JP2016199579A - Pharmaceutical composition for inhibiting recurrence, aggravation, and metastasis of hepatocarcinoma - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は医薬組成物に関し、特に肝癌の再発、悪化または転移の抑制に用いる医薬組成物に関する。本発明は、さらに薬物の製造方法に関し、特に肝癌の再発、悪化または転移を抑制に用いる薬物の製造方法に関する。 The present invention relates to a pharmaceutical composition, and particularly to a pharmaceutical composition used for suppressing recurrence, worsening or metastasis of liver cancer. The present invention further relates to a method for producing a drug, and more particularly to a method for producing a drug used for suppressing recurrence, worsening or metastasis of liver cancer.
国際がんジャーナル（International Journal of Cancer）からの情報によると肝癌（Liver Cancer）の発症頻度は、全世界で悪性腫瘍の中で５番目に高く、肝癌の多くは、肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma、HCC）であり肝癌患者全体の約７０〜８５％以上を占めている。近年、主な肝癌治療法としては、手術切除（Resection）、局所焼灼療法（Local Ablation）および肝臓移植によって肝癌の治療が行われるが、１５〜２０％の患者しか適応できない。肝癌の早期発見および早期治療によって生存率は高くなるが、切除手術を受けた患者に対しても治療後に肝癌が再発してしまうことが多い。 According to information from the International Journal of Cancer, Liver Cancer is the fifth most common malignant tumor in the world, and most liver cancers are hepatocellular carcinoma, HCC) and accounts for about 70 to 85% or more of all patients with liver cancer. In recent years, liver cancer is treated by surgical resection, local ablation, and liver transplantation as the main treatment methods for liver cancer, but only 15 to 20% of patients can be applied. Early detection and early treatment of liver cancer increases survival, but liver cancer often recurs after treatment for patients who have undergone resection surgery.
外科年報（Annual of Surgery）では、手術後の１２ヶ月以内に６０％の肝癌患者に肝癌再発が認められ、手術中に敏感な検出技術により肝癌の微小転移（micro-metastasis）を検出可能であり、肝癌の微小転移を発見された患者に対しても、手術後の１年以内の再発率が３０〜４０％であることが報告されていた。また、手術後に残された肝病変によって更に再び肝癌になる可能性がある。肝癌の再発で患者の全体生存期間を大幅に減縮させることから、肝癌患者に対して手術治療後の再発予防または再発遅延が望まれている。 In the Annual of Surgery, recurrence of liver cancer was observed in 60% of patients with liver cancer within 12 months after surgery, and micro-metastasis of liver cancer could be detected by sensitive detection techniques during surgery. It has been reported that the recurrence rate within one year after surgery is 30 to 40% for patients who have been found to have micrometastasis of liver cancer. Moreover, there is a possibility that liver cancer may be caused again by liver lesions left after the operation. Since the recurrence of liver cancer significantly reduces the overall survival time of patients, prevention of recurrence or delay of recurrence after surgical treatment is desired for liver cancer patients.
従来、多くの試験では、手術後の肝癌の再発率を低減させる方法、例えば、トランス動脈化学塞栓療法（trans-arterial chemotherapy）、レチノイド（retinoids）、アジュバントインターフェロン（adjuvant interferon）、養子免疫療法（adoptive immunotherapy）および動脈内放射性リピオドール（intra-arterial radioactive lipiodol）などの有効方法を求めていた。上述の方法は、肝癌の再発リスクの低下または患者の生存率向上の潜在的能力を示しているものの、いずれの方法も臨床試験によって認証されておらず、肝癌の術後補助療法の標準的治療として行われていない状態である。そのため、新薬物または新治療法が強く求められている。 Traditionally, many trials have used methods to reduce the recurrence rate of liver cancer after surgery, such as trans-arterial chemotherapy, retinoids, adjuvant interferon, adoptive immunotherapy (adoptive There was a need for effective methods such as immunotherapy and intra-arterial radioactive lipiodol. Although the methods described above show potential for reducing the risk of liver cancer recurrence or improving patient survival, none of these methods have been approved by clinical trials and are standard treatments for postoperative adjuvant therapy for liver cancer. It is a state that is not done as. Therefore, there is a strong demand for new drugs or new treatments.
肝癌形成過程を分析すると、肝癌は、高度血管新生を示し、かつその進行が血管新生因子（angiogenic factors）に関連することが見られる。血管新生研究分野の一流の科学者であるJudah Folkmanを含む研究員は、理論および実験において血管新生抑制剤が他の療法との併用によって癌治療に更なる効果を発揮することを指摘した（ChristoｐHer Rice, L Eric Huang. From antiangiogenesis to hypoxia: current research and future directions. Cancer Management and Research. 2011:3 9-16）。また、細胞外マトリックス（extracellular matrix、ECM）の成分とするヘパラン硫酸（heparan sulfate、HS）の分解は、腫瘍の浸潤・転移の要因であることが証明された。この分解工程に関与する主要な酵素として、ヘパラナーゼ（heparanase）がある。 Analysis of the hepatocarcinogenesis process shows that hepatic cancer exhibits high angiogenesis and its progression is related to angiogenic factors. Researchers, including Judah Folkman, a leading scientist in the field of angiogenesis research, pointed out in theory and experiments that angiogenesis inhibitors can be used in combination with other therapies to further improve cancer treatment (Christop Her Rice). , L Eric Huang. From antiangiogenesis to hypoxia: current research and future directions. Cancer Management and Research. 2011: 3 9-16). Moreover, it has been proved that the degradation of heparan sulfate (HS), which is a component of the extracellular matrix (ECM), is a factor of tumor invasion and metastasis. Heparanase is a major enzyme involved in this degradation process.
ヘパラナーゼは、内因性グルクロニダーゼの一種で、細胞外マトリックス中のヘパラン硫酸側鎖を分解することが可能であり、かつ、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを分解可能な唯一の内因性グルクロニダーゼであり、特定の部位にヘパラン硫酸を分解させて腫瘍の浸潤・転移の促進を図る。ヘパラナーゼは、細胞外マトリックスの分解、血管新生増殖因子の放出および血管リモデリングなどのプロセスに関与することにより、腫瘍転移および血管新生に重要な影響を与える。また、ヘパラン硫酸は、ヘパラナーゼによって分解された後、生物活性を示す血管新生増殖因子を細胞外マトリックス中に放出し、これらの血管新生増殖因子が血管新生を促進することでさらに癌細胞の増殖、転移および癌の悪化を促進することになる。そのため、ヘパラナーゼの活性を阻害することにより、腫瘍成長と転移の抑制に効果を与える可能性があり、ヘパラナーゼが過剰に働くかどうかは、悪性腫瘍の予防または治療に対して重要な課題となる。 Heparanase is a kind of endogenous glucuronidase that can degrade heparan sulfate side chains in the extracellular matrix and is the only endogenous glucuronidase that can degrade heparan sulfate proteoglycans. Decompose sulfuric acid to promote tumor invasion and metastasis. Heparanase has an important impact on tumor metastasis and angiogenesis by participating in processes such as extracellular matrix degradation, angiogenic growth factor release and vascular remodeling. Heparan sulfate, after being degraded by heparanase, releases angiogenic growth factors that exhibit biological activity into the extracellular matrix, and these angiogenic growth factors promote angiogenesis to further proliferate cancer cells, It will promote metastasis and cancer progression. Therefore, inhibition of heparanase activity may have an effect on suppression of tumor growth and metastasis, and whether heparanase works excessively is an important issue for the prevention or treatment of malignant tumors.
過去の研究において、ヘパラナーゼは、いろんな種類の腫瘍中で過剰に働き、かつ発症や進行過程に相関していることが発見された。これによって、多くの研究報告では、この酵素の抑制を癌治療の戦略としており、例えば、小分子薬、化学的修飾された天然物、および中和抗体（neutralizing antibodies）の開発などがこれに該当する。 In past studies, heparanase was found to work excessively in various types of tumors and correlate with onset and progression. Thus, many research reports have indicated that the inhibition of this enzyme is a strategy for cancer treatment, such as the development of small molecule drugs, chemically modified natural products, and neutralizing antibodies. To do.
米国第6，143，730号特許には、硫酸化オリゴ糖の調製およびその適用が開示されており、該硫酸化オリゴ糖の一般式（I）は、R1 -（Rx）n-R2の構造であり、ここで、R1、R2および各Rxは単糖単位であり、その全てが同じまたは異なることができ、隣接する単糖単位は、１→２、１→３、１→４および/またはｌ→６グルコシド結合で連結され、かつｎは、１〜６の整数であり、該オリゴ糖は、抗血管新生、抗転移および／または抗炎症薬として機能している。上述した抗血管新生効果は、インビトロ実験および臨床試験のデータによって既に検証された。一方、抗転移効果に関しては、動物実験のデータのみを得たが、ヒト臨床試験データによって検証されていない。
以上のことにより、現在、肝癌の再発リスクの低下または肝癌患者生存率の向上に用いる方法は発見されたが、十分なヒト臨床データによって検証されていないため、安全性および有効性を有する新医薬組成物および治療法が期待されている。
US Pat. No. 6,143,730 discloses the preparation of sulfated oligosaccharides and their application, wherein the general formula (I) of the sulfated oligosaccharide has the structure of R1- (Rx) n-R2. Where R1, R2 and each Rx are monosaccharide units, all of which can be the same or different, and adjacent monosaccharide units are 1 → 2, 1 → 3, 1 → 4 and / or Linked by l → 6 glucoside bonds, and n is an integer of 1 to 6, and the oligosaccharide functions as an anti-angiogenic, anti-metastatic and / or anti-inflammatory agent. The anti-angiogenic effects described above have already been verified by data from in vitro experiments and clinical trials. On the other hand, regarding the anti-metastatic effect, only data from animal experiments was obtained, but it was not verified by human clinical trial data.
Based on the above, although a method for reducing the risk of recurrence of liver cancer or improving the survival rate of patients with liver cancer has been discovered, it has not been validated by sufficient human clinical data. Compositions and therapies are expected.
本発明の一実施形態に係る肝癌の再発、悪化または転移の抑制に用いる医薬組成物は、治療有効量を有する少なくとも一般式（I）で表される化合物、および医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアを含む。 The pharmaceutical composition used for suppressing recurrence, worsening or metastasis of liver cancer according to one embodiment of the present invention comprises at least a compound represented by the general formula (I) having a therapeutically effective amount, and a pharmaceutically acceptable diluent. Excipients or carriers.
ここで、前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｎは、０〜３の整数で、かつ、３ｎ＋６または ３ｎ＋７個のＲはＳＯ３Ｈを表し、残りのＲはＨを表す。
Here, in the compound represented by the general formula (I), n is an integer of 0 to 3, and 3n + 6 or 3n + 7 R represents SO 3 H, and the remaining R represents H.
上記の形態によれば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ＳＯ３Ｈを表す３ｎ＋７個のＲは、主成分である。
上記の形態によれば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｎは２または３で、かつ、ＳＯ３Ｈを表す３ｎ＋７個のＲは、主成分である。
According to the above embodiment, in the compound represented by the general formula (I), 3n + 7 one R representing an SO 3 H is the main component.
According to the above embodiment, in the compound represented by formula (I), n is 2 or 3, and the 3n + 7 one R representing an SO 3 H, which is the main component.
上記の形態によれば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｎは３で、かつ、ＳＯ３Ｈを表す３ｎ＋７個のＲの相対含有量は、最も高い。
上記の形態によれば、前記治療有効量は、８０〜３１５ｍｇ／日である。
上記の形態によれば、前記治療有効量は、１６０ｍｇ／日であることが好ましい。
According to the above embodiment, in the compound represented by formula (I), n is 3, and the relative content of 3n + 7 one R representing an SO 3 H is the highest.
According to the above form, the therapeutically effective amount is 80-315 mg / day.
According to the above form, the therapeutically effective amount is preferably 160 mg / day.
本発明による医薬組成物中に、有効成分とする一般式（Ｉ）で表される化合物は、ナトリウム塩の形で使用され、医薬的に許容可能な塩、例えば、カルシウム塩またはアミン塩の形で使用されてもよい。したがって、本発明による医薬組成物の有効成分は、一般式（Ｉ）で表される化合物を含むナトリウム塩または他の医薬的に許容可能な塩である。 In the pharmaceutical composition according to the present invention, the compound represented by the general formula (I) as an active ingredient is used in the form of a sodium salt, and is in the form of a pharmaceutically acceptable salt such as a calcium salt or an amine salt. May be used. Therefore, the active ingredient of the pharmaceutical composition according to the present invention is a sodium salt or other pharmaceutically acceptable salt containing the compound represented by the general formula (I).
上述した医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアは、溶媒、分散媒、充填剤、固体担体、水溶液、抗菌剤、抗真菌剤および遅延吸収剤またはこれらの類縁物質を含む。活性成分に併用しない従来の媒体または試剤以外に、本発明の医薬組成物中に、併用可能な媒体または試剤が使用される。 The pharmaceutically acceptable diluents, excipients or carriers described above include solvents, dispersion media, fillers, solid carriers, aqueous solutions, antibacterial agents, antifungal agents and delayed absorption agents or related substances. In addition to conventional media or reagents not used in combination with active ingredients, media or reagents that can be used in combination in the pharmaceutical compositions of the present invention are used.
上述した本発明による医薬組成物は、少なくとも１種類の治療法との併用で肝癌の再発、悪化または転移を抑制することが可能である。上述した治療法は、塞栓療法、標的薬物療法、化学療法、放射線療法または肝臓切除手術を含む。 The above-described pharmaceutical composition according to the present invention can suppress the recurrence, worsening or metastasis of liver cancer in combination with at least one treatment method. The above-described therapies include embolization therapy, targeted drug therapy, chemotherapy, radiation therapy or liver resection surgery.
上記の形態によれば、本発明の医薬組成物は、肝癌患者に対する術後の再発率を低減させ、または、肝癌患者に対する術後の再発までの時間を延ばす。 According to said form, the pharmaceutical composition of this invention reduces the recurrence rate after a surgery with respect to a liver cancer patient, or extends the time to the recurrence after a surgery with respect to a liver cancer patient.
本発明の他の実施形態によれば、本発明は、一般式（Ｉ）で表される組成物により、肝癌の再発、悪化または転移を抑制する薬物の調製方法を提供し、その方法は、治療有効量の一般式（Ｉ）で表される化合物を、医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアと組み合わせることを含む。 According to another embodiment of the present invention, the present invention provides a method for preparing a drug that suppresses recurrence, worsening, or metastasis of liver cancer with the composition represented by the general formula (I). It comprises combining a therapeutically effective amount of a compound of general formula (I) with a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier.
上記の形態によれば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｎは０〜３の整数で、かつ３ｎ＋６または３ｎ＋７個のＲはＳＯ３Ｈを表し、残りのＲはＨを表す。
上記の形態によれは、前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、前記ＳＯ３Ｈを表す３ｎ＋７個のＲは、主成分である。
According to the above embodiment, in the compound represented by formula (I), n is an integer of 0 to 3, and 3n + 6 or 3n + 7 one R represents SO 3 H, the remaining R represents H .
According to the above embodiment, in the compounds represented by formula (I), wherein SO 3 represents an H 3n + 7 pieces of R is the main component.
上記の形態によれば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｎは２または３で、かつ、ＳＯ３Ｈを表す３ｎ＋７個のＲは、主成分である。
上記の形態によれば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物において、ｎは３で、かつ、ＳＯ３Ｈを表す３ｎ＋７個のＲの相対含有量は、最も高い。
According to the above embodiment, in the compound represented by formula (I), n is 2 or 3, and the 3n + 7 one R representing an SO 3 H, which is the main component.
According to the above embodiment, in the compound represented by formula (I), n is 3, and the relative content of 3n + 7 one R representing an SO 3 H is the highest.
上記の形態によれば、前記医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアは、水または水を溶媒とする溶液である。
上記の形態によれば、前記医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアは、生理的食塩水またグルコースの水溶液である。
According to the above form, the pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier is water or a solution containing water as a solvent.
According to the above form, the pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier is physiological saline or an aqueous solution of glucose.
本発明の属する当業者に本発明をもっと明らかに理解させるため、以下、図面を参照しながら、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。 In order that those skilled in the art to which the present invention pertains will more clearly understand the present invention, preferred embodiments of the present invention will be described in detail below with reference to the drawings.
本発明による肝癌の再発、悪化または転移の抑制に用いる医薬組成物は、下記の実施例の説明により本発明の属する当業者にはその創作精神が明らかにし、さらにこの医薬組成物を完成できる。しかしながら、本発明の実施は、下記の実施例によってその実施形態が制限されることない。以下、本発明による医薬組成物の調製、妥当性確認およびその用途の実施形態についてそれぞれ説明する。 The pharmaceutical composition used for the suppression of recurrence, worsening or metastasis of liver cancer according to the present invention will be apparent to those skilled in the art to which the present invention belongs from the following description of the examples, and the pharmaceutical composition can be completed. However, the embodiment of the present invention is not limited by the following examples. Hereinafter, preparation of a pharmaceutical composition by this invention, validation, and embodiment of the use are each demonstrated.
＜本発明の医薬組成物の調製＞
本発明の医薬組成物の有効成分の原料としては、酵母菌Pichia holstiiから得られる。該医薬組成物の有効成分は、主に、酵母菌の培養と発酵、生成物の加水分解、精製およびスルホン化などのステップによって調製される。具体的には、NRRL Y-2448という菌株名の酵母菌Pichia holstiiを、酸素があって窒素源が限られる培地で培養し、右旋性ブドウ糖（D-glucose）を炭素源として必要以上のオルトリン酸塩（ortho-ｐhosｐhate）を供給することにより、多種類の多糖構造を含み、かつ、本発明の医薬組成物の有効成分の半合成（Semi-synthesis）の基本原料とする細胞外リン酸化マンナン（ｐhosｐhomannan，PS）が製造される。リン酸化マンナンは、分子構造が高度分岐で、かつ高分子量（約5 x 106 〜39 x 106 Dalton）のリン酸化マンナンコア（ｐhosｐhomannan core，PC）からなる。Ｐholstii的の培養、発酵方法およびリン酸化マンナンの分離は、Jeanes, A.; Pittsley, J. E.; Watson, P. R.; Dimler, R. J. Arch. Biochem. Bioｐhys. 1961, 92, 343-350及Bretthauer, R. K.; Kaczorowski, G. J.; Weise, M. J. Biochemistry 1973, 12, 1251-1256に開示されている情報を基に実現された。通常、生産率としては、４００Lの発酵規模で２０ｋｇのリン酸化マンナンの粗製物が得られる。
<Preparation of the pharmaceutical composition of the present invention>
The raw material of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is obtained from the yeast Pichia holstii. The active ingredients of the pharmaceutical composition are prepared mainly by steps such as yeast culture and fermentation, product hydrolysis, purification and sulfonation. Specifically, the yeast Pichia holstii, named NRRL Y-2448, was cultured in a medium with oxygen and a limited nitrogen source, and dextroglucose (D-glucose) was used as a carbon source to produce more ortholine than necessary. An extracellular phosphorylated mannan containing a wide variety of polysaccharide structures and serving as a basic raw material for semi-synthesis of an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention by supplying an ortho-phosphate (Phosphomannan, PS) is manufactured. Phosphorylated mannan has a highly branched molecular structure and is composed of a phosphorylated mannan core (PC) having a high molecular weight (about 5 × 10 6 to 39 × 10 6 Dalton). Pholstii-like culture, fermentation method and isolation of phosphorylated mannan are described in Jeanes, A .; Pittsley, JE; Watson, PR; Dimler, RJ Arch. Biochem. Biophys. , GJ; Weise, MJ Biochemistry 1973, 12, 1251-1256. Usually, as a production rate, a crude product of 20 kg phosphorylated mannan is obtained at a fermentation scale of 400 L.
好適な実施例において、リン酸化マンナンの加水分解反応を100℃で６〜１０時間行い、リン酸化マンナンの濃度を４０〜５０ｇ／Lに制御した。加水分解の環境としてｐH値を２．２〜２．５にし、１MのHCL溶液を触媒としてKCLの存在下で加水分解を行った。加水分解反応が開始してからの最初の１時間以内に、リン酸化マンナンを溶液と徐々混合するときに、ｐH値は３までやや高くなるので、ｐH値を２．２〜２．５に調整するように１ＭのHCL溶液を再び加える必要がある。毎回の加水分解反応によってリン酸化マンナン２．５ｋｇ（湿重量）を処理し、加水分解後の産物は、低分子量のオリゴ糖リン酸塩フラクション（oligosaccharide ｐhosｐhate fraction、OPF）を含み、加水分解産物を１ＭのNaOH溶液で中和反応させ、ｐH値を９〜９．５に調整した。 In a preferred embodiment, the phosphorylated mannan hydrolysis reaction was carried out at 100 ° C. for 6 to 10 hours, and the phosphorylated mannan concentration was controlled to 40 to 50 g / L. The hydrolysis was carried out in the presence of KCL using a 1 M HCL solution as a catalyst with a pH value of 2.2 to 2.5 as the hydrolysis environment. When the phosphorylated mannan is gradually mixed with the solution within the first hour after the start of the hydrolysis reaction, the pH value increases slightly to 3, so the pH value is adjusted to 2.2-2.5. It is necessary to add the 1M HCL solution again. Treating phosphorylated mannan 2.5 kg (wet weight) by hydrolysis reaction each time, the product after hydrolysis contains low molecular weight oligosaccharide phosphate fraction (OPF), The pH was adjusted to 9 to 9.5 by neutralizing with 1M NaOH solution.
更なる好適な実施例において、加水分解に用いる溶液は、６００ｇのKCLを６０Lの水中に溶解するように調製され、ｐH値を２．４に調整するように１ＭのHCL溶液を加え、かつ、この溶液を７５Lのステンレス反応容器中に置いた。発酵して得られたリン酸化マンナンの粗製物（湿重量２．４９kｇ）を、反応容器の添加口により溶液中に段階的に加え、かつ混合後の溶液を100℃まで加熱し、急激に撹拌する状態で７時間維持した。反応環境のｐH値を１時間ごとに１回検出し、かつ反応開始後の１時間に１MのHCLを加えてｐH値を２．３に調整した。加水分解反応を停止した後、加水分解産物を室温まで冷却させて１MのNaOHを加え、これによってｐH値を９．５に調整した。 In a further preferred embodiment, the solution used for hydrolysis is prepared to dissolve 600 g of KCL in 60 L of water, 1 M HCl solution is added to adjust the pH value to 2.4, and This solution was placed in a 75 L stainless steel reaction vessel. The crude phosphorylated mannan (wet weight 2.49 kg) obtained by fermentation is added stepwise into the solution through the addition port of the reaction vessel, and the mixed solution is heated to 100 ° C. and stirred rapidly. For 7 hours. The pH value of the reaction environment was detected once every hour, and 1 M HCL was added 1 hour after the start of the reaction to adjust the pH value to 2.3. After stopping the hydrolysis reaction, the hydrolyzate was cooled to room temperature and 1 M NaOH was added, thereby adjusting the pH value to 9.5.
加水分解反応後の精製プロセスでは、分子直径が１０，０００Daltonのフィルタ（nominal molecular weight cut off membrane、NMWCO membrane）によって限外濾過（ultrafiltration）を行い、加水分解産物中のオリゴ糖リン酸塩フラクション、非リン酸化オリゴ糖および塩類を該フィルタに通過させ、分子量の高いリン酸化マンナンコアをフィルタに留置されることにより、流速の増大オリゴ糖リン酸塩フラクションおよび非リン酸化オリゴ糖を、リン酸化マンナンコアから分離させた。上述した分離プロセスは、ダイアフィルトレーション（diafiltration）モードにおいて十字流（tangential）またはクロスフロー（cross flow）濾過系によって完成された。このようなシステムでは、有効フィルタ面積および流速の増加によって加工量を容易に増加することができる。ここで、フィルタの分子直径は、３，０００〜１００，０００ Daltonであることが好ましく、より好ましくは、１０，０００ Daltonである。 In the purification process after the hydrolysis reaction, ultrafiltration is performed with a filter having a molecular diameter of 10,000 Dalton (nominal molecular weight cut off membrane, NMWCO membrane), and the oligosaccharide phosphate fraction in the hydrolyzate, The non-phosphorylated oligosaccharide and salts are passed through the filter, and a phosphorylated mannan core having a high molecular weight is placed on the filter, thereby increasing the flow rate of the oligosaccharide phosphate fraction and the non-phosphorylated oligosaccharide into the phosphorylated mannan. Separated from the core. The separation process described above has been completed by a tangential or cross flow filtration system in diafiltration mode. In such a system, the processing amount can be easily increased by increasing the effective filter area and the flow velocity. Here, the molecular diameter of the filter is preferably 3,000 to 100,000 Dalton, and more preferably 10,000 Dalton.
好適な実施例では、加水分解産物を７０Ｌに希釈して１５０Ｌのステンレス鋼溝内に置いた後、連続した２組のSartorius Hydrosart１０Ｋ （NMWCO 10，000）フィルタカートリッジ（各フィルタカートリッジのフィルタ面積が０．６ ｍ２）からなる限外濾過系を使用し、純水を用いて体積を8倍にしたダイアフィルトレーションにより処理した。上述したダイアフィルトレーションのパラメータとしては、吸気圧力（inlet pressure）を２００ｋＰａに、排気圧力（outlet pressure）を１５０ｋＰａに、ダイアフィルトレーションプロセスにおいてフィルタを通過できずに残った残留物（retentate）のクロスフロー流速（cross flow rate）を１５．６ Ｌ／ｍｉｎに、浸透物（permeate）の流速を６６〜８７ Ｌ／ｈ／ｍ２（１６〜２２℃）にするように設定された。ダイアフィルトレーション後の浸透物（６３０ Ｌ、導電率１．１ ｍＳ／ｃｍ）を６回に分けてから、後続するイオン交換クロマトグラフィー（ion-exchange chromatograｐHy）を行った。 In a preferred embodiment, the hydrolyzate is diluted to 70 L and placed in a 150 L stainless steel groove, followed by two consecutive Sartorius Hydrosart 10K (NMWCO 10,000) filter cartridges (each filter cartridge has a filter area of 0). .6 m 2 ) was used, and the mixture was treated by diafiltration with a volume of 8 times using pure water. The diafiltration parameters mentioned above include an inlet pressure of 200 kPa, an exhaust pressure of 150 kPa, and a retentate that remains unfiltered in the diafiltration process. The cross flow rate was set to 15.6 L / min, and the permeate flow rate was set to 66-87 L / h / m 2 (16-22 ° C.). The permeate (630 L, conductivity 1.1 mS / cm) after diafiltration was divided into 6 times, and the subsequent ion-exchange chromatography (ion-exchange chromatograpHy) was performed.
続いて、上述した濾過物に対し、イオン交換クロマトグラフィー法で二次精製を行った。好適な実施例において、イオン交換クロマトグラフィー法では、まず、３０ＬのＤＥＡＥ−ＳｐＨｅｒｉｌｏｓｅカラムが０．０１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液に１．５ Ｌ /ｍｉｎの流速で平衡状態になり、次いで、上述した濾過物（毎回約100Ｌ、合計六回）をカラムの上端から加え、０．０１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液で溶出して流出物（effluent）の導電率が０．２ ｍＳ /ｃｍのベースライン以内になったときに、中性フラクション（neutral fraction）を溶出した。それから、0.25 ＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液でオリゴ糖リン酸塩フラクションを溶出し、流出物を１Ｌ収集して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。上述した六回の溶出に得られた適切なフラクションを結合して逆浸透法で２０Ｌに濃縮すると同時に塩類を除去した。濾過物の導電率が０．２ ｍＳ /ｃｍ以下になるまでダイアフィルトレーションモードにおいて逆浸透を継続し、最終的に溶液を６ Ｌに濃縮した。得られた産物を凍結乾燥（lyoｐhilization）した後、その中のオリゴ糖リン酸塩フラクションが、白色で吸湿性を有する粉末で表わされ、約566 ｇであった。ＨＰＬＣ分析によって産物は、純度が約９３％であるため、更なる精製をすることなく、本発明の医薬組成物の調製に十分に用いられる。 Subsequently, the above-described filtrate was subjected to secondary purification by ion exchange chromatography. In a preferred embodiment, the ion exchange chromatography method first equilibrates a 30 L DEAE-Spherylose column with 0.01 M NH 4 HCO 3 solution at a flow rate of 1.5 L / min and then as described above. Filtrate (approx. 100L each time, 6 times in total) is added from the top of the column and eluted with 0.01M NH 4 HCO 3 solution, the effluent conductivity is within the baseline of 0.2 mS / cm When it became, a neutral fraction was eluted. The oligosaccharide phosphate fraction was then eluted with a 0.25 M NH 4 HCO 3 solution and 1 L of the effluent was collected and analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). Appropriate fractions obtained in the six elutions described above were combined and concentrated to 20 L by reverse osmosis, and at the same time salts were removed. Reverse osmosis was continued in the diafiltration mode until the filtrate conductivity was 0.2 mS / cm or less, and the solution was finally concentrated to 6 L. After the resulting product was lyophilized, the oligosaccharide phosphate fraction therein was expressed as a white, hygroscopic powder and weighed about 566 g. Since the product is about 93% pure by HPLC analysis, it is fully used in the preparation of the pharmaceutical composition of the present invention without further purification.
上述した逆浸透プロセスは、大量の加水分解産物（毎回加水分解約 ５０〜６０Ｌ）を、後続する凍結乾燥法で処理可能な程度まで速やかに減少させることを可能にすると共に、その後の歩留まりを向上させる重要なプロセスとなっている。また、逆浸透プロセスは、さらにフラクションにおける大量の無機塩類を除去することにより、わずかな無機塩類のみを含有する高純度の最終産物を得ることができた。 The reverse osmosis process described above allows large amounts of hydrolyzate (approximately 50-60 L of hydrolysis each time) to be rapidly reduced to a level that can be processed by the subsequent freeze-drying process, while improving subsequent yields. It has become an important process. Moreover, the reverse osmosis process was able to obtain a high-purity end product containing only a few inorganic salts by further removing a large amount of inorganic salts in the fraction.
最後、上述した酵母菌Pichia holstii NRRL Y-2448を培養、発酵、加水分解および精製した後で得られたリン酸マンナン産物をスルホン化（sulfonation）することにより、本発明の医薬組成物の有効成分を得た。まず、上述の精製で得られたリン酸マンナン産物４７８ｇを、ジメチルホルムアミド（Dimethylformamide，DMF ）と混合し、さらに三酸化硫黄―ピリジン複合物（sulfur trioxide pyridine-complex）３．７８ｋｇを加え、 ２５℃で３日間撹拌混合した後、産物が厚いオイル状物（thick oil）として分離された。ジメチルホルムアミドを抽出し、さらにアルコール 1 Ｌで残留物３回にわたって洗浄した後に約３Ｌの水中に溶解した。次いで、この溶液中に１ＭのＮａＯＨ溶液５ Ｌを加えることでｐH値を９．５に調整し、ジクロロメタン（Dichloromethane）３ Ｌで３回にわたって抽出することで放出されたピリジンを除去した。水相（aqueous ｐHase）部分は、水で希釈されて炭素濾過（charcoal filter，Cuno R53S）によって脱色された。水で溶液に２０Ｌに希釈してから体積を８倍にした１ＭのＮａＣＬ溶液でダイアフィルトレーションし、さらに濾過物の導電率が０．２ｍＳ / ｃｍより低くなるまで純水でダイアフィルトレーションした。最後、この溶液を逆浸透法で6 Ｌに濃縮し、さらに孔径 ０．２ μｍのフィルタで濾過し、冷凍乾燥した後に白色で吸湿性を有する固形物７６０ｇを、本発明の医薬組成物の有効成分として得た。 Finally, the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is obtained by sulfonating the phosphate mannan product obtained after culturing, fermenting, hydrolyzing and purifying the yeast Pichia holstii NRRL Y-2448 described above. Got. First, 478 g of the mannan phosphate product obtained by the above purification was mixed with dimethylformamide (DMF), and 3.78 kg of sulfur trioxide pyridine-complex was added, After 3 days of stirring and mixing, the product was isolated as a thick oil. Dimethylformamide was extracted and further washed three times with 1 L of alcohol and then dissolved in about 3 L of water. Subsequently, 5 L of 1 M NaOH solution was added to the solution to adjust the pH value to 9.5, and the pyridine released was extracted by extracting 3 times with 3 L of dichloromethane. The aqueous pHase portion was diluted with water and decolorized by carbon filtration (Cuno R53S). After diluting the solution to 20 L with water, diafiltration with a 1M NaCl solution with a volume of 8 times, and further diafiltration with pure water until the conductivity of the filtrate is lower than 0.2 mS / cm. did. Finally, this solution is concentrated to 6 L by the reverse osmosis method, filtered through a filter having a pore size of 0.2 μm, freeze-dried, and then 760 g of a white, hygroscopic solid is obtained as an effective pharmaceutical composition of the present invention. Obtained as an ingredient.
本発明の医薬組成物の確認
本発明の医薬組成物の有効成分に含まれる成分は、高速液体クロマトグラフィーまたはエレクトロスプレーイオン化-フーリエ変換型質量分析計（Liquid Chromatograｐhy / Electrospray Ionization - Fourier transform mass spectrometry，LC/ESI-FTMS）により分析かつ確認される。その検出分析条件を後述する。
Confirmation of the pharmaceutical composition of the present invention The components contained in the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention include high performance liquid chromatography or electrospray ionization-Fourier transform mass spectrometer (Liquid Chromatography / Electrospray Ionization-Fourier transform mass spectrometry, Analyzed and confirmed by LC / ESI-FTMS). The detection analysis conditions will be described later.
高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatograｐhy、ＨＰＬＣ）の一部の測定条件は、次の通りである。
高速液体クロマトグラフィーシステム：Shimadzu LC-20ATvp Shimadzu LC-20ADvp pumps、Shimadzu SIL-20ACオートサンプラー（Autosampler）およびShimadzu SCL-20A System Controller
紫外線検出器（UV Detector）：Shimadzu SPD-20AV Detector 、波長２８０nm
データシステム（Data System）：Xcalibur 2.0.7
高速液体クロマトグラフィーのカラム：ACE3, C18-AR, 4.6 x 150 mm
ガードカラム（guard column）：ACE3，C18，3.0μm，3.2 x 10mm
カラム温度：周囲環境温度
オートサンプラー温度：４℃
移動相Ａ（mobile ｐHase A）：５ｍＭのジ酢酸アンモニウム（dibutyl ammonium acetate）を含有し、かつ、水とメタノールの体積比8：2で混合して調製された溶液
移動相Ｂ（mobile ｐHase Ｂ）：５ｍＭのジ酢酸アンモニウム（dibutyl ammonium acetate）を含有し、かつ、水/メタノールの体積比1：9で混合して調製された溶液
高速液体クロマトグラフィーに用いる勾配溶離表(Gradient Table)は、表１に示す。
Some measurement conditions of high performance liquid chromatography (HPLC) are as follows.
High performance liquid chromatography system: Shimadzu LC-20ATvp Shimadzu LC-20ADvp pumps, Shimadzu SIL-20AC Autosampler and Shimadzu SCL-20A System Controller
UV Detector: Shimadzu SPD-20AV Detector, wavelength 280nm
Data System: Xcalibur 2.0.7
High-performance liquid chromatography column: ACE3, C18-AR, 4.6 x 150 mm
Guard column: ACE3, C18, 3.0μm, 3.2 x 10mm
Column temperature: Ambient temperature Autosampler temperature: 4 ° C
Mobile phase A (mobile pHHase A): A solution containing 5 mM dibutyl ammonium acetate and prepared by mixing water and methanol at a volume ratio of 8: 2 Mobile phase B (mobile pHHase B) : A solution containing 5 mM dibutyl ammonium acetate and mixed at a volume ratio of 1: 9 in water / methanol Gradient Table used for high performance liquid chromatography It is shown in 1.
質量分析計の測定条件は、次の通りである。
質量分析計：Thermo LTQ Orbitrap XL
データシステム（Data System）：Xcalibur ２.０.７
イオン化モード（Ionization Mode）：エレクトロスプレーイオン化の負イオンモード
イオンスプレー電圧（Ion Spray Voltage）：４．５ｋＶ
キャピラリ温度（Capillary Temperature）：３５０℃
キャピラリ電圧（Capillary Voltage）：−１８Ｖ
チューブレンズ（Tube Lens）：−１００Ｖ
シースガス流量（Sheath Gas Flow）：６０単位
補助ガス流量（Auxiliary Gas Flow）：３０単位
スイープガス流量（Sweep Gas Flow）：５単位
衝突ガス：ヘリウムガス（Helium）
The measurement conditions of the mass spectrometer are as follows.
Mass spectrometer: Thermo LTQ Orbitrap XL
Data System: Xcalibur 2.0.7
Ionization Mode: Negative ion mode of electrospray ionization Ion Spray Voltage: 4.5 kV
Capillary temperature: 350 ° C
Capillary voltage: -18V
Tube lens: -100V
Sheath gas flow: 60 units Auxiliary gas flow: 30 units Sweep gas flow: 5 units Collision gas: helium gas (Helium)
上述した方法で分析した後、本発明の医薬組成物の有効成分に含まれる成分およびその構造、分子式と分子量を表２に示す。 Table 2 shows the components contained in the active ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention and their structures, molecular formulas and molecular weights after analysis by the method described above.
表２に示すように、本発明の医薬組成物の有効成分が異性体を排除した場合には、成分１〜８の８種類の成分を含んでいる。その基礎構造は、１→３および/または１→２グルコシド結合（glycosidic bond）によってマンノース単位（mannose）２〜５個を結合したオリゴ糖分子である。詳しくは、１→２グルコシド結合で末端の糖単位と結合した以外に、残りの糖単位との間には、１→３グルコシド結合で結合した。表１に示す構造式に対応すれば、ｎ＝０の場合に二糖と表され、ｎ＝１の場合に三糖と表され、ｎ＝２の場合に四糖と表され、ｎ＝３の場合に五糖と表される。 As shown in Table 2, when the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention excludes isomers, it contains 8 kinds of ingredients 1-8. Its basic structure is an oligosaccharide molecule in which 2 to 5 mannose units are linked by 1 → 3 and / or 1 → 2 glycosidic bonds. Specifically, in addition to binding to the terminal sugar unit with a 1 → 2 glucoside bond, the remaining sugar units were bonded with a 1 → 3 glucoside bond. According to the structural formula shown in Table 1, it is represented as a disaccharide when n = 0, represented as a trisaccharide when n = 1, represented as a tetrasaccharide when n = 2, and n = 3 In the case of, it is expressed as pentasaccharide.
上述した基礎構造によれば、本発明の医薬組成物の有効成分における各成分は、１個目の糖単位の６番炭素（C６）における水酸基（OH group）のHをＰＯ３Ｈ２またはその塩類に置換し、残りの３ｎ＋７個の水酸基において、３ｎ＋６または３ｎ＋７個の水酸基のHをスルホン酸（SO3H）またはその塩類に置換した。表２に示す構造式に対応すれば、成分１、成分３、成分５および成分７は、それぞれ、３ｎ＋６個の水酸基のＨをＳＯ３Ｈまたはその塩類に置換した二糖、三糖、四糖および五糖であり、即ち、１個目の糖単位の６番炭素（C６）における水酸基以外に、水酸基１個のみをＳＯ３Ｈまたはその塩類に置換した。一方、成分２、成分４、成分６および成分８は、それぞれ、３ｎ＋７個の水酸基のＨをＳＯ３Ｈまたはその塩類に置換した二糖、三糖、四糖および五糖であり、即ち、１個目の糖単位の６番炭素（C６）における水酸基以外に、水酸基１個のみをSO3Hまたはその塩類に置換した。 According to the basic structure described above, each component in the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is such that H of the hydroxyl group (OH group) in the 6th carbon (C6) of the first sugar unit is PO 3 H 2 or its In the remaining 3n + 7 hydroxyl groups, H of 3n + 6 or 3n + 7 hydroxyl groups was substituted with sulfonic acid (SO 3 H) or a salt thereof. According to the structural formula shown in Table 2, Component 1, Component 3, Component 5 and Component 7 are disaccharides, trisaccharides and tetrasaccharides in which H of 3n + 6 hydroxyl groups are replaced with SO 3 H or salts thereof, respectively. In other words, in addition to the hydroxyl group at the 6th carbon (C6) of the first sugar unit, only one hydroxyl group was substituted with SO 3 H or a salt thereof. On the other hand, component 2, component 4, component 6 and component 8 are disaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides and pentasaccharides in which H of 3n + 7 hydroxyl groups are replaced with SO 3 H or salts thereof, ie, 1 In addition to the hydroxyl group at the 6th carbon (C6) of the first sugar unit, only one hydroxyl group was substituted with SO 3 H or its salt.
図１は、本発明に係る医薬組成物の有効成分についてLC／ESI−FTMSで分析して得られたトータルイオンクロマトグラム（Total ion chromatogram，TIC）を示す図である。図１に示すように、本発明の医薬組成物の有効成分において、成分８および成分６は主成分であり、即ち、一般式（I）で表される化合物において、ｎは、２または３で、ＳＯ３Ｈを表す３ｎ＋７個のＲは、主成分である。また、図１には、本発明の医薬組成物の有効成分において、成分８の相対含有量が最も高いことも示され、即ち、一般式（I）で表される化合物において、ｎは３で、かつＳＯ３Ｈを表す３ｎ＋７個のRの相対含有量は、最も高い。 FIG. 1 is a diagram showing a total ion chromatogram (TIC) obtained by analyzing the active ingredient of the pharmaceutical composition according to the present invention by LC / ESI-FTMS. As shown in FIG. 1, in the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, component 8 and component 6 are main components, that is, in the compound represented by the general formula (I), n is 2 or 3. , 3n + 7 Rs representing SO 3 H are main components. FIG. 1 also shows that the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention has the highest relative content of ingredient 8, that is, in the compound represented by the general formula (I), n is 3. And the relative content of 3n + 7 R representing SO 3 H is the highest.
図１によれば、本発明の医薬組成物の有効成分において、成分１〜成分８以外に、他の成分、例えば、滞留時間1.86min、9.33min、37.75minおよび40.53minに対応する成分を含んでもよい。 According to FIG. 1, in the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, in addition to ingredient 1 to ingredient 8, other ingredients such as ingredients corresponding to residence times of 1.86 min, 9.33 min, 37.75 min and 40.53 min are included. But you can.
上述したLC/ESI-FTMSのトータルイオンクロマトグラムの分析結果を基づいて得られた各成分のデータは、ピークに対応した滞留時間（Apex Retention Time）、ピーク面積、ピーク面積の割合、ピーク高さおよびピーク高さの割合を含む。これらのデータを表３に示す。 The data of each component obtained based on the analysis results of the LC / ESI-FTMS total ion chromatogram described above are the retention time (Apex Retention Time) corresponding to the peak, peak area, peak area ratio, and peak height. And peak height percentage. These data are shown in Table 3.
表３の各成分のピーク面積の割合によれば、本発明の医薬組成物の有効成分中において、成分８および成分６は主成分であることが示される。この２つの成分のピーク面積の割合は合計８２．２％である。即ち、一般式（I）で表される化合物において、ｎは、２または３で、かつSO3Hを表す３ｎ＋７個のRは、主成分である。また、表３には、本発明の医薬組成物の有効成分において、成分８の相対含有量が最も高くて、そのピーク面積の割合が４８．２６％であることが示される。即ち、一般式（I）で表される化合物において、ｎは３で、かつSO3Hを表す３ｎ＋７個のRの相対含有量は、最も高い。構造における水酸基をスルホ基（SO3H）に置換することによって分け、表３の分析結果によれば、一般式（I）で表される化合物において、１個目の糖単位の６番炭素（C６）における水酸基以外、残りの３ｎ＋７個の水酸基をすべてスルホ基に置換した。即ち、成分２、成分４、成分６および成分８のピーク面積の割合の合計は９２．０１％である。一方、一般式（１）で表される化合物において、３ｎ＋７個の水酸基のうちの３ｎ＋６個の水酸基をスルホ基に置換した。即ち、成分１、成分３、成分５および成分７のピーク面積の割合の合計は７．９９％である。これにより、本発明の医薬組成物の有効成分において、３ｎ＋７個の水酸基をすべてスルホ基に置換した成分を主成分とすることが明らかとなった。 According to the ratio of the peak area of each component in Table 3, it is shown that component 8 and component 6 are the main components in the active ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention. The ratio of the peak areas of these two components is 82.2% in total. That is, in the compound represented by the general formula (I), n is 2 or 3, and 3n + 7 Rs representing SO 3 H are main components. Table 3 shows that the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention has the highest relative content of ingredient 8 and a peak area ratio of 48.26%. That is, in the compound represented by the general formula (I), n is 3 and the relative content of 3n + 7 Rs representing SO 3 H is the highest. The hydroxyl group in the structure is divided by substitution with a sulfo group (SO 3 H), and according to the analysis results in Table 3, in the compound represented by the general formula (I), the 6th carbon ( Except for the hydroxyl group in C6), the remaining 3n + 7 hydroxyl groups were all substituted with sulfo groups. That is, the sum of the ratios of the peak areas of component 2, component 4, component 6, and component 8 is 92.01%. On the other hand, in the compound represented by the general formula (1), 3n + 6 hydroxyl groups out of 3n + 7 hydroxyl groups were substituted with sulfo groups. That is, the sum of the ratios of the peak areas of component 1, component 3, component 5 and component 7 is 7.9%. Thereby, it became clear that the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is mainly composed of a component in which 3n + 7 hydroxyl groups are all substituted with sulfo groups.
本発明の医薬組成物の用途
現在、本発明の医薬組成物は、肝癌の治療過程中に補助療法として使用されている。好適な実施例では、本発明の医薬組成物は、肝癌の再発、悪化または転移の抑制に用いる。具体的に、本発明の医薬組成物の臨床効果としては、肝癌患者に対する術後の再発までの時間を延ばし、または肝癌患者に対する術後の再発率を低下させることである。以下、本発明の医薬組成物が実際にその医薬用途に使用し得るかどうかを証明するため、その治療する病症、薬理作用、有効投与量、使用方法、薬理試験の方法および結果を実施例により説明する。
Uses of the pharmaceutical composition of the present invention Currently, the pharmaceutical composition of the present invention is used as an adjuvant therapy during the course of treatment of liver cancer. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention is used to suppress the recurrence, worsening or metastasis of liver cancer. Specifically, the clinical effect of the pharmaceutical composition of the present invention is to extend the time until relapse after surgery for liver cancer patients or to reduce the postoperative recurrence rate for liver cancer patients. Hereinafter, in order to prove whether or not the pharmaceutical composition of the present invention can actually be used for its pharmaceutical use, the disease to be treated, pharmacological action, effective dosage, usage method, pharmacological test method and results are shown by Examples. explain.
本発明の医薬組成物は、肝癌（Liver Cancer）の治療に適用され、塞栓療法、標的薬物療法、化学療法、放射線療法または肝臓切除術などの治療法のうちの少なくとも１種の治療法との併用で肝癌の再発、悪化または転移を抑制することが可能である。好適な実施例において、本発明の医薬組成物は、肝臓切除術（hepatectomy）を受けた肝癌患者に適用された。本発明の医薬組成物の薬理作用としては、ヘパラナーゼおよび血管新生増殖因子の活性を抑えることにより、肝腫瘍の転移および肝腫瘍の血管新生を抑制し、肝癌の再発、悪化および転移を抑制する効果を達成することができる。好適な実施例において、ヒト臨床試験によって本発明の医薬組成物の安全性、予備的有効性および有効投与量が確認されており、かつ肝癌患者に対する術後の再発までの時間を延ばし、または肝癌患者に対する術後の再発率を低下させることができる。このヒト臨床試験方法は、多施設（multi-center）、無作為化（randomized）および並行群間（parallel-group）と言う臨床試験に設計された。 The pharmaceutical composition of the present invention is applied to the treatment of liver cancer (Liver Cancer) and is used with at least one treatment method such as embolization therapy, targeted drug therapy, chemotherapy, radiotherapy or liver resection. In combination, it is possible to suppress recurrence, worsening or metastasis of liver cancer. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention has been applied to liver cancer patients who have undergone hepatectomy. As the pharmacological action of the pharmaceutical composition of the present invention, the effects of inhibiting the activity of heparanase and angiogenic growth factor, thereby suppressing liver tumor metastasis and liver tumor angiogenesis, and suppressing the recurrence, worsening and metastasis of liver cancer Can be achieved. In a preferred embodiment, the safety, preliminary efficacy and effective dosage of the pharmaceutical composition of the present invention has been confirmed by human clinical trials, and the time until recurrence after surgery for liver cancer patients is increased, or liver cancer The postoperative recurrence rate for patients can be reduced. This human clinical trial method was designed for clinical trials called multi-center, randomized and parallel-group.
本発明の医薬組成物は、臨床で使用される時に注射によって投与され、その水溶性が高いため、水を溶媒として使用してもよい。使用可能な注射溶媒は、滅菌水、滅菌水を溶媒とする生理食塩水またはグルコース水溶液などを含んでもよいがそれらに限定されない。また、他の油性溶媒を使用してもよい。好適な実施例において、等張生理食塩水（normal saline）を溶媒として使用した。
本発明の医薬組成物は、用法・用量を均一化するように単位投与量で調製された。各単位投与量は、一定量の有効成分を含み、この有効成分は、医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアと混合される時に、所望の治療効果を達成することができる。
The pharmaceutical composition of the present invention is administered by injection when used clinically, and water may be used as a solvent because of its high water solubility. Usable injection solvents may include, but are not limited to, sterile water, physiological saline using sterile water as a solvent, or aqueous glucose solution. Moreover, you may use another oil-based solvent. In a preferred embodiment, normal saline was used as the solvent.
The pharmaceutical composition of the present invention was prepared in a unit dose so as to uniform the dosage and administration. Each unit dosage contains a certain amount of active ingredient which can achieve the desired therapeutic effect when mixed with a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier.
本発明の医薬組成物の有効成分が水に対する溶解度は４００ｍｇ／ｍｌより高いので、本発明の医薬組成物の有効成分１６０ ｍｇは、水 ０．４ ｍｌに完全に溶解できた。好適な実施例において、各単位投与量の薬剤には、本発明の医薬組成物の有効成分２１５ｍｇおよび生理食塩水１ｍｌを含み、混合溶解した後の濃度が２００ｍｇ／ｍｌ、その中から０．８ｍｌを取り出して注射し、本発明の医薬組成物の有効成分の含有量１６０ｍｇに相当する。 Since the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention has a solubility in water higher than 400 mg / ml, 160 mg of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention was completely soluble in 0.4 ml of water. In a preferred embodiment, each unit dose contains 215 mg of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention and 1 ml of physiological saline, and the concentration after mixing and dissolution is 200 mg / ml, of which 0.8 ml Is taken out and injected, which corresponds to a content of 160 mg of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention.
臨床試験に使用された治療効果と安全分析母集団（efficacy / safety population）は、治療意図（Intent-to-treat、ITT）に基づく分析母集団であり、治療意図に基づく分析母集団は、試験資格を持って無作為に抽出された被験者を分析対象として、一方、いずれの試験用薬剤を服用せず、または無作為抽出後に記録されないヒトを分析対象外として排除するように定義される。 Treatment effect and safety analysis population (efficacy / safety population) used in clinical trials is an analysis population based on intent-to-treat (ITT). Qualified and randomly extracted subjects are defined as analysis targets, while humans who do not take any test drug or are not recorded after random sampling are excluded from analysis.
上述したヒト臨床試験において、肝臓切除術を受けた肝癌患者を、未投薬で臨床管理されない対照群（５８人）、本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が１６０ ｍｇ/日の試験群（５７人）、および本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が２５０ ｍｇ/日の試験群（５７人）のような３組に無作為割り付けた。試験群の被験者は、肝臓切除術を受けた後４〜６週以内により投与を開始し、４週間を１コースとし、各コースの最初の３週間において、各週間のうち４日間連日皮下注射によって投与し、各コースの第４週間休薬した。９コース（合計３６週）を繰り返した後、フォローアップ期間（follow-up period）とする１２週を設けた。２組の試験群の被験者に対して、３６週間の投与期間において、４週間間隔でルーチン検査と追跡を行い、後続する１２週間のフォローアップ期間において、６週間間隔で検査を一回行った。対照群の被験者に対して、対照薬物または偽薬を投与せず、合計４８週間のフォローアップ期間において、６週間間隔でルーチン検査と追跡を一回行った。 In the human clinical trials described above, liver cancer patients who underwent liver resection were treated with a control group (58 patients) who had not been clinically managed without medication, and a test group in which the dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention was 160 mg / day (57 persons), and the dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention was randomly assigned to 3 groups as in the test group (57 persons) of 250 mg / day. Subjects in the study group started administration within 4-6 weeks after undergoing liver resection, with 4 weeks taken as one course, and in the first 3 weeks of each course by daily subcutaneous injection for 4 days of each week. Administration was withdrawn for the fourth week of each course. After repeating 9 courses (36 weeks in total), 12 weeks were set as a follow-up period. Subjects in the two test groups were routinely tested and followed at 4-week intervals in the 36-week dosing period and once at 6-week intervals in the subsequent 12-week follow-up period. Control subjects were not administered control drug or placebo, and were routinely tested and followed once every 6 weeks for a total of 48 weeks of follow-up.
各コースを開始する前に、被験者に対して、病歴の確認、身体検査（ｐhysical examination）、併用薬（concomitant medication）を確認し、さらにα-フェトプロテイン（α-fetoprotein、AFP）を含むルーチン検査を行った。１ヶ月ごとに被験者全員に腹部超音波検査を行った。４コース目および７コース目の初日に、腹部CTスキャンを行った。また、被験者が肝癌再発と疑われた場合に必ず腹部CTスキャンを行うようにしていた。さらに、肝臓外の部位の腫瘍再発状況（extra-hepatic tumor recurrence）を監視するように、４コース目および７コース目の初日に、胸部X線検査、骨スキャンおよび脳CTスキャンも行った。 Before starting each course, subjects will be checked for medical history, physical examination, concomitant medication, and routine examinations that include α-fetoprotein (AFP). went. Every month, all subjects underwent abdominal ultrasonography. Abdominal CT scans were performed on the first day of the 4th and 7th courses. In addition, an abdominal CT scan was always performed when the subject was suspected of having liver cancer recurrence. In addition, chest X-ray examinations, bone scans and brain CT scans were also performed on the first day of the 4th and 7th courses to monitor extra-hepatic tumor recurrence at sites outside the liver.
一般的に、血清中α-フェトプロテインおよび腹部超音波検査は、肝臓腫瘍再発の初期評価基準としている。α-フェトプロテイン濃度上昇または腹部超音波検査結果によって新たな肝腫瘍を形成する可能性があるとみられた場合、腹部CTスキャンで再発腫瘍の血管構造を検査する必要がある。この腫瘍がCTスキャンで造影した動脈相（arterial ｐhase）において典型的な血管過多と示されるとともに、造影剤（contrast medium）が静脈相（venous ｐhase）に速やかに洗い流されたと、この病巣は肝癌の再発（HCC recurrence）と定義された。被験者の病巣が、すでに生検または外科的切除術を受けた場合、肝癌の再発は、組織学的検査によって確認されてもよい。 In general, serum alpha-fetoprotein and abdominal ultrasonography are the primary assessment criteria for liver tumor recurrence. If increased α-fetoprotein levels or abdominal ultrasonography results indicate that a new liver tumor may be formed, the abdominal CT scan should examine the vascular structure of the recurrent tumor. When this tumor is shown to be typical vascular hypertrophy in an arterial phase contrasted by CT scan, and the contrast medium is quickly washed away into the venous phase, the lesion is caused by liver cancer. Defined as recurrent (HCC recurrence). If the subject's lesion has already undergone a biopsy or surgical resection, recurrence of liver cancer may be confirmed by histological examination.
上述したヒト臨床試験の有効性主要評価項目 （primary efficacy endpoint）は、試験を終了したときの肝癌の非再発率（non-recurrence rate of HCC）である。一方、有効性副次的評価項目（secondary efficacy endpoint）は、最初の再発までの時間（time to first recurrence）である。最初の再発までの時間は、無作為抽出の日から、コンピューターCTスキャンまたは組織学的検査によって腫瘍の再発を確認できた日までの時間と計算された。 The primary efficacy endpoint of the human clinical trial described above is the non-recurrence rate of HCC at the end of the trial. On the other hand, the secondary efficacy endpoint is the time to first recurrence. The time to first recurrence was calculated as the time from the date of random sampling to the date that tumor recurrence was confirmed by computer CT scan or histological examination.
試験結果のデータは次の通りである。対照群５８人のうち、５８人が資料分析における治療意図に基づく分析母集団となり、そのうちの２６人（約４５％を占める）は、試験終了時に肝癌が再発し、そのうちの２９人（約５０％を占める）は、試験終了時に肝癌が再発せず、そのうちの３人（約５％を占める）は、試験途中ドロップアウト（dropout）した。本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が１６０ ｍｇ/日の試験群５７人のうち、５６人が資料分析における治療意図に基づく分析母集団となり、そのうちの１６人（約２９％を占める）は、試験終了時に肝癌が再発し、そのうちの３５人（約６３％を占める）は、試験終了時に肝癌が再発せず、そのうちの５人（約９％を占める）は、試験途中ドロップアウト（dropout）した。本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が２５０ ｍｇ/日の試験群５７人のうち、５４人が資料分析における治療意図に基づく分析母集団となり、そのうちの２１人（約３９％を占める）は、試験終了時に肝癌が再発し、そのうちの２２人（約４１％を占める）は、試験終了時に肝癌が再発せず、そのうちの１１人（約２０％を占める）は、試験途中ドロップアウト（dropout）した。 The test result data are as follows. Of the 58 control groups, 58 became the analysis population based on treatment intentions in the data analysis, 26 of which (approximately 45%) recurred with liver cancer at the end of the study, 29 of which (about 50 Liver cancer did not recur at the end of the study, 3 of whom (approximately 5%) dropped out during the study. Of the 57 test groups with a dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention of 160 mg / day, 56 became the analysis population based on the treatment intention in the data analysis, and 16 of them (occupying about 29%) ), Liver cancer recurred at the end of the study, of which 35 (approximately 63%) did not recur at the end of the study, and 5 of them (approximately 9%) were dropped out during the study (Dropout). Of the 57 test groups with a dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention of 250 mg / day, 54 became the analysis population based on the treatment intention in the data analysis, of which 21 (accounting for about 39%) ), Liver cancer recurred at the end of the study, of which 22 (approximately 41%) did not recur at the end of the study, 11 of them (approximately 20%) were dropped out during the study (Dropout).
図２は、試験終了時に、対照群、本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が１６０ ｍｇ/日の試験群、および本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が２５０ ｍｇ/日の試験群の被験者母集団において、肝癌が再発しなかった人数および途中ドロップアウトした患者数の割合を示す図である。図２を参照すれば、本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が１６０ ｍｇ/日の試験群に対して、その肝癌非再発率は、６３％であり、一方、投薬しなかった対照群の非再発率は、５０％であり、統計的手法によって両者の間に差（P= 0.07）があると判断される。即ち、本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が１６０ ｍｇ/日で、肝臓切除術を受けた肝癌患者に対して皮下注射法で周期的に投与することによって、患者の肝癌再発率を低減することができた。 FIG. 2 shows that at the end of the test, the dose of the active ingredient of the control group, the pharmaceutical composition of the present invention is 160 mg / day, and the dosage of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is 250 mg / day. FIG. 4 is a graph showing the number of patients whose liver cancer did not recur and the ratio of the number of patients dropped out during the test population in the test group. Referring to FIG. 2, the non-recurrence rate of the liver cancer was 63% for the test group in which the dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention was 160 mg / day, while the control was not administered. The non-recurrence rate of the group is 50%, and it is judged that there is a difference (P = 0.07) between the two by statistical methods. That is, the dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is 160 mg / day, and it is periodically administered by subcutaneous injection to a liver cancer patient who has undergone liver resection. It was possible to reduce.
上述した試験結果によれば、本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が２５０ ｍｇ/日の試験群は、投薬しなかった対照群に比べ、患者の肝癌再発率を著しく低減する効果がないことが示される。 According to the test results described above, the test group in which the dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is 250 mg / day has an effect of significantly reducing the recurrence rate of the liver cancer of the patient compared with the control group that was not administered. Not shown.
図３は、試験の進行に伴って（０〜４８週）、対照群、および本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が１６０ ｍｇ/日の試験群に対して、総人数に対する肝癌が再発しなかった人数の割合の変化を示す図である。２組の被験者母集団に対して、試験開始から、７０％の被験者の肝癌が再発しないまでの時間は、点線で示される。図３を参照すれば、対照群の被験者母集団の場合、試験開始から７０％の被験者の肝癌が再発しないまでの時間は、２７週であり、一方、本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が１６０ ｍｇ/日の試験群の被験者母集団の場合、試験開始から７０％の被験者の肝癌が再発しないまでの時間は、４８週であることがみられる。このような試験結果によれば、本実施例において、本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が１６０ ｍｇ/日で、肝臓切除術を受けた肝癌患者に対して皮下注射法で周期的に投薬することによって、患者の肝癌再発までの時間を著しく延ばすことができた。 FIG. 3 shows that as the test progressed (0 to 48 weeks), the control group and the test group with a dose of active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention of 160 mg / day showed liver cancer for the total number of people. It is a figure which shows the change of the ratio of the number of people who did not recur. For the two sets of subject populations, the time from the start of the study until 70% of the subject's liver cancers do not recur is shown in dotted lines. Referring to FIG. 3, in the case of the subject population of the control group, the time from the start of the test until the liver cancer of 70% of the subjects does not recur is 27 weeks, while the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention In the case of a subject population in the test group with a dose of 160 mg / day, it can be seen that the time from the start of the test until the liver cancer of 70% of the subjects does not recur is 48 weeks. According to such test results, in this example, the dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention was 160 mg / day, and the liver cancer patients who underwent liver resection were periodically injected by subcutaneous injection. The patient's time to recurrence of liver cancer could be significantly prolonged.
また、他の臨床実験データによれば、本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が８０ ｍｇ/日の被験者の場合には、腫瘍が大きくなるのを抑える効果があるとみられる。一方、本発明の医薬組成物の有効成分の投与量が３１５ ｍｇ/日の被験者の場合には、重度の血小板減少症（severe thrombocytopenia）を起こす恐れがある。 Further, according to other clinical experimental data, it is considered that when the dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is 80 mg / day, there is an effect of suppressing the growth of the tumor. On the other hand, when the dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is 315 mg / day, severe thrombocytopenia may occur.
以上説明したのは、本発明の好適な実施方式であるが本発明の実施範囲を限定するものではない。本技術領域の技術要員は本発明の精神と範囲を離れない前提で、若干の改善と修飾を行うことができ、これらの改善と修飾は本発明の保護範囲に属する。 What has been described above is a preferred embodiment of the present invention, but does not limit the scope of the present invention. Technical personnel in this technical field can make some improvements and modifications without departing from the spirit and scope of the present invention, and these improvements and modifications belong to the protection scope of the present invention.
Claims (16)
治療有効量の少なくとも一般式（I）で表される化合物、および医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアを含み、
ここで、前記一般式（I）で表される化合物において、nは、０〜３の整数であり、かつ、３ｎ＋６または３ｎ＋７個のＲはＳＯ３Ｈを表し、残りのＲはＨを表し、
前記化合物のうち、前記３ｎ＋７個のＲがＳＯ３Ｈを表す前記化合物が、９０％以上含まれる、
ことを特徴とする医薬組成物。 A pharmaceutical composition used for suppressing recurrence, worsening and metastasis of liver cancer,
A therapeutically effective amount of at least a compound of general formula (I) and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier,
Here, in the compound represented by the general formula (I), n is an integer of 0 to 3, and 3n + 6 or 3n + 7 R represents SO 3 H, and the remaining R represents H.
Among the compounds, 90% or more of the compound in which the 3n + 7 Rs represent SO 3 H is included.
The pharmaceutical composition characterized by the above-mentioned.
治療有効量の少なくとも一般式（I）で表される化合物、および医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアを含み、
ここで、前記一般式（I）で表される化合物において、nは、０〜３の整数であり、かつ、各糖単元は少なくとも３個のＳＯ３Ｈを有することを特徴とする医薬組成物。 A pharmaceutical composition used for suppressing recurrence, worsening and metastasis of liver cancer,
A therapeutically effective amount of at least a compound of general formula (I) and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier,
Here, in the compound represented by the general formula (I), n is an integer of 0 to 3, and each sugar unit has at least 3 SO 3 H. .
治療有効量の少なくとも一般式（I）で表される化合物、および医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアを含み、
ここで、前記一般式（I）で表される化合物において、nは、０〜３の整数であり、かつ、前記化合物の硫酸化程度が８５％以上であることを特徴とする医薬組成物。 A pharmaceutical composition used for suppressing recurrence, worsening and metastasis of liver cancer,
A therapeutically effective amount of at least a compound of general formula (I) and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier,
Here, in the compound represented by the general formula (I), n is an integer of 0 to 3, and the degree of sulfation of the compound is 85% or more.
治療有効量の少なくとも一般式（I）で表される化合物、および医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアを含み、
ここで、前記一般式（I）で表される化合物において、nは、０〜３の整数であり、かつ、３ｎ＋７個のＲはＳＯ３Ｈを表すことを特徴とする医薬組成物。 A pharmaceutical composition used for suppressing recurrence, worsening and metastasis of liver cancer,
A therapeutically effective amount of at least a compound of general formula (I) and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier,
Here, in the compound represented by the general formula (I), n is an integer of 0 to 3, and 3n + 7 Rs represent SO 3 H.
前記治療法は、塞栓療法、標的薬物療法、化学療法、放射線療法または肝臓切除手術を含むことを特徴とする請求項１１に記載の医薬組成物。 It is possible to suppress the recurrence, worsening or metastasis of liver cancer in combination with at least one treatment method,
12. The pharmaceutical composition according to claim 11, wherein the treatment comprises embolization, targeted drug therapy, chemotherapy, radiation therapy or liver resection.
治療有効量の前記一般式（Ｉ）で表される化合物を、医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤またはキャリアと組み合わせることを含む方法。 A method for preparing a drug that suppresses recurrence, worsening, or metastasis of liver cancer using the compound represented by the general formula (I) according to any one of claims 1 to 11,
A method comprising combining a therapeutically effective amount of a compound of general formula (I) with a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier.
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