JP2016196486A - 脳腫瘍を治療するための分枝鎖アミノトランスフェラーゼ1(bcat1)の阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】現行療法の欠点を克服して患者の生存率を改善する、脳腫瘍、好ましくは神経膠芽腫または星状細胞系脳腫瘍の療法のための手段の提供。【解決手段】脳腫瘍を治療する方法において使用するための(a)分枝鎖アミノトランスフェラーゼ1(BCAT1)の生物学的活性または(b)BCAT1をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害することのできる化合物、脳腫瘍を治療するための医薬組成物を調製するための(a)BCAT1の生物学的活性または(b)BCAT1をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害することのできる化合物の使用、及び BCAT1の生物学的活性またはBCAT1をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害する化合物を同定する方法。【選択図】図1−1
Description
本発明は、脳腫瘍を治療する方法において使用するための(a)分枝鎖アミノトランスフェラーゼ1(BCAT1)の生物学的活性または(b)BCAT1をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害することのできる化合物を提供する。
ヒト悪性神経膠芽腫は、ヒトの悪性脳腫瘍の最多数を占めている。これまで、神経膠腫の治療には、神経外科技術(切除または定位固定法)、放射線療法および化学療法が含まれる。例えば星状細胞腫瘍のための現在の医療基準は、外科的腫瘍切除術を含んでおり、その後に経口アルキル化剤であるテモゾラミド(TMZ)による化学療法および放射線療法を行うことができる。しかし、神経膠芽腫は、電離放射線、化学療法および外科的切除には応答できないので治療不能であると考えられている。言い換えると、これらの療法を使用しても、患者の延命は極めて短い。これは、これらの療法を実施しても癌診断後の平均寿命が12〜16カ月間に過ぎないことを意味する。
そこで、本発明の基礎にある技術的課題は、現行療法の欠点を克服して患者の生存率を改善する、脳腫瘍、好ましくは神経膠芽腫または星状細胞系脳腫瘍の療法のための手段を提供することである。
前記の技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けた実施形態を提供することによって達成される。
本発明に至った実験において、これまでに例えば抗けいれん薬として使用されてきたガバペンチンのような公知のBACT1阻害剤が、癌療法、つまり一般的には新生物に対する、特に星状細胞系脳腫瘍のような脳腫瘍を治療するための効果的な療法における新規な治療選択肢を表すことが見いだされた。BACT1阻害剤は、いずれかの確立された化学療法の標的とはされていない分子経路を標的とすることによって作用する可能性がある。
そこで、本発明は、新生物形成を治療する方法において使用するための(a)分枝鎖アミノトランスフェラーゼ1(BCAT1)の生物学的活性または(b)BCAT1をコードする遺伝子の発現、を低減もしくは阻害することのできる化合物に関する。
「新生物」は、新生物形成の結果としての異常な組織の塊である。「新生物形成」は、細胞の異常な増殖である。細胞の増殖は卓越し、その周囲の正常組織に対して調和しない。この増殖は、刺激の停止後でさえ同一の過剰方法で持続する。この増殖は、通常は腫物または腫瘍を誘発する。新生物は良性、前癌状態(細胞腫−原位置)または悪性(癌)の場合がある。本発明による治療対象新生物は、BCAT1を(過剰)発現する新生物である。そこで、新生物中のBCAT1の判定は、BCAT阻害療法を開始すべき兆候である。治療対象の新生物は、脳腫瘍、特にIDH1野生型を発現する星状細胞系脳腫瘍、神経膠腫もしくは神経膠芽腫である。
分枝鎖アミノ酸(BCAA)であるバリン、ロイシンおよびイソロイシンは、肝異化作用を免れる必須アミノ酸であり、全身循環で入手することができる。BCAA代謝は、中枢神経系における神経伝達物質であるグルタミン酸を含む非必須アミノ酸の合成のために身体全体を通して窒素を移動させる重要な輸送システムを提供する。BCAA異化経路の脱制御は、頻回に神経機能障害を生じさせる。BCAA異化作用の最初の工程は、細胞質分枝鎖アミノ酸トランスアミナーゼ1(BCAT1)またはミトコンドリアBCAT2アイソザイムによるα−アミノ基のα−ケトグルタル酸(α−KG)への転移を含み、産物としてグルタミン酸および各分枝鎖ケト酸(BCKA)が得られる(Ichihara et al., J. Biochem. 59, pp.160−169, (1966)、Taylor et al., J. Biol. Chem. 241, pp.4396−4405, (1966))。BCAT2の発現は遍在性であるが、BCAT1の発現は、BCAAが神経伝達物質であるグルタミン酸の合成のための窒素の主要起源である脳を含む少数の組織に限定されている。アミノ基転移後、BCKAはさらにトリカルボン酸(TCA)回路に侵入するアセチル−CoAおよびスクシニル−CoAへ異化される(図1a)。BCKA異化作用の副産物として生成されるNADHおよびFADH2は、ATP産生のための呼吸鎖の複合体IIIへ還元当量を運搬するために使用される。
最初に神経膠芽腫の分画内で検出されたIDH1(イソクエン酸脱水素酵素1)内の突然変異は、世界保健機関(WHO)グレードIIおよびIII神経膠腫および二次性神経膠芽腫の大半に存在するが、原発性神経膠芽腫内では希である(Balss et al., Acta Neuropath. 116, pp.597−602(2008))。IDH2における突然変異もまた、5〜10%という低頻度ではあったが検出された(Balss, Balss et al., Acta Neuropath. 116, pp.597−602(2008)、Yan et al., N. Eng. J. Med. 360, pp.765−773(2009))。IDH突然変異は神経膠腫の病因において中心的役割を果たし(Parsons et al, Science 321, pp.1807−1812(2008))、最初にRNA発現およびDNAメチル化パターンに基づいて同定された2つの主要神経膠腫サブグループを識別する重要な分類指標を構成することが証明されている。IDH1変異型(IDHmut)を示す脳腫瘍はIDH1が変異していない(IDHwt)脳腫瘍よりも良好な予後を有することが解明されている(Hartmann et al., Acta Neuropathol. 120, pp.707−718(2010))。
本発明者らは、IDHmut(IDH1−R132H突然変異を有する)とIDHwt脳腫瘍との1つの相違は、BCAT1過剰発現が最も一般的で最も攻撃的な成人脳腫瘍であるIDHwt神経膠芽腫の高度に特異的な特徴であることを見いだした。IDHmut腫瘍では観察されたがIDHwt腫瘍および正常脳では観察されなかったBCAT1プロモーター2の特異的メチル化は、IDHmut腫瘍における低BCAT1発現が、腫瘍代謝産物の2−ヒドロキシグルタレートである変異型IDH1およびIDH2酵素の産物によるヒストンデメチラーゼおよび5−メチルシトシンヒドロキシラーゼのTETファミリーの阻害を通して媒介されると考えられるIDH1突然変異関連性DNAメチル化の結果であることを証明している。興味深いことに、プロモーター1を起源とするBCAT1 mRNA発現の制御は、IDHwt腫瘍においてはHEY1転写レプレッサーのための結合部位のメチル化を通してIDH非依存性エピジェネティック機序によって達成されるが、IDHmut腫瘍においては達成されないようである。2つのプロモーターにおけるDNAメチル化のこれらの全く逆のパターンは、BCAT1抑制が「パッセンジャー」メチル化を通してのIDH1突然変異の単なる副産物として発生するのではなくむしろ、IDHwtおよびIDHmut腫瘍における細胞代謝の差次的制御には各群におけるBCAT1発現の厳密な制御を必要とすることを明らかにしている。
一般に使用される診断用IDH1−R132H染色に類似して、BCAT1染色はIDHwtをIDHmut神経膠腫から識別するために役立つ可能性があり、BCAT1染色はIDHwt原発性神経膠芽腫を非IDH1−R132H突然変異を備える10%近いIDHmut星状細胞腫から識別するという追加の利点も提供する。最も重要なことに、本発明は、BCAT1およびBCAA代謝が神経膠腫療法における新規な代謝に基づくアプローチを開発するための基礎を提供することを示している。
これは、IDHwt神経膠芽腫におけるBCAT1の抑制が腫瘍細胞増殖ならびに、周囲脳組織への神経毒性を頻回に誘発して脳腫瘍患者における腫瘍関連性てんかんを引き起こす腫瘍細胞によるグルタミン酸の排出を有意に妨害する能力を有することを意味する。
さらに、本発明のデータは、悪性細胞増殖を支持するために最も重要であると考えられる2つの栄養素であるグルコースおよびグルタミンの大量の利用可能性がIDHwt神経膠芽腫の持続性の高速増殖を支持するためには不十分であることを証明している。
これを言い換えると、本発明では、BCAT1過剰発現が神経膠芽腫、特にIDHwt神経膠芽腫の高度に特徴的な特性であり、それらの攻撃的な臨床挙動に必須であることが証明されている。そこで、BCAT1発現およびBCAA異化作用は、神経膠腫の診断的および予後的評価の有望なマーカーであり、新規治療標的として機能する。さらに、本発明は、神経膠腫の病理学的機序の中核を成す代謝遺伝子のIDH1突然変異関連性異常DNAメチル化によるサイレンシングによる最初の例を提示する。腫瘍成長の初期におけるBCAT1のサイレンシングは、IDHmut神経膠腫が代謝供給源としてBCAAを利用することを防止し、BCAT1−依存性IDHwt神経膠芽腫に比してIDHmut神経膠腫の悪性増殖挙動が小さいことを説明する。
生物学的活性の低減、サイレンシングまたは阻害は、ある化合物のBCAT1との直接的な相互作用もしくは結合によって、または間接的相互作用、例えばBCAT1の生物学的活性と関連する化合物との相互作用によって実行することができる。生物学的活性の低減もしくは阻害は、さらにまた変化した、例えばBCAT1の不活性形の、好ましくは過剰の適用によって達成することもできる。
治療作用を得る目的でBCAT1の生物学的活性またはBCAT1をコードする遺伝子の発現を低減、サイレンシングもしくは阻害する適切な化合物の例として以下のものが挙げられる。
(a)様々なタイプのプラスミド、ベクターもしくは天然/合成/突然変異ウイルス、改変オリゴヌクレオチド、例えば、PTO、LNA、2’F−ANA、タンパク質−ヌクレオチド複合体、RNAi、siRNAもしくはミクロmiRNA、shRNA、メチルメトキシ−、ホスホロアミド酸、PNA、モルホリノ、ホスホルアミデート、シクロヘキセン(CeNA)、ギャップ−mere、リボザイム、アプタマー、CpG−オリゴ、DNA−ザイム、リボスイッチ、または脂質もしくは脂質含有分子、(b)ペプチド、ペプチド複合体、全てのタイプのリンカーを含む、
(c)小分子、
(d)抗体およびそれらの誘導体、特に、キメラ、Fab−フラグメント、Fc−フラグメント、または、
(e)担体、リポソーム、ナノ粒子、複合体または上記に挙げた構築物を含有する任意の他の送達系、
(f)酸化剤またはスルフヒドリル(SH基)改変剤。
(c)小分子、
(d)抗体およびそれらの誘導体、特に、キメラ、Fab−フラグメント、Fc−フラグメント、または、
(e)担体、リポソーム、ナノ粒子、複合体または上記に挙げた構築物を含有する任意の他の送達系、
(f)酸化剤またはスルフヒドリル(SH基)改変剤。
本発明の目的に適したまた別の化合物およびそのような化合物を同定/選択する方法については以下でより詳細に記載する。
好ましくは、医薬組成物中では、上述したそのような化合物は薬学的に許容される担体と結合されている。「薬学的に許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される宿主にとって毒性ではないあらゆる担体を含むことが意図されている。適切な医薬担体の例は当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルジョン、例えば油/水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、慣習方法によって調製することができ、活性化合物を有効量で被験者に投与することができる。
「有効量」は、新生物の経過および重症度に影響を及ぼしてそのような病理の低減または寛解をもたらすのに十分である有効成分の量を意味する。新生物の治療および/または防止に有用な「有効量」は、当業者であれば公知の方法を使用して決定することができる(例えば、Fingl et al., The Pharmocological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., New York, pp.1−46(1975)を参照されたい)。
適切な組成物の投与は、様々な方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって実行することができる。投与経路は、当然ながら、療法の種類および該医薬組成物中に含有された化合物の種類に左右される。投与レジメンは、主治医および他の臨床因子によって決定されることになる。医療分野において周知であるように、任意の1人の患者のための用量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与すべき特定化合物、投与の時間および経路、療法の種類、全身健康状態および同時に投与される他の薬物を含む多数の因子に左右される。
当業者であれば、本発明の治療のために有用な化合物を、BCAT1のアミノ酸配列、およびこのタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列に関する知見に基づいて容易に同定または生成することができる。各配列は、UniProtKB/Swiss−Protデータベース(P54687、BCAT1_HUMAN)、Genbank(NCBI参照配列:NM_005504)およびヒト遺伝子解析機構の遺伝子命名法委員会(HGNC)データベース(HGNC ID:976)に見いだされる。
本発明のさらに好ましい実施形態では、BCAT1をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害するのに有用な化合物は、BCAT1に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、shRNAまたはsiRNAである。好ましくは、BCAT1発現をサイレンシングするのに有用な化合物は、ヒトBCAT1(BCAT1 shRNAI NM_005504.3−1064s1c1およびBCAT1 shRNAII NM_005504.3−751s1c1)ならびにヒトIDH1(IDH1 shRNAI NM_005896.2−1363s1c1およびIDH1 shRNAII NM_005896.2−292s1c1)mRNA転写産物の様々な領域を標的とする非依存性のMission(登録商標)shRNA構築物である。
適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドの生成には、所望の作用、例えば該タンパク質の発現の阻害が生じるようにアンチセンス相互作用のためのBCAT1コーディング遺伝子内の1つ以上の部位が発生するとの決定が含まれる。好ましい遺伝子内部位は、(a)該遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始もしくは停止コドンを含む領域、または(b)「ループ」もしくは「バルジ」である、つまり二次構造の一部ではないmRNAの1領域である。1つ以上の標的部位が同定されている場合は、該標的と十分に相補的である、つまり十分良好に、および十分な特異性でハイブリダイズして所望の作用を生じさせるオリゴヌクレオチドが選択される。本発明の状況では、「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であってよい、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の水素結合を意味する。本明細書で使用する「相補的」は、2つのヌクレオチド間の厳密な対合の能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドの所定の位置にあるヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の同一位置にあるヌクレオチドと水素結合可能な場合は、該オリゴヌクレオチドおよびDNAもしくはRNAは、その位置で相補的であると考えられる。該オリゴヌクレオチドおよびDNAもしくはRNAは、各分子内の十分な数の対応する位置が相互に水素結合を生成可能なヌクレオチドによって占有される場合に相補的である。そこで、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、該オリゴヌクレオチドおよびDNAもしくはRNA標的間で安定性および特異的結合が発生するように十分な程度の相補的もしくは厳密な対合を示すために使用される用語である。当該技術分野では、アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的核酸の配列に100%相補的である必要はないと理解されている。アンチセンス化合物は、標的DNAもしくはRNA分子への該化合物の結合が該標的DNAもしくはRNAの正常機能を妨害して有用性の消失を誘発し、特異的結合が所望である条件下で、つまり治療の場合、該アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
当業者であれば、本発明にしたがってBCAT1についての公知のDNA配列に基づいてアンチセンス化合物およびsiRNAまたはshRNAを生成することができる。
「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマーもしくはポリマーまたはそれらのミメティックを意味する。この用語には、天然型核酸塩基、糖および共有結合インターヌクレオシド(バックボーン)結合から成るオリゴヌクレオチドならびに同様に機能する非天然成分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような改変もしくは置換オリゴヌクレオチドは、望ましい特性、例えば増強された細胞取り込み、核酸標的に対する増強された親和性およびヌクレアーゼの存在下での増加した安定性のために天然型より好ましいことが多い。アンチセンスオリゴヌクレオチドは該アンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、例えば以下に記載するようなオリゴヌクレオチドミメティックを含むがそれらに限定されない他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明によるアンチセンス化合物は、約8〜約50個の核酸塩基(つまり、約8〜約50個の連結ヌクレオシド)を含んでいる。特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、いっそうより好ましくは約15〜約20個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物には、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)、オリゴヌクレオチド(オリゴザイム)、ならびに標的核酸にハイブリダイズしてその発現を阻害する他の短鎖触媒性RNAまたは触媒性オリゴヌクレオチドが含まれる。
または、本発明の化合物は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば哺乳動物宿主内で転写することを可能にするベクターである。好ましくは、そのようなベクターは、遺伝子治療に有用なベクターである。遺伝子治療に有用な好ましいベクターは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはより好ましくはRNAウイルス、例えばレトロウイルスである。いっそうより好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたは鳥類レトロウイルスの誘導体である。本発明において使用可能なそのようなレトロウイルスベクターの例として:モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV)が挙げられる。最も好ましくは、例えば、マウスベクターに比較してより広い宿主範囲を提供するテナガザル白血病ウイルス(GaLV)などの非ヒト霊長類レトロウイルスベクターが使用される。組換え型レトロウイルスは不完全であるので、感染粒子を生成するためには支援が必要とされる。そのような支援は、例えばLTR内の制御配列の制御下で該レトロウイルスの構造遺伝子全部をコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を使用することによって提供することができる。適切なヘルパー細胞系は、当業者に周知である。前記ベクターは、形質導入細胞を同定することができるように選択可能なマーカーをコードする遺伝子を追加して含有することができる。さらに、レトロウイルスベクターは、それらが標的に特異的になるような方法で改変できる。これは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質、好ましくは抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって達成することができる。当業者に、標的特異的ベクターを生成する追加の方法は公知である。さらにin vitroまたはin vivo遺伝子療法に適したベクターおよび方法は文献に記載されており、当業者に公知である。例えば国際公開第94/29469号または同第97/00957号を参照されたい。
標的器官、例えば脳腫瘍においてのみ発現を達成するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを転写するためのDNA配列を組織特異的プロモーターに結合させて遺伝子療法に使用することができる。そのようなプロモーターは、当業者に周知である(例えば、Zimmermann et al., (1994)Neuron 12, 11−24、Vidal et al., (1990)EMBO J. 9, 833− 840、Mayford et al., (1995), Cell 81, 891−904、Pinkert et al., (1987)Genes & Dev. 1, 268−76を参照されたい)。
オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は、一般に該オリゴヌクレオチドのインターヌクレオシドバックボーンを形成すると言われている。RNAおよびDNAの正常結合またはバックボーンは、3’〜5’ホスホジエステル結合である。本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、改変バックボーンまたは非天然インターヌクレオシド結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。改変バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、該バックボーン内のリン原子を保持するオリゴヌクレオチドおよび該バックボーン内にリン原子を有していないオリゴヌクレオチドが含まれる。安定性を増すことのできる改変オリゴヌクレオチドバックボーンは当業者に公知であり、好ましくは、そのような改変はホスホロチオエート結合である。
好ましいオリゴヌクレオチドミメティックは、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが証明されており、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれているオリゴヌクレオチドミメティックである。PNA化合物では、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンはアミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンと置換されている。核酸塩基は保持され、該バックボーンのアミド成分のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている(例えば、Nielsen et al., Science 254(1991), 1497−1500を参照されたい)。
改変オリゴヌクレオチドは、さらに1つ以上の置換もしくは改変糖成分を含有することができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位置で以下の内の1つを含んでいる。OH;F;O−、S−、もしくはN−アルキル;O−、S−、もしくはN−アルケニル;O−、S−もしくはN−アルキニル;またはO−アルキル−O−アルキル(式中、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは未置換C1〜C10アルキルもしくはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルであってよい)。特に好ましい改変糖成分は、2’−O−メトキシエチル糖成分である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸塩基の改変または置換をさらに含むことができる。改変核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基、例えば5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、6−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシンなどが含まれ、核酸二本鎖安定性を増すことが証明されているため、5−メチルシトシン置換が好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドのまた別の改変は、該オリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する1つ以上の成分もしくはコンジュゲートと化学結合させる工程を含んでいる。そのような成分には、脂質成分、例えばコレステロール成分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分が含まれる。
本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物をさらに含んでいる。本発明との関連における「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、アンチセンス化合物、特に各々が少なくとも1つのモノマー単位、つまりオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから作られている、2つ以上の化学的に別個の領域を含有するオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも1つの領域を含有し、該オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取り込み、および/または標的核酸に対する増加した結合親和性を付与することができるように改変される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを開裂させることのできる酵素のための基質として機能することができる。一例として、RNase Hは、RNA:DNA二本鎖のRNAストランドを開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。このためRNase Hの活性化は、結果としてRNA標的の開裂を生じさせ、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大幅に高める。結果として、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラオリゴヌクレオチドが使用された場合にはより短いオリゴヌクレオチドを用いて匹敵する結果を得られることが多い。本発明のキメラアンチセンス化合物は、上述した2つ以上のオリゴヌクレオチド、改変オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および/またはオリゴヌクレオチドミメティックの複合構造として形成することができる。そのような化合物は、当該技術分野においてはハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれてきた。
本発明のさらに好ましい実施形態では、新生物を治療する方法において使用するための化合物は、BCAT1の生物学的活性を低減もしくは阻害する化合物である。
そのような化合物は本発明の適応とは異なる医学的適応の分野で記載があり、好ましくは例えば1−(アミノメチル)シクロヘキサン酢酸(ガバペンチン)またはGoto et al., The Journal of Biological Chemistry 280(44)(2005), 37246−56、Hu et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16(2006), 2337−40、Caballero et al., Molecular Diversity 13(2009), 493−500、米国特許第6,632,831号明細書、同第6,809,119号明細書および欧州特許第11157000(B)号明細書に記載された化合物を含んでいる。
BCAT1の生物学的活性を低減もしくは阻害することのできる化合物また別の例として、BCAT1に対して向けられた(中和)抗体または実質的に同一の結合特異性を有するそれらのフラグメントが挙げられる。用語「抗体」は、好ましくは様々なエピトープ特異性を備えるプールされたモノクローナル抗体から実質的に成る抗体ならびに別個のモノクローナル抗体調製物を意味する。モノクローナル抗体は、例えば、当業者には周知の方法によってBCAT1のフラグメントを含有する抗原から作成される(例えば、Kohler et al., Nature 256(1975), 495を参照されたい)。本明細書で使用する用語「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(Mab)は、タンパク質に特異的に結合可能な完全な分子ならびに抗体フラグメント(例えば、FabおよびF(ab’)2フラグメント)を含むことが意図されている。FabおよびF(ab’)2フラグメントには完全な抗体のFcフラグメントが欠けており、循環からより迅速に排出され、完全な抗体より非特異的組織結合が少ない可能性がある(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316−325(1983))。そこで、これらのフラグメント、ならびにFABまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明のために有用な抗体には、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体が含まれる。
または、本発明のために好ましい化合物は、BCAT1の不活性種または上述したアプローチ/ベクターにしたがって導入可能なBCAT1の不活性種をコードする核酸配列である。そのような不活性種は、突然変異生成の周知の方法にしたがって生成することができる。そのような化合物は、ヒト身体においてそれらの機能的に活性の対応物と置き換えることによって、特に過剰に適用された場合に治療作用を有することができる。BCAT1の潜在的不活性種の分析は、分枝鎖L−アミノ酸から分枝鎖α−ケト酸への(可逆性)アミノ基転移をアッセイすることによって、例えばグルタミン酸の産生を決定することによって実施することができる。適切なアッセイは、文献ならびに米国特許第6,809,119号明細書の実施例39、Hu et al.(2006)、および欧州特許第11157000(B)号明細書に記載されている。
本発明の好ましい実施形態では、上記で詳細に記載した化合物は、星状細胞系脳腫瘍または神経膠芽腫を治療する方法において使用される。
本発明は、BCAT1の生物学的活性および/またはその発現を低減もしくは阻害する化合物を同定する方法であって、
(a)候補化合物をBCAT1もしくはその遺伝子を含む試験系とともにインキュベートする工程と、
(b)BCAT1の生物学的活性をアッセイする工程を含む方法であって、
好ましくは前記試験化合物の非存在下における試験系と比較したBCAT1の生物学的活性の阻害もしくは消失が、所望の特性を有する候補化合物の存在を表示する方法にさらに関する。
(a)候補化合物をBCAT1もしくはその遺伝子を含む試験系とともにインキュベートする工程と、
(b)BCAT1の生物学的活性をアッセイする工程を含む方法であって、
好ましくは前記試験化合物の非存在下における試験系と比較したBCAT1の生物学的活性の阻害もしくは消失が、所望の特性を有する候補化合物の存在を表示する方法にさらに関する。
工程(b)は、上述したアッセイを使用して分枝鎖L−アミノ酸から分枝鎖α−ケト酸への(可逆性)アミノ基転移をアッセイすることによって実施することができる。
そのような候補分子の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質、または小分子が含まれる。そのような分子は、公知の技術を使用して合理的に設計することができる。
好ましくは、スクリーニングに使用される前記試験系は、類似の化学的および/または物理的特性の物質を含んでおり、最も好ましくは、前記物質はほぼ同一である。本発明の使用にしたがって調製および同定可能な化合物は、発現ライブラリー、例えばcDNA発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、低分子有機化合物、リガンド、ホルモン、ペプチドミメティック、PNAなどであってよい。
国際公開第98/25146号パンフレットは、所望の特性、特にポリペプチドまたはその細胞受容体を作動、結合、または拮抗する能力を有する化合物について複合体のライブラリーをスクリーニングする方法をさらに記載している。そのようなライブラリー内の複合体は、試験下の化合物、該化合物の合成における少なくとも1つの工程を記録しているタグ、およびレポーター分子による改変を受けやすいテザーを含んでいる。テザーの改変は、複合体が所望の特性を有する化合物を含有することを明示するために使用される。タグは、そのような化合物の合成における少なくとも1つの工程を解明するために解読することができる。BCAT1またはそのような分子をコードする核酸分子と相互作用する化合物を同定する他の方法は、例えば、ファージディスプレイシステムを用いたin vitroスクリーニングならびにフィルター結合アッセイまたは相互作用の「リアルタイム」測定である。
当業者には、例えばBCAT1にとっての基質またはリガンドとして作用することができる低分子有機化合物のミメティックを設計、合成および評価可能であることも周知である。例えば、ハパロシンのD−グルコースミメティックが細胞毒性における多剤耐性支援関連タンパク質に拮抗する際、ハパロシンと類似の有効性を示すことが記載されている。Dinh, J. Med. Chem. 41(1998), 981−987を参照されたい。
これらの方法は全て、本発明にしたがって、BCAT1の生物学的活性またはその発現を低減もしくは阻害する化合物を同定するために使用することができる。
BCAT1をコードする遺伝子もまた、阻害剤をスクリーニングするための標的として機能することができる。阻害剤は、例えば、BCAT1をコードする遺伝子のmRNAに結合することにより該mRNAの未変性コンフォメーションを不安定化させ、転写および/または翻訳を妨害するタンパク質を含むことができる。さらに、文献は核酸分子、例えば結果として細胞増殖もしくは細胞死の遅延を生じさせる細胞内部でそれに化合物が結合する規定もしくは未規定標的RNA分子の構造を模擬するRNAフラグメントを同定する方法が記載されている。例えば国際公開第98/18947号パンフレットおよびそこで言及された参考文献を参照されたい。これらの核酸分子は、興味深い未知の医薬化合物を同定するため、および疾患を治療する際に使用する未知のRNA標的を同定するために使用することができる。これらの方法および組成物は、BCAT1の発現レベルを低下させるのに有用な化合物を同定するために使用することができる。
本発明の方法にしたがって試験および同定可能な化合物は、発現ライブラリー、例えばcDNA発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、低分子有機化合物、ホルモン、ペプチドミメティック、PNAなどであってよい(Milner, Nature Medicine 1(1995), 879−880、Hupp, Cell 83(1995), 237−245、Gibbs, Cell 79(1994), 193−198および上記で言及した参考文献)。さらに、BCAT1の推定制御因子をコードする、および/またはBCAT1の上流または下流でそれらの作用を発揮する遺伝子は、例えば、当該技術分野において公知の遺伝子ターゲティングベクターを使用する挿入突然変異生成を使用して同定することができる。前記化合物は、さらにまた公知の阻害剤の機能的誘導体またはアナログであってよい。そのような有用な化合物は、例えば、BCAT1に結合するトランス作用因子またはそれをコードする遺伝子の制御配列であってよい。トランス作用因子の同定は、当該技術分野における標準方法を使用して実施することができる。タンパク質がタンパク質自体または制御配列に結合するかどうかを決定するためには、標準天然ゲルシフト分析を実施することができる。タンパク質もしくは制御配列に結合するトランス作用因子を同定するために、該タンパク質もしくは制御配列は、標準タンパク質精製法における親和性試薬として、または発現ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用することができる。BCAT1と相互作用するポリペプチドをコードする核酸分子の同定は、例えばScofield(Science 274(1996), 2063−2065)に記載されているように、いわゆる酵母「ツーハイブリッドシステム」の使用によっても達成することができる。このシステムでは、BCAT1は、GAL4転写因子のDNA結合ドメインに結合している。この融合ポリペプチドを発現する、およびGAL4転写因子によって認識される適切なプロモーターによって駆動されるlacZレポーター遺伝子を含む酵母菌株は、活性化ドメインに融合した植物タンパク質またはそのペプチドを発現するcDNAのライブラリーを用いて形質転換される。そこで、cDNAの1つによってコードされるペプチドがBCAT1のペプチドを含む融合ペプチドと相互作用可能な場合、該複合体はレポーター遺伝子の発現を指令することができる。この方法で、BCAT1およびBCAT1をコードする遺伝子は、BCAT1と相互作用するペプチドおよびタンパク質を同定するために使用することができる。当業者には、次に阻害剤を同定するためにこれや類似のシステムを利用可能なことが明白である。
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するが、本発明を制限するものとは見なされない。
(実施例1)
一般的方法
(a)RNA単離および定量的リアルタイムPCR(qRT−PCR)
AllPrep DNA/RNA/タンパク質ミニキット(Qiagen社)を製造業者の指示にしたがって使用し、全RNAを抽出した。Ambion社製FirstChoice(登録商標)ヒト脳参照全RNAが正常脳RNAプールとして機能した(n=ドナー23例)。製造業者の指示にしたがってランダムプライマーおよびsuperscript II(Invitrogen社(独国カールスルーエ))を使用し、全RNA(500ng)を逆転写させた。贈呈された各DNAサンプルはApplied Biosystems社製Prism 7900HT高速リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社(米国カリフォルニア州フォスターシティ))を用いてAbsolute SYBR Green ROX Mix(ABgene社(英国エプソム))を使用して3回ずつ分析した。特異的mRNAの相対量をARF、B2MおよびTBPへ基準化した。プライマー配列は、以下の表1Aに表示した。
一般的方法
(a)RNA単離および定量的リアルタイムPCR(qRT−PCR)
AllPrep DNA/RNA/タンパク質ミニキット(Qiagen社)を製造業者の指示にしたがって使用し、全RNAを抽出した。Ambion社製FirstChoice(登録商標)ヒト脳参照全RNAが正常脳RNAプールとして機能した(n=ドナー23例)。製造業者の指示にしたがってランダムプライマーおよびsuperscript II(Invitrogen社(独国カールスルーエ))を使用し、全RNA(500ng)を逆転写させた。贈呈された各DNAサンプルはApplied Biosystems社製Prism 7900HT高速リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社(米国カリフォルニア州フォスターシティ))を用いてAbsolute SYBR Green ROX Mix(ABgene社(英国エプソム))を使用して3回ずつ分析した。特異的mRNAの相対量をARF、B2MおよびTBPへ基準化した。プライマー配列は、以下の表1Aに表示した。
(b)ウェスタンブロット分析
ヒト組織の使用を含む全実験は、ハインリッヒ・ハイネ大学デュッセルドルフの医学部治験審査委員会のガイドラインを遵守して実施した。新鮮な冷凍ヒト腫瘍組織サンプルおよび非新生物脳組織サンプルは、ULTRA−TURRAX(IKA社(独国シュタウフェン))を用いてグアニジンイソチオシアネート溶液(4M)中に溶解させ、CsCl−超遠心分離にかけた。得られたタンパク質分画の透析濾過は、基本的には記載されたように45Amicon Ultra−0.5遠心濾過装置(Millipore社(独国シュヴァルバッハ)、3kDaカットオフ)を使用して実施した。細胞系の全タンパク質は、AllPrep DNA/RNA/タンパク質ミニキット(Qiagen社)を使用して抽出した。10μgのタンパク質を10% SDS−PAGEによって分離し、PVDF膜(Millipore社)へ移した。膜をブロッキング溶液(TBS中5% BSA、0.1% Tween 20)中でブロックし、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体は室温で1時間インキュベートし、その後タンパク質の化学発光検出を実施した(ECLキット、GE Healthcare社(英国リトルチャルフォント))。
ヒト組織の使用を含む全実験は、ハインリッヒ・ハイネ大学デュッセルドルフの医学部治験審査委員会のガイドラインを遵守して実施した。新鮮な冷凍ヒト腫瘍組織サンプルおよび非新生物脳組織サンプルは、ULTRA−TURRAX(IKA社(独国シュタウフェン))を用いてグアニジンイソチオシアネート溶液(4M)中に溶解させ、CsCl−超遠心分離にかけた。得られたタンパク質分画の透析濾過は、基本的には記載されたように45Amicon Ultra−0.5遠心濾過装置(Millipore社(独国シュヴァルバッハ)、3kDaカットオフ)を使用して実施した。細胞系の全タンパク質は、AllPrep DNA/RNA/タンパク質ミニキット(Qiagen社)を使用して抽出した。10μgのタンパク質を10% SDS−PAGEによって分離し、PVDF膜(Millipore社)へ移した。膜をブロッキング溶液(TBS中5% BSA、0.1% Tween 20)中でブロックし、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体は室温で1時間インキュベートし、その後タンパク質の化学発光検出を実施した(ECLキット、GE Healthcare社(英国リトルチャルフォント))。
以下の抗体を使用した。α−チューブリンに対するマウスモノクローナル抗体(1:2000、#T9026、Sigma−Aldrich社(米国ミズーリ州63178セントルイス))、BCAT1に対するマウスモノクローナル抗体(1:2000、ECA39、クローン51、#611270、BD Biosciences社(米国カリフォルニア州サンノゼ))、IDH1に対するラットモノクローナル抗血清(1:1、A. von Deimling、DKFZ(ドイツ癌研究センター)より提供(独国ハイデルベルク)、Dianova社(独国ハンブルク)より市販)、HADHSCに対するマウスモノクローナル抗体(1:500、#H00003033−M01、Abnova社)、CDKN1Bに対するウサギモノクローナル抗体(1:1000、p27 Kipl、#3686、Cell Signaling Technology社)、Aktに対するウサギモノクローナル抗体(1:1000、#9272、Cell Signaling Technology社)、ホスホ−Aktに対するウサギモノクローナル抗体(Ser473)(1:1000、#193H12、Cell Signaling Technology社)、p70 S6キナーゼに対するウサギポリクローナル抗体(1:1000、#9202、Cell Signaling Technology社)、ホスホ−p70 S6キナーゼに対するウサギポリクローナル抗体(Thr389)(1:1000、#9205、Cell Signaling Technology社)、HRP結合抗ラットIgG(1:10000、A. von Deimling、DKFZより提供(独国ハイデルベルク))、HRP結合ウマ抗マウスIgG(1:5000、#7076、Cell Signaling Technology社)、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(1:2000、#7074、Cell Signaling Technology社)。
(c)免疫組織化学的染色
腫瘍切片はキシロールを用いて脱パラフィンし、エタノールの濃度を低下させながら再水和させた。抗原性賦活化処理は、スチーマー内の10mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH6.0)中で40分間加熱することによって実施した。内因性ペルオキシダーゼは、3%過酸化水素中で該腫瘍切片をインキュベートすることによって不活性化した。切片は、一次抗BCAT1(ECA39)マウスモノクローナル抗体、1:500に希釈したクローン51(BD Biosciences社(カリフォルニア州サンノゼ))またはDako REAL(商標)抗体希釈液(Dako社(デンマーク国グロストルップ))中に1:20で希釈したマウス抗ヒトIDH1 R132H抗体(Dianova社(独国ハンブルク))とともに一晩インキュベートした。結合抗体を検出するための染色は、標準プロトコールにしたがってEnVision(商標)検出システム(ペルオキシダーゼ/DAB+、ウサギ/マウス)(Dako社(デンマーク国グロストルップ))を使用して実施し、その後の対比染色はヘマトキシリンを使用して実施した。
腫瘍切片はキシロールを用いて脱パラフィンし、エタノールの濃度を低下させながら再水和させた。抗原性賦活化処理は、スチーマー内の10mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH6.0)中で40分間加熱することによって実施した。内因性ペルオキシダーゼは、3%過酸化水素中で該腫瘍切片をインキュベートすることによって不活性化した。切片は、一次抗BCAT1(ECA39)マウスモノクローナル抗体、1:500に希釈したクローン51(BD Biosciences社(カリフォルニア州サンノゼ))またはDako REAL(商標)抗体希釈液(Dako社(デンマーク国グロストルップ))中に1:20で希釈したマウス抗ヒトIDH1 R132H抗体(Dianova社(独国ハンブルク))とともに一晩インキュベートした。結合抗体を検出するための染色は、標準プロトコールにしたがってEnVision(商標)検出システム(ペルオキシダーゼ/DAB+、ウサギ/マウス)(Dako社(デンマーク国グロストルップ))を使用して実施し、その後の対比染色はヘマトキシリンを使用して実施した。
(d)DNAメチル化分析
DNAメチル化は、MassARRAY技術によって分析した。つまり、500ngのゲノムDNAは、製造業者の指示にしたがってEZメチル化キット(Zymo Research社)を使用して亜硫酸水素ナトリウムを用いて化学的に改変した。亜硫酸水素処理したDNAは、BCAT1転写産物1(T1、ENST00000261192)のTSSの周囲で−990bp〜+612bpの4つのアンプリコン(A1〜A4)およびBCAT1転写産物4(T4、ENST00000539282)および6(T6、ENST00000538118)のプロモーターの−198bp〜+63bpの3つのアンプリコン(A5〜A7)を生成するプライマーを用いてPCR増幅させた。これらのアンプリコンは、T7ポリメラーゼにより転写させ、その後、T特異的−RNAaseA切断を実施した。消化したフラグメントは、質量分析法により定量した。プライマー配列は、以下の表1Bに表示した。DNAメチル化標準物質(0%、20%、40%、60%、80%、および100%メチル化ゲノムDNA)を使用して、該アンプリコンの不偏の増幅を確証した。
DNAメチル化は、MassARRAY技術によって分析した。つまり、500ngのゲノムDNAは、製造業者の指示にしたがってEZメチル化キット(Zymo Research社)を使用して亜硫酸水素ナトリウムを用いて化学的に改変した。亜硫酸水素処理したDNAは、BCAT1転写産物1(T1、ENST00000261192)のTSSの周囲で−990bp〜+612bpの4つのアンプリコン(A1〜A4)およびBCAT1転写産物4(T4、ENST00000539282)および6(T6、ENST00000538118)のプロモーターの−198bp〜+63bpの3つのアンプリコン(A5〜A7)を生成するプライマーを用いてPCR増幅させた。これらのアンプリコンは、T7ポリメラーゼにより転写させ、その後、T特異的−RNAaseA切断を実施した。消化したフラグメントは、質量分析法により定量した。プライマー配列は、以下の表1Bに表示した。DNAメチル化標準物質(0%、20%、40%、60%、80%、および100%メチル化ゲノムDNA)を使用して、該アンプリコンの不偏の増幅を確証した。
(e)細胞培養
ヒト神経膠腫細胞系U−87MG(HTB−14)、LN−229(CRL−2611)、Hs683(HTB−138)およびU−373MG(HTB−17)は、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンミックスを補給したダルベッコの最小必須培地(DMEM)中で培養した。細胞系は、ショート・タンデム・リピート(STR)分析によって真正であることが証明された。脳腫瘍幹様細胞NCH421kはハイデルベルク大学医学部で施設内審査委員会によって承認された研究提案書にしたがって外科的切除を受けた患者の原発性神経膠芽腫から樹立された。これらは、以前の試験において遺伝子型および表現型にしたがって特徴付けられた(Campos, B., et al. Differentiation therapy exerts antitumor effects on stem−like glioma cells. Clin Cancer Res 16, 2715−2728(2010))。NCH421k細胞は、各々20ng/mLの濃度で20% BIT無血清補給液、塩基性線維芽細胞増殖因子および上皮成長因子(全てProvitro社(独国ベルリン))を含有するDMEM/F−12培地中の未被覆の組織培養皿上の浮遊凝集体(ニューロスフェア)として増殖させた。HEK293TおよびHEK293細胞は、抗生物質を含まない10%ウシ胎児血清を含有するDMEM中の単層培養として維持した。
ヒト神経膠腫細胞系U−87MG(HTB−14)、LN−229(CRL−2611)、Hs683(HTB−138)およびU−373MG(HTB−17)は、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンミックスを補給したダルベッコの最小必須培地(DMEM)中で培養した。細胞系は、ショート・タンデム・リピート(STR)分析によって真正であることが証明された。脳腫瘍幹様細胞NCH421kはハイデルベルク大学医学部で施設内審査委員会によって承認された研究提案書にしたがって外科的切除を受けた患者の原発性神経膠芽腫から樹立された。これらは、以前の試験において遺伝子型および表現型にしたがって特徴付けられた(Campos, B., et al. Differentiation therapy exerts antitumor effects on stem−like glioma cells. Clin Cancer Res 16, 2715−2728(2010))。NCH421k細胞は、各々20ng/mLの濃度で20% BIT無血清補給液、塩基性線維芽細胞増殖因子および上皮成長因子(全てProvitro社(独国ベルリン))を含有するDMEM/F−12培地中の未被覆の組織培養皿上の浮遊凝集体(ニューロスフェア)として増殖させた。HEK293TおよびHEK293細胞は、抗生物質を含まない10%ウシ胎児血清を含有するDMEM中の単層培養として維持した。
全細胞系は、5% CO2を含む37℃の加湿インキュベーター内で培養した。低酸素実験のために、細胞は窒素供給C16低酸素インキュベーター(Labotect社(独国ゲッティンゲン))内の1% O2で培養した。
(f)クロマチン免疫沈降法(ChIP)
ChIPは、フラグでタグされたHEY1を過剰発現するHEK293細胞上で実施したが、これは現在入手可能なHEY1に対する抗体がChIPアッセイに特異的ではないためである。HEY1過剰発現のための構築物は、FLAG、pDest26(C末端タグ)およびpDest11(N−末端タグ)でタグされたゲートウェイ適合(gateway compatible)ベクターを用いて調製した。1μgのコントロールベクターもしくはHEY1発現ベクターいずれかをわずかに修正を加えた製造業者の指示にしたがってTransIT(登録商標)−LT1(Mirus Bio LLC社(米国ワイオミング州53711マディソン))を使用して15cmプレート当たり2.5×106個のHEK293細胞中にトランスフェクトした。2枚の培養皿由来の細胞は、トランスフェクション48時間後に採取した。クロマチンは、製造業者のプロトコール(Covaris社)にしたがってCovaris S2を含む非イオン性剪断バッファーを用いて調製した。ChIPは、抗FLAG抗体(Cell signaling #2368)を使用して実施した。ChIP後に回収したDNAはコントロールとして機能するインプットクロマチンおよび模擬免疫沈降(抗IgG抗体、Diagenode社、Kch−803−015)を用いるqRT−PCRのために使用した。qRT−PCRは、表2に列挙したプライマーを使用してSYBRグリーン検出法を用いて3回ずつ実施した。インプットシグナルに対する結合の比率を報告した。
ChIPは、フラグでタグされたHEY1を過剰発現するHEK293細胞上で実施したが、これは現在入手可能なHEY1に対する抗体がChIPアッセイに特異的ではないためである。HEY1過剰発現のための構築物は、FLAG、pDest26(C末端タグ)およびpDest11(N−末端タグ)でタグされたゲートウェイ適合(gateway compatible)ベクターを用いて調製した。1μgのコントロールベクターもしくはHEY1発現ベクターいずれかをわずかに修正を加えた製造業者の指示にしたがってTransIT(登録商標)−LT1(Mirus Bio LLC社(米国ワイオミング州53711マディソン))を使用して15cmプレート当たり2.5×106個のHEK293細胞中にトランスフェクトした。2枚の培養皿由来の細胞は、トランスフェクション48時間後に採取した。クロマチンは、製造業者のプロトコール(Covaris社)にしたがってCovaris S2を含む非イオン性剪断バッファーを用いて調製した。ChIPは、抗FLAG抗体(Cell signaling #2368)を使用して実施した。ChIP後に回収したDNAはコントロールとして機能するインプットクロマチンおよび模擬免疫沈降(抗IgG抗体、Diagenode社、Kch−803−015)を用いるqRT−PCRのために使用した。qRT−PCRは、表2に列挙したプライマーを使用してSYBRグリーン検出法を用いて3回ずつ実施した。インプットシグナルに対する結合の比率を報告した。
(g)siRNAの一過性トランスフェクション
HEK293T細胞は、わずかな改変を加えた製造業者の指示(Dharmacon社)にしたがってDhamaFect1を用いて、Ambion社(HEY1、s23868−70)またはDharmacon社(コントロール非ターゲティング:D−001810−10)のsiRNA二本鎖を使用してトランスフェクトした。つまり、各siRNAプールは、1×siRNAバッファー(Dharmacon社)中に希釈し、RPMIと混合し、96ウエルプレートの6ウエル内に分配した。1.2×104個のHEK293または9×103個のHEK293T細胞は、siRNA/DharmaFECT混合物の上部に播種した(最終的な容量は150μL/ウエルおよび20nMのsiRNAであった)。37℃での48時間のインキュベーション後、RNAをその後の分析のためにウエルから単離した。
HEK293T細胞は、わずかな改変を加えた製造業者の指示(Dharmacon社)にしたがってDhamaFect1を用いて、Ambion社(HEY1、s23868−70)またはDharmacon社(コントロール非ターゲティング:D−001810−10)のsiRNA二本鎖を使用してトランスフェクトした。つまり、各siRNAプールは、1×siRNAバッファー(Dharmacon社)中に希釈し、RPMIと混合し、96ウエルプレートの6ウエル内に分配した。1.2×104個のHEK293または9×103個のHEK293T細胞は、siRNA/DharmaFECT混合物の上部に播種した(最終的な容量は150μL/ウエルおよび20nMのsiRNAであった)。37℃での48時間のインキュベーション後、RNAをその後の分析のためにウエルから単離した。
(h)ウイルスの産生および形質導入
レンチウイルスベクターは、HEK293T細胞のpsPAX2(Addgene 12260、Didier Trono社、パッケージングベクター)、pMD2.G(Addgene 12259、Didier Trono社、エンベローププラスミド)、およびpLKO.1 shRNA構築物(Sigma−Aldrich社)とのコトランスフェクションによって生成した。トランスフェクションは、TransIT(登録商標)−LT1(Mirus Bio LLC社)を使用して実施し、ウイルスはトランスフェクション48および72時間後に採取して結合させた。
レンチウイルスベクターは、HEK293T細胞のpsPAX2(Addgene 12260、Didier Trono社、パッケージングベクター)、pMD2.G(Addgene 12259、Didier Trono社、エンベローププラスミド)、およびpLKO.1 shRNA構築物(Sigma−Aldrich社)とのコトランスフェクションによって生成した。トランスフェクションは、TransIT(登録商標)−LT1(Mirus Bio LLC社)を使用して実施し、ウイルスはトランスフェクション48および72時間後に採取して結合させた。
M.O.I.が2であるウイルスを用いた神経膠腫細胞の感染は、8μg/mLのポリブレン(Chemicon社(米国マサチューセッツ州ビルリカ))の存在下で実施した。ウイルス含有上清を24時間後に取り出し、細胞は形質導入第3日、第5日および第7日に分割した。ヒトBCAT1(BCAT1 shRNAI NM_005504.3−1064s1c1およびBCAT1 shRNAII NM_005504.3−751s1c1)ならびにヒトIDH1(IDH1 shRNAI NM_005896.2−1363s1c1およびIDH1 shRNAII NM_005896.2−292s1c1)mRNA転写産物の様々な領域を標的とする2つの非依存性のMission(登録商標)shRNA構築物を使用した。非ターゲティングshRNA(Mission SHC002)をコントロールとして使用した。BCAT1およびIDH1ノックダウンの定量は、定量的リアルタイムPCRおよびウェスタンブロットによって評価した。
(i)ジメチル−α−ケトグルタル酸およびガバペンチンを用いた処理
5×104細胞/ウエルは、総量500μLの細胞培養培地で24ウエルプレート内へ播種した。培地を細胞の播種16時間後に取り除き、5mMもしくは10mMのジメチル−α−ケトグルタル酸(ジメチル2−オキソグルタレート、Sigma−Aldrich社)または5mM、10mMもしくは20mMのガバペンチン(1−(アミノメチル)−シクロヘキサン、Sigma−Aldrich社)を含有する500μLの培地と交換した。対応する量の200mM HEPESバッファー(pH7.4)を各コントロールウエルに加えた。
5×104細胞/ウエルは、総量500μLの細胞培養培地で24ウエルプレート内へ播種した。培地を細胞の播種16時間後に取り除き、5mMもしくは10mMのジメチル−α−ケトグルタル酸(ジメチル2−オキソグルタレート、Sigma−Aldrich社)または5mM、10mMもしくは20mMのガバペンチン(1−(アミノメチル)−シクロヘキサン、Sigma−Aldrich社)を含有する500μLの培地と交換した。対応する量の200mM HEPESバッファー(pH7.4)を各コントロールウエルに加えた。
(j)細胞周期分析およびアポトーシスの検出
細胞周期分析は、ガバペンチンを用いた処理の20時間後およびレンチウイルス形質導入の6日後に実施した。ニコレッティバッファー(0.1%のクエン酸ナトリウム(pH7.4)、0.05% Triton X−100、50μg/mLのヨウ化プロピジウム)を、死細胞および生細胞両方を含有するウエルに加えた。4℃の暗所に4時間置いた後、DNA含量をFACS Canto II(BD Biosciences社(米国カリフォルニア州サンノゼ))を用いるフローサイトメトリーによって分析した。FACS Divaソフトウエアを使用して各細胞周期段階、sub−G1(死細胞)、G1、S、およびG2/M期内の細胞の分布を定量した。レンチウイルスノックダウン後のアポトーシス活性を調査するために、NCH421k細胞をアネキシンV−PE(フィコエリトリン)および7−AAD(7−アミノアクチノマイシンD、BD Biosciences社)とともに暗所で15分間インキュベートし、直後にフローサイトメトリーを実施した。
細胞周期分析は、ガバペンチンを用いた処理の20時間後およびレンチウイルス形質導入の6日後に実施した。ニコレッティバッファー(0.1%のクエン酸ナトリウム(pH7.4)、0.05% Triton X−100、50μg/mLのヨウ化プロピジウム)を、死細胞および生細胞両方を含有するウエルに加えた。4℃の暗所に4時間置いた後、DNA含量をFACS Canto II(BD Biosciences社(米国カリフォルニア州サンノゼ))を用いるフローサイトメトリーによって分析した。FACS Divaソフトウエアを使用して各細胞周期段階、sub−G1(死細胞)、G1、S、およびG2/M期内の細胞の分布を定量した。レンチウイルスノックダウン後のアポトーシス活性を調査するために、NCH421k細胞をアネキシンV−PE(フィコエリトリン)および7−AAD(7−アミノアクチノマイシンD、BD Biosciences社)とともに暗所で15分間インキュベートし、直後にフローサイトメトリーを実施した。
(k)増殖分析
ガバペンチン処理後またはレンチウイルスノックダウン後の神経膠腫細胞の増殖を評価するために、Click−iT(登録商標)EdU細胞増殖アッセイ(Invitrogen社(独国カールスルーエ))を製造業者の指示にしたがって使用した。細胞は、10μMのヌクレオシドアナログEdU(5−エチニル−2’デオキシウリジン)とともに16時間インキュベートした。EdUを取り込んだ細胞の定量は、FACS Canto II(BD Biosciences社)を用いて実施した。
ガバペンチン処理後またはレンチウイルスノックダウン後の神経膠腫細胞の増殖を評価するために、Click−iT(登録商標)EdU細胞増殖アッセイ(Invitrogen社(独国カールスルーエ))を製造業者の指示にしたがって使用した。細胞は、10μMのヌクレオシドアナログEdU(5−エチニル−2’デオキシウリジン)とともに16時間インキュベートした。EdUを取り込んだ細胞の定量は、FACS Canto II(BD Biosciences社)を用いて実施した。
(l)グルタミン酸の定量
ガバペンチンにより処理した細胞の上清中のグルタミン酸の濃度は、グルタミン/グルタミン酸測定キット(GLN−1、Sigma−Aldrich社)を製造業者の指示にしたがって使用し測定した。反応容量は総量100μLに縮小し、吸光度はTecan Infinite M200プレートリーダー(Tecan社(オーストリア国))を用いてマイクロプレート(Corning(登録商標)96ウエル、クリアフラットボトムUV−透過性マイクロプレート)内で3回ずつ測定した。データは、1ウエル当たりの細胞数に標準化した。
ガバペンチンにより処理した細胞の上清中のグルタミン酸の濃度は、グルタミン/グルタミン酸測定キット(GLN−1、Sigma−Aldrich社)を製造業者の指示にしたがって使用し測定した。反応容量は総量100μLに縮小し、吸光度はTecan Infinite M200プレートリーダー(Tecan社(オーストリア国))を用いてマイクロプレート(Corning(登録商標)96ウエル、クリアフラットボトムUV−透過性マイクロプレート)内で3回ずつ測定した。データは、1ウエル当たりの細胞数に標準化した。
(m)免疫蛍光染色
細胞はレンチウイルス形質導入の5日後にガラス製カバースリップ上に置いた。細胞を4%ホルムアルデヒド中で固定し、1×PBSで2回すすぎ洗いをし、0.2% Tritonを含有するPBS中で透過化した。1×PBSを用いてすすぎ洗いをした後、細胞は室温にて30分間10%ヤギ血清中でインキュベートした。サンプルは、1時間一次抗体(マウス抗α−チューブリン抗体、1:200、#T9026、Sigma−Aldrich社)および1時間室温で二次抗体(FITC結合ヤギ抗マウス抗体、1:100、ab6785、Abcam社)とともにインキュベートし、その後、DAPI含有Vectashield封入剤(Vector Laboratories社、米国カリフォルニア州バーリンゲーム)を用いて封入した。蛍光イメージングのために、Zeiss Axioplan顕微鏡上で40×対物レンズを用いて撮影した。
細胞はレンチウイルス形質導入の5日後にガラス製カバースリップ上に置いた。細胞を4%ホルムアルデヒド中で固定し、1×PBSで2回すすぎ洗いをし、0.2% Tritonを含有するPBS中で透過化した。1×PBSを用いてすすぎ洗いをした後、細胞は室温にて30分間10%ヤギ血清中でインキュベートした。サンプルは、1時間一次抗体(マウス抗α−チューブリン抗体、1:200、#T9026、Sigma−Aldrich社)および1時間室温で二次抗体(FITC結合ヤギ抗マウス抗体、1:100、ab6785、Abcam社)とともにインキュベートし、その後、DAPI含有Vectashield封入剤(Vector Laboratories社、米国カリフォルニア州バーリンゲーム)を用いて封入した。蛍光イメージングのために、Zeiss Axioplan顕微鏡上で40×対物レンズを用いて撮影した。
(n)3Dマイクロチャネル移動アッセイ
ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)ベースのマイクロチャネルチップは、Dr. Ralf Kemkemer(Intelligent Systems社Max Planck研究所(独国))の厚意により提供された。5×11×300μm(W×H×L)の微細孔チャネル構造は、使用前に50μg/mLのフィブロネクチン溶液とのインキュベーションによって生物機能化した。チップをTeflonホルダー上で固定し、2×105個の細胞をチャネルの極めて近くにあるチップ上に播種した。細胞をチップ上に付着させた後、生細胞イメージングを25時間実施した。実験中、化学勾配またはチャネル内の流動は適用しなかった。複数の位置の位相差時間差画像を10分毎に、空気加湿および加熱チャンバーを装備した自動倒立顕微鏡(Zeiss Cell Observer、Carl Zeiss社)を用いて捕捉した。画像は、Zeiss AxioVision and ImageJソフトウエアを用いて記録および加工処理した。細胞挙動を分析し、以前に報告されたようにカテゴリー分類した(Bai, A.H., et al. MicroRNA−182 promotes leptomeningeal spread of non−sonic hedgehog−medulloblastoma. Acta Neuropathol(2011)、Rolli, C.G., Seufferlein, T., Kemkemer, R. & Spatz, J.P. Impact of tumor cell cytoskeleton organization on invasiveness and migration:a microchannel−based approach. PLoS One 5, e8726(2010))。
ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)ベースのマイクロチャネルチップは、Dr. Ralf Kemkemer(Intelligent Systems社Max Planck研究所(独国))の厚意により提供された。5×11×300μm(W×H×L)の微細孔チャネル構造は、使用前に50μg/mLのフィブロネクチン溶液とのインキュベーションによって生物機能化した。チップをTeflonホルダー上で固定し、2×105個の細胞をチャネルの極めて近くにあるチップ上に播種した。細胞をチップ上に付着させた後、生細胞イメージングを25時間実施した。実験中、化学勾配またはチャネル内の流動は適用しなかった。複数の位置の位相差時間差画像を10分毎に、空気加湿および加熱チャンバーを装備した自動倒立顕微鏡(Zeiss Cell Observer、Carl Zeiss社)を用いて捕捉した。画像は、Zeiss AxioVision and ImageJソフトウエアを用いて記録および加工処理した。細胞挙動を分析し、以前に報告されたようにカテゴリー分類した(Bai, A.H., et al. MicroRNA−182 promotes leptomeningeal spread of non−sonic hedgehog−medulloblastoma. Acta Neuropathol(2011)、Rolli, C.G., Seufferlein, T., Kemkemer, R. & Spatz, J.P. Impact of tumor cell cytoskeleton organization on invasiveness and migration:a microchannel−based approach. PLoS One 5, e8726(2010))。
(o)動物実験
動物使用研究は、政府認証機関(カールスルーエ行政管区庁(独国))により承認され、国立衛生研究所ガイドライン「実験動物の管理と使用の指針」を遵守した施設内動物保護職員により管理された。
動物使用研究は、政府認証機関(カールスルーエ行政管区庁(独国))により承認され、国立衛生研究所ガイドライン「実験動物の管理と使用の指針」を遵守した施設内動物保護職員により管理された。
(p)同所性脳腫瘍モデル
BCAT1 shRNAIノックダウンまたは非ターゲティングshRNAを備える計2×105個のU−87MG細胞を定位固定的に6匹の7〜9週齢の無胸腺マウス(CD1 nu/nu、Charles River Laboratories社(米国マサチューセッツ州ウィルミントン))の脳内に各々移植した。移植4週間後、動物を犠死させ、脳を切除し、低温切開片を作製した。脳切開片は、ヘマトキシリン&エオシンにより染色し、腫瘍容積はImageJを用いて計算した。
BCAT1 shRNAIノックダウンまたは非ターゲティングshRNAを備える計2×105個のU−87MG細胞を定位固定的に6匹の7〜9週齢の無胸腺マウス(CD1 nu/nu、Charles River Laboratories社(米国マサチューセッツ州ウィルミントン))の脳内に各々移植した。移植4週間後、動物を犠死させ、脳を切除し、低温切開片を作製した。脳切開片は、ヘマトキシリン&エオシンにより染色し、腫瘍容積はImageJを用いて計算した。
(q)過塩素酸細胞抽出およびNMR分光法
細胞はトリプシン処理により採取し、氷温PBSを用いて1回洗浄し、細胞ペレットは−80℃で冷凍した。典型的には1×108個の採取した細胞を過塩素酸抽出にかけ、その後に公表されたプロトコール50にしたがってKOH中和を実施した。つまり、2mLの氷温1N HClO4を採取した細胞の凍結ペレットに加えた。ペレットはTeflon製乳棒およびガラス製ホモジナイザーを使用して崩壊させた。1mLの氷温水をこの溶解物に加え、90秒間ボルテックスミキサーに掛け、4℃で10分間10,000×gで遠心した。ペレットを再抽出し、上清を結合した。この抽出物をKOHで中和し、pHを6.5〜7.0に調整した。沈降したKClO4を20分間25,000×gでペレット化し、上清を凍結乾燥した。
細胞はトリプシン処理により採取し、氷温PBSを用いて1回洗浄し、細胞ペレットは−80℃で冷凍した。典型的には1×108個の採取した細胞を過塩素酸抽出にかけ、その後に公表されたプロトコール50にしたがってKOH中和を実施した。つまり、2mLの氷温1N HClO4を採取した細胞の凍結ペレットに加えた。ペレットはTeflon製乳棒およびガラス製ホモジナイザーを使用して崩壊させた。1mLの氷温水をこの溶解物に加え、90秒間ボルテックスミキサーに掛け、4℃で10分間10,000×gで遠心した。ペレットを再抽出し、上清を結合した。この抽出物をKOHで中和し、pHを6.5〜7.0に調整した。沈降したKClO4を20分間25,000×gでペレット化し、上清を凍結乾燥した。
凍結乾燥した抽出物の残留物は、30mMリン酸ナトリウムおよび0.1mMアジ化ナトリウム(pH7.02)を含有する0.5mLのD2Oバッファー(99.9% D)中に溶解させた。定量的分析のために、参照キャピラリー(1.5mm OD、0.99mm ID)に上述したD2Oバッファー中の11mMのトリメチルシリル−2,2,3,3−テトラジューテロプロパン酸(TSP、ナトリウム塩)の溶液を充填した。続いて、このキャピラリーをBunsenバーナーの炎で密封した。キャリブレーション溶液は、10.49mMのグルコースおよび4.95mmのグルコースの計算濃度を得るためにD2Oバッファー中の計量した量のグルコースおよびクエン酸を配置することによって調製した。キャリブレーション溶液+キャピラリーの1H−NMRスペクトルは、600MHz(Avance AV−600、Bruker BioSpin社)で標準5mm NMRチューブおよび三重共鳴逆プローブを使用して、抽出物に対して使用する条件と同一条件(20℃、残留HDOシグナルの前飽和、繰り返し時間TR=7秒間、30°のフリップ角)下で獲得した。シトレートおよびグルコースについてのシグナル積分を上記に提示した濃度に対応する数値に設定したところ、TSPメチルシグナルの積分は、4.60±0.10mMプロトンと等価であることが見いだされた。細胞抽出物は、挿入したキャリブレーション済み参照キャピラリー(1時間に512のトランジェント)を用いて測定し、分枝鎖アミノ酸、様々な代謝産物、およびTSP参照物質についての1H−NMRシグナルを積分した。TSP積分は4.60mMであると規定されたので、代謝産物シグナル積分は使用された0.5mLの容量に対する代謝産物濃度(mM(μmol/mL))で直接的に生じさせた。次に、これらのデータを抽出前に決定した細胞計数を使用してフェムトモル/細胞に転換した。
(r)細胞ホモジネートの調製
細胞ペレットは、100μLの水中に希釈し、超音波処理によってホモジナイズした(超音波装置、3〜5×20サイクル、出力80%、Branson Sonifier 450、Dietzenbach社(独国))。タンパク質は、Lowry(Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. & Randall, R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193, 265−275(1951)にしたがってHelenius and Simonsの改変(Helenius, A. & Simons, K. The binding of detergents to lipophilic and hydrophilic proteins. J Biol Chem 247, 3656−3661(1972))を加えて、標準物質としてウシ血清アルブミンを使用して決定した。ホモジネートの最終タンパク質濃度は、2〜4mg/mLでなければならない。これらの希釈率を全分析に対して使用した。
細胞ペレットは、100μLの水中に希釈し、超音波処理によってホモジナイズした(超音波装置、3〜5×20サイクル、出力80%、Branson Sonifier 450、Dietzenbach社(独国))。タンパク質は、Lowry(Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. & Randall, R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193, 265−275(1951)にしたがってHelenius and Simonsの改変(Helenius, A. & Simons, K. The binding of detergents to lipophilic and hydrophilic proteins. J Biol Chem 247, 3656−3661(1972))を加えて、標準物質としてウシ血清アルブミンを使用して決定した。ホモジネートの最終タンパク質濃度は、2〜4mg/mLでなければならない。これらの希釈率を全分析に対して使用した。
(s)統計的分析
IDH1/IDH2突然変異状態とBCAT1タンパク質発現との関係(図1k)は、両側フィッシャー直接確率検定を用いて試験した。スチューデントのt検定(両側、対応のない)を全ての他の統計的比較のために使用した。* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001。
IDH1/IDH2突然変異状態とBCAT1タンパク質発現との関係(図1k)は、両側フィッシャー直接確率検定を用いて試験した。スチューデントのt検定(両側、対応のない)を全ての他の統計的比較のために使用した。* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001。
(実施例2)
ガバペンチンによる細胞増殖の阻害 ヒト神経膠芽腫細胞系U−87MG(HTB−14)、HS683(HTB−138)およびU−373MG(HTB−17、LGC Standards社(英国テディントンTW11 OLY))は、10%ウシ胎児血清および1%のペニシリン/ストレプトマイシンミックスを補給したダルベッコの最小必須培地中で培養した。5×104細胞/ウエルを総量500μLの細胞培養培地で24ウエルプレート内へ播種した。培地を細胞の播種4時間後に除去し、各々5mM、10mMおよび20mMの最終濃度で1−(アミノメチル)−シクロヘキシル酢酸(1 - (Aminomethyl ) - cyclohexylessigsaure)(ガバペンチン、500mMの濃度で200mM HEPESバッファー中に溶解させた)を含有する500μLの培地と置き換えた。対応する量の200mM HEPESを各コントロールウエルに加えた。培地交換の5時間後、Invitrogens社(米国カリフォルニア州92008カールスバッド)製のClick iT(登録商標)増殖キットを使用して細胞増殖を測定するために5−エチニル−2’−デオキシウリジン(EdU(米国カリフォルニア州92008カールスバッド))を加えた。細胞はEdU適用16時間後に採取し、増殖は製造業者の指示にしたがってBD Biosciences FACS Canto IIフローサイトメーター(BD Biosciences社(米国ニュージャージー州07417フランクリンレイクス))を使用して測定した。各処理に対して3回の反復測定値を得た。全細胞系において、疑似処理細胞と比較してガバペンチン処理細胞内では細胞増殖の約20〜55%の濃度依存性の有意な減少が観察された。結果は、図10に示す。
ガバペンチンによる細胞増殖の阻害 ヒト神経膠芽腫細胞系U−87MG(HTB−14)、HS683(HTB−138)およびU−373MG(HTB−17、LGC Standards社(英国テディントンTW11 OLY))は、10%ウシ胎児血清および1%のペニシリン/ストレプトマイシンミックスを補給したダルベッコの最小必須培地中で培養した。5×104細胞/ウエルを総量500μLの細胞培養培地で24ウエルプレート内へ播種した。培地を細胞の播種4時間後に除去し、各々5mM、10mMおよび20mMの最終濃度で1−(アミノメチル)−シクロヘキシル酢酸(1 - (Aminomethyl ) - cyclohexylessigsaure)(ガバペンチン、500mMの濃度で200mM HEPESバッファー中に溶解させた)を含有する500μLの培地と置き換えた。対応する量の200mM HEPESを各コントロールウエルに加えた。培地交換の5時間後、Invitrogens社(米国カリフォルニア州92008カールスバッド)製のClick iT(登録商標)増殖キットを使用して細胞増殖を測定するために5−エチニル−2’−デオキシウリジン(EdU(米国カリフォルニア州92008カールスバッド))を加えた。細胞はEdU適用16時間後に採取し、増殖は製造業者の指示にしたがってBD Biosciences FACS Canto IIフローサイトメーター(BD Biosciences社(米国ニュージャージー州07417フランクリンレイクス))を使用して測定した。各処理に対して3回の反復測定値を得た。全細胞系において、疑似処理細胞と比較してガバペンチン処理細胞内では細胞増殖の約20〜55%の濃度依存性の有意な減少が観察された。結果は、図10に示す。
(実施例3)
BCAT1アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞増殖の阻害
レンチウイルスベクターは、HEK293T細胞のpsPAX2(Addgene 12260、Didier Trono社、パッケージングベクター)、pMD2.G(Addgene 12259、Didier Trono社、エンベローププラスミド)、およびpLKO.1 shRNA構築物(Sigma−Aldrich社(米国ミズーリ州63178セントルイス))でのコトランスフェクションによって生成した。トランスフェクションは、TransIT(登録商標)−LT1(Mirus Bio LLC社(米国ワイオミング州53711マディソン))を使用して実施し、ウイルスはトランスフェクションの48および72時間後に採取した。BCAT1 mRNA転写産物の様々な領域を標的とする2つの独立shRNA構築物を使用した。MISSION shRNA TRCN0000005907 NM_005504.3−1064s1c1(shRNA1)およびTRCN0000005909 NM_005504.3−751s1c1(shRNA2)。全てSigma−Aldrich社製(米国ミズーリ州63178セントルイス)。非ターゲティングshRNAをコントロールとして使用した。
BCAT1アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞増殖の阻害
レンチウイルスベクターは、HEK293T細胞のpsPAX2(Addgene 12260、Didier Trono社、パッケージングベクター)、pMD2.G(Addgene 12259、Didier Trono社、エンベローププラスミド)、およびpLKO.1 shRNA構築物(Sigma−Aldrich社(米国ミズーリ州63178セントルイス))でのコトランスフェクションによって生成した。トランスフェクションは、TransIT(登録商標)−LT1(Mirus Bio LLC社(米国ワイオミング州53711マディソン))を使用して実施し、ウイルスはトランスフェクションの48および72時間後に採取した。BCAT1 mRNA転写産物の様々な領域を標的とする2つの独立shRNA構築物を使用した。MISSION shRNA TRCN0000005907 NM_005504.3−1064s1c1(shRNA1)およびTRCN0000005909 NM_005504.3−751s1c1(shRNA2)。全てSigma−Aldrich社製(米国ミズーリ州63178セントルイス)。非ターゲティングshRNAをコントロールとして使用した。
ヒト神経膠芽腫細胞系U87−MG(HTB−14)、HS683(HTB−138)およびU373−MG(HTB−17、LGC Standards社(英国テディントンTW11 OLY))は、総量500μLの細胞培養培地中で24ウエルプレート(5×104細胞/ウエル)に播種した。24時間後、細胞には8μg/mlのポリブレンの存在下でウイルスを形質導入した。ウイルス含有上清を24時間後に取り出し、細胞は形質導入の第3日および第5日に分割した。減少したBCAT1 mRNAおよびタンパク質発現は、定量的リアルタイムPCRおよびウェスタンブロットを使用して検出した(ECA39抗体、BD Biosciences Pharmingen社(米国カリフォルニア州92121サンディエゴ))。増殖アッセイは、細胞を10μM EdUとともに16時間インキュベートした後にClick−iT(登録商標)EdU細胞増殖キットを使用して第6日に実施した。BCAT1 shRNA形質導入細胞の全てにおいて、増殖の低下は細胞系に依存して20〜80%に観察された。これらの結果は、図11に示す。
(実施例4)
IDH wt 神経膠芽腫におけるBCAT1過剰発現の決定
WHOグレードII、IIIおよびIVの星状神経膠腫由来の遺伝子発現データ上でのマイクロアレイの予測分析は、下記の表3に明らかなように、BCAT1は他の星状細胞腫から原発性神経膠芽腫を識別する最良の分類指標であることを確認した。
IDH wt 神経膠芽腫におけるBCAT1過剰発現の決定
WHOグレードII、IIIおよびIVの星状神経膠腫由来の遺伝子発現データ上でのマイクロアレイの予測分析は、下記の表3に明らかなように、BCAT1は他の星状細胞腫から原発性神経膠芽腫を識別する最良の分類指標であることを確認した。
IDH−突然変異状態に基づいて腫瘍を分類すると、BCAT1 mRNA発現レベルはIDHmut神経膠腫との比較で、IDHwt神経膠腫より有意に高かったが(図1b、P<0.0001、両側スチューデントt検定)、BCAT2発現については匹敵する増強されたレベルは観察されなかった(図1c、P=0.0301)。経路分析は、BCAT1に加えて、BCAA代謝経路の数種の他の遺伝子のRNA発現はIDHmut腫瘍に比較してIDHwtにおいてアップレギュレートされた(図7)。RNA発現結果と一致して、ウェスタンブロット分析は、BCAT1タンパク質発現がIDHwt腫瘍では高いが、IDH1またはIDH2いずれかにおける特異的突然変異とは無関係に、本質的にIDHmut腫瘍においては存在しないことを証明した(図1d)。20例の神経膠腫についてのBCAT1のプロモーターおよびコーディング領域両方についてのシーケンシングは、ナンセンス突然変異も推定活性化突然変異も明らかにしなかった。IDH1もしくはIDH2突然変異とBCAT1発現との間で観察された緊密な相関は、81例の原発性ヒト神経膠腫(77例の星状細胞腫、4例の乏突起神経膠腫)からの切片の免疫組織化学的染色を通してさらに確証されたが、特にIDHwt46例中45例の腫瘍は強度のBCAT1染色を示し(図1e)、他方IDH1(30例のR132H、1例のR132C、1例のR132S)もしくはIDH2(3例のR172K)における突然変異を備える35例中35例の腫瘍はBCAT1陰性であった(図1f〜h)、(P<0.0001、フィッシャーの直接確率検定、図1k)。BCAT1染色パターンは、このためIDH1−R132H変異タンパク質に対する広く使用される抗体を用いて得られたパターンと高度に相補性である(図1i、j)。しかし、IDH1−R132H染色とは相違して、BCAT1抗体は、さらに抗IDH1−R132Hによっては認識されない余り一般的ではないIDH1およびIDH2突然変異を備える腫瘍からIDHwt腫瘍(図1e)も識別する(図1g〜h)。これらのデータは、高BCAT1発現が、診断状況においてこれらの腫瘍を確実に同定するために使用可能なIDHwt神経膠腫の特徴的特性であることを証明している。
(実施例5)
BCAT1の基質依存性発現の決定
BCAT1は、神経膠芽腫細胞系LN−229、U−87MG、U−373MGにおいて強度に、A172においてはより低い程度に発現することが見いだされたが(図2a)、全てIDH1およびIDH2野生型遺伝子を有することが確証された。BCAT1発現はさらにHs683細胞系においても上昇し、それは、元来、乏突起神経膠腫に由来したが、それでもまだIDHwt遺伝子型を提示する。そこで、これら全部の細胞系は、BCAT1機能を試験するために適切なモデルであると考察することができる。BCAT1 RNAおよびタンパク質発現は、神経膠芽腫において頻回に存在する、低酸素条件下ではアップレギュレートされた(図2b)。BCAT1発現は、基質α−KGの濃度と相関しており、培養培地中の細胞透過性ジメチル−α−KG基質の濃度を上げた後にはアップレギュレートされた(図2c)。これとは反対に、細胞質内のα−KGの主要起源であるIDH1のshRNA媒介性ノックダウンは、BCAT1発現の強力なダウンレギュレーションをもたらした(図2d)。
BCAT1の基質依存性発現の決定
BCAT1は、神経膠芽腫細胞系LN−229、U−87MG、U−373MGにおいて強度に、A172においてはより低い程度に発現することが見いだされたが(図2a)、全てIDH1およびIDH2野生型遺伝子を有することが確証された。BCAT1発現はさらにHs683細胞系においても上昇し、それは、元来、乏突起神経膠腫に由来したが、それでもまだIDHwt遺伝子型を提示する。そこで、これら全部の細胞系は、BCAT1機能を試験するために適切なモデルであると考察することができる。BCAT1 RNAおよびタンパク質発現は、神経膠芽腫において頻回に存在する、低酸素条件下ではアップレギュレートされた(図2b)。BCAT1発現は、基質α−KGの濃度と相関しており、培養培地中の細胞透過性ジメチル−α−KG基質の濃度を上げた後にはアップレギュレートされた(図2c)。これとは反対に、細胞質内のα−KGの主要起源であるIDH1のshRNA媒介性ノックダウンは、BCAT1発現の強力なダウンレギュレーションをもたらした(図2d)。
(実施例6)
2種の選択的プロモーターにおけるDNAメチル化を通して差次的制御されたBCAT1発現
IDHwtおよびIDHmut神経膠腫におけるBCAT1発現の差次的制御を詳細に解明するために、患者サンプル中の転写産物発現を定量した。RT−PCRおよびシーケンシングを使用して、IDHwt星状細胞原発性腫瘍ならびに23例の正常脳組織のプールにおける、Ensemblデータベース内に列挙された3つのタンパク質コーディングBCAT1転写産物の発現を確証した(図9)。これらの3種の転写産物(T1、T4およびT6)は、3種全てがウェスタンブロット分析によって同定された43kDの単一タンパク質バンドに対応する、386、398、および385アミノ酸のタンパク質をコードする。これらの転写産物は2種の選択的プロモーターを起源とし(図3a)、T1、T4およびT6内の2、14および1個のアミノ酸各々をコードするそれらの第1エクソンだけが相違する。転写産物特異的qRT−PCRはT6を原発性腫瘍内の全BCAT1 mRNAの73%を提示する主要転写産物であると同定した(図3b)。明白に、全BCAT1転写産物の発現は、IDHmut腫瘍に比較してIDHwt腫瘍において有意に高かった。
2種の選択的プロモーターにおけるDNAメチル化を通して差次的制御されたBCAT1発現
IDHwtおよびIDHmut神経膠腫におけるBCAT1発現の差次的制御を詳細に解明するために、患者サンプル中の転写産物発現を定量した。RT−PCRおよびシーケンシングを使用して、IDHwt星状細胞原発性腫瘍ならびに23例の正常脳組織のプールにおける、Ensemblデータベース内に列挙された3つのタンパク質コーディングBCAT1転写産物の発現を確証した(図9)。これらの3種の転写産物(T1、T4およびT6)は、3種全てがウェスタンブロット分析によって同定された43kDの単一タンパク質バンドに対応する、386、398、および385アミノ酸のタンパク質をコードする。これらの転写産物は2種の選択的プロモーターを起源とし(図3a)、T1、T4およびT6内の2、14および1個のアミノ酸各々をコードするそれらの第1エクソンだけが相違する。転写産物特異的qRT−PCRはT6を原発性腫瘍内の全BCAT1 mRNAの73%を提示する主要転写産物であると同定した(図3b)。明白に、全BCAT1転写産物の発現は、IDHmut腫瘍に比較してIDHwt腫瘍において有意に高かった。
BCAT1転写制御の考えられる機序を調査するために、全グレードの星状細胞腫において、2種の選択的プロモーター(図3c)をカバーする亜硫酸水素塩処理したDNAから増幅させたPCR産物のMassARRAY分析を使用して定量的DNAメチル化分析を実施した。IDHwtおよびIDHmut腫瘍に対して明確に異なるメチル化パターンが観察された。主要プロモーター(プロモーター2)はIDHmut腫瘍内では高メチル化されたが、IDHwt腫瘍および正常脳内ではほとんどメチル化されなかった(図3c、右のパネル)。A6およびA7アンプリコンのメチル化の程度の平均は、IDH1突然変異状態と強度に関連していた(図3d)。これらのデータは、IDHmut腫瘍内でのプロモーター2メチル化による転写産物T4およびT6の抑制を示している。プロモーター1(図3c、左のパネル)は、CpG島のすぐ上流の高メチル化配列の伸長を除いて、全腫瘍サンプル中ならびに正常脳中でほとんどメチル化していなかった。この上流領域内では、IDHwtおよびIDHmut腫瘍間のアンプリコンA2内の位置−699/−697(CpG4;5)および−660(CpG6)で3種の差次的にメチル化されたCpG−ジヌクレオチドが同定された。プロモーター2におけるメチル化パターンとは対照的に、CpG4;5(図3e)およびCpG6(図3f)は、IDHwt腫瘍よりIDHmut腫瘍において有意に少ないメチル化を示した。この差次的メチル化領域(DMR)内のメチル化の程度はIDHwt腫瘍内のBCAT1転写産物T1の発現と相関しており、その機能的関連性を支持している(図3g)。観察されたCpG特異的メチル化パターンは、T1のダウンレギュレーションをもたらすDMRへのレプレッサー結合と一致している。レプレッサーHEY1がBCAT1プロモーター1には結合するがプロモーター2には結合しないこと(図3a)は、以前にChlPseqデータによって示唆されている。RNA発現データの分析は、正常脳と比較して星状細胞腫瘍におけるHEY1レプレッサーの過剰発現を確証した。HEY1レプレッサー活性と一致して、HEK293T細胞におけるsiRNA媒介性HEY1ノックダウンは転写産物−T1発現を増加させた(図3h、i)。ChIP分析は、上流コントロール領域および翻訳開始部位に近い領域と比較して、2種の相違するHEY1構築物の最強の結合がDMR内で発生することを証明した(図3j、k)。まとめると、これらのデータは、星状細胞腫内のBCAT1転写産物の差次的発現が、IDHmut腫瘍内のプロモーター2の広範囲のメチル化およびIDHwt腫瘍内のプロモーター1のHEY1−レプレッサー結合部位におけるCpG部位特異的メチル化を含むDNAメチル化によって制御されることを強力に証明している。
(実施例7)
BCAT1の抑制を通した神経膠芽腫細胞によるグルタミン酸遊離の減少
神経膠芽腫におけるBCAT1の機能的役割に関する洞察を得るために、細胞系U−87MGおよびU−373MG細胞系を、BCAT1を特異的に阻害するがBCAT2を阻害しないロイシンアナログであるガバペンチンを用いて処理した。20mMガバペンチンを用いて20時間処理した細胞の抽出物についての1H−NMR分光測定は、BCAT1阻害と一致して、BCAAの細胞内蓄積を証明した(図4ab)。神経膠芽腫は、高濃度のグルタミン酸を遊離し、興奮毒性機序によるニューロン死をもたらす。グルタミン酸遊離はガバペンチンによるBCAT1の阻害に伴って有意に減少し(図4c)、これはBCAT1がIDHwt神経膠腫におけるBCAA異化作用を通してのグルタミン酸産生にとっての主要寄与因子であることを示している。
BCAT1の抑制を通した神経膠芽腫細胞によるグルタミン酸遊離の減少
神経膠芽腫におけるBCAT1の機能的役割に関する洞察を得るために、細胞系U−87MGおよびU−373MG細胞系を、BCAT1を特異的に阻害するがBCAT2を阻害しないロイシンアナログであるガバペンチンを用いて処理した。20mMガバペンチンを用いて20時間処理した細胞の抽出物についての1H−NMR分光測定は、BCAT1阻害と一致して、BCAAの細胞内蓄積を証明した(図4ab)。神経膠芽腫は、高濃度のグルタミン酸を遊離し、興奮毒性機序によるニューロン死をもたらす。グルタミン酸遊離はガバペンチンによるBCAT1の阻害に伴って有意に減少し(図4c)、これはBCAT1がIDHwt神経膠腫におけるBCAA異化作用を通してのグルタミン酸産生にとっての主要寄与因子であることを示している。
これらの所見を独立して確証するために、どちらも全3種のBCAT1転写産物を標的とする2つのshRNAを使用して、U−87MG、U−373MGおよびHs683細胞におけるshRNA媒介性BCAT1ノックダウンを実施した。24時間のインキュベーション後のU−87MG細胞培養培地のタンデム−MS分析は、グルタミン酸遊離ならびにBCAA取り込みがコントロール細胞と比較してBCAT1ノックダウン細胞において減少することを明らかにした(図4d)。アラニン、グリシンおよびトレオニンの遊離における有意な増加も観察された。細胞内アミノ酸濃度の定量は、アスパラギン酸塩、グリシンおよびトレオニンの有意な蓄積を明らかにした(図4e)。グルタミン酸の少ないが有意な蓄積もBCAT1ノックダウン後に観察された。しかし、培地容量対細胞内容量の高い比率を考慮に入れると、グルタミン酸の総濃度は、この小さな細胞内蓄積による有意な影響は受けない。BCAT2ノックアウトマウスでは、BCAA異化作用の阻害は高濃度のBCAAならびにラパマイシン(mTOR)シグナリング経路および代償性の増加したタンパク質分解(増加したタンパク質の代謝回転)の機構的標的を介しての末梢組織中での高率のタンパク質合成を生じさせる。
BCAT1ノックダウンは、BCAT1の下流でのバリンおよびイソロイシンの異化作用において関与する酵素である3−ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ(HADH)の強力なダウンレギュレーションをもたらした(図4f、g)。HADHは脂肪酸代謝にとって極めて重要であるので、BCAT1ノックダウンは膜合成に必須の脂肪酸の合成または分解も変化させるであろう。
(実施例8)
BCAT1ノックダウンによるマイクロチャネル内の神経膠芽腫遊走の制限
BCAT1ノックダウンは、細胞の形態に強度に影響を及ぼし、丸みを帯びた、伸長していない外観を生じさせた(図5a〜b)。これらの形態上の変化が、腫瘍細胞が隣接組織を浸潤する能力に影響を及ぼす可能性があるかどうかを試験するために、三次元環境を模擬するためのマイクロチャネル移動チップを使用した(図5c)。BCAT1ノックダウンの後に、U−87MG細胞の大多数(55%)はマイクロチャネル内に短距離透過したが、マイクロチャネルを完全に浸潤するために積極的に変形することはできず、ほとんどのコントロール細胞(78%)はチャネルを完全に浸潤した(図5d)。BCAT1ノックダウン細胞のこの低下した浸潤性は、観察された長鎖脂肪酸の低い存在度およびコレステロール代謝における相違によって誘発される変化した膜組成に起因すると思われる(図4g)。そのような変化は、膜成分の一般的利用可能性ならびに細胞浸潤を妨害する膜弾性に十分に影響を及ぼす可能性がある。
BCAT1ノックダウンによるマイクロチャネル内の神経膠芽腫遊走の制限
BCAT1ノックダウンは、細胞の形態に強度に影響を及ぼし、丸みを帯びた、伸長していない外観を生じさせた(図5a〜b)。これらの形態上の変化が、腫瘍細胞が隣接組織を浸潤する能力に影響を及ぼす可能性があるかどうかを試験するために、三次元環境を模擬するためのマイクロチャネル移動チップを使用した(図5c)。BCAT1ノックダウンの後に、U−87MG細胞の大多数(55%)はマイクロチャネル内に短距離透過したが、マイクロチャネルを完全に浸潤するために積極的に変形することはできず、ほとんどのコントロール細胞(78%)はチャネルを完全に浸潤した(図5d)。BCAT1ノックダウン細胞のこの低下した浸潤性は、観察された長鎖脂肪酸の低い存在度およびコレステロール代謝における相違によって誘発される変化した膜組成に起因すると思われる(図4g)。そのような変化は、膜成分の一般的利用可能性ならびに細胞浸潤を妨害する膜弾性に十分に影響を及ぼす可能性がある。
(実施例9)
BCAT1は、神経膠芽腫増殖にとって必須である
BCAT1が腫瘍細胞増殖に及ぼす影響を評価するために、阻害およびノックダウン実験を実施した。EdU取り込みに基づいて推定された56%までの増殖の濃度依存性減少は、阻害剤ガバペンチンを用いた処理後に観察された(図6a)。細胞周期分析は、ガバペンチン処理がG2およびS分画の同時減少を伴うG1期における細胞の増加した分画によって指示される部分的G1停止を誘導することを示唆した(図6b)。ShRNA媒介性BCAT1ノックダウンは、類似の作用を誘発した(図6c、d)。BCAT1ノックダウンは、全3種の細胞系において増殖を20〜70%減少させ、G1停止および細胞CDKNlB/p27KIP1の強度の増加をもたらした。明らかに、CDKNlB/p27KIP1蓄積の程度は、G1分画のサイズとの正相関を示した(図6d)。sub−G1期にある細胞の分画によって指示される細胞死は、Hs683の場合を除いて5%未満のままであり、これは下記表4に示すように中等度の増加を示した。
BCAT1は、神経膠芽腫増殖にとって必須である
BCAT1が腫瘍細胞増殖に及ぼす影響を評価するために、阻害およびノックダウン実験を実施した。EdU取り込みに基づいて推定された56%までの増殖の濃度依存性減少は、阻害剤ガバペンチンを用いた処理後に観察された(図6a)。細胞周期分析は、ガバペンチン処理がG2およびS分画の同時減少を伴うG1期における細胞の増加した分画によって指示される部分的G1停止を誘導することを示唆した(図6b)。ShRNA媒介性BCAT1ノックダウンは、類似の作用を誘発した(図6c、d)。BCAT1ノックダウンは、全3種の細胞系において増殖を20〜70%減少させ、G1停止および細胞CDKNlB/p27KIP1の強度の増加をもたらした。明らかに、CDKNlB/p27KIP1蓄積の程度は、G1分画のサイズとの正相関を示した(図6d)。sub−G1期にある細胞の分画によって指示される細胞死は、Hs683の場合を除いて5%未満のままであり、これは下記表4に示すように中等度の増加を示した。
細胞増殖の匹敵する減少は、これらの細胞がアネキシンV/7AAD染色によって決定されるより高いアポトーシス率を示した以外は、無血清培地中の神経膠芽腫一次球状培養中でのBCAT1ノックダウン後に観察された(図9)。観察された増殖の減少と一致して、BCAT1ノックダウンは、U−87MG、U−373MGおよびHs683細胞におけるv−aktマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ(AKT)の減少したリン酸化をもたらした(図6e)。
BCAT1ノックダウンがin vivoの腫瘍増殖に及ぼす作用は、U−87MG細胞のCD−1ヌードマウスへの大脳内移植によって評価した(図6f〜h)。同数の生細胞の移植4週間後に、全6匹のコントロールマウス、BCAT1−shRNA形質導入細胞が移植されたマウス6匹中1匹だけが、例えば昏睡または非協調運動活動などの神経学的症状を提示した。マウス脳切片のヘマトキシリン&エオシン染色は、コントロール細胞が移植されたマウスにおける大きな腫瘍を明らかにしたが(図6f)、BCAT1ノックダウン細胞が移植されたマウスにおいては有意に小さな腫瘍が見られた(図6g)。定量的分析は、腫瘍容積における群間の有意差を確証した(図6h、P=0.0091)。
脳腫瘍、好ましくは、神経膠腫、神経膠芽腫または星状細胞系脳腫瘍の療法に利用可能である。
Claims (12)
- 脳腫瘍を治療する方法において使用するための(a)分枝鎖アミノトランスフェラーゼ1(BCAT1)の生物学的活性または(b)BCAT1をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害することのできる化合物。
- 脳腫瘍を治療するための医薬組成物を調製するための(a)分枝鎖アミノトランスフェラーゼ1(BCAT1)の生物学的活性または(b)BCAT1をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害することのできる化合物の使用。
- 前記化合物は、BCAT1をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAである請求項1に記載の化合物または請求項2に記載の使用。
- 前記化合物は、BCAT1の生物学的活性を低減もしくは阻害する化合物である請求項1に記載の化合物または請求項2に記載の使用。
- 前記化合物は、1−(アミノメチル)シクロヘキサン酢酸である請求項4に記載の化合物または使用。
- 前記化合物は、BCAT1に対する抗体またはそのフラグメントである請求項4に記載の化合物または使用。
- 前記化合物は、BCAT1の不活性種である請求項1に記載の化合物または請求項2に記載の使用。
- 治療対象の新生物がBCAT1(過剰)発現を示す請求項1に記載の化合物または請求項2に記載の使用。
- 治療対象の前記脳腫瘍は、星状細胞系脳腫瘍、神経膠腫または神経膠芽腫である請求項1〜8のいずれか一項に記載の化合物または使用。
- 前記脳腫瘍は、IDHwt神経膠芽腫である請求項9に記載の化合物または使用。
- BCAT1の生物学的活性またはBCAT1をコードする遺伝子の発現を低減もしくは阻害する化合物を同定する方法であって、
(a)候補化合物をBCAT1もしくはBCAT1をコードする遺伝子を含む試験系とともにインキュベートする工程と、
(b)BCAT1の生物学的活性をアッセイする工程を含み、
このときBCAT1の前記生物学的活性の阻害もしくは消失が所望の特性を有する候補化合物の存在を示す方法。 - BCAT1の前記生物学的活性の阻害もしくは消失は、試験化合物の非存在によって特徴付けられる試験系との比較によって決定される請求項11に記載の方法。
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