初に記載されて以来(非特許文献2、3)、ES細胞は、フィーダー細胞、馴化培地、血清、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、及びペプチドの多様な経験的組み合わせを用いて誘導され維持されてきた(非特許文献2〜7)。現在では、膨大なトライ・アンド・エラーの結果、未分化多能性幹細胞を、白血球阻害因子（LIF）及び／又は低分子化合物（即ち、PD0325901、PD184352、PD173074、SU5402、CHIR99021等）の存在下、化学的に定義された培養条件下で効率的に誘導し維持することができる(非特許文献8、9)。   In mammals, the placenta is a vital organ for fetal development in the uterus. The placenta functions as a junction between the fetus and the maternal environment, not only promoting the exchange of gases, nutrients, and excreta, but also promoting pregnancy-related hormone production and fetal immune defenses. The main structural and functional components of this tissue consist of cells of the trophoblast lineage. This lineage is separated from the internal cell mass (ICM) line that forms the embryo body before implantation into the uterus and is limited to the formation of the fetal part of the placenta (Non-Patent Document 1). Over the past decades, ICM-derived embryonic stem (ES) cells and trophectoderm (TE) -derived trophoblast stem (TS) cells have substantially improved our understanding of the molecular mechanisms of early embryonic and placental development. Made progress. Since ES cells were first described (Non-Patent Documents 2 and 3), ES cells were induced using various empirical combinations of feeder cells, conditioned media, serum, cytokines, growth factors, hormones, and peptides. It has been maintained (Non-Patent Documents 2 to 7). Currently, as a result of enormous trial and error, undifferentiated pluripotent stem cells can be transformed into leukocyte inhibitory factor (LIF) and / or low molecular weight compounds (ie PD0325901, PD184352, PD173074, SU5402, CHIR99021, etc.) It can be efficiently induced and maintained under chemically defined culture conditions (Non-Patent Documents 8 and 9).

TS細胞の樹立及び維持方法として、血清やフィーダー細胞、コンディションドメディウム等組成が化学的に定義されていない培養条件が幾つか報告されている（特許文献1、2；非特許文献10）。また、本発明者らは、化学的定義条件下におけるTS細胞の樹立及び維持方法を近年報告している（非特許文献11）。   As a method for establishing and maintaining TS cells, several culture conditions whose compositions are not chemically defined such as serum, feeder cells, and conditioned medium have been reported (Patent Documents 1 and 2; Non-Patent Document 10). In addition, the present inventors have recently reported a method for establishing and maintaining TS cells under chemically defined conditions (Non-patent Document 11).

いくつかのシグナル経路の干渉（Fgfrの阻害、Mek及び／又はMapkによるFgfシグナルの抑制；I型受容体、Alk4、Alk5、及びAlk7の阻害によるTgf-β/アクチビンシグナルの阻害；及びGsk3の阻害によるWntシグナルの活性化）によりES細胞の多能性が促進されることが報告されている(非特許文献8、9、12)。また、エピブラスト幹細胞（EpiSC）の未分化状態を支持することができる、改変されたEpiSC培養条件が報告されている(非特許文献4)。   Interference of several signaling pathways (inhibition of Fgfr, inhibition of Fgf signal by Mek and / or Mapk; inhibition of Tgf-β / activin signal by inhibition of type I receptors, Alk4, Alk5 and Alk7; and inhibition of Gsk3 It has been reported that ES cell pluripotency is promoted by activation of Wnt signal by (Non-patent Documents 8, 9, and 12). In addition, modified EpiSC culture conditions that can support the undifferentiated state of epiblast stem cells (EpiSC) have been reported (Non-patent Document 4).

特許文献3には、ヒトTS細胞をbFGFで処理すると、Oct4及びfgfr2発現が減少することが記載されている。   Patent Document 3 describes that treatment of human TS cells with bFGF decreases Oct4 and fgfr2 expression.

マウスES細胞は、初期胚中に移植することにより、キメラにおいて、生殖系列を含む全ての型の胎生細胞に寄与することができ、四倍体キメラ形成によってほとんど全てがES細胞由来の個体を生み出すことができる(非特許文献13)。しかしながら、受精卵又は初期胚を用いずにES細胞から個体を生み出すことについては未だ報告されていない。   Murine ES cells can contribute to all types of embryonic cells, including germline, in chimeras by transplanting into early embryos, and tetraploid chimera formation produces almost all ES cell-derived individuals (Non-Patent Document 13). However, it has not yet been reported to produce individuals from ES cells without using fertilized eggs or early embryos.

この現象は、ES細胞が栄養膜系列を生み出すことができないということで、合理的に説明される。しかしながら、いままでに、ES細胞等の多能性幹細胞とTS細胞の凝集により初期胚を再構成する技術は存在しない。   This phenomenon is rationally explained by the inability of ES cells to produce trophoblast lineages. However, until now, there is no technique for reconstructing an early embryo by aggregation of pluripotent stem cells such as ES cells and TS cells.

US 6,630,349 B1US 6,630,349 B1 US 7,642,091 B2US 7,642,091 B2 US 2006/0211110 A1US 2006/0211110 A1

Rossant, R. and Cross, J. C. (2001) 'Placental development: Lessons from mouse mutants', Nature reviews Genetics 2: 538-548.Rossant, R. and Cross, J. C. (2001) 'Placental development: Lessons from mouse mutants', Nature reviews Genetics 2: 538-548. Evans, M. J. and Kaufman, M. H. (1981) 'Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos', nature 292: 154-156.Evans, M. J. and Kaufman, M. H. (1981) 'Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos', nature 292: 154-156. Martin, R. G. (1981) 'Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells', Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 78(12): 7634-7638.Martin, R. G. (1981) 'Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells', Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 78 (12): 7634-7638. Smith, A. G., Heath, J. K., Donaldson, D. D., Wong, G. G., Moreau, J., Stahl, M. and Rogers, D. (1988) 'Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides', nature 336: 688-690.Smith, AG, Heath, JK, Donaldson, DD, Wong, GG, Moreau, J., Stahl, M. and Rogers, D. (1988) 'Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified products', nature 336: 688 -690. Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A. and Gough, N. M. (1988) 'Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells', nature 336: 684-687.Williams, RL, Hilton, DJ, Pease, S., Willson, TA, Stewart, CL, Gearing, DP, Wagner, EF, Metcalf, D., Nicola, NA and Gough, NM (1988) 'Myeloid leukaemia inhibitory factor retaining the developmental potential of embryonic stem cells', nature 336: 684-687. Ying, Q.-L., Nichols, J., Chambers, I. and Smith, A. (2003) 'BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentiation and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in Collaboration with STAT3', Cell 115: 281-292.Ying, Q.-L., Nichols, J., Chambers, I. and Smith, A. (2003) 'BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentiation and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in Collaboration with STAT3', Cell 115: 281-292. Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. and Niwa, H. (2004) 'A novel mechanism for regulating clonal propagation of mouse ES cells', Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms 9(5): 471-7.Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. and Niwa, H. (2004) 'A novel mechanism for regulating clonal propagation of mouse ES cells', Genes to cells: devoted to molecular & cellular mechanisms 9 (5) : 471-7. Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P. and Smith, A. (2008) 'The ground state of embryonic stem cell self-renewal', nature 453(7194): 519-23.Ying, QL, Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P. and Smith, A. (2008) 'The ground state of embryonic stem cell self-renewal ', nature 453 (7194): 519-23. Nichols, J., Silva, J., Roode, M. and Smith, A. (2009) 'Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo', Development 136(19): 3215-22.Nichols, J., Silva, J., Roode, M. and Smith, A. (2009) 'Suppression of Erk signaling promoting ground state pluripotency in the mouse embryo', Development 136 (19): 3215-22. Tanaka, S. (1998) 'Promotion of Trophoblast Stem Cell Proliferation by FGF4', Science 282(5396): 2072-2075.Tanaka, S. (1998) 'Promotion of Trophoblast Stem Cell Proliferation by FGF4', Science 282 (5396): 2072-2075. Ohinata, Y. and Tsukiyama, T. (2014) 'Establishment of Trophoblast Stem Cells under Defined Culture Conditions in mice', PLOS ONE, e107308.Ohinata, Y. and Tsukiyama, T. (2014) 'Establishment of Trophoblast Stem Cells under Defined Culture Conditions in mice', PLOS ONE, e107308. Li, W., Wei, W., Zhu, S., Zhu, J., Shi, Y., Lin, T., Hao, E., Hayek, A., Deng, H. and Ding, S. (2009) 'Generation of rat and human inducedpluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors', Cell stem cell 4(1): 16-9.Li, W., Wei, W., Zhu, S., Zhu, J., Shi, Y., Lin, T., Hao, E., Hayek, A., Deng, H. and Ding, S. ( 2009) 'Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors', Cell stem cell 4 (1): 16-9. Nagy, A., Gocza, E., Diaz, E. M., Prideaux, V. R., Ivanyi,E., Markkula, M. and Rossant, J. (1990) 'Embryonic stem cells alone are able tosupport fetal development in the mouse', Development 110: 815-821.Nagy, A., Gocza, E., Diaz, EM, Prideaux, VR, Ivanyi, E., Markkula, M. and Rossant, J. (1990) 'Embryonic stem cells alone are able tosupport fetal development in the mouse', Development 110: 815-821.

本発明は、多能性幹細胞とTS細胞から初期胚を再構成するための技術を提供することを目的とする。   An object of the present invention is to provide a technique for reconstructing an early embryo from pluripotent stem cells and TS cells.

本発明者は、鋭意検討の結果、TS細胞を単一細胞あるいは数個の細胞からなる凝集塊に分散させ、特定の成分を含む培地中で浮遊培養を行うと、TS細胞は浮遊しながら***し、球状の上皮構造を高効率に自己組織化することを見出した。形成された球状の立体組織は、胚盤胞の様な内腔を有しており、未分化な栄養膜系列細胞のマーカーであるCdx2を高発現していた。この内腔にES細胞を注入した後、立体組織を偽妊娠マウス子宮に移植すると、高効率に着床させることに成功した。従って、インビトロにおいて、TS細胞から、初期胚の栄養膜外胚葉様の機能的な構造体を効率的に作製可能であり、この構造体を用いれば、ES細胞とTS細胞から初期胚を再構成可能であることが示された。   As a result of diligent study, the present inventor dispersed TS cells into agglomerates consisting of a single cell or several cells, and carried out suspension culture in a medium containing specific components. And found that the spherical epithelial structure self-assembles with high efficiency. The formed spherical three-dimensional tissue had a blastocyst-like lumen and highly expressed Cdx2, which is a marker for undifferentiated trophoblast-lineage cells. After injecting ES cells into this lumen, the three-dimensional tissue was transplanted into a pseudopregnant mouse uterus, and it succeeded in implantation with high efficiency. Therefore, it is possible to efficiently produce a trophoblast-like ectoderm-like functional structure of early embryos from TS cells in vitro, and this structure can be used to reconstruct early embryos from ES cells and TS cells. It was shown to be possible.

発明者らは、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである： The inventors have further studied based on the above findings and have completed the present invention.
That is, the present invention is as follows:

［１］哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含む培地中で浮遊培養することを含む、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造方法。
［２］培地が更にWntシグナル阻害剤を含む、［１］記載の製造方法。
［３］培地が更にヘパリンを含む、［１］又は［２］記載の製造方法。
［４］培地が更にROCK阻害剤を含む、［１］〜［３］のいずれか記載の製造方法。
［５］培地が、基底膜調製物のゲル成分を含まない、［１］〜［４］のいずれか記載の製造方法。
［６］浮遊培養に供する哺乳動物栄養膜幹細胞が、単一細胞又は２〜１０個の細胞からなる細胞凝集塊に分散されている、［１］〜［５］のいずれか記載の製造方法。
［７］浮遊培養に供する哺乳動物栄養膜幹細胞が、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地中で培養することにより樹立されたものである、［１］〜［６］のいずれか記載の製造方法。
［８］［１］〜［７］のいずれか記載の製造方法により製造された、栄養膜外胚葉様胞状構造体。
［９］哺乳動物栄養膜幹細胞及び当該栄養膜幹細胞に由来する栄養膜系列細胞からなる、［８］記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体。
［１０］哺乳動物多能性幹細胞を注入後、偽妊娠哺乳動物の子宮内に移植した際に、子宮に着床する活性を有する、［８］又は［９］記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体。
［１１］哺乳動物多能性幹細胞を、［８］〜［１０］のいずれか記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入することを含む、哺乳動物胚の製造方法。
［１２］注入した哺乳動物多能性幹細胞又は当該多能性可能性幹細胞に由来する細胞を含む栄養膜外胚葉様胞状構造体を哺乳動物の子宮内に移植し、当該子宮に着床させることを更に含む、［１１］記載の製造方法。 [1] An trophoblastic ectoderm-like structure comprising suspension culture of a mammalian trophoblast stem cell in a medium containing a non-gel water-soluble component of an FGF, an activin signal pathway agonist, and a basement membrane preparation Production method.
[2] The production method of [1], wherein the medium further contains a Wnt signal inhibitor.
[3] The production method of [1] or [2], wherein the medium further contains heparin.
[4] The production method according to any one of [1] to [3], wherein the medium further contains a ROCK inhibitor.
[5] The production method according to any one of [1] to [4], wherein the medium does not contain the gel component of the basement membrane preparation.
[6] The production method according to any one of [1] to [5], wherein mammalian trophoblast stem cells to be subjected to suspension culture are dispersed in a single cell or a cell aggregate composed of 2 to 10 cells.
[7] Mammalian trophoblast stem cells to be subjected to suspension culture are established by culturing mammalian trophectoderm or extraembryonic ectoderm in a medium containing FGF2 and activin signaling pathway agonists. [1] The production method according to any one of [6].
[8] A trophoblastic embryoid vesicular structure produced by the production method according to any one of [1] to [7].
[9] The trophoblast-ectoderm-like vesicular structure according to [8], comprising mammalian trophoblast stem cells and trophoblast lineage cells derived from the trophoblast stem cells.
[10] The trophoblastic ectoderm-like follicular form according to [8] or [9], which has an activity of implanting into the uterus when injected into a uterus of a pseudopregnant mammal after injecting a mammalian pluripotent stem cell Structure.
[11] A method for producing a mammalian embryo, comprising injecting a mammalian pluripotent stem cell into the trophoblastic ectoderm-like vesicular structure according to any one of [8] to [10].
[12] Transplanting the infused mammalian pluripotent stem cells or trophoblastic ectoderm-like vesicular structures containing cells derived from the pluripotent stem cells into the uterus of a mammal, and implanting the uterus The production method according to [11], further comprising:

本発明によれば、TS細胞から、栄養膜外胚葉様の機能的な胞状構造体を製造することができる。この胞状構造体は、内腔に多能性幹細胞を注入後、哺乳動物の子宮内に移植すると、子宮に着床する活性を有するので、多能性幹細胞とTS細胞から初期胚を再構成することが可能となる。   According to the present invention, a trophoblast-like functional alveolar structure can be produced from TS cells. This alveolar structure has an activity of implanting into the uterus after injecting pluripotent stem cells into the lumen and then transplanting it into the uterus of a mammal, so it reconstructs the early embryo from pluripotent stem cells and TS cells. It becomes possible.

GOF18-EGFP (Oct3/4-EGFP)レポーター導入遺伝子を有するE3.5胚盤胞。スケールバー、50μm。E3.5 blastocyst with GOF18-EGFP (Oct3 / 4-EGFP) reporter transgene. Scale bar, 50 μm. CDM/LIF/2i（左）及びCDM/FAXY (FGF2、12.5 ng/ml)（右）中で5日目に生じた増殖物。スケールバー、100μm。Proliferation occurring on day 5 in CDM / LIF / 2i (left) and CDM / FAXY (FGF2, 12.5 ng / ml) (right). Scale bar, 100 μm. 継代1日目（上）、2日目（中）、及び3日目（下）におけるTS細胞コロニーの形態。スケールバー、100μm。TS cell colony morphology on passage 1st day (top), 2nd day (middle), and 3rd day (bottom). Scale bar, 100 μm. E3.5胚盤胞（左）及びE6.5 ExE（右）から誘導されたTS細胞。スケールバー、100μm。TS cells derived from E3.5 blastocyst (left) and E6.5 ExE (right). Scale bar, 100 μm. フィブロネクチンコートしたプラスチック底ディッシュ上のTS細胞の免疫蛍光染色。スケールバー、100μm。Immunofluorescence staining of TS cells on fibronectin-coated plastic bottom dishes. Scale bar, 100 μm. CDM/LIF/2i中のES細胞（赤）及びCDM/FAXY 中のE3.5胚盤胞由来TS細胞（青）の増殖。Proliferation of ES cells (red) in CDM / LIF / 2i and E3.5 blastocyst-derived TS cells (blue) in CDM / FAXY. ES細胞、E3.5胚盤胞由来TS細胞、及びE6.5 ExE由来TS細胞の間の、ES細胞特異的遺伝子、普遍的に発現している遺伝子、及びTS細胞特異的遺伝子の発現レベルの比較。Expression levels of ES cell-specific genes, universally expressed genes, and TS cell-specific genes among ES cells, E3.5 blastocyst-derived TS cells, and E6.5 ExE-derived TS cells Comparison. ES細胞、E3.5胚盤胞由来TS細胞、及びE6.5 ExE由来TS細胞の間の、外胚葉遺伝子、中胚葉遺伝子、及び内胚葉遺伝子の発現レベルの比較。Comparison of expression levels of ectoderm, mesoderm, and endoderm genes among ES cells, E3.5 blastocyst-derived TS cells, and E6.5 ExE-derived TS cells. 12.5 ng/ml、25 ng/ml、及び50 ng/mlにおける、FGF2のTS細胞マーカー遺伝子及び分化した栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルに対する用量依存的効果。Dose-dependent effect on the expression level of FGF2 TS cell marker gene and differentiated trophoblast lineage marker gene at 12.5 ng / ml, 25 ng / ml and 50 ng / ml. ES細胞とE3.5胚盤胞由来TS細胞との間の、FGFリガンドファミリー遺伝子の発現レベルの比較。Comparison of expression levels of FGF ligand family genes between ES cells and E3.5 blastocyst-derived TS cells. ES細胞とE3.5胚盤胞由来TS細胞との間の、FGF受容体遺伝子の発現レベルの比較。Comparison of expression level of FGF receptor gene between ES cells and E3.5 blastocyst-derived TS cells. FGF2 (-F、左から2番目)、アクチビンA (-A、右から2番目)、又はXAV939(-X、右)の除去時のTS細胞の形態学的変化。FAXYはコントロールとして未分化TS細胞を表す（左）。スケールバー、100μm。Morphological changes in TS cells upon removal of FGF2 (-F, second from left), activin A (-A, second from right), or XAV939 (-X, right). FAXY represents undifferentiated TS cells as a control (left). Scale bar, 100 μm. FGF2 (-F)の除去時のTS細胞マーカー遺伝子の発現レベルの変化。Changes in the expression level of the TS cell marker gene upon removal of FGF2 (-F). アクチビンA (-A)の除去時のTS細胞マーカー遺伝子の発現レベルの変化。Change in expression level of TS cell marker gene upon removal of activin A (-A). XAV939 (-X) の除去時のTS細胞マーカー遺伝子の発現レベルの変化。Change in expression level of TS cell marker gene upon removal of XAV939 (-X). FGF2 (-F)の除去時の栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化。Change in expression level of trophoblast marker gene upon removal of FGF2 (-F). アクチビンA (-A)の除去時の栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化。Change in expression level of trophoblast series marker gene upon removal of activin A (-A). XAV939 (-X) の除去時の栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化。Changes in the expression level of trophoblast lineage marker genes upon removal of XAV939 (-X). FAM-FLICAによる、蛍光ベースでのポリカスパーゼ陽性細胞の検出。未分化コントロール(FAXY、左)及びY27632除去(-Y、右)。スケールバー、100μm。Fluorescence-based detection of polycaspase positive cells with FAM-FLICA. Undifferentiated control (FAXY, left) and Y27632 removed (-Y, right). Scale bar, 100 μm. ポリカスパーゼ陽性細胞の定量、百分率（％）で示す。Quantification and percentage (%) of polycaspase positive cells. フィブロネクチン（左）及びマトリゲル（右）上のTS細胞コロニーの形態。スケールバー、100μm。TS cell colony morphology on fibronectin (left) and Matrigel (right). Scale bar, 100 μm. E14.5胚におけるTS細胞の胎盤特異的寄与。Placenta-specific contribution of TS cells in E14.5 embryos. E14.5における胎盤切片のDAPI染色（灰色）及びEGFP蛍光（緑）の共焦点マージイメージ。de、脱落膜；gi、巨細胞；sp、海綿状栄養膜細胞；la、ラビリンス；ch、絨毛膜。スケールバー、200μm。Confocal merged image of DAPI staining (grey) and EGFP fluorescence (green) of placenta sections at E14.5. de, decidua; gi, giant cell; sp, spongiform trophoblast cell; la, labyrinth; ch, chorion. Scale bar, 200 μm. 培養したTS細胞の形態を示す。左の写真は、血清を含むMEF条件培地に、FGF4及びヘパリンを添加した、従来技術の培地中で培養したTS細胞、右の写真は、血清を含むMEF条件培地に、FGF2、ヘパリン、アクチビンA、XAV939を添加した培地中で培養したTS細胞を、それぞれ示す。The morphology of cultured TS cells is shown. Left photo shows TS cells cultured in a conventional medium with FGF4 and heparin added to MEF conditioned medium containing serum, right photo shows FGF2, heparin, activin A in MEF conditioned medium containing serum , TS cells cultured in a medium supplemented with XAV939 are shown. TS細胞の浮遊培養による、栄養膜外胚葉様構造体の形成。左図は、培養開始時における分散したTS細胞を示す。右図は、培養開始３日後に形成された栄養膜外胚葉様構造体を示す。Formation of trophoblast-like germ layer-like structures by suspension culture of TS cells. The left figure shows dispersed TS cells at the start of culture. The right figure shows an trophoblast-like germ layer-like structure formed 3 days after the start of culture. 栄養膜外胚葉様構造体におけるCdx2発現。左：明視野、中：Cdx2、右：核。Cdx2 expression in trophoblast-like germ layer-like structures. Left: bright field, middle: Cdx2, right: nucleus. 栄養膜外胚葉様構造体へのES細胞の注入。左写真：注入操作。右写真：左：明視野、中：ES細胞、右：重ね合わせ。Injection of ES cells into trophoblastic ectoderm-like structures. Left photo: Injection operation. Right photo: left: bright field, middle: ES cells, right: superimposed. ES細胞を注入した栄養膜外胚葉様構造体の着床後の脱落膜形成。Decidual membrane formation after implantation of trophoblast-like germ layer-like structures injected with ES cells.

本発明は、哺乳動物栄養膜幹細胞から栄養膜外胚葉様胞状構造体を製造する方法を提供する。また、本発明は、当該製造方法により製造された栄養膜外胚葉様胞状構造体を提供する。更に、本発明は、当該栄養膜外胚葉様胞状構造体を用いた哺乳動物胚の製造方法を提供する。   The present invention provides a method for producing trophoblast ectoderm-like alveolar structures from mammalian trophoblast stem cells. In addition, the present invention provides a trophoblastic ectoderm-like vesicular structure produced by the production method. Furthermore, the present invention provides a method for producing a mammalian embryo using the trophoblast epidermoid structure.

Ｉ．栄養膜幹（TS）細胞
本明細書において、栄養膜幹（TS）細胞は、以下の4つ全ての形質を備える細胞を意味する：
（1）自己複製能、
（2）TS細胞マーカー遺伝子発現陽性、
（3）インビトロにおいて、栄養膜サブタイプへ分化する能力、
（4）キメラにおいて、胎盤へ寄与する能力。 I. Trophoblast stem (TS) cell As used herein, a trophoblast stem (TS) cell means a cell with all four traits:
(1) Self-replication ability,
(2) Positive expression of TS cell marker gene,
(3) ability to differentiate into trophoblast subtypes in vitro,
(4) Ability to contribute to the placenta in chimeras.

（1）の自己複製能は、（2）〜（4）の形質を維持したまま、細胞が増殖する能力を意味する。   The self-replicating ability of (1) means the ability of cells to grow while maintaining the traits of (2) to (4).

（2）のTS細胞マーカーとしては、eomesodermin (Eomes)、E74-like factor 5 (Elf5)、Cdx2、Klf5、Esrrb、Sox2、Tcfap2c等が挙げられる。本発明においては、Eomes、Elf5、Cdx2、Klf5、Esrrb、Sox2及びTcfap2cからなる群から選択される少なくとも1つのTS細胞マーカーを発現している場合、「TS細胞マーカー遺伝子発現陽性」と判断する。一態様において、本発明において用いられるTS細胞は、Eomes、Elf5、Cdx2、Klf5、Esrrb、Sox2及びTcfap2cの全てのTS細胞マーカー遺伝子発現が陽性である。TS細胞マーカー遺伝子の発現は、定量的RT-PCRにより決定することができる。   Examples of the TS cell marker (2) include eomesodermin (Eomes), E74-like factor 5 (Elf5), Cdx2, Klf5, Esrrb, Sox2, and Tcfap2c. In the present invention, if at least one TS cell marker selected from the group consisting of Eomes, Elf5, Cdx2, Klf5, Esrrb, Sox2 and Tcfap2c is expressed, it is determined as “TS cell marker gene expression positive”. In one embodiment, the TS cells used in the present invention are positive for expression of all TS cell marker genes of Eomes, Elf5, Cdx2, Klf5, Esrrb, Sox2 and Tcfap2c. The expression of the TS cell marker gene can be determined by quantitative RT-PCR.

TS細胞は、他の系列マーカー遺伝子発現陰性により更に特徴付けられてもよい。一態様において、本発明に用いられるTS細胞は、Nanog、Cripro、Klf2、Oct3/4及びKlf4からなる群から選択される1以上（好ましくは全て）のES細胞マーカー遺伝子発現陰性である。一態様において、本発明に用いられるTS細胞は、Nestin、Sox1及びNcamからなる群から選択される1以上（好ましくは全て）の外胚葉マーカー遺伝子発現陰性である。一態様において、本発明に用いられるTS細胞は、Hoxa1、Hoxb1、Flk1及びTからなる群から選択される1以上（好ましくは全て）の中胚葉マーカー遺伝子発現陰性である。一態様において、本発明に用いられるTS細胞は、Gata4、Gata6、Afp及びFoxa2からなる群から選択される1以上（好ましくは全て）の内胚葉マーカー遺伝子発現陰性である。   TS cells may be further characterized by negative expression of other lineage marker genes. In one embodiment, the TS cells used in the present invention are negative for expression of one or more (preferably all) ES cell marker genes selected from the group consisting of Nanog, Cripro, Klf2, Oct3 / 4 and Klf4. In one embodiment, the TS cells used in the present invention are negative for expression of one or more (preferably all) ectoderm marker genes selected from the group consisting of Nestin, Sox1 and Ncam. In one embodiment, the TS cells used in the present invention are negative for expression of one or more (preferably all) mesoderm marker genes selected from the group consisting of Hoxa1, Hoxb1, Flk1 and T. In one embodiment, the TS cells used in the present invention are negative for expression of one or more (preferably all) endoderm marker genes selected from the group consisting of Gata4, Gata6, Afp and Foxa2.

（3）のインビトロにおいて、栄養膜サブタイプへ分化する能力は、インビトロにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜からなる群から選択される少なくとも1つの栄養膜サブタイプへ分化する能力を意味する。各栄養膜サブタイプへの分化は、各栄養膜サブタイプのマーカー遺伝子発現により確認することができる。栄養膜サブタイプへ分化する能力は、評価対象の細胞を、栄養膜サブタイプへの分化条件化で培養したときに、栄養膜サブタイプのマーカー遺伝子の発現が誘導されるか否かを指標に評価することができる。栄養膜巨細胞のマーカー遺伝子としては、PL-1、Hand1等を挙げることができる。海綿状栄養膜のマーカー遺伝子としては、Mash2、Tpbp/-4311等を挙げることができる。ラビリンス栄養膜のマーカー遺伝子としては、Esx1、Dlx3等を挙げることができる。特定の栄養膜サブタイプのマーカー遺伝子のうち少なくとも1つが上昇した場合、当該栄養膜サブタイプへの分化が誘導されたと評価する。栄養膜サブタイプへの分化条件としては、後述する実施例におけるCDM-FAXY条件から、FGF2又はアクチビンAのいずれかを除去した条件を挙げることができる。   The ability to differentiate into trophoblast subtype in (3) is differentiated in vitro into at least one trophoblast subtype selected from the group consisting of trophoblast giant cells, spongy trophoblasts, and labyrinth trophoblasts Means ability to do. Differentiation into each trophoblast subtype can be confirmed by marker gene expression of each trophoblast subtype. The ability to differentiate into the trophoblast subtype is determined by whether or not the expression of the marker gene of the trophoblast subtype is induced when the cells to be evaluated are cultured under the differentiation condition to the trophoblast subtype. Can be evaluated. Examples of trophoblast giant cell marker genes include PL-1, Hand1, and the like. Examples of the spongy trophoblast marker gene include Mash2, Tpbp / -4311, and the like. Examples of marker genes for labyrinth trophoblasts include Esx1, Dlx3, and the like. When at least one marker gene of a specific trophoblast subtype is elevated, it is evaluated that differentiation into the trophoblast subtype is induced. Examples of conditions for differentiation into trophoblast subtypes include conditions in which either FGF2 or activin A is removed from the CDM-FAXY conditions in the examples described later.

ここで、本明細書において、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有するTS細胞を「未分化のTS細胞」と称する。一方、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜からなる群から選択される一部（即ち、1又は2）の栄養膜サブタイプへのみ分化する能力を有するTS細胞を「分化したTS細胞」と称する。本発明において用いられるTS細胞は、好ましくは、未分化のTS細胞である。   Herein, TS cells having the ability to differentiate into all trophoblast subtypes of trophoblast giant cells, spongy trophoblasts, and labyrinth trophoblasts are referred to as “undifferentiated TS cells”. On the other hand, “differentiated TS cells having the ability to differentiate into only a part (ie, 1 or 2) of trophoblast subtype selected from the group consisting of trophoblast giant cells, spongy trophoblasts, and labyrinth trophoblasts Referred to as “TS cells”. The TS cells used in the present invention are preferably undifferentiated TS cells.

（4）のキメラにおいて、胎盤へ寄与する能力は、評価対象の細胞を胚盤胞中へ注入し、偽妊娠動物の子宮角へ移入したときに、評価対象の細胞が発生キメラ子孫動物の胎盤の胎仔部位へ寄与するか否かを試験することにより評価することができる。胎盤の胎仔部位において、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜からなる群から選択される少なくとも1つの栄養膜系列への寄与がある場合、評価対象の細胞は、キメラにおいて胎盤へ寄与する能力を有すると評価することができる。   In the chimera in (4), the ability to contribute to the placenta is that the cell to be evaluated is generated when the cell to be evaluated is injected into the blastocyst and transferred to the uterine horn of a pseudopregnant animal. It can be evaluated by testing whether or not it contributes to the fetal site. If the placental fetal region has a contribution to at least one trophoblast lineage selected from the group consisting of trophoblast giant cells, spongy trophoblasts, and labyrinth trophoblasts, the cells to be evaluated are sent to the placenta in the chimera It can be evaluated that it has the ability to contribute.

栄養膜外胚葉とは、胚盤胞において、内部細胞塊と胞胚腔を覆うように胚盤胞の外部に存在する細胞をいう。   The trophoblast ectoderm refers to a cell existing outside the blastocyst so as to cover the inner cell mass and the blastocoel in the blastocyst.

胚体外外胚葉とは、胚盤葉のうち胚体域の周辺にあって胚体の形成に寄与しない部位をいう。胚体外外胚葉は着床後に、栄養外胚葉から形成される。   The extraembryonic ectoderm is a part of the blastoderm that is located around the embryonic body area and does not contribute to the formation of the embryo body. The extraembryonic ectoderm is formed from the trophectoderm after implantation.

哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）である。尚、ヒト胚の破壊を伴うプロセスは、倫理的に実施困難であるが、倫理的問題が生じない限り、本発明は、ヒト栄養膜外胚葉様胞状構造体、及びその製造；並びに、当該ヒト栄養膜外胚葉様胞状構造体を用いたヒト胚の製造をも包含する。   Examples of mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, rabbit eyes such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats, horses, and sheep, cats such as dogs and cats, and humans Primates such as monkeys, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, marmosets, orangutans and chimpanzees. The mammal is preferably a rodent (such as a mouse) or a primate (human and non-human primate). It should be noted that a process involving destruction of a human embryo is ethically difficult to implement, but unless an ethical problem arises, the present invention relates to a human trophoblast ectoderm-like structure and its production; It also includes the production of human embryos using trophoblastic ectoderm-like vesicular structures.

哺乳動物の系統は特に限定されないが、例えば、マウスの系統としては、純系としてC57BL/6系統、BALB/c系統、C3H系統、FVB系統、DBA2系統など、交雑系としてB6C3F1系統、BDF1系統、B6D2F1系統、ICR系統などを、ラットの系統としては、Wistar、SDなどを挙げることができる。   Mammal strains are not particularly limited, but for example, mouse strains include C57BL / 6 strain, BALB / c strain, C3H strain, FVB strain, DBA2 strain, etc. as pure strains, B6C3F1 strain, BDF1 strain, B6D2F1 Examples of strains, ICR strains, and rat strains include Wistar and SD.

本発明に用いられるTS細胞は、自体公知の方法により、栄養膜外胚葉又は胚体外外胚葉より樹立し、維持することが出来る。TS細胞の樹立及び維持方法として、血清やフィーダー細胞、コンディションドメディウム等組成が化学的に定義されていない培養条件が幾つか報告されている（US 6,630,349 B1；US 7,642,091 B2；Tanaka, S. (1998) 'Promotion of Trophoblast Stem Cell Proliferation by FGF4', Science 282(5396): 2072-2075）。また、化学的定義条件下におけるTS細胞の樹立及び維持方法が報告されている（Ohinata, Y. and Tsukiyama, T. (2014) 'Establishment of Trophoblast Stem Cells under Defined Culture Conditions in mice', PLOS ONE, e107308）。   TS cells used in the present invention can be established and maintained from trophoblastic or extraembryonic ectoderm by a method known per se. As a method for establishing and maintaining TS cells, several culture conditions whose composition is not chemically defined, such as serum, feeder cells, and conditioned medium have been reported (US 6,630,349 B1; US 7,642,091 B2; Tanaka, S. ( 1998) 'Promotion of Trophoblast Stem Cell Proliferation by FGF4', Science 282 (5396): 2072-2075). In addition, methods for establishing and maintaining TS cells under chemically defined conditions have been reported (Ohinata, Y. and Tsukiyama, T. (2014) 'Establishment of Trophoblast Stem Cells under Defined Culture Conditions in mice', PLOS ONE, e107308).

本発明に用いられるTS細胞は、好ましくは、以下の「TS細胞の製造方法Ｉ」により製造されたTS細胞、又は「TS細胞の培養方法Ｉ」により維持されたTS細胞である。   The TS cell used in the present invention is preferably a TS cell produced by the following “TS cell production method I” or a TS cell maintained by “TS cell culture method I”.

1．TS細胞の製造方法Ｉ
TS細胞の製造方法Ｉは、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、生体外において、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地中で培養することを含む。 1． TS cell production method I
TS cell production method I includes culturing mammalian trophectoderm or extraembryonic ectoderm in vitro in a medium containing FGF2 and activin signaling pathway agonists.

栄養膜外胚葉とは、胚盤胞において、内部細胞塊と胞胚腔を覆うように胚盤胞の外部に存在する細胞をいう。   The trophoblast ectoderm refers to a cell existing outside the blastocyst so as to cover the inner cell mass and the blastocoel in the blastocyst.

哺乳動物栄養外胚葉は、胚から単離された栄養外胚葉として、又は栄養外胚葉を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）として、培養に供することができる。単離された栄養外胚葉は、栄養外胚葉を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）から、内部細胞塊（ICM）を除去することにより、得ることができる。胚盤胞から、マイクロカッター等で栄養外胚葉の一部を採取することにより、胚を破壊することなく、栄養膜外胚葉を単離することもできる。従って、胚破壊を要することなくTS細胞を樹立することが可能である。栄養外胚葉を、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中で培養すると良好に増殖しTS細胞が誘導されるのに対して、ICMを同培地中で培養してもほとんど増殖しない。従って、栄養外胚葉及び内部細胞塊を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）を、そのまま培養に供すると、栄養外胚葉から誘導されたTS細胞が、内部細胞塊から誘導された細胞を凌駕し、培養物中の大多数が栄養外胚葉から誘導されたTS細胞となる。従って、操作容易の観点から、一態様において、栄養外胚葉を、栄養外胚葉を含む哺乳動物胚（例、桑実胚、胚盤胞）として、培養に供するのが好ましい。   The mammalian trophectoderm can be subjected to culture as a trophectoderm isolated from the embryo or as a mammalian embryo containing the trophectoderm (eg, morula, blastocyst). An isolated trophectoderm can be obtained by removing the inner cell mass (ICM) from a mammalian embryo (eg, morula, blastocyst) containing the trophectoderm. By collecting a part of the vegetative ectoderm from the blastocyst with a microcutter or the like, the trophoblast ectoderm can be isolated without destroying the embryo. Therefore, TS cells can be established without requiring embryo destruction. When the vegetative ectoderm is cultured in a medium containing FGF2, activin signal pathway agonist, and Wnt signal inhibitor (preferably a medium containing FGF2, activin signal pathway agonist, Wnt signal inhibitor, and ROCK inhibitor). While it proliferates well and induces TS cells, it hardly grows even if ICM is cultured in the same medium. Accordingly, when a mammalian embryo containing a trophectoderm and an inner cell mass (eg, morula, blastocyst) is directly subjected to culture, TS cells derived from the trophectoderm are induced from the inner cell mass. The majority of the cultures are TS cells derived from trophectoderm. Therefore, from the viewpoint of ease of operation, in one embodiment, it is preferable that the vegetative ectoderm is subjected to culture as a mammalian embryo containing the vegetative ectoderm (eg, morula, blastocyst).

胚体外外胚葉とは、胚盤葉のうち胚体域の周辺にあって胚体の形成に寄与しない部位をいう。胚体外外胚葉は着床後に、栄養外胚葉から形成される。   The extraembryonic ectoderm is a part of the blastoderm that is located around the embryonic body area and does not contribute to the formation of the embryo body. The extraembryonic ectoderm is formed from the trophectoderm after implantation.

哺乳動物胚体外外胚葉は、胚から単離された胚体外外胚葉として、又は胚体外外胚葉を含む哺乳動物胚として、培養に供することができる。単離された胚体外外胚葉は、胚体外外胚葉を含む哺乳動物胚から、エピブラストを除去することにより、得ることができる。胚体外外胚葉と同様に、エピブラストを、FGF2、及びアクチビンシグナル経路作用物質（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤）を含む培地中で培養すると、良好に増殖し、エピブラスト幹細胞が樹立される。従って、エピブラスト幹細胞の混入を抑制する観点から、胚体外外胚葉を、胚から単離された胚体外外胚葉として、培養に供するのが好ましい。一態様において、エピブラストを含まない、単離された胚体外外胚葉が、培養に供される。   The mammalian embryonic ectoderm can be subjected to culture as an extraembryonic ectoderm isolated from the embryo or as a mammalian embryo containing the extraembryonic ectoderm. An isolated extraembryonic ectoderm can be obtained by removing epiblast from a mammalian embryo containing the extraembryonic ectoderm. As with the extraembryonic ectoderm, epiblasts are treated with FGF2, and activin signaling pathway agonists (preferably FGF2, activin signaling pathway agonists and Wnt signal inhibitors, more preferably FGF2, activin signaling pathway agonists, Wnt When cultured in a medium containing a signal inhibitor and a ROCK inhibitor), the cells proliferate well and establish epiblast stem cells. Therefore, from the viewpoint of suppressing contamination with epiblast stem cells, it is preferable to subject the extraembryonic ectoderm to culture as an extraembryonic ectoderm isolated from the embryo. In one embodiment, isolated extraembryonic ectoderm, free of epiblast, is subjected to culture.

栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を含む胚の胎生日齢は、動物種により異なるため、一概に規定することはできないが、各種哺乳動物の胚発生について詳細に報告されているので、当業者であれば、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を含む適切な胎生日齢の胚を容易に得ることができる。マウスについては、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を含む胚の胎生日齢は、通常E2〜10日、好ましくはE3.5〜6.5日である。   Since the embryonic age of embryos containing trophectoderm or extraembryonic ectoderm differs depending on the animal species, it cannot be defined unconditionally, but it has been reported in detail for embryo development in various mammals. If present, it is possible to easily obtain embryos of an appropriate embryonic day including trophectoderm or extraembryonic ectoderm. For mice, the embryonic age of embryos containing trophectoderm or extraembryonic ectoderm is usually E2 to 10 days, preferably E3.5 to 6.5 days.

FGF2、及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（培地Ｉ）の組成について説明する。培地Ｉは、TS細胞の製造方法Ｉ及び下記のTS細胞の培養方法Ｉにおいて好適に使用され得る。   The composition of a medium (medium I) containing FGF2 and activin signal pathway acting substances will be described. The medium I can be suitably used in TS cell production method I and TS cell culture method I described below.

FGFは、公知のサイトカインであり、ヒト及びマウスにおいては、FGF1〜FGF23が確認されている。ヒトFGF19はマウスFGF15のオルソログであるので、ヒト及びマウスのFGFファミリーは22のメンバーで構成される（TRENDS in Genetics, Vol.20, No.11, p.563-569, 2004、Genome Biol., vol.2, 3005.1-3005.12, 2001）。本明細書において、FGFの呼称はヒトFGFのノメンクラチャに従うものとする。本発明において用いられるFGFは、栄養外胚葉又は胚体外胚葉から栄養膜幹細胞への分化、或いは栄養膜幹細胞の維持培養を可能とするものであれば、特に限定されないが、好ましくは、FGF2又はFGF4である。本発明に用いるFGF（例、FGF2、FGF4）は、通常哺乳動物のFGFである。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。FGF（例、FGF2、FGF4）は、多くの哺乳動物の種間で交差反応性を有するので、本発明の目的を達成し得る限り、いずれの哺乳動物のFGF（例、FGF2、FGF4）を用いてもよいが、好適には、培養する細胞と同一種の哺乳動物のFGF（例、FGF2、FGF4）が用いられる。例えば、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のFGF（例、FGF2、FGF4）が用いられる。ここで、例えば、マウスFGF2とは、FGF2が、マウスが生体内で天然に発現するFGF2のアミノ酸配列を有することを意味する。本明細書中、他のタンパク質等についても、同様に解釈する。   FGF is a known cytokine, and FGF1 to FGF23 have been confirmed in humans and mice. Since human FGF19 is an ortholog of mouse FGF15, the human and mouse FGF families are composed of 22 members (TRENDS in Genetics, Vol. 20, No. 11, p.563-569, 2004, Genome Biol., vol.2, 3005.1-3005.12, 2001). In this specification, the name of FGF follows the nomenclature of human FGF. The FGF used in the present invention is not particularly limited as long as it enables differentiation from vegetative ectoderm or definitive endoderm to trophoblast stem cells, or maintenance culture of trophoblast stem cells, but preferably FGF2 or FGF4 It is. The FGF (eg, FGF2, FGF4) used in the present invention is usually a mammalian FGF. Examples of mammals include those described above. Since FGF (eg, FGF2, FGF4) has cross-reactivity among many mammalian species, any mammalian FGF (eg, FGF2, FGF4) can be used as long as the object of the present invention can be achieved. Preferably, mammalian FGF of the same species as the cell to be cultured (eg, FGF2, FGF4) is used. For example, rodent (mouse, rat, etc.) or primate (human etc.) FGF (eg, FGF2, FGF4) is used. Here, for example, mouse FGF2 means that FGF2 has the amino acid sequence of FGF2 that the mouse naturally expresses in vivo. In the present specification, other proteins and the like are interpreted in the same manner.

FGF2は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）とも呼ばれる、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。マウスFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_032032.1（2014年2月18日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-9）を除いたアミノ酸配列（成熟型マウスFGF2アミノ酸配列）等を例示することができる。ヒトFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001997.5（2014年2月18日更新）等を例示することができる。   FGF2 is a known cytokine, also called basic fibroblast growth factor (bFGF), and its amino acid sequence is also known. The representative amino acid sequence of mouse FGF2 is NCBI accession number, NP_032032.1 (updated on February 18, 2014), and the amino acid sequence excluding the N-terminal signal sequence (1-9) from this amino acid sequence ( Examples include mature mouse FGF2 amino acid sequence). As a representative amino acid sequence of human FGF2, NP_001997.5 (updated on February 18, 2014) can be exemplified by the NCBI accession number.

マウスFGF4の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_034332.2（2014年5月26日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-29）を除いたアミノ酸配列（成熟型マウスFGF4アミノ酸配列）等を例示することができる。ヒトFGF4の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001998.1（2014年4月20日更新）、このアミノ酸配列からN末端シグナル配列（1-30）を除いたアミノ酸配列（成熟型ヒトFGF4アミノ酸配列）等を例示することができる。   The representative amino acid sequence of mouse FGF4 is NCBI accession number, NP_034332.2 (updated on May 26, 2014), and the amino acid sequence obtained by removing the N-terminal signal sequence (1-29) from this amino acid sequence ( Examples include mature mouse FGF4 amino acid sequence). The representative amino acid sequence of human FGF4 is the NCBI accession number, NP_001998.1 (updated on April 20, 2014), and the amino acid sequence obtained by removing the N-terminal signal sequence (1-30) from this amino acid sequence ( Examples include mature human FGF4 amino acid sequence).

本発明において使用されるFGF（例、FGF2、FGF4）は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたタンパク質X」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Xの重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。   The FGF (eg, FGF2, FGF4) used in the present invention is preferably isolated. “Isolation” means that an operation to remove a target component or a factor other than cells has been performed, and the state existing in nature has been removed. The purity of “isolated protein X” (percentage of the weight of protein X in the total protein weight) is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 99% or more, Most preferably 100%.

培地中における、FGF2の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常1 ng/ml以上、好ましくは、12.5 ng/ml以上、より好ましくは25 ng/ml以上、更に好ましくは50 ng/ml以上である。TS細胞の未分化状態を良好に維持する観点から、FGF2濃度を25 ng/ml以上、好ましくは50 ng/ml以上とすることが好ましい。細胞増殖への悪影響がない限りFGF2濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、500 ng/ml以下である。一態様において、培地中のFGF2濃度は、通常1〜1000 ng/ml、好ましくは12.5〜500 ng/ml、より好ましくは25〜500 ng/ml、更に好ましくは50〜500 ng/mlである。FGF2は、特に、TS細胞の増殖及び未分化状態の維持に寄与する。   The concentration of FGF2 in the medium is not particularly limited as long as it is a concentration that can achieve a desired effect such as induction of TS cells from trophectoderm or extraembryonic ectoderm, and proliferation of TS cells. 1 ng / ml or more, preferably 12.5 ng / ml or more, more preferably 25 ng / ml or more, still more preferably 50 ng / ml or more. From the viewpoint of favorably maintaining the undifferentiated state of TS cells, the FGF2 concentration is preferably 25 ng / ml or more, preferably 50 ng / ml or more. The upper limit of the FGF2 concentration is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth, but it is usually 1000 ng / ml or less, preferably 500 ng / ml or less from the viewpoint of culture cost. In one embodiment, the concentration of FGF2 in the medium is usually 1-1000 ng / ml, preferably 12.5-500 ng / ml, more preferably 25-500 ng / ml, and even more preferably 50-500 ng / ml. FGF2 particularly contributes to TS cell proliferation and maintenance of undifferentiated state.

アクチビンシグナル経路作用物質としては、アクチビン、作動性抗アクチビン受容体抗体、アクチビン受容体アゴニスト等を挙げることができる。アクチビンは公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。本発明に用いるアクチビンは、通常哺乳動物のアクチビンである。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。アクチビンは、多くの哺乳動物の種間で交差反応性を有するので、本発明の目的を達成し得る限り、いずれの哺乳動物のアクチビンを用いてもよいが、好適には、培養する細胞と同一種の哺乳動物のアクチビンが用いられる。例えば、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のアクチビンが用いられる。アクチビンは、通常二量体構造を有し、これを構成するサブユニット（βサブユニットとよばれる）としては、哺乳動物においては４種類（βA、βB、βC、βE）が知られている。アクチビンとしては、アクチビンA（βA‐βA）、アクチビンAB（βA‐βB）、アクチビンB（βB‐βB）、アクチビンC（βC‐βC）、アクチビンE（βE‐βE）などを挙げることができる。これらのアクチビンは、全てアクチビン受容体を介して細胞へ作用する。尚、本明細書においては、前記の組み合わせ以外のサブユニットの組み合わせであっても、アクチビン受容体を介してその下流のシグナルを活性化できるものは、全てアクチビンに包含されるものとする。アクチビンシグナル経路作用物質は、好ましくはアクチビン（例、アクチビンA）である。 Examples of activin signal pathway agonists include activin, agonistic anti-activin receptor antibodies, activin receptor agonists, and the like. Activin is a known cytokine, and its amino acid sequence is also known. The activin used in the present invention is usually mammalian activin. Examples of mammals include those described above. Since activin is cross-reactive between many mammalian species, any mammalian activin may be used as long as the object of the present invention can be achieved, but preferably the same as the cells to be cultured. A kind of mammalian activin is used. For example, rodent (mouse, rat, etc.) or primate (human etc.) activin is used. Activins usually have a dimeric structure, and there are four types of subunits (called β subunits) (β A , β B , β C , β E ) known in mammals. It has been. Activins include activin A (β A -β A ), activin AB (β A -β B ), activin B (β B -β B ), activin C (β C -β C ), activin E (β E- β E ). All of these activins act on cells via activin receptors. In the present specification, all the combinations of subunits other than the above-mentioned combinations that can activate the downstream signal via the activin receptor are included in activin. The activin signaling pathway agent is preferably activin (eg, activin A).

本発明において使用されるアクチビンは、好ましくは単離されている。   The activin used in the present invention is preferably isolated.

培地中における、アクチビンシグナル経路作用物質の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されない。アクチビンシグナル経路作用物質としてアクチビンAを用いる場合、その培地中濃度は、通常1 ng/ml以上、好ましくは、10 ng/ml以上、より好ましくは20 ng/ml以上である。細胞増殖への悪影響がない限りアクチビンA濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、500 ng/ml以下である。一態様において、培地中のアクチビンA濃度は、通常1〜1000 ng/ml、好ましくは10〜500 ng/ml、より好ましくは20〜500ng/mlである。アクチビンシグナル経路作用物質は、特に、TS細胞の増殖及び未分化状態の維持に寄与する。   The concentration of the activin signaling pathway agent in the medium is particularly limited as long as it can achieve a desired effect such as induction of TS cells from trophectoderm or extraembryonic ectoderm and proliferation of TS cells. Not. When activin A is used as an activin signal pathway agonist, its concentration in the medium is usually 1 ng / ml or more, preferably 10 ng / ml or more, more preferably 20 ng / ml or more. The upper limit of activin A concentration is not particularly limited as long as cell growth is not adversely affected, but is usually 1000 ng / ml or less, preferably 500 ng / ml or less from the viewpoint of culture cost. In one embodiment, the activin A concentration in the medium is usually 1-1000 ng / ml, preferably 10-500 ng / ml, more preferably 20-500 ng / ml. Activin signaling pathway agents contribute in particular to the proliferation of TS cells and the maintenance of the undifferentiated state.

培地Ｉは、好ましくは、Wntシグナル阻害剤を更に含有する。Wntシグナル阻害剤を用いることにより、TS細胞の未分化性が高まる。Wntシグナル阻害剤は、Wntにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Wntシグナル阻害剤としては、例えば、XAV939（3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one）、IWR-1-end（4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl]-N-8-quinolinyl-benzamide）等のタンキラーゼ阻害剤、IWP-2（N-(6-Methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide）、CKI-7（N-(2-Aminoethyl)-5-chloro-8-isoquinolinesulfonamide）、D4476（4-[4-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-5-(2-pyridinyl)1H-imidazol-2-yl]-benzamide）、Dkk1、Cerberus蛋白、Wnt受容体阻害剤、可溶型Wnt受容体、Wnt抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、Wntに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられるがこれらに限定されない。Wntシグナル阻害剤としては、低分子化合物が好ましく、なかでも、XAV939等のタンキラーゼ阻害剤が好ましい。XAV939は、古典的なWntシグナル阻害剤であり、ポリADPリボシル化酵素であるタンキラーゼ1及びタンキラーゼ2の阻害を介して、アキシンの安定化によるβカテニン分解を活性化する(Huang et al.、2008)。   Medium I preferably further contains a Wnt signal inhibitor. By using a Wnt signal inhibitor, the undifferentiation of TS cells is increased. The Wnt signal inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by Wnt. Examples of Wnt signal inhibitors include XAV939 (3,5,7,8-Tetrahydro-2- [4- (trifluoromethyl) phenyl] -4H-thiopyrano [4,3-d] pyrimidin-4-one), IWR -1-end (4-[(3aR, 4S, 7R, 7aS) -1,3,3a, 4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2- Tankylase inhibitors such as yl] -N-8-quinolinyl-benzamide), IWP-2 (N- (6-Methyl-2-benzothiazolyl) -2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo -3-phenylthieno [3,2-d] pyrimidin-2-yl) thio] -acetamide), CKI-7 (N- (2-Aminoethyl) -5-chloro-8-isoquinolinesulfonamide), D4476 (4- [4 -(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl) -5- (2-pyridinyl) 1H-imidazol-2-yl] -benzamide), Dkk1, Cerberus protein, Wnt receptor inhibitor, possible Examples include, but are not limited to, soluble Wnt receptors, Wnt antibodies, casein kinase inhibitors, antisense nucleic acids against Wnt, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), dominant negative mutants, and expression vectors thereof. As the Wnt signal inhibitor, a low molecular compound is preferable, and among them, a tankyrase inhibitor such as XAV939 is preferable. XAV939 is a classic Wnt signal inhibitor and activates β-catenin degradation by stabilizing axin through inhibition of the poly ADP ribosylation enzymes tankyrase 1 and tankyrase 2 (Huang et al., 2008 ).

培地中における、Wntシグナル阻害剤の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されない。Wntシグナル阻害剤としてXAV939を用いる場合、その濃度は、通常0.1 nM以上、好ましくは3 nM以上、より好ましくは10 nM以上である。細胞増殖への悪影響がない限りXAV939濃度の上限値は特にないが、細胞毒性を回避する観点から、通常50μM以下、好ましくは5μM以下、より好ましくは、500 nM以下である。一態様において、培地中のXAV939濃度は、通常0.1 nM〜50μM、好ましくは3 nM〜5μM、より好ましくは10〜500 nMである。Wntシグナル阻害剤は、特に、TS細胞の未分化状態の維持に寄与する。   The concentration of the Wnt signal inhibitor in the medium is not particularly limited as long as it can achieve a desired effect such as induction of TS cells from trophectoderm or extraembryonic ectoderm and proliferation of TS cells. . When XAV939 is used as a Wnt signal inhibitor, the concentration is usually 0.1 nM or more, preferably 3 nM or more, more preferably 10 nM or more. The upper limit of the XAV939 concentration is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth, but is usually 50 μM or less, preferably 5 μM or less, more preferably 500 nM or less from the viewpoint of avoiding cytotoxicity. In one embodiment, the concentration of XAV939 in the medium is usually 0.1 nM to 50 μM, preferably 3 nM to 5 μM, more preferably 10 to 500 nM. The Wnt signal inhibitor particularly contributes to maintaining the undifferentiated state of TS cells.

培地Ｉは、ROCK阻害剤を含んでいても良い。ROCK阻害剤は、特に、誘導されたTS細胞の生存の維持に寄与する。   Medium I may contain a ROCK inhibitor. ROCK inhibitors particularly contribute to the maintenance of induced TS cell survival.

ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y27632（(R)-(+)-trans-N-(4-Pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide）（Ishizakiら, Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiyaら, Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（1-(5-Isoquinolinylsulfonyl)homopiperazine）（Uehataら, Nature 389: 990-994 (1997)参照）、H-1152（5-[[(2S)-hexahydro-2-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl]sulfonyl]-4-methyl-isoquinoline）（Sasakiら, Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（[(+)-(R)-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl) benzamide）（Nakajimaら, Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）及びそれらの誘導体、並びにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体もまた使用できる（例えば、米国特許出願公開第20050209261号、同第20050192304号、同第20040014755号、同第20040002508号、同第20040002507号、同第20030125344号、同第20030087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、1種又は2種以上のROCK阻害剤が使用され得る。ROCK阻害剤としては、低分子化合物が好ましく、なかでも、Y27632が好ましい。   The ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho-kinase (ROCK). For example, Y27632 ((R)-(+)-trans-N- (4-Pyridyl) -4- ( 1-aminoethyl) -cyclohexanecarboxamide) (see Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)), Fasudil / HA1077 (1- (5-Isoquinolinylsulfonyl) homopiperazine) (see Uehata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), H-1152 (5-[[(2S) -hexahydro-2-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl] sulfonyl] -4-methyl-isoquinoline) (see Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)), Wf-536 ([(+)-(R) -4- (1-aminoethyl) -N- ( 4-pyridyl) benzamide) (see Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52 (4): 319-324 (2003)) and derivatives thereof, as well as antisense nucleic acids against ROCK, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), Dominant negative mutants and their expression vectors. In addition, since other low molecular weight compounds are known as ROCK inhibitors, such compounds or their derivatives can also be used in the present invention (for example, US Patent Application Publication Nos. 20050209261 and 20050192304). No. 20040014755, No. 20040002508, No. 20040002507, No. 20030125344, No. 20030087919, and International Publication Nos. 2003/062227, 2003/059913, No. 2003/062225, No. 2002/076976, 2004/039796). In the present invention, one or more ROCK inhibitors may be used. As the ROCK inhibitor, a low molecular compound is preferable, and Y27632 is particularly preferable.

培地中における、ROCK阻害剤の濃度は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されない。ROCK阻害剤としてY27632を用いる場合、その濃度は、通常0.1 μM以上、好ましくは1μM以上、より好ましくは5 μM以上である。細胞増殖への悪影響がない限りY27632濃度の上限値は特にないが、細胞毒性を回避する観点から、通常1000 μM以下、好ましくは100 μM以下、より好ましくは、50 μM以下である。一態様において、培地中のY27632濃度は、通常0.1 〜1000 μM、好ましくは1〜100 μM、より好ましくは5〜50 μMである。ROCK阻害剤としてFasudil／HA1077を用いる場合、目安としてY27632の上記濃度の約2倍の濃度で用いることができ、ROCK阻害剤としてH−1152を用いる場合には、目安としてY27632の上記濃度の約1／50倍の濃度で用いることができる。   The concentration of the ROCK inhibitor in the medium is not particularly limited as long as it can achieve a desired effect such as induction of TS cells from trophectoderm or extraembryonic ectoderm and proliferation of TS cells. When Y27632 is used as the ROCK inhibitor, the concentration is usually 0.1 μM or more, preferably 1 μM or more, more preferably 5 μM or more. The upper limit of the Y27632 concentration is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell proliferation, but it is usually 1000 μM or less, preferably 100 μM or less, more preferably 50 μM or less from the viewpoint of avoiding cytotoxicity. In one embodiment, the concentration of Y27632 in the medium is usually 0.1 to 1000 μM, preferably 1 to 100 μM, more preferably 5 to 50 μM. When Fasudil / HA1077 is used as a ROCK inhibitor, it can be used at a concentration about twice the above-mentioned concentration of Y27632 as a guide. When H-1152 is used as a ROCK inhibitor, about It can be used at a concentration of 1/50 times.

FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質の好適な組み合わせは、FGF2及びアクチビン（例、アクチビンA）である。   A preferred combination of FGF2 and activin signaling pathway agonist is FGF2 and activin (eg, activin A).

FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2、アクチビン（例、アクチビンA）、及びタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。   A preferred combination of FGF2, activin signal pathway agonist, and Wnt signal inhibitor is FGF2, activin (eg, activin A), and tankyrase inhibitor (eg, XAV939).

培地にROCK阻害剤が含まれる場合、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2、アクチビン（例、アクチビンA）、タンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）及びY27632である。   When the medium contains a ROCK inhibitor, a suitable combination of FGF2, activin signaling pathway agonist, Wnt signal inhibitor and ROCK inhibitor is FGF2, activin (eg, activin A), tankyrase inhibitor (eg, XAV939) And Y27632.

培地Ｉは、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham’s F−12培地、RPMI1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal培地およびこれらの混合培地など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、Neurobasal培地、DMEM培地及びHam’s F−12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、Neurobasal：DMEM：Ham’s F−12＝2：0．8〜1．2：0．8〜1．2である。   The medium I can be prepared using a medium used for culturing mammalian cells as a basal medium. As the basal medium, for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, αMEM medium, DMEM medium, Ham's F- The medium is not particularly limited as long as it can be used for culturing mammalian cells, such as 12 medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal medium, and mixed medium thereof. In one embodiment, a mixed medium of Neurobasal medium, DMEM medium and Ham's F-12 medium is used. The mixing ratio is a volume ratio, for example, Neurobasal: DMEM: Ham's F-12 = 2: 0.8 to 1.2: 0.8 to 1.2.

培地Ｉは、血清含有培地又は無血清培地であり得る。無血清培地とは、無調製又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤の組み合わせ、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせ）を用いることにより、無血清条件でのTS細胞の樹立及び維持が可能となる。   Medium I can be a serum-containing medium or a serum-free medium. A serum-free medium means a medium that does not contain unprepared or unpurified serum, and a medium that contains purified blood-derived components or animal tissue-derived components (for example, growth factors) corresponds to a serum-free medium. It shall be. From the viewpoint of avoiding contamination of chemically undecided components, a serum-free medium is preferably used in the present invention. FGF2 and activin signal pathway agonist (preferably a combination of FGF2, activin signal pathway agonist and Wnt signal inhibitor, more preferably a combination of FGF2, activin signal pathway agonist, Wnt signal inhibitor and ROCK inhibitor) It is possible to establish and maintain TS cells under serum-free conditions.

培地Ｉは、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2−メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物としては、N2、B27、KSR等を挙げることができる。N2は、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレスシン及び亜セレン酸ナトリウムを含む、公知の血清代替用組成物である。B27の組成は、J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993、Brain Res., vol. 494, p. 65-74, 1989等に記載されている。KSRは、例えば、WO98/30679記載の方法により調製できる。N2、B27及びKSRは、Invitrogen等から購入可能である。培地中に添加される血清代替物の量は、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、Invitrogen社製のN2サプリメント及びB27サプリメントであれば、それぞれ、培地全体の容量の1/500〜1/10容量が添加される。好適な態様において、培養に用いられる培地は、N2及びB27を含む。   Medium I may contain a serum replacement. The serum substitute may appropriately contain, for example, albumin, transferrin, fatty acid, collagen precursor, trace element, 2-mercaptoethanol or 3'thiolglycerol, or an equivalent thereof. Examples of such serum substitutes include N2, B27, KSR and the like. N2 is a known serum replacement composition containing insulin, transferrin, progesterone, putrescine and sodium selenite. The composition of B27 is described in J. Neurosci. Res., Vol. 35, p. 567-576, 1993, Brain Res., Vol. 494, p. 65-74, 1989, etc. KSR can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679. N2, B27 and KSR can be purchased from Invitrogen or the like. The amount of the serum substitute added to the medium is not particularly limited as long as it can achieve a desired effect such as induction of TS cells from trophectoderm or extraembryonic ectoderm, and proliferation of TS cells. In the case of N2 supplement and B27 supplement manufactured by Invitrogen, 1/500 to 1/10 volume of the entire medium is added. In a preferred embodiment, the medium used for culturing includes N2 and B27.

培地Ｉは、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得る範囲で、他の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL−グルタミン等）、還元剤（例えば1−チオグリコレート、2−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d−ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等が挙げられるが、これらに限定されない。   Medium I can contain other additives as long as a desired effect such as induction of TS cells from vegetative ectoderm or extraembryonic ectoderm and proliferation of TS cells can be achieved. Examples of additives include insulin, iron sources (eg, transferrin), minerals (eg, sodium selenate), saccharides (eg, glucose), organic acids (eg, pyruvate, lactic acid, etc.), serum proteins (eg, albumin, etc.) ), Amino acids (eg L-glutamine, etc.), reducing agents (eg 1-thioglycolate, 2-mercaptoethanol etc.), vitamins (eg ascorbic acid, d-biotin etc.), antibiotics (eg streptomycin, penicillin, gentamicin) Etc.), buffering agents (for example, HEPES, etc.) and the like, but are not limited thereto.

培地Ｉは、好適には、化学的に定義された培地である。「化学的に定義された培地」とは、血清、馴化培地等の組成が化学的に未決定な因子を含まず、化学的に組成が定義された因子のみから構成された培地を意味する。   Medium I is preferably a chemically defined medium. “Chemically defined medium” means a medium composed of only factors whose composition is chemically defined without including factors whose composition is chemically undecided, such as serum and conditioned medium.

一態様において、製造方法Ｉにおいて用いられる培地Ｉは、基礎培地中に、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、N2、及びB27（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、N2、及びB27、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、ROCK阻害剤、N2、及びB27）を含む。アクチビンシグナル経路作用物質は、好適にはアクチビン（例、アクチビンA）である。Wntシグナル阻害剤は、好適にはタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。ROCK阻害剤は、好適にはY27632である。基礎培地は、Neurobasal培地、DMEM培地及びHam’s F−12培地の混合培地でありうる。該培地は、好適には化学的に定義された培地である。   In one embodiment, the medium I used in the production method I includes FGF2, activin signal pathway agonist, N2 and B27 (preferably FGF2, activin signal pathway agonist, Wnt signal inhibitor, N2, And B27, more preferably FGF2, activin signal pathway agonist, Wnt signal inhibitor, ROCK inhibitor, N2, and B27). The activin signaling pathway agent is preferably activin (eg, activin A). The Wnt signal inhibitor is preferably a tankyrase inhibitor (eg, XAV939). The ROCK inhibitor is preferably Y27632. The basal medium can be a mixed medium of Neurobasal medium, DMEM medium and Ham's F-12 medium. The medium is preferably a chemically defined medium.

一態様において、製造方法Ｉにおいて用いられる培地Ｉは、FGF4を含有しない。従来、MEF、馴化培地、血清、FGF4、ヘパリンを含む培地中で、TS細胞を樹立し、維持する方法が知られているが、製造方法Ｉにおいては、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質の組み合わせ（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤の組み合わせ、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせ）を用いることにより、FGF4を含有しない培地中でのTS細胞の樹立及び維持が可能となる。   In one embodiment, medium I used in production method I does not contain FGF4. Conventionally, a method for establishing and maintaining TS cells in a medium containing MEF, conditioned medium, serum, FGF4, and heparin is known. In production method I, a combination of FGF2 and activin signal pathway agonists ( Preferably, a combination of FGF2, activin signal pathway agonist and Wnt signal inhibitor, more preferably a combination of FGF2, activin signal pathway agonist, Wnt signal inhibitor and ROCK inhibitor) contains FGF4 It is possible to establish and maintain TS cells in a medium that does not.

製造方法Ｉにおいては、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、フィーダー細胞とともに／又はフィーダー細胞無しで培養する。フィーダー細胞とは、TS細胞と共に培養された際に、TS細胞としての能力を維持した状態でのTS細胞の増殖を補助する環境を提供する、非TS細胞（例、線維芽細胞）をいう。化学的に未決定な因子の混入を排除する観点から、好適には、培養がフィーダー細胞無しで行われる。化学的に定義された培地中で、フィーダー細胞無しで培養を行うことにより、化学的に定義された条件下での培養が可能となる。製造方法Ｉにおいては、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質の組み合わせ（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤の組み合わせ、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤の組み合わせ）を用いることにより、フィーダー細胞無しでTS細胞の樹立及び維持が可能となる。   In the production method I, mammalian trophectoderm or extraembryonic ectoderm is cultured with / without feeder cells. A feeder cell refers to a non-TS cell (eg, fibroblast) that provides an environment that assists the growth of TS cells while maintaining the ability as TS cells when cultured with TS cells. From the viewpoint of eliminating contamination with chemically undecided factors, the culture is preferably performed without feeder cells. By culturing without a feeder cell in a chemically defined medium, it is possible to culture under chemically defined conditions. In production method I, a combination of FGF2 and activin signal pathway agonists (preferably a combination of FGF2, activin signal pathway agonists and Wnt signal inhibitors, more preferably FGF2, activin signal pathway agonists, Wnt signal inhibitors , And a combination of ROCK inhibitors), TS cells can be established and maintained without feeder cells.

培養に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。   The incubator used for culturing is not particularly limited. For example, flask, tissue culture flask, dish, petri dish, tissue culture dish, multi-dish, microplate, microwell plate, micropore, multiplate, multiwell Examples include plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.

TS細胞の製造又は維持における培養は、接着条件下／非接着条件下のいずれの条件下で行ってもよいが、好適には、接着条件下で行われる。接着条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているもの等を使用することができる。   Cultivation in the production or maintenance of TS cells may be performed under any of adhesion / non-adhesion conditions, but is preferably performed under adhesion conditions. In order to enable culturing under adhesion conditions, the incubator is preferably cell adhesive. Cell adhesion incubators include those that have been artificially treated so that the surface of the incubator becomes cell adhesion, or artificial treatment (for example, cell What is coated with an outer matrix or the like can be used.

細胞外マトリクスとは、細胞の外側の空間を構成する生体高分子をいう。細胞外マトリクスとしては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等の細胞接着性タンパク質、コラーゲン、エラスチン等の線維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等のグルコサミノグリカンやプロテオグリカン等が挙げられ、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導、及びTS細胞の増殖等の所望の効果を達成し得る範囲で、特に限定されないが、好ましくは細胞接着性タンパク質であり、より好ましくはフィブロネクチン、ラミニンである。一態様において、細胞外マトリクスとして、基底膜調製物を用いることができる。基底膜調製物としては、その上に未分化なTS細胞を播腫して培養した場合に、未分化状態を維持したまま、その生存を維持する機能を有する基底膜構成成分を含むものであれば、その由来する細胞の種類は特に限定されない。基底膜調製物は、好適には、肉腫細胞由来であり、より好ましくはEngelbreth Holm Swarn（EHS）マウス肉腫由来である。基底膜調製物は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、塩析、尿素抽出及び透析に付すことや、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液等を用いて除去することで作成することができる。基底膜調製物としては市販のものが利用でき、例えば、マトリゲル（BD Bioscience）などが挙げられる。マトリゲルは、Engelbreth Holm Swarn（EHS）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。マトリゲルの主成分はラミニン、IV型コラーゲン、ニドゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンである（例えば、タンパク質重量比で、60-85% ラミニン、5-30% IV型コラーゲン, 1-10% ニドゲン、1-10% ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及び 1-5% エンタクチン（US patent No. 4829000））が、これらに加えてTGF−β、線維芽細胞増殖因子（FGF）、組織プラスミノゲン活性化因子、EHS腫瘍が天然に産生する増殖因子 (PDGF, IGF-1, NGF等) が含まれる。マトリゲルは、US patent No. 4829000に開示された方法により調製することが出来る。一態様において、本発明の製造方法に用いられる基底膜調製物は、US patent No. 4829000に開示された基底膜調製物である。   The extracellular matrix refers to a biopolymer that constitutes the space outside the cell. Examples of the extracellular matrix include cell adhesion proteins such as fibronectin, vitronectin, and laminin, fibrous proteins such as collagen and elastin, glucosaminoglycans and proteoglycans such as hyaluronic acid and chondroitin sulfate, and the like. Although not particularly limited as long as desired effects such as induction of TS cells from in vitro ectoderm and proliferation of TS cells can be achieved, cell adhesive proteins are preferable, and fibronectin and laminin are more preferable. In one embodiment, a basement membrane preparation can be used as the extracellular matrix. A basement membrane preparation should contain a basement membrane component that has the function of maintaining its survival while maintaining undifferentiated state when undifferentiated TS cells are seeded and cultured on the basement membrane preparation. For example, the type of cell from which it is derived is not particularly limited. The basement membrane preparation is preferably derived from sarcoma cells, more preferably from Engelbreth Holm Swarn (EHS) mouse sarcoma. The basement membrane preparation is prepared by subjecting cells having basement membrane-forming ability adhered to a support through the basement membrane to salting-out, urea extraction and dialysis, or a solution having the ability to dissolve the lipids of the cells. Or by using an alkaline solution or the like. As the basement membrane preparation, commercially available products can be used, and examples thereof include Matrigel (BD Bioscience). Matrigel is a basement membrane preparation derived from Engelbreth Holm Swarn (EHS) mouse sarcoma. The main ingredients of Matrigel are laminin, type IV collagen, nidogen, heparan sulfate proteoglycan and entactin (for example, 60-85% laminin, 5-30% type IV collagen, 1-10% nidogen, 1- 10% heparan sulfate proteoglycan and 1-5% entactin (US patent No. 4829000)), but also TGF-β, fibroblast growth factor (FGF), tissue plasminogen activator, EHS tumor It contains growth factors (PDGF, IGF-1, NGF, etc.) that it produces. Matrigel can be prepared by the method disclosed in US patent No. 4829000. In one embodiment, the basement membrane preparation used in the production method of the present invention is the basement membrane preparation disclosed in US patent No. 4829000.

細胞外マトリクスを培養器にコーティングする方法としては、一般的に、非共有結合（水素結合、イオン結合、疎水結合等）、共有結合等を使用した方法を用いることができる。例えば、培養器中に、細胞外マトリクスを含む適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液等）を加え、静置することにより、細胞外マトリクスを培養器の表面に非共有結合により不溶性担体に結合させることが出来る。   As a method for coating the extracellular matrix on the incubator, generally, a method using a non-covalent bond (hydrogen bond, ionic bond, hydrophobic bond, etc.), a covalent bond or the like can be used. For example, by adding an appropriate buffer containing an extracellular matrix (for example, phosphate buffer) to the incubator and allowing to stand, the extracellular matrix is bound to the surface of the incubator with an insoluble carrier by noncovalent bonding. It can be made.

特に、ROCK阻害剤を含まない培地中でTS細胞を誘導する場合には、誘導されたTS細胞の生存維持の観点から、細胞外マトリクスコートされた培養器中で培養を行うことが好ましい。   In particular, when TS cells are induced in a medium not containing a ROCK inhibitor, it is preferable to culture in an incubator coated with an extracellular matrix from the viewpoint of maintaining the survival of the induced TS cells.

その他の培養条件は、通常の哺乳動物細胞の培養条件に準じて、当業者であれば適宜設定できる。例えば、培養温度は、通常約30〜40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、通常約1〜10％、好ましくは約2〜5％である。湿度は通常約70〜100％の範囲であり、好ましくは約95〜100％である。 Other culture conditions can be appropriately set by those skilled in the art according to normal mammalian cell culture conditions. For example, the culture temperature is usually about 30-40 ° C, preferably about 37 ° C. The CO 2 concentration is usually about 1-10%, preferably about 2-5%. The humidity is usually in the range of about 70-100%, preferably about 95-100%.

TS細胞の製造方法Ｉを、更に詳細に説明すると、以下の通りである。   The TS cell production method I is described in further detail as follows.

生体より分離された桑実胚、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、培養器中に播種し、FGF2及びアクチビンAを含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンA及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF2、アクチビンA、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中で培養する。該培養器は、通常の細胞培養において使用されるものを用いることができるが、好ましくは、桑実胚、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉、或いはこれから誘導された細胞の容器への接着を促進させるために、細胞接着性の培養器（例、フィブロネクチン等の細胞外マトリクスでコートされた培養器）が用いられる。以下の培養に用いる培養器も同様である。   Mulberry embryo, vegetative ectoderm or extraembryonic ectoderm separated from the living body is seeded in a culture vessel, and a medium containing FGF2 and activin A (preferably a medium containing FGF2, activin A and Wnt signal inhibitor, More preferably, the cells are cultured in a medium containing FGF2, activin A, Wnt signal inhibitor, and ROCK inhibitor. As the incubator, those used in normal cell culture can be used. Preferably, morulae, trophectoderm or extraembryonic ectoderm, or cells derived therefrom are promoted to adhere to the container. For this purpose, a cell-adhesive incubator (eg, an incubator coated with an extracellular matrix such as fibronectin) is used. The same applies to the incubator used for the following culture.

当該培養の結果、桑実胚、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉が増殖物（outgrowth）を形成し、初代外植片（primary explant）を得る。培養条件にもよるが、増殖物の形成は、培養の開始から、通常3〜7日後に生じる。   As a result of the culturing, morula, vegetative ectoderm or extraembryonic ectoderm forms an outgrowth to obtain a primary explant. Depending on the culture conditions, growth formation usually occurs 3-7 days after the start of the culture.

このようにして得られた初代外植片を、そのまま培養することによってもTS細胞を樹立することは可能であるが、好ましくはこの初代外植片を、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。外植片の分散は、適宜な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。なかでも細胞障害性が少ないものが好ましく、このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE (Invitrogen)又はアキュターゼ(MILLIPORE)等の市販品が入手可能である。分散された細胞を、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中に懸濁し、培養器中で更に培養する。   Although it is possible to establish TS cells by culturing the primary explants obtained in this manner as they are, it is preferable that the primary explants be single cells or a state close thereto. Disperse until. The explants are dispersed using an appropriate cell dissociation solution. As the cell dissociation solution, for example, EDTA; proteolytic enzymes such as trypsin, collagenase IV, metalloprotease and the like can be used alone or in appropriate combination. Among them, those having low cytotoxicity are preferable, and as such a cell dissociation solution, for example, commercially available products such as dispase (Adia), TrypLE (Invitrogen), or Accutase (MILLIPORE) are available. The dispersed cells are cultured in a medium containing FGF2 and activin signal pathway agonists (preferably a medium containing FGF2, activin signal pathway agonists and Wnt signal inhibitors, more preferably FGF2, activin signal pathway agonists, Wnt signals). In a medium containing an inhibitor and a ROCK inhibitor), the suspension is further cultured in an incubator.

培養を継続すると、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉から誘導された細胞は、培養条件によっても異なるが、継代後通常1週間以内に、培養器の底面にコロニーを形成する。このコロニーがTS細胞のコロニーである。コロニー形成は顕微鏡等を用いて確認することができる。このコロニーを、回収し、上述と同様に単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、更にFGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中に懸濁し、培養器中で更に培養する。栄養外胚葉又は胚体外外胚葉から誘導されたTS細胞は、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含む培地）中で良好に増殖するのに対して、ICMに由来する細胞は、ほとんど増殖しない。従って、この継代操作を繰り返すことにより、栄養外胚葉から誘導されたTS細胞が、内部細胞塊に由来する細胞を凌駕し、培養物中の大多数が栄養外胚葉から誘導されたTS細胞となり、最終的に、ICMに由来する細胞を含まない、TS細胞からなる細胞集団を構成するに至る。   If the culture is continued, cells derived from the trophectoderm or extraembryonic ectoderm will form a colony on the bottom of the incubator, usually within one week after passage, depending on the culture conditions. This colony is a colony of TS cells. Colony formation can be confirmed using a microscope or the like. This colony is recovered and dispersed to a single cell or a state close thereto as described above, and further contains a medium containing FGF2 and activin signal pathway agonists (preferably FGF2, activin signal pathway agonists and Wnt signals). It is suspended in a medium containing an inhibitor, more preferably a medium containing FGF2, an activin signal pathway acting substance, a Wnt signal inhibitor, and a ROCK inhibitor, and further cultured in an incubator. TS cells derived from trophectoderm or extraembryonic ectoderm is a medium containing FGF2 and activin signal pathway agonists (preferably a medium containing FGF2, activin signal pathway agonists and Wnt signal inhibitors, more preferably In contrast, cells derived from ICM hardly proliferate, whereas FGF2, an activin signal pathway agent, a medium containing a Wnt signal inhibitor, and a ROCK inhibitor grows well. Therefore, by repeating this passaging operation, TS cells derived from the trophectoderm exceed the cells derived from the inner cell mass, and the majority of the culture becomes TS cells derived from the trophectoderm. Eventually, a cell population composed of TS cells, which does not contain cells derived from ICM, is constructed.

尚、TS細胞コロニーに加えて、エピブラスト幹細胞のコロニーの混入が生じる場合がある。従って、必要に応じて、培養物からエピブラスト幹細胞コロニーを除去することにより、TS細胞を精製してもよい。一態様において、製造方法Ｉは、培養物からエピブラスト幹細胞コロニーを除去し、TS細胞を単離する工程を含む。TS細胞コロニーは、コンパクトで、ドーム状の特徴的な形態を呈しているので、エピブラスト幹細胞のコロニーとは、明確に視覚的に識別することができる。従って、このようなTS細胞コロニーに特徴的な形態を指標に、例えば、顕微鏡下でTS細胞のコロニーをパスツールピペット、マイクロマニピュレーター等を用いて選択的にピックアップすることにより、TS細胞を単離することができる。また、限界希釈法によって、TS細胞のコロニーのみを生じたウェルから細胞を採集することによっても、TS細胞を単離することができる。あるいはTS細胞の細胞表面マーカー等を指標にして、セルソーター等を用いてTS細胞を単離してもよい。「単離されたTS細胞」の純度（総細胞数に占めるTS細胞の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。   In addition to TS cell colonies, epiblast stem cell colonies may be mixed. Therefore, if necessary, TS cells may be purified by removing epiblast stem cell colonies from the culture. In one embodiment, production method I includes a step of removing epiblast stem cell colonies from the culture and isolating TS cells. Since the TS cell colony has a compact and dome-like characteristic shape, it can be clearly distinguished from the epiblast stem cell colony. Therefore, TS cells can be isolated by selectively picking up TS cell colonies using a Pasteur pipette, micromanipulator, etc. can do. Alternatively, TS cells can be isolated by collecting cells from wells in which only TS cell colonies have been produced by the limiting dilution method. Alternatively, TS cells may be isolated using a cell sorter or the like using TS cell surface markers as an index. The purity of “isolated TS cells” (percentage of TS cells in the total number of cells) is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 99% or more, most preferably Is 100%.

製造方法Ｉにより製造されるTS細胞は、通常20継代以上、好ましくは30継代以上、理論的には無限に、栄養膜幹細胞としての形質を維持しながら増殖する。   The TS cells produced by the production method I usually proliferate while maintaining the trait as a trophoblast stem cell for 20 passages or more, preferably 30 passages or more, theoretically infinitely.

製造方法Ｉにより得られた細胞が、TS細胞としての形質、即ち、
（1）自己複製能、
（2）TS細胞マーカー遺伝子発現陽性、
（3）インビトロにおいて、栄養膜サブタイプへ分化する能力、及び
（4）キメラにおいて、胎盤へ寄与する能力
を維持しているか否か確認してもよい。一態様において、製造方法Ｉは、このような確認工程を含む。確認工程は、得られた細胞から一部の細胞をサンプルとして分離すること、該サンプルがTS細胞としての形質を維持しているか否か試験すること、及び該サンプルがTS細胞としての形質を維持していることが確認された場合、サンプルが由来する細胞をTS細胞として取得することを含む。 The cell obtained by the production method I is a trait as a TS cell, that is,
(1) Self-replication ability,
(2) Positive expression of TS cell marker gene,
It may be confirmed whether (3) the ability to differentiate into trophoblast subtypes in vitro, and (4) the ability to contribute to the placenta in a chimera are maintained. In one embodiment, manufacturing method I includes such a confirmation step. The confirmation process includes separating a part of cells from the obtained cells as a sample, testing whether the sample maintains a trait as a TS cell, and maintaining the trait as a TS cell. If it is confirmed that the cell is derived, it includes obtaining the cell from which the sample is derived as a TS cell.

確認工程においては、上記形質のうち、（2）〜（4）の全ての形質を、サンプルが有しているか否か試験する。（2）〜（4）の形質の確認方法は、上記「1．用語の定義」の項に記載した通りである。（1）の形質については、継代培養後の細胞について、（2）〜（4）の形質を有していることをもって、サンプルが（1）の形質を有していると判定可能である。   In the confirmation step, it is tested whether or not the sample has all the traits (2) to (4) among the traits. The method for confirming the traits of (2) to (4) is as described in the section “1. Definition of terms” above. About the trait of (1), it can be judged that the sample has the trait of (1) by having the traits of (2) to (4) for the cells after subculture. .

好ましい態様において、製造方法Ｉにより製造されるTS細胞は、未分化であり、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する。   In a preferred embodiment, TS cells produced by production method I are undifferentiated and capable of differentiating into all trophoblast subtypes of trophoblast giant cells, spongy trophoblasts, and labyrinth trophoblasts in vitro and in vivo. Have

製造方法Ｉにより得られるTS細胞は、理論的には永久的に凍結保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。当該TS細胞は凍結保存・融解後もTS細胞としての形質を維持する。凍結保存においては、ジメチルスルホキシドとウシ胎仔血清アルブミンを含有するセルバンカー（DIA−IATRON社製）等の自体公知の細胞凍結保存用組成物中に細胞を懸濁し、−80〜−200℃、好ましくは−196℃（液体窒素中）の条件で細胞を保存する。   The TS cells obtained by the production method I can be theoretically cryopreserved and can be used after thawing and sleeping as needed. The TS cells maintain their characteristics as TS cells even after cryopreservation and thawing. In cryopreservation, the cells are suspended in a composition for cell cryopreservation known per se such as a cell banker (manufactured by DIA-IATRON) containing dimethyl sulfoxide and fetal bovine serum albumin, and is preferably -80 to -200 ° C, preferably Store cells at -196 ° C (in liquid nitrogen).

製造方法Ｉにより得られるTS細胞を凍結保存後起眠させる際には、常法に従って溶媒中で融解し、懸濁して細胞浮遊液とする。一度起眠した当該TS細胞を、培養後、再度凍結しても、当該細胞のTS細胞としての形質は維持される。   When the TS cells obtained by the production method I are put to sleep after cryopreservation, they are thawed and suspended in a solvent according to a conventional method to obtain a cell suspension. Even if the TS cells once asleep are cultured and then frozen again, the traits of the cells as TS cells are maintained.

2．TS細胞の培養方法Ｉ
培養方法Ｉは、哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF及びアクチビンシグナル経路作用物質（好ましくは、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地）を含む培地中で培養することを含む。培養方法Ｉは、栄養膜幹細胞を、栄養膜幹細胞としての形質を維持したまま継代又は増殖する方法である。従って、培養方法Ｉは、培養したTS細胞を回収し、これを播種することを含み得る。 2． TS cell culture method I
Culture method I includes culturing mammalian trophoblast stem cells in a medium containing FGF and an activin signal pathway agonist (preferably, a medium containing FGF, an activin signal pathway agonist and a Wnt signal inhibitor). Culture method I is a method for subculturing or proliferating trophoblast stem cells while maintaining the trait as trophoblast stem cells. Therefore, the culture method I can include recovering the cultured TS cells and seeding them.

培養方法Ｉにおいて培養される栄養膜幹細胞には、上記製造方法Ｉにより製造された栄養膜幹細胞のみならず、それ以外の方法により樹立された栄養膜幹細胞も包含される。培養方法Ｉにおいて培養される栄養膜幹細胞は、好ましくは、単離されている。培養方法Ｉにおいて培養される栄養膜幹細胞は、好ましくは、未分化の栄養膜幹細胞であり、インビトロ及びインビボにおいて、栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜、及びラビリンス栄養膜の全ての栄養膜サブタイプへ分化する能力を有する。培養方法Ｉによれば、このような未分化な状態を維持したまま、栄養膜幹細胞を継代培養することが可能である。従来の方法（Tanaka, 1998）によると、継代後のコロニーの端に巨細胞が現れるなど、一部の細胞の分化が避けられなかったところ、培養方法Ｉにより、このような巨細胞の出現を回避し、分化したTS細胞や栄養膜サブタイプの混入を抑制しながら、未分化なTS細胞を継代培養することが可能となった。従って、一態様において、培養方法Ｉにより得られる培養物には、巨細胞が含まれず、細胞として栄養膜幹細胞（好ましくは、未分化の栄養膜幹細胞）のみが含まれる。   The trophoblast stem cells cultured in the culture method I include not only the trophoblast stem cells produced by the production method I but also trophoblast stem cells established by other methods. The trophoblast stem cells cultured in the culture method I are preferably isolated. The trophoblast stem cells cultured in the culture method I are preferably undifferentiated trophoblast stem cells, and all trophoblast subtypes of trophoblast giant cells, spongy trophoblasts, and labyrinth trophoblasts in vitro and in vivo Has the ability to differentiate into According to the culture method I, it is possible to subculture trophoblast stem cells while maintaining such an undifferentiated state. According to the conventional method (Tanaka, 1998), giant cells appeared at the end of the colonies after passage, and some cell differentiation was unavoidable. As a result, it was possible to subculture undifferentiated TS cells while suppressing contamination of differentiated TS cells and trophoblast subtypes. Accordingly, in one embodiment, the culture obtained by the culture method I does not include giant cells, and includes only trophoblast stem cells (preferably, undifferentiated trophoblast stem cells) as cells.

培養方法Ｉに用いられる培地（培地ＩＩとする）の態様は、FGFの種類がFGF2に限定されないことを除き、上記培地Ｉの態様と同一である。FGFは、好ましくはFGF2又はFGF4である。FGFとして、FGF2を用いる場合、培地中のFGF2濃度は、培地Ｉの態様と同一である。FGFとして、FGF4を用いる場合、FGF4の濃度は、TS細胞を、TS細胞としての形質を維持したままでの、TS細胞の継代又は増殖等の所望の効果を達成し得るような濃度である限り特に限定されないが、通常1 ng/ml以上、好ましくは、10 ng/ml以上、より好ましくは20 ng/ml以上である。TS細胞の未分化状態を良好に維持する観点から、FGF4濃度を20 ng/ml以上とすることが好ましい。細胞増殖への悪影響がない限りFGF4濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 ng/ml以下、好ましくは、300 ng/ml以下、より好ましくは50 ng/ml以下である。一態様において、培地中のFGF4濃度は、通常1〜1000 ng/ml、好ましくは10〜300 ng/ml、より好ましくは20〜50 ng/mlである。   The mode of the medium (referred to as medium II) used in the culture method I is the same as that of the above-mentioned medium I except that the type of FGF is not limited to FGF2. FGF is preferably FGF2 or FGF4. When FGF2 is used as FGF, the concentration of FGF2 in the medium is the same as that of medium I. When FGF4 is used as the FGF, the concentration of FGF4 is such that the TS cell can achieve a desired effect such as passage or proliferation of the TS cell while maintaining the characteristics of the TS cell. Although not particularly limited, it is usually 1 ng / ml or more, preferably 10 ng / ml or more, more preferably 20 ng / ml or more. From the viewpoint of favorably maintaining the undifferentiated state of TS cells, the FGF4 concentration is preferably 20 ng / ml or more. The upper limit of the FGF4 concentration is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth, but is usually 1000 ng / ml or less, preferably 300 ng / ml or less, more preferably 50 ng / ml or less from the viewpoint of culture cost. . In one embodiment, the concentration of FGF4 in the medium is usually 1-1000 ng / ml, preferably 10-300 ng / ml, more preferably 20-50 ng / ml.

培地ＩＩが、FGF2を含有する場合、該培地はFGF4を含んでいてもいなくてもよい。一態様において、培地ＩＩが、FGF2を含有する場合、該培地はFGF4を含まない。培地ＩＩが、FGF4を含有する場合、該培地はFGF2を含んでいてもいなくてもよい。一態様において、培地ＩＩが、FGF4を含有する場合、該培地はFGF2を含まない。   When the culture medium II contains FGF2, the culture medium may or may not contain FGF4. In one embodiment, when medium II contains FGF2, the medium does not contain FGF4. When the culture medium II contains FGF4, the culture medium may or may not contain FGF2. In one embodiment, when medium II contains FGF4, the medium does not contain FGF2.

培地ＩＩは、ヘパリンを含んでいてもよい。ヘパリンは、特にTS細胞の未分化性維持に有効である。特に、FGFとしてFGF4を用いる場合、ヘパリンと組み合わせて培地に添加することが好ましい。培地中のヘパリン濃度は、TS細胞の未分化性維持等の所望の効果を達成し得る濃度である限り特に限定されないが、通常、0.1 ng/ml以上、好ましくは1 ng/ml以上である。TS細胞の維持、増殖へ悪影響がない限り、ヘパリン濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常、1000 ng/ml以下、好ましくは、100 ng/ml以下である。一態様において、培地中のヘパリン濃度は、通常0.1〜1000 ng/ml、好ましくは1〜100 ng/ml、より好ましくは5〜20 ng/mlである。   Medium II may contain heparin. Heparin is particularly effective for maintaining the undifferentiated nature of TS cells. In particular, when FGF4 is used as FGF, it is preferably added to the medium in combination with heparin. The concentration of heparin in the medium is not particularly limited as long as it is a concentration that can achieve a desired effect such as maintenance of undifferentiation of TS cells, but is usually 0.1 ng / ml or more, preferably 1 ng / ml or more. The upper limit of the heparin concentration is not particularly limited as long as TS cell maintenance and proliferation are not adversely affected, but is usually 1000 ng / ml or less, preferably 100 ng / ml or less from the viewpoint of culture cost. In one embodiment, the concentration of heparin in the medium is usually 0.1 to 1000 ng / ml, preferably 1 to 100 ng / ml, more preferably 5 to 20 ng / ml.

培地ＩＩは、好ましくは無血清培地である。該培地は、好ましくは化学的に定義された培地である。   Medium II is preferably a serum-free medium. The medium is preferably a chemically defined medium.

一態様において、培地ＩＩは、FGF（例、FGF2、FGF4）及びアクチビンシグナル経路作用物質（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤）に加えて、ROCK阻害剤を含む。   In one embodiment, medium II is in addition to FGF (eg, FGF2, FGF4) and activin signal pathway agonist (preferably, FGF (eg, FGF2, FGF4), activin signal pathway agonist and Wnt signal inhibitor), Contains a ROCK inhibitor.

一態様において、培地ＩＩは、ROCK阻害剤を含まない。   In one embodiment, Medium II does not contain a ROCK inhibitor.

培養方法Ｉにおいては、哺乳動物TS細胞を、フィーダー細胞とともに／又はフィーダー細胞無しで培養する。化学的に未決定な因子の混入を排除する観点から、好適には、培養がフィーダー細胞無しで行われる。化学的に定義された培地中で、フィーダー細胞無しで培養を行うことにより、化学的に定義された条件下でのTS細胞の維持培養が可能となる。培養方法Ｉにおいては、FGF（例、FGF2、FGF4）及びアクチビンシグナル経路作用物質（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤）の組み合わせを用いることにより、フィーダー細胞無しでTS細胞の維持培養が可能となる。   In the culture method I, mammalian TS cells are cultured together with / without feeder cells. From the viewpoint of eliminating contamination with chemically undecided factors, the culture is preferably performed without feeder cells. By culturing without a feeder cell in a chemically defined medium, it is possible to maintain and culture TS cells under chemically defined conditions. In the culture method I, by using a combination of FGF (eg, FGF2, FGF4) and activin signal pathway acting substance (preferably, FGF (eg, FGF2, FGF4), activin signal pathway acting substance and Wnt signal inhibitor). This makes it possible to maintain and culture TS cells without feeder cells.

培養に用いる培養器としては、上記製造方法Ｉにおいて用いることができる培養器と同一のものを使用することができる。   As the incubator used for the culture, the same incubator that can be used in the above production method I can be used.

TS細胞の維持培養は、接着条件下／非接着条件下のいずれの条件下で行ってもよいが、好適には、接着条件下で行われる。接着条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているもの等を使用することができる。   The maintenance culture of TS cells may be performed under any condition of adhesion / non-adhesion, but is preferably performed under adhesion. In order to enable culturing under adhesion conditions, the incubator is preferably cell adhesive. Cell adhesion incubators include those that have been artificially treated so that the surface of the incubator becomes cell adhesion, or artificial treatment (for example, cell What is coated with an outer matrix or the like can be used.

ここで、ROCK阻害剤を含む培地を用いる場合、細胞外マトリクスとしては、上記製造方法Ｉにおいて用いることができる細胞外マトリクス（例、フィブロネクチン）と同一のものを使用することができる。   Here, when a medium containing a ROCK inhibitor is used, the same extracellular matrix (eg, fibronectin) that can be used in the production method I can be used as the extracellular matrix.

一方、ROCK阻害剤を含まない培地を用いる場合、細胞外マトリクスとしてマトリゲル等の基底膜調製物を用いることが好ましい。マトリゲルでコートされた培養器上で、TS細胞を接着培養することにより、ROCK阻害剤がなくても、TS細胞を、栄養膜幹細胞としての形質を維持したまま継代培養することが可能となる。   On the other hand, when using a medium not containing a ROCK inhibitor, it is preferable to use a basement membrane preparation such as Matrigel as the extracellular matrix. Adhesive culture of TS cells on a matrigel-coated incubator enables subculture of TS cells while maintaining their trait as trophoblast stem cells without a ROCK inhibitor .

培養方法Ｉにおけるその他の細胞培養条件は、特に断りのない限り、上記製造方法Ｉにおける、栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を培養する際の培養条件、或いはこれらから誘導されたTS細胞を維持する際の培養条件と同様である。   The other cell culture conditions in the culture method I are the culture conditions for culturing the vegetative ectoderm or extraembryonic ectoderm in the production method I, or maintain TS cells derived therefrom, unless otherwise specified. It is the same as the culture conditions at the time.

即ち、TS細胞を、FGF（例、FGF2、FGF4）及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、並びにヘパリン及び／又はROCK阻害剤を含む培地）中に懸濁し、培養器中で培養する。この培養により、TS細胞は、培養器の底面にコロニーを形成する。増殖したTS細胞コロニーを回収し、適宜な細胞解離液により単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、分散したTS細胞を、FGF（例、FGF2、FGF4）及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地（好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質及びWntシグナル阻害剤を含む培地、より好ましくは、FGF（例、FGF2、FGF4）、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、並びにヘパリン及び／又はROCK阻害剤を含む培地）中に再び懸濁し、新たな培養器中で培養する。この操作を繰り返すことにより、TS細胞を、TS細胞としての形質を維持したまま、継代培養することが可能となる。   That is, TS cells are cultured in a medium containing FGF (eg, FGF2, FGF4) and an activin signal pathway agonist (preferably, a medium containing FGF (eg, FGF2, FGF4), an activin signal pathway agonist and a Wnt signal inhibitor, More preferably, it is suspended in FGF (eg, FGF2, FGF4), an activin signal pathway agonist, a Wnt signal inhibitor, and a medium containing heparin and / or ROCK inhibitor) and cultured in an incubator. By this culture, TS cells form colonies on the bottom of the incubator. Collect the expanded TS cell colonies and disperse them to a single cell or a state close to this with an appropriate cell dissociation solution. Disperse the TS cells into FGF (eg, FGF2, FGF4) and activin signal pathway agonists. Medium (preferably, medium containing FGF (eg, FGF2, FGF4), activin signal pathway acting substance and Wnt signal inhibitor, more preferably FGF (eg, FGF2, FGF4), activin signal pathway acting substance, Wnt signal Medium) containing inhibitors and heparin and / or ROCK inhibitors) and cultivated in a new incubator. By repeating this operation, it becomes possible to subculture the TS cells while maintaining the characteristics as TS cells.

FGF及びアクチビンシグナル経路作用物質の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、及びアクチビン（例、アクチビンA）である。   A preferred combination of FGF and an activin signaling pathway agent is FGF2 or FGF4 and activin (eg, activin A).

FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、アクチビン（例、アクチビンA）、及びタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。   A preferred combination of FGF, activin signal pathway agonist, and Wnt signal inhibitor is FGF2 or FGF4, activin (eg, activin A), and tankyrase inhibitor (eg, XAV939).

培地にROCK阻害剤が含まれる場合、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、アクチビン（例、アクチビンA）、タンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）及びY27632である。   When a ROCK inhibitor is contained in the medium, a suitable combination of FGF, activin signal pathway agonist, Wnt signal inhibitor and ROCK inhibitor is FGF2 or FGF4, activin (eg, activin A), tankyrase inhibitor (eg, XAV939) and Y27632.

培養方法Ｉにより、通常20継代以上、好ましくは30継代以上、理論的には無限に、TS細胞としての形質を維持しながらTS細胞を継代培養することが可能である。   According to the culture method I, it is possible to subculture the TS cells while maintaining the traits as TS cells, usually 20 passages or more, preferably 30 passages or more, theoretically infinitely.

培養方法Ｉにより、TS細胞を、長期間にわたって、TS細胞としての形質を維持した状態で増殖することができるので、自体公知の方法で、当該TS細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入されたTS細胞や、特定の遺伝子を欠損したTS細胞等の遺伝子改変TS細胞を製造することができる。   By culturing method I, TS cells can be propagated for a long period of time while maintaining the characteristics of TS cells. Therefore, the gene of the TS cells is modified by a method known per se, for example, a specific foreign Genetically modified TS cells such as TS cells into which a gene has been introduced or TS cells lacking a specific gene can be produced.

本項における、用語の定義、培養条件等の態様は、特にことわりのない限り、上記「製造方法Ｉ」の項に記載したものと同一である。   Definitions of terms, culture conditions, etc. in this section are the same as those described in the above section “Production Method I” unless otherwise specified.

ＩＩ．栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造方法
本発明は、哺乳動物TS細胞を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含む培地（好ましくは、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含む培地）中で浮遊培養することを含む、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造方法を提供するものである。 II. The present invention relates to mammalian TS cells in a medium containing FGF, an activin signal pathway agonist and a non-gel water-soluble component of a basement membrane preparation (preferably FGF, activin signal). A method for producing a trophoblastic ectoderm-like alveolar structure comprising suspension culture in a medium containing a pathway agent, a Wnt signal inhibitor, and a non-gel water-soluble component of a basement membrane preparation) .

栄養膜外胚葉様胞状構造体は、哺乳動物TS細胞及び当該TS細胞に由来する細胞により構成された上皮からなる略球状の細胞集合体（cell assembly）であり、その内部に当該上皮が取り囲むことにより形成された卵割腔様の空洞を有する。当該空洞は、当該構造体外部に対して閉鎖されている。略球状とは、顕微鏡観察下における構造体の最も長い直径（長径）と最も短い直径（短径）との比（短径／長径）が、１〜２．０の範囲、好ましくは１〜１．５の範囲内であることをいう。哺乳動物TS細胞及び当該TS細胞に由来する細胞により構成された上皮は、単層又は多層であり得るが、好ましくは単層である。   The trophoblastic germ-like vesicular structure is a substantially spherical cell assembly composed of an epithelium composed of mammalian TS cells and cells derived from the TS cells, and the epithelium surrounds the cell assembly. It has a cleavage space-like cavity formed by The cavity is closed with respect to the outside of the structure. “Substantially spherical” means that the ratio (minor axis / major axis) of the longest diameter (major axis) to the shortest diameter (minor axis) of the structure under a microscope is in the range of 1 to 2.0, preferably 1-1. .5 is within the range. The epithelium composed of mammalian TS cells and cells derived from the TS cells can be monolayer or multilayer, but is preferably monolayer.

栄養膜外胚葉様胞状構造体は、胎盤胞に近似した大きさを有しており、その直径（長径）は、通常５０〜１００μｍ、好ましくは７０〜９０μｍである。   The trophoblastic ectoderm-like structure has a size similar to that of a placental vesicle, and its diameter (major axis) is usually 50 to 100 μm, preferably 70 to 90 μm.

本発明の製造方法に用いられる培地（培地ＩＩＩとする）は、基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含むことを除き、上述の培地Ｉ又は培地ＩＩの態様と同一である。即ち、培地ＩＩＩは、上記培地Ｉ又は培地ＩＩに、基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を添加することにより調製することができる。   The medium used in the production method of the present invention (referred to as medium III) is the same as the above-described medium I or medium II except that it contains a non-gel water-soluble component of the basement membrane preparation. That is, the medium III can be prepared by adding the non-gel water-soluble component of the basement membrane preparation to the medium I or the medium II.

基底膜調製物は、本発明の製造方法に用いた時に、TS細胞から栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成を支持することができるものであれば、その由来する細胞の種類は特に限定されない。基底膜調製物としては、上記「Ｉ．栄養膜幹（TS）細胞」の項に記載されたものを使用することができる。基底膜調製物は、好適には、肉腫細胞由来であり、より好ましくはEngelbreth Holm Swarm（EHS）マウス肉腫由来である。例えば、マトリゲル（BD Bioscience）などを市販の基底膜調製物として使用することができる。 The basement membrane preparation is not particularly limited as long as it can support the formation of trophoblastic ectodermal-like structures from TS cells when used in the production method of the present invention. . As the basement membrane preparation, those described in the above section “ I. Trophoblast stem (TS) cells ” can be used. The basement membrane preparation is preferably derived from sarcoma cells, more preferably from Engelbreth Holm Swarm (EHS) mouse sarcoma. For example, Matrigel (BD Bioscience) can be used as a commercially available basement membrane preparation.

基底膜調製物の非ゲル水溶性成分とは、基底膜調製物からゲル化後のゲル構成成分を除去することにより得られる水溶性の残渣成分を意味する。基底膜調製物の非ゲル水溶性成分は、基底膜調製物を培地に添加し、室温において維持することによりゲル化を誘導した後に、遠心分離を行い、上清を回収し、フィルター（例えば、孔径0.45μm以下、好適には0.22μm以下のもの）によりろ過することにより、得ることが出来る。   The non-gel water-soluble component of the basement membrane preparation means a water-soluble residual component obtained by removing the gel component after gelation from the basement membrane preparation. The non-gel water-soluble component of the basement membrane preparation is induced by gelation by adding the basement membrane preparation to the medium and maintaining it at room temperature, followed by centrifugation, collecting the supernatant, and filtering (for example, It can be obtained by filtering with a pore diameter of 0.45 μm or less, preferably 0.22 μm or less.

培地中に添加する基底膜調製物の非ゲル水溶性成分の濃度は、TS細胞から栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成を支持することができる濃度であり、培地に添加する基底膜調製物自体のタンパク質濃度として、通常0.05 mg/ml以上、好ましくは0.1 mg/ml以上、より好ましくは0.2 mg/ml以上である。TS細胞から栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成を支持することができる限り、培地中に添加する基底膜調製物の非ゲル水溶性成分の濃度の上限値は特に限定されないが、費用対効果の観点から、培地に添加する基底膜調製物自体のタンパク質濃度として、通常2 mg/ml以下、好ましくは1 mg/ml以下とすることが望ましい。   The concentration of the non-gel water-soluble component in the basement membrane preparation added to the medium is a concentration that can support the formation of trophoblastic ectoderm-like vesicular structures from TS cells, and the basement membrane preparation added to the medium The protein concentration itself is usually 0.05 mg / ml or more, preferably 0.1 mg / ml or more, more preferably 0.2 mg / ml or more. The upper limit of the concentration of the non-gel water-soluble component of the basement membrane preparation added to the medium is not particularly limited as long as it can support the formation of trophoblastic ectoderm-like vesicular structures from TS cells, but it is cost-effective From this viewpoint, the protein concentration of the basement membrane preparation itself to be added to the medium is usually 2 mg / ml or less, preferably 1 mg / ml or less.

尚、本発明の製造方法においては、培地に基底膜調製物の非ゲル水溶性成分が含まれていれば足りるので、基底膜調製物の非ゲル水溶性成分として、基底膜調製物自体を培地に添加してもよい。しかしながら、ゲル成分を除去しないと、形成されたゲル成分の浮遊物によって、栄養膜外胚葉様胞状構造体の立体形成が阻害されてしまい、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造効率が低下してしまう。従って、ゲル成分を除去した、単離された基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を用いることが好ましく、培地ＩＩＩには、好適には、基底膜調製物のゲル成分が含まれない。   In the production method of the present invention, it is sufficient if the medium contains the non-gel water-soluble component of the basement membrane preparation. Therefore, the basement membrane preparation itself is used as the non-gel water-soluble component of the basement membrane preparation. You may add to. However, if the gel component is not removed, the three-dimensional formation of the trophoblastic ectoderm-like vesicle structure is inhibited by the formed suspension of the gel component, and the production efficiency of the trophoblast ectoderm-like vesicle structure is reduced. End up. Therefore, it is preferred to use the non-gel water-soluble component of the isolated basement membrane preparation from which the gel component has been removed, and medium III preferably does not contain the gel component of the basement membrane preparation.

培地ＩＩＩにおける、FGF及びアクチビンシグナル経路作用物質の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、及びアクチビン（例、アクチビンA）である。   A preferred combination of FGF and an activin signal pathway agonist in medium III is FGF2 or FGF4 and activin (eg, activin A).

培地ＩＩＩにおける、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及びWntシグナル阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、アクチビン（例、アクチビンA）、及びタンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）である。   A preferred combination of FGF, activin signal pathway agonist, and Wnt signal inhibitor in medium III is FGF2 or FGF4, activin (eg, activin A), and tankyrase inhibitor (eg, XAV939).

培地ＩＩＩにROCK阻害剤が含まれる場合、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及びROCK阻害剤の好適な組み合わせは、FGF2又はFGF4、アクチビン（例、アクチビンA）、タンキラーゼ阻害剤（例、XAV939）及びY27632である。   When ROCK inhibitor is contained in medium III, suitable combinations of FGF, activin signal pathway agonist, Wnt signal inhibitor and ROCK inhibitor are FGF2 or FGF4, activin (eg, activin A), tankyrase inhibitor (eg, XAV939) and Y27632.

培地ＩＩＩには、好適には、ヘパリンが含有される。   The medium III preferably contains heparin.

本発明の製造方法においては、分散された哺乳動物栄養膜幹細胞を、上記培地ＩＩＩ中で、培養器に対して、非接着性の条件下で培養し（即ち、浮遊培養し）、複数の栄養膜幹細胞を集合させて凝集塊を形成し、この凝集塊を培地ＩＩＩにおいて引き続き培養することにより、栄養膜外胚葉様胞状構造体へと誘導する。   In the production method of the present invention, the dispersed mammalian trophoblast stem cells are cultured in the above medium III under non-adhesive conditions with respect to the incubator (that is, suspended culture), and a plurality of nutrients are obtained. Membrane stem cells are aggregated to form aggregates, and these aggregates are subsequently cultured in medium III to induce trophoblast ectodermal-like structures.

この浮遊培養に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。非接着性の条件下での培養を可能とするため、培養器は、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞非接着性となるように人工的に処理されているものや、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの等を使用することができる。   The incubator used for this suspension culture is not particularly limited. For example, flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi dishes, micro plates, micro well plates, micro pores, multi plates, Examples include multi-well plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles. In order to enable culturing under non-adhesive conditions, the incubator is preferably non-cell-adhesive. As a cell non-adhesive incubator, the surface of the incubator is artificially treated so as to be non-cell-adhesive, or artificially treated for the purpose of improving the adhesion with cells (for example, Those that are not coated with an extracellular matrix or the like can be used.

栄養膜幹細胞の凝集塊の形成に際しては、まず、栄養膜幹細胞を継代培養から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態（例えば、２〜１０個の細胞からなる細胞凝集塊）にまで分散する。栄養膜幹細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。分散された栄養膜幹細胞は上記培地ＩＩＩ中に懸濁される。   In forming an aggregate of trophoblast stem cells, first, the trophoblast stem cells are recovered from the subculture, and are collected from a single cell or a state close thereto (for example, a cell aggregate composed of 2 to 10 cells). ). The trophoblast stem cells are dispersed using an appropriate cell dissociation solution. As the cell dissociation solution, for example, EDTA; proteolytic enzymes such as trypsin, collagenase IV, metalloprotease and the like can be used alone or in appropriate combination. The dispersed trophoblast stem cells are suspended in the medium III.

分散により誘導される栄養膜幹細胞の細胞死を抑制するために、ＲＯＣＫ阻害剤を培養開始時から培地ＩＩＩに添加することが好ましい。培地ＩＩＩ中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、分散により誘導される栄養膜幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度であり、培地Ｉ及び培地ＩＩにおいて記載したＲＯＣＫ阻害剤の濃度であれば、このような細胞死抑制効果を達成することが出来る。例えば、Ｙ−２７６３２について、このような濃度は、通常約０．１〜２００μＭ、好ましくは約２〜５０μＭである。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を添加する期間内で変動させてもよく、例えば期間の後半で濃度を半減させることができる。或いは、浮遊培養開始後、一定期間はROCK阻害剤を添加した培地ＩＩＩ中で培養を行い、その後（例えば、栄養膜幹細胞の凝集塊の形成が確認された後）、ＲＯＣＫ阻害剤を培地から除いてもよい。   In order to suppress cell death of trophoblast stem cells induced by dispersion, it is preferable to add a ROCK inhibitor to medium III from the beginning of the culture. The concentration of the ROCK inhibitor in the medium III is a concentration that can suppress cell death of trophoblast stem cells induced by dispersion, and if the concentration of the ROCK inhibitor described in the medium I and the medium II is such a concentration, A cell death inhibitory effect can be achieved. For example, for Y-27632 such a concentration is usually about 0.1-200 μM, preferably about 2-50 μM. The concentration of the ROCK inhibitor may be varied within the addition period. For example, the concentration can be halved in the latter half of the period. Alternatively, culture is performed in medium III supplemented with a ROCK inhibitor for a certain period after the start of suspension culture, and then the ROCK inhibitor is removed from the medium (for example, after the formation of aggregates of trophoblast stem cells has been confirmed). May be.

分散された栄養膜幹細胞の懸濁液を、上記培養器中に播き、分散させた栄養膜幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、栄養膜幹細胞が***し、***した細胞同士が接着したまま、分離せずに***を繰り返すことにより、栄養膜幹細胞の凝集塊を形成する。単一細胞にまで分散した栄養膜幹細胞を用いた場合には、１つの凝集塊に含まれる栄養膜幹細胞は、１個の栄養膜幹細胞に由来するクローナルな集団である。浮遊培養開始時における栄養膜幹細胞の濃度は、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造が可能である限り、特に限定されないが、細胞密度が高すぎると、分散した複数の栄養膜幹細胞同士が再度凝集してしまうため、このような再凝集を防止する観点から、浮遊培養開始時における栄養膜幹細胞の濃度は、ある程度低いことが好ましい。浮遊培養開始時における栄養膜幹細胞の濃度は、例えば、1 x 106個/ml以下、好ましくは、5 x 105個/ml以下である。浮遊培養開始時における栄養膜幹細胞の濃度は低いぶんには特に問題はなく、極端な例として、１つのウェルに１個の栄養膜幹細胞のみを培養する、いわゆるシングルセルカルチャー（例えば、１個／mlの細胞濃度）から浮遊培養を開始してもよい。浮遊培養開始時における栄養膜幹細胞の濃度は、好適には、1 x 105個/ml〜5 x 105個/ml（例、2 x 105個/ml）である。 The suspension of dispersed trophoblast stem cells is seeded in the above incubator, and the dispersed trophoblast stem cells are cultured under non-adhesive conditions in the incubator, thereby dividing the trophoblast stem cells. Then, while dividing cells are adhered to each other and repeating division without separation, an aggregate of trophoblast stem cells is formed. When trophoblast stem cells dispersed up to a single cell are used, the trophoblast stem cells contained in one aggregate are a clonal population derived from one trophoblast stem cell. The concentration of trophoblast stem cells at the start of suspension culture is not particularly limited as long as the trophoblast-embryonic vesicular structure can be produced, but if the cell density is too high, a plurality of dispersed trophoblast stem cells are Since aggregation occurs, the concentration of trophoblast stem cells at the start of suspension culture is preferably low to some extent from the viewpoint of preventing such reaggregation. The concentration of trophoblast stem cells at the start of suspension culture is, for example, 1 × 10 6 cells / ml or less, preferably 5 × 10 5 cells / ml or less. When the concentration of trophoblast stem cells at the start of suspension culture is low, there is no particular problem. As an extreme example, only one trophoblast stem cell is cultured in one well, so-called single cell culture (for example, 1 cell / cell). The suspension culture may be started from a cell concentration of ml). The concentration of trophoblast stem cells at the beginning suspension culture, preferably a 1 x 10 5 cells / ml to 5 x 10 5 cells / ml (Example, 2 x 10 5 cells / ml).

本発明の製造方法においては、哺乳動物TS細胞を、フィーダー細胞とともに／又はフィーダー細胞無しで浮遊培養する。化学的に未決定な因子の混入を排除する観点から、好適には、浮遊培養がフィーダー細胞無しで行われる。本発明の製造方法においては、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分の組み合わせ（好ましくは、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分の組み合わせ、より好ましくは、FGF2、アクチビンシグナル経路作用物質、Wntシグナル阻害剤、ROCK阻害剤、及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分の組み合わせ）を用いることにより、フィーダー細胞無しで栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成が可能となる。   In the production method of the present invention, mammalian TS cells are cultured in suspension with or without feeder cells. From the viewpoint of eliminating contamination with chemically undecided factors, suspension culture is preferably performed without feeder cells. In the production method of the present invention, a combination of non-gel water-soluble components of FGF, activin signal pathway agonist and basement membrane preparation (preferably, FGF, activin signal pathway agonist, Wnt signal inhibitor and basement membrane preparation By using a combination of non-gel water-soluble components, more preferably a combination of FGF2, activin signaling pathway agonists, Wnt signal inhibitors, ROCK inhibitors, and non-gel water-soluble components of basement membrane preparations) Without this, formation of trophoblastic ectoderm-like structures is possible.

浮遊培養における温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は、哺乳動物細胞の通常の培養条件に準じて、当業者であれば、適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。 Other culture conditions such as temperature and CO 2 concentration in suspension culture can be appropriately set by those skilled in the art in accordance with normal culture conditions for mammalian cells. The culture temperature is not particularly limited and is, for example, about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.

通常、浮遊培養開始から１日後には栄養膜幹細胞からなる凝集塊が形成され、その内部に空洞の形成が認められるようになる。そして、この凝集塊を栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成が確認されるまで引き続き浮遊培養することにより、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体を得ることが出来る。即ち、この浮遊培養の操作により、１個の栄養膜幹細胞から、栄養膜外胚葉様胞状構造体が自己組織化される。栄養膜外胚葉様胞状構造体の形成に要する浮遊培養の期間は、分散された栄養膜幹細胞の浮遊培養の開始から、通常、３〜４日程度である。４日を超えて浮遊培養を継続すると、徐々に栄養外胚葉様構造が保てなくなる。１個の栄養膜外胚葉様胞状構造体を構成する細胞数は、浮遊培養開始3日目の時点で50-100個程度であり、培養を継続することにより、細胞数は増加する。   Usually, one day after the start of suspension culture, an aggregate composed of trophoblast stem cells is formed, and the formation of cavities therein is observed. Then, the trophoblast ectoderm-like vesicular structure of the present invention can be obtained by continuing the suspension culture of the aggregate until the formation of the trophoblast ectoderm-like structure is confirmed. That is, by this floating culture operation, the trophoblast ectodermal-like vesicular structure is self-organized from one trophoblast stem cell. The period of suspension culture required for the formation of trophoblastic ectoderm-like structures is usually about 3 to 4 days from the start of suspension culture of dispersed trophoblast stem cells. When suspension culture is continued for more than 4 days, the trophectoderm-like structure cannot be maintained gradually. The number of cells constituting one trophoblastic ectoderm-like vesicular structure is about 50 to 100 on the third day from the start of suspension culture, and the number of cells increases by continuing the culture.

栄養膜外胚葉様胞状構造体が形成されたことは、上皮からなる立体的な球構造体が形成されたことを顕微鏡下で観察することにより行うことが出来る。TS細胞マーカー（例、Cdx2）に対する抗体を用いた免疫組織学的染色を行い、当該構造体が当該マーカーを高発現しており、該構造体を構成する細胞に占めるTS細胞が占める割合が、50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、より更に好ましくは95%以上（例えば100%）であることを確認してもよい。更には、得られた構造体に、哺乳動物多能性幹細胞を注入後、哺乳動物の子宮内に移植することにより、子宮に着床する活性を有することを確認してもよい。   Formation of the trophoblastic ectoderm-like structure can be performed by observing under a microscope that a three-dimensional spherical structure composed of epithelium is formed. Perform immunohistological staining with an antibody against a TS cell marker (eg, Cdx2), the structure highly expresses the marker, and the proportion of TS cells in the cells constituting the structure is It may be confirmed that it is 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more (for example, 100%). Furthermore, after injecting a mammalian pluripotent stem cell into the obtained structure, it may be confirmed that it has an activity of implanting into the uterus by transplanting it into the uterus of the mammal.

また、本発明は、上記製造方法により製造された栄養膜外胚葉様胞状構造体をも提供する。本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体は、好適には、哺乳動物TS細胞及び当該TS細胞に由来する細胞（即ち、TS細胞から分化した栄養膜系列細胞）からなる。TS細胞に由来する細胞としては、栄養膜巨細胞、栄養膜細胞、合胞体栄養膜細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体を構成する細胞の多くはTS細胞であり、TS細胞が占める割合は、通常、50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、より更に好ましくは95%以上（例えば100%）である。TS細胞が占める割合は、栄養膜外胚葉様胞状構造体を構成する細胞に占めるCdx2（TS細胞マーカー）陽性細胞の割合として定義することができる。好ましい態様において、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体は、哺乳動物TS細胞からなり、該構造体を構成する細胞に占めるCdx2陽性細胞の割合が100%である。   The present invention also provides a trophoblastic ectoderm-like vesicular structure produced by the above production method. The trophoblastic ectoderm-like vesicular structure of the present invention preferably comprises a mammalian TS cell and a cell derived from the TS cell (that is, a trophoblast lineage cell differentiated from the TS cell). Examples of cells derived from TS cells include, but are not limited to, trophoblast giant cells, trophoblast cells, syncytial trophoblast cells and the like. Many of the cells constituting the trophoblastic germ-like vesicular structure of the present invention are TS cells, and the proportion of TS cells is usually 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and more Preferably it is 90% or more, more preferably 95% or more (for example, 100%). The proportion of TS cells can be defined as the proportion of Cdx2 (TS cell marker) positive cells in the cells that make up the trophoblastic endoderm-like structures. In a preferred embodiment, the trophoblastic ectoderm-like vesicular structure of the present invention consists of mammalian TS cells, and the proportion of Cdx2-positive cells in the cells constituting the structure is 100%.

本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体は、好適には単離されており、哺乳動物TS細胞及び当該TS細胞に由来する細胞以外の細胞（例、内部細胞塊）を含まない。   The trophoblastic ectoderm-like vesicular structure of the present invention is preferably isolated and does not contain mammalian TS cells and cells other than cells derived from the TS cells (eg, inner cell mass).

胚盤胞から、マイクロカッター等により内部細胞塊を除去することにより、栄養膜外胚葉様胞状構造体を得ることも可能であるが、内部細胞塊部分の完全な除去は困難であり、内部細胞系列の細胞が、栄養膜外胚葉様胞状構造体内に残存する可能性を完全に排除することが困難である。これに対して、上記製造方法により製造することができる、TS細胞及び当該TS細胞に由来する栄養膜系列細胞のみからなる栄養膜外胚葉様胞状構造体は、決して内部細胞系列の細胞を含まないので、内部細胞系列の細胞の存在が排除できない栄養膜外胚葉様胞状構造体とは、物として異なる。   By removing the inner cell mass from the blastocyst with a microcutter or the like, it is possible to obtain an trophoblastic ectoderm-like structure, but it is difficult to completely remove the inner cell mass part. It is difficult to completely eliminate the possibility that lineage cells remain in the trophoblastic ectoderm-like vesicular structure. On the other hand, the trophoblast-ectoderm-like vesicular structure consisting only of TS cells and trophoblast lineage cells derived from the TS cells, which can be produced by the above production method, never contains cells of the internal cell lineage. Therefore, it differs from the trophoblastic ectoderm-like structure that cannot exclude the presence of cells of the internal cell lineage.

本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体は、好適には、哺乳動物多能性幹細胞を注入後、哺乳動物の子宮内に移植した際に、子宮に着床する活性を有する。従って、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体及び哺乳動物多能性幹細胞を用いることにより、子宮内において、当該多能性幹細胞のみに由来する非キメラ胚の形成を誘導することができる。多能性幹細胞の注入及び、哺乳動物の子宮内への移植については後述する。   The trophoblastic ectoderm-like vesicular structure of the present invention preferably has an activity of implanting into the uterus when injected into a mammal's uterus after injecting a mammalian pluripotent stem cell. Therefore, by using the trophoblastic embryoid-like vesicular structure and the mammalian pluripotent stem cell of the present invention, it is possible to induce the formation of a non-chimeric embryo derived only from the pluripotent stem cell in the uterus. The injection of pluripotent stem cells and transplantation into the uterus of a mammal will be described later.

ＩＩＩ．哺乳動物胚の製造方法
本発明は、哺乳動物多能性幹細胞を、上記本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入することを含む、哺乳動物胚の製造方法を提供するものである。 III. Method for Producing Mammalian Embryo The present invention provides a method for producing a mammalian embryo, which comprises injecting mammalian pluripotent stem cells into the trophoblast-embryonic dermatoid structure of the present invention.

多能性幹細胞とは、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞***を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。   Pluripotent stem cells are the ability to differentiate into all the cells that make up the living body except the placenta (differentiated pluripotency) and the ability to generate daughter cells that have the same differentiation potential as the self through cell division (self-replication) Cell).

多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。本発明においては、ES細胞又はiPS細胞が好適に用いられる。   Examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), etc. The cell is not limited to this as long as it is a cell having both. In the present invention, ES cells or iPS cells are preferably used.

また、多能性幹細胞に換えて、内部細胞塊を上記本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入してもよい。内部細胞塊は、胚盤胞から栄養外胚葉を除去することにより単離することができる。内部細胞塊を注入する場合には、塊の状態を維持したまま（塊の状態を破壊せずに）注入してもよいし、トリプシン等のタンパク質分解酵素処理により単一細胞またはこれに近い状態にまで分散した後に、分散した内部細胞塊構成細胞を注入してもよい。   Further, instead of pluripotent stem cells, the inner cell mass may be injected into the trophoblast-like germ layer-like structure of the present invention. The inner cell mass can be isolated by removing trophectoderm from the blastocyst. When injecting an inner cell mass, it may be injected while maintaining the state of the mass (without destroying the state of the mass), or a single cell or a state close to this by proteolytic enzyme treatment such as trypsin After the dispersion, the dispersed inner cell mass constituting cells may be injected.

多能性幹細胞又は内部細胞塊が由来する哺乳動物種は、栄養膜外胚葉様胞状構造体が由来する哺乳動物種と同一であることが好ましい。例えば、通常、マウス多能性幹細胞又は内部細胞塊をマウス栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入し、ヒト多能性幹細胞又は内部細胞塊をヒト栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入する。   The mammalian species from which the pluripotent stem cell or inner cell mass is derived is preferably the same as the mammalian species from which the trophoblastic ectoderm-like vesicular structure is derived. For example, usually, mouse pluripotent stem cells or inner cell masses are injected into mouse trophoblast ectodermal vesicular structures, and human pluripotent stem cells or inner cell masses are injected into human trophoblast ectodermal vesicular structures.

栄養膜外胚葉様胞状構造体への多能性幹細胞又は内部細胞塊の注入は、胎盤胞注入法（Gardner R.L. 1968. Mouse chimeras obtained by the injection of cells into blastocyst. Nature 371: 333-336）に準じて実施することが出来る。例えば、キャピラリーを用いて、分散した多能性幹細胞又は内部細胞塊構成細胞を、１つの栄養膜外胚葉様胞状構造体につき、1〜20個程度、栄養膜外胚葉様胞状構造体内の卵割腔様の空洞中へマイクロインジェクションする。   Injection of pluripotent stem cells or inner cell mass into trophoblastic ectoderm-like vesicular structure is done by placental cyst injection (Gardner RL 1968. Mouse chimeras obtained by the injection of cells into blastocyst. Nature 371: 333-336) It can be carried out accordingly. For example, about 1 to 20 dispersed pluripotent stem cells or inner cell mass-constituting cells using capillaries per trophoblast ectoderm-like blastoid structure in the trophoblast ectoderm-like blastoid structure Microinject into a cavity-like cavity.

このようにして得られた、注入された多能性幹細胞又は内部細胞塊を含む本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体（即ち、胚）をインビトロにおいて培養することにより、多能性幹細胞又は内部細胞塊の体細胞分化が誘導され、胚発生が生じることが期待される。   By culturing in vitro the trophoblast ectoderm-like vesicular structure (ie, embryo) of the present invention containing the injected pluripotent stem cells or inner cell mass obtained in this way, pluripotent stem cells or It is expected that somatic differentiation of the inner cell mass is induced and embryonic development occurs.

上述の様に、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体は、着床する活性を有するため、胚発生をより確実に生じさせるため、注入された多能性幹細胞又は内部細胞塊、或いは当該多能性幹細胞又は内部細胞塊に由来する細胞を含む、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体（即ち、胚）を、レシピエント哺乳動物（雌）の子宮又は卵管に移入し、当該子宮に着床させてもよい。   As described above, the trophoblastic ectoderm-like vesicular structure of the present invention has an implanting activity, and thus more reliably causes embryogenesis. The trophoblastic ectoderm-like vesicular structure (ie, embryo) of the present invention comprising cells derived from pluripotent stem cells or inner cell mass is transferred to the uterus or fallopian tube of a recipient mammal (female), It may be implanted in the uterus.

ホルモン補充を行わない場合、胚の着床を促すため、性周期に合わせて多能性幹細胞又は内部細胞塊、或いは当該多能性幹細胞又は内部細胞塊に由来する細胞を含む、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体（即ち、胚）を、レシピエント哺乳動物（雌）の子宮又は卵管に移入することが好ましい。例えば、ヒトの場合、***後5日目にレシピエントの子宮又は卵管に胚を移入する。あるいは、子宮内膜の状態を整えるため、ホルモン補充周期法を適用し、エストロゲン投与により子宮内膜の肥厚を促し、その後、黄体ホルモンを投与してもよい。例えば、ヒトの場合、ホルモン補充周期法を適用し、生理後19〜20日にレシピエントの子宮又は卵管に胚を移入する。また、レシピエント哺乳動物として、偽妊娠哺乳動物を用いてもよい。偽妊娠哺乳動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。レシピエント哺乳動物の動物種は、多能性幹細胞又は内部細胞塊、及び栄養膜外胚葉様胞状構造体がそれぞれ由来する哺乳動物種と同一であることが好ましい。   In the absence of hormone supplementation, the nutrition of the present invention includes pluripotent stem cells or inner cell masses or cells derived from the pluripotent stem cells or inner cell masses according to the sexual cycle in order to promote implantation of the embryo It is preferred to transfer the extramembranous dermatoid vesicular structure (ie embryo) to the uterus or fallopian tube of the recipient mammal (female). For example, in the case of a human, the embryo is transferred to the recipient's uterus or fallopian tube 5 days after ovulation. Alternatively, in order to adjust the condition of the endometrium, a hormone replacement cycle method may be applied to promote the thickening of the endometrium by estrogen administration, and then luteinizing hormone may be administered. For example, in the case of humans, the hormone replacement cycle method is applied, and embryos are transferred to the recipient's uterus or fallopian tubes 19-20 days after menstruation. A pseudopregnant mammal may be used as the recipient mammal. A pseudopregnant mammal can be obtained by mating a female animal having a normal cycle with a male animal castrated by vagina ligation or the like. The species of recipient mammal is preferably the same as the mammal species from which the pluripotent stem cells or inner cell mass and trophoblastic ectoderm-like structures are derived, respectively.

着床の有無は、脱落膜形成を確認することにより確認することが出来る。胚が子宮内に着床すると、脱落膜の形成が生じ、胚発生を良好に支持する。その結果、胎盤を除くすべての部分が移入した多能性幹細胞又は内部細胞塊に由来する胚が形成される。また、この妊娠を維持することにより、移入した多能性幹細胞又は内部細胞塊のみが寄与する子孫哺乳動物を誕生させることも期待できる。本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体自体には、内部細胞塊が含まれないので、本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体内に多能性幹細胞又は内部細胞塊を導入することにより、導入した多能性幹細胞又は内部細胞塊のみが寄与する胚及び子孫哺乳動物を、キメラ胚形成無しで、生じさせることが可能となる。   The presence or absence of implantation can be confirmed by confirming the formation of the decidua. When the embryo is implanted in the uterus, decidua formation occurs and favors embryo development. As a result, embryos derived from pluripotent stem cells or inner cell mass into which all parts except the placenta have been transferred are formed. Moreover, by maintaining this pregnancy, it can also be expected to produce offspring mammals to which only the transferred pluripotent stem cells or inner cell mass contribute. Since the trophoblast ectoderm-like vesicular structure itself does not contain an inner cell mass, by introducing pluripotent stem cells or inner cell mass into the trophoblast ectoderm-like vesicular structure of the present invention, Embryos and offspring mammals to which only the introduced pluripotent stem cells or inner cell mass contribute can be generated without the formation of chimeric embryos.

不妊治療の臨床研究においては胚盤胞の質を決定しているのは内部細胞塊よりも栄養外胚葉であることが示唆されている。例えば、栄養外胚葉やそこから分化する胎盤の機能に不全があることにより、そのままでは妊娠に至らないヒト胚盤胞から内部細胞塊を分離し、正常なTS細胞から製造した本発明の栄養膜外胚葉様胞状構造体中にこれを注入することにより、機能不全のない良質の胚盤胞を得ることが可能である。更に、この胚盤胞をレシピエントの子宮又は卵管に移入し、当該子宮に着床させることにより、正常な妊娠及び分娩に導くことが可能である。従って、本発明は、栄養外胚葉や胎盤の機能不全を原因とする不妊に対する比類のない治療手段を提供する。   Clinical studies on fertility have suggested that it is the trophectoderm rather than the inner cell mass that determines the quality of the blastocyst. For example, the trophoblast of the present invention produced from normal TS cells by separating the inner cell mass from human blastocysts that do not lead to pregnancy by themselves due to the lack of function of the trophectoderm and the placenta that differentiates from them By injecting this into the ectoderm-like vesicular structure, it is possible to obtain a good quality blastocyst without dysfunction. Furthermore, this blastocyst can be transferred to the recipient's uterus or fallopian tube and implanted into the uterus, leading to normal pregnancy and delivery. Thus, the present invention provides a unique treatment for infertility caused by dysfunctional ectoderm or placenta dysfunction.

本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。   The contents of all publications, including patents and patent application specifications cited in this specification, are hereby incorporated by reference herein to the same extent as if all were explicitly stated. Is.

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。   The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.

［参考例１］
［材料及び方法］
（TS細胞の誘導）
以下の条件（CDM/FAXYと称す）を、着床前E3.5胚盤胞及び着床後E6.5胚体外外胚葉からのTS細胞の誘導及び維持に用いた。CDM/FAXYは、250 mlのNeurobasal (Invitrogen)、250 mlのDMEM/F12 (Ham’s) (1:1) (Invitrogen)、2.5 ml N2 サプリメント (Invitrogen)、B27 サプリメント (Invitrogen)、5 ml ペニシリン-ストレプトマイシン-L-グルタミン溶液(Invitrogen)、ウシ血清アルブミン (Sigma、最終濃度0.05%)、1-チオグリコレート(Sigma、最終濃度1.5 × 10-4M)、組み換え型マウスbasic FGF (R&D、最終濃度12.5-50 ng/ml)、組み換え型 ヒトアクチビンA (R&D、最終濃度20 ng/ml)、XAV939 (Calbiochem、最終濃度10 nM)、及びY27632 (Stemgent、最終濃度5 μM)を配合することにより調製した。E3.5胚盤胞及びE6.5胚体外外胚葉を、15 μg/mlヒト血漿フィブロネクチン(Millipore)で37℃にて少なくとも1時間コートした96穴プレート上、CDM/FAXY中にまいた。増殖したTS細胞の初期増殖物は、5日目までには明らかとなった。まいてから5〜8日後に、これらの増殖物をTripLE Select (Invitrogen)により単一細胞へ分散させた。新たに樹立された細胞株をフィブロネクチンコートしたディッシュ上で更にTripLE Selectにより増殖させ、その後、Cellbanker 2 (Mitsubishi Chemical Medience)を用いて凍結させるか、更なる解析に用いた。培地は2日おきに交換した。CDM/FAXYに、KnockOutTM serum replacement (Invitrogen、1% final concentration)を用いることができ、正の細胞接着効果をもたらした。Y27632を加えない場合には、0.2% マトリゲル (BD Biosciences)をコートしたディッシュをTS細胞培養に用いた。 [Reference Example 1]
[Materials and methods]
(Induction of TS cells)
The following conditions (referred to as CDM / FAXY) were used for the induction and maintenance of TS cells from pre-implantation E3.5 blastocysts and post-implantation E6.5 extraembryonic ectoderm. CDM / FAXY is 250 ml Neurobasal (Invitrogen), 250 ml DMEM / F12 (Ham's) (1: 1) (Invitrogen), 2.5 ml N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), 5 ml penicillin-streptomycin -L-glutamine solution (Invitrogen), bovine serum albumin (Sigma, final concentration 0.05%), 1-thioglycolate (Sigma, final concentration 1.5 × 10 −4 M), recombinant mouse basic FGF (R & D, final concentration 12.5) -50 ng / ml), recombinant human activin A (R & D, final concentration 20 ng / ml), XAV939 (Calbiochem, final concentration 10 nM), and Y27632 (Stemgent, final concentration 5 μM). . E3.5 blastocysts and E6.5 extraembryonic ectoderm were seeded in CDM / FAXY on 96-well plates coated with 15 μg / ml human plasma fibronectin (Millipore) at 37 ° C. for at least 1 hour. The initial growth of expanded TS cells was evident by day 5. Five to eight days after seeding, these growths were dispersed into single cells by TripLE Select (Invitrogen). Newly established cell lines were further grown on a fibronectin-coated dish with TripLE Select and then frozen using Cellbanker 2 (Mitsubishi Chemical Medience) or used for further analysis. The medium was changed every 2 days. KnockOut ™ serum replacement (Invitrogen, 1% final concentration) could be used for CDM / FAXY, resulting in a positive cell adhesion effect. When Y27632 was not added, a dish coated with 0.2% Matrigel (BD Biosciences) was used for TS cell culture.

（定量的PCR (qPCR)解析）
RNeasy Mini kits (Qiagen)を用いて細胞から全RNAを精製した。逆転写のため、ReverTra Ace (Toyobo)及びoligo (dT)20プライマーを用いた。qPCR解析のため、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)及びCFX384 Real-Time System (Bio-Rad)を用いた。転写レベルはトリプリケートの反応で定義し、対応するGapdhに対して規準化した。 (Quantitative PCR (qPCR) analysis)
Total RNA was purified from cells using RNeasy Mini kits (Qiagen). ReverTra Ace (Toyobo) and oligo (dT) 20 primers were used for reverse transcription. For qPCR analysis, Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) and CFX384 Real-Time System (Bio-Rad) were used. Transcription levels were defined by triplicate reactions and normalized to the corresponding Gapdh.

（免疫蛍光染色）
細胞をフィブロネクチンコートしたプラスチック底ディッシュ(35 mm μ-Dish; ibidi)上で2日間増殖させ、4%パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液で室温にて1時間固定し、その後0.1% Triton X100/PBSで3回洗浄した。細胞をブロッキング溶液(0.5% 正常ヤギ血清 [Vector]を含むPBS + 0.1% Triton X-100 [PBST])でブロックし、ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体とともに4℃にて一晩インキュベートした。次に、細胞をPBSTにより3回洗浄し、Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (1:500; A11036、Invitrogen)とともに室温にて1時間インキュベートし、PBST中で洗浄し、DAPI (1 μg/ml; Invitrogen)により対比染色し、画像化した。ウサギ抗Cdx2抗体(ab76541、Abcam)は、1:500希釈で用いた。 (Immunofluorescence staining)
Cells were grown for 2 days on fibronectin-coated plastic bottom dishes (35 mm μ-Dish; ibidi), fixed with 4% paraformaldehyde / phosphate buffer for 1 hour at room temperature, then 0.1% Triton X100 / PBS Washed 3 times. Cells were blocked with blocking solution (PBS containing 0.5% normal goat serum [Vector] + 0.1% Triton X-100 [PBST]) and incubated overnight at 4 ° C. with primary antibody diluted in blocking solution. The cells were then washed 3 times with PBST, incubated with Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (1: 500; A11036, Invitrogen) for 1 hour at room temperature, washed in PBST, and DAPI (1 μg / ml; Invitrogen) and counterstained and imaged. Rabbit anti-Cdx2 antibody (ab76541, Abcam) was used at a 1: 500 dilution.

（アポトーシス解析）
アポトーシス細胞は、FAM-FLICA Poly Caspase Assay Kit (ImmunoChemistry Technologies)を用いて検出し、細胞をHoechst 33342 (200 μg/ml、ImmunoChemistry Technologies)により対比染色した。 (Apoptosis analysis)
Apoptotic cells were detected using the FAM-FLICA Poly Caspase Assay Kit (ImmunoChemistry Technologies), and the cells were counterstained with Hoechst 33342 (200 μg / ml, ImmunoChemistry Technologies).

（画像化）
画像は、DP72カメラ(Olympus)を備えたIX71倒立顕微鏡(Olympus)、DP71カメラ(Olympus)を備えたSZX12解剖顕微鏡(Olympus)、又はFV1000倒立共焦点顕微鏡を用いて得た。 (Imaging)
Images were obtained using an IX71 inverted microscope (Olympus) equipped with a DP72 camera (Olympus), an SZX12 dissecting microscope (Olympus) equipped with a DP71 camera (Olympus), or an FV1000 inverted confocal microscope.

（レンチウイルス産生及び感染）
293FTを100 mmディッシュにつき4 × 106個まき、一晩インキュベートした。細胞を、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて、pLV-CAG1.1-EGFP、pMDL g/p、pREV、及びpVSVG ベクター(Okada et al.、2007)でトランスフェクトした。トランスフェクションから48及び72時間後、トランスフェクタントからの培養液を回収し、0.45μm孔セルロースアセテートフィルター(Millipore)を通して濾過し、ろ液をウイルス上清として用いた。トランスダクションの1日前に、TS細胞を6穴プレート(Greiner Bio One)に1ウェルあたり1 × 105個まいた。トランスダクションの日に、培地を4 mg/mlポリブレン(Nacalai Tesque)を添加したウイルス上清に交換し、次に24時間インキュベートした。 (Lentiviral production and infection)
4 × 10 6 293FT were seeded per 100 mm dish and incubated overnight. Cells were transfected with pLV-CAG1.1-EGFP, pMDL g / p, pREV, and pVSVG vectors (Okada et al., 2007) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 48 and 72 hours after transfection, the culture medium from the transfectant was collected and filtered through a 0.45 μm pore cellulose acetate filter (Millipore), and the filtrate was used as the virus supernatant. One day before transduction, 1 × 10 5 TS cells were plated per well in 6-well plates (Greiner Bio One). On the day of transduction, the medium was replaced with virus supernatant supplemented with 4 mg / ml polybrene (Nacalai Tesque) and then incubated for 24 hours.

（胚盤胞注入）
キメラマウスを作成するため、TS細胞をC57BL/6 胚盤胞中へ注入し、CD1偽妊娠マウスの子宮角へ移入した。全ての動物試験は、実験動物の管理と使用に関するガイドライン（RIKEN神戸研究所）に適合したものであり、機関の動物実験委員会により承認されたものである。 (Blastocyst injection)
To create chimeric mice, TS cells were injected into C57BL / 6 blastocysts and transferred to the uterine horns of CD1 pseudopregnant mice. All animal tests conform to the guidelines for the management and use of laboratory animals (RIKEN Kobe Laboratory) and have been approved by the institutional animal experiment committee.

［結果］
（化学的に定義された条件におけるTS細胞の樹立及び自己複製）
主要なシグナル経路の活性化（例、BMP、アクチビン、TGFβ、FGF、WNT等）に対する胎盤胞の反応を観察するため、本発明者は、最初に、BMP4、BMP7、LDN-193189、Dorsomorphin、アクチビンA、TGFβs1、GDF3、SB431542、A-83-01、LIF、FGF2、FGF4、PD0325901、PD184352、PD173074、SU5402、WNT3、CHIR99021、XAV939、GF109203X、及びY27632の多様な組み合わせを含有する化学的に定義された培地（CDM）中で、マウス胚盤胞を培養した。その結果、CDM中におけるFGF2、アクチビンA、XAV939、及びY27632の組み合わせが、E3.5胎盤胞からの早いTE増殖を引き起こすことが示された。この目的のため、本発明者はOct3/4-EGFPレポーターを内部にもつ、CD1 × B6 F1 GOF18 胚盤胞（図1）(Yoshimizu et al.、1999)を、LIF、PD0325901（MEK阻害剤）、及びCHIR99021（GSK3阻害剤）を含有するCDM（CDM／L2i、ES細胞培養条件）、又はFAXYを含有するCDM（12.5 ng/ml FGF2、20 ng/ml activin A、10 nM XAV939、5 μM Y27632）(CDM/FAXY、TS細胞培養条件)中で培養した。5日後、CDM/L2i中で増殖した内部細胞塊（ICM）は、Oct3/4-EGFP陽性の増殖物（outgrowth）を生じた（図2、左）。対照的に、CDM/FAXY中で増殖した胚盤胞の外層（栄養膜外胚葉、TE）は、Oct3/4-EGFP陰性の増殖物を形成した（図2、右）。これらの初代TE外植片は、マウスES細胞の継代に用いるプロトコールに沿った単一細胞分散により、増殖させることができた。継代した細胞は、最初にコンパクトでドーム状のコロニーを形成し、その後次第に形状が変化し、TS細胞の特徴的形態となった（図3）。次に、本発明者は桑実胚及び胚盤胞（CD1 × B6 F1、CD1 × CD1、or 129 × B6 F1）を採集し、FGF2、FGF4、アクチビンA、XAV939、及びY27632の多様な組み合わせを含むCDM中で培養した。全ての遺伝学的バックグラウンドにおいて、TS細胞株は、FAXYを含有するCDM中でのみ効率的に誘導することができた（表1）。しばしば、エピブラスト幹細胞（EpiSC）(Brons et al.、2007; Tesar et al.、2007)様の非TS細胞が外植片の初期継代物中に現れた（表1）。これらの細胞は、最初にTS細胞と共存するが、TS細胞よりも速く増殖するため、最終的にTS細胞より優勢となった。更に、本発明者は、CDM/FAXY中で培養した、原腸陥入後 (E6.5) 129 × B6 F1胚から切り出した胚体外外胚葉 (ExE)から、TS細胞株を誘導することができた（図4、表1）。 [result]
(TS cell establishment and self-replication under chemically defined conditions)
In order to observe the placental vesicle response to activation of major signaling pathways (eg, BMP, activin, TGFβ, FGF, WNT, etc.), we first started with BMP4, BMP7, LDN-193189, Dorsomorphin, activin Chemically defined to contain various combinations of A, TGFβs1, GDF3, SB431542, A-83-01, LIF, FGF2, FGF4, PD0325901, PD184352, PD173074, SU5402, WNT3, CHIR99021, XAV939, GF109203X, and Y27632. Mouse blastocysts were cultured in the same medium (CDM). As a result, it was shown that the combination of FGF2, activin A, XAV939, and Y27632 in CDM causes rapid TE growth from E3.5 placental cysts. For this purpose, the present inventors used CD1 × B6 F 1 GOF18 blastocyst (FIG. 1) (Yoshimizu et al., 1999) with Oct3 / 4-EGFP reporter inside as LIF, PD0325901 (MEK inhibitor). ), And CDM containing CHIR99021 (GSK3 inhibitor) (CDM / L2i, ES cell culture conditions), or CDM containing FAXY (12.5 ng / ml F GF2, 20 ng / ml a ctivin A, 10 nM X AV939 , 5 μM Y 27632) (CDM / FAXY, TS cell culture conditions). After 5 days, the inner cell mass (ICM) grown in CDM / L2i yielded Oct3 / 4-EGFP positive outgrowth (FIG. 2, left). In contrast, the outer layer of blastocysts grown in CDM / FAXY (extratrophoblastic germ, TE) formed Oct3 / 4-EGFP negative growths (Figure 2, right). These primary TE explants could be expanded by single cell dispersion following the protocol used for passage of mouse ES cells. Passaged cells first formed compact, domed colonies, and then gradually changed in shape to become the characteristic morphology of TS cells (Fig. 3). Next, the present inventors collected mulberry embryos and blastocysts (CD1 × B6 F 1 , CD1 × CD1, or 129 × B6 F 1 ) and collected various FGF2, FGF4, activin A, XAV939, and Y27632 Incubated in CDM containing combinations. In all genetic backgrounds, the TS cell line could only be efficiently induced in CDM containing FAXY (Table 1). Often, non-TS cells like epiblast stem cells (EpiSC) (Brons et al., 2007; Tesar et al., 2007) appeared in early passages of explants (Table 1). These cells initially coexisted with TS cells, but proliferated faster than TS cells and eventually became dominant over TS cells. Furthermore, the present inventors have cultured in CDM / FAXY, after gastrulation (E6.5) 129 × B6 F 1 extraembryonic ectoderm cut from embryos (ExE), to induce TS cell lines (Fig. 4, Table 1).

（TS細胞の分子的特性）
22継代後のTS細胞の免疫蛍光染色の結果、ほとんどすべての細胞において、栄養膜幹細胞マーカーであるcaudal-type homeobox protein 2 (Cdx2)の核局在が認められた（図5）。TS細胞とES細胞の増殖速度を比較するため、本発明者らは、各継代時（即ち、2日間隔）に2 × 105個の細胞をまいた。ES細胞の増殖速度（およそ8．9時間）は、TS細胞のそれ（およそ、9．2時間）よりも速かった（図6）。TS細胞は、少なくとも30継代まで維持することができた。 (Molecular characteristics of TS cells)
As a result of immunofluorescent staining of TS cells after 22 passages, nuclear localization of caudal-type homeobox protein 2 (Cdx2), a trophoblast stem cell marker, was observed in almost all cells (FIG. 5). In order to compare the growth rate of TS cells and ES cells, we seeded 2 × 10 5 cells at each passage (ie, every 2 days). The proliferation rate of ES cells (approximately 8.9 hours) was faster than that of TS cells (approximately 9.2 hours) (FIG. 6). TS cells could be maintained for at least 30 passages.

分子状態を解析するため、本発明者は、定量的PCR（qPCR）により、TS細胞及びES細胞における遺伝子発現の特徴づけ及び比較を行った。TS細胞は、Nanog、Cripro、Klf2、Oct3/4、及びKlf4を含むES細胞特異的マーカー遺伝子をほとんど発現していなかった（図7）。反対に、それらの細胞は、eomesodermin (Eomes)、E74-like factor 5 (Elf5)、及びCdx2を含むTS細胞マーカー遺伝子を高いレベルで発現していた。これらの遺伝子はES細胞においてはほとんど発現されていなかった（図7）。ES細胞と比較して、TS細胞は、estrogen-related receptor beta (Esrrb)及びtranscription factor activating enhancer-binding protein 2 gamma (Tcfap2c)を高いレベルで発現し、Kruppel-like factor 5 (Klf5)、retinoic acid-regulated zinc-finger gene (Rex1) (Rogers et al.、1991)、E-cadherin (Cdh1)、SRY-related HMG-box 2 (Sox2)、及びT-box transcription factor 3 (Tbx3)を同等のレベルで発現していた（図7）。E3.5 胚盤胞由来TS細胞及びE6.5 ExE由来TS細胞は、これらの遺伝子について極めて類似した発現パターンを示した（図7）。TS細胞及びES細胞の両方とも、外胚葉マーカー(Nestin、Sox1、Ncam)、中胚葉マーカー(Hoxa1、Hoxb1、Flk1、T)、及び内胚葉マーカー(Gata4、Gata6、Afp、Foxa2)をほとんど発現していなかった（図8）。   In order to analyze the molecular state, the present inventors have characterized and compared gene expression in TS cells and ES cells by quantitative PCR (qPCR). TS cells hardly expressed ES cell-specific marker genes including Nanog, Cripro, Klf2, Oct3 / 4, and Klf4 (FIG. 7). In contrast, these cells expressed high levels of TS cell marker genes including eomesodermin (Eomes), E74-like factor 5 (Elf5), and Cdx2. These genes were hardly expressed in ES cells (FIG. 7). Compared with ES cells, TS cells express higher levels of estrogen-related receptor beta (Esrrb) and transcription factor activating enhancer-binding protein 2 gamma (Tcfap2c), and Kruppel-like factor 5 (Klf5), retinoic acid -Regulated zinc-finger gene (Rex1) (Rogers et al., 1991), E-cadherin (Cdh1), SRY-related HMG-box 2 (Sox2), and T-box transcription factor 3 (Tbx3) (Fig. 7). E3.5 blastocyst-derived TS cells and E6.5 ExE-derived TS cells showed very similar expression patterns for these genes (FIG. 7). Both TS and ES cells express most ectoderm markers (Nestin, Sox1, Ncam), mesoderm markers (Hoxa1, Hoxb1, Flk1, T), and endoderm markers (Gata4, Gata6, Afp, Foxa2). (Figure 8).

（FGF2、アクチビンA、及びXAV939の必要性）
TS細胞を未分化状態で維持するためのFGF2の最適濃度を調べるため、本発明者は、E3.5 胚盤胞由来TS細胞(129 × B6 F1 バックグラウンド)を、12.5、25、又は50 ng/ml FGF2を含有するCDM/FAXY中で培養した。FGF2の濃度はTS細胞マーカー遺伝子 (Cdx2、Eomes、Sox2、Esrrb、Klf5、Elf5、及びTcfap2c)の発現レベルに影響を与えなかったが、FGF2は、分化した栄養膜系列マーカー（栄養膜巨細胞 (placental lactogen 1 [PL-1]、及びHomo sapiens heart and neural crest derivatives expressed 1 [Hand1])、海綿状栄養膜細胞 (mammalian achaete-scute homologous protein 2 [Mash2] 及びtorophoblast specific protein alpha [Tpbp/4311])、及びラビリンス栄養膜(extraembryonic spermatogenesis homeobox 1 [Esx1]、glial cells missing homolog 1 [Gcm1]、及びdistal-less homeobox 3 [Dlx3])）の発現を用量依存的に抑制した（図9）。 (Necessity of FGF2, Activin A, and XAV939)
In order to determine the optimal concentration of FGF2 for maintaining TS cells in an undifferentiated state, the present inventors used E3.5 blastocyst-derived TS cells (129 × B6 F 1 background) at 12.5, 25, or 50. Cultured in CDM / FAXY containing ng / ml FGF2. The concentration of FGF2 did not affect the expression level of the TS cell marker genes (Cdx2, Eomes, Sox2, Esrrb, Klf5, Elf5, and Tcfap2c), but FGF2 is a differentiated trophoblast marker (trophoblast giant cell ( placental lactogen 1 [PL-1] and Homo sapiens heart and neural crest derivatives expressed 1 [Hand1]), spongy trophoblast cells (mammalian achaete-scute homologous protein 2 [Mash2] and torophoblast specific protein alpha [Tpbp / 4311] ) And labyrinth trophoblastic membrane (extraembryonic spermatogenesis homeobox 1 [Esx1], glial cells missing homolog 1 [Gcm1], and distal-less homeobox 3 [Dlx3])) were suppressed in a dose-dependent manner (FIG. 9).

本発明者は、次にTS細胞及びES細胞におけるFGFリガンド類の発現レベルを比較した。脊椎動物においてはFGFファミリーは少なくとも23のメンバーからなる(Itoh and Ornitz、2008)。FGF4のみが、ES細胞において高いレベルで発現していた（図10）。本発明者は、また、TS細胞及びES細胞におけるFGF受容体遺伝子の発現レベルを解析した。TS細胞は、Fgfr1及びFgfr2を高いレベルで発現していた。これらは、二倍体栄養膜において強く発現している(Haffner-Krausz et al.、1999)。TS細胞は、Fgfr3を低いレベルで発現していた（図11）。ES細胞はFgfr1のみを高いレベルで発現していた。   The inventor next compared the expression levels of FGF ligands in TS cells and ES cells. In vertebrates, the FGF family consists of at least 23 members (Itoh and Ornitz, 2008). Only FGF4 was expressed at high levels in ES cells (FIG. 10). The inventor also analyzed the expression level of the FGF receptor gene in TS cells and ES cells. TS cells expressed Fgfr1 and Fgfr2 at high levels. These are strongly expressed in diploid trophoblasts (Haffner-Krausz et al., 1999). TS cells expressed Fgfr3 at low levels (FIG. 11). ES cells expressed only Fgfr1 at a high level.

どの因子が、TS細胞の密な幹細胞様コロニー形態の維持に必要であるかを定義するため、本発明者は、FGF2、アクチビンA、またはXAV939を除いた時のTS細胞における形態変化を観察した。これらの試験の前の5回の継代については、TS細胞の未分化状態をCDM-FAXY (50 ng/ml FGF2)中で維持した。FGF2又はアクチビンAの除去により、劇的に増殖速度が減少し、主に平らな上皮細胞への分化が誘導された（図12）。XAV939の除去により、コロニーの端に分化した細胞の一貫した出現が生じた（図12）。   In order to define which factors are necessary to maintain the dense stem cell-like colony morphology of TS cells, we observed morphological changes in TS cells when FGF2, activin A, or XAV939 were excluded. . For 5 passages prior to these studies, the undifferentiated state of TS cells was maintained in CDM-FAXY (50 ng / ml FGF2). Removal of FGF2 or activin A dramatically reduced the growth rate and induced differentiation into mainly flat epithelial cells (FIG. 12). Removal of XAV939 resulted in a consistent appearance of differentiated cells at the end of the colony (FIG. 12).

次に、本発明者は、TS細胞及びその分化した子孫の特徴づけをqPCRにより行った。特に、本発明者は、各種マーカー（栄養膜幹細胞 (Cdx2、Eomes、Sox2、Esrrb、Elf5、Tcfap2c)、栄養膜巨細胞(PL-1、Hand1)、海綿状栄養膜細胞 (Mash2、Tpbp/-4311)、及びラビリンス栄養膜 (Esx1、Gcm1、Dlx3)）の発現を解析した。FGF2又はアクチビンAの除去により、Tcfap2cを除くTS細胞マーカー遺伝子の発現の急速な下方制御（図13、14）、及びラビリンス栄養膜マーカーであるGcm1を除く、全ての栄養膜細胞系列マーカーの急速な上方制御が生じた（図14、17）。XAV939の不在により、Cdx2及びTcfap2cの発現レベルにほとんど影響はなかったが、4日後において、この化合物の除去により、Eomes、Sox2、Esrrb、及びElf5の発現の抑制（図15）；Mash2、Dlx3、及びGcm1の上方制御（図16）；及びPL-1及びTpbp/4311の下方制御（図18）が生じた。   Next, the inventor performed characterization of TS cells and their differentiated progeny by qPCR. In particular, the present inventors have identified various markers (trophoblast stem cells (Cdx2, Eomes, Sox2, Esrrb, Elf5, Tcfap2c), trophoblast giant cells (PL-1, Hand1), spongy trophoblast cells (Mash2, Tpbp /- 4311) and labyrinth trophoblasts (Esx1, Gcm1, Dlx3)) were analyzed. Rapid down-regulation of TS cell marker gene expression excluding Tcfap2c (Figs. 13 and 14) by removal of FGF2 or activin A, and rapid growth of all trophoblast cell lineage markers except Gcm1, a labyrinth trophoblast marker Up-regulation occurred (Figures 14 and 17). The absence of XAV939 had little effect on the expression levels of Cdx2 and Tcfap2c, but after 4 days, removal of this compound suppressed the expression of Eomes, Sox2, Esrrb, and Elf5 (FIG. 15); Mash2, Dlx3, And up-regulation of Gcm1 (FIG. 16); and down-regulation of PL-1 and Tpbp / 4311 (FIG. 18).

（Y27632の必要性）
Y27632の必要性について検証するため、Y27632のみを培養から除き、その影響を調べた。Y27632の除去から24時間後において、FGF2、アクチビンA、又はXAV939を除いた時とは対照的に、約60％の細胞がポリカスパーゼ陽性アポトーシス細胞であり、非常に少数の細胞が生存していた（図19、20）。また、本発明者は、Y27632除去後においてもTS細胞の生存を維持できる細胞外マトリクスを検索した。本発明者は、TS細胞がY27632不在下で、マトリゲルコートしたディッシュ上で、少なくとも20継代維持できることを見出した。これらの細胞は、コンパクトでドーム形状をしたコロニー形態を呈した（図21）。 (Necessity of Y27632)
In order to verify the necessity of Y27632, only Y27632 was removed from the culture and the effect was examined. 24 hours after the removal of Y27632, in contrast to when FGF2, activin A, or XAV939 was omitted, approximately 60% of the cells were polycaspase positive apoptotic cells and very few cells were alive (Figures 19 and 20). In addition, the present inventors searched for an extracellular matrix that can maintain the survival of TS cells even after Y27632 removal. The inventors have found that TS cells can be maintained for at least 20 passages on Matrigel-coated dishes in the absence of Y27632. These cells exhibited a compact, dome-shaped colony morphology (FIG. 21).

（キメラマウスにおける胎盤へ寄与する能力）
TS細胞が胎盤へ寄与する能力を解析するため、これらの細胞をC57BL/6 胚盤胞胚(n=100)へ注入した。ドナーTS細胞の可視化のため、注入した細胞は、最初に、レンチウイルス感染によりCAG-EGFPにより標識された(Okada et al.、2007)。ドナーTS細胞は、E14.5のみにおいて、胎盤の胎仔部位へ寄与した(6/69、8.7%)(図22)。TS細胞は全ての栄養膜サブタイプ（栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜細胞、及びラビリンス栄養膜）へ分化した（図23）。母体の脱落膜又は胚体外中胚葉絨毛膜中には、TE由来細胞はなかった。 (Ability to contribute to placenta in chimeric mice)
To analyze the ability of TS cells to contribute to the placenta, these cells were injected into C57BL / 6 blastocyst embryos (n = 100). For visualization of donor TS cells, the injected cells were first labeled with CAG-EGFP by lentiviral infection (Okada et al., 2007). Donor TS cells contributed to the placenta fetal site only in E14.5 (6/69, 8.7%) (FIG. 22). TS cells differentiated into all trophoblast subtypes (trophoblast giant cells, spongy trophoblast cells, and labyrinth trophoblasts) (FIG. 23). There were no TE-derived cells in the maternal decidua or extraembryonic mesoderm chorion.

過去の検討では、従来のTS細胞は、初代マウス胚性線維芽細胞（MEF）のフィーダー層上で、FGF4、ヘパリン、血清、及び馴化培地の存在下で樹立され維持されてきた。この方法は、固い上皮様形態のコロニーの継代を可能にする。この系においては、FGF4、ヘパリン、又はMEFの除去によって、増殖の急速な低下、及びその後の巨細胞様形質を有する細胞への分化を生じる(Tanaka、1998)。この細胞株の継続的な維持のためには、線維芽細胞馴化培地をも要する(Tanaka、1998)。最適条件下でさえ、継代後のコロニーの端にいくつかの巨細胞が常に現れることから、小さいパーセントの細胞が分化していることが示唆される(Tanaka、1998)。一方、新たなTS細胞は、FGF4不在化で、FGF2、アクチビンA、Wntシグナル阻害剤、及びROCK阻害剤を含有する培地中で樹立し、維持することができる。この条件は、典型的なTS細胞様上皮様形態及び幹細胞性を有するコロニーの継代を可能にした。50 ng/ml FGF4、20 ng/ml アクチビンA、10 nM XAV939、及び5 μM Y27632を含有するCDMは、TS細胞株を生じさせることはできなかった（表1）。   In past studies, conventional TS cells have been established and maintained in the presence of FGF4, heparin, serum, and conditioned medium on the primary mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder layer. This method allows the passage of solid epithelial-like morphology colonies. In this system, removal of FGF4, heparin, or MEF results in a rapid decrease in proliferation and subsequent differentiation into cells with giant cell-like traits (Tanaka, 1998). For continuous maintenance of this cell line, fibroblast conditioned medium is also required (Tanaka, 1998). Even under optimal conditions, several giant cells always appear at the edge of colonies after passage, suggesting that a small percentage of cells are differentiated (Tanaka, 1998). On the other hand, new TS cells can be established and maintained in a medium containing FGF2, activin A, Wnt signal inhibitor, and ROCK inhibitor in the absence of FGF4. This condition allowed passage of colonies with typical TS cell-like epithelial-like morphology and stem cell nature. CDM containing 50 ng / ml FGF4, 20 ng / ml activin A, 10 nM XAV939, and 5 μM Y27632 failed to give rise to TS cell lines (Table 1).

従来のTS細胞培養条件（即ち、未定義の血清因子及びフィーダー細胞を含有する）からFGF4を除くと、その後、巨細胞様形質を有する細胞への分化が生じる(Tanaka、1998)。対照的に、CDM/FAXYからFGF2又はアクチビンAを除くと、増殖が急速に減少し、その後、全ての栄養膜細胞系列の細胞（栄養膜巨細胞、海綿状栄養膜細胞、及びラビリンス栄養膜）への分化を生じた(図12、13、14、16、17)。この偏りのない分化能力は、新たなTS細胞がインビトロにおいて実質的に未分化状態を維持していることを示唆する。XAV939の除去により、ゆっくりとした分化、いくつかのTS細胞マーカー遺伝子の下方制御、及び分化した栄養膜系列マーカー遺伝子の発現レベルの変化が生じた(図12、15、18)。これらの結果は、Wntシグナル阻害剤がTS細胞の未分化状態を安定的に維持するために必要であり、この化合物がFGF2及びアクチビンAとは異なる伝達経路を介して作用することを示す。TS細胞生存へのY27632の要求性は、マトリゲルでコートしたディッシュ上で細胞を培養することで回避することができたが、結果として得られた細胞は、典型的なTS細胞のコロニーとは異なるコロニー形態を有していた（図21）。   Removal of FGF4 from conventional TS cell culture conditions (ie, containing undefined serum factors and feeder cells) then causes differentiation into cells with giant cell-like traits (Tanaka, 1998). In contrast, when FGF2 or activin A is removed from CDM / FAXY, proliferation rapidly decreases and then all trophoblast cell lineage cells (trophoblast giant cells, spongy trophoblast cells, and labyrinth trophoblasts) Differentiation occurred (FIGS. 12, 13, 14, 16, 17). This unbiased differentiation potential suggests that new TS cells remain substantially undifferentiated in vitro. Removal of XAV939 resulted in slow differentiation, downregulation of several TS cell marker genes, and changes in the expression levels of differentiated trophoblast lineage marker genes (FIGS. 12, 15, 18). These results indicate that the Wnt signal inhibitor is necessary for stably maintaining the undifferentiated state of TS cells, and that this compound acts via a transmission pathway different from that of FGF2 and activin A. The requirement of Y27632 for TS cell survival could be circumvented by culturing cells on a matrigel-coated dish, but the resulting cells differ from typical TS cell colonies It had a colony morphology (Figure 21).

いくつかのシグナル経路の干渉（Fgfrの阻害、Mek及び／又はMapkによるFgfシグナルの抑制；I型受容体、Alk4、Alk5、及びAlk7の阻害によるTgf-β/アクチビンシグナルの阻害；及びGsk3の阻害によるWntシグナルの活性化）によりES細胞の多能性が促進される(Ying et al.、2008; Li et al.、2009; Nichols et al.、2009)。対照的に、本発明者の結果は、FGF2によるFgfシグナルの活性化、アクチビンAによるアクチビンシグナルの活性化、及びXAV939によるWntシグナルの抑制によって、化学的に定義された条件中でTS細胞の誘導及び維持を可能とすることを示した。従って、ES細胞とTS細胞は、ICM及びTEの初期胚特性をそれぞれ反映するが、異なるシグナル条件下で誘導及び維持される。   Interference of several signaling pathways (inhibition of Fgfr, inhibition of Fgf signal by Mek and / or Mapk; inhibition of Tgf-β / activin signal by inhibition of type I receptors, Alk4, Alk5 and Alk7; and inhibition of Gsk3 (Activation of Wnt signal by) promotes ES cell pluripotency (Ying et al., 2008; Li et al., 2009; Nichols et al., 2009) In contrast, our results show that FGF2 activates the Fgf signal, activin A activates the activin signal, and XAV939 suppresses the Wnt signal in chemically defined conditions. And showed that maintenance is possible. Thus, ES and TS cells reflect the early embryonic characteristics of ICM and TE, respectively, but are induced and maintained under different signal conditions.

CDM/FAXYを用いて樹立されたTS細胞は、全ての栄養膜サブタイプ（栄養膜 巨細胞 (gi)、海綿状栄養膜細胞 (sp)、及びラビリンス栄養膜 (la)）へ寄与することができた（図22、23）。この偏りのない分化能力は、キメラにおけるインビボでの栄養膜系列特異的寄与とともに、TS細胞が実質的に未分化な状態を維持していることを示唆する。   TS cells established using CDM / FAXY may contribute to all trophoblast subtypes (trophoblast giant cells (gi), spongy trophoblast cells (sp), and labyrinth trophoblasts (la)) (Figs. 22 and 23). This unbiased differentiation potential, along with in vivo trophoblast lineage specific contribution in chimeras, suggests that TS cells remain substantially undifferentiated.

これらの結果は、樹立されたTS細胞が、未分化栄養膜幹細胞の全ての基準（自己複製能力、マーカー遺伝子発現、全ての栄養膜サブタイプへインビトロにおいて分化する能力、及びキメラにおいて胎盤へ寄与する能力）を満たすことを示す。TS細胞を維持するシグナル経路を定義したことは、初期栄養膜発生に鍵となる洞察を与え、TEとICMとの間の分子相互作用を明らかにし、TS及びES細胞を用いた技術の発展を加速させる。   These results show that established TS cells contribute to all criteria of undifferentiated trophoblast stem cells (self-renewal ability, marker gene expression, ability to differentiate in vitro to all trophoblast subtypes, and placenta in chimeras Ability). Defining the signaling pathway that sustains TS cells provides key insights into early trophoblast development, reveals molecular interactions between TE and ICM, and advances the development of technology using TS and ES cells. Accelerate.

［参考例２］
TS細胞の維持培養を、以下の２条件で行い、その形態を比較した。
１．20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を作製し、20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を70%濃度に希釈し、FGF4（50 ng/ml）及びヘパリン（10 ng/ml）を添加した、従来の培地（Manipulating mouse embryo third edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003, 8th chapter, protocol 8-9）。
２．20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を作製し、20%ウシ胎仔血清を含むRPMI1640培地でMEF条件培地を70%濃度に希釈し、FGF2（50ng/ml）、ヘパリン（10 ng/ml）、アクチビンA（20 ng/ml）、XAV939（20 μM）を添加した培地。 [Reference Example 2]
Maintenance culture of TS cells was performed under the following two conditions, and their forms were compared.
1. Prepare MEF conditioned medium in RPMI1640 medium containing 20% fetal calf serum, dilute MEF conditioned medium to 70% concentration in RPMI1640 medium containing 20% fetal calf serum, and add FGF4 (50 ng / ml) and heparin ( 10 ng / ml) conventional medium (Manipulating mouse embryo third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003, 8th chapter, protocol 8-9).
2. Prepare MEF conditioned medium with RPMI1640 medium containing 20% fetal calf serum, dilute MEF conditioned medium to 70% concentration with RPMI1640 medium containing 20% fetal calf serum, FGF2 (50 ng / ml), heparin (10 ng / ml), activin A (20 ng / ml), medium supplemented with XAV939 (20 μM).

結果を図24に示す。FGF2、ヘパリン、アクチビンA、XAV939を添加した条件（図24、左）においては、未分化なTS細胞の特徴である、滑らかな辺縁を持つコロニーが多く形成され、巨細胞等の分化した細胞の出現が抑制された。この結果から、これらの因子の添加は、血清を含むMEF条件培地中においてもTS細胞の未分化性を維持し、培養することに有効であることが示された。   The results are shown in FIG. Under the conditions where FGF2, heparin, activin A, and XAV939 were added (Fig. 24, left), many colonies with smooth edges, which are characteristic of undifferentiated TS cells, were formed, and differentiated cells such as giant cells The appearance of was suppressed. From these results, it was shown that the addition of these factors is effective for maintaining and culturing the undifferentiated state of TS cells even in a MEF conditioned medium containing serum.

［実施例１］
参考例１においてTS細胞の誘導及び維持に用いた培地（CDM/FAXY）に、ヘパリン（10 ng/ml）を添加した。このヘパリン含有CDM/FAXY培地にマトリゲルを2%の濃度で溶解し、室温で保温することにより、マトリゲルをゲル化させた。次に、遠心及びフィルター濾過を行うことによって、形成されたゲルを除去し、マトリゲルの水溶性成分を含むCDM/FAXY培地を得た。参考例１において樹立及び維持したTS細胞を、トリプシンなどの処理を行うことにより単一細胞あるいは数個（２〜５個）の細胞からなる塊に解離させ、この培地中に2 x 105 個/mlの濃度で分散し、接着細胞培養用の処理を行っていないpetri dishに播種することにより、浮遊培養を行った。TS細胞は***し、***した細胞同士が接着したまま、分離せずに***を繰り返すことにより、TS細胞の凝集塊を形成した。 [Example 1]
Heparin (10 ng / ml) was added to the medium (CDM / FAXY) used for induction and maintenance of TS cells in Reference Example 1. Matrigel was dissolved in this heparin-containing CDM / FAXY medium at a concentration of 2%, and kept at room temperature to gel the matrigel. Next, the formed gel was removed by performing centrifugation and filter filtration to obtain a CDM / FAXY medium containing a water-soluble component of Matrigel. The TS cells established and maintained in Reference Example 1 are dissociated into single cells or a mass composed of several (2 to 5) cells by treatment with trypsin or the like, and 2 × 10 5 cells in this medium. Suspension culture was performed by dispersing at a concentration of / ml and seeding in a petri dish that had not been treated for adherent cell culture. TS cells were divided, and the divided cells repeatedly adhered to each other without being separated to form aggregates of TS cells.

培養開始1日後には、TS細胞の凝集塊内部に、空スペースが認められるようになり、3日後には、単層の上皮からなる立体的な栄養外胚葉様の球構造が形成された（図25）。培地へのマトリゲル添加後の遠心および濾過によるゲルの除去は必須ではなかったが、本操作を省略した場合は、培地中に浮遊する浮遊物によって栄養外胚葉様の立体構造の形成が阻害され、効率が低くなった。   One day after the start of culture, an empty space was observed inside the aggregate of TS cells, and three days later, a three-dimensional trophectoderm-like sphere structure consisting of a single layer of epithelium was formed ( Figure 25). The removal of the gel by centrifugation and filtration after the addition of Matrigel to the medium was not essential, but when this operation was omitted, the formation of trophic ectoderm-like three-dimensional structure was inhibited by the suspended matter floating in the medium, Efficiency became low.

形成されたTS細胞からなる栄養外胚葉様構造体は未分化な栄養膜系列細胞のマーカーであるCdx2を高発現していた（図26）。   The formed trophectoderm-like structure composed of TS cells highly expressed Cdx2, which is a marker of undifferentiated trophoblast lineage cells (FIG. 26).

栄養外胚葉様構造体は胚盤胞に近似した大きさを有していた。また、この構造体は、胚盤胞の様な内腔を有しており、胚盤胞注入法と同様の方法によってES細胞を内腔中へ注入することができた（図27）。   The trophectoderm-like structure had a size approximating that of a blastocyst. In addition, this structure had a blastocyst-like lumen, and ES cells could be injected into the lumen by a method similar to the blastocyst injection method (FIG. 27).

ES細胞を注入した栄養外胚葉様構造体は、胚盤胞と同様の方法によって偽妊娠マウス子宮に移植を行うことにより、高効率で着床した。着床後、胚盤胞移植時に酷似した外見上正常な脱落膜が形成された（図28）。   The trophectoderm-like structures injected with ES cells were implanted with high efficiency by transplantation into pseudopregnant mouse uterus by the same method as blastocysts. After implantation, an apparently normal decidua was formed that closely resembled blastocyst transplantation (FIG. 28).

以上の結果から、TS細胞から初期胚の栄養膜外胚葉様の機能的な立体組織がインビトロにおいて形成されたことが確認された。   From the above results, it was confirmed that a functional three-dimensional tissue like an trophoblastic ectoderm-like embryo of the early embryo was formed in vitro from TS cells.

本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。   While the invention has been described with emphasis on preferred embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that the preferred embodiments can be modified. The present invention contemplates that the present invention may be practiced otherwise than as specifically described herein. Accordingly, this invention includes all modifications encompassed within the spirit and scope of the appended claims.

ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。   The contents of all publications, including the patents and patent application specifications mentioned herein, are hereby incorporated by reference herein to the same extent as if all were expressly cited. .

参考文献
Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K. and Lonai, P. (1998) 'Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development', Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5082-5087.
Brons, I. G. M., Smithers, L. E., Trotter, M. W. B., Rugg-Gunn, P., Sun, B., Chuva de Sousa Lopes, S. M., Howlett, S. K., Clarkson, A., Ahrlund-Richter, L., Pedersen, R. A. et al. (2007) 'Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos', nature 448(7150): 191-195.
Evans, M. J. and Kaufman, M. H. (1981) 'Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos', nature 292: 154-156.
Feldman, B., Poueymirou, W., Papaioannou, V. E., DeChiara, T. M. and Goldfarb, M. (1995) 'Requirement of FGF-4 for Postimplantation Mouse Development', Science 267: 246-249.
Haffner-Krausz, R., Gorivodsky, M., Chen, Y. and Lonai, P. (1999) 'Expression of Fgfr2 in the early mouse embryo indicates its involvement in preimplantation development', Mechanisms of Development 85: 167-172.
Huang, S. M., Mishina, Y. M., Liu, S., Cheung, A., Stegmeier, F., Michaud, G. A., Charlat, O., Wiellette, E., Zhang, Y., Wiessner, S. et al. (2009) 'Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling', nature461(7264): 614-20.
Itoh, N. and Ornitz, D. M. (2008) 'Functional evolutionary history of the mouse Fgf gene family', Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 237(1): 18-27.
Li, W., Wei, W., Zhu, S., Zhu, J., Shi, Y., Lin, T., Hao, E., Hayek, A., Deng, H. and Ding, S. (2009) 'Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors', Cell stem cell 4(1): 16-9.
Martin, R. G. (1981) 'Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells', Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 78(12): 7634-7638.
Nagy, A., Gocza, E., Diaz, E. M., Prideaux, V. R., Ivanyi, E., Markkula, M. and Rossant, J. (1990) 'Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse', Development 110: 815-821.
Nichols, J., Silva, J., Roode, M. and Smith, A. (2009) 'Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo', Development 136(19): 3215-22.
Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. and Niwa, H. (2004) 'A novel mechanism for regulating clonal propagation of mouse ES cells', Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms 9(5): 471-7.
Okada, Y., Ueshin, Y., Isotani, A., Saito-Fujita, T., Nakashima, H., Kimura, K., Mizoguchi, A., Oh-Hora, M., Mori, Y., Ogata, M. et al. (2007) 'Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer', Nature biotechnology 25(2): 233-7.
Rappolee, D. A., Basilico, C., Patel, Y. and Werb, Z. (1994) 'Expression and function of FGF-4 in peri-implantation development in mouse embryos', Development 120: 2259.
Rogers, B. M., Hosler, A. B. and Gudas, J. L. (1991) 'Specific expression of a retinoic acid-regulated, zinc-finger gene, Rex-1, in preimplantation embryos, trophoblast and spermatocytes', Development 113: 815-824.
Rossant, R. and Cross, J. C. (2001) 'Placental development: Lessons from mouse mutants', Nature reviews Genetics 2: 538-548.
Smith, A. G., Heath, J. K., Donaldson, D. D., Wong, G. G., Moreau, J., Stahl, M. and Rogers, D. (1988) 'Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides', nature 336: 688-690.
Sumi, T., Oki, S., Kitajima, K. and Meno, C. (2013) 'Epiblast Ground State Is Controlled by Canonical Wnt/β-Catenin Signaling in the Postimplantation Mouse Embryo and Epiblast Stem Cells', PLoS ONE 8(5): e63378.
Tanaka, S. (1998) 'Promotion of Trophoblast Stem Cell Proliferation by FGF4', Science 282(5396): 2072-2075.
Tesar, P. J., Chenoweth, J. G., Brook, F. A., Davies, T. J., Evans, E. P., Mack, D. L., Gardner, R. L. and McKay, R. D. G. (2007) 'New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells', nature448(7150): 196-199.
Uehata, M., Ishizaki, T., Satoh, H., Ono, T., Kawahara, T., Morishita, T., Tamakawa, H., Yamagami, K., Inui, J., Maekawa, M. et al. (1997) 'Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension', nature 389: 990-994.
Wilder, P. J., Kelly, D., Brigman, K., Peterson, C. L., Nowling, T., Gao, Q.-S., McComb, R. D., Capecchi, M. R. and Rizzino, A. (1997) 'Inactivation of the FGF-4 Gene in Embryonic Stem Cells Alters the Growth and/or the Survival of Their Early Differentiated Progeny', Developmental Biology 192: 614-629.
Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A. and Gough, N. M. (1988) 'Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells', nature 336: 684-687.
Xu, X., Weinstein, M., Li, C., Naski, M., Cohen, R. I., Ornitz, D. M., Leder, P. and Deng, C. (1998) 'Fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2)-mediated reciprocal regulation loop between FGF8 and FGF10 is essential for limb induction', Development 125: 753-765.
Ying, Q.-L., Nichols, J., Chambers, I. and Smith, A. (2003) 'BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentiation and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in Collaboration with STAT3', Cell 115: 281-292.
Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P. and Smith, A. (2008) 'The ground state of embryonic stem cell self-renewal', nature 453(7194): 519-23.
Yoshimizu, T., Sugiyama, N., Felice, M. D., Yeom, Y. I., Ohbo, K., Masuko, K., Obinata, M., Abe, K., Scholer, H. R. and Matsui, Y. (1999) 'Germline-specific expression of the Oct-4/green fluorescent protein (GFP) transgene in mice', Development Growth & Differentiation41: 675-684. References
Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, JK and Lonai, P. (1998) 'Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development ', Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5082-5087.
Brons, IGM, Smithers, LE, Trotter, MWB, Rugg-Gunn, P., Sun, B., Chuva de Sousa Lopes, SM, Howlett, SK, Clarkson, A., Ahrlund-Richter, L., Pedersen, RA et al. (2007) 'Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos', nature 448 (7150): 191-195.
Evans, MJ and Kaufman, MH (1981) 'Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos', nature 292: 154-156.
Feldman, B., Poueymirou, W., Papaioannou, VE, DeChiara, TM and Goldfarb, M. (1995) 'Requirement of FGF-4 for Postimplantation Mouse Development', Science 267: 246-249.
Haffner-Krausz, R., Gorivodsky, M., Chen, Y. and Lonai, P. (1999) 'Expression of Fgfr2 in the early mouse embryo indicates its involvement in preimplantation development', Mechanisms of Development 85: 167-172.
Huang, SM, Mishina, YM, Liu, S., Cheung, A., Stegmeier, F., Michaud, GA, Charlat, O., Wiellette, E., Zhang, Y., Wiessner, S. et al. 2009) 'Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signaling', nature461 (7264): 614-20.
Itoh, N. and Ornitz, DM (2008) 'Functional evolutionary history of the mouse Fgf gene family', Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists 237 (1): 18-27.
Li, W., Wei, W., Zhu, S., Zhu, J., Shi, Y., Lin, T., Hao, E., Hayek, A., Deng, H. and Ding, S. ( 2009) 'Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors', Cell stem cell 4 (1): 16-9.
Martin, RG (1981) 'Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells', Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 78 (12): 7634-7638.
Nagy, A., Gocza, E., Diaz, EM, Prideaux, VR, Ivanyi, E., Markkula, M. and Rossant, J. (1990) 'Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse' , Development 110: 815-821.
Nichols, J., Silva, J., Roode, M. and Smith, A. (2009) 'Suppression of Erk signaling promoting ground state pluripotency in the mouse embryo', Development 136 (19): 3215-22.
Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. and Niwa, H. (2004) 'A novel mechanism for regulating clonal propagation of mouse ES cells', Genes to cells: devoted to molecular & cellular mechanisms 9 (5) : 471-7.
Okada, Y., Ueshin, Y., Isotani, A., Saito-Fujita, T., Nakashima, H., Kimura, K., Mizoguchi, A., Oh-Hora, M., Mori, Y., Ogata , M. et al. (2007) 'Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer', Nature biotechnology 25 (2): 233-7.
Rappolee, DA, Basilico, C., Patel, Y. and Werb, Z. (1994) 'Expression and function of FGF-4 in peri-implantation development in mouse embryos', Development 120: 2259.
Rogers, BM, Hosler, AB and Gudas, JL (1991) 'Specific expression of a retinoic acid-regulated, zinc-finger gene, Rex-1, in preimplantation embryos, trophoblast and spermatocytes', Development 113: 815-824.
Rossant, R. and Cross, JC (2001) 'Placental development: Lessons from mouse mutants', Nature reviews Genetics 2: 538-548.
Smith, AG, Heath, JK, Donaldson, DD, Wong, GG, Moreau, J., Stahl, M. and Rogers, D. (1988) 'Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified products', nature 336: 688 -690.
Sumi, T., Oki, S., Kitajima, K. and Meno, C. (2013) 'Epiblast Ground State Is Controlled by Canonical Wnt / β-Catenin Signaling in the Postimplantation Mouse Embryo and Epiblast Stem Cells', PLoS ONE 8 (5): e63378.
Tanaka, S. (1998) 'Promotion of Trophoblast Stem Cell Proliferation by FGF4', Science 282 (5396): 2072-2075.
Tesar, PJ, Chenoweth, JG, Brook, FA, Davies, TJ, Evans, EP, Mack, DL, Gardner, RL and McKay, RDG (2007) 'New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells' , nature448 (7150): 196-199.
Uehata, M., Ishizaki, T., Satoh, H., Ono, T., Kawahara, T., Morishita, T., Tamakawa, H., Yamagami, K., Inui, J., Maekawa, M. et al. (1997) 'Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension', nature 389: 990-994.
Wilder, PJ, Kelly, D., Brigman, K., Peterson, CL, Nowling, T., Gao, Q.-S., McComb, RD, Capecchi, MR and Rizzino, A. (1997) 'Inactivation of the FGF-4 Gene in Embryonic Stem Cells Alters the Growth and / or the Survival of Their Early Differentiated Progeny ', Developmental Biology 192: 614-629.
Williams, RL, Hilton, DJ, Pease, S., Willson, TA, Stewart, CL, Gearing, DP, Wagner, EF, Metcalf, D., Nicola, NA and Gough, NM (1988) 'Myeloid leukaemia inhibitory factor retaining the developmental potential of embryonic stem cells', nature 336: 684-687.
Xu, X., Weinstein, M., Li, C., Naski, M., Cohen, RI, Ornitz, DM, Leder, P. and Deng, C. (1998) 'Fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2)- mediated reciprocal regulation loop between FGF8 and FGF10 is essential for limb induction ', Development 125: 753-765.
Ying, Q.-L., Nichols, J., Chambers, I. and Smith, A. (2003) 'BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentiation and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in Collaboration with STAT3', Cell 115: 281-292.
Ying, QL, Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P. and Smith, A. (2008) 'The ground state of embryonic stem cell self-renewal ', nature 453 (7194): 519-23.
Yoshimizu, T., Sugiyama, N., Felice, MD, Yeom, YI, Ohbo, K., Masuko, K., Obinata, M., Abe, K., Scholer, HR and Matsui, Y. (1999) ' Germline-specific expression of the Oct-4 / green fluorescent protein (GFP) transgene in mice ', Development Growth & Differentiation41: 675-684.

本発明によれば、TS細胞から、栄養膜外胚葉様の機能的な胞状構造体を製造することができる。この胞状構造体は、内腔に多能性幹細胞を注入後、偽妊娠哺乳動物の子宮内に移植すると、子宮に着床する活性を有するので、多能性幹細胞とTS細胞から初期胚を再構成することが可能となる。   According to the present invention, a trophoblast-like functional alveolar structure can be produced from TS cells. This alveolar structure has an activity of implanting pluripotent stem cells into the lumen and then transplanted into the uterus of a pseudopregnant mammal. It can be configured.

Claims (12)

哺乳動物栄養膜幹細胞を、FGF、アクチビンシグナル経路作用物質、及び基底膜調製物の非ゲル水溶性成分を含む培地中で浮遊培養することを含む、栄養膜外胚葉様胞状構造体の製造方法。   A method for producing a trophoblastic ectoderm-like vesicular structure, comprising suspension-culturing mammalian trophoblast stem cells in a medium containing FGF, an activin signal pathway agonist, and a non-gel water-soluble component of a basement membrane preparation. 培地が更にWntシグナル阻害剤を含む、請求項１記載の製造方法。   The production method according to claim 1, wherein the medium further contains a Wnt signal inhibitor. 培地が更にヘパリンを含む、請求項１又は２記載の製造方法。   The production method according to claim 1 or 2, wherein the medium further contains heparin. 培地が更にROCK阻害剤を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。   The manufacturing method of any one of Claims 1-3 in which a culture medium contains a ROCK inhibitor further. 培地が、基底膜調製物のゲル成分を含まない、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。   The manufacturing method of any one of Claims 1-4 in which a culture medium does not contain the gel component of a basement membrane preparation. 浮遊培養に供する哺乳動物栄養膜幹細胞が、単一細胞又は２〜１０個の細胞からなる細胞凝集塊に分散されている、請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。   The production method according to any one of claims 1 to 5, wherein the mammalian trophoblast stem cells to be subjected to suspension culture are dispersed in a single cell or a cell aggregate composed of 2 to 10 cells. 浮遊培養に供する哺乳動物栄養膜幹細胞が、哺乳動物栄養外胚葉又は胚体外外胚葉を、FGF2及びアクチビンシグナル経路作用物質を含む培地中で培養することにより樹立されたものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法。   Mammalian trophoblast stem cells to be subjected to suspension culture are established by culturing mammalian trophectoderm or extraembryonic ectoderm in a medium containing FGF2 and activin signal pathway agonists. 6. The production method according to any one of 6 above. 請求項１〜７のいずれか１項記載の製造方法により製造された、栄養膜外胚葉様胞状構造体。   A trophoblastic ectoderm-like follicular structure produced by the production method according to claim 1. 哺乳動物栄養膜幹細胞及び当該栄養膜幹細胞に由来する栄養膜系列細胞からなる、請求項８記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体。   The trophoblast outer germ-like vesicular structure according to claim 8, which comprises mammalian trophoblast stem cells and trophoblast lineage cells derived from the trophoblast stem cells. 哺乳動物多能性幹細胞を注入後、偽妊娠哺乳動物の子宮内に移植した際に、子宮に着床する活性を有する、請求項８又は９記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体。   10. The trophoblast epidermoid structure according to claim 8 or 9, which has an activity of implanting into a uterus when implanted into a uterus of a pseudopregnant mammal after injecting a mammalian pluripotent stem cell. 哺乳動物多能性幹細胞を、請求項８〜１０のいずれか１項記載の栄養膜外胚葉様胞状構造体内に注入することを含む、哺乳動物胚の製造方法。   A method for producing a mammalian embryo, comprising injecting a mammalian pluripotent stem cell into the trophoblast-embryonic dermatoid structure according to any one of claims 8 to 10. 注入した哺乳動物多能性幹細胞又は当該多能性可能性幹細胞に由来する細胞を含む栄養膜外胚葉様胞状構造体を哺乳動物の子宮内に移植し、当該子宮に着床させることを更に含む、請求項１１記載の製造方法。   The method further comprises transplanting the trophoblastic ectoderm-like structure containing the injected mammalian pluripotent stem cells or cells derived from the pluripotent stem cells into the uterus of the mammal and implanting the uterus. The production method according to claim 11.
JP2015102260A 2015-05-19 2015-05-19 Trophoblast ectoderm-like structure, and method for producing the same Pending JP2016214138A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015102260A JP2016214138A (en) 2015-05-19 2015-05-19 Trophoblast ectoderm-like structure, and method for producing the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015102260A JP2016214138A (en) 2015-05-19 2015-05-19 Trophoblast ectoderm-like structure, and method for producing the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2016214138A true JP2016214138A (en) 2016-12-22

Family

ID=57577499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015102260A Pending JP2016214138A (en) 2015-05-19 2015-05-19 Trophoblast ectoderm-like structure, and method for producing the same

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2016214138A (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020520630A (en) * 2018-04-26 2020-07-16 ステムメディケア・カンパニー・リミテッド Cell line constantly secreting and expressing HLA-G protein and method for producing the same
JP2021141832A (en) * 2020-03-11 2021-09-24 株式会社日立製作所 Cell culture method and cell-culturing device
WO2021193596A1 (en) * 2020-03-24 2021-09-30 学校法人自治医科大学 Temporary treatment medium, treatment kit, embryo developmental arrest inhibitor, method for inhibiting embryo developmental arrest, method for producing developmental engineering product, transfer method, therapeutic method, and developmental engineering product

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020520630A (en) * 2018-04-26 2020-07-16 ステムメディケア・カンパニー・リミテッド Cell line constantly secreting and expressing HLA-G protein and method for producing the same
JP2021141832A (en) * 2020-03-11 2021-09-24 株式会社日立製作所 Cell culture method and cell-culturing device
JP7339192B2 (en) 2020-03-11 2023-09-05 株式会社日立製作所 CELL CULTURE METHOD AND AUTOMATED CELL CULTURE DEVICE
WO2021193596A1 (en) * 2020-03-24 2021-09-30 学校法人自治医科大学 Temporary treatment medium, treatment kit, embryo developmental arrest inhibitor, method for inhibiting embryo developmental arrest, method for producing developmental engineering product, transfer method, therapeutic method, and developmental engineering product

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7088496B2 (en) Manufacturing method of retinal tissue
CN108884436B (en) Induced expanded pluripotent stem cells, methods of making and using
US9694036B2 (en) Production of midbrain dopaminergic neurons and methods for the use thereof
JP6602288B2 (en) Methods and compositions for culturing endoderm progenitor cells in suspension
KR101658876B1 (en) Treatment of pluripotent cells
AU2022275469A1 (en) Method for reproducible differentiation of clinical-grade retinal pigment epithelium cells
ES2626656T3 (en) Single pluripotent stem cell culture
JP5128946B2 (en) Feeder-independent long-term culture of embryonic stem cells
KR20180135482A (en) Method of manufacturing retinal tissue
Gandolfi et al. Why is it so difficult to derive pluripotent stem cells in domestic ungulates?
JP2012523240A (en) Methods and compositions for stem cell culture
EP2094833A2 (en) Differentiation of pluripotent cells into primary germ layer progenitors
US20130122589A1 (en) Targeted differentiation of stem cells
WO2015125926A1 (en) Method for establishing and maintaining trophoblast stem cells
JP2021521792A (en) Differentiation method of eyeball cells and their use
CA3173076A1 (en) Generation of thymic epithelial progenitor cells in vitro
JPWO2017175876A1 (en) How to re-establish stem cells
Moraveji et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 promotes efficient derivation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis
Wu et al. A chemically defined system supports two distinct types of stem cell from a single blastocyst and their self‐assembly to generate blastoid
JP2016214138A (en) Trophoblast ectoderm-like structure, and method for producing the same
Bose et al. In vitro differentiation of pluripotent stem cells into functional β islets under 2D and 3D culture conditions and in vivo preclinical validation of 3D islets
Weatherbee et al. Transgene directed induction of a stem cell-derived human embryo model
WO2018119155A1 (en) Methods of pancreatic differentiation of stem cells
US20240174985A1 (en) Method for producing ovarian somatic cell-like cells, and method for inducing differentiation of primate pluripotent stem cells into ovarian somatic cell-like cells
Cermola et al. Gastruloid development competence discriminates different states of pluripotency between naïve and primed