JP2016192909A - 胃癌に関する情報の取得方法、ならびに胃癌に関する情報を取得するためのマーカーおよび胃癌検出用キット - Google Patents
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Abstract
Description
DNAの断片化は、超音波処理、アルカリ処理、制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、アルカリ処理によりDNAの断片化を行なう場合は、DNA溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度0.1〜1.0 Nとなるよう添加し、10〜40℃で5〜15分間インキュベーションすることによりDNAが断片化される。また、制限酵素処理によりDNAの断片化を行なう場合、用いる制限酵素はDNAの塩基配列に基づいて適宜選択され、例えばMseIやBamHIなどが用いられる。
DNAを増幅する工程としては、PCR法、定量的PCR法、IVT(in vitro transcription)増幅法、SPIA(商標)増幅法などを行う工程が挙げられる。
メチル化DNAおよび/または非メチル化DNAを検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法、サザンハイブリダイゼーションなどを行う工程が挙げられる。
本実施形態では、被験者から採取した生体試料から調製したDNA試料中の上記のマーカーについてメチル化解析を行い、得られた解析結果に基づいて該被験者の胃癌に関する情報を取得することができる。なお、メチル化解析および胃癌の情報の取得については、これまでに述べたことと同様である。
本実施形態において、マーカーとして用いられる核酸としては、例えば、配列番号2または3の塩基配列からなるマーカーとして用いられる核酸が挙げられる。この配列番号2または3の塩基配列からなるマーカーとして用いられる核酸は、MSP法によるメチル化解析に適している。
被検者由来のDNA試料に含まれるZNF568遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の解析結果を測定装置から取得するステップ;
取得した解析結果に基づいて、前記生体試料における胃癌細胞の有無を判定するステップ。
なお、判定装置30は、図4に示されるように測定装置20とは別個の機器であってもよいし、測定装置20を内包する機器であってもよい。後者の場合、判定装置30は、それ自体で診断補助装置10であり得る。
図7は、胃癌に関する情報の取得のフローチャートの一例である。ここでは、被検者由来の生体試料を用いて得られたゲル画像情報からバンド強度を取得し、得られたバンド強度が閾値以上であるか否かの判定を行う場合を例として挙げて説明する。しかし、本発明は、この実施形態のみに限定されるものではない。
(1)メチル化データの取得
実施例1では、胃癌の癌部組織(69検体)および胃癌の非癌部組織(2検体)について、TCGA(The Cancer Genome Atlas:http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp)において公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)のメチル化データを取得した。また、正常組織(23検体)について、Nazor KL.らの文献(Recurrent variations in DNA methylation in human pluripotent stem cells and their differentiated derivatives. Cell Stem Cell 2012;10(5):620-634)に公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChipのメチル化データを取得した。
Infinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)を用いたデータマイニングの結果、ZNF568遺伝子のプロモータ領域が、胃癌の癌部組織に特異的にメチル化が認められるマーカーとして同定された(図1参照)。以降、これらのマーカーを本実施例のマーカーとも呼ぶ。
(1)メチル化データの取得
実施例2では、14種類の癌/腫瘍組織検体、11種類の非癌部組織検体および19種類の正常組織検体のメチル化データを比較した。なお、各組織の検体数を以下の表に示す。
・論文1:Nazor KLら、Recurrent variations in DNA methylation in human pluripotent stem cells and their differentiated derivatives. Cell Stem Cell 2012;10(5):620-634
・論文2:Reinius LEら、Differential DNA Methylation in Purified Human Blood Cells: Implications for Cell Lineage and Studies on Disease Susceptibility, PLoS One, 7(7) e41361
(mCpG)=(シグナルM)/{(シグナルM)+(シグナルU)}
得られたメチル化率(mCpG)の値について、腫瘍組織検体と正常組織検体との間で統計学的に有意な差を認められる場合にメチル化陽性とした。そして、各癌種のメチル化陽性率(%)を算出した。
メチル化陽性率(%)=(メチル化陽性検体数/総検体数)×100
(例えば、脳腫瘍の場合、メチル化陽性率は「脳腫瘍検体のうちメチル化陽性検体数/脳腫瘍総検体数(=114)×100」によって算出する。)
(1)生体試料
実施例3では、胃癌患者由来の生体試料として、胃癌患者から採取した癌部組織のFFPEサンプル(6検体)を用いた。また、対照試料として、正常胃組織(2検体)を用いた。
(i)ゲノムDNAの抽出
上記の各胃癌組織のFFPEサンプルからゲノムDNAを、QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。正常組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット(GEヘルスケアライフサイエンス社)を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNAからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor(COSMO BIO社製)により断片化して、非メチル化DNA断片(0%メチル化DNA)の溶液を得た。この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ(New England Biolab社)を反応させることによりCG配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片(100%メチル化DNA)の溶液を得た。
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
上記(2)で得られた測定用試料および対照試料を用いて、MSPを行った。用いたPCR試薬の組成、プライマーセットおよびPCR条件を以下に示す。
<PCR試薬>
DW(滅菌水) 18.8μL
10×PCR buffer with MgCl2(Roche社) 2.5μL
10 mM dNTP mix 0.5μL
10μMセンスプライマー 1.0μL
10μMアンチセンスプライマー 1.0μL
Faststart Taq polymerase(Roche社) 0.2μL
測定用試料 1.0μL
トータル 25.0μL
上記のMSPで用いたプライマーセットを表5に示す。これらのプライマーセットは、増幅対象の領域のDNAがメチル化している場合に増幅産物を得ることができるプライマーセット(以下、「メチル化検出用プライマーセット」とも呼ぶ)である。また、精度管理用プライマーセットとして、バイサルファイト処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのプライマーセットも用いた(表6参照)。ZNF568遺伝子のプロモータ領域において、メチル化検出用プライマーセットで解析される領域の塩基配列を配列番号2で示した。
95℃で6分、
95℃で30秒、X℃で30秒、72℃で30秒をYサイクル、
72℃で7分、
16℃で放置。
なお、上記の反応条件において「X」および「Y」はそれぞれ、表5および6に示されるアニーリング温度およびサイクル数を表す。
上述のMSPで得られた増幅産物を2%アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図4に示す。なお、図中で「control」として示されている「0」および「100」はそれぞれ0%メチル化対照試料および100%メチル化対照試料を表す。
20 測定装置
30 判定装置
40 記録媒体
300 コンピュータ本体
301 入力部
302 表示部
310 CPU
311 ROM
312 RAM
313 ハードディスク
314 入出力インターフェイス
315 読出装置
316 通信インターフェイス
317 画像出力インターフェイス
318 バス
321 取得部
322 記憶部
323 算出部
324 判定部
325 出力部
Claims (8)
- 被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、
前記DNA試料に含まれるZNF568遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を判定する工程と、
前記判定工程において、メチル化が存在すると判定された場合は、前記生体試料が胃癌細胞を含むとの情報を取得する工程と
を含む、胃癌に関する情報の取得方法。 - 前記プロモータ領域が、配列番号2の塩基配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記メチル化の有無の判定が、質量分析法およびメチル化特異的PCR法から選択される少なくとも1つの方法で得られた結果に基づいて行われる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記生体試料が、組織、血液または血清である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 被検者から単離した核酸に由来する核酸であって、
前記由来する核酸は、ZNF568遺伝子のプロモータ領域の全部またはその一部の連続する塩基配列をバイサルファイト処理して得られる配列を有し、
前記プロモータ領域は、CpG部位と、CpG部位を構成しないシトシン塩基とを含み、
胃癌に関する情報を取得するためのマーカーとして用いられる、
前記核酸。 - 配列番号3の塩基配列からなる、請求項5に記載の核酸。
- プライマーを含む胃癌検出用試薬キットであって、
前記プライマーは、ZNF568遺伝子のプロモータ領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし、且つメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズするプライマーである、前記キット。 - 前記プライマーが、配列番号4または5の塩基配列からなるプライマーである請求項7に記載のキット。
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