JP2016174562A - METHOD FOR PREDICTING BLOOD STREAM INFECTION RISK OF MRSA WHICH USES SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM OF cna GENE OF METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS (MRSA) - Google Patents
METHOD FOR PREDICTING BLOOD STREAM INFECTION RISK OF MRSA WHICH USES SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM OF cna GENE OF METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS (MRSA) Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の血流感染のリスクを予測する方法に関する。 The present invention relates to a method for predicting the risk of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) bloodstream infection.
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)は、1940年代に工業的に量産化に成功したペニシリンに対し、当時良好な感受性を示し、化膿傷や肺炎などの治療に奏効した。しかし、ペニシリンの普及と使用量の増加に伴い、ペニシリン耐性株が世界各地に広がっていった。これに対抗するためメチシリンが開発され、1960年頃より欧米で使用されるようになった。しかしながら、間もなくメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus）が確認され、1970年代後半より海外の医療現場で大きな関心事となった。現在では、臨床分離される黄色ブドウ球菌の6割程度がMRSAと判定される事態に至っている。 Staphylococcus aureus showed good sensitivity to penicillin, which was successfully mass-produced industrially in the 1940s, and was effective in treating suppuration and pneumonia. However, with the spread of penicillin and the increase in usage, penicillin resistant strains spread around the world. Methicillin was developed to counter this, and has been used in Europe and America since about 1960. However, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) was soon confirmed and became a major concern in overseas medical settings since the late 1970s. Currently, about 60% of clinically isolated Staphylococcus aureus has been determined to be MRSA.
MRSAの病原性は通常の黄色ブドウ球菌と比較して特に強いわけではなく、それらと同等程度の各種感染症を引き起こす。したがって、通常の感染防御能力を有する人に対しては一般的に無害である。黄色ブドウ球菌と同様に常在菌のひとつと考えられ、健康な人の鼻腔、咽頭、皮膚などからも検出される。 The pathogenicity of MRSA is not particularly strong compared to normal S. aureus, and causes various infectious diseases similar to those. Therefore, it is generally harmless for people with normal infection defense capabilities. Like Staphylococcus aureus, it is considered to be one of the resident bacteria and is also detected in the nasal cavity, pharynx, and skin of healthy people.
一般的には内科系より外科系の疾患を有する患者で問題となる場合が多く、例えば開腹開胸手術後の術後感染などで治療困難な例も多い。特に透析等を必要とする血液疾患やガンなどの悪性疾患を基礎疾患に持つ患者ではリスクが高くなる。また、新生児や高齢者などもハイリスクグループとなる。 In general, there are many cases that are more problematic in patients with surgical diseases than internal medicine, and there are many cases that are difficult to treat due to, for example, postoperative infection after open thoracotomy. The risk is particularly high in patients who have blood diseases requiring dialysis or other malignant diseases such as cancer as basic diseases. Newborns and the elderly are also high-risk groups.
治療薬としては、バンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシン等の抗MRSA薬が用いられている。しかし、安全域及び有効治療域が狭いため、その血中濃度が有効域に達しないことによる耐性菌出現や、血中濃度を大きく超えてしまうことによる副作用発現の危険性がある。 Anti-MRSA drugs such as vancomycin, teicoplanin and arbekacin are used as therapeutic agents. However, since the safe range and the effective treatment range are narrow, there is a risk of appearance of resistant bacteria due to the blood concentration not reaching the effective range and the appearance of side effects due to the blood concentration being greatly exceeded.
MRSAはしばしば血流感染を起こし菌血症を誘発し、さらに重篤な感染症である敗血症を誘発する。MRSAの遺伝子を検出し、MRSA感染の有無を検出する方法は報告されていた（特許文献１及び２を参照）。しかし、感染に大きく関わる臨床症状とMRSAの遺伝子特異性との相関についてはこれまで検討されていなかった。
MRSA often causes bloodstream infections and induces bacteremia, and more severe infections, sepsis. A method for detecting the MRSA gene and detecting the presence or absence of MRSA infection has been reported (see
本発明は、MRSAの特定の遺伝子の一塩基多型を解析し、MRSAの血流感染のリスクを評価する方法の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for analyzing a single nucleotide polymorphism of a specific gene of MRSA and evaluating the risk of bloodstream infection of MRSA.
本発明者らは、MRSA感染症の発症/保菌とMRSAの遺伝子の関連を探るべく、MRSA株について網羅的遺伝子解析を行い、MRSAの接着やバイオフィルム形成に関与する遺伝子の１つであるcna遺伝子がMRSA感染症の発症/保菌と関連していることを見出した。類似のフェノタイプを有する遺伝子としてsdrC遺伝子、clfa遺伝子、clfb遺伝子、sdrD遺伝子、fnbA遺伝子等があるが、これらの遺伝子群と臨床像との間に関連はなかった。 In order to investigate the relationship between the onset / carrying of MRSA infection and the MRSA gene, the present inventors conducted comprehensive gene analysis on MRSA strains, and cna, one of the genes involved in MRSA adhesion and biofilm formation. We found that the gene is associated with the onset / carrying of MRSA infection. There are sdrC gene, clfa gene, clfb gene, sdrD gene, fnbA gene, etc. as genes having similar phenotypes, but there was no association between these gene groups and clinical features.
本発明者らは、クラスター解析により、血流感染を発症しやすいMRSA株群において、MRSAのcna遺伝子に一塩基多型が認められ、一塩基多型部位における変異を有するMRSA株において、血流感染を起こしやすいことを見出した。 According to the cluster analysis, the present inventors found that a single nucleotide polymorphism was found in the MRSA cna gene in a group of MRSA strains prone to develop bloodstream infection, and in the MRSA strain having a mutation at a single nucleotide polymorphism site, I found it easy to cause infection.
本発明者らは、MRSA株のcna遺伝子の一塩基多型を分析することにより、該MRSA株が血流感染を誘発するリスクを評価、判定し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have found that the MRSA strain can evaluate and determine the risk of inducing bloodstream infection by analyzing a single nucleotide polymorphism of the cna gene of the MRSA strain, and have completed the present invention. It was.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] MRSA（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）のcna遺伝子の変異を検出することを含む、MRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法であって、
a）被験体からMRSAを単離し、該MRSAから核酸試料を調製する工程、
b）前記MRSAのcna遺伝子の変異を検出する工程、
を含み、cna遺伝子の変異が検出された場合にMRSAの血液感染のリスクが高いと評価する、MRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[２] 変異が一塩基多型部位における変異である、[１]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[３] 変異がcna遺伝子がコードするCnaタンパク質のアミノ酸の置換をもたらすものである、[１]又は[２]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[４] 変異がcna遺伝子がコードするCnaタンパク質の機能ドメインのアミノ酸の置換をもたらすものである、[３]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[５] 変異が以下の（１）〜（１７）の少なくとも１つの変異である、[１]又は[２]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法：
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基におけるCからAへの変異、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基におけるGからTへの変異、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基におけるAからGへの変異、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基におけるTからAへの変異、
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基におけるCからAへの変異、
（１１） 配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基におけるCからTへの変異、
（１２） 配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基におけるAからGへの変異、
（１３） 配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基におけるCからTへの変異、
（１４） 配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基におけるGからAへの変異、
（１５） 配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基におけるTからCへの変異、
（１６） 配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基におけるTからCへの変異、及び
（１７） 配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基におけるTからCへの変異。
That is, the present invention is as follows.
[1] A test method for determining the risk of blood infection of MRSA, comprising detecting a mutation in the cna gene of MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus),
a) isolating MRSA from a subject and preparing a nucleic acid sample from the MRSA;
b) detecting a mutation in the MRSA cna gene;
A test method for determining the risk of blood infection with MRSA, wherein the risk of blood infection with MRSA is evaluated as high when a mutation in the cna gene is detected.
[2] The test method for determining the risk of MRSA blood infection according to [1], wherein the mutation is a mutation at a single nucleotide polymorphism site.
[3] The test method for determining the risk of blood infection with MRSA according to [1] or [2], wherein the mutation causes substitution of an amino acid of a Cna protein encoded by the cna gene.
[4] The test method for determining the risk of blood infection of MRSA according to [3], wherein the mutation causes substitution of an amino acid in a functional domain of the Cna protein encoded by the cna gene.
[5] The testing method for determining the risk of blood infection with MRSA of [1] or [2], wherein the mutation is at least one of the following (1) to (17):
(1) a C to A mutation at the 2840th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a mutation from G to T at the 2272nd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(3) a G to A mutation at the 2266th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(4) G to A mutation at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(5) a C to A mutation at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(6) a mutation from G to T at the 1711th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(7) a G to T mutation at the 194th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(8) A to G mutation at the 191st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(9) a mutation from T to A at the 136th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(10) a C to A mutation at the 78th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(11) a C to T mutation at the 2253rd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(12) A to G mutation at the 1983th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(13) C to T mutation at the 1941st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(14) a mutation from G to A at the 1842th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(15) T to C mutation at the 1716th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(16) T to C mutation at the 1530th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (17) T to C mutation at the 12th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[６] 変異が以下の（１）〜（１０）の少なくとも１つの変異である、[３]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法：
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてA947Dの置換をもたらす変異、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV758Lの置換をもたらす変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてE756Kの置換をもたらす変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV746Iの置換をもたらす変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてT663Kの置換をもたらす変異、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV571Lの置換をもたらす変異、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてG65Vの置換をもたらす変異、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基におけるAからGへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてN64Sの置換をもたらす変異、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基におけるTからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてS46Tの置換をもたらす変異、及び
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における、CからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてD26Eの置換をもたらす変異。
[6] The test method for determining the risk of blood infection with MRSA according to [3], wherein the mutation is at least one of the following (1) to (10):
(1) A mutation from C to A at the 2840th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which causes substitution of A947D in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2,
(2) a mutation from G to T at the 2272nd base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of V758L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(3) a mutation from G to A at the 2266th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of E756K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(4) a mutation from G to A at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of V746I in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(5) a mutation from C to A at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of T663K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(6) a mutation from G to T at the 1711th base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of V571L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(7) a mutation from G to T at the 194th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of G65V in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(8) A mutation from A to G at the 191st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which causes substitution of N64S in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2,
(9) A mutation from T to A at the 136th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which causes substitution of S46T in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2, and (10) A mutation from C to A in the 78th base of the nucleotide sequence represented by No. 1 and resulting in a substitution of D26E in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID No. 2.
[７] 変異が以下の（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）の少なくとも１つの変異である、[４]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法：
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV758Lの置換をもたらす変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてE756Kの置換をもたらす変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV746Iの置換をもたらす変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてT663Kの置換をもたらす変異、及び
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV571Lの置換をもたらす変異。
[８] シークエンス解析により変異を検出する、[１]〜[７]のいずれかのMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[９] MRSAが血流感染のリスクが高いと評価された場合に、該MRSAは敗血症を引き起こすリスクが高いと判定する、[１]〜[８]のいずれかのMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[7] The test for determining the risk of blood infection with MRSA according to [4], wherein the mutation is at least one of the following (2), (3), (4), (5) and (6): Method:
(2) a mutation from G to T at the 2272nd base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of V758L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(3) a mutation from G to A at the 2266th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of E756K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(4) a mutation from G to A at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of V746I in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(5) a mutation from C to A at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which causes substitution of T663K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2, and (6) sequence A mutation from G to T in the 1711th base of the nucleotide sequence represented by No. 1, which causes substitution of V571L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID No. 2.
[8] A test method for determining a risk of blood infection with MRSA according to any one of [1] to [7], wherein a mutation is detected by sequence analysis.
[9] When MRSA is evaluated to have a high risk of bloodstream infection, the MRSA is judged to have a high risk of causing sepsis. The risk of blood infection of MRSA according to any one of [1] to [8] Inspection method for judging.
[１０] 配列番号１で表されるMRSAのcna遺伝子の塩基配列の以下の(１)〜(１７)の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブ：
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における一塩基多型部位、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における一塩基多型部位、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における一塩基多型部位、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における一塩基多型部位、
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における一塩基多型部位、
（１１） 配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基における一塩基多型部位、
（１２） 配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基における一塩基多型部位、
（１３） 配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基における一塩基多型部位、
（１４） 配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基における一塩基多型部位、
（１５） 配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基における一塩基多型部位、
（１６） 配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基における一塩基多型部位、及び
（１７） 配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基における一塩基多型部位。
[１１] 配列番号１で表されるMRSAのcna遺伝子の塩基配列の以下の(１)〜(１０)の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブ：
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における一塩基多型部位、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における一塩基多型部位、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における一塩基多型部位、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における一塩基多型部位、及び
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における一塩基多型部位。
[１２] 配列番号１で表されるMRSAのcna遺伝子の塩基配列の以下の（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブ：
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、及び
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位。
[１３] [１０]〜[１２]のいずれかのプローブ又はその標識物を標識した固定化基板からなるDNAチップ。
[10] An oligonucleotide comprising at least one single nucleotide polymorphic site of the following (1) to (17) of the nucleotide sequence of the MRSA cna gene represented by SEQ ID NO: 1, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 Bloodstream infection of MRSA consisting of an oligonucleotide consisting of a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the above or a sequence complementary to the partial sequence, or a sequence that can hybridize with these sequences under stringent conditions, or a label thereof Probes for performing tests to determine the risk of:
(1) a single nucleotide polymorphism site at the 2840th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a single nucleotide polymorphism site at the 2272nd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(3) a single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(4) a single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(5) a single nucleotide polymorphism site at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(6) a single nucleotide polymorphism site at the 1711th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(7) a single nucleotide polymorphic site at the 194th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(8) a single nucleotide polymorphism site at the 191st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(9) a single nucleotide polymorphism site at the 136th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(10) a single nucleotide polymorphism site at the 78th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(11) a single nucleotide polymorphism site at the 2253rd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(12) a single nucleotide polymorphism site at the 1983th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(13) a single nucleotide polymorphism site at the 1941st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(14) a single nucleotide polymorphism site at the 1842th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(15) a single nucleotide polymorphism site at the 1716th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(16) a single nucleotide polymorphic site at the 1530th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1; and (17) a single nucleotide polymorphic site at the 12th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[11] An oligonucleotide comprising at least one single nucleotide polymorphic site of the following (1) to (10) of the nucleotide sequence of the MRSA cna gene represented by SEQ ID NO: 1, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 Bloodstream infection of MRSA consisting of an oligonucleotide consisting of a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the above or a sequence complementary to the partial sequence, or a sequence that can hybridize with these sequences under stringent conditions, or a label thereof Probes for performing tests to determine the risk of:
(1) a single nucleotide polymorphism site at the 2840th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a single nucleotide polymorphism site at the 2272nd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(3) a single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(4) a single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(5) a single nucleotide polymorphism site at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(6) a single nucleotide polymorphism site at the 1711th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(7) a single nucleotide polymorphic site at the 194th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(8) a single nucleotide polymorphism site at the 191st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(9) A single nucleotide polymorphic site at the 136th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and (10) a single nucleotide polymorphic site at the 78th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[12] Contains at least one single nucleotide polymorphic site of the following (2), (3), (4), (5) and (6) of the base sequence of the MRSA cna gene represented by SEQ ID NO: 1. An oligonucleotide comprising a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the base sequence of SEQ ID NO: 1, a sequence complementary to the partial sequence, or a sequence capable of hybridizing with these sequences under stringent conditions Alternatively, a probe comprising a label for performing a test for determining the risk of bloodstream infection of MRSA:
(2) a single nucleotide polymorphism site at the 2272nd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(3) a single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(4) a single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(5) a single nucleotide polymorphic site at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (6) a single nucleotide polymorphic site at the 1711th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[13] A DNA chip comprising an immobilized substrate labeled with the probe according to any one of [10] to [12] or a label thereof.
MRSAのcna遺伝子は、MRSAの接着やバイオフィルム形成に関与する遺伝子であり、cna遺伝子の一塩基多型部位における変異が、MRSAの血流感染の起こしやすさに関連している。従って、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型を分析することにより、MRSAの血流感染を起こすリスクを評価、判定することができる。 The MRSA cna gene is involved in MRSA adhesion and biofilm formation, and mutations in the single nucleotide polymorphic site of the cna gene are associated with the likelihood of MRSA bloodstream infection. Therefore, by analyzing the single nucleotide polymorphism of the MRSA cna gene, the risk of causing MRSA bloodstream infection can be evaluated and determined.
特定の被験体から単離したMRSAが血流感染を起こすリスクがあると判定された場合、厳格な除菌を行ったり、あるいは、効果的な抗MRSA薬の投与計画を設計し、未然にMRSAの血流感染を防ぐことが可能になる。 If MRSA isolated from a particular subject is determined to be at risk of developing a bloodstream infection, rigorously sterilize or design an effective anti-MRSA drug regimen before MRSA It becomes possible to prevent bloodstream infection.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、MRSA（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）のcna遺伝子の一塩基多型を検出することにより、MRSAが血流感染を起こすリスクを評価判定する方法である。MRSAの血流感染とは、MRSAが血管内に侵入することをいい、MRSAが血液中に存在している状態を菌血症という。MRSAの血流感染は、カテーテルを介して起こることが多く、カテーテルを介して感染することをカテーテル関連血流感染（CRBSI)という。血流感染したMRSAによる感染症を敗血症といい、敗血症に罹患した患者の死亡率は高い。すなわち、MRSAが血流感染を起こした場合、敗血症を発症するリスクが高まる。本発明により、MRSAが血流感染するリスク、MRSA菌血症となるリスク、及びMRSAが敗血症を誘発するリスクを評価判定することができる。さらに、本発明において、敗血症の重症化のリスクの評価、判定も行うことができる。 The present invention is a method for evaluating and determining the risk of MRSA causing bloodstream infection by detecting a single nucleotide polymorphism of the cna gene of MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus). MRSA bloodstream infection refers to MRSA invading blood vessels, and the state where MRSA is present in blood is called bacteremia. MRSA bloodstream infection often occurs via a catheter, and the infection via a catheter is called catheter-related bloodstream infection (CRBSI). Infections caused by bloodstream-infected MRSA are called sepsis, and the mortality rate of patients suffering from sepsis is high. That is, when MRSA causes bloodstream infection, the risk of developing sepsis increases. According to the present invention, the risk of MRSA causing bloodstream infection, the risk of becoming MRSA bacteremia, and the risk of MRSA inducing sepsis can be evaluated and determined. Furthermore, in the present invention, it is possible to evaluate and determine the risk of increasing the severity of sepsis.
cna遺伝子領域は，細菌の接着・バイオフィルム形成に関与する遺伝子のひとつである。MRSAは株によっては、cna遺伝子領域を欠失しており、cna遺伝子領域を有するMRSAについてcna遺伝子の一塩基多型を調べればよい。 The cna gene region is one of the genes involved in bacterial adhesion and biofilm formation. MRSA lacks the cna gene region in some strains, and single nucleotide polymorphisms of the cna gene may be examined for MRSA having the cna gene region.
本発明においては、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型（SNPs）を分析し一塩基多型部位におけるcna遺伝子の変異を検出し、MRSAが血流感染を起こすリスク、MRSA菌血症となるリスク、又はMRSAが敗血症を誘発するリスクを評価判定するための検査を行い、MRSAが血流感染を起こすリスク、MRSA菌血症となるリスク、又はMRSAが敗血症を誘発するリスクを予測、評価、判定するための補助的データを取得する。評価、判定とは予測ともいう。 In the present invention, single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the MRSA cna gene are analyzed to detect mutations in the cna gene at the single nucleotide polymorphism site, and the risk of MRSA causing bloodstream infection and the risk of MRSA bacteremia Or test to evaluate and assess the risk of MRSA inducing sepsis, predicting, assessing and assessing the risk of MRSA causing bloodstream infection, the risk of MRSA bacteremia, or the risk of MRSA inducing sepsis To get supplementary data. Evaluation and determination are also called prediction.
本発明者らは、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型（SNPs)が血流感染の起こしやすさと関連していることを見出し、本発明を完成させたが、ここで血流感染の起こしやすさと関連しているとは、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型部位の変異とMRSAの血流感染のしやすさとが統計学的に関連していることをいう。 The present inventors have found that single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the cRNA gene of MRSA are related to the likelihood of bloodstream infection, and have completed the present invention. Is related statistically to the mutation of the single nucleotide polymorphism site in the MRSA cna gene and the susceptibility to MRSA bloodstream infection.
一塩基多型の分析は、一塩基多型部位の塩基の種類、すなわちアレルを決定することをいい、１対の染色体上の一方の染色体について検出する場合も、両方の染色体について検出する場合も包含され、両方の染色体について検出する場合にも、一塩基多型部位においてホモ接合性かヘテロ接合性かの検出を含む。MRSA株から単離した試料に含まれる特定のアレルに対立する各々のアレルを検出し、遺伝子型を決定することができる。あるアレルのみが検出された場合は当該アレルをホモに有するホモ接合性であり、２つのアレルが検出された場合には該２つのアレルをヘテロに有するヘテロ接合性である。 Single nucleotide polymorphism analysis is the determination of the type of base at a single nucleotide polymorphism site, that is, the allele, which may be detected for one chromosome on a pair of chromosomes or for both chromosomes. Including and detecting for both chromosomes also includes detection of homozygous or heterozygous at single nucleotide polymorphism sites. Each allele that opposes a specific allele in a sample isolated from an MRSA strain can be detected and genotyped. When only a certain allele is detected, it is homozygous having the allele as a homozygote, and when two alleles are detected, it is heterozygous having the two alleles as heterogeneous.
本発明の方法においては、被験体からMRSAを単離し、該MRSAのcna遺伝子における一塩基多型部位の変異の有無を検出する。被験体から採取した菌がMRSAであるか否かは、公知の薬剤感受性を測定する方法、PBP2'（penicillin binding protein 2'）を検出する方法又はmecA遺伝子を検出する方法により判断することができる。薬剤感受性測定は、ディスク拡散法、Etest、微量液体希釈法等により行うことができる。
In the method of the present invention, MRSA is isolated from a subject, and the presence or absence of a mutation at a single nucleotide polymorphism site in the cna gene of the MRSA is detected. Whether or not the bacteria collected from the subject is MRSA can be determined by a known method for measuring drug sensitivity, a method for detecting PBP2 ′ (
具体的には、cna遺伝子の以下の（１）〜（１７）の一塩基多型の少なくとも１つの一塩基多型を分析する。cna遺伝子の塩基配列を配列番号１に、cna遺伝子がコードするCnaタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に表す。cna遺伝子のセンス鎖の塩基配列は、MRSAゲノムのアンチセンス鎖の塩基配列の2809884番目の塩基から2812874番目の塩基配列に相当する。以下の（１）〜（１７）において「2810035：G>T」等の記載は、MRSAゲノムのアンチセンス鎖の配列中の塩基番号を示すとともに、アンチセンス鎖のGがTに変異していることを示す。cna遺伝子のセンス鎖においては、例えば、「2810035：G>T」で表される一塩基多型部位の変異は配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における多型であり、CのAへの変異になる。図２においても同様に「2810035：G>T」等で一塩基多型部位の変異を示しているが、図２の各変異は下の（１）〜（１７）の変異である。 Specifically, at least one single nucleotide polymorphism of the following single nucleotide polymorphisms of the cna gene (1) to (17) is analyzed. The nucleotide sequence of the cna gene is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the Cna protein encoded by the cna gene is shown in SEQ ID NO: 2. The base sequence of the sense strand of the cna gene corresponds to the base sequence from the 280984th base to the 2812874th base sequence of the antisense strand of the MRSA genome. In the following (1) to (17), descriptions such as “2810035: G> T” indicate the base number in the sequence of the antisense strand of the MRSA genome, and G of the antisense strand is mutated to T It shows that. In the sense strand of the cna gene, for example, the mutation at the single nucleotide polymorphism site represented by “2810035: G> T” is a polymorphism at the 2840th base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, Mutation to A. Similarly, in FIG. 2, mutations at the single nucleotide polymorphism site are indicated by “2810035: G> T” or the like, but the mutations in FIG. 2 are the following mutations (1) to (17).
（１）2810035:G>T
配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における多型をいい、C（野生型）又はA（変異型）である。
（２）2810603:C>A
配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はT（変異型）である。
（３）2810609:C>T
配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はA（変異型）である。
（４）2810639:C>T
配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はA（変異型）である。
（５）2810887:G>T
配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における多型をいい、C（野生型）又はA（変異型）である。
（６）2811164:C>A
配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はT（変異型）である。
（７）2812681:C>A
配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はT（変異型）である。
（８）2812684:T>C
配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における多型をいい、A（野生型）又はG（変異型）である。
（９）2812739:A>T
配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における多型をいい、T（野生型）又はA（変異型）である。
（１０）2812797:G>T
配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における多型をいい、C（野生型）又はA（変異型）である。
（１１）2810622:G>A
配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基における多型をいい、C（野生型）又はT（変異型）である。
（１２）2810892:T>C
配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基における多型をいい、A（野生型）又はG（変異型）である。
（１３）2810934:G>A
配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基における多型をいい、C（野生型）又はT（変異型）である。
（１４）2811033:C>T
配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はA（変異型）である。
（１５）2811159:A>G
配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基における多型をいい、T（野生型）又はC（変異型）である。
（１６）2811345:A>G
配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基における多型をいい、T（野生型）又はC（変異型）である。
（１７）2812863:A>G
配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基における多型をいい、T（野生型）又はC（変異型）である。
(1) 2810035: G> T
The polymorphism at the 2840th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is referred to as C (wild type) or A (mutant type).
(2) 2810603: C> A
This refers to a polymorphism at the 2272st base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is G (wild type) or T (mutant).
(3) 2810609: C> T
The polymorphism at the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is referred to as G (wild type) or A (mutant type).
(4) 2810639: C> T
The polymorphism at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is referred to as G (wild type) or A (mutant type).
(5) 2810887: G> T
The polymorphism at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is referred to as C (wild type) or A (mutant type).
(6) 2811164: C> A
The polymorphism at the 1711th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is referred to as G (wild type) or T (mutant type).
(7) 2812681: C> A
The polymorphism at the 194th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is referred to as G (wild type) or T (mutant type).
(8) 2812684: T> C
This refers to a polymorphism at the 191st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is A (wild type) or G (mutant).
(9) 2812739: A> T
The polymorphism at the 136th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is referred to as T (wild type) or A (mutant type).
(10) 2812797: G> T
The polymorphism at the 78th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is referred to as C (wild type) or A (mutant type).
(11) 2810622: G> A
This refers to a polymorphism at the 2253rd base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is C (wild type) or T (mutant).
(12) 2810892: T> C
The polymorphism at the 1983th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is referred to as A (wild type) or G (mutant).
(13) 2810934: G> A
The polymorphism at the 1941st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is referred to as C (wild type) or T (mutant).
(14) 2811033: C> T
The polymorphism at the 1842th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is referred to as G (wild type) or A (mutant).
(15) 2811159: A> G
This refers to a polymorphism at the 1716th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is T (wild type) or C (mutant).
(16) 2811345: A> G
This refers to a polymorphism at the 1530th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is T (wild type) or C (mutant).
(17) 2812863: A> G
The polymorphism at the 12th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is referred to as T (wild type) or C (mutant).
上記一塩基多型部位における塩基の変異を検出すればよい。
これら17の一塩基多型のうち、（１）〜（１０）の変異は以下のCnaタンパク質のアミノ酸変異を伴うミスセンス変異である（図９〜１１）。
What is necessary is just to detect the variation | mutation of the base in the said single nucleotide polymorphic site.
Among these 17 single nucleotide polymorphisms, the mutations (1) to (10) are missense mutations accompanied by amino acid mutations in the following Cna protein (FIGS. 9 to 11).
（１）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の947番目のアラニン（A）のアスパラギン酸（D)への置換（A947D)
（２）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の758番目のバリン（V）のロイシン（L)への置換（V758L)
（３）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の756番目のグルタミン酸（E）のリジン（K)への置換（E756K)
（４）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の746番目のバリン（V）のイソロイシン（I)への置換（V746I)
（５）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の663番目のトレオニン（T）のリジン（K)への置換（T663K)
（６）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の571番目のバリン（V）のロイシン（I)への置換（V571L)
（７）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列のCnaタンパク質の65番目のグリシン（G）のバリン（V)への置換（G65V)
（８）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列のCnaタンパク質の64番目のアスパラギン（N）のセリン（S)への置換（N64S)
（９）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列のCnaタンパク質の46番目のセリン（S）のトレオニン（T)への置換（S46T)
（１０）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列のCnaタンパク質の26番目のアスパラギン酸（D）のグルタミン酸（E)への置換（D26E)
(1) Replacement of the 947th alanine (A) with aspartic acid (D) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (A947D)
(2) Substitution of 758th valine (V) to leucine (L) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (V758L)
(3) Substitution of 756th glutamic acid (E) to lysine (K) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (E756K)
(4) Substitution of 746th valine (V) to isoleucine (I) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (V746I)
(5) Substitution of 663 threonine (T) to lysine (K) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (T663K)
(6) Substitution of 571 valine (V) to leucine (I) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (V571L)
(7) Replacement of amino acid sequence of Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 with valine (G65) of glycine (G) at position 65 of Cna protein (G65V)
(8) Replacement of the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 with the serine (S) of the 64th asparagine (N) of the Cna protein (N64S)
(9) Replacement of the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 with the threonine (T) of the 46th serine (S) of the Cna protein (S46T)
(10) Replacement of the 26th aspartic acid (D) with glutamic acid (E) of the Cna protein in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (D26E)
このうち、（２）V758L、（３）E756K、（４）V746I、（５）T663K及び（６）V571Lの５つの変異は、配列番号２に表されるアミノ酸配列の第533番目から905番目の配列からなるCnaタンパク質の機能ドメインにおける変異である（図１１）。 Of these, five mutations (2) V758L, (3) E756K, (4) V746I, (5) T663K, and (6) V571L are from the 533rd to 905th amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. This is a mutation in the functional domain of the Cna protein consisting of the sequence (FIG. 11).
MRSAのcna遺伝子において、上記（１）〜（１７）の一塩基多型部位における少なくとも１つの塩基の野生型から変異型への変異を検出すればよい。特に、Cnaタンパク質のアミノ酸の置換を伴う（１）〜（１０）の変異を検出することが好ましく、さらに、Cnaタンパク質の機能ドメインに存在するアミノ酸の置換を伴う（２）、（３）、（４）、（５）又は（６）の変異を検出すればよい。すなわち、（１）〜（１７）の一塩基多型部位における、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個若しくは又は17個の部位における変異を検出すればよく、あるいは、（１）〜（１０）の一塩基多型部位における、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは10個の部位における変異を検出すればよく、あるいは、（２）、（３）、（４）、（５）又は（６）の一塩基多型部位における、１個、２個、３個、４個若しくは５個の部位における変異を検出すればよい。 In the MRSA cna gene, it is only necessary to detect a mutation from the wild type to the mutant type of at least one base in the single nucleotide polymorphic site of the above (1) to (17). In particular, it is preferable to detect mutations (1) to (10) involving substitution of amino acids of Cna protein, and further, substitution of amino acids present in the functional domain of Cna protein (2), (3), ( What is necessary is just to detect the mutation of 4), (5) or (6). That is, one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven in the single nucleotide polymorphic site of (1) to (17), It suffices to detect mutations at 12, 13, 14, 15, 16, or 17 sites, or 1, 2 at the single nucleotide polymorphism sites of (1) to (10). It suffices to detect mutations at three, four, five, six, seven, eight, nine or ten sites, or (2), (3), (4), (5 ) Or (6) a mutation at one, two, three, four or five sites in the single nucleotide polymorphism site may be detected.
また、MRSAのcna遺伝子がコードするCnaタンパク質における（１）〜（１０）の一塩基多型により生じるアミノ酸の変異を検出してもよく、好ましくは（２）、（３）、（４）、（５）又は（６）の一塩基多型により生じるアミノ酸変異を検出すればよい。 Moreover, you may detect the variation | mutation of the amino acid which arises by the single nucleotide polymorphism in (1)-(10) in Cna protein which the cna gene of MRSA codes, Preferably (2), (3), (4), What is necessary is just to detect the amino acid variation which arises by the single nucleotide polymorphism of (5) or (6).
上記のcna遺伝子の一塩基多型部位に変異がある場合、MRSAは血流感染を起こすリスクが高く、菌血症を誘発するリスクが高く、さらに敗血症を誘発するリスクが高いと評価判定することができる。 MRSA has a high risk of causing bloodstream infection, a high risk of inducing bacteremia, and a high risk of inducing sepsis if there is a mutation in the single nucleotide polymorphic site of the above cna gene Can do.
また、上記一塩基多型の代わりに、上記一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型を分析してもよい。上記一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型とは、上記遺伝子多型と関連性のある遺伝子多型であり、具体的には、上記遺伝子多型がＸである場合には、常に別の遺伝子多型がＹとなるという関係が成立するものである。 Instead of the single nucleotide polymorphism, a single nucleotide polymorphism in linkage disequilibrium with the single nucleotide polymorphism may be analyzed. The single nucleotide polymorphism in linkage disequilibrium with the single nucleotide polymorphism is a genetic polymorphism related to the genetic polymorphism. Specifically, when the genetic polymorphism is X, The relationship that another gene polymorphism is always Y is established.
本発明において、上記の（１）〜（１７）の一塩基多型は、被験体に感染したMRSAが血流感染するリスク、MRSA菌血症となるリスク、及びMRSAが敗血症を誘発するリスクを判定するための遺伝子マーカーということができる。 In the present invention, the single nucleotide polymorphisms of the above (1) to (17) have a risk that MRSA infected with a subject has a bloodstream infection risk, MRSA bacteremia, and a risk that MRSA induces sepsis. It can be referred to as a genetic marker for determination.
本発明の方法においては、最初に被験体から試料を採取し、該試料中のMRSAの存在を確認する。試料としては、咽頭若しくは鼻腔ぬぐい液、咽頭若しくは鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、唾液、便、便懸濁液、尿、痰等が挙げられる。単離したMRSA株のcna遺伝子の上記の一塩基多型を分析する。cna遺伝子の一塩基多型の分析の前に、単離したMRSAがcna遺伝子領域を有しているか否かを検出してもよい。MRSAがcna遺伝子領域を有していない場合、以後の一塩基多型の分析を行う必要はない。 In the method of the present invention, a sample is first collected from a subject, and the presence of MRSA in the sample is confirmed. Samples include pharyngeal or nasal wipes, pharyngeal or nasal wash, nasal aspirate, saliva, stool, stool suspension, urine, sputum and the like. The single nucleotide polymorphism of the isolated MRSA strain cna gene is analyzed. Prior to analysis of the single nucleotide polymorphism of the cna gene, it may be detected whether or not the isolated MRSA has the cna gene region. When MRSA does not have the cna gene region, it is not necessary to perform subsequent single nucleotide polymorphism analysis.
MRSAのcna遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、サンガー法、ジデオキシ法、サイクルシークエンス法、Maxam-Gilbert法（化学分解法）等の公知の方法により直接配列決定するシークエンス解析による解析法、遺伝子多型に特異的なプローブや該プローブを固定化したマイクロアレイ（DNAチップ）などを用いるハイブリダイゼーション法、遺伝子多型に特異的なプライマーを用いる種々の方法があげられ、さらに具体的に、PCR法、LAMP法、制限断片長多型（RFLP）を利用する方法、NASBA法、LCR法、SDA法、変性勾配ゲル電気泳動法（DGGE）、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（CCM）、プライマー伸長法（TaqMan（登録商標）法）、PCR-SSCP法、SNaPshot法、MassArray法、一本鎖コンフォメーション多型解析（SSCP;single strand conformation polymorphism）、Invader法、シングルヌクレオチドプライマー法、Pyrosequncing法、SNP-IT法、BeadArray法、Scorpion法、MADI-TOF/MS法等が挙げられる。 Analysis of single nucleotide polymorphisms in the MRSA cna gene can be performed by conventional gene polymorphism analysis methods. For example, analysis methods by sequence analysis that directly sequence by known methods such as the Sanger method, dideoxy method, cycle sequence method, Maxam-Gilbert method (chemical degradation method), probes specific to gene polymorphisms and immobilizing the probes Hybridization methods using microarrays (DNA chips), etc., and various methods using primers specific to gene polymorphism, and more specifically, PCR method, LAMP method, restriction fragment length polymorphism (RFLP) , NASBA method, LCR method, SDA method, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), method using chemical cleavage of mismatch site (CCM), primer extension method (TaqMan (registered trademark) method), PCR-SSCP method, SNaPshot method, MassArray method, single strand conformation polymorphism (SSCP), Invader method, single nucleotide primer method, Examples include Pyrosequncing method, SNP-IT method, BeadArray method, Scorpion method, MADI-TOF / MS method and the like.
また、シークエンス解析による解析法の１つとして、数千万のDNA断片の塩基配列を同時並行的に決定することができる次世代シーケンサー（第２世代シーケンサー）を用いた方法も利用できる。次世代シーケンサーとしては、Genome Sequencer FLX(GD FLX）（Roche社）、Illumina HiSeq/MiSeq（Illumina社）、Genome Analyzer IIx(GAIIx)（Illumina社）等を用いることができる。 In addition, as one analysis method by sequence analysis, a method using a next-generation sequencer (second generation sequencer) capable of simultaneously determining the base sequences of tens of millions of DNA fragments can be used. Genome Sequencer FLX (GD FLX) (Roche), Illumina HiSeq / MiSeq (Illumina), Genome Analyzer IIx (GAIIx) (Illumina), etc. can be used as the next-generation sequencer.
シークエンス解析による解析法は公知の方法で行えばよく、具体的には、一塩基多型部位の５’側の数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、一塩基多型部位の塩基を決定すればよい。 The analysis method by sequence analysis may be performed by a known method. Specifically, a sequence reaction is performed using a primer set at a position of several tens of bases on the 5 ′ side of the single nucleotide polymorphism site, and the analysis result From this, the base of the single nucleotide polymorphism site may be determined.
プローブやマイクロアレイを用いる方法は、一塩基多型部位を含むcna遺伝子配列の一部配列に対応するオリゴヌクレオチド又はその相補的配列、或いはそれらの配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いて行うことができる。すなわち、MRSAから単離した核酸試料、あるいは単離核酸試料をPCR等の公知の方法により増幅した核酸試料とプローブとをハイブリダイゼーションさせ分析すればよい。ハイブリダイゼーションの条件は、一塩基多型を区別するのに足りる条件である。例えば遺伝子多型部位が特定の塩基の場合にはハイブリダイズするが、他の塩基の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件が挙げられる。このような条件は当業者ならば適宜設定することができる。一例として、ストリンジェントな条件としては、約5〜6×SSC中において、約60℃以上、好ましくは約65℃以上、さらに好ましくは約70℃以上でハイブリダイゼーションを行う条件をいう。また、ストリンジェントな条件は、約0.1〜1×SSC中において、約40〜70℃、好ましくは約50〜67℃、さらに好ましくは約60〜65℃で洗浄処理を行うことを含むものであってもよい。 The method using a probe or microarray is an oligonucleotide consisting of an oligonucleotide corresponding to a partial sequence of a cna gene sequence containing a single nucleotide polymorphism site, a complementary sequence thereof, or a sequence that hybridizes to these sequences under stringent conditions. This can be performed using a probe consisting of nucleotides. That is, a nucleic acid sample isolated from MRSA or a nucleic acid sample obtained by amplifying the isolated nucleic acid sample by a known method such as PCR may be hybridized and analyzed. Hybridization conditions are sufficient to distinguish single nucleotide polymorphisms. For example, it may be hybridized when the gene polymorphic site is a specific base, but not hybridized when it is another base, such as stringent conditions. Such conditions can be appropriately set by those skilled in the art. As an example, stringent conditions refer to conditions in which hybridization is performed in about 5-6 × SSC at about 60 ° C. or higher, preferably about 65 ° C. or higher, more preferably about 70 ° C. or higher. Further, stringent conditions include performing a washing treatment at about 40 to 70 ° C., preferably about 50 to 67 ° C., more preferably about 60 to 65 ° C. in about 0.1 to 1 × SSC. May be.
プローブの一端を基板に固定することによりDNAチップ（マイクロアレイ）を作製し、該DNAチップを用いてもよい。この場合、DNAチップには、１つの遺伝子多型部位に対応するプローブのみが固定されていても、複数の遺伝子多型部位に対応するプローブが固定されていてもよい。プローブを固定化する基板としては、ニトロセルロース膜、スライドガラス、マイクロビーズ等が挙げられる。DNAチップを作製する際、プローブとなるオリゴヌクレオチドは基板上で合成してもよく、あるいは合成したオリゴヌクレオチドを基板上に固定化することもできる。市販のアレイヤー等を用いることによりプローブであるオリゴヌクレオチドを吸着や共有結合を利用して固定化することできる。このようなDNAチップを用いた遺伝子多型の検出は、例えば「DNAマイクロアレイと最新PCR法」、村松正明及び那波浩之監修、秀潤社、2000年、第10章などに記載されている。一塩基多型を検出するためのプローブは、蛍光物質、酵素、化学発光物質、放射性同位体等で標識されていてもよい。標識は、フルオレセイン、Cy3、Cy5、ローダミン等の公知の標識物質を用い、公知の方法で行うことができる。
A DNA chip (microarray) may be prepared by fixing one end of the probe to the substrate, and the DNA chip may be used. In this case, only a probe corresponding to one gene polymorphic site may be immobilized on the DNA chip, or probes corresponding to a plurality of gene polymorphic sites may be immobilized. Examples of the substrate on which the probe is immobilized include a nitrocellulose membrane, a slide glass, and microbeads. When producing a DNA chip, an oligonucleotide to be a probe may be synthesized on a substrate, or the synthesized oligonucleotide can be immobilized on the substrate. By using a commercially available arrayer or the like, an oligonucleotide as a probe can be immobilized using adsorption or covalent bond. The detection of genetic polymorphism using such a DNA chip is described in, for example, “DNA microarray and latest PCR method”, supervised by Masaaki Muramatsu and Hiroyuki Nami, Shujunsha, 2000,
cna遺伝子の一塩基多型を検出するためのプローブは、一塩基多型の配列情報に基づいて適宜設計することができる。プローブとしては、cna遺伝子の一塩基多型部位を含む塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列、あるいはそれらの配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列からなる、塩基長が5〜50、好ましくは10〜30、さらに好ましくは10〜25のヌクレオチドを用いることができる。 A probe for detecting a single nucleotide polymorphism of the cna gene can be appropriately designed based on the single nucleotide polymorphism sequence information. The probe includes a nucleotide sequence comprising a single nucleotide polymorphic site of the cna gene, a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, or a sequence that can hybridize to these sequences under stringent conditions, and has a base length of 5 ˜50, preferably 10-30, more preferably 10-25 nucleotides can be used.
本発明の方法で用いるプローブとして、配列番号１で表されるMRSAのcna遺伝子の塩基配列の以下の(１)〜(１７)の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブが挙げられる。 As a probe used in the method of the present invention, an oligonucleotide comprising at least one single nucleotide polymorphism site of the following (1) to (17) of the nucleotide sequence of the MRSA cna gene represented by SEQ ID NO: 1, It consists of a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a sequence complementary to the partial sequence, or an oligonucleotide consisting of a sequence that can hybridize with these sequences under stringent conditions, or a label thereof. And probes for performing tests to determine the risk of MRSA bloodstream infection.
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における一塩基多型部位
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における一塩基多型部位
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における一塩基多型部位
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における一塩基多型部位
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における一塩基多型部位
（１１） 配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基における一塩基多型部位
（１２） 配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基における一塩基多型部位
（１３） 配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基における一塩基多型部位
（１４） 配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基における一塩基多型部位
（１５） 配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基における一塩基多型部位
（１６） 配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基における一塩基多型部位
（１７） 配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基における一塩基多型部位
(1) Single nucleotide polymorphism site at the 2840th base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (2) Single nucleotide polymorphism site at the 2272nd nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (3) SEQ ID NO: 1 Single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the nucleotide sequence shown in (4) Single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (5) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 Single nucleotide polymorphism site at base 1988 (6) Single nucleotide polymorphism site at base 1711 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (7) Single nucleotide polymorphism site at nucleotide 194 of SEQ ID NO: 1 Nucleotide polymorphism site (8) Single nucleotide polymorphism site at base 191 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (9) Single nucleotide polymorphism site at base 136 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (10 ) Represented by SEQ ID NO: 1 Single nucleotide polymorphism site at the 78th base of the nucleotide sequence (11) Single nucleotide polymorphism site at the 2253rd base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (12) 1983 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 Single nucleotide polymorphic site in the base of (13) Single nucleotide polymorphic site in the 1941st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (14) Single base polymorphism in the 1842th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 Type site (15) Single nucleotide polymorphism site at base 1617 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (16) Single nucleotide polymorphism site at base 1530 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (17) Sequence Single nucleotide polymorphism site in the 12th base of the base sequence shown by number 1
この中でも、(１)〜(１０)の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブが好ましく、（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブがさらに好ましい。 Among them, an oligonucleotide comprising at least one single nucleotide polymorphic site of (1) to (10), which is a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or complementary to the partial sequence A probe for performing a test for determining the risk of bloodstream infection of MRSA, comprising an oligonucleotide consisting of a sequence, or a sequence that can hybridize with these sequences under stringent conditions, or a label thereof, is preferred ( 2) An oligonucleotide containing at least one single nucleotide polymorphic site of (3), (4), (5) and (6), which is a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the base sequence of SEQ ID NO: 1. Or MRSA consisting of an oligonucleotide consisting of a sequence complementary to a partial sequence thereof, or a sequence capable of hybridizing with these sequences under stringent conditions, or a label thereof. A probe for performing a test for determining the risk of bloodstream infection is more preferable.
プライマーを用いる方法は、一塩基多型部位を含むMRSAのcna遺伝子配列の一部にアニーリングするプライマーを用いて、被験体から単離したMRSAの核酸を増幅させて行う。プライマーは、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型部位の塩基を同定できるプライマーであり、cna遺伝子の一塩基多型部位を含む配列を有する領域を増幅することのできる配列である。このようなプライマーは、一塩基多型部位を含む配列を含んでいてもよく、また一塩基多型部位を含む領域の3’側と5’側の両端に設定されたフォワードプライマーとリバースプライマーのプライマー対であってもよい。プライマーとしては、cna遺伝子の一塩基多型部位を含む塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列或いはストリンジェント条件下でそれらの配列にハイブリダイズし得る塩基長5〜50、好ましくは10〜30、さらに好ましくは15〜25であるヌクレオチドを用いることができる。 The method using a primer is performed by amplifying MRSA nucleic acid isolated from a subject using a primer that anneals to a part of the MRSA cna gene sequence containing a single nucleotide polymorphism site. The primer is a primer that can identify the base of the single nucleotide polymorphic site of the cna gene of MRSA, and is a sequence that can amplify a region having a sequence containing the single nucleotide polymorphic site of the cna gene. Such a primer may contain a sequence containing a single nucleotide polymorphic site, and a forward primer and a reverse primer set at both ends of the 3 ′ side and 5 ′ side of the region containing the single nucleotide polymorphic site. It may be a primer pair. As a primer, a base sequence containing a single nucleotide polymorphic site of the cna gene, a base sequence complementary to the base sequence, or a base length capable of hybridizing to these sequences under stringent conditions, 5 to 50, preferably 10 to Nucleotides that are 30, more preferably 15-25 can be used.
上記のプローブ又はプライマーはMRSAのcna遺伝子の塩基配列の一塩基多型部位を含む連続した塩基配列において、数個、好ましくは１個又は２個、特に好ましくは１個のミスマッチを有していてもよい。 The above probe or primer has several, preferably one or two, particularly preferably one mismatch in a continuous base sequence including a single nucleotide polymorphic site of the base sequence of MRSA cna gene. Also good.
本発明は、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型を分析するために用いるプローブ及び一塩基多型を分析するために一塩基多型部位を含むDNA断片の増幅に用いるプライマー、好ましくは、少なくとも一対のプライマーセットを包含する。また、本発明はプローブを固定化したDNAチップをも包含する。さらに、プローブ、DNAチップ、プライマー等を含むcna遺伝子の一塩基多型部位を解析するためのキットも包含する。該キットは、他に一塩基多型の解析に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、核酸標識分子、緩衝液、該キットの取扱説明書等を含んでいてもよい。 The present invention relates to a probe used for analyzing a single nucleotide polymorphism of the MRSA cna gene and a primer used for amplification of a DNA fragment containing a single nucleotide polymorphism site to analyze a single nucleotide polymorphism, preferably at least a pair of Of primer sets. The present invention also includes a DNA chip on which a probe is immobilized. Furthermore, a kit for analyzing a single nucleotide polymorphic site of a cna gene including a probe, a DNA chip, a primer and the like is also included. The kit may additionally contain a restriction enzyme, polymerase, nucleoside triphosphate, nucleic acid labeling molecule, buffer solution, instruction manual for the kit, etc. used for single nucleotide polymorphism analysis.
Cnaタンパク質の変異の検出は、被験体から単離したMRSAよりタンパク質を抽出し、該タンパク質中にアミノ酸の変異を有するCnaタンパク質が存在するか否かを調べればよい。例えば、変異アミノ酸を有するCnaタンパク質とは結合するが、変異を有しない野生型のCnaタンパク質と結合しない抗Cnaタンパク質抗体を用いて抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ法により変異タンパク質を検出することができる。抗原抗体反応を利用したイムノアッセイとしては、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）、イムノドットブロット、イムノクロマトグラフィー、ラテックス等の粒子を利用した凝集法、ウエスタンブロット等が挙げられる。また、Cnaタンパク質を単離し、アミノ酸配列を決定し、変異アミノ酸を有するか否かを調べてもよい。 The detection of the Cna protein mutation may be performed by extracting the protein from MRSA isolated from the subject and examining whether the Cna protein having an amino acid mutation is present in the protein. For example, a mutant protein can be detected by an immunoassay method using an antigen-antibody reaction using an anti-Cna protein antibody that binds to a Cna protein having a mutant amino acid but does not bind to a wild-type Cna protein having no mutation. . Examples of the immunoassay using antigen-antibody reaction include ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), immunodot blot, immunochromatography, agglutination using particles such as latex, Western blot, and the like. Alternatively, the Cna protein may be isolated, the amino acid sequence may be determined, and it may be examined whether or not it has a mutated amino acid.
特定の被験体から単離したMRSAが血流感染を起こすリスクがあると判定された場合、厳格な除菌を行うことにより未然にMRSAの血流感染を防ぐことができる。特にカテーテルを介した血流感染がしばしば起こることに鑑み、カテーテルの除菌は効果的である。さらに、効果的な抗MRSA薬の投与計画を設計し、未然にMRSAの血流感染を防ぐことも可能になる。 When it is determined that MRSA isolated from a specific subject is at risk of causing bloodstream infection, it is possible to prevent MRSA bloodstream infection by performing strict sterilization. In particular, in view of the frequent occurrence of bloodstream infection via a catheter, sterilization of the catheter is effective. In addition, an effective administration plan for anti-MRSA drugs can be designed to prevent MRSA bloodstream infection.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
対象と方法
患者背景およびMRSA採取
MRSAは1998年から2003年までに金沢大学附属病院にて加療を受けた患者より分離・培養された96株を用いた。グラム染色およびスタフィスライドテストを用いたコアグラーゼ産生試験によりMRSAを同定した。薬剤感受性はMicroScan WalkAway 96Plus (SIEMENS, Munich)を用いて計測した。毒素の同定には、SET-RPLA, EXT-RPLA及びTST-RPLA (DENKA, Tokyo)を用いた。それぞれ、使用説明書通りに操作した。
Subjects and methods Patient background and MRSA collection
MRSA used 96 strains isolated and cultured from patients who were treated at the Kanazawa University Hospital from 1998 to 2003. MRSA was identified by coagulase production test using Gram staining and staphy slide test. Drug sensitivity was measured using MicroScan WalkAway 96Plus (SIEMENS, Munich). To identify toxins, SET-RPLA, EXT-RPLA and TST-RPLA (DENKA, Tokyo) were used. Each was operated according to the instruction manual.
患者の基礎検査値はMRSAが培養された時点、あるいはそれ以前のものを用いた。MRSA感染症発症中の検査値は、抗MRSA薬を投与中の値を用いた。また、MRSA感染症により死亡した患者の検査値は、除いて解析を行った。MRSAの感染発症は、抗MRSA薬(バンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシン、ダプトマイシン、リネゾリド)の使用、あるいは無菌検体からのMRSA培養陽性とした。 The patient's basic test values were used when MRSA was cultured or earlier. As the test value during the onset of MRSA infection, the value during administration of the anti-MRSA drug was used. In addition, the test values of patients who died of MRSA infection were excluded and analyzed. Onset of MRSA infection was the use of anti-MRSA drugs (vancomycin, teicoplanin, arbekacin, daptomycin, linezolid) or MRSA culture positive from sterile specimens.
バイオフィルムアッセイ
バイオフィルム形成能は96穴プレートへの接着にて測定した。既定の濃度に希釈したMRSAを96穴プレートへ播種し、一晩インキュベーションした。翌日、PBSにて洗浄後、接着した菌を100％エタノールにて固定した。クリスタルバイオレットを用いて染色後、プレートリーダーにて595nmの波長で計測し、接着菌を測定した。
Biofilm assay The biofilm-forming ability was measured by adhesion to a 96-well plate. MRSA diluted to a predetermined concentration was seeded in a 96-well plate and incubated overnight. The next day, after washing with PBS, the adhered bacteria were fixed with 100% ethanol. After staining with crystal violet, measurement was performed at a wavelength of 595 nm with a plate reader to measure adherent bacteria.
DNAシーケンス
MRSAのDNAはNucleo Spin Tissue kit (MACHREY-NAGEL, Duren)を用いて抽出した。抽出したDNAよりTruSeq DNA HT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA)を用いてライブラリを作成後、Hiseq (Illumina)により網羅的遺伝子解析を行った。遺伝子の変異はレファレンスゲノム(HO 5096 0412)を用いて検討した。
DNA sequencing
MRSA DNA was extracted using Nucleo Spin Tissue kit (MACHREY-NAGEL, Duren). A library was prepared from the extracted DNA using the TruSeq DNA HT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, Calif.), And then comprehensive gene analysis was performed using Hiseq (Illumina). Gene mutations were examined using a reference genome (HO 5096 0412).
統計解析
統計ソフトはStatViewを用いた。統計解析にはANOVA, Kruskal-Wallis,およびカイ2乗検定を用いた。
Statistical analysis StatView was used as statistical software. ANOVA, Kruskal-Wallis, and chi-square test were used for statistical analysis.
結果
接着・バイオフィルム関連遺伝子領域の遺伝子変異がMRSA感染症の発症/保菌と相関した
96株の網羅的遺伝子解析により、1871か所の遺伝子挿入・欠失(indel)、89091か所の一塩基変異(SNPs)が認められた。これらの変異と、MRSA感染症発症/保菌との相関を検討した。図１−１及び図１−２にはMRSA感染症発症と相関係数の高いおよび低いindel とその遺伝子領域を、それぞれ50変異ずつ示す。それらのうち21か所がaで示す、接着・バイオフィルム関連分子をコードする遺伝子領域であった。bの4か所は毒素関連領域、cの1か所は薬剤耐性関連領域であった。図２−１及び図２−２には、同様にMRSA感染症発症と相関係数の高いおよび低いSNPs その遺伝子領域を、それぞれ50変異ずつ示す。それらのうち17か所がaで示す、接着・バイオフィルム関連分子をコードする遺伝子領域であり、bの2か所は毒素関連領域、cの1か所は薬剤耐性関連領域であった。なお今回、検討した接着・バイオフィルム関連分子（Adhesion/biofilm)、薬剤感受性関連分子(Anti-micorbial resistance)、毒素関連分子(Toxin)を図３に示した。
Results Mutations in the adhesion / biofilm-related gene region correlated with the onset / carrying of MRSA infections
Comprehensive gene analysis of 96 strains revealed 1871 insertions / deletions (indel) and 89091 single nucleotide mutations (SNPs). We examined the correlation between these mutations and the onset / carrying of MRSA infections. FIG. 1-1 and FIG. 1-2
クラスター解析による群分けはcna遺伝子領域の有無と一致した
96株を遺伝子配列の相同性によりクラスター解析を行った。これらのクラスター分類と接着・バイオフィルム関連分子であるcna領域の有無が一致し、主に4つのクラスターに分類された(図４)。他、図３に示す接着・バイオフィルム関連分子遺伝子領域の有無とクラスター分類は一致しなかった。各クラスターの患者背景を図５に示す。クラスターＡで平均年齢が低く、クラスターＢではアルブミン値が低い結果であった。
Grouping by cluster analysis was consistent with the presence or absence of the cna gene region
Cluster analysis was performed on 96 strains based on homology of gene sequences. These cluster classifications coincided with the presence or absence of the cna region, which is an adhesion / biofilm-related molecule, and were mainly classified into four clusters (FIG. 4). In addition, the presence / absence of the adhesion / biofilm-related molecular gene region shown in FIG. 3 did not match the cluster classification. The patient background of each cluster is shown in FIG. The average age was low in cluster A, and the albumin level was low in cluster B.
血流感染を発症しやすい一群が認められ、この群にはcna領域が認められた
ついで、これらの群における臨床病態について検討を行った。cna領域を認めるクラスターC群で、有意に血流感染の発症率が高かった(図４及び図６)。その原因としてカテーテル感染によるものが多かった。また、同群は、抗MRSA薬を使用する率が高かった。一方、死亡率、死亡あるいは感染症のためにICU入室する率はほぼ同等であった(図６)。感染症発症中の検査データを図７に示す。クラスターCでは発症中の血小板がクラスターＢに比較し低値であった。
A group susceptible to bloodstream infection was observed, and the cna region was observed in this group. The clinical pathology in these groups was then examined. In the cluster C group in which the cna region was observed, the incidence of bloodstream infection was significantly high (FIGS. 4 and 6). The cause was often due to catheter infection. The group also had a higher rate of using anti-MRSA drugs. On the other hand, the mortality rate and the rate of entering ICU due to death or infection were almost the same (Figure 6). The test data during the onset of infection is shown in FIG. In cluster C, onset platelets were lower than in cluster B.
クラスターＣのMRSA株の特徴
プレートバイオフィルムアッセイにより測定した各クラスターの接着・バイオフィルム形成能を図８に示す。クラスターＣは高い接着能を示した。一方、クラスターＡの株もcna遺伝子領域を持つが、接着能は低かった。そこで、クラスターＡとクラスターＣのcna遺伝子領域について検討を進めた。クラスターＣの全株に存在し、クラスターＡには存在しないcna遺伝子領域のSNPsが17か所認められた(図９)。図９の右の数字はMRSAのゲノム配列のアンチセンス鎖における塩基番号である。そのうち、10か所はアミノ酸変異を伴う、ミスセンスバリアントであった。また、これらのミスセンスバリアントのうち5か所は、cna遺伝子領域の機能コドン上に存在していた(図１０)。さらに、タンパク構造予測に基づく構造分析では、これらの変異が一部集中しており、ホットスポットを形成していた(図１１)。一方、毒素産生能試験では、クラスターＣ株が特異的にエンテロトキシンＡを産生していた(図１２)。また、薬剤耐性試験では、クラスターＣ株はゲンタマイシンに対する耐性が低い一方、レボフロキサシン、エリスロマイシンに対しては高い耐性を示した(図１３)。
Features of MRSA strain of cluster C FIG. 8 shows the adhesion / biofilm forming ability of each cluster measured by a plate biofilm assay. Cluster C showed high adhesive ability. On the other hand, the strain of cluster A also has a cna gene region, but its adhesion ability was low. Therefore, the cna gene region of cluster A and cluster C was studied. There were 17 SNPs in the cna gene region that were present in all strains of cluster C and not in cluster A (FIG. 9). The numbers on the right in FIG. 9 are the base numbers in the antisense strand of the MRSA genomic sequence. Of these, 10 were missense variants with amino acid mutations. In addition, five of these missense variants were present on the functional codon of the cna gene region (FIG. 10). Furthermore, in the structural analysis based on protein structure prediction, these mutations were partially concentrated and formed hot spots (FIG. 11). On the other hand, in the toxin production ability test, cluster C strain specifically produced enterotoxin A (FIG. 12). In the drug resistance test, the cluster C strain showed low resistance to gentamicin, while high resistance to levofloxacin and erythromycin (FIG. 13).
本発明により、MRSAの血流感染を未然に防止することができ、MRSAの感染の拡大を防ぐことができる。 According to the present invention, MRSA bloodstream infection can be prevented in advance, and the spread of MRSA infection can be prevented.
Claims (13)
a）被験体からMRSAを単離し、該MRSAから核酸試料を調製する工程、
b）前記MRSAのcna遺伝子の変異を検出する工程、
を含み、cna遺伝子の変異が検出された場合にMRSAの血液感染のリスクが高いと評価する、MRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。 A test method for determining the risk of blood infection of MRSA, comprising detecting a mutation in the MRA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) cna gene,
a) isolating MRSA from a subject and preparing a nucleic acid sample from the MRSA;
b) detecting a mutation in the MRSA cna gene;
A test method for determining the risk of blood infection with MRSA, wherein the risk of blood infection with MRSA is evaluated as high when a mutation in the cna gene is detected.
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基におけるCからAへの変異、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基におけるGからTへの変異、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基におけるAからGへの変異、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基におけるTからAへの変異、
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基におけるCからAへの変異、
（１１） 配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基におけるCからTへの変異、
（１２） 配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基におけるAからGへの変異、
（１３） 配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基におけるCからTへの変異、
（１４） 配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基におけるGからAへの変異、
（１５） 配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基におけるTからCへの変異、
（１６） 配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基におけるTからCへの変異、及び
（１７） 配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基におけるTからCへの変異。 The test method for determining the risk of blood infection of MRSA according to claim 1 or 2, wherein the mutation is at least one of the following (1) to (17):
(1) a C to A mutation at the 2840th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a mutation from G to T at the 2272nd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(3) a G to A mutation at the 2266th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(4) G to A mutation at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(5) a C to A mutation at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(6) a mutation from G to T at the 1711th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(7) a G to T mutation at the 194th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(8) A to G mutation at the 191st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(9) a mutation from T to A at the 136th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(10) a C to A mutation at the 78th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(11) a C to T mutation at the 2253rd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(12) A to G mutation at the 1983th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(13) C to T mutation at the 1941st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(14) a mutation from G to A at the 1842th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(15) T to C mutation at the 1716th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(16) T to C mutation at the 1530th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (17) T to C mutation at the 12th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてA947Dの置換をもたらす変異、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV758Lの置換をもたらす変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてE756Kの置換をもたらす変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV746Iの置換をもたらす変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてT663Kの置換をもたらす変異、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV571Lの置換をもたらす変異、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてG65Vの置換をもたらす変異、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基におけるAからGへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてN64Sの置換をもたらす変異、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基におけるTからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてS46Tの置換をもたらす変異、及び
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における、CからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてD26Eの置換をもたらす変異。 The test method for determining the risk of blood infection of MRSA according to claim 3, wherein the mutation is at least one of the following (1) to (10):
(1) A mutation from C to A at the 2840th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which causes substitution of A947D in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2,
(2) a mutation from G to T at the 2272nd base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of V758L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(3) a mutation from G to A at the 2266th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of E756K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(4) a mutation from G to A at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of V746I in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(5) a mutation from C to A at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of T663K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(6) a mutation from G to T at the 1711th base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of V571L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(7) a mutation from G to T at the 194th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of G65V in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(8) A mutation from A to G at the 191st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which causes substitution of N64S in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2,
(9) A mutation from T to A at the 136th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which causes substitution of S46T in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2, and (10) A mutation from C to A in the 78th base of the nucleotide sequence represented by No. 1 and resulting in a substitution of D26E in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID No. 2.
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV758Lの置換をもたらす変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてE756Kの置換をもたらす変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV746Iの置換をもたらす変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてT663Kの置換をもたらす変異、及び
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV571Lの置換をもたらす変異。 The test method for determining the risk of blood infection of MRSA according to claim 4, wherein the mutation is at least one of the following (2), (3), (4), (5) and (6):
(2) a mutation from G to T at the 2272nd base of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of V758L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(3) a mutation from G to A at the 2266th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of E756K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(4) a mutation from G to A at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 that causes substitution of V746I in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2;
(5) a mutation from C to A at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which causes substitution of T663K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2, and (6) sequence A mutation from G to T in the 1711th base of the nucleotide sequence represented by No. 1, which causes substitution of V571L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID No. 2.
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における一塩基多型部位、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における一塩基多型部位、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における一塩基多型部位、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における一塩基多型部位、
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における一塩基多型部位、
（１１） 配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基における一塩基多型部位、
（１２） 配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基における一塩基多型部位、
（１３） 配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基における一塩基多型部位、
（１４） 配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基における一塩基多型部位、
（１５） 配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基における一塩基多型部位、
（１６） 配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基における一塩基多型部位、及び
（１７） 配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基における一塩基多型部位。 An oligonucleotide comprising at least one single nucleotide polymorphism site of the following (1) to (17) of the nucleotide sequence of the MRSA cna gene represented by SEQ ID NO: 1, comprising 5 to 5 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 Risk of MRSA bloodstream infection consisting of an oligonucleotide consisting of a partial sequence consisting of 30 bases or a sequence complementary to the partial sequence, or a sequence that can hybridize with these sequences under stringent conditions, or a label thereof. Probe for testing to determine:
(1) a single nucleotide polymorphism site at the 2840th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a single nucleotide polymorphism site at the 2272nd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(3) a single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(4) a single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(5) a single nucleotide polymorphism site at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(6) a single nucleotide polymorphism site at the 1711th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(7) a single nucleotide polymorphic site at the 194th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(8) a single nucleotide polymorphism site at the 191st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(9) a single nucleotide polymorphism site at the 136th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(10) a single nucleotide polymorphism site at the 78th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(11) a single nucleotide polymorphism site at the 2253rd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(12) a single nucleotide polymorphism site at the 1983th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(13) a single nucleotide polymorphism site at the 1941st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(14) a single nucleotide polymorphism site at the 1842th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(15) a single nucleotide polymorphism site at the 1716th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
(16) a single nucleotide polymorphic site at the 1530th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1; and (17) a single nucleotide polymorphic site at the 12th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における一塩基多型部位、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における一塩基多型部位、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における一塩基多型部位、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における一塩基多型部位、及び
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における一塩基多型部位。 An oligonucleotide comprising at least one single nucleotide polymorphism site of the following (1) to (10) of the nucleotide sequence of the MRSA cna gene represented by SEQ ID NO: 1, comprising 5 to 5 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 Risk of MRSA bloodstream infection consisting of an oligonucleotide consisting of a partial sequence consisting of 30 bases or a sequence complementary to the partial sequence, or a sequence that can hybridize with these sequences under stringent conditions, or a label thereof. Probe for testing to determine:
(1) a single nucleotide polymorphism site at the 2840th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(2) a single nucleotide polymorphism site at the 2272nd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(3) a single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(4) a single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(5) a single nucleotide polymorphism site at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(6) a single nucleotide polymorphism site at the 1711th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(7) a single nucleotide polymorphic site at the 194th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(8) a single nucleotide polymorphism site at the 191st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(9) A single nucleotide polymorphic site at the 136th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and (10) a single nucleotide polymorphic site at the 78th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、及び
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位。 An oligonucleotide comprising at least one single nucleotide polymorphism site of the following (2), (3), (4), (5) and (6) of the base sequence of the MRSA cna gene represented by SEQ ID NO: 1. An oligonucleotide consisting of a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the base sequence of SEQ ID NO: 1, a sequence complementary to the partial sequence, or a sequence capable of hybridizing with these sequences under stringent conditions, or a label thereof Probes for testing to determine the risk of bloodstream infection of MRSA consisting of:
(2) a single nucleotide polymorphism site at the 2272nd base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(3) a single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(4) a single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(5) a single nucleotide polymorphic site at the 1988th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (6) a single nucleotide polymorphic site at the 1711th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
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