JP2016166171A - イムノコンジュゲート及びその作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2009年7月3日に出願された「Immuno−conjugates a
nd methods for producing them」と題されるオーストラ
リア国特許第2009903127号明細書;2009年7月6日に出願された「Imm
uno−conjugates and methods for producing
them」と題される米国仮特許出願第61/223353号明細書;及び2009年
10月30日に出願された「Variable domain molecules a
nd methods of use」と題される米国仮特許出願第61/256703
号明細書からの優先権を主張し、これらの内容は全て参照により援用される。
コンジュゲーションを促進するように修飾された、又はそれにコンジュゲートした化合物
を有するタンパク質に関する。
ン又は軟骨魚類由来の免疫グロブリン新規抗原受容体(IgNAR))又はその抗原結合
ドメインを含むタンパク質は、その高度に特異的な結合性により、対象の特定の標的に分
子を送達するのに特に好適である。例えば、免疫グロブリン又はその抗原結合ドメインを
含むタンパク質は、腫瘍細胞などの細胞を死滅させたり、又はその増殖を阻害したりする
細胞傷害性化合物又は細胞増殖抑制化合物、例えば薬物とコンジュゲートすることができ
る(Lambert、2005年)。かかるコンジュゲートは、免疫グロブリン又は断片
が結合する抗原を発現する細胞への細胞傷害性化合物又は細胞増殖抑制化合物の、対象の
全身にわたる非特異的な送達ではない、標的化された送達を促進する。かかるコンジュゲ
ートにより、毒性レベルの化合物が対象において、全身的にではなく、必要とされる部位
に送達されることが確実となり、対象にとって概して毒性である化合物の使用が可能とな
り得る。さらに、抗体又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質をフルオロフォア又は
放射性同位元素などの検出可能な化合物とコンジュゲートすることにより、対象における
標的分子の検出が促進され、例えば、癌細胞などの罹患細胞の検出が、例えば生体内イメ
ージングに基づく方法を用いて促進される。
、化合物が抗体上の多くの部位に結び付く異種分子混合物をもたらす。例えば、化合物は
典型的には抗体又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質に対し、抗体又は抗原結合ド
メイン中の、多くの場合に多数あるリジン残基を介してコンジュゲートさせることで、異
種抗体−化合物コンジュゲート混合物が生成されている。用いられる反応条件に応じて、
異種混合物は典型的には、0個から約8個に至る、又はそれ以上の化合物が結び付いたコ
ンジュゲートの分布を含む。加えて、化合物が抗体又はタンパク質に対して特定の整数比
を有する一部のコンジュゲートの各々の中に、化合物が抗体又はタンパク質上の様々な部
位に結び付いた潜在的に異種の混合物がある。コンジュゲーション反応によって生じた異
種混合物の中の様々なコンジュゲート種を分離して特徴付けるには、分析的及び調製的方
法は不適当である。
ュゲーションは、例えば化合物が抗原結合に必要な領域にコンジュゲートされる場合に、
抗体/タンパク質の抗原との結合を低減し、又は完全に妨害し得る。インタクトな抗体と
比べてはるかに小さい抗原結合ドメインを含み、抗原結合にとって重要でないコンジュゲ
ーションに好適な残基がほとんどないこともあるタンパク質では、このリスクは増加する
。例えば、抗体の抗原結合ドメイン程度しか含まないタンパク質は、抗原結合を低減又は
妨害することなしに化合物がコンジュゲートすることのできる部位をほとんど有しない。
。概して、炭水化物は過ヨウ素酸酸化により修飾されて反応性アルデヒドを生成し、次に
それを用いて反応性アミンを含有する化合物をシッフ塩基の形成により結び付けることが
できる。アルデヒドはアミン基と反応し得るため反応は低pHで行われ、従って抗体又は
抗原結合ドメイン中のリジン残基はプロトン化され、非反応性である。生成されたアルデ
ヒドと結び付けるにはヒドラジド基が最も好適であり、これはヒドラジド基が低pHで反
応性を有し、ヒドラゾン連結鎖を形成するためである。この連結鎖は、次にシアノ水素化
ホウ素ナトリウムで還元することによりヒドラジン連結鎖を形成してさらに安定化させる
ことができる(Rodwellら、1986年)。この手法の欠点としては、連結に必要
な条件が厳しく、一部の抗体分子に損傷を与え、及びそれらを凝集させ得ることが挙げら
れる。例えば、一部の抗体可変領域中に存在するメチオニン残基は過ヨウ素酸による酸化
を特に受け易い可能性があり、これは抗原結合アビディティの消失につながり得る。ヒス
チジン残基及び/又はトリプトファン残基もまた酸化され易い。さらに、抗体の抗原結合
ドメインを含むタンパク質の多くはFc領域を含むとは限らず、つまりそうしたタンパク
質は前述の方法では化合物とコンジュゲートすることができない。
ールは中性pHで反応性を有する。遊離チオール基は比較的反応性が高いため、システイ
ン残基を有するタンパク質は多くの場合にジスルフィドで連結されたオリゴマーとしてそ
の酸化された形態で存在するか、又は内部架橋されたジスルフィド基を有する。細胞外タ
ンパク質は、概して遊離チオールを有しない(Garman、1997年)。システイン
残基は遺伝子工学技術によってタンパク質に導入されており、リガンドとの共有結合が形
成され、又は新規の分子内ジスルフィド結合が形成されている。しかしながら、システイ
ンチオール基のタンパク質への挿入又は置換は、特に反応又は酸化に比較的利用し易いも
のの場合には、すなわち化合物のコンジュゲーションに有用な部位に位置する場合には、
潜在的に問題がある。これは、タンパク質の濃縮溶液中では、大腸菌(Escheric
hia coli)のペリプラズム中であろうと、培養上清中であろうと、又は部分的若
しくは完全に精製されたタンパク質中であろうと、タンパク質の表面上のシステイン残基
が対形成して酸化し、分子間ジスルフィド、ひいてはタンパク質凝集体を形成し得るため
である。かかるタンパク質凝集は、例えば所望の生物活性を有する有用な形態の単離タン
パク質の収率低下につながることが多い。さらに、酸化的にタンパク質は、新規に操作さ
れたシステインと既存のシステイン残基との間に分子内ジスルフィド結合を形成すること
があり、これによるミスフォールディング又は三次構造の消失によりタンパク質が不活性
又は非特異的になり得る。前述の問題の各々は、正しいフォールディング及び安定性、並
びに結果として抗原結合活性を確保するよう互いに結合するいくつかのシステイン残基を
概して含む抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質では悪化する。
単純なコンジュゲーションを可能にするように修飾されたタンパク質が当該技術分野にお
いて必要とされていることは明らかであろう。好ましいタンパク質は、様々な系における
組換え作製を、好ましくは分子間結合により連結された著しいレベルの多量体凝集体を生
じることなく促進し得る。
領域内の部位であって、可変領域の抗原との結合を妨害することなく化合物をコンジュゲ
ートすることが可能な部位を特定しようと努めた。本明細書において例証するとおり、本
発明者らは、可変領域のフレームワーク領域1(FR1)内に、コンジュゲーションに利
用可能であり、且つ可変領域の抗原結合部位から十分に外れていて、そこにコンジュゲー
トされる化合物が抗原結合を抑制又は妨害する可能性が低い多数の部位を決定した。これ
らの部位は重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)の双方に保存されている。こ
の決定に基づき、本発明者らは、FR1に2つのシステイン残基が挿入された変異可変領
域を含む様々なタンパク質を作製した。これらのシステイン残基は、それらの間にジスル
フィド結合が形成され得るような位置に置かれる。組換え作製及び/又は精製の間、シス
テイン残基はジスルフィド結合により連結され、そのためそれらの残基が同じタンパク質
内の、或いは別のタンパク質における他のシステイン残基と結合することが低減又は妨害
される。これにより、連結した多量体及び/又は異常に折り畳まれた可変領域が作製され
る可能性が低下し、機能タンパク質の作製及び/又は単離が可能となる。単離後、システ
イン残基は還元されるか、又は他の方法で分解され、化合物のタンパク質とのコンジュゲ
ーションが可能となる。本発明者らはまた、ポリエチレングリコール(PEG)などの嵩
高い化合物及び放射性同位元素などのイメージング用化合物を含め、これらのタンパク質
に対する多数の化合物のコンジュゲーションが、可変領域の抗原との結合を妨害しないこ
とも実証した。
のシステイン残基を含む免疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって、
システイン残基の少なくとも1つが化合物にコンジュゲートされない場合にシステイン残
基間にジスルフィド結合が形成可能であるタンパク質を提供する。
つのシステイン残基を含む免疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって
、システイン残基の少なくとも2つが化合物にコンジュゲートされない場合にシステイン
残基間にジスルフィド結合が形成可能であるタンパク質を提供する。
疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)とを含む単離されたタンパク質であって、可変領域の
少なくとも1つが、フレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステ
イン残基を含み、システイン残基の少なくとも1つが別の化合物にコンジュゲートされな
い場合にシステイン残基間にジスルフィド結合が形成可能であるタンパク質を提供する。
疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)とを含む単離されたタンパク質であって、可変領域の
少なくとも1つが、フレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステ
イン残基を含み、システイン残基の少なくとも2つが別の化合物にコンジュゲートされな
い場合にシステイン残基間にジスルフィド結合が形成可能であるタンパク質を提供する。
も1つのVHとを含む。
置する。
定領域(CDR)1との間に位置する。
により付番して残基2から30の間に位置する。好ましくは、システイン残基は、Kab
at付番方式により付番して残基7〜20及び/又は残基24〜30の間に位置し、より
好ましくは残基7〜20の間に位置する。さらなる例において、残基は、Kabat付番
方式により付番して残基6〜16の間に位置する。さらなる例において、残基は、Kab
at付番方式により付番して残基7〜16の間に位置する。
により付番して残基2から22の間に位置する。好ましくは、システイン残基は、Kab
at付番方式により付番して残基7〜20の間に位置する。さらなる例において、残基は
、Kabat付番方式により付番して残基7〜19の間に位置する。さらなる例において
、残基は、Kabat付番方式により付番して残基7〜17の間に位置する。
ステイン残基に対して追加的なものである。当業者は、天然に存在する抗体の少なくとも
大多数において、保存されたシステイン残基がKabat付番方式により付番してVLで
は残基23にあり、及び/又はVHでは残基22にあることを認識するであろう。
対してN末端側に位置する。好ましくは、システイン残基は以下の1つ又は複数に位置す
る:
(i)Kabat付番方式により付番してκ VLの残基8及び残基11;
(ii)Kabat付番方式により付番してκ VLの残基14及び残基17;
(iii)Kabat付番方式により付番してλ VLの残基7及び残基11;
(iv)Kabat付番方式により付番してλ VLの残基14及び残基17;
(v)Kabat付番方式により付番してλ VLの残基8及び残基12;
(vi)Kabat付番方式により付番してVHの残基7及び残基10;及び/又は
(vii)Kabat付番方式により付番してVHの残基13及び残基16。
(i)Kabat付番方式により付番してκ VLの残基13及び残基19;
(ii)Kabat付番方式により付番してλ VLの残基13及び残基19;
(iii)Kabat付番方式により付番してVHの残基6及び残基9;及び/又は
(iv)Kabat付番方式により付番してVHの残基12及び残基18。
る。例えば、本発明者らは、システイン残基間に位置する残基の置換が、又はさらにはC
DR内に天然に存在するシステイン残基を置き換えても、本発明のタンパク質の抗原との
結合を妨害しないことを明確に実証している。
パク質であって、少なくとも1つのVLが少なくとも1つのVHと結合して抗原結合部位
を形成するタンパク質も提供する。
びVHを含む。例えば、タンパク質は、
(i)単鎖Fv断片(scFv);
(ii)二量体scFv(di−scFv);又は
(iii)Fc又は重鎖定常ドメイン(CH)2及び/又はCH3に連結された(i)及
び/又は(ii)の少なくとも1つ
である。
びVHを含む。一例において、タンパク質の各ポリペプチド鎖がVLとVHとを含む。好
ましくは、かかるタンパク質は、
(i)ダイアボディ;
(ii)トリアボディ;又は
(iii)テトラボディ
である。
。免疫グロブリンの例示的形態が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用さ
れると解釈されるべきである。
されたシステイン残基を含む。或いは、本発明のタンパク質は、システイン残基の少なく
とも1つにコンジュゲートした化合物を含み、ここで化合物のコンジュゲーションは、タ
ンパク質の抗原との結合を妨害しない。例示的化合物としては、放射性同位体、検出可能
標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象におけるタンパ
ク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される化合物が
挙げられる。当業者は、タンパク質という用語が、1つ又は複数の免疫グロブリン可変領
域を含むタンパク質、例えば、本明細書に記載されるものなどのFv含有タンパク質を含
む抗体又はその断片を包含することを理解するであろう。
ートされる。例えば、PEGは単分散PEGである。
分子量、約1,500Da以下などの分子量を有する。一例において、PEGは1,00
0Da以下の分子量、900Da以下など、例えば、800Da以下、600Da以下な
どの分子量を有する。一例において、PEGは約550Da〜約1,000Daの分子量
を有する。
位を有する。例えば、PEGは約50個以下のエチレングリコール単位を有する。好まし
くは、PEGは48個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、PEGは約40
個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、PEGは約30個以下のエチレング
リコール単位を有する。例えば、PEGは約27個以下のエチレングリコール単位を有す
る。例えば、PEGは約24個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、PEG
は約15個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、PEGは約12個以下のエ
チレングリコール単位を有する。好ましくは、PEGは約12〜27個のエチレングリコ
ール単位を含む。
0%又は90%又は95%又は96%又は97%又は98%又は99%又は100%同一
の配列を含み、且つFR1におけるシステイン残基の少なくとも1つにコンジュゲートさ
れた短鎖単分散PEGを有する少なくとも1つのポリペプチドを含む。好ましくは、PE
Gは15〜30個のエチレングリコール単位、好ましくは24個のエチレングリコール単
位を含む。タンパク質は1個以上の、及び好ましくは10個又は5個又は4個又は3個又
は2個未満の置換、好ましくは保存的アミノ酸置換又は欠失又は挿入を含むことができる
。記載される配列に対する例示的な変化としては、N末端セリンの欠失、又はセリンによ
る別のアミノ酸残基の置換(好ましくは保存的アミノ酸置換)及び/又はC末端リジン及
び/又はアルギニンの欠失若しくは置換が挙げられる。
残基を含むように修飾した。この残基により、それとの化合物の部位特異的コンジュゲー
ションが可能となる。N末端セリン/スレオニン変異を上記で考察されるシステイン変異
と組み合わせることにより、本発明者らは、少なくとも2つの異なる化合物を部位特異的
にコンジュゲートすることのできるタンパク質を作製した。
に含む本発明のタンパク質を提供する。セリン残基又はスレオニン残基はタンパク質のN
末端に付加され得る(すなわち、タンパク質の配列に対して追加的なものである)。好ま
しくは、セリン残基又はスレオニン残基はタンパク質のN末端に天然に存在するアミノ酸
残基に置き換わり、すなわち置換変異の結果である。場合により、スレオニン残基又はセ
リン残基は化合物、例えば上記に記載される化合物に連結される。
ートした第1の化合物と、スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした第2の化
合物であって、第1の化合物と異なる第2の化合物とを含む。
の好ましいタンパク質は、ヒト上皮成長因子(Her)2、腫瘍関連糖タンパク質Tag
72、MUC1又は前立腺特異的膜抗原(PSMA)からなる群から選択される抗原に特
異的に結合する。他のタンパク質は交差反応性のため、又はタンパク質が多重特異性であ
るため、抗原、例えば上記に挙げた抗原の複数に結合する。
列番号55、59、61、109、115又は117のいずれか1つに示される配列と8
0%又は90%又は95%又は96%又は97%又は98%又は99%又は100%同一
の配列を含む。修飾に好適な部位が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用
されると解釈されるべきである。例えば、タンパク質は、そのタンパク質がFR1にシス
テイン残基を含むことを条件として、配列番号57、63、65、75、77、79、8
1、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103又は10
5、119、121、123、125、127、129、131又は133のいずれか1
つに示される配列と少なくとも約80%又は90%又は95%又は96%又は97%又は
98%又は99%又は100%同一の配列を含む。
含むタンパク質も作製した。この部位はまた、FR1にシステイン残基が存在しない場合
であっても、化合物のコンジュゲーションに有用である。
変領域(VL)とを含む単離されたタンパク質であって、可変領域の少なくとも1つがN
末端スレオニン残基又はセリン残基を含むタンパク質も提供する。セリン残基又はスレオ
ニン残基は、タンパク質のN末端に付加され得る。好ましくは、セリン残基又はスレオニ
ン残基はタンパク質のN末端に天然に存在するアミノ酸残基に置き換わり、すなわち置換
変異の結果である。
も1つのタンパク質を含むFvを含み、ここでは少なくとも1つのVLが少なくとも1つ
のVHと結合して抗原結合部位を形成する。
例えば、タンパク質は、
(i)単鎖Fv断片(scFv);
(ii)二量体scFv(di−scFv);又は
(iii)Fc又は重鎖定常ドメイン(CH)2及び/又はCH3に連結された(i)及
び/又は(ii)の少なくとも1つ
である。
おいて、タンパク質の各ポリペプチド鎖がVLとVHとを含む。好ましくは、かかるタン
パク質は、
(i)ダイアボディ;
(ii)トリアボディ;又は
(iii)テトラボディ
である。
。免疫グロブリンの例示的形態が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用さ
れると解釈されるべきである。
合物をさらに含む。例示的化合物が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用
されると解釈されるべきである。
された、配列番号55、59、61、109、115又は117のいずれか1つに示され
る配列と少なくとも約80%又は90%又は95%又は96%又は97%又は98%又は
99%又は100%同一の配列を含む。例えば、タンパク質は、タンパク質がN末端スレ
オニン残基又はセリン残基を含むことを条件として、配列番号57、63、65、75、
77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、
103、105、119、121、123、125、127、129、131又は133
のいずれか1つに示される配列と少なくとも約80%又は90%又は95%又は96%又
は97%又は98%又は99%又は100%同一の配列を含む。
ン残基及び/又はN末端スレオニン残基若しくはセリン残基を含む修飾された免疫グロブ
リン可変領域を含むタンパク質を本発明がさらに提供することもまた提供し、ここで未修
飾形態の可変領域は、システイン残基の少なくとも1つ(好ましくはシステイン残基の少
なくとも2つ又はその全て)及び/又はスレオニン残基若しくはセリン残基を含まない。
システイン残基及び/又はスレオニン残基若しくはセリン残基が位置するのに好適な部位
が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用されると解釈されるべきである。
たもの、又はキメラのものである。
る。
ては、コードされたタンパク質のFR1における少なくとも2つのシステイン残基をコー
ドするコドンを含むように、及び/又はN末端セリン残基若しくはスレオニン残基を含む
ように改変された、配列番号54、58、60、108、114又は116の任意の1つ
又は複数に示される配列と少なくとも約80%又は90%又は95%又は96%又は97
%又は98%又は99%又は100%同一の配列を有するものが挙げられる。一例におい
て、本発明の核酸は、配列番号56、62、64、74、76、78、80、82、84
、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、118、12
0、122、124、126、128、130、132の任意の1つ又は複数に示される
配列と少なくとも約80%又は90%又は95%又は96%又は97%又は98%又は9
9%又は100%同一の配列を含み、但しその配列がFR1における少なくとも2つのシ
ステイン残基及び/又はN末端セリン残基若しくはスレオニン残基を含むタンパク質をコ
ードすることを条件とする。当業者は、コドン使用の縮重に起因して、数多くのヌクレオ
チド配列が本発明のタンパク質をコードし得ることを認識するであろう。かかるヌクレオ
チド配列は全て本発明により包含される。例えば、コドン最適化された核酸を作製して、
特定の細胞型又は生物における発現を促進することができる。
製することができる。好ましくはかかる発現コンストラクト又は核酸は、ベクター、好ま
しくは細胞において複製可能なベクター、例えばプラスミド又はファージミド又はコスミ
ド又は人工染色体に含まれる。
好ましくは本発明のタンパク質を発現する細胞も提供する。例示的細胞としては、限定は
されないが、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞が挙げられる。
発明のタンパク質の作製方法の基盤も提供する。従って、本発明はまた、本発明のタンパ
ク質の作製方法も提供し、この方法は、本発明の発現コンストラクトを、コードされたタ
ンパク質が作製されるのに十分な条件下に維持するステップを含む。例えば、この方法は
、コードされたタンパク質が作製されるのに十分な(sufficient the e
ncoded for the protein to be produced)条件
下で本発明の細胞を培養するステップを含む。一例において、この方法は、タンパク質を
単離するステップをさらに含む。この方法は、タンパク質を、例えば結合活性又はアフィ
ニティについて試験するステップをさらに含むことができる。この方法は、タンパク質を
医薬組成物に製剤化するステップをさらに含むことができる。
(i)フレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステイン残基を含
む本発明のタンパク質を得るステップと、
(ii)システイン残基の少なくとも1つに化合物をコンジュゲートするステップであっ
て、それによりコンジュゲートを作製するステップと、
を含む方法も提供する。
り連結され、及びこの方法は、化合物を1つ又は複数のシステイン残基に連結する前にジ
スルフィド結合を還元するか、又は他の方法で分解するステップをさらに含む。好ましく
は、ジスルフィド結合を還元するか、又は他の方法で分解するステップによりタンパク質
に遊離チオール基が生成され、及び化合物はチオール反応基を有する。チオール反応基を
有する化合物を反応させることにより、コンジュゲートが作製される。
例えば、タンパク質を、マレイミド官能基を含む化合物と接触させることでコンジュゲー
ションが起こる。
レオニン残基をさらに含み、及びこの方法は、化合物をセリン残基又はスレオニン残基に
コンジュゲートするステップをさらに含む。好ましくは、セリン残基又はスレオニン残基
にコンジュゲートされる化合物は、1つ又は複数のシステイン残基にコンジュゲートされ
る化合物とは異なる。
(i)N末端スレオニン残基又はセリン残基を含む本発明のタンパク質を得るステップと
、
(ii)タンパク質のN末端にある少なくとも1つのセリン残基又はスレオニン残基に化
合物をコンジュゲートするステップであって、それによりコンジュゲートを作製するステ
ップと、
を含む方法を提供する。
及び/又はコンジュゲートを医薬組成物に製剤化するステップをさらに含む。
対する毒性化合物又は放射性同位体の送達及び/又は生体内イメージング及び/又はタン
パク質の安定性向上を含めた、様々な用途に有用な試薬を作製したことは明らかであろう
。
。例えば、本発明は、病態の治療用又は予防用薬剤の製造における本発明のタンパク質の
使用を提供する。本発明はまた、対象における病態の治療又は予防方法であって、本発明
のタンパク質又は組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法も提供
する。例示的病態が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用されると解釈さ
れるべきである。さらに本発明のタンパク質の例示的なコンジュゲート形態が本明細書に
記載され、それらは本発明のこの例に準用されると解釈されなければならない。
のタンパク質又はそれを含む組成物に細胞を接触させるステップを含む方法をさらに提供
する。一例において、細胞は、タンパク質又は組成物を投与することによって対象に接触
させられる。
法であって、
(i)タンパク質が抗原に結合するのに十分な時間にわたり、且つそのような条件下で、
対象に本発明のタンパク質を投与するステップであって、タンパク質が検出可能標識にコ
ンジュゲートされる、ステップと、
(ii)検出可能標識をインビボで位置特定又は検出するステップと、
を含む方法も提供する。
ど、又はその一部を位置特定又は検出するのに有用であることを認識するであろう。例示
的抗原が本明細書全体を通じて記載され、それらは本発明のこの例に準用されると解釈さ
れるべきである。
に結合して複合体を形成するのに十分な時間にわたり、且つそのような条件下で、対象か
らの試料を本発明のタンパク質又は組成物と接触させるステップと、複合体を検出するス
テップであって、複合体の検出が病態の診断又は予後判定をもたらすステップとを含む方
法も提供する。好ましくは、タンパク質は検出可能標識にコンジュゲートされ、標識の検
出が複合体の指標となる。
較した前記複合体のレベルの亢進又は低下が病態の診断又は予後判定をもたらすステップ
を含む。
、タンパク質は粒子(例えば、ファージ又はリボソーム)又は細胞の表面に提示される。
明らかに、本発明はまた、本発明のタンパク質を複数含む前記ライブラリをコードする核
酸のライブラリも提供する。
十分な(又は結合するような)時間にわたり、且つそのような条件下で、本発明のライブ
ラリを抗原と接触させるステップと、タンパク質を単離するステップとを含む方法をさら
に提供する。
(i)免疫グロブリン可変領域を含む複数のタンパク質をコードする核酸を得る、又は作
製するステップであって、可変領域が、フレームワーク領域(FR)1内に位置する少な
くとも2つのシステイン残基及び/又はN末端スレオニン残基若しくはセリン残基を含む
、ステップと、
(ii)以下の作動可能に連結された核酸:
a)プロモーター;
b)(i)で得られた、又は作製された核酸;及び
c)可変領域を含むタンパク質の細胞又は粒子における/その上への提示を促進するポ
リペプチドをコードする核酸
を含む発現コンストラクトのライブラリを作製するステップと、
(iii)発現コンストラクトによりコードされたタンパク質を、それらが細胞又は粒子
において/その上に提示されるように発現させるステップと、
を含む方法をさらに提供する。
位が本明細書に記載され、それらは本発明のこの例に準用されると解釈されるべきである
。
るか、又はヒト抗体に由来する。
含む。かかる核酸は発現コンストラクトに導入することができる。場合により、タンパク
質を発現させてもよい。
変領域を含むタンパク質も作製した。本発明者らは、このタンパク質が生体内で安定であ
ることを見出した。
を含む領域によって連結された免疫グロブリンVHと免疫グロブリンVLとを各々が含む
複数のポリペプチドを含む単離されたタンパク質であって、
(i)ポリペプチドの少なくとも1つが、配列番号111に示される配列又はそれと少な
くとも約60%同一の配列を含むVHを含み;及び
(ii)少なくとも別のポリペプチドが、配列番号113に示される配列又はそれと少な
くとも約60%同一の配列を含むVLを含み、
(i)におけるポリペプチドのVHと(ii)におけるポリペプチドのVLとが会合し
て、腫瘍抗原TAG72との特異的な結合能を有するFvを形成するタンパク質をさらに
提供する。本明細書の記載では、このタンパク質は抗TAG72タンパク質と称される。
しかしながら、文脈上特に指示されない限り、「本発明のタンパク質」を参照する本明細
書の任意の記載が、このタンパク質に等しく適用される。
ミノ酸、4個以下のアミノ酸など、例えば、3個以下のアミノ酸、2個以下のアミノ酸な
ど、例えば、1個又は0個のアミノ酸を有するVHとVLとを連結する領域を含む。
て5位にスレオニン及び/又はKabat付番方式による53位にスレオニン及び/又は
Kabat付番方式により付番して79位にグルタミン酸を含むVLを含む。
t付番方式により付番して80位にロイシンを含むVHを含む。
(i)配列番号111に示される配列又はそれと少なくとも約60%同一の配列を含むV
Hと、
(ii)配列番号113に示される配列又はそれと少なくとも約60%同一の配列を含む
VLと、
を各々が含む少なくとも2つのポリペプチドであって、
1つのポリペプチドのVHと別のポリペプチドのVLとが会合して、TAG72との特
異的な結合能を有するFvを形成するポリペプチドを含む。
ある。
(i)ポリペプチドの少なくとも1つは、配列番号111に示される配列を含むVHの相
補性決定領域(CDR)を含むVHを含み;及び
(ii)少なくとも別のポリペプチドは、配列番号113に示される配列を含むVLのC
DRを含むVLを含む。
(i)配列番号111のアミノ酸31〜35に示される配列を含むCDRH1;
(ii)配列番号111のアミノ酸50〜66に示される配列を含むCDRH2;
(iii)配列番号111のアミノ酸99〜104に示される配列を含むCDRH3;
(iv)配列番号113のアミノ酸24〜40に示される配列を含むCDRL1;
(v)配列番号113のアミノ酸56〜62に示される配列を含むCDRL2;及び
(vi)配列番号113のアミノ酸95〜103に示される配列を含むCDRL3。
(i)配列番号111に示される配列又はそのヒト化若しくは脱免疫化形態を含むVHと
、
(ii)配列番号113に示される配列又はそのヒト化若しくは脱免疫化形態を含むVL
と、
を双方が含む少なくとも2つのポリペプチドを含む。
も2つのポリペプチドを含む抗TAG72タンパク質を提供する。
上に記載されるとおりのフレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシ
ステイン残基を含む。例示的配列は上記に示される。例えば、配列は、配列番号57、6
3、75、77、99、103、119、121、123、125、127、129、1
31又は133の任意の1つ又は複数に示される配列と少なくとも約80%又は90%又
は95%又は96%又は97%又は98%又は99%又は100%同一であり、且つシス
テイン残基を含む。好ましくは、配列は、配列番号57に示される配列と少なくとも約8
0%又は90%又は95%又は96%又は97%又は98%又は99%又は100%同一
であり、且つシステイン残基を含む。
る配列と少なくとも約80%又は90%又は95%又は96%又は97%又は98%又は
99%又は100%同一の配列を含む。
を含む。例えば、化合物は、タンパク質におけるポリペプチドの少なくとも1つのシステ
イン残基又はセリン残基又はリジン残基にコンジュゲートされる。
R1内に位置する少なくとも2つのシステイン残基を含み、システイン残基の少なくとも
2つが化合物にコンジュゲートされない場合に、システイン残基及び/又はN末端セリン
残基及び/又はスレオニン残基の間にジスルフィド結合が形成可能であり、及び化合物は
システイン残基の少なくとも1つ及び/又はセリン残基にコンジュゲートされる。例えば
、ポリペプチドはシステイン残基とN末端セリン残基及び/又はスレオニン残基とを含み
、及び化合物はシステイン残基の少なくとも1つにコンジュゲートされ、及び異なる化合
物がセリン残基にコンジュゲートされる。
ペプチド、タンパク質、対象におけるタンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれら
の混合物からなる群から選択される。
ートすることにより、その安定性及び腫瘍取り込みが実質的に増加することを見出した。
本発明者らは、単分散PEG及び/又は低分子量を有するPEGが、より高分子量のPE
Gと実質的に同程度まで安定性及び/又は腫瘍取り込みを増加させることを見出した。概
して大きい分子は小さい分子と比べて対象からのクリアランスが遅いため、これは直感に
反するように思われる。概して大きいPEGほど様々な分子量の分子の混合物を含むため
、より小さい、及び/又は単分散のPEGの使用は、それが分子レベルで同様のタンパク
質コンジュゲートの作製を促進する限りは、利点を提供する。かかるコンジュゲートは生
体内用途に望ましい。
PEG)にコンジュゲートされる。例えば、PEGは単分散PEGである。
分子量、約1,500Da以下の分子量などを有する。一例において、PEGは、1,0
00Da以下、900Da以下など、例えば、800Da以下、600Da以下などの分
子量を有する。一例において、PEGは約550Da〜約1,000Daの分子量を有す
る。
位を有する。例えば、PEGは約50個以下のエチレングリコール単位を有する。好まし
くは、PEGは48個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、PEGは約40
個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、PEGは約30個以下のエチレング
リコール単位を有する。例えば、PEGは約27個以下のエチレングリコール単位を有す
る。例えば、PEGは約24個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、PEG
は約15個以下のエチレングリコール単位を有する。例えば、PEGは約12個以下のエ
チレングリコール単位を有する。好ましくは、PEGは約12〜27個のエチレングリコ
ール単位を含む。
−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−四酢酸(DOTA)などの大環状キレ
ート剤にコンジュゲートされる。
る。
ードする単離核酸をさらに提供する。
する核酸を含む発現コンストラクトをさらに提供する。
えば、細胞は、本発明の抗TAG72タンパク質又はそれに由来するポリペプチドをコー
ドする核酸及び/又はそれを含む発現コンストラクトを含む。
現コンストラクトを、コードされたポリペプチド及びタンパク質が作製されるように維持
するステップを含む方法をさらに提供する。
ficient the encoded for the protein to b
e produced)条件下で細胞を培養するステップを含む。
の抗TAG72タンパク質の作製方法であって、
(i)FR1にシステイン残基を含む本発明の抗TAG72タンパク質を得るステップと
、
(ii)1つ又は複数のポリペプチドのFR1におけるシステイン残基の少なくとも1つ
に化合物をコンジュゲートするステップであって、それによりタンパク質を作製するステ
ップと、
を含む方法をさらに提供する。
システイン残基はジスルフィド結合によって連結され、及びこの方法は、化合物を1つ又
は複数のシステイン残基にコンジュゲートする前に、ジスルフィド結合を還元するか、又
は他の方法で分解するステップをさらに含む。例えば、ジスルフィド結合を還元するか、
又は他の方法で分解するステップによりタンパク質に遊離チオール基が生成され、及び化
合物は、化合物のタンパク質とのコンジュゲーションを可能にするチオール反応基を有す
る。
N末端セリン残基又はスレオニン残基を含み、及びこの方法は、化合物をセリン残基又は
スレオニン残基にコンジュゲートするステップをさらに含む。
た化合物を含む本発明の抗TAG72タンパク質の作製方法であって、
(i)N末端セリン残基及び/又はスレオニン残基を含む本発明の抗TAG72タンパク
質を得るステップと、
(ii)ポリペプチドのN末端にある少なくとも1つのセリン残基又はスレオニン残基に
化合物をコンジュゲートするステップであって、それによりタンパク質を作製するステッ
プと、
を含む方法を提供する。
EGにコンジュゲートするステップを含む。
定する方法であって、
(i)本発明の抗TAG72タンパク質又はそれを含む組成物を、それが、存在する場合
には腫瘍抗原TAG72に結合するように、対象に投与するステップと、
(ii)TAG72に結合したタンパク質をインビボで検出するステップであって、結合
したタンパク質の検出により癌が位置特定及び/又は検出及び/又は診断及び/又は予後
判定される、ステップと、
を含む方法をさらに提供する。
(i)対象からの試料を本発明の抗TAG72タンパク質又はそれを含む組成物と、それ
が、存在する場合には腫瘍抗原TAG72に結合するように接触させるステップと、
(ii)TAG72に結合したタンパク質を検出するステップであって、結合したタンパ
ク質の検出が癌の診断又は予後判定をもたらす、ステップと、
を含む方法をさらに提供する。
トされ、及びこの方法は、TAG72に結合したタンパク質を検出するため標識を検出す
るステップを含む。
成物を、それが癌細胞上の腫瘍抗原TAG72に結合して癌を治療するように投与するス
テップを含む方法をさらに提供する。
する。
。
配列番号1−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号2−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号3−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号4−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号5−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号6−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号7−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号8−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号9−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号10−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号11−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号12−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号13−ヒト抗体重鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号14−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号15−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号16−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号17−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号18−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号19−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号20−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号21−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号22−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号23−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号24−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号25−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号26−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号27−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号28−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号29−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号30−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号31−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号32−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号33−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号34−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号35−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号36−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号36−ヒト抗体κ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号37−ヒト抗体λ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号38−ヒト抗体λ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号39−ヒト抗体λ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号40−ヒト抗体λ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号41−ヒト抗体λ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号42−ヒト抗体λ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号43−ヒト抗体λ軽鎖のFR1のアミノ酸配列;
配列番号44−ラクダ科動物免疫グロブリンのFR1のアミノ酸配列;
配列番号45−ラクダ科動物免疫グロブリンのFR1のアミノ酸配列;
配列番号46−ラクダ科動物免疫グロブリンのFR1のアミノ酸配列;
配列番号47−ラクダ科動物免疫グロブリンのFR1のアミノ酸配列;
配列番号48−ラクダ科動物免疫グロブリンのFR1のアミノ酸配列;
配列番号49−ラクダ科動物免疫グロブリンのFR1のアミノ酸配列;
配列番号50−ラクダ科動物免疫グロブリンのFR1のアミノ酸配列;
配列番号51−アブラツノザメIgNARのFR1のアミノ酸配列;
配列番号52−テンジクザメIgNARのFR1のアミノ酸配列;
配列番号53−リンカーのアミノ酸配列;
配列番号54−AVP04−07抗TAG72ダイアボディをコードするヌクレオチド配
列;
配列番号55−AVP04−07抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号56−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−50
と命名される修飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号57−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−50
と命名される修飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号58−AVP07−17抗Her2ダイアボディをコードするヌクレオチド配列
;
配列番号59−AVP07−17抗Her2ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号60−AVP02−60抗MUC1ダイアボディをコードするヌクレオチド配列
;
配列番号61−AVP02−60抗MUC1ダイアボディのアミノ酸配列
配列番号62−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−84
と命名される修飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号63−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−84
と命名される修飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号64−FR1あるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去と、
N末端セリンとを含むAVP07−63と命名される修飾AVP07−17抗Her2ダ
イアボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号65−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−63と命名される修飾AVP07−17抗Her
2ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号66−AVP04−07においてN末端Gln残基をSer残基と置換するため
の変異原性プライマーのヌクレオチド配列;
配列番号67−AVP04−07においてN末端Gln残基をSer残基と置換するため
の変異原性プライマーのヌクレオチド配列;
配列番号68−AVP07−17においてアラニン残基をシステインに置き換えるための
変異原性プライマーのヌクレオチド配列;
配列番号69−AVP07−17においてアラニン残基をシステインに置き換えるための
変異原性プライマーのヌクレオチド配列;
配列番号70−ヒトHer2のアミノ酸配列;
配列番号71−ヒトPSMAのアミノ酸配列;
配列番号72−ヒトMUC1のアイソフォームのアミノ酸配列;及び
配列番号73−いくつかの型の癌で発現するヒトMUC1のアイソフォームのアミノ酸配
列。
配列番号74−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−85
と命名される修飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号75−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−85
と命名される修飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号76−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−78
と命名される修飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号77−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−78
と命名される修飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号78−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP02−10
1と命名される修飾AVP02−60抗MUC1ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号79−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP02−10
1と命名される修飾AVP02−60抗MUC1ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号80−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP02−10
4と命名される修飾AVP02−60抗MUC1ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号81−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP02−10
4と命名される修飾AVP02−60抗MUC1ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号82−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP02−10
2と命名される修飾AVP02−60抗MUC1ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号83−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP02−10
2と命名される修飾AVP02−60抗MUC1ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号84−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP02−10
5と命名される修飾AVP02−60抗MUC1ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号85−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP02−10
5と命名される修飾AVP02−60抗MUC1ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号86−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−88と命名される修飾AVP07−17抗HER
2ダイアボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号87−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−88と命名される修飾AVP07−17抗HER
2ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号88−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−90と命名される修飾AVP07−17抗HER
2ダイアボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号89−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−90と命名される修飾AVP07−17抗HER
2ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号90−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−89と命名される修飾AVP07−17抗HER
2ダイアボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号91−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−89と命名される修飾AVP07−17抗HER
2ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号92−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−91と命名される修飾AVP07−17抗HER
2ダイアボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号93−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−91と命名される修飾AVP07−17抗HER
2ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号94−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP02−10
3と命名される修飾AVP02−60抗MUC1ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号95−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP02−10
3と命名される修飾AVP02−60抗MUC1ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号96−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−68と命名される修飾AVP07−17抗HER
2ダイアボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号97−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除去
と、N末端セリンとを含むAVP07−68と命名される修飾AVP07−17抗HER
2ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号98−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−51
と命名される修飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号99−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−51
と命名される修飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号100−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−7
0と命名される修飾AVP04−07抗TAG72 scFvをコードするヌクレオチド
配列;
配列番号101−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−7
0と命名される修飾AVP04−07抗TAG72 scFvのアミノ酸配列;
配列番号102−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−7
4と命名される修飾AVP04−07抗TAG72トリアボディをコードするヌクレオチ
ド配列;
配列番号103−FR1におけるシステイン残基とN末端セリンとを含むAVP04−7
4と命名される修飾AVP04−07抗TAG72トリアボディのアミノ酸配列;
配列番号104−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除
去と、N末端セリンとを含むAVP07−71と命名される修飾AVP07−17抗HE
R2 scFvをコードするヌクレオチド配列;
配列番号105−FR1におけるシステイン残基と、CDR3H中のシステイン残基の除
去と、N末端セリンとを含むAVP07−71と命名される修飾AVP07−17抗HE
R2 scFvのアミノ酸配列;
配列番号106−AVP04−07におけるVL鎖のFR1領域のKabat位置L8及
びL11にシステイン残基を導入するための変異原性プライマーのヌクレオチド配列;
配列番号107−AVP04−07におけるVL鎖のFR1領域のKabat位置L8及
びL11にシステイン残基を導入するための変異原性プライマーのヌクレオチド配列;
配列番号108−CDR3Hシステイン残基Cys104(Kabat付番H100)及
びCys109(H100E)をアラニンに置き換え、且つN末端セリンを含むAVP0
7−86と命名される修飾AVP07−17抗HER2ダイアボディをコードするヌクレ
オチド配列;
配列番号109−CDR3Hシステイン残基Cys104(Kabat付番H100)及
びCys109(H100E)をアラニンに置き換え、且つN末端セリンを含むAVP0
7−86と命名される修飾AVP07−17抗HER2ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号110−AVP04−07抗TAG72ダイアボディのVHをコードするヌクレ
オチド配列;
配列番号111−AVP04−07抗TAG72ダイアボディのVHのアミノ酸配列;
配列番号112−AVP04−07抗TAG72ダイアボディのVLをコードするヌクレ
オチド配列;
配列番号113−AVP04−07抗TAG72ダイアボディのVLのアミノ酸配列;
配列番号114−リンカー配列を欠くAVP04−07抗TAG72ダイアボディ(AV
P04−69と命名される)をコードするヌクレオチド配列;
配列番号115−リンカー配列を欠くAVP04−07抗TAG72ダイアボディ(AV
P04−69と命名される)のアミノ酸配列;
配列番号116−リンカー配列及びVH中のリンカーに対してN末端側のアミノ酸を欠く
AVP04−07抗TAG72ダイアボディ(AVP04−09と命名される)をコード
するヌクレオチド配列;
配列番号117−リンカー配列及びVH中のリンカーに対してN末端側のアミノ酸を欠く
AVP04−07抗TAG72ダイアボディ(AVP04−09と命名される)のアミノ
酸配列;
配列番号118−VLのFR1にシステイン残基を含むAVP04−50と命名される修
飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号119−VLのFR1にシステイン残基を含むAVP04−50と命名される修
飾AVP04−07抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号120−VLのFR1にシステイン残基を含み、且つリンカー配列を欠くAVP
04−50と命名される修飾AVP04−69抗TAG72ダイアボディをコードするヌ
クレオチド配列;
配列番号121−VLのFR1にシステイン残基を含み、且つリンカー配列を欠くAVP
04−50と命名される修飾AVP04−69抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列
;
配列番号122−VLのFR1にシステイン残基を含み、且つリンカー配列及びVH中の
リンカーに対してN末端側のアミノ酸を欠くAVP04−50と命名される修飾AVP0
4−09抗TAG72ダイアボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号123−FR1にシステイン残基を含み、且つリンカー配列及びVH中のリンカ
ーに対してN末端側のアミノ酸を欠くAVP04−50と命名される修飾AVP04−0
9抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号124−VHにN末端セリン残基を含む修飾AVP04−07抗TAG72ダイ
アボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号125−VHにN末端セリン残基を含む修飾AVP04−07抗TAG72ダイ
アボディのアミノ酸配列;
配列番号126−リンカー配列を欠き、且つVHにN末端セリン残基を含む修飾AVP0
4−69抗TAG72ダイアボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号127−リンカー配列を欠き、且つVHにN末端セリン残基を含む修飾AVP0
4−69抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号128−リンカー配列及びVH中のリンカーに対してN末端側のアミノ酸を欠き
、且つVHにN末端セリン残基を含む修飾AVP04−09抗TAG72ダイアボディを
コードするヌクレオチド配列;
配列番号129−リンカー配列及びVH中のリンカーに対してN末端側のアミノ酸を欠き
、且つVHにN末端セリン残基を含む修飾AVP04−09抗TAG72ダイアボディの
アミノ酸配列;
配列番号130−VLのFR1にシステイン残基及びVHにN末端セリン残基を含み、且
つリンカー配列を欠く修飾AVP04−50抗TAG72ダイアボディをコードするヌク
レオチド配列;
配列番号131−VLのFR1にシステイン残基及びVHにN末端セリン残基を含み、且
つリンカー配列を欠く修飾AVP04−50抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号132−VLのFR1にシステイン残基及びVHにN末端セリン残基を含み、且
つリンカー配列及びVH中のリンカーに対してN末端側のアミノ酸を欠く修飾AVP04
−50抗TAG72ダイアボディをコードするヌクレオチド配列;
配列番号133−VLのFR1にシステイン残基及びVHにN末端セリン残基を含み、且
つリンカー配列及びVH中のリンカーに対してN末端側のアミノ酸を欠く修飾AVP04
−50抗TAG72ダイアボディのアミノ酸配列;
配列番号134はリンカーのアミノ酸配列であり;及び
配列番号135はリンカーのアミノ酸配列である。
本明細書全体を通じて、特に具体的に明記しない限り、又は特に文脈上必要でない限り
、単一のステップ、組成物、一群のステップ又は一群の組成物に対する参照は、1つ及び
複数(すなわち1つ以上)のそれらのステップ、組成物、一群のステップ又は一群の組成
物を包含すると解釈されるべきである。
良例を受け入れる余地を有することを理解するであろう。本発明はかかる変形例及び改良
例を全て含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において参照され、
又は指示される全てのステップ、特徴、組成物及び化合物も、個別に、又はまとめて含み
、及び前記ステップ又は特徴のあらゆる組み合わせ又は任意の2つ以上も含む。
、それらの実施形態は、あくまでも例示目的を意図しているに過ぎない。機能的に均等な
生成物、組成物及び方法は、本明細書に記載されるとおり、明らかに本発明の範囲内に含
まれる。
に準用されると解釈されなければならない。
分野(例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、生化学
及びホモロジーモデリング)の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する
と解釈されなければならない。
的技術は、当業者に周知の標準的手順である。かかる技術は、J.Perbal、「A
Practical Guide to Molecular Cloning」、Jo
hn Wiley and Sons(1984年)、J.Sambrookら「Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual」、Cold
Spring Harbour Laboratory Press(1989年)、
T.A.Brown(編者)、「Essential Molecular Biolo
gy:A Practical Approach」、第1及び2巻、IRL Pres
s(1991年)、D.M.Glover及びB.D.Hames(編者)、「DNA
Cloning:A Practical Approach」、第1〜4巻、IRL
Press(1995年及び1996年)、及びF.M.Ausubelら(編者)、「
Current Protocols in Molecular Biology」、
Greene Pub.Associates and Wiley−Intersci
ence(1988年、現在までの改訂版を全て含む)、Ed Harlow及びDav
id Lane(編者)「Antibodies:A Laboratory Manu
al」、Cold Spring Harbour Laboratory、(1988
年)、及びJ.E.Coliganら(編者)「Current Protocols
in Immunology」、John Wiley & Sons(現在までの改訂
版を全て含む)などの資料において文献の各所に記載及び説明されている。
び定義は、例えば、Kabat(1987年及び/又は1991年)、Borkら(19
94年)及び/又はChothia及びLesk(1987年及び1989年)又はAl
−Lazikaniら(1997年)における論考によりさらに明確となり得る。
いずれも意味するものと理解されなければならず、及び双方の意味又は一方の意味の明示
的な支持を提供するものと解釈されなければならない。
における用語「〜の間」は、挙げられる2つの残基の間に位置する任意の残基及び挙げら
れる2つの残基を意味するものと解釈されなければならない。例えば、用語「残基8〜1
1の間」は、κ VL又はVHとの関連においては残基8、9、10及び11を含むもの
と理解されなければならず、及び/又はλ VLとの関連における用語「残基8〜12の
間」は、λ VLがKabat付番方式の残基10を含まないため、残基8、9、11及
び12を意味するものと理解されなければならない。
mprises)」若しくは「〜を含んでいる(comprising)」などのその変
形は、記載される要素、完全体(integer)若しくはステップ、又は一群の要素、
完全体若しくはステップが包含され、しかし任意の他の要素、完全体若しくはステップ、
又は一群の要素、完全体若しくはステップを除外するものではないことを含意するものと
理解され得る。
が、そのソースから、直接得る必要はないものの、得られ得ることを示すものと解釈され
なければならない。
本明細書で使用されるとき、用語「免疫グロブリン」は、抗体又は任意の抗体関連タン
パク質を意味するものと解釈されなければならない。当業者は、抗体が、複数のポリペプ
チド鎖から構成される可変領域、例えば軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)
を含むタンパク質であると概して見なされることを認識するであろう。抗体はまた、概し
て、定常領域又は定常断片若しくは結晶性断片(Fc)として配列され得る定常ドメイン
も含む。抗体は、1個又は数個の密接に関連する抗原に特異的に結合することができる。
概して、抗体は、その基本単位として4本の鎖からなる構造を含む。完全長抗体は、共有
結合で連結された2本の重鎖(約50〜70kD)と2本の軽鎖(各約23kD)とを含
む。軽鎖は、概して可変領域と定常ドメインとを含み、及び哺乳動物ではκ軽鎖又はλ軽
鎖のいずれかである。重鎖は、概して可変領域と、ヒンジ領域によって別の1つ又は複数
の定常ドメインに連結された1つ又は2つの定常ドメインとを含む。哺乳動物の重鎖は以
下の種類、すなわちα、δ、ε、γ、又はμのうちの一つである。各軽鎖はまた、重鎖の
一方に共有結合で連結されている。例えば、2本の重鎖及び重鎖と軽鎖とは、鎖間ジスル
フィド結合及び非共有結合性の相互作用により一体に保持される。鎖間ジスルフィド結合
の数は、抗体の種類によって異なり得る。各鎖は、N末端可変領域(VH又はVL、各々
が約110アミノ酸長である)と、C末端における1つ又は複数の定常ドメインとを有す
る。軽鎖の定常ドメイン(CL、約110アミノ酸長)は重鎖の第1の定常ドメイン(C
H、約330〜440アミノ酸長)と整列し、それにジスルフィド結合している。軽鎖可
変領域は重鎖の可変領域と整列する。抗体重鎖は2つ以上のさらなるCHドメイン(CH
2、CH3など)を含むことができ、定常ドメインCH1とCmとの間に特定され得るヒ
ンジ領域を含むことができる。抗体は任意の種類(例えば、IgG、IgE、IgM、I
gD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG
4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスであり得る。好ましくは、抗体はネズミ科動
物(マウス又はラット)抗体又は霊長類(好ましくはヒト)抗体である。用語「抗体」は
また、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体及びキメラ抗体も包含する。抗体に関連する
、ひいては用語「免疫グロブリン」に包含されるタンパク質には、ドメイン抗体、ラクダ
科動物抗体及び軟骨魚類由来の抗体(すなわち、免疫グロブリン新規抗原受容体(IgN
AR))が含まれる。概して、ラクダ科動物抗体及びIgNARは、VHを含むがVLを
欠き、重鎖免疫グロブリンと称されることが多い。本明細書で使用されるとき、用語「免
疫グロブリン」には、例えば可変領域を含む抗原結合部位を理由として、T細胞受容体及
び抗原との結合能を有しないタンパク質を含む他の免疫グロブリン様ドメインは包含され
ない。さらに、用語「免疫グロブリン」には、FR1を含まない免疫グロブリンドメイン
を含むタンパク質は、かかるタンパク質によっては本発明を実施できないため、包含され
ない。
免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のなかで、CDR、すなわちCDRl、CDR2、及びC
DR3、並びにFRのアミノ酸配列を含む部分を指す。IgNARの場合、用語「可変領
域」にはCDR2の存在は必要でない。VHは重鎖の可変領域を指す。VLは軽鎖の可変
領域を指す。本発明で用いられる方法によれば、CDR及びFRに割り当てられるアミノ
酸位置はKabat(1987年及び1991年)に従い定義される。当業者は、本発明
の実施において他の付番方式、例えばChothia及びLesk(1987年及び/又
は1989年)及び/又はAl−Lazikaniら(1997年)の超可変ループ付番
方式を使用することが容易に可能であろう。
原との結合能、好ましくは1つ又は複数の抗原との特異的結合能を有し、且つ少なくとも
約30アミノ酸を含むFR1を少なくとも含むタンパク質を意味するものと解釈されなけ
ればならない。重鎖の例示的FR1の配列を本明細書に提供する(例えば、配列番号1〜
13を参照)。好ましくは、重鎖は3つ又は4つのFR(例えば、FR1、FR2、FR
3及び場合によりFR4)を、3つのCDRと共に含む。好ましくは、重鎖は以下のとお
り位置するFR及びCDRを含む:Kabat付番方式により付番して、残基1〜25又
は1〜30(FR1)、31〜25(CDR1)、36〜49(FR2)、50〜65(
CDR2)、66〜94(FR3)、95〜102(CDR3)及び103〜113(F
R4)。一例において、重鎖は、前記重鎖及び複数の(好ましくは3つ又は4つの)定常
ドメインを含むか、又は定常断片(Fc)に連結された免疫グロブリンに由来する。
原との結合能、好ましくは1つ又は複数の抗原との特異的結合能を有し、且つ約23アミ
ノ酸を含むFR1を少なくとも含むタンパク質を意味するものと解釈されなければならな
い。軽鎖の例示的FR1の配列を本明細書に提供する(例えば、配列番号14〜43を参
照)。好ましくは、軽鎖は3つ又は4つのFR(例えば、FR1、FR2、FR3及び場
合によりFR4)を、3つのCDRと共に含む。好ましくは、軽鎖は以下のとおり位置す
るFR及びCDRを含む:Kabat付番方式により付番して、残基1〜23(FRl)
、24〜34(CDR1)、35〜49(FR2)、50〜56(CDR2)、57〜8
8(FR3)、89〜97(CDR3)及び98〜107(FR4)。一例において、軽
鎖は、1つの定常ドメインに連結された、及び/又は定常断片(Fc)に連結されない前
記軽鎖を含む免疫グロブリンに由来する。
変領域残基を意味するものと理解される。天然に存在する免疫グロブリン(例えば、抗体
)の各可変領域は、典型的には、FRl、FR2、FR3及びFR4として特定される4
つのFRを有する。CDRをKabatにより定義する場合、例示的軽鎖FR(LCFR
)残基はおよそ残基1〜23(LCFR1)、35〜49(LCFR2)、57〜88(
LCFR3)、及び98〜107(LCFR4)に位置する。λLCFR1は、κLCF
R1には含まれる残基10を含まないことに留意されたい。例示的重鎖FR(HCFR)
残基はおよそ残基1〜30(HCFRl)、36〜49(HCFR2)、66〜94(H
CFR3)、及び103〜113(HCFR4)に位置する。
)は、天然N末端残基と相補性決定領域1(CDR1)の始点との間の残基として定義さ
れる。これらの残基は、少なくとも2つの命名法、1)Kabat(1987年及び/又
は2001年)及び2)Chothia及びLesk(1987年、1989年及びAl
−Lazikaniら1997年)により付番されている。Chothia及びLesk
付番方式は、十分に確立されたKabat方式をベースとして、免疫グロブリン可変領域
における軽鎖CDR1及び重鎖CDR1の配列長のばらつきについて、三次元構造におけ
るそれらの実際の位置により良く適合するように付番し直すことを試みたものである。C
hothia及びLeskにより採用されたCDRに特化した付番は、その後1989年
に修正されたが、次に1997年に元に戻された。これらの付番方式の間には、CDRル
ープ内に存在する残基を取り扱う際に僅かな違いがある。
行して、単一の高度に保存されたシステイン残基(Cys)が概して存在する。κ及びλ
可変軽鎖の双方の中に、この保存されたシステインは不変的にKabat23位にあり、
CDR2とCDR3との間のフレームワーク領域3として定義される領域内に不変的にK
abat88位にある別の高度に保存されたシステイン残基とジスルフィド結合を形成す
る。しかしながら本発明は、FR1の他のアミノ酸に対する保存システインの位置を変化
させ得るインデル、例えば1個、2個又は3個のアミノ酸の、概して人工的なインデルを
企図する。
2位(FR1内)及び92位(FR3内)の保存されたシステイン間に起こる。しかしな
がら、この対形成は全ての免疫グロブリンでほぼ完全に保存されており、このジスルフィ
ド結合がおそらくIgループ多様化の開始時に既に存在したこと、及び選択圧下に維持さ
れたことが示唆される。ジスルフィド結合のほぼ完全な保存は、それがIgループの安定
性に大きく寄与することをさらに示唆する。
Rl、CDR2、及びCDR3又は超可変領域)は、その存在が抗原結合に必要な、免疫
グロブリン可変領域のアミノ酸残基を指す。各可変領域は典型的には、CDRl、CDR
2及びCDR3として特定される3つのCDR領域を有する。各CDRは、Kabat(
1987年及び/又は1991年)により定義されるとおりの「相補性決定領域」のアミ
ノ酸残基を含み得る。例えば、重鎖可変領域では、CDRH1は残基31〜35の間にあ
り、CDRH2は残基50〜65の間にあり、及びCDRH3は残基95〜102の間に
ある。軽鎖では、CDRL1は残基24〜34の間にあり、CDRL2は残基50〜56
の間にあり、及びCDRL3は残基89〜97の間にある。これらのCDRはまた、例え
ばKabat(1987年及び/又は1991年)に記載されるとおりの、多数の挿入も
含み得る。
き、少なくとも1つの定常ドメインを含む免疫グロブリンの一部分であって、概して(必
須ではないが)グリコシル化され、且つ1つ又は複数のF受容体及び/又は補体カスケー
ドの成分に結合する(例えば、エフェクター機能をもたらす)部分を指す。重鎖定常領域
は、5種のアイソタイプ:α、δ、ε、γ、又はμのいずれかから選択され得る。さらに
、様々なサブクラスの重鎖(重鎖のIgGサブクラスなど)が、種々のエフェクター機能
に関与し、従って所望の重鎖定常領域を選択することにより、所望のエフェクター機能を
有するタンパク質を作製することができる。好ましい重鎖定常領域は、γ1(IgG1)
、γ2(IgG2)及びγ3(IgG3)である。
疫グロブリン/抗体、例えばIgG又はIgM又はIgEにおいて極めて類似しているド
メインである。免疫グロブリンの定常領域は、概して複数の定常ドメインを含み、例えば
、γ、α及びδ重鎖の定常領域は3つの定常ドメインを含み、γ、α及びδ重鎖のFcは
2つの定常ドメインを含む。μ及びε重鎖の定常領域は4つの定常ドメインを含み、Fc
領域は2つの定常ドメインを含む。
又は単一のポリペプチドから構成されるかに関わらず、VLとVHとが会合することによ
り、抗原結合部位を有する、すなわち抗原との特異的な結合能を有する複合体を形成する
任意のタンパク質を意味するものと解釈されなければならない。抗原結合部位を形成する
VH及びVLは単一のポリペプチド鎖にあっても、又は異なるポリペプチド鎖にあっても
よい。さらに本発明のFv(並びに本発明の任意のタンパク質)は、同じ抗原を結合して
も、又はしなくてもよい複数の抗原結合部位を有し得る。この用語は、免疫グロブリンに
直接由来する断片も、並びに組換え手段を用いて作製されたかかる断片に対応するタンパ
ク質も包含するものと理解されなければならない。いくつかの例では、VHは重鎖定常ド
メイン(CH)1に連結されず、及び/又はVLは軽鎖定常ドメイン(CL)に連結され
ない。ポリペプチド又はタンパク質を含む例示的なFvとしては、Fab断片、Fab’
断片、F(ab’)断片、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又は高
次複合体、又は定常領域若しくはそのドメイン、例えばCH2若しくはCH3ドメインに
連結された前述のもののいずれかが挙げられる。「Fab断片」は免疫グロブリンの一価
の抗原結合性断片からなり、全免疫グロブリンを酵素パパインで消化することにより作製
することができ、それによりインタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなる断片が得られ、
又は組換え手段を用いて作製することができる。免疫グロブリンの「Fab’断片」は、
全免疫グロブリンをペプシンで処理し、続いて還元することにより得ることができ、それ
によりインタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなる分子が得られる。このように処理した
免疫グロブリンにつき2つのFab’断片が得られる。Fab’断片はまた、組換え手段
によっても作製することができる。免疫グロブリンの「F(ab’)2断片」は、2つの
Fab’断片が2つのジスルフィド結合により一体に保持される二量体からなり、全免疫
グロブリン分子を酵素ペプシンで、続く還元はなしに処理することにより得られる。「F
ab2」断片は、例えばロイシンジッパー又はCH3ドメインを用いて連結される2つの
Fab断片を含む組換え断片である。「単鎖Fv」又は「scFv」は、軽鎖の可変領域
と重鎖の可変領域とが好適な柔軟性のあるポリペプチドリンカーにより共有結合で連結さ
れている免疫グロブリンの可変領域断片(Fv)を含む組換え分子である。この用語の範
囲内に含まれる例示的Fv含有タンパク質の詳細な考察は、本明細書で以下に提供される
。
るタンパク質により形成される構造を意味するものと解釈されなければならない。抗原結
合部位は一連の連続するアミノ酸でなくてもよく、又はさらには単一のポリペプチド鎖に
あるアミノ酸でなくてもよい。例えば、2つの異なるポリペプチド鎖から作製されるFv
において、抗原結合部位は、抗原と相互作用するVL及びVHの一連の領域から構成され
るが、しかしながら概して各可変領域でCDRの1つ又は複数にあるとは限らない。
れるとおりの免疫グロブリンの可変領域におけるFR及びCDRの位置を決定する付番方
式を意味する。
れた一連の連続するアミノ酸、又は互いに共有結合的に若しくは非共有結合的に連結され
た一連のポリペプチド鎖(すなわち、ポリペプチド複合体)を含むものと解釈されなけれ
ばならない。例えば、一連のポリペプチド鎖は、好適な化学結合又はジスルフィド結合を
用いて共有結合的に連結されてもよい。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合
、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。本発明により企図される非
共有結合は、例えば何らかの形態のダイアボディ又はトリアボディ又はテトラボディにお
けるVHとVLとの間の相互作用である。
るアミノ酸を意味するように意味するものと理解されるだろう。
合であることを認識するであろう。この結合は、SS結合又はジスルフィド架橋とも称さ
れる。タンパク質では、ジスルフィド結合は概して2つのシステイン残基のチオール基間
で起こり、シスチンを生じる。
化に十分な、例えばジスルフィド結合の形成を許容する条件を含むことを認識するであろ
う。
)を引き起こし得る任意の組成物を意味するものと理解されなければならない。例示的抗
原としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、リン酸基、蛍光ペプチド
又はポリペプチド、グリコシル化(glyscosylated)ペプチド又はペプチド
等が挙げられる。
の1つ又は複数の抗原又はそれを発現する細胞と、別の抗原又は細胞との反応又は会合と
比べてより高い頻度で、より高速に、より長い持続時間で及び/又はより高いアフィニテ
ィで反応又は会合することを意味するものと解釈されなければならない。例えば、抗原に
特異的に結合するタンパク質は当該の抗原を、他の抗原との結合と比べてより高いアフィ
ニティ、アビディティで、より容易に、及び/又はより長い持続時間で結合する。また、
この定義を読むことで、例えば第1の抗原に特異的に結合するタンパク質が第2の抗原に
特異的に結合しても、又はしなくてもよいことが理解される。従って、「特異的な結合」
は、必ずしも用語「選択的な結合性」によって意味されるように結合が排他的であること
、又は別の抗原の結合が検出不可能であることを要求するものではない。必須ではないが
、概して結合と言うとき、それは特異的な結合を意味し、及び各用語は他の用語の明示的
な支持を提供するものと理解されなければならない。
害する」又は「妨害」は、抗原との結合の完全な抑止又は完全な阻害を意味するものと解
釈されなければならない。
本発明は、1つ又は複数の抗原に特異的又は選択的に結合し、且つ本明細書において任
意の実施形態により記載されるとおり修飾される免疫グロブリン可変領域を含む任意のタ
ンパク質を企図する。好ましいタンパク質は、少なくとも1つのVHと少なくとも1つの
VLとを含む。例示的免疫グロブリン可変領域は、抗体及びその修飾された形態(例えば
、ヒト化抗体)並びにラクダ科動物免疫グロブリン及びIgNARなどの重鎖抗体由来の
可変領域である。
抗体可変領域
本明細書の記載に基づけば当業者には明らかなとおり、本発明のタンパク質は、FR1
に少なくとも2つのシステイン残基を含むように修飾された抗体由来の1つ又は複数の可
変領域を含む。本発明はまた抗体分子も提供する。かかる抗体は、初めに目的の抗原に対
する抗体を作製し、その抗体を(例えば組換え手段を用いて)修飾することによるか、又
は既に作製されている抗体を修飾することにより作製されてもよい。
のモノクローナル抗体の作製方法が、Kohler及びMilstein、(1975年
)による。ハイブリドーマ法では、典型的には、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿
主動物を免疫原又は抗原又はそれを発現する細胞で免疫し、その免疫原又は抗原に特異的
に結合し得る抗体を産生する、又は産生する能力を有するリンパ球を生じさせる。次に、
ポリエチレングリコールなどの好適な融剤を用いて免疫化動物のリンパ球又は脾臓細胞を
不死化細胞系と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding、1986年)。
得られたハイブリドーマ細胞は、融合しなかった不死化細胞の成長又は生存を阻害する1
つ又は複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地で培養してもよい。例えば、親細
胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はH
PRT)を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、及びチミジンを含み(「HAT培地」)、これらの物質がHGPRT欠損細
胞の成長を妨げる。本明細書はまた、例えば、一般的にLargaespada(199
0年)又はWeissingerら(1991年)に詳細に記載されるABL−MYC技
術を用いる他の抗体作製方法も企図する。
る細胞、例えばハイブリドーマ又はトランスフェクトーマから生成される。かかるハイブ
リドーマ及び/又はトランスフェクトーマの様々な供給源は当業者には明らかで、例えば
American Type Culture Collection(ATCC)及び
/又はEuropean Collection of Cell Cultures(
ECACC)が挙げられる。抗体の可変領域をコードする配列を単離及び/又は修飾する
方法は当業者には明らかで、及び/又は本明細書に記載される。
書において任意の実施形態により記載されるとおりの部位にシステイン残基を含むように
修飾される。概してこれは、抗体をコードする核酸を単離すること、領域をコードし、且
つ修飾された抗体を発現するFR1の必要な部位に、システイン残基をコードするコドン
(すなわち、TGT又はTGC)を含むようにその配列を修飾することを伴う。
ASGYTFT(配列番号1);QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVS
GYTLT(配列番号2);QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGY
TFT(配列番号3);QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTF
T(配列番号4);QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS(
配列番号5);QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLS(配列
番号6);QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLS(配列番号
7);QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS(配列番号8)
;QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号9);E
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号10);EV
QLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号11);EVQ
LVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFD(配列番号12);及びEV
QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(配列番号13)からなる
群から選択される配列を含む。
C(配列番号14);DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC(配列番号15
);EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC(配列番号16);EIVLTQ
SPATLSLSPGERATLSC(配列番号17);EIVLTQSPGTLSLS
PGERATLSC(配列番号18);DIVMTQSPDSLAVSLGERATIN
C(配列番号19);DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC(配列番号20
);DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号21);EIVMTQ
SPATLSLSPGERATLSC(配列番号22);DIQMTQSPDFLAVS
LGERATINC(配列番号23);EIVLTQSPSSLSASVGDRVTIT
C(配列番号24);DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISC(配列番号25
);DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC(配列番号26);EIVLTQ
SPDFQSVTPKEKVTITC(配列番号27);ETTLTQSPAFMSAT
PGDKVNISC(配列番号28);AIRMTQSPFSLSASVGDRVTIT
C(配列番号29);AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC(配列番号30
);NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITC(配列番号31);DVVMTQ
SPLSLPVTLGQPASISC(配列番号32);DIVMTQTPLSSPVT
LGQPASISC(配列番号33);DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTIT
C(配列番号34);VIWMTQSPSLLSASTGDRVTISC(配列番号35
);及びAIRMTQSPSSFSASTGDRVTITC(配列番号36)からなる群
から選択される配列を含む。
(配列番号37);QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC(配列番号38);
QSALTQPASVSGSPGQSITISC(配列番号39);QSALTQPRS
VSGSPGQSVTISC(配列番号40);SYVLTQPPSVSVAPGKTA
RITC(配列番号41);SYELTQPPSVSVSPGQTASITC(配列番号
42);及びQLVLTQSPSASASLGASVKLTC(配列番号43)からなる
群から選択される配列を含む。
なリストではない。これらの例は、本発明を限定するのではなく、本発明を説明する目的
で提供される。公知の方法を用いて、及び/又は例えばKabat(1987年及び/又
は2001年)の開示に基づき、さらなるFR1の配列を決定することは、当業者の能力
の範囲内である。
の位置に2つ以上のシステイン残基を含むように容易に修飾される。
R1をコードする核酸の配列を決定することが容易に可能であろう。
本発明のタンパク質は、ヒト化抗体又はヒト抗体又はそれに由来する可変領域に由来し
てもよく、又はそれであってもよい。用語「ヒト化抗体」は、キメラ分子であって、概し
て組換え技術を用いて調製され、非ヒト種の抗体に由来する抗原結合部位を有し、及びそ
の分子の残りの抗体構造がヒト抗体の構造及び/又は配列に基づくキメラ分子を指すもの
と理解されなければならない。抗原結合部位は、好ましくは、ヒト抗体の可変領域におけ
る適切なFRにグラフトされた非ヒト抗体のCDRと、ヒト抗体の残りの領域とを含む。
抗原結合部位は野生型であってもよく、又は1つ又は複数のアミノ酸置換により修飾され
てもよい。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク残基が対応する非ヒト残
基に置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、又は移入されたCDR
若しくはフレームワーク配列にも存在しない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は
、CDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域
の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも
1つ、典型的には2つの可変領域の実質的に全てを含み得る。非ヒト抗体をヒト化する方
法は当該技術分野において公知である。ヒト化は、本質的に、米国特許第5225539
号明細書、米国特許第6054297号明細書又は米国特許第5585089号明細書の
方法に従い実施することができる。他の抗体のヒト化方法が除外されることはない。当業
者は、完全抗体でない本発明のタンパク質もまたヒト化することができ、例えば、可変ド
メインがヒト化されてもよいことを理解するであろう。
れるとき、ヒト、例えばヒト生殖細胞系列又は体細胞に存在する配列に由来する、又はそ
れに対応する可変抗体領域、及び場合により定常抗体領域を有する抗体を指す。「ヒト」
抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基、例えばランダム又は部位特異的変
異によりインビトロで導入された変異(特に保存的置換が関与する変異又は抗体の少数の
残基における変異、例えば抗体の残基の1、2、3、4又は5個における変異、好ましく
は例えば抗体のCDRの1つ又は複数を構成する残基の1、2、3、4又は5個における
変異)を含み得る。これらの「ヒト抗体」は、実際にヒトによって産生される必要はなく
、むしろ、組換え手段を用いて作製されても、及び/又はヒト抗体定常領域及び/又は可
変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物(例えば、マウス)から単離され
てもよい。ヒト抗体又はその断片は、ファージディスプレイライブラリ(例えば、米国特
許第6300064号明細書;米国特許第5885793号明細書;米国特許第6204
023号明細書;米国特許第6291158号明細書;又は米国特許第6248516号
明細書に記載されるとおり)を含めた、当該技術分野において公知の様々な技術を用いて
、又はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物を使用して(例えば
、国際公開第2002/066630号パンフレット;Lonbergら(1994年)
又はJakobovitsら(2007年)に記載されるとおり)作製することができる
。
。用語「キメラ抗体」は、重鎖及び/又は軽鎖の一部分が、特定の種(例えば、マウスな
どのネズミ科動物)に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗
体中の対応する配列と同一又は相同であり、一方、1つ又は複数の鎖の残りの部分が、別
の種(例えば、ヒトなどの霊長類)に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラ
スに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにかかる抗体の断片を
、それらが所望の生物活性を呈する限りにおいて指す(米国特許第4,816,567号
明細書)。典型的には、キメラ抗体は、主にヒトドメインを有する抗体を作製するために
、げっ歯類又はウサギ可変領域とヒト定常領域とを利用する。例えば、キメラ抗体は、ヒ
ト定常ドメイン及び/又はヒト定常領域に融合した本発明の任意の実施形態により修飾さ
れたマウス抗体の可変領域を含む。かかるキメラの抗体の作製は当該技術分野において公
知であり、標準的な手段によって実現され得る(例えば、米国特許第5,807,715
号明細書;米国特許第4,816,567号明細書及び米国特許第4,816,397号
明細書に記載のとおり)。
ンパク質に対して免疫応答を生じる可能性を低減するため除去された(すなわち変異させ
た)1つ又は複数のエピトープ、例えばB細胞エピトープ又はT細胞エピトープを有する
。脱免疫化タンパク質の作製方法は当該技術分野において公知であり、例えば、国際公開
第00/34317号パンフレット、国際公開第2004/108158号パンフレット
及び国際公開第2004/064724号パンフレットに記載される。例えば、この方法
は、タンパク質におけるエピトープを予測するためインシリコ解析を実施するステップと
、予測されたエピトープにおける1つ又は複数の残基を変異させ、それによりその免疫原
性を低下させるステップとを含む。次にタンパク質が、例えばインシリコ又はインビトロ
又はインビボで分析され、抗原に結合するその能力を維持していることが確認される。好
ましくはCDR内に存在するエピトープを変異させることは、その変異が抗原結合性を低
下させる可能性が低くない限り行わない。抗原の予測方法は当該技術分野において公知で
あり、例えばSaha(2004年)に記載される。AVP04−07における例示的な
候補エピトープは、配列番号55の以下の位置:35〜41;68〜77;84〜90;
109〜119;122〜128;160〜169;及び185〜194に存在する。免
疫原性が潜在的に低下するように変異させ得る残基としては、K38、T71、A72、
K74、T87、T112、V113、S114、S115、G116、T125、Q1
63、Q164、P166、F188、T189、G190又はS191が挙げられる。
重鎖免疫グロブリンは、それが重鎖を含み、しかし軽鎖を含まない限りにおいて、構造
的に多くの他の形態の免疫グロブリン(例えば、抗体)と異なる。従って、このような免
疫グロブリンは「重鎖のみの抗体(heavy chain only antibod
y)」とも称される。重鎖免疫グロブリンは、例えばラクダ科動物及び軟骨魚類(IgN
ARとも称される)に見られる。
る重鎖可変領域(「VHドメイン」と称される)及び従来の4本鎖抗体に存在する軽鎖可
変領域(「VLドメイン」と称される)と区別するため、概してラクダ科動物Igにおい
て「VHHドメイン」、及びIgNARにおいてV−NARと称される。
在を必要としない。この特徴によって重鎖免疫グロブリンは、VH及びVLの双方のドメ
インを含むいくつかの従来の4本鎖抗体と区別される。これは、単一のドメイン結合断片
が重鎖免疫グロブリンに由来できることを意味し、重鎖免疫グロブリンは発現し易く、概
して安定的で可溶性である。重鎖免疫グロブリン及びその可変領域ドメインであって、そ
れに由来するドメインはまた、長い表面ループ(特にCDR3)も含むことができ、これ
は、酵素などの抗原に、並びに感染症の原因となるウイルス及び病原体のタンパク質の表
面上に多く見られる空洞の貫通及びそれに対する結合を促進する。
離及び/又は使用方法についての概要は、特に以下の参考文献、国際公開第94/046
78号パンフレット、国際公開第97/49805号パンフレット及び国際公開第97/
49805号パンフレットに見出される。
としては、以下のもの、すなわちGGSVQTGGSLRLSCEISGLTFD(配列
番号44);GGSVQTGGSLRLSCAVSGFSFS(配列番号45);GGS
EQGGGSLRLSCAISGYTYG(配列番号46);GGSVQPGGSLTL
SCTVSGATYS(配列番号47);GGSVQAGGSLRLSCTGSGFPY
S(配列番号48);GGSVQAGGSLRLSCVAGFGTS(配列番号49);
及びGGSVQAGGSLRLSCVSFSPSS(配列番号50)が挙げられる。
び/又は使用方法についての概要は、特に国際公開第2005/118629号パンフレ
ットに見出される。3型アブラツノザメIgNAR FR1の例示的コンセンサス配列は
、配列AWVEQTPRTAKETGESLTINCVLT(配列番号51)を含む。3
型テンジクザメIgNAR FR1の例示的コンセンサス配列は、配列ARVDQTPK
TITKETGESLTINCVLS(配列番号52)を含む。
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ
免疫グロブリン可変領域を含む例示的な好ましいタンパク質は、国際公開第98/04
4001号パンフレット及び国際公開第94/007921号パンフレットに記載される
ものなどの、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び高次タンパク質複合体であ
る。
であって、各々が構造VL−X−VH又はVH−X−VLを含むポリペプチド鎖を含むタ
ンパク質を意味するものと解釈されなければならず、式中、VLは免疫グロブリン軽鎖可
変領域であり、VHは免疫グロブリン重鎖可変領域であり、Xは、単一のポリペプチド鎖
内のVHとVLとの会合(又はFvの形成)を可能にするには不十分な残基を含むリンカ
ーであるか、又は存在せず、及び一方のポリペプチド鎖のVHが他方のポリペプチド鎖の
VLに結合して抗原結合部位を形成し、すなわち、1つ又は複数の抗原との特異的な結合
能を有するFv分子を形成する。VL及びVHは各ポリペプチド鎖で同じである可能性が
あり、又はVL及びVHは各ポリペプチド鎖で異なり、二重特異性ダイアボディ(すなわ
ち、異なる特異性を有する2つのFvを含む)を形成する可能性がある。
であって、各々が構造VL−X−VH又はVH−X−VLを含むポリペプチド鎖を含むタ
ンパク質を意味するものと解釈されなければならず、式中、VLは免疫グロブリン軽鎖可
変領域であり、VHは免疫グロブリン重鎖可変領域であり、Xは、単一のポリペプチド鎖
内のVHとVLとの会合(又はFvの形成)を可能にするには不十分な残基を含むリンカ
ーであるか、又は存在せず、及び一つのポリペプチド鎖のVHが別のポリペプチド鎖のV
Lと会合し、それにより三量体タンパク質(トリアボディ)を形成する。例えば、第1の
ポリペプチド鎖のVHが第2のポリペプチド鎖のVLと会合し、第2のポリペプチド鎖の
VHが第3のポリペプチド鎖のVLと会合し、及び第3のポリペプチドのVHが第1のポ
リペプチド鎖のVLと会合する。VLとVHとが会合することにより、抗原結合部位、す
なわち1つ又は複数の抗原との特異的な結合能を有するFvが形成される。VL及びVH
は各ポリペプチド鎖で同じである可能性があり(すなわち、単一特異性トリアボディが生
じる)、又はVLのうちの2つ及びVHのうちの2つが同じで、且つ各々における第3の
ものが第3のポリペプチド鎖において異なることで二重特異性タンパク質を生じる可能性
があり、又は各ポリペプチド鎖でVL及びVHが異なり、それにより三価のタンパク質を
形成する可能性がある。
であって、各々が構造VL−X−VH又はVH−X−VLを含むポリペプチド鎖を含むタ
ンパク質を意味するものと解釈されなければならず、式中、VLは免疫グロブリン軽鎖可
変領域であり、VHは免疫グロブリン重鎖可変領域であり、Xは、単一のポリペプチド鎖
内のVHとVLとの会合(又はFvの形成)を可能にするには不十分な残基を含むリンカ
ーであるか、又は存在せず、及び一つのポリペプチド鎖のVHが別のポリペプチド鎖のV
Lと会合し、それにより四量体タンパク質(テトラボディ)を形成する。VLとVHとが
会合することにより、抗原結合部位、すなわち1つ又は複数の抗原との特異的な結合能を
有するFvが形成される。例えば、第1のポリペプチド鎖のVHが第2のポリペプチド鎖
のVLと会合し、第2のポリペプチド鎖のVHが第3のポリペプチド鎖のVLと会合し、
第3のポリペプチド鎖のVHが第4のポリペプチド鎖のVLと会合し、及び第4のポリペ
プチド鎖のVHが第1のポリペプチド鎖のVLと会合する。VL及びVHは各ポリペプチ
ド鎖で同じである可能性があり(すなわち、単一特異性テトラボディが生じる)、又はV
L及びVHは2本のポリペプチド鎖においてあるタイプで、且つ他の2本のポリペプチド
鎖において異なるタイプであって、二重特異性テトラボディを生じる可能性があり、又は
VL及びVHは各ポリペプチド鎖で異なり、それにより四重特異性テトラボディを形成す
る可能性がある。
法を認識しているであろう。概してこれらのタンパク質は、VHとVLとが直接連結され
た、又はVHとVLとの会合を可能にするには不十分な長さのリンカーを用いて連結され
たポリペプチド鎖を含む。VH及びVLは任意の順序で、すなわちVL−VH又はVH−
VLで位置することができる。VH及びVLは、例えば、それらのポリペプチド鎖をコー
ドする核酸を、目的の1つ又は複数の可変領域を含む免疫グロブリン(抗体又はキメラ抗
体又はヒト化抗体又はヒト抗体を含む)を発現する細胞から、又はVH及びVLポリペプ
チド鎖を発現する組換えライブラリ(例えば、scFvライブラリ、例えば、欧州特許第
0239400号明細書又は米国特許第4946778号明細書に記載のとおり)から単
離することにより容易に得られる。次にVH及び/又はVLは、本明細書において任意の
実施形態により記載されるとおりの必要なシステイン残基を含むように容易に修飾するこ
とができる。
VH及びVLドメインの順序に応じてダイアボディ、トリアボディ及び/又はテトラボデ
ィを形成する。好ましくは、リンカーは12個以下のアミノ酸を含む。例えば、NからC
の順序に並んだ以下の構造VH−X−VL(式中、Xはリンカーである)を有するポリペ
プチド鎖の場合、3〜12残基を有するリンカーは、概してダイアボディの形成をもたら
し、1又は2残基を有するリンカーは、又はリンカーが存在しない場合、概してトリアボ
ディの形成をもたらす。NからCの順序で並んだ以下の構造VL−X−VH(式中、Xは
リンカーである)を有するポリペプチド鎖の場合、3〜12残基を有するリンカーは、概
してダイアボディの形成をもたらし、1又は2残基を有するリンカーは、概してダイアボ
ディ、トリアボディ及びテトラボディの形成をもたらし、及びリンカーを欠くポリペプチ
ドは、概してトリアボディ又はテトラボディを形成する。
カー配列組成物は、融合タンパク質のフォールディングの安定性に影響し得る。融合タン
パク質と無関係なリンカーを介したタンパク質の間接的な融合により、2つのタンパク質
間の立体障害が回避され、連結の自由度が達成される。
ましくないことが多く、これらの構造はタンパク質の柔軟性、及び結果的にその機能的活
性を制限し得る。むしろ、より望ましいリンカーは、拡がったコンホメーションを選択的
にとる配列である。実際、ごく最近に設計されたリンカー配列は、リンカーに強制的にル
ープコンホメーションをとらせる高含量のグリシン残基を有する。概して設計リンカーで
はグリシンが使用され、これは、β−炭素がないことにより、ポリペプチド骨格が、他の
アミノ酸にはエネルギー的に禁じられた二面角にアクセス可能となるためである。
ーは、アラニン及び/又はセリンをさらに含むグリシンリンカーである。かかるリンカー
は柔軟性を提供し、親水性を高め、及び比較的プロテアーゼ耐性が高い。例えば、Kor
ttら、2001年を参照のこと。
ンカーのN末端との間の接合部に重要であり得る。従って、タンパク質のC末端に隣接す
る領域にグリシンを含むリンカーが好ましい。これに関連して、これはリンカーの第1の
アミノ酸残基がグリシンでなければならないという要件を付与するものではない。
ることができる。例えば、リンカーは配列Glyn−Pro−Glynを含む(式中、n
は約1〜約5の数字である)。
配列番号135);S;SG;SGG;及びSGGGからなる群から選択される配列を含
む。
ンフレットに記載されるとおり、例えばタンパク質間のジスルフィド結合による、共有結
合で連結されたタンパク質も含むことができる。
のVLドメインに接続する別の免疫グロブリンからのVHドメインを含む2つの単鎖融合
産物を非共有結合的に会合させて、それにより各々が異なる免疫グロブリン由来の2つの
Fvを形成することにより作製することができる。例えば、Hudson及びKortt
(1999年)を参照のこと。同様に、多重特異性トリアボディは、3つの単鎖融合タン
パク質を以下のとおり非共有結合的に会合させることにより作製することができる:
(i)短鎖リンカーにより第2の免疫グロブリンのVLドメインに接続する第1の免疫グ
ロブリンからのVHドメインを含む第1のタンパク質;
(ii)短鎖リンカーにより第3の免疫グロブリンのVLドメインに接続する第2の免疫
グロブリンからのVHドメインを含む第2のタンパク質;及び
(iii)短鎖リンカーにより第1の免疫グロブリンのVLドメインに接続する第3の免
疫グロブリンからのVHドメインを含む第3のタンパク質。
ィ及び四重特異性テトラボディを作製するための上記に対する好適な修飾を判断すること
が容易に可能であろう。
テトラボディ又は高次多量体を企図し、特定の抗原に結合するものに限定されると解釈さ
れてはならない。例示的抗原が、限定ではなく、例示を目的として本明細書に記載される
。
酸1〜115又は配列番号59のアミノ酸1〜129又は配列番号61のアミノ酸1〜1
20又は配列番号109のアミノ酸1〜129に示されるVH配列であって、FR1にお
ける2つ以上のシステイン残基及び/又はN末端スレオニン/セリン残基を含むように修
飾されるVH配列を含む。例えば、VHは、
(i)配列番号57のアミノ酸1〜115;
(ii)配列番号63のアミノ酸1〜115;
(iii)配列番号75のアミノ酸1〜115;
(iv)配列番号77のアミノ酸1〜115;
(v)配列番号99のアミノ酸1〜115;
(vi)配列番号65のアミノ酸1〜129;
(vii)配列番号87のアミノ酸1〜129;
(viii)配列番号89のアミノ酸1〜129;
(ix)配列番号91のアミノ酸1〜129;
(x)配列番号93のアミノ酸1〜129;
(xi)配列番号97のアミノ酸1〜129;
(xii)配列番号79のアミノ酸1〜120;
(xiii)配列番号81のアミノ酸1〜120;
(xiv)配列番号83のアミノ酸1〜120;
(xv)配列番号85のアミノ酸1〜120;及び/又は
(xvi)配列番号95のアミノ酸1〜120
に示される配列を含む。
1〜234又は配列番号59のアミノ酸135〜245又は配列番号61のアミノ酸12
6〜232又は配列番号109のアミノ酸135〜245に示されるVL配列であって、
FR1における2つ以上のシステイン残基及び/又はN末端スレオニン/セリン残基を含
むように修飾されるVL配列を含む。例えば、VLは、
(i)配列番号57のアミノ酸121〜234;
(ii)配列番号63のアミノ酸121〜234;
(iii)配列番号75のアミノ酸121〜234;
(iv)配列番号77のアミノ酸121〜234;
(v)配列番号99のアミノ酸121〜234;
(vi)配列番号65のアミノ酸135〜245;
(vii)配列番号87のアミノ酸135〜245;
(viii)配列番号89のアミノ酸135〜245;
(ix)配列番号91のアミノ酸135〜245;
(x)配列番号93のアミノ酸135〜245;
(xi)配列番号97のアミノ酸135〜245;
(xii)配列番号79のアミノ酸126〜232;
(xiii)配列番号81のアミノ酸126〜232;
(xiv)配列番号83のアミノ酸126〜232;
(xv)配列番号85のアミノ酸126〜232;及び/又は
(xvi)配列番号95のアミノ酸126〜232
に示される配列を含む。
の好適なリンカーにより連結されることができる。ダイアボディについては、リンカーは
好ましくは配列GGGSを含む。トリアボディ又はテトラボディについては、好ましくは
リンカーはないか、又は単一のグリシン残基である。
イン残基及び/又はN末端スレオニン/セリン残基を含むように修飾される配列番号55
に示される配列を含む少なくとも1つのポリペプチド鎖(及び好ましくは各々がそのよう
な配列を含む2つのポリペプチド鎖)を含む。例えば、ダイアボディは、配列番号57、
63、75、77又は79の1つ又は複数に示される配列を含む少なくとも1つのポリペ
プチド鎖(及び好ましくは各々がそのような配列を含む2つのポリペプチド鎖)を含む。
含む少なくとも1つのポリペプチド鎖(及び好ましくは各々がそのような配列を含む2つ
又は3つのポリペプチド鎖)を含む。
イン残基及び/又はN末端スレオニン/セリン残基を含むように修飾される配列番号10
9に示される配列を含む少なくとも1つのポリペプチド鎖(及び好ましくは各々がそのよ
うな配列を含む2つのポリペプチド鎖)を含む。例えば、ダイアボディは、配列番号65
、87、89、91、93又は97の1つ又は複数に示される配列を含む少なくとも1つ
のポリペプチド鎖(及び好ましくは各々がそのような配列を含む2つのポリペプチド鎖)
を含む。
イン残基及び/又はN末端スレオニン/セリン残基を含むように修飾される配列番号61
に示される配列を含む少なくとも1つのポリペプチド鎖(及び好ましくは各々がそのよう
な配列を含む2つのポリペプチド鎖)を含む。例えば、ダイアボディは、配列番号79、
81、83、85又は95の1つ又は複数に示される配列を含む少なくとも1つのポリペ
プチド鎖(及び好ましくは各々がそのような配列を含む2つのポリペプチド鎖)を含む。
当業者は、scFvが単一のポリペプチド鎖にVH及びVL領域を含むことを認識する
であろう。好ましくは、ポリペプチド鎖はVHとVLとの間にポリペプチドリンカーをさ
らに含み、それによりscFvが抗原結合に望ましい構造を形成する(すなわち、単一の
ポリペプチド鎖のVHとVLとが互いに会合してFvを形成する)ことが可能となる。こ
れは、異なるポリペプチド鎖からの可変領域が互いに会合又は結合するダイアボディ又は
高次多量体とは区別される。例えば、リンカーは、よりscFvに好適なリンカーの1つ
である(Gly4Ser)3(すなわちGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号53
))を有する過剰の12アミノ酸残基を含む。
〜129又は配列番号61のアミノ酸1〜120又は配列番号109のアミノ酸1〜12
9に示されるVH配列であって、FR1における2つ以上のシステイン残基及び/又はN
末端スレオニン/セリン残基を含むように修飾されるVH配列を含む。一例において、s
cFvはTAG72に結合し、VHは、
(i)配列番号57のアミノ酸1〜115;
(ii)配列番号63のアミノ酸1〜115;
(iii)配列番号75のアミノ酸1〜115;
(iv)配列番号77のアミノ酸1〜115;又は
(v)配列番号99のアミノ酸1〜115;
の1つに示される配列を含み、及びVLは、
(i)配列番号57のアミノ酸121〜234;
(ii)配列番号63のアミノ酸121〜234;
(iii)配列番号75のアミノ酸121〜234;
(iv)配列番号77のアミノ酸121〜234;又は
(v)配列番号99のアミノ酸121〜234
の1つに示される配列を含む。
。
(i)配列番号65のアミノ酸1〜129;
(ii)配列番号87のアミノ酸1〜129;
(iii)配列番号89のアミノ酸1〜129;
(iv)配列番号91のアミノ酸1〜129;
(v)配列番号93のアミノ酸1〜129;又は
(vi)配列番号97のアミノ酸1〜129
の1つに示される配列を含み、及びVLは、
(i)配列番号65のアミノ酸135〜245;
(ii)配列番号87のアミノ酸135〜245;
(iii)配列番号89のアミノ酸135〜245;
(iv)配列番号91のアミノ酸135〜245;
(v)配列番号93のアミノ酸135〜245;又は
(vi)配列番号97のアミノ酸135〜245
の1つに示される配列を含む。
。
(i)配列番号79のアミノ酸1〜120;
(ii)配列番号81のアミノ酸1〜120;
(iii)配列番号83のアミノ酸1〜120;
(iv)配列番号85のアミノ酸1〜120;又は
(v)配列番号95のアミノ酸1〜120
の1つに示される配列を含み、及びVLは、
(i)配列番号79のアミノ酸126〜232;
(ii)配列番号81のアミノ酸126〜232;
(iii)配列番号83のアミノ酸126〜232;
(iv)配列番号85のアミノ酸126〜232;又は
(v)配列番号95のアミノ酸126〜232
の1つに示される配列を含む。
では単一のシステイン残基がVHのFR及びVLのFRに導入され、及びそれらのシステ
イン残基がジスルフィド結合によって連結され、安定的なFvをもたらす(例えば、Br
inkmannら、1993年を参照のこと)。
結合性の連結鎖によって連結された2つのscFv分子を含むタンパク質を提供する。か
かる二量体scFvの例としては、例えば、ロイシンジッパードメイン(例えば、Fos
又はJunに由来する)に連結された2つのscFvであって、それによりロイシンジッ
パードメインが会合して二量体化合物を形成するものが挙げられる(例えば、Koste
lny 1992年又はKruif及びLogtenberg、1996年を参照のこと
)。或いは、例えば米国特許出願公開第20060263367号明細書に記載されると
おり、2つのscFvは、双方のscFvの形成及び抗原との結合を可能にするのに十分
な長さのペプチドリンカーによって連結される。さらなる例において、例えばAlbre
chtら(2004年)に記載されるとおり、各scFvがシステイン残基を例えばリン
カー領域に、又は末端に含むように修飾され、それらのscFvがジスルフィド結合によ
って連結される。
記載されるとおりの、例えばグリコシル化が可能であるように修飾されたリンカーを含む
scFvも企図する。
び/又はVLを含むその修飾された形態を作製することが容易に可能であろう。VH及び
/又はVLの例示的配列が本明細書に記載され、それらは本発明のこの実施形態に準用さ
れるものと解釈されるべきである。
される。
当業者は、ミニボディが、免疫グロブリンのCH2及び/又はCH3ドメインに融合し
た免疫グロブリンのVH及びVLドメインを含むことを認識するであろう。場合により、
ミニボディはVHとVLとの間にヒンジ領域を含み、時にこのコンホメーションはフレッ
クスミニボディ(Flex Minibody)(Huら、1996年)と称される。ミ
ニボディはCH1又はCLを含まない。好ましくは、VH及びVLドメインは免疫グロブ
リンのヒンジ領域とCH3ドメインとに融合する。領域の各々は、同じ免疫グロブリンに
由来してもよい。或いは、VH及びVLドメインが一つの免疫グロブリンに由来し、ヒン
ジ及びCH2/CH3が別の免疫グロブリンに由来する可能性があり、又はさらにヒンジ
とCH2/CH3とが異なる免疫グロブリンに由来する可能性がある。本発明はまた、一
つの免疫グロブリン由来のVH及びVLと、別の免疫グロブリン由来のVH及びVLとを
含む多重特異性ミニボディも企図する。前記ミニボディの可変領域の少なくとも1つは、
本明細書に記載されるとおりFR1にシステイン残基を含む。
いることにより、本発明のミニボディを作製することが容易に可能であろう。
能にするCH3ドメイン(又はCH2ドメイン)と、ジスルフィド結合による二量体化に
適応する免疫グロブリンヒンジとを保持する単一のタンパク質鎖においてコードされる全
免疫グロブリンの小型版であることを理解するであろう。
ットに記載されている。
米国特許第5,731,168号明細書は、組換え細胞培養物から回収され、それによ
り二重特異性タンパク質を生じるヘテロ二量体の割合が最大化されるように、一対のFv
間の接合部分が操作された分子について記載している。好ましい接合部分は、CH3ドメ
インの少なくとも一部を含む。この方法では、第1のタンパク質の接合部分の1つ又は複
数の小さいアミノ酸側鎖がより大きい側鎖{例えば、チロシン又はトリプトファン)に置
き換えられる。第2のタンパク質の接合部分に対しては、大きいアミノ酸側鎖がより小さ
い側鎖(例えば、アラニン又はスレオニン)に置き換えられることにより、1つ又は複数
の大きい側鎖と同じ又は類似したサイズの補償的な「キャビティ」が設けられる。
タンパク質を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中のタンパク質の一方をアビジンとカ
ップリングし、他方をビオチンとカップリングすることができる。かかるタンパク質は、
例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化するために提案されている(米国特許第
4,676,980号明細書)。可変領域を含むヘテロコンジュゲートタンパク質は、任
意の好都合な架橋方法を用いて作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野において公知
であり、数多くの架橋技法と共に、米国特許第4,676,980号明細書に記載されて
いる。
る。Brennan(1985年)は、インタクトな抗体をタンパク質分解により切断し
てF(ab’)2断片を生成する手順を記載する。これらの断片をジチオール錯生成剤の
亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元すると、隣接ジチオールが安定化し、分子間ジスルフィ
ドの形成が抑制される。次に生成されたFab’断片がチオニトロ安息香酸(TNB)誘
導体に変換される。次にFab’−TNB誘導体の一つをメルカプトエチルアミンで還元
することによりFab’−チオールに再度変換し、等モル量の他のFab’−TNB誘導
体と混合することで、二重特異性タンパク質が形成される。
り、これを化学的にカップリングして、可変領域を含む二重特異性タンパク質を形成する
ことができる。Shalaby(1992年)は、完全ヒト化二重特異性F(ab’)2
分子の作製について記載している。各Fab’断片を大腸菌(E.coli)から別個に
分泌させ、インビトロで特異的な化学カップリングに供することにより、可変領域を含む
二重特異性タンパク質を形成した。このように形成された二重特異性タンパク質は、関連
抗原を発現する細胞及び正常ヒトT細胞に結合することが可能であったとともに、ヒト乳
房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を惹起する。
の融合物(例えば、米国特許第6248516号明細書に記載されるとおり)、単鎖Fa
b(例えば、Hustら、2007年)又はFab3(例えば、欧州特許第199303
02894号明細書に記載されるとおり)が挙げられる。
本発明は、可変領域と定常領域(例えばFc)又はそのドメイン、例えばCH2及び/
又はCH3ドメインとを含むタンパク質を包含する。例えば、本発明は、ミニボディ(上
記に考察されるとおり)又はscFv−Fc融合物又はダイアボディ−Fc融合物又はト
リアボディ−Fc融合物又はテトラボディ−Fc融合物又はscFc−CH2融合物又は
ダイアボディ−CH2融合物又はトリアボディ−CH2融合物又はテトラボディ−CH2
融合物又はscFv−CH3融合物又はダイアボディ−CH3融合物又はトリアボディ−
CH3融合物又はテトラボディ−CH3融合物を提供する。これらのタンパク質のいずれ
も、可変領域と定常領域又は定常ドメインとの間にリンカー、好ましくは免疫グロブリン
ヒンジ領域を含み得る。
につなぎ合わせる重鎖分子の一部分を含む。このヒンジ領域は約25残基を含み、及び柔
軟性を有するため、2つのN末端抗原結合領域が独立して動くことが可能となる。ヒンジ
領域は、3つの異なるドメイン、すなわち上部、中央、及び下部ヒンジドメインにさらに
分けることができる(Rouxら 1998年)。
番方式による約231〜340位に延在する重鎖免疫グロブリン分子の一部分を含む。概
してインタクトな天然IgG分子の2つCH2ドメインの間には、2つのN連結分枝状炭
水化物鎖が間置される。一実施形態において、本発明のタンパク質は、IgG1分子(例
えばヒトIgG1分子)に由来するCH2ドメインを含む。別の実施形態において、本発
明のタンパク質は、IgG4分子(例えば、ヒトIgG4分子)に由来するCH2ドメイ
ンを含む。
約110残基、例えば約341〜446b位(Kabat EU付番方式)に延在する重
鎖免疫グロブリン分子の一部分を含む。CH3ドメインは、典型的には免疫グロブリンの
C末端部分を形成する。しかしながら、いくつかの免疫グロブリンでは、さらなるドメイ
ンがCH3ドメインから延在して分子のC末端部分を形成し得る(例えば、IgMのμ鎖
及びIgEのe鎖におけるCH4ドメイン)。一実施形態において、本発明のタンパク質
は、IgG1分子(例えば、ヒトIgG1分子)に由来するCH3ドメインを含む。別の
実施形態において、本発明のタンパク質は、IgG4分子(例えば、ヒトIgG4分子)
に由来するCH3ドメインを含む。
られ得る。好ましい実施形態において、タンパク質の定常領域ドメイン又はその一部分は
ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、定常領域ドメイン又はその一部分は、例
えば、げっ歯類種(例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット)又は非ヒト霊長類種(
例えばチンパンジー、マカク)を含めた別の哺乳類種の免疫グロブリンに由来してもよい
ことが理解される。さらに、定常領域ドメイン又はその一部分は、IgM、IgG、Ig
D、IgA及びIgEを含めた任意の免疫グロブリンクラス、及びIgG1、IgG2、
IgG3及びIgG4を含めた任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来してもよい。好
ましい例において、ヒトアイソタイプIgG1が使用される。
な寄託物の形態で利用可能であり、又はその配列を公的に利用可能なデータベースから入
手することができる。特定のエフェクター機能を有する(若しくは特定のエフェクター機
能を欠く)、又は特定の修飾を備えて免疫原性を低減する定常領域ドメインを選択するこ
とができる。
又は細胞を結合し、且つ様々な生物学的作用を媒介するFc領域又はその一部分(例えば
CH2ドメイン)の機能上の能力を指す。エフェクター機能は抗原依存性であっても、又
は抗原非依存性であってもよい。「抗原依存性エフェクター機能」は、免疫グロブリンの
対応する抗原との結合後に通常誘導されるエフェクター機能を指す。典型的な抗原依存性
エフェクター機能としては、補体タンパク質(例えばC1q)を結合する能力が挙げられ
る。例えば、補体のC1成分のFc領域との結合は古典的補体系を活性化し、補体依存性
細胞傷害(CDCC)と称される過程である細胞病原体のオプソニン化及び溶解をもたら
すことができる。補体の活性化はまた炎症反応も刺激し、また自己免疫性の過敏症にも関
与し得る。他の抗原依存性エフェクター機能はまた、免疫グロブリンの、そのFc領域を
介した、細胞上の特定のFc受容体(「FcR」)との結合により媒介される。種々のク
ラスの免疫グロブリンに特異的なFc受容体が、IgG(γ受容体、又はIgλR)、I
gE(ε受容体、又はIgεR)、IgA(α受容体、又はIgαR)及びIgM(μ受
容体、又はIgμRs)を含め、数多くある。細胞表面上のFc受容体に対する免疫グロ
ブリンの結合は、免疫複合体のエンドサイトーシス、免疫グロブリンで被覆された粒子又
は微生物の貪食及び破壊(抗体依存性食作用、又はADCPとも称される)、免疫複合体
のクリアランス、キラー細胞による抗体で被覆された標的細胞の溶解(抗体依存性細胞媒
介性細胞傷害、又はADCCと称される)、炎症性メディエーターの放出、免疫系細胞活
性化の調節、胎盤通過及び免疫グロブリン産生の制御を含めた、数多くの重要且つ多様な
生物学的反応を引き起こす。
抗原を結合しているかどうかに関わらず、免疫グロブリンにより誘導され得るエフェクタ
ー機能を指す。典型的な抗原非依存性エフェクター機能としては、細胞輸送、免疫グロブ
リンの循環半減期及びクリアランス速度、及び精製の促進が挙げられる。サルベージ受容
体としても知られる構造的に固有のFc受容体の「新生児Fc受容体」又は「FcRn」
が、半減期及び細胞輸送の制御に重要な役割を果たす。微生物細胞(例えばブドウ球菌プ
ロテインA又はG)から精製された他のFc受容体は、Fc領域との高アフィニティでの
結合能を有し、Fc含有タンパク質の精製の促進に使用することができる。
選択されるプライマーを使用して、クローニングすることができる。免疫グロブリン配列
のクローニングは、例えば米国特許第5,658,570号明細書に記載される。
ブリン分子に由来してもよい。例えば、タンパク質は、IgG1分子に由来するCH2ド
メイン又はその一部分と、IgG3分子に由来するCH3領域又はその一部分とを含み得
る。
Fcの少なくともある領域を含む。例えば、FcRnに結合するFc領域の一部分は、K
abat付番によるIgG1のアミノ酸約282〜438を含む。
全に欠失させた改変合成定常領域(「ドメイン欠失定常領域」)を含む。本発明はまた、
エフェクター機能が改変された、例えば向上した、又は低減した修飾Fc領域又はその一
部も包含する。多くのかかる修飾Fc領域が当該技術分野において公知であり、例えば、
米国特許第7217797号明細書;米国特許第7217798号明細書;又は米国特許
出願公開第20090041770号明細書(半減期の向上)又は米国特許出願公開第2
005037000号明細書(ADCCの増加)に記載される。
本発明は、本発明のタンパク質の変異型の使用を企図する。例えば、かかる変異ポリペ
プチドは、本明細書に示される配列と比較して1つ又は複数の保存的アミノ酸置換を含む
。いくつかの例では、ポリペプチドは10個以下、例えば、9個又は8個又は7個又は6
個又は5個又は4個又は3個又は2個の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置
換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖及び/又はヒドロパシー性(hydropathi
city)及び/又は親水性を有するアミノ酸残基に置き換わる置換である。
1個又は2個又は3個又は4個のみの、又はそれ以下の保存的アミノ酸変化を有する。保
存的アミノ酸変化の詳細は以下に提供される。当業者は認識しているであろうとおり、か
かる小さい変化は、組換え細胞中で発現させたときポリペプチドの活性を変化させること
がないと合理的に予想することができる。
、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタ
ミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプト
ファン)、β−分枝状側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側
鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる
。
する。いくつかの例において、ポリペプチドは10個以下、例えば、9個又は8個又は7
個又は6個又は5個又は4個又は3個又は2個の挿入及び/又は欠失を含む。
本発明は、本明細書において任意の実施形態又は例に記載されるとおりのFR1内の任
意の部位におけるシステイン残基の位置を企図する。
のシステイン残基を含む免疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって、
システイン残基が、化合物との残基の少なくとも1つのコンジュゲーションが可能である
ように位置し、及びシステイン残基の少なくとも1つが化合物とコンジュゲートしない場
合、システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパク質を提供する。
つのシステイン残基を含む免疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって
、システイン残基が、化合物との残基の少なくとも1つのコンジュゲーションが可能であ
るように位置し、及びシステイン残基の少なくとも2つが化合物とコンジュゲートしない
場合、システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパク質を提供する。
疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)とを含む単離されたタンパク質であって、可変領域の
少なくとも1つがフレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステイ
ン残基を含み、システイン残基が、化合物との残基の少なくとも1つのコンジュゲーショ
ンが可能であるように位置し、及びシステイン残基の少なくとも1つが別の化合物とコン
ジュゲートしない場合、システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパ
ク質を提供する。
疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)とを含む単離されたタンパク質であって、可変領域の
少なくとも1つがフレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステイ
ン残基を含み、システイン残基が、化合物との残基の少なくとも1つのコンジュゲーショ
ンが可能であるように位置し、及びシステイン残基の少なくとも2つが別の化合物とコン
ジュゲートしない場合、システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパ
ク質を提供する。
テイン残基は、化合物とのコンジュゲーションが可能であるように位置することが好まし
い。
で使用されるとき、用語「FR1のループ領域」は、FR1の2つの領域及び/又は2つ
のアミノ酸が互いに会合又は結合(例えば、水素結合により)する柔軟性を提供する、例
えば、βシート状の2つのアミノ酸が互いに会合又は結合するのに十分な柔軟性を提供す
るFR1内のアミノ酸の配列を意味するものと解釈されなければならない。FR1のルー
プ領域はCDR1の一部ではない。
成を可能にするように位置する。
システイン残基が、タンパク質が折り畳まれたときに残基間にジスルフィド結合が形成さ
れるのに十分に近接するように位置することを意味するものと理解されなければならない
。例えば、2つのシステイン残基における2つの炭素原子間の距離は、互いの約6〜7Å
又は互いの2〜9Å、例えば互いの約3.5〜6.8Å、例えば、互いの約4Å以内であ
ってもよい。タンパク質における残基の近接性を予測する方法及び/又はジスルフィド結
合が形成される可能性を予測する方法は、当業者には明らかで、及び/又は本明細書に記
載される。
する少なくとも2つのシステイン残基であって、互いの約2〜9Å以内、好ましくは、互
いの約6〜7Å以内にあるシステイン残基を含む。
れ得る残基に位置する。溶媒露出又は溶媒露出表面積の決定方法は当該技術分野において
公知であり、例えば、Shrake−Rupleyアルゴリズム又はLCPO法が挙げら
れる。
置する少なくとも2つのシステイン残基であって、それらの側鎖(好ましくはそのチオー
ル基)が溶媒に露出されるように位置するシステイン残基を含む。
表面上にあり、従ってタンパク質が存在する、又は懸濁される溶媒と接触可能であること
を意味するものと理解されなければならない。好ましくは、側鎖の少なくとも1つ(又は
一方又は双方)が溶媒に十分に露出し、従ってそこに化合物がコンジュゲートすることが
できる。
しくは全てに位置する少なくとも2つのシステイン残基を含む:
(i)それらの側鎖が互いに向かって傾くように位置する;
(ii)それらの側鎖原子が溶媒に露出されるように位置する;及び/又は
(iii)それらのCα炭素原子が互いの約6〜7Åにあるように位置する。
記載されるとおりの)は、フレームワーク領域1(FR1)内に位置する少なくとも2つ
のシステイン残基であって、FR1内にジスルフィド結合を形成することができ、或いは
化合物の化学量論的コンジュゲーションのために還元することができるシステイン残基を
提供する。本発明のこれらの生成物は、FR1内にジスルフィド結合を形成することので
きるフレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステイン残基を提供
しない他のシステインコンジュゲーション戦略と比べて利点を有する。これらの先行する
非効率な戦略としては、単一のシステイン残基(Kimら、2008年)、C末端システ
イン残基(Sirkら、2008年)及びインタクトな抗体における単一のシステイン残
基(Junutulaら、2008年)が挙げられ、そのいずれもが、低い発現収率、ば
らつきのあるコンジュゲーション及び大規模処理に伴う複雑さをもたらす。さらに、鎖間
ジスルフィド結合の部分的な還元によりシステイン残基にコンジュゲートされた抗体は化
学量論にばらつきがあり(抗体当たり0個から8個に至る薬物)、及び潜在的に100種
超が生じる(Junutulaら、2008年)。
明らかで、インシリコ法が挙げられる。例えば、タンパク質の構造的特徴は、X線結晶構
造解析及び/又はNMR分光法を用いて決定される三次元生体分子構造を含め、例えばN
CBI Molecules Modelling Database(MMDB)によ
るなどの、National Institutes of Health、8600
Rockville Pike,Bethesda MD 20894のNationa
l Center for Biotechnology Information(N
CBI)のウェブサイトで利用可能な適切なソフトウェアを使用して決定される。NCB
I保存ドメインデータベース(CDD)は既知のSmart及びPhamコレクションか
らのドメインを含み、3D構造ビューアー(Cn3D)へのリンクを有する。NCBI保
存ドメイン構造検索ツール(Conserved Domain Architectu
re Retrieval Tool:CDART)は、隣接タンパク質に対してそのド
メイン構造により事前に計算されたドメイン割り当てを使用する。
り、及び/又は、例えば、Moult、1996年;Chouら、1974年;Chou
ら、1974年;Chouら、1978年;Chouら、1978年;又はChouら、
1979年に記載されている。
が現在利用可能である。一つのかかる二次構造予測方法は、ホモロジーモデリングに基づ
く。例えば、30%より高い配列同一性、又は40%より高い類似性を有する2つのタン
パク質は、多くの場合に同様の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース(
PDB)の最近の拡大により、タンパク質の構造内にある潜在的な折り畳みの数を含め、
二次構造の予測性の向上がもたらされている(Holmら、1999年)。例えば、タン
パク質の構造の決定方法は、例えば米国特許出願公開第20020150906号明細書
に記載され、又はコンピュータプログラム若しくはアルゴリズム、例えば、MODELL
ERを使用することである(Sali及びBlundell、1993年)。これらの技
法は、そのタンパク質の配列を、特徴付けられた構造を有するタンパク質の配列とアライ
ンメントすることによる。かかるアラインメントアルゴリズムは当該技術分野において公
知であり、例えばNCBIのBLASTなどのソフトウェアパッケージを通じて利用可能
である。次に、既に特徴付けられているタンパク質又はペプチドにおけるアラインメント
された配列又は部分配列に対応する構造情報に基づき、問い合わせるタンパク質の構造情
報、すなわち三次元構造が予測される。このようにして、免疫グロブリンのFR1領域に
対応するタンパク質の三次元構造のライブラリを作成することが可能である。
996年)、「プロファイル解析」(Bowieら、1991年;Gribskovら、
1990年;Gribskovら、1989年)、及び「進化リンケージ(evolut
ionary linkage)」が挙げられる。従来のタンパク質配列スレッディング
は、タンパク質の3D構造スキャフォールドの予測に使用される。典型的には、スレッデ
ィングは、タンパク質の折り畳みを、その配列並びに二次構造及び溶媒露出などのローカ
ルパラメータを組み込むスコアリング関数を用いることにより、候補構造鋳型(例えば、
Fv又はFab又はFR1の既知の構造)のライブラリに対してその配列をスレッディン
グ(又は比較)することにより割り当てる方法である(Rostら 1997年;Xu及
びXu 2000年;及びPanchenkoら 2000年)。例えば、スレッディン
グ法は、問い合わせ配列の各残基についてのアミノ酸配列の二次構造及び溶媒露出度を予
測することから始まる。得られた予測構造の一次元(1D)プロファイルが、既知の3D
構造のライブラリの各メンバーにスレッディングされる。各配列−構造対について、動的
計画法を用いて最適なスレッディングが得られる。総合的に最良の配列−構造対が、その
問い合わせ配列についての予測3D構造となる。二次構造が解かれた免疫グロブリンのF
v及びFab断片の数に起因して、ここでの場合にスレッディングは比較的単純となる。
teine resides)が含まれ、例えば4個又は6個又は8個又は10個のシス
テイン残基が含まれることが好ましい。例えばシステイン残基は対になり、すなわち2個
の残基の組み合わせが、それらの間にジスルフィド結合が形成され得るように並べられる
。
び/又は非還元条件下で別のシステイン残基又は化合物に連結しないシステイン残基を含
まない。
突然変異誘発
可変領域を含むタンパク質をコードするDNAは、当該技術分野の標準的方法を用いて
単離される。例えば、目的の領域に隣接する可変領域内の保存領域にアニールするプライ
マーが設計され、次にそれらのプライマーを用いて介在核酸が、例えばPCRによって増
幅される。好適な方法及び/又はプライマーは当該技術分野において公知であり、及び/
又は例えばBorrebaeck(編)、1995年及び/又はFroyenら、199
5年に記載される。かかる増幅方法に好適な鋳型DNA源は、例えば、例えば本明細書に
記載されるとおりの可変領域を含むタンパク質を発現するハイブリドーマ、トランスフェ
クトーマ及び/又は細胞に由来する。
知の様々な方法のいずれかにより修飾される。そのような方法としては、限定はされない
が、タンパク質をコードする予め調製済みのDNAの部位特異的(又はオリゴヌクレオチ
ド媒介性)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製が
挙げられる。組換えタンパク質の変異型はまた、制限酵素断片操作又は合成オリゴヌクレ
オチドとのオーバーラップ伸長PCRにより構築されてもよい。変異原性プライマーは1
つ又は複数のシステインコドン置換をコードし、例えばシステインをコードするコドン(
すなわち、TGT又はTGC)を構成する残基を含む。標準的な突然変異誘発技法を用い
てかかる変異DNAをコードするDNAを生成することができる。一般的な手引きは、S
ambrookら 1989年;及び/又はAusubelら 1993年に見ることが
できる。
法である。この技法は当該技術分野において公知である(例えば、Carterら 19
85年;Hoら 1989年;及びKunkel 1987年を参照のこと)。簡潔には
、DNAの部位特異的突然変異誘発の実施では、初めに出発DNAを、所望の変異(例え
ば、システインをコードする1つ又は複数のコドンの挿入)をコードするオリゴヌクレオ
チドをかかる出発DNAの一本鎖とハイブリダイズすることにより変化させる。ハイブリ
ダイゼーション後、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
且つ出発DNAの一本鎖を鋳型として用いて、DNAポリメラーゼを使用して第2の鎖全
体を合成する。このように、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが、得られた二
本鎖DNAに組み込まれる。発現プラスミドにおいて変異が誘発されるタンパク質を発現
する遺伝子内で部位特異的突然変異誘発を実施してもよく、得られたプラスミドを配列決
定し、所望のシステイン置換変異の組込みを確認してもよい。部位特異的プロトコル及び
フォーマットには、市販のキット、例えばQuikChange(登録商標)多部位特異
的突然変異誘発キット(Stratagene、La Jolla,CA)が含まれる。
。Higuchi、1990年;Itoら 1991年;Bernhardら 1994
年;及びValletteら 1989年を参照のこと。簡潔には、少量の鋳型DNAを
PCRにおける出発物質として使用するとき、鋳型DNAの対応する領域と配列が僅かに
異なるプライマーを用いて、プライマーが鋳型と異なる位置においてのみ鋳型配列と異な
る特定のDNA断片を比較的多量に生成することができる。
記載される技法に基づく。出発物質は、変異させる出発タンパク質DNAを含むプラスミ
ド(又は他のベクター)である。変異させる出発DNA中の1つ又は複数のコドンが同定
される。同定された1つ又は複数の変異部位の両側に固有の制限エンドヌクレアーゼ部位
がなければならない。かかる制限部位が存在しない場合、制限部位を上述のオリゴヌクレ
オチド媒介性突然変異誘発法を用いて出発DNAにおける適切な位置に導入することで生
成してもよい。それらの部位でプラスミドDNAを切断し、直鎖化する。制限部位間のD
NAの配列をコードするが、但し所望の1つ又は複数の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオ
チドが、標準的手順を用いて合成され、ここでオリゴヌクレオチドの2本の鎖は別個に合
成され、次に標準的技術を用いて共にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオ
チドはカセットと称される。このカセットは、直鎖化されたプラスミドの末端と適合する
5’及び3’末端を有するように設計され、従ってこれはプラスミドに直接ライゲートす
ることができる。以上でこのプラスミドは変異DNA配列を含む。コードされたシステイ
ン置換を含む変異DNAは、DNA配列決定により確認することができる。
として用いるオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によっても生成される(Sambr
ook及びRussel、2001年;Zollerら 1983年;Zoller及び
Smith、1982年)。
組換えタンパク質の場合、それをコードする核酸が好ましくは発現ベクター内に置かれ
、次に発現ベクターが、本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、好ましく
はジスルフィド架橋又は結合を生じることのできる細胞、例えば、大腸菌(E.coli
)細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞、例えば、サルCOS細胞、チャイニー
ズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞にトランスフェクトされることで、組
換え宿主細胞においてタンパク質の合成が達成される。免疫グロブリンをコードするDN
Aの細菌における組換え発現に関するレビュー論文としては、Skerraら、(199
3年)及びPlueckthun、(1992年)が挙げられる。これらの目的を達成す
る分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、例えばAusubel又は
Sambrookに記載される。多岐にわたるクローニング及びインビトロ増幅方法が組
換え核酸の構築に好適である。組換え免疫グロブリンの作製方法もまた、当該技術分野に
おいて公知である。米国特許第4,816,567号明細書;米国特許第5225539
号明細書、米国特許第6054297号明細書、米国特許第7566771号明細書又は
米国特許第5585089号明細書を参照のこと。
DNAの増幅)のため、又は無細胞系若しくは細胞中での発現のため、発現コンストラク
ト又は複製可能ベクターに挿入される。好ましくは、核酸はプロモーターに作動可能に連
結される。
であり、TATAボックス又はイニシエーターエレメントを含めた正確な転写開始に必要
なゲノム遺伝子の転写制御配列を含み、例えば発生刺激及び/又は外部刺激に応答して、
又は組織特異的な形で核酸の発現を変化させるさらなる制御エレメント(例えば、上流活
性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー)は含まれても、又は含ま
れなくてもよい。ここでの文脈では、用語「プロモーター」はまた、それが作動可能に連
結される核酸の発現をもたらし、活性化し、又は亢進させる、組換え、合成若しくは融合
核酸、又は誘導体を記載するためにも用いられる。好ましいプロモーターは、発現をさら
に亢進させ、及び/又は前記核酸の空間的な発現及び/又は時間的な発現を変化させる1
つ又は複数の特定の制御エレメントのさらなるコピーを含み得る。
モーターが、そのプロモーターにより核酸の発現が制御されるような位置に置かれること
を意味する。
る核酸が、好適なプロモーター、例えばT7プロモーターに作動可能に連結され、得られ
た発現コンストラクトが転写及び翻訳に十分な条件に曝露される。インビトロ発現又は無
細胞発現に典型的な発現ベクターについては記載がなされており、限定はされないが、T
NT T7系及びTNT T3系(Promega)、pEXP1−DESTベクター及
びpEXP2−DESTベクター(Invitrogen)が挙げられる。
限定はされないが、以下の1つ又は複数が挙げられる:シグナル配列、本発明のタンパク
質をコードする配列(例えば、本明細書に提供される情報から得られる)、エンハンサー
エレメント、プロモーター、及び転写終結配列。当業者は、タンパク質の発現に好適な配
列を認識しているであろう。例えば、例示的シグナル配列としては、原核生物分泌シグナ
ル(例えば、pelB、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、又は耐熱性
エンテロトキシンII)、酵母分泌シグナル(例えば、インベルターゼリーダー、α因子
リーダー、又は酸性ホスファターゼリーダー)又は哺乳動物分泌シグナル(例えば、単純
ヘルペスgDシグナル)が挙げられる。
ロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ
、トリプトファン(trp)プロモーター系、及びtacプロモーターなどのハイブリッ
ドプロモーター)が挙げられる。これらのプロモーターは、グラム陰性又はグラム陽性微
生物などの真正細菌、例えば、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、
例えば、エシェリキア属(Escherichia)、例えば大腸菌(E.coli)、
エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)
、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモ
ネラ属(Salmonella)、例えばサルモネラ・チフィムリウム(Salmone
lla typhimurium)、セラチア属(Serratia)、例えばセラチア
・マルセッセンス(Serratia marcescans)、及び赤痢菌属(Shi
gella)、並びにB.スブチリス(B.subtilis)及びB.リケニフォルミ
ス(B.licheniformis)などのバチルス属(Bacilli)、P.エル
ギノーサ(P.aeruginosa)などのシュードモナス属(Pseudomona
s)、及びストレプトマイセス属(Streptomyces)を含めた、原核生物での
発現に有用である。好ましくは、宿主は大腸菌(E.coli)である。一つの好ましい
大腸菌(E.coli)クローニング宿主は大腸菌(E.coli)294(ATCC
31,446)であるが、大腸菌(E.coli)B、大腸菌(E.coli)X 17
76(ATCC 31,537)、及び大腸菌(E.coli)W3110(ATCC
27,325)、DH5α又はDH10Bなどの他の株も好適である。
初期プロモーター(CMV−IE)、ヒト伸長因子1−αプロモーター(EF1)、核内
低分子RNAプロモーター(U1a及びU1b)、α−ミオシン重鎖プロモーター、シミ
アンウイルス40プロモーター(SV40)、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(RSV
)、アデノウイルス主要後期プロモーター、β−アクチンプロモーター;CMVエンハン
サー/β−アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター又はその活性断片を含
むハイブリッド制御エレメントが挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、SV4
0により形質転換されたサル腎臓CV1系統(COS−7、ATCC CRL 1651
);ヒト胎児由来腎臓系統(293細胞又は懸濁培養で成長させるためサブクローニング
した293細胞;ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10);又は
チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)である。
ロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びS.
ポンベ(S.pombe)を含む群から選択される酵母細胞中での発現に好適な典型的な
プロモーターとしては、限定はされないが、ADH1プロモーター、GAL1プロモータ
ー、GAL4プロモーター、CUP1プロモーター、PHO5プロモーター、nmtプロ
モーター、RPR1プロモーター、又はTEF1プロモーターが挙げられる。
EI2プロモーター、ボンビックス・ムリ(Bombyx muri)から単離された昆
虫アクチンプロモーター、ドロソフィラ・エスピー(Drosophila sp.)d
shプロモーター(Marshら 2000年)及び誘導性メタロチオネインプロモータ
ーが挙げられる。組換えタンパク質の発現に好ましい昆虫細胞としては、BT1−TN−
5B1−4細胞、及びスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugi
perda)細胞(例えば、sf19細胞、sf21細胞)を含む群から選択される昆虫
細胞が挙げられる。核酸断片の発現に好適な昆虫としては、限定はされないが、ドロソフ
ィラ・エスピー(Drosophila sp.)が挙げられる。S.フルギペルダ(S
.frugiperda)の使用もまた企図される。
業者に公知である。所与の細胞に用いられる技法は、成功を収めている公知の技法に依存
する。組換えDNAの細胞への導入手段としては、とりわけ、マイクロインジェクション
、DEAE−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクタミン(lipof
ectamine)(Gibco、MD,米国)及び/又はセルフェクチン(cellf
ectin)(Gibco、MD,米国)の使用によるなどのリポソーム媒介性トランス
フェクション、PEG媒介性DNA取り込み、電気穿孔及びDNAがコーティングされた
タングステン又は金粒子の使用によるなどの微粒子銃(Agracetus Inc.、
WI,米国)が挙げられる。
培地で培養され得る。Ham Fl0(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(S
igma)、RPMl−1640(Sigma)、及びダルベッコ変法イーグル培地((
DMEM)、Sigma)などの市販の培地が、哺乳動物細胞の培養に好適である。本明
細書で考察される他の細胞型の培養用培地は、当該技術分野において公知である。
本発明のタンパク質は、好ましくは単離される。「単離される」とは、タンパク質が実
質的に精製され、又はその天然に存在する環境から取り出されて、例えば異種環境中にあ
ることを意味する。「実質的に精製される」とは、タンパク質が夾雑物質を実質的に含ま
ない、例えば、夾雑物質を少なくとも約70%又は75%又は80%又は85%又は90
%又は95%又は96%又は97%又は98%又は99%含まないことを意味する。
書に記載される。
で産生するか、又は培地中に直接分泌させることができる。タンパク質が細胞内産生され
る場合、第一段階として、粒子状残屑が、宿主細胞又は溶解断片のいずれも、例えば遠心
又は限外ろ過により取り除かれる。Carterら(1992年)は、大腸菌(E.co
li)の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順について記載している。簡潔には
、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、及びフッ化フェニルメチルスルホニル(P
MSF)の存在下で細胞ペーストを約30分間解凍する。遠心により細胞残屑を取り除く
ことができる。タンパク質が培地中に分泌される場合、概して初めにかかる発現系からの
上清が、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばAmicon又はMillipore
Pellicon限外ろ過ユニットを使用して濃縮される。タンパク質分解を抑制するた
め、PMSFなどのプロテアーゼ阻害薬を前述のステップのいずれかに含めてもよく、及
び外来性の夾雑物の増加を防ぐため、抗生物質を含めてもよい。
ー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製すること
ができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技法である。アフィニティリ
ガンドとしてのプロテインAの適合性は、タンパク質中に存在する任意の免疫グロブリン
Fcドメイン(仮に存在する場合)の種及びアイソタイプに依存する。プロテインAを使
用して、ヒトγ1、γ2、又はγ4重鎖に基づく免疫グロブリンを精製することができる
(Lindmarkら 1983年)。プロテインGは、あらゆるマウスアイソタイプ及
びヒトγ3に推奨される(Gussら 1986年)。他の場合には、本発明のタンパク
質における可変領域が結合する、又はそれを生じさせた抗原又はエピトープ決定基を使用
してアフィニティ精製を実施することができる。アフィニティリガンドが結び付くマトリ
ックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。コ
ントロールド・ポア・グラス(controlled pore glass)又はポリ
(スチレンジビニル)ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで実現
できるものと比べてより高い流量及びより短い処理時間が可能である。回収されるタンパ
ク質に応じて、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでの
クロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE(商標)でのクロマトグラフィー、陰
イオン又は陽イオン交換樹脂(ポリアスパラギン酸カラムなど)でのクロマトグラフィー
、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタ
ンパク質精製技法もまた利用可能である。
ヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、又はインフルエンザウイルス赤血球凝
集素(HA)タグ、又はシミアンウイルス5(V5)タグ、又はFLAGタグ、又はグル
タチオンS−トランスフェラーゼ(GST)タグを含むように修飾され得ることも認識す
るであろう。好ましくは、タグはヘキサ−hisタグである。得られるタンパク質は、次
にアフィニティ精製などの当該技術分野において公知の方法を用いて精製される。例えば
、ヘキサ−hisタグを含むタンパク質の精製は、タンパク質を含む試料を、固体又は半
固体担体上に固定化されたヘキサ−hisタグを特異的に結合するニッケル−ニトリロ三
酢酸(Ni−NTA)と接触させ、試料を洗浄して未結合のタンパク質を除去し、続いて
結合したタンパク質を溶離させることにより行われる。それに代えて又は加えて、アフィ
ニティ精製法ではタグに結合するリガンド又は抗体が用いられる。
む混合物は、低pH疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
本発明のタンパク質は、その決定されたアミノ酸配列から標準的な技術を用いて、例え
ば、BOC又はFMOC化学を用いて容易に合成される。合成ペプチドは、固相、液相、
又はペプチド縮合の公知の技法、又はそれらの任意の組み合わせを用いて調製され、及び
天然及び/又は非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸
は、Merrifield、1963年の当初の固相手順の脱保護、中和、カップリング
及び洗浄プロトコルを伴う標準的なBoc(Nα−アミノ保護Nα−t−ブチルオキシカ
ルボニル)アミノ酸樹脂、又はCarpino及びHan、1972年により記載される
塩基不安定Nα−アミノ保護9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)アミノ酸
であり得る。Fmoc及びBocの双方のNα−アミノ保護アミノ酸とも、例えば、Fl
uka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambr
idge Research Biochemical、Bachem、又はPenin
sula Labsなどの様々な商業的供給元から入手することができる。
本発明はまた、本明細書において任意の実施形態により記載されるタンパク質のコンジ
ュゲートも提供する。タンパク質をコンジュゲートすることのできる化合物の例は、放射
性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、
対象におけるタンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から
選択される化合物である。例示的治療剤としては、限定はされないが、抗血管形成剤、新
血管新生及び/又は他の血管新生の阻害剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、化学療法剤
又は治療用核酸が挙げられる。
れる。当該技術分野において公知のそれらの薬物クラス、及びその作用機序についての説
明は、Goodmanら、「Goodman and Gilman’s The Ph
armacological Basis of Therapeutics」、第8版
、Macmillan Publishing Co.、1990年を参照のこと。免疫
グロブリン−免疫毒素コンジュゲートの調製に関するさらなる技法が、例えばVitet
ta(1993年)及び米国特許第5,194,594号明細書に提供される。例示的毒
素としては、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、外毒素A鎖(シュ
ードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)由来)、
リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、αサルシン、アリューリテス・フォルディイ
(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タ
ンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タン
パク質(PAPI、PAPII、及びPAP−S)、モモルディカ・カランティア(mo
mordica charantia)阻害薬、クルシン、クロチン、サパオナリア・オ
フィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害薬、ゲロニン、ミ
トゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン
及びトリコテセン(tricothecene)が挙げられる。例えば、国際公開第93
/21232号パンフレットを参照のこと。
トカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシ
ド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチ
ン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサント
ロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デ−ヒドロテストステロン、グルココ
ルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロ
マイシン、代謝拮抗薬(メトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、
シタラビン、フルダラビン、5−フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシウレア、
アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビンなど)、アルキル化剤(メクロレタミン
、チオエパ(thioepa)、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSN
U)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニト
ール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン(DTIC)、プロカルバジン、マイトマイシ
ンC、シスプラチン及びその他の、カルボプラチンなどの白金誘導体など)、抗生物質(
ダクチノマイシン(旧アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ダウノルビシン(旧ダウノ
マイシン)、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキ
サントロン、プリカマイシン、アントラマイシン(AMC)など)が挙げられる。
ゼ阻害薬、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬(マリマスタット、ノバスタット、B
AY 12−9566、AG 3340、BMS−275291及び同様の薬剤など)、
内皮細胞の遊走及び増殖阻害薬(TNP−470、スクアラミン、2−メトキシエストラ
ジオール、コンブレタスタチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ペニシラミン、S
CH66336(Schering−Plough Corp、Madison,NJ)
、R115777(Janssen Pharmaceutica,Inc、Titus
ville,NJ)及び同様の薬剤など)、血管形成成長因子の拮抗薬(ZD6474、
SU6668、血管形成剤に対する抗体及び/又はその受容体(VEGF、bFGF、及
びアンギオポエチン−1など)、サリドマイド、サリドマイド類似体(CC 5013な
ど)、Sugen 5416、SU5402、抗血管形成リボザイム(アンギオザイムな
ど)、インターフェロンα(インターフェロンα2aなど)、スラミン及び同様の薬剤な
ど)、VEGF−Rキナーゼ阻害薬及びその他の抗血管形成チロシンキナーゼ阻害薬(S
U011248など)、内皮特異的インテグリン/生存シグナル伝達の阻害薬(ビタキシ
ン及び同様の薬剤など)、銅アンタゴニスト/キレート剤(テトラチオモリブデート、カ
プトプリル及び同様の薬剤など)、カルボキシアミドトリアゾール(CAI)、ABT−
627、CM101、インターロイキン−12(IL−12)、IM862、PNU14
5156E並びに血管形成を阻害するヌクレオチド分子(アンチセンス−VEGF−cD
NA、アンジオスタチンをコードするcDNA、p53をコードするcDNA及び欠損V
EGF受容体−2をコードするcDNAなど)及び同様の薬剤が挙げられる。血管形成、
新血管新生、及び/又は他の血管新生の阻害薬の他の例は、抗血管形成ヘパリン誘導体及
び関連分子(例えば、ヘペリナーゼIII(heperinase III))、テモゾ
ロミド、NK4、マクロファージ遊走阻害因子(MIF)、シクロオキシゲナーゼ−2阻
害薬、低酸素誘導因子1の阻害薬、抗血管形成大豆イソフラボン、オルチプラズ、フマギ
リン及びその類似体、ソマトスタチン類似体、ペントサンポリサルフェート、テコガラン
ナトリウム、ダルテパリン、タムスタチン、トロンボスポンジン、NM−3、コンブレス
タチン(combrestatin)、カンスタチン、アバスタチン、他の関連標的に対
する抗体(抗α−v/β−3インテグリン及び抗キニノスタチンmAbsなど)及び同様
の薬剤である。
は、例えば本明細書に記載されるとおりの、免疫グロブリン又はそれに由来するタンパク
質などの、本発明の別のタンパク質又は免疫グロブリン可変領域を含むタンパク質を含め
た、別のタンパク質にコンジュゲート又は連結される。他のタンパク質が除外されること
はない。さらなるタンパク質は当業者に明らかで、例えば、とりわけ免疫調節薬又は半減
期を延長するタンパク質若しくはペプチド又は血清アルブミンに結合する他のタンパク質
が挙げられる。
イン」は、ある細胞集団により放出されるタンパク質又はペプチドであって、別の細胞に
対して細胞間メディエーターとして作用するタンパク質又はペプチドの総称である。サイ
トカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、成長因子及び従来のポリペプチドホ
ルモンが挙げられる。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成
長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン;副甲状腺ホルモン、サイロキシ
ン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン
、例えば、卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)及び黄体形成ホ
ルモン(LH)など、肝成長因子;プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子、プロラク
チン、胎盤性ラクトゲン、OBタンパク質、腫瘍壊死因子−α及び−β;ミュラー管抑制
物質、ゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、イン
テグリン、トロンボポエチン(TPO)、NGF−Bなどの神経成長因子、血小板成長因
子、TGF−α及びTGF−βなどの形質転換成長因子(TGF)、インスリン様成長因
子−I又は−II、エリスロポエチン(EPO)、骨誘導因子、インターフェロン−α、
−β、又は−γなどのインターフェロン;コロニー刺激因子(CSF)、例えば、マクロ
ファージ−CSF(M−CSF)、顆粒球マクロファージ−CSF(GM−CSF);及
び顆粒球−CSF(G−CSF)、インターロイキン(IL)、例えば、IL−1、IL
−1α、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、I
L−9、IL−IO5 IL−I1、IL−12;IL−13、IL−14、IL−15
、IL−16、IL−17、IL−18、IL−21及びLIFなどが含まれる。
発現部位に動員する。ケモカインとしては、限定はされないが、RANTES、MCAF
、M1P1−α又はMIP1−βが挙げられる。当業者は、特定のサイトカインが化学走
化作用を有することでも知られ、それらもまた用語ケモカインに分類され得ることを認識
するであろう。
0228364号明細書又は米国特許出願公開第20080260757号明細書に記載
される。
能である。例としては、限定はされないが、13C、15N、2H、125I、123I
、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、111Inなどの、低エネルギー
放射性核種(例えば診断目的に好適)が挙げられる。好ましくは放射性核種は、投与とイ
メージング部位への局在化との間の経過時間後に活性又は検出を可能にするのに好適な半
減期を有する、γ線、光子、又は陽電子放出放射性核種である。本発明はまた、125I
、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、1
66Ho、177Lu、186Re及び188Reなどの高エネルギー放射性核種(例え
ば治療目的としての)も包含する。これらの同位体は、典型的には短い経路長を有する高
エネルギーα粒子又はβ粒子を生じる。かかる放射性核種は、それらが近接する細胞、例
えばコンジュゲートが結合又は侵入した腫瘍性細胞を死滅させる。放射性核種は局在化し
ていない細胞には影響をほとんど又は全く与えず、本質的に非免疫原性である。或いは、
高エネルギー同位体は、例えばホウ素中性子捕捉療法の場合のように、本来安定的な同位
体の熱照射により生成されてもよい(Guanら、1998年)。
ストレプトアビジンなど)にコンジュゲートされ、ここではコンジュゲートが患者に投与
され、続いて未結合のコンジュゲートが除去剤を使用して循環中から除去され、次に治療
剤(例えば、ラジオヌクレオチド)にコンジュゲートした「リガンド」(例えば、アビジ
ン)が投与される。
非タンパク様部分を含むように修飾することができる。好ましくは、タンパク質の誘導体
化に好適な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定
はされないが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、
エチレングリコール/プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デ
キストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラ
ン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ
酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(n
−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコール(propr
opylene glycol)(PPG)ホモポリマー、プロリプロピレンオキシド(
prolypropylene oxide)/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシ
エチレン化ポリオール(例えば、グリセロール;POG)、ポリビニルアルコール、及び
その混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが、水中でのそ
の安定性により、製造において利点を有し得る。
復単位を有するものとして特徴付けられる。
)(PEO)、ポリオキシエチレン(POE)、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチ
ルセルロース、又はデキストランが挙げられ、これらはタンパク質の安定性又はサイズ等
を増加させるため、一般にタンパク質にコンジュゲートされる。
Gの場合、これらのオリゴマー又はポリマーは、例えば、水酸化物イオンのエポキシド環
に対する求核攻撃により惹起されるエチレンオキシドのアニオン開環重合により生成され
る。タンパク質修飾に最も有用な形態のPEGのうちの一つは、モノメトキシPEG(m
PEG)である。
Gが多分散であっても、又は単分散であってもよいことを認識するであろう。多分散PE
Gは、異なる分子量を有するPEGの混合物を含む。多分散PEGの場合、特定の分子量
に対する参照は、その混合物中のPEGの数平均分子量を指すと理解され得る。サイズ分
布はその重量平均分子量(MW)及びその数平均分子量(Mn)により統計的に特徴付け
られ、それらの分子量の比は多分散性指数(Mw/Mn)と称される。MW及びMnは、
特定の態様では質量分析により計測される。PEG−タンパク質コンジュゲートの多く、
特に1KDより大きいPEGにコンジュゲートしたものは、親PEG分子の多分散性に起
因して様々な範囲の分子量を呈する。例えば、mPEG2K(Sunbright ME
−020HS、NOF)の場合、実際の分子質量は1.5〜3.0KDの範囲に分布し、
多分散性指数は1.036である。
含むことを認識するであろう。単分散PEGは、例えばPolypure AS、ノルウ
ェーから市販されている。
得る。例えば、PEGの分子量は約1〜約100kDa、約1.5〜約50kDa、約1
.5〜約10kDa、約1.5kDa〜約5kDa、約1.5kDa〜約kDa、約1.
5〜約2kDaである。
EGは約1.5kDaの分子量を有する。好ましくは、PEGは約2kDaの分子量を有
する。
G24−マレイミドである。
様において、直鎖状(例えばアルコキシPEG又は二官能性PEG)、分枝鎖状又はマル
チアーム状(例えばフォーク型PEG又はポリオールコアに結合したPEG)、樹枝状(
dentritic)であるか、又は分解性連結を含む。さらに、ポリマー分子の内部構
造は種々のパターンのいずれかに組織化され、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダム
コポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、及びブロ
ックトリポリマーからなる群から選択される。
結び付く場合に、ポリマーは同じ分子であっても、又は異なる分子であってもよい。一般
に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、限定はされないが、改良され
るタンパク質の特定の特性又は機能、タンパク質誘導体が限定条件下での治療に使用され
ることになるかどうか等を含む考慮事項に基づき決定することができる。
を有する誘導体を調製することにより、ポリマー(例えば、PEG)を活性化させる必要
があり得ることを認識するであろう。
ーサー部分が含まれる。本発明のスペーサー部分は切断可能であっても、又は切断不可能
であってもよい。例えば、切断可能なスペーサー部分はレドックス切断可能なスペーサー
部分であり、従ってスペーサー部分は、細胞質などの、酸化還元ポテンシャルがより低い
環境中及び遊離スルフヒドリル基を含む分子の濃度がより高い他の領域において切断可能
である。酸化還元ポテンシャルの変化により切断され得るスペーサー部分の例としては、
ジスルフィドを含むものが挙げられ得る。切断刺激は、コンジュゲートタンパク質が細胞
内に取り込まれた時に提供されることができ、そこではより低い酸化還元ポテンシャルの
細胞質がスペーサー部分の切断を促進する。
が標的細胞中に放出される。pHの低下は、エンドソーム輸送、腫瘍増殖、炎症、及び心
筋虚血などの、多くの生理学的及び病理学的過程に関与する。pHは生理学的な7.4か
らエンドソームにおいて5〜6に、又はリソソームにおいて4〜5に降下する。癌細胞の
リソソーム又はエンドソームの標的化に用いられ得る酸感受性スペーサー部分の例として
は、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヒドラゾン、トリチル、cis−アコニチ
ル、又はチオカルバモイルに見られるものなどの、酸切断可能な結合を有するものが挙げ
られる(例えば、米国特許第4,569,789号明細書、同第4,631,190号明
細書、同第5,306,809号明細書、及び同第5,665,358号明細書を参照の
こと)。他の例示的な酸感受性スペーサー部分はジペプチド配列Phe−Lys及びVa
l−Lysを含む。
ば、リソソーム酵素又は腫瘍関連酵素に対して感受性を有し得る。酵素切断することので
きる連結部分の例としては、限定はされないが、ペプチド及びエステルが挙げられる。例
示的な酵素切断可能な連結部分としては、カテプシンB又はプラスミンなどの腫瘍関連プ
ロテアーゼに対して感受性を有するものが挙げられる。カテプシンBにより切断可能な部
位としては、ジペプチド配列バリン−シトルリン及びフェニルアラニン−リジンが挙げら
れる。
システイン(チオール)とのコンジュゲーション
化合物をシステイン残基にコンジュゲートするための様々な方法が当該技術分野におい
て公知であり、当業者には明らかであろう。かかるコンジュゲーション用の試薬は、典型
的には反応性の官能基を有し、それが(i)システインのシステインチオールと直接反応
して標識タンパク質を形成し得るか、(ii)リンカー試薬と反応してリンカー−標識中
間体を形成し得るか、又は(iii)リンカータンパク質と反応して標識タンパク質を形
成し得る。リンカーの場合、有機化学反応、条件、及び試薬を用いるいくつかの経路が当
業者に公知であり、それらとしては(1)本発明のタンパク質のシステイン基をリンカー
試薬と反応させ、それにより共有結合を介したタンパク質−リンカー中間体を形成し、続
いて活性化化合物と反応させること;及び(2)化合物の求核基をリンカー試薬と反応さ
せ、それにより共有結合を介した化合物−リンカー中間体を形成し、続いて本発明のタン
パク質のシステイン基と反応させることが挙げられる。上記から当業者には明らかなとお
り、本発明では二官能性リンカーが有用である。例えば、二官能性リンカーは、1つ又は
複数のシステイン残基と共有結合で連結するためのチオール修飾基と、化合物と共有結合
的又は非共有結合的に連結するための少なくとも1つの結合部分(例えば、第2のチオー
ル修飾部分)とを含む。
調製することができる。システインチオール基は求核性であり、(i)活性エステル、例
えば、NHSエステル、HOBtエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物;(i
i)ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキル及びベンジル;(iii)アルデヒド基
、ケトン基、カルボキシル基、及びマレイミド基;及び(iv)スルフィド交換を介した
、ピリジルジスルフィドを含むジスルフィドを含む、リンカー試薬又は化合物−リンカー
中間体又は薬物上の求電子基と反応することにより共有結合を形成することが可能である
。化合物又はリンカー上の求核基としては、限定はされないが、リンカー部分及びリンカ
ー試薬上の求電子基と反応することにより共有結合を形成することが可能な、アミン基、
チオール基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、オキシム基、ヒドラジン基、チオセミカル
バゾン基、ヒドラジンカルボキシレート基、及びアリールヒドラジン基が挙げられる。
イミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、2,6−ジクロロトリア
ジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、及びホスホラミダイトが挙げられるが、他の
官能基もまた用いることができる。
のMay−SHに還元して本発明のタンパク質と反応させることができ(Chariら、
1992年)、それによりジスルフィドリンカーを含むメイタンシノイド−イムノコンジ
ュゲートが得られる。ジスルフィドリンカーを含むメイタンシノイドコンジュゲートは報
告されている(国際公開第04/016801号パンフレット;米国特許第688487
4号明細書;及び国際公開第03/068144号パンフレット)。ジスルフィドリンカ
ーSPPは、リンカー試薬N−スクシンイミジル4−(2−ピリジルチオ)ペンタノエー
トを含んで構成される。
パク質のカルボキシル基置換基のN−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(NHS)で
ある。化合物のNHSエステルは、予め形成し、単離し、精製し、及び/又は特徴付けて
もよく、又はインサイチュで形成してタンパク質の求核基と反応させてもよい。典型的に
は、カルボキシル型の化合物は、何らかの組み合わせのカルボジイミド試薬、例えばジシ
クロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、又はウロニウム試薬、例
えばTSTU(O−(N−スクシンイミジル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロ
ニウムテトラフルオロホウ酸、HBTU(O−ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N
,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート)、又はHATU(
O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウ
ロニウムヘキサフルオロホスファート)、アクチベータ、例えば1−ヒドロキシベンゾト
リアゾール(HOBt)、及びN−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより活
性化され、化合物のNHSエステルが得られる。ある場合には、化合物とタンパク質とを
化合物のインサイチュでの活性化及びタンパク質との反応によりカップリングして、一段
階でコンジュゲートを形成してもよい。他の活性化及びカップリング試薬としては、TB
TU(2−(1H−ベンゾトリアゾ−1−イル)−1−1,3,3−テトラメチルウロニ
ウムヘキサフルオロホスファート)、TFFH(N,N’,N’,N’−テトラメチルウ
ロニウム2−フルオロ−ヘキサフルオロホスファート)、PyBOP(ベンゾトリアゾー
ル−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
、EEDQ(2−エトキシ−1−エトキシカルボニル−1,2−ジヒドロ−キノリン)、
DCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド);DIPCDI(ジイソプロピルカルボジイ
ミド)、MSNT(1−(メシチレン−2−スルホニル)−3−ニトロ−1H−1,2,
4−トリアゾール、及びアリールスルホニルハライド、例えばトリイソプロピルベンゼン
スルホニルクロリドが挙げられる。
(iodoacetimide)又はハロゲン化ハロアセチル/アルキル、アジリジン(
aziridne)、アクリロイル誘導体を使用してシステインのチオールと反応させ、
化合物との反応性を有するチオエーテルを作製することが挙げられる(例えば、Sche
lteら、2000年(マレイミドの使用);Reddyら、1988年(マレイミド誘
導体の使用);Ramseier及びChang、1994年(ヨードアセトアミド(i
odacetamide)の使用);Eisenら、1953年(2,4−ジニトロベン
ゼンスルホン酸(dinitrobenzeneulfonic acid)の使用);
Grossmanら、1981年(アジリジンの使用);又はYemら、1992年(ア
クリロイル誘導体の使用)。遊離チオールの活性化ピリジルジスルフィドとのジスルフィ
ド交換もまたコンジュゲートの作製に有用である(Kingら、1978年及びそこで引
用される参考文献、例えば、5−チオ−2−ニトロ安息香(TNB)酸の使用)。好まし
くは、マレイミドが使用される。
(ヨウ素化によるなど)、又はキレート剤の使用によって間接的に標識されてもよい。本
明細書で使用されるとき、語句「間接的に標識する」及び「間接的な標識手法」は双方と
も、キレート剤がタンパク質に共有結合で結び付き、且つ少なくとも1つの放射性核種が
そのキレート剤と会合することを意味する。かかるキレート剤は、タンパク質及び放射性
同位体の双方に結合するため、典型的には二官能性キレート剤と称される。例示的なキレ
ート剤は、1−イソチオシクマトベンジル(isothiocycmatobenzyl
)−3−メチルジオテレントリアミン五酢酸(methyldiothelene tr
iaminepentaacetic acid)(「MX−DTPA」)及びシクロヘ
キシルジエチレントリアミン五酢酸(「CHX−DTPA」)誘導体、又はDOTAを含
む。DOTA−マレイミド(4−マレイミドブチルアミドベンジル−DOTA)などのリ
ンカー試薬は、Axworthyら(2000年)の手順に従い、アミノベンジル−DO
TAを、クロロギ酸イソプロピル(Aldrich)により活性化されたA−マレイミド
酪酸(Fluka)と反応させることにより調製することができる。DOTA−マレイミ
ド試薬は本発明のタンパク質の遊離システインアミノ酸と反応し、そこに金属錯体リガン
ドを提供する(Lewisら、1998年)。DOTA−NHS(l,4,7,10−テ
トラアザシクロドデカン−l,4,7,10−四酢酸モノ(N−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル)などのキレート化リンカー標識試薬が市販されている(Macrocycl
ics、Dallas,TX)。
TCEP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩;Getzら、1999年
;Soltec Ventures、Beverly,MA)などの還元剤で処理するこ
とにより、リンカー試薬とのコンジュゲーション用に反応性にすることが好ましい。室温
での希薄(200nM)水性硫酸銅(CuSO4)との連結に必要のないシステイン残基
間に、ジスルフィド結合を再び確立することができる。当該技術分野において公知の他の
オキシダント、すなわち酸化剤、及び酸化条件が用いられてもよい。周囲空気酸化もまた
有効である。この穏やかな部分的再酸化ステップにより、鎖内ジスルフィドが高忠実度で
効率的に形成される。
化合物をスレオニン残基又はセリン残基とコンジュゲートするための方法もまた、当該
技術分野において公知である。例えば、Zhang及びTam(1996年)は、セリン
又はスレオニンの1,2−アミノアルコールからカルボニル前駆体を誘導し、これを過ヨ
ウ素酸酸化により選択的に、且つ高速でアルデヒド型に変換することができる方法を記載
している。本発明のタンパク質に結合させる化合物中のシステインの1,2−アミノチオ
ールとアルデヒドを反応させると、安定なチアゾリジン生成物が形成される。この方法は
、N末端セリン残基又はスレオニン残基のタンパク質の標識に特に有用である。
化合物、例えばPEGをタンパク質とコンジュゲートするための様々な方法が当該技術
分野において公知である。PEGの場合、分子は、アミン又はイミダゾール、カルボン酸
基、ヒドロキシル基又はスルフヒドリル基とのその結合を促進するように活性化すること
ができる。
活性化し、PEGジクロロトリアジン誘導体を作製した。この誘導体は、リジン、セリン
、チロシン、システイン及びヒスチジンなどの複数の機能的求核性官能基と反応すること
ができる。このプロトコルの改良版によりPEG−クロロトリアジンが作製されており、
これは反応性がより低く、リジン残基又はシステイン残基とより選択的にコンジュゲート
する(Mutsushimaら、1980年)。
つの形態は、スクシンイミジルカーボネートPEG(SC−PEG;Zalipskyら
、1992年)及びベンゾトリアゾールカーボネートPEG(BTC−PEG;米国特許
第5,560,234号明細書)である。これらの化合物の双方とも、リジン残基と選択
的に反応してカルバメート連結を形成するが、しかしながらヒスチジン及びチロシンと反
応することも知られている。SC−PEGは、BTC−PEGと比べて加水分解に対する
抵抗性が若干高い。
ヒドである(米国特許第5,252,714号明細書)。この化学の利点は、酸性条件下
(約pH5)では大部分がN末端α−アミンについて選択的であり、従って非特異的なコ
ンジュゲーションに関する潜在的な問題が回避される。PEG−プロピオンアルデヒドの
アセタール誘導体、すなわちPEG−アセタールアルデヒドは、それがPEG−プロピオ
ンアルデヒドより長い貯蔵を提供する限りにおいてさらなる利益を提供する(米国特許第
5,990,237号明細書)。
いられているアシル化剤の一つである。活性エステルはほぼ生理学的条件で第一級アミン
と反応して安定なアミドを形成する。PEG−カルボン酸のスクシンイミジル活性エステ
ルへの活性化は、PEG−カルボン酸をN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS又はHO
Su)及びカルボジイミドと反応させることにより達成される。PEGの例示的カルボン
酸誘導体としては、カルボキシメチル化PEG(CM−PEG;Zalipskyら、1
990年)、ブタン酸誘導体及びプロピオン酸誘導体(米国特許第5,672,662号
明細書)が挙げられる。メチレン単位の付加により活性エステルとPEG骨格との間の距
離を変化させると、水及びアミンに対する反応性に劇的な影響を(例えば、加水分解の減
少により)及ぼすことができる。それに代えて又は加えて、加水分解は、カルボン酸に対
してα−分枝部分を導入することにより低減することができる。
ば、本明細書に記載されるとおりのシステイン残基を含むように修飾されたタンパク質を
使用する)に有用である。システインコンジュゲーション用の例示的PEG誘導体として
は、PEG−マレイミド、PEG−ビニルスルホン、PEG−ヨードアセトアミド及びP
EG−オルトピリジルジスルフィドが挙げられる。PEGのシステイン残基との例示的な
コンジュゲーション方法は、Goodson及びKatre(1990)及び/又は上記
に記載される。PEG−ビニルスルホンを使用した例示的コンジュゲーション方法は、例
えばLiら(2006年)に記載される。
第二級アミン基に対してPEGをコンジュゲートする方法について記載する。この手法の
利点は、アシル−ヒスチジン(histidne)結合が安定でない、つまりタンパク質
が徐々に放出されることである(すなわち、コンジュゲートは徐放製剤又はプロドラッグ
として振舞う)。
末端セリン又はスレオニンを利用するものである。この手法を用いてPEGが生理活性タ
ンパク質にコンジュゲートされている(例えば、Gaertner及びOfford、1
996年)。
本発明のタンパク質は、研究、診断及び治療における用途を含め、様々な用途に有用で
ある。タンパク質が結合する抗原によっては、例えば細胞を死滅させたり、又は増殖を抑
えたりするための、細胞への化合物の送達、及び/又はイメージング、及び/又はインビ
トロアッセイに有用であり得る。一例において、タンパク質は、イメージング及び細胞傷
害剤の細胞への送達の双方に有用であり、すなわち検出可能標識と細胞傷害剤とに、又は
一部が細胞傷害剤にコンジュゲートし、且つ一部が検出可能標識にコンジュゲートしてい
るタンパク質の混合物を含む組成物にコンジュゲートされる。
阻害因子の)結合、(b)受容体シグナル伝達機能、及び/又は(c)刺激機能を阻害す
る(低減又は抑制することのできる)阻害薬としても作用することができる。受容体機能
の阻害薬として作用するタンパク質は、リガンド結合を直接的又は間接的に(例えば、コ
ンホメーション変化を引き起こすことにより)阻止することができる。
本発明は、任意の1つ又は複数の抗原との特異的な結合能を有するFR1に少なくとも
2つのシステイン残基を含む少なくとも1つの可変領域を含むタンパク質を企図し、すな
わち、本発明の例は、特定の抗原を要件とすることに対比して汎用的である。
化細胞に関連する、又はそれにより発現される、及び/又は自己免疫疾患に関連する、及
び/又は炎症性疾患又は病態に関連する、及び/又は神経変性疾患に関連する、及び/又
は免疫不全障害に関連する抗原に特異的に結合するタンパク質を企図する。
形成タンパク質受容体IB型、Dijkeら 1994年、国際公開第20040633
62号パンフレット);E16(LAT1、SLC7A5、国際公開第20040489
38号パンフレット);STEAP1(前立腺の6回膜貫通上皮抗原;国際公開第200
4065577号パンフレット);CA125(MUC16、国際公開第2004045
553号パンフレット);MPF(MSLN、SMR、巨核球増強因子、メソテリン、国
際公開第2003101283号パンフレット);Napi3b(NAPI−3B、NP
TIIb、SLC34A2、溶質輸送体ファミリー34;国際公開第200402277
8号パンフレット);Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、SEMA
5B、SEMAG、セマフォリン5b、セマドメイン、7トロンボスポンジンリピート(
1型及びHike型)、膜貫通ドメイン(TM)及び短い細胞質ドメイン、(セマフォリ
ン)5B、国際公開第2004000997号パンフレット);PSCA(米国特許出願
公開第2003129192号明細書);ETBR(エンドセリンB型受容体、国際公開
第2004045516号パンフレット);MSG783(RNF124、国際公開第2
003104275号パンフレット);STEAP2(HGNC_8639、IPCA−
I、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前立腺癌関連遺伝子1、
前立腺癌関連タンパク質1、前立腺の6回膜貫通上皮抗原2、6回膜貫通前立腺タンパク
質、国際公開第2003087306号パンフレット);TrpM4(BR22450、
FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一過性受容器電位陽イオンチャネル、サ
ブファミリーM、メンバー4、米国特許出願公開第2003143557号明細書);C
RIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、テラトカルシノーマ
由来成長因子、米国特許出願公開第2003224411号明細書);CD21(CR2
(補体受容体T)又はC3DR(C3d/エプスタイン・バーウイルス受容体)国際公開
第2004045520号パンフレット);CD79b(CD79B、CD79β、IG
b(免疫グロブリン関連β)、B29、国際公開第2004016225号パンフレット
);FcRH2(DFGP4、IRTA4、SPAP1A(SH2ドメイン含有ホスファ
ターゼアンカータンパク質Ia)、SPAP1B、SPAP1C、国際公開第20040
16225号パンフレット);HER2(ErbB2、国際公開第2004048938
号パンフレット);NCA(CEACAM6、国際公開第2004063709号パンフ
レット);MDP(DPEP1、国際公開第2003016475号パンフレット);I
L20Rα(IL20Ra、ZCYTOR7、欧州特許第1394274号明細書);ブ
レビカン(BCAN、BEHAB、米国特許出願公開第2003186372号明細書)
;EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5、国際公開第20
03042661号パンフレット);ASLG659(B7h、米国特許出願公開第20
040101899号明細書);PSCA(前立腺幹細胞抗原前駆体、国際公開第200
4022709号パンフレット);GEDA(脂肪腫HMGIC融合パートナー様タンパ
ク質 国際公開第2003054152号パンフレット);BAFF−R(B細胞活性化
因子受容体、BLyS受容体3、BR3、国際公開第2004058309号パンフレッ
ト);CD22(B細胞受容体CD22−Bアイソフォーム、BL−CAM、Lyb−8
、Lyb8、SIGLEC−2、FLJ22814、国際公開第2003072036号
パンフレット);CD79a(CD79A、CD79α、免疫グロブリン関連α、Igβ
(CD79B)と共有結合的に相互作用して表面上にIg M分子との複合体を形成し、
B細胞分化に関与するシグナルを伝達するB細胞特異的タンパク質である;国際公開第2
003088808号パンフレット);CXCR5(バーキットリンパ腫受容体1、CX
CL13ケモカインにより活性化され、リンパ球遊走及び体液性防御において機能し、H
IV−2感染並びにおそらくはAIDS、リンパ腫、骨髄腫及び白血病の発症において役
割を果たすGタンパク質共役受容体である 国際公開第2004040000号パンフレ
ット);HLA−DOB(ペプチドを結合し、それらをCD4+Tリンパ球に提示するM
HCクラスII分子(Ia抗原)のβサブユニット;国際公開第9958658号パンフ
レット);P2X5(プリン受容体P2Xリガンド開口型イオンチャネル5、細胞外AT
Pによりゲート開閉されるイオンチャネルであり、シナプス伝達及び神経形成に関わり得
る。欠損は特発性排尿筋不安定の病態生理に関与し得る;国際公開第200404774
9号パンフレット);CD72(B細胞分化抗原CD72、Lyb−2;国際公開第20
04042346号パンフレット);LY64(リンパ球抗原64(RP 105)、ロ
イシンリッチリピート(LRR)ファミリーのI型膜タンパク質であり、B細胞活性化及
びアポトーシスを制御し、機能喪失は全身性エリテマトーデス患者における疾患活性の上
昇に関連する;米国特許出願公開第2002193567号明細書);FcRHl(Fc
受容体様タンパク質1、C2型Ig様ドメイン及びITAMドメインを含む免疫グロブリ
ンFcドメインについての推定受容体であり、Bリンパ球分化において役割を有し得る
国際公開第2003077836号パンフレット);IRTA2(免疫グロブリンスーパ
ーファミリー受容体転座関連2、B細胞発生及びリンパ腫形成において役割を有する可能
性のある推定免疫受容体である;一部のB細胞悪性腫瘍では転座による遺伝子の調節解除
が起こる;国際公開第2003077836号パンフレット);TENB2(TMEFF
2、トモレギュリン、TPEF、HPP1、TR、推定膜貫通プロテオグリカンであり、
EGF/ヘレグリン成長因子ファミリー及びフォリスタチンに関連する;国際公開第20
04074320号パンフレット);CD20(国際公開第94/11026号パンフレ
ット);VEGF−A(Prestaら、1997年);p53;EGFR;プロゲステ
ロン受容体;カテプシンD;Bcl−2;Eカドヘリン;CEA;ルイスX;Ki67;
PCNA;CD3;CD4;CD5;CD7;CD11c;CD11d;c−Myc;τ
;PrPSC;又はAβが挙げられる。
を含む)、MUC1(例えば、配列番号72又は73に示される配列を含む)、TAG7
2(例えば、Johnsonら、1986年に記載されるとおりの高分子量ムチン様タン
パク質)又はPSMA(例えば、配列番号71に示される配列を含む)に特異的に結合す
る。例えば、本発明のタンパク質はHer2に特異的に結合する。例えば、本発明のタン
パク質はMUC1に特異的に結合する。例えば、本発明のタンパク質はTAG72に特異
的に結合する。例えば、本発明のタンパク質はPSMAに特異的に結合する。
シマブ(C2B8;国際公開第94/11026号パンフレット);又はベバシズマブ(
ヒト化A.4.6.1;Prestaら、1997年))が挙げられる。
。他のかかるタンパク質は、ある抗原結合部位を別のタンパク質の結合部位と組み合わせ
得る。或いは、目的の抗−抗原領域を、T細胞受容体分子(例えば、CD3)などの、白
血球上のトリガー分子、又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及び/
又はFcγRIII(CD16)などの、IgGに対するFc受容体(FcγR)に結合
する領域と組み合わせ、それにより目的の抗原を発現する細胞に細胞防御機構を集中させ
、局在化させてもよい。二重特異性タンパク質はまた、目的の抗原を発現する細胞に細胞
傷害剤を局在化させるためにも用いられ得る。これらのタンパク質は、目的の抗原を結合
する領域と、細胞傷害剤(例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロ
イド、リシンA鎖、メトトレキサート又は放射性同位体ハプテン)を結合する領域とを有
する。国際公開第96/16673号パンフレットは二重特異性抗ErbB2/抗Fcγ
RIII抗体を記載し、及び米国特許第5,837,234号明細書は二重特異性抗Er
bB2/抗FcγRI抗体を開示する。二重特異性抗ErbB2/Fcα抗体が国際公開
第98/02463号パンフレットに示される。米国特許第5,821,337号明細書
は二重特異性抗ErbB2/抗CD3抗体を教示する。
本発明のタンパク質(同義語、有効成分)は、予防的処置又は治療的処置のための非経
口、局所、経口、若しくは局在投与、エアロゾル投与、又は経皮投与に有用である。医薬
組成物は、投与方法に応じた様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与
に好適な単位剤形としては、粉末、錠剤、丸薬、カプセル及びロゼンジが挙げられ、さも
なければ非経口投与による。本発明の医薬組成物が経口投与されるときには、消化から保
護されなければならないことが認識される。これは、典型的には、タンパク質を組成物と
複合体化して、それを酸及び酵素の加水分解に対して耐性にするか、或いは化合物をリポ
ソームなどの適切な抵抗性を有する担体にパッケージングすることにより達成される。タ
ンパク質を消化から保護する手段は当該技術分野において公知である。
る。語句「治療有効量」は、対象における処置又は他の治療効果を促進し、誘発し、及び
/又は亢進するのに十分な量を指す。明らかなとおり、これらの製剤中における本発明の
タンパク質の濃度は幅広く異なり得るとともに、選択された特定の投与方式及び患者の必
要性に従い、主として液量、粘度、体重などに基づき選択されることになる。疾患の種類
及び重症度に応じて、例えば1つ又は複数の別個の投与による場合であっても、或いは持
続注入による場合であっても、治療有効量は約1μg/kg〜15mg/kg(例えば0
.1〜20mg/kg)の分子であり得る。典型的な1日投薬量は約1μg/kg〜10
0mg/kg又はそれ以上の範囲となる可能性がある。患者に投与されるタンパク質の例
示的投薬量は、約0.1〜約10mg/kg(患者体重)の範囲である。数日間又はそれ
以上にわたる反復投与については、病態に応じて、処置は疾患症状の所望の抑制が起こる
まで続けられる。例示的投与レジメンは、約4mg/kgの初回負荷用量と、その後の約
2mg/kgのタンパク質の週1回維持用量の投与を含む。他の投薬量レジメンが有用で
あり得る。この治療の経過は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる
。
(does)で製剤化される。
経皮、又は蠕動投与及び腫瘍若しくは疾患部位への直接注入(腔内投与)を含む他のかか
る経路を介した注射用に製剤化される。投与される組成物は、一般に、薬学的に許容可能
な担体、好ましくは水性担体中に溶解した本発明のタンパク質の溶液を含み得る。例えば
緩衝生理食塩水など、様々な水性担体を使用することができる。他の例示的担体としては
、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び5%ヒト血清アルブミンが挙
げられる。混合油及びオレイン酸エチルなどの非水性媒体もまた用いられ得る。リポソー
ムもまた担体として用いられ得る。媒体は、等張性及び化学的安定性を亢進する少量の添
加剤、例えば緩衝剤及び防腐剤を含有してもよい。組成物は、pH調整剤及び緩衝剤、毒
性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム、乳酸ナトリウムなどの、生理学的条件に近似させる必要に応じた薬学的に許容可能な
補助物質を含有してもよい。
Sciences」、第16版 Mack Publishing Company、
1980年に例示されるとおり、概して当該技術分野において公知である。
を含むエアロゾル化された組成物を投与するための組成物及び方法について記載し、これ
は本発明のタンパク質の投与にも好適である。
び/又は治療される対象によって異なり得る。好適な投薬量の決定は技能を有する医師の
能力の範囲内であり、例えば、最適以下の投薬量で開始し、投薬量を漸増させながら変更
して最適又は有効な投薬量を決定することによる。或いは、治療/予防に適切な投薬量を
決定するため、細胞培養アッセイ又は動物試験のデータが使用され、ここで好適な用量は
、毒性をほとんど又は全く伴わない活性化合物のED50を含む循環濃度の範囲内である
。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路によってこの範囲内で異なり得る。
治療的に/予防的に有効な用量は、初めは細胞培養アッセイから推定することができる。
用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるときのIC50(すなわち、最大半
量の症状抑制を実現する化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を実現するように調整さ
れ得る。かかる情報を使用して、ヒトにおける有効用量をより正確に決定することができ
る。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより計測されてもよい。
て、第2の化合物と組み合わされてもよい。医薬複合製剤又は投与レジメンの第2の化合
物は、好ましくは組み合わせのタンパク質に対して、それらが互いに悪影響を及ぼし合う
ことがないよう補足的な活性を有する。
、及び/又は心保護薬であってもよい。かかる分子は好適には、意図する目的に有効な量
で組み合わされて存在する。本発明のタンパク質を含有する医薬組成物はまた、チューブ
リン形成阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、又はDNA結合剤などの、治療有効量の化学
療法剤も有し得る。
たり一定の薬物濃度をもたらすように設計され、本発明の化合物の送達に使用することが
できる。
タンパク質をそれを必要とする対象に投与するステップを含む方法も提供する。
防する」又は「予防」は、特定の疾患又は病態の少なくとも1つの症状の発症を止め、又
は妨げるのに十分な量の本明細書に記載されるタンパク質を投与することを含む。
明細書に記載される1つ又は複数の阻害薬及び/又は1つ又は複数の薬剤を、特定の疾患
又は病態の少なくとも1つの症状を軽減又は解消するのに十分な治療有効量で投与するこ
とを含む。
動物を意味するものと解釈されなければならない。例示的対象としては、限定はされない
が、ヒト、霊長類、家畜(例えば、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、ロバ、ブタ)、コンパニオン
動物(例えば、イヌ、ネコ)、実験室試験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モル
モット、ハムスター)、捕獲野生動物(例えば、キツネ、シカ)が挙げられる。好ましく
は哺乳動物はヒト又は霊長類である。より好ましくは哺乳動物はヒトである。
ることであり、いかなる特定の病態にも限定されるものではなく、疾患又は障害を含み得
る。一例では、病態は癌又は免疫病理学的障害である。
又はリンパ性悪性腫瘍が挙げられる。かかる癌のより詳細な例としては、有棘細胞癌(例
えば上皮有棘細胞癌)、肺癌、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁
平上皮癌腫、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃癌(gastric cancer
)又は胃癌(stomach cancer)、膵癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌
、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫又は子宮癌腫
、唾液腺癌腫、腎癌(kidney cancer)又は腎癌(renal cance
r)、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、並びに頭頸部癌が挙
げられる。好ましくは癌は乳癌又は卵巣癌又は前立腺癌である。
胃癌又は子宮癌、好ましくは乳癌が挙げられる。かかる癌は、例えばHer2に結合する
本発明のタンパク質により治療することができる。
られる。かかる癌は、例えばPSMAに結合する本発明のタンパク質により治療すること
ができる。
腸癌、胃癌、膵癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、非小細胞肺癌、及び前立腺癌などの癌腫
が挙げられる。かかる癌は、例えばTag72に結合する本発明のタンパク質により治療
することができる。
コフォームを発現する。例示的癌はとしては、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、乳癌、肺癌、及
び膀胱癌などの癌腫が挙げられる。かかる癌は、例えばMUC1に結合する本発明のタン
パク質により治療することができる。
の抗原との反応により引き起こされる任意の病態である。従って、「免疫病理学的障害」
は、対象の免疫系が抗原と反応することにより生じる障害と定義することができる。免疫
病理学的障害としては、自己免疫疾患及び過敏性反応(例えばI型:アナフィラキシー、
じんま疹、食物アレルギー、喘息;II型:自己免疫性溶血性貧血、輸血反応;III型
:血清病、壊死性血管炎、糸球体腎炎、関節リウマチ、ループス;IV型:接触性皮膚炎
、移植片拒絶反応)が挙げられる。自己免疫疾患としては、リウマチ性障害(例えば、関
節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、SLE及びループス腎炎などのループス、多
発筋炎/皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬性関節炎な
ど)、変形性関節症、自己免疫性胃腸及び肝障害(例えば、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍
性大腸炎及びクローン病)、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁
性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及びセリアック病など)、血管炎(例えば、チャーグ−
ストラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、及び多発性動脈炎(polyarteriit
is)を含むANCA関連血管炎など)、自己免疫性神経障害(例えば、多発性硬化症、
オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、及び自己免疫
性多発ニューロパチー)、腎障害(例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及び
ベルジェ病など)、自己免疫性皮膚障害(例えば、乾癬、蕁麻疹、じんま疹、尋常性天疱
瘡、水疱性類天疱瘡、及び皮膚エリテマトーデスなど)、血液障害(例えば、血小板減少
性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、及び自己免疫性溶血性貧血など)
、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患(例えば、内耳疾患及び難
聴など)、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、及び自己免疫性内分泌障害(例
えば、インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)などの糖尿病関連自己免疫疾患、アジソ
ン病、及び自己免疫性甲状腺疾患(例えば、グレーブス病及び甲状腺炎)など)が挙げら
れる。より好ましいかかる疾患としては、例えば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ANC
A関連血管炎、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、IDDM
、悪性貧血、甲状腺炎、及び糸球体腎炎が挙げられる。
体組織の防御反応であり、急性であることも、又は慢性であることもある。従って、炎症
性障害は、好中球、単球、マスト細胞、好塩基球、好酸球、マクロファージが関与する疾
患であって、サイトカイン放出、ヒスタミン放出、酸化的バースト、食作用、他の顆粒酵
素の放出及び走化性が生じる疾患を含む。過敏性反応(上記の免疫病理学的障害のなかで
定義される)はまた、多くの場合に補体活性化、及び好中球、マスト細胞、好塩基球等の
様々な白血球の動員/浸潤が関わるため、炎症性疾患(急性又は慢性)と見なすこともで
きる。
うな量で投与され得る。製剤は、様々な方法で、例えば摂取又は注射又は吸入により、容
易に投与される。
同時的又は逐次的なレジメンとして投与され得る。逐次的に投与される場合、その組み合
わせは2回以上の投与で投与され得る。組み合わせ投与は、別個の製剤又は単一の医薬製
剤を使用した同時投与、及びいずれかの順序による連続投与であって、好ましくは、双方
の(又は全ての)活性薬剤が同時にその生物活性を及ぼす期間が存在する連続投与を含む
。
おり、インビトロ及び/又はインビボで試験される。
一例において、本発明のタンパク質は、化合物にコンジュゲートされていてもなお、抗
原に結合する。本タンパク質は、それが由来するタンパク質と少なくとも同程度に抗原に
結合し得る。或いは、タンパク質又はそれを含むコンジュゲートは、それが由来するタン
パク質の、又はシステイン残基を欠く、及び/又は化合物をコンジュゲートしていない形
態のタンパク質の少なくとも約10%又は20%又は30%又は40%又は50%又は6
0%又は70%又は80%又は90%のアフィニティ又はアビディティで抗原に結合する
。
又はコンジュゲートされていないタンパク質の標的抗原との結合を阻止するタンパク質の
能力を示す単純な免疫測定法、例えば競合的結合アッセイが挙げられる。競合的結合は、
被験タンパク質が基準タンパク質の一般的な抗原との特異的結合を阻害するアッセイで測
定される。数多くのタイプの競合的結合アッセイ、例えば、固相直接又は間接放射免疫測
定法(RIA)、固相直接又は間接酵素免疫測定法(EIA)、サンドイッチ競合アッセ
イ;固相直接ビオチン−アビジンEIA;固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイ
ッチアッセイ;125I標識を用いる固相直接標識RIA;固相直接ビオチン−アビジン
EIA;又は直接標識RIAが公知である(例えば、Harlow及びLane、198
8年を参照のこと)。典型的にかかるアッセイには、未標識の試験タンパク質と、標識さ
れた基準タンパク質と、そのいずれかを有する細胞又は固体表面に結合した精製抗原との
使用が関わる。試験タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定す
ることにより、競合的阻害が計測される。
の活性をインビトロで評価するために、様々なアッセイを利用することができる。例えば
、本発明のタンパク質が細胞又はその集合に投与され、それが前記細胞に結合できるか否
か、及び/又は前記細胞により内部に取り込まれるか否かが決定される。かかるアッセイ
は、本発明のタンパク質を検出可能標識で標識する(すなわち、コンジュゲートを作製す
る)ことにより促進されるが、しかしながら本発明のタンパク質は標識タンパク質によっ
ても検出することができるため、これは必須ではない。かかるアッセイは、本発明のタン
パク質が細胞に化合物を送達する能力(すなわち、ペイロード)及び/又はイメージング
におけるその有用性の評価に有用である。好ましくは細胞は、本発明のタンパク質が結合
する抗原を発現し、より好ましくは検出又は治療が所望される細胞型の細胞系又は初代細
胞培養物である。
害活性又は細胞増殖抑制活性の計測は、本発明のタンパク質が結合する抗原を発現する細
胞を本発明のタンパク質に曝露し;タンパク質が生物学的作用をもたらすのに好適な期間
、例えば約6時間〜約5日間にわたり細胞を培養し;及び細胞生存度、細胞毒性及び/又
は細胞死を計測することにより行われる。生存度(増殖)、細胞毒性、及び細胞死の計測
に有用な細胞ベースのインビトロアッセイは当該技術分野において公知である。
(Promega Corp.、Madison,WI)が市販されており、これは鞘翅
目(Coleoptera)ルシフェラーゼの組換え発現に基づく均一アッセイ方法であ
る(米国特許第5583024号明細書;同第5674713号明細書及び同第5700
670号明細書)。この細胞増殖アッセイは、代謝活性を有する細胞の指標となる、細胞
中に存在するATPの定量化に基づき培養物中の生細胞数を決定する(米国特許第660
2677号明細書)。或いは、細胞生存度は、非蛍光性レサズリンを使用してアッセイさ
れ、レサズリンが本発明のタンパク質の存在下で培養される細胞に加えられる。生細胞に
よりレサズリンが赤色蛍光レゾルフィンに還元され、例えば顕微鏡法又は蛍光プレートリ
ーダーを使用して、容易に検出可能となる。細胞生存度の解析キットが、例えばMole
cular Probes、Eugene,OR,米国から利用可能である。他の細胞生
存度アッセイとしては、3H−チミジン又は14C−チミジンの、DNAの合成に伴うD
NAへの取り込みの測定が挙げられ、これは細胞***に関連するDNA合成についてのア
ッセイである。かかるアッセイでは、細胞が標識チミジンの存在下で、細胞***が生じる
のに十分な時間にわたりインキュベートされる。組み込まれなかった全てのチミジンが洗
浄により取り除かれた後、標識(例えば放射性標識)が、例えばシンチレーションカウン
タを使用して検出される。細胞増殖を測定する別のアッセイとしては、例えばBrdU取
り込みによるDNA合成の計測(ELISA又は免疫組織化学、Amersham Ph
armacia Biotechからキットを入手可能)が挙げられる。細胞死を検出す
る例示的アッセイとしては、APOPTEST(Immunotechから入手可能)に
よるアポトーシス初期の細胞の染色が挙げられ、これは細胞試料の固定が不要である。こ
の方法は、アネキシンV抗体を利用してアポトーシスを受けている細胞に特有の細胞膜再
構成を検出する。このように染色されたアポトーシス細胞は、次に固定化されたアネキシ
ンV抗体を使用して、蛍光活性化細胞分離法(FACS)、ELISA、又は付着及びパ
ニングのいずれかにより選別され得る。或いは、末端デオキシヌクレオチド転換酵素媒介
性ビオチン化UTPニック末端標識(TUNEL)アッセイを用いて細胞死レベルが決定
される。TUNELアッセイは酵素の末端デオキシヌクレオチド転換酵素を使用して、ア
ポトーシス中に生成される3’−OH DNA末端をビオチン化ヌクレオチドで標識する
。次に、検出可能なマーカーにコンジュゲートされたストレプトアビジンを使用してビオ
チン化ヌクレオチドが検出される。TUNEL染色用のキットは、例えばInterge
n Company、Purchase,NYから入手可能である。
し、続いて本発明のタンパク質を、例えばイムノアフィニティー精製を用いて単離するこ
とにより評価することができる。本発明のタンパク質の回収量の低下が、血清中での、又
は細胞に対する曝露時の、本発明のタンパク質の分解を示す。
的な放射性免疫測定法又は蛍光免疫測定法を用いて評価される。
本発明のタンパク質はまた、その安定性及び/又は効力についてインビボで試験するこ
ともできる。例えば、本発明のタンパク質が対象に投与され、タンパク質の血清レベルが
、例えばELISAを用いて、又はタンパク質にコンジュゲートした検出可能標識の検出
により、経時的に検出される。これにより本発明のタンパク質の生体内安定性を判断する
ことが可能となる。
、本発明のタンパク質が結合する抗原に基づき好適なモデルを決定することが容易に可能
であろう。例示的なモデル、例えばヒト癌のモデルは、当該技術分野において公知である
。例えば乳癌のマウスモデルは、線維芽細胞成長因子3(Mullerら、1990年)
;TGF−α(Matsuiら、1990年);erbB2(Guyら、1992年);
RET−1(Iwamotoら、1990年)を過剰発現するマウス又はヒト乳癌細胞の
SCIDマウスへの移植を含む。卵巣癌のモデルは、卵巣癌細胞のマウスへの移植(例え
ば、Robyら、2000年に記載されるとおり);黄体形成ホルモンを慢性的に分泌す
るトランスジェニックマウス(Rismaら、1995年);又はWx/Wvマウスを含
む。前立腺癌のマウスモデルもまた当該技術分野において公知であり、例えば、SV40
初期遺伝子の強制発現から得られるモデルを含む(例えば、ミニマルラットプロバシンプ
ロモーター(minimal rat probasin promoter)を利用し
てSV40初期遺伝子を発現させるTRAMPモデル、又はロングプロバシンプロモータ
ー(long probasin promoter)を使用してラージT抗原を発現さ
せるトランスジェニックマウス、まとめて「LADY」モデルと称されるもの、又はc−
myc又はBcl−2又はFgf8bを発現するか、又はドミナントネガティブTGFβ
を発現するマウス(前立腺癌のトランスジェニックモデルのレビューについては、Mat
usikら、2001年を参照のこと)。
て、糖尿病を抑制し、予防し、治療し、又は遅延させるその能力を試験することもでき(
例えば、Tangら(2004年)に記載されるとおり)、及び/又はGVHDのマウス
モデルに(例えば、Trenado(2002年)に記載されるとおり)及び/又は乾癬
のマウスモデルに(例えば、Wangら 2008年)及び/又は関節リウマチのモデル
、例えばSKG株のマウス(Sakaguchiら)、ラットII型コラーゲン関節炎モ
デル、マウスII型コラーゲン関節炎モデル又はいくつかの種における抗原誘導性関節炎
モデル(Bendele、2001年))及び/又は多発性硬化症(例えば、実験的自己
免疫性脳脊髄炎(EAE;Bradl及びLinington、1996年))及び/又
は炎症性気道疾患(例えば、OVAチャレンジ又はゴキブリ抗原チャレンジ(Chenら
2007年;Lukacsら 2001年)のモデル及び/又は炎症性腸疾患のモデル
(例えば、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘導性大腸炎モデル又は大腸炎のMu
c2欠損マウスモデル(Van der Sluisら 2006年)に投与することも
できる。
一例において、本発明は病態の診断又は予後判定方法を提供する。
診断する」、「診断される」又は「診断の」などは、臨床状態の任意の一次診断又は再発
性疾患の診断を含む。
再発の可能性を含め、疾患の起こり得る転帰又は進行を指す。
のタンパク質は、診断又は研究目的での、細胞ソーティング(例えば、フローサイトメト
リー、蛍光活性化細胞分離法)などの用途に有用性がある。例えば、試料を本発明のタン
パク質と、それが抗原に結合して複合体を形成するのに十分な時間にわたり、且つそのよ
うな条件下で接触させ、次に複合体を検出するか、又は複合体のレベルを測定する。この
ために、タンパク質は標識されても、又は標識されなくてもよい。タンパク質は、例えば
本明細書に記載される方法を用いて、直接標識することができる。標識されない場合、タ
ンパク質は、例えば凝集アッセイにあるような、好適な手段を用いて検出することができ
る。未標識抗体又は断片はまた、タンパク質、例えばタンパク質と反応性を有する標識抗
体(例えば、第2の抗体)又は他の好適な試薬(例えば、標識プロテインA)の検出に使
用することのできる別の(すなわち、1つ又は複数の)好適な試薬と組み合わせて使用す
ることもできる。
組織化学法、免疫蛍光法、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、蛍光結合免疫吸着測
定法(FLISA) ウエスタンブロッティング、RIA、バイオセンサーアッセイ、タ
ンパク質チップアッセイ及び免疫染色アッセイ(例えば免疫蛍光法)からなる群から選択
されるアッセイを用いること。
フォーマットが特に有用である。
はポリカーボネート製マイクロウェル又はディップスティック、膜、又はガラス担体(例
えばスライドガラス)などの上に固定化することを含む。目的の抗原に特異的に結合する
本発明のタンパク質を固定化された試料と直接接触させ、前記試料中に存在するその標的
抗原のいずれかと直接的な結合を形成する。この本発明のタンパク質は、概して検出可能
なレポーター分子、例えば、FLISAの場合には蛍光標識(例えばFITC又はテキサ
スレッド)又は蛍光性半導体ナノ結晶(米国特許第6,306,610号明細書に記載さ
れるとおり)で、又はELISAの場合には酵素(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ(
HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)又はβ−ガラクトシダーゼ)で標識され、或
いは本発明のタンパク質に結合する標識抗体を使用することができる。未結合のタンパク
質を全て洗浄により取り除いた後、標識が、蛍光標識の場合には直接、或いは酵素標識の
場合には、基質、例えば、過酸化水素、TMB、若しくはトルイジン、又は5−ブロモ−
4−クロロ−3−インドール−β−D−ガラクトピラノシド(galaotopyran
oside)(x−gal)などを加えることにより検出される。かかるELISA又は
FLISAに基づくシステムは、タンパク質が結合する既知量のタンパク質標準、例えば
、単離された、及び/又は組換えのタンパク質又はその免疫原性断片若しくはそのエピト
ープに対して検出システムを較正することにより、試料中のタンパク質量の定量化に特に
好適となる。
合する抗体を固体マトリックス、例えば、膜、ポリスチレン若しくはポリカーボネート製
マイクロウェル、ポリスチレン若しくはポリカーボネート製ディップスティック又はガラ
ス担体の上に固定化することから構成される。次に試料は、前記本発明のタンパク質と物
理的に関係付けられ、前記化合物が結合するタンパク質を結合し、又は「捕捉」する。次
に、異なるタンパク質又は同じタンパク質の異なる部位に結合する標識された本発明のタ
ンパク質を使用して、結合したタンパク質が検出される。或いは、第2の(検出する)抗
体を結合する第3の標識抗体を使用することができる。
当業者には上記から明らかなとおり、本発明はまた、本発明のタンパク質を使用したイ
メージング方法も企図する。イメージングのため、本発明のタンパク質が検出可能標識に
コンジュゲートされ、検出可能標識は、イメージングにより検出可能なシグナルを放出す
ることのできる任意の分子又は薬剤であってよい。例えば検出可能標識は、タンパク質、
放射性同位体、フルオロフォア、可視光発光フルオロフォア、赤外光発光フルオロフォア
、金属、強磁性物質、電磁気放出物質 特定のMR分光シグネチャを有する物質、X線吸
収若しくは反射物質、又は音響変調物質であってもよい。
れる腫瘍、臓器、若しくは組織に局所投与されてもよい。概してタンパク質は、腫瘍、組
織、又は臓器の所望の光学像を実現するのに有効な用量で投与される。かかる用量は、用
いられる特定のタンパク質、イメージング手技に供される腫瘍、組織、又は臓器、使用さ
れるイメージング機器などによって幅広く異なり得る。
瘍のイメージング、臓器の断層イメージング、臓器機能のモニタリング、冠動脈造影、蛍
光内視鏡検査、レーザーガイド手術、光音響法及び超音波蛍光法などを含めた、様々な生
物医学的応用における組織及び臓器の生体内光学イメージング造影剤として使用される。
本発明のタンパク質がイメージングに有用な例示的疾患、例えば癌が本明細書に記載され
、それらは本発明の本実施形態に準用されるものと解釈されなければならない。一例にお
いて、本発明のタンパク質コンジュゲートは、対象において本発明の特定のタンパク質が
集中しているところをモニタリングすることによる腫瘍及び他の異常の存在の検出に有用
である。別の実施形態において、本発明のタンパク質は、腹腔鏡検査時に腫瘍の微小転移
を検出するためのレーザー応用ガイド手術に有用である。さらに別の実施形態において、
本発明のタンパク質は、動脈硬化性プラーク及び血餅の診断において有用である。
CT、超音波、平面ガンマカメライメージング、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法
(SPECT)、陽電子放射断層撮影法(PET)、他の核医学に基づくイメージング、
可視光を使用する光学イメージング、ルシフェラーゼを使用する光学イメージング、フル
オロフォアを使用する光学イメージング、他の光学イメージング、近赤外光を使用するイ
メージング、又は赤外光を使用するイメージングが挙げられる。
さらに含む。
おいて検出可能標識からのシグナルを計測するために、それらの技法のいずれかを適用す
ることができる。例えば、光学イメージングは、特定の医学分野で幅広い支持を受けてい
るイメージングモダリティの一つである。例としては、細胞成分の光学標識、並びにフル
オレセイン血管造影及びインドシアニングリーン血管造影などの血管造影が挙げられる。
光学イメージング造影剤の例としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体
、インドシアニングリーン、オレゴングリーン、オレゴングリーン誘導体の誘導体、ロー
ダミングリーン、ローダミングリーンの誘導体、エオシン、エリトリロシン(erytl
irosin)、テキサスレッド、テキサスレッドの誘導体、マラカイトグリーン、ナノ
ゴールドスルホスクシンイミジルエステル(nanogold sulfosuccin
imidyl ester)、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン、ピリジ
ルオキサゾール(pyridyloxazole)誘導体、カスケードイエロー色素、ダ
ポキシル(dapoxyl)色素が挙げられる。
して、ガンマカメライメージングが企図される。当業者は、ガンマカメライメージングの
応用技術に精通しているであろう。一実施形態において、シグナルの計測は、111In
又は99mTcコンジュゲート、特に111In−オクトレオチド又は99mTc−ソマ
トスタチン類似体のγカメライメージングの使用を含み得る。
T)が企図される。CTは、様々な角度から一連のX線写真を撮影し、次にそれらをコン
ピュータで合成することにより、身体の任意の部分の三次元画像の構築を可能にする。コ
ンピュータは、任意の角度からの、及び任意の深さの二次元スライスを表示するようにプ
ログラムされる。スライスを合成して三次元表現を構築してもよい。
のタンパク質にコンジュゲートした放射線不透過性造影剤を静脈注射することが、軟部組
織塊の特定及び描写に役立ち得る。同様に、造影剤は軟部組織病変の血管分布の評価にも
役立つ。例えば、造影剤の使用は、腫瘍と隣接する血管構造との関係の描写に役立ち得る
。
、イオタラム酸、イオヘキソール、ジアトリゾ酸、イオパミドール、エチオドール、及び
イオパノ酸が挙げられる。ガドリニウム剤、例えばガドペンテート(gadopenta
te)もまた、CT造影剤として有用であることが報告されている。
メージングモダリティである。MRIでは、画像化される試料を強静磁場中に置き、高周
波(RF)放射パルスで励起することにより、試料において正味の磁化を生じさせる。次
に様々な磁場勾配及び他のRFパルスが、空間情報を記録信号に符号化するように働く。
それらの信号を収集して分析することにより三次元画像を計算することが可能となり、こ
の画像は、CT像と同じく、通常は二次元スライスで表示される。スライスを合成して三
次元表現を構築してもよい。
されるものと異なる。MRI造影剤の例としては、ガドリニウムキレート、マンガンキレ
ート、クロムキレート、及び鉄粒子が挙げられる。例えば、本発明のタンパク質は、スカ
ンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、モリ
ブデン、ルテニウム、セリウム、インジウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、
サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、
エルビウム、ツリウム、及びイッテルビウムからなる群から選択される常磁性金属のキレ
ートを含む化合物にコンジュゲートされる。本発明に有用な造影剤のさらなる例は、ハロ
カーボンベースのナノ粒子、例えばPFOB又は他のフッ素ベースのMRI剤である。C
T及びMRIの双方とも、組織境界及び血管構造を識別するのに役立つ解剖学的情報を提
供する。
しては、陽電子放射断層撮影法(PET)及び単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(
SPECT)が挙げられる。PETでは、患者が陽電子を放射する放射性物質を摂取する
か、又はそれを注入され、それらの陽電子が体内を移動する物質としてモニタリングされ
得る。
ECTである。両者の主な違いは、陽電子を放射する物質の代わりに、SPECTは高エ
ネルギー光子を放射する放射性トレーサーを使用することである。SPECTは、冠動脈
疾患を含めた複数の病気の診断に役立ち、米国では、既に毎年約250万件のSPECT
心臓検査が行われている。
、15O、18F、82Rb、62Cu、及び68Gaで標識される。本発明のタンパク
質はSPECTに対しては、陽電子放射体、例えば99mTc、201Tl、及び67G
a、111Inで標識される。
専門領域において使用することができる。例えば、フルオロフォアの紫外線励起後の単純
な観察から、先進的な機器を使用する高度な分光イメージングに至るまで、長年にわたり
技術開発が行われてきた(例えば、Andersson−Engelsら、1997年を
参照のこと)。蛍光、例えばフルオロフォア又は蛍光タンパク質からの蛍光をインビボ検
出するための当該技術分野において公知の具体的な装置又は方法としては、限定はされな
いが、生体内近赤外蛍光(例えば、Frangioni、2003年を参照のこと)、M
aestro(商標)生体内蛍光イメージングシステム(Cambridge Rese
arch & Instrumentation,Inc.;Woburn,MA)、フ
ライングスポットスキャナを使用した生体内蛍光イメージング(例えば、Ramanuj
amら、2001年を参照のこと)などが挙げられる。
Dカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査装置、蛍光光度計、フォトダイオ
ード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マ
イクロプレートリーダー、又は光電子増倍管を使用したシグナル増幅が挙げられる。
セイを用いて、例えば本明細書に記載されるモデルを使用して試験される。
本発明はまた、本発明のタンパク質を含む製品、又は「キット」も提供する。製品は、
場合により、容器と、例えば、本明細書において任意の実施形態により記載される方法に
おける本発明のタンパク質の使用についての説明を提供する容器上の、又は容器に関連付
けられたラベル又は添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シ
リンジ、ブリスターパック等が挙げられる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な
材料で形成され得る。容器は本発明のタンパク質組成物を保持するとともに、無菌のアク
セスポートを有し得る(例えば容器は、皮下注射針により穿孔可能な栓を有する静注用溶
液の袋又はバイアルであってもよい)。それに代えて、又は加えて、製品は、注射用静菌
水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学
的に許容可能な緩衝液を含む第2の(又は第3の)容器をさらに含んでもよい。さらに製
品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含めた、商業的な及び使用者
の観点から望ましい他の材料を含み得る。
1.1 Avibodyの分子モデル作成
Avibodyは、抗体の可変ドメインを含む組換えタンパク質である。Avibod
yはモノクローナル抗体の可変ドメインを、VHからVLへの又はVLからVHへのいず
れかの向きで短鎖リンカー領域により分散して単一のポリペプチド鎖に融合することによ
り利用する。これらのAvibodyは、リンカー長さに応じて、1、2、3又は4個の
機能的結合部位をそれぞれ含む安定的で生物学的に活性なモノボディ(scFv)、ダイ
アボディ、トリアボディ又はテトラボディを形成するように設計される。
又はFASTAの双方の検索を使用したRCSB PDBデータバンク(www.pdb
.org)の検索を行った。最高の配列同一性、分解能及び完全性を有する構造ヒットを
選択し、モデル化されたAvibodyのFvドメインの鋳型として用いた。pdbファ
イルの非対称ユニットが1つより多い鋳型モデルを含んだ場合、全ての鋳型を使用し、同
等に取り扱った。
置の設定に四次鋳型を使用し、これらのAvibodyのモデリングを可能にした。ダイ
アボディについては1LMK(Perisicら、1994年)又は1MOE(Carm
ichaelら、2003年)を様々に使用し、トリアボディについては1NQB(Pe
iら、1997年)を使用して、モデリングのため四次空間に鋳型を配置した。
されたコア座標セット(Gelfandら、1998年a)の複数部を四次鋳型と最小二
乗法でアラインメントし、「コア」ホモ二量体又はホモ三量体を形成した。各Avibo
dyについて選択されたFv鋳型を、次にこの「核」ホモ二量体又はホモ三量体中の各F
vと最小二乗法でアラインメントして鋳型ホモ二量体又はホモ三量体を形成した。続いて
これらのファイルを編集し、様々なAvibodyのモデリングに必要な連結性を反映さ
せた。
」四次モデルを使用せず、連結残基は「アブイニシオ」でループとしてモデル化した。
ell、1993年)を用いるDiscovery Studio(DS)ソフトウェア
(v2.5、Accelrys、CA,米国)を使用してAvibodyの分子モデルを
作成し、ソフトウェアに含まれるスコアリング関数を用いて評価した。全物理的エネルギ
ーについてのMODELLER作成の確率密度関数(PDF)の各々における高位ランキ
ングスコアの存在及び離散最適化タンパク質エネルギー(DOPE)スコアに基づき最良
のモデルを選択した(Shenら、2006年)。さらなる解析のため、選択されたモデ
ルをpdbファイルに書き出した。得られたモデルの画像もまたDSを使用して作成した
。
関連する残基の溶媒露出表面積(ASA)の計算が含まれた。ASAは、本明細書では、
モデル化されたジスルフィド変異体のコンジュゲーションへの利用可能性の能力の評価と
して使用される。次にASA平均値からの標準偏差(Excelで計算)を、ジスルフィ
ドにおけるシステイン残基の双方若しくは一方又は残基(すなわち、CDR)の他の基が
同様に露出していたかどうかに関する指標として用いた。例えば、大きい標準偏差は、ジ
スルフィド中の残基の一つについて、還元及び/又はコンジュゲーションのための露出が
少ない可能性があることを示す。CDRについては残基当たり平均の平均ASAもまた含
め、概して露出している残基の基とのジスルフィドの比較を促進する。シート内で保存さ
れたジスルフィドの平均ASAを使用して、ほぼ埋もれている、又は到達不可能な残基の
基とのジスルフィドの比較を促進した。
ョンか、若しくは三量体コンジュゲーションであったのか、又はそれぞれのscFvがV
HからVLへの向きにあったのか、若しくはVLからVHへの向きにあったのかに関わら
ず、コンジュゲーション確率の指標としてのASAに関して、モデル化されたジスルフィ
ド変異体の露出度に有意な差は認められなかった。
AVP04−07 Avibody(配列番号55)は、理論的pI/Mw:8.0/
51kDaの、VLκ軽鎖及びサブグループI VH鎖を有する組換えダイアボディであ
る。AVP04−07は腫瘍関連抗原TAG72を認識する。
それらを配列に融合して、2つの機能的結合部位を含む安定した生物学的に活性のダイア
ボディを形成する。CC49の可変ドメインは、極めて優れたインビトロ及びインビボ特
性を有する高発現で高度に安定した組換え分子を実現するため、アミノ酸配列が修飾され
ている(Robergeら、2006年)。
抗体、1ZA6が浮上し(Larsonら、2005年)、これはギャップなしアライン
メントでVH及びVLの双方のドメインにおいてAVP04−07と82%の同一性マッ
チを有した。
換えヒト化抗体もまた、TAG72抗原を認識する。
vドメインをモデル化した。上記に記載される1LMKを鋳型の四次空間アラインメント
に使用して、上記に記載される方法でAVP04−07ダイアボディを形成した。選択さ
れた最高スコアのAVP04−07ダイアボディモデルを図1に示し、これはこのAvi
body二量体の「未変異の」立体配置に相当する。
AVP07−17 Avibody(配列番号59)は、理論的pI/Mw:6.4/
55kDaの、極めて長いCDRH3ループ、VLλ軽鎖及びサブグループI VH鎖を
有する組換えダイアボディである。AVP07−17は腫瘍関連抗原HER2を認識する
。
04−07と比較してRCSB pdbで利用可能な構造との同一性が低い。AVP04
−07について得られた結果と比較したとき、それほど高いAVP07−17との同一性
を示したVL及びVHのFv対はなかった。
ATRASサーバー(Kawabata 2003年、Kawabataら 2000年
)は、BLASTプログラムを用いた現行のPDBに対する標準的な配列相同性検索を使
用し、アラインメント領域のグラフ表現を備えて鋳型選択を支援する。この方法から2つ
の良好な鋳型が明らかとなり、いずれもVL及びVHの双方のドメインにおいて64%超
の配列同一性を有した。
リンカー残基及びCDRH3を除きAVP07−17と80.6%の同一性を有した)、
及びb)3G04(Sandersら、2007年)(これはリンカー残基及びCDRH
3を除きAVP07−17と73.5%の同一性を有した)のpdbファイルに含まれた
。
て、上記に記載される方法でAVP07−17(「未変異の」)ダイアボディを形成した
。モデリングでは、AVP07−17の長いCDRH3ループ長さもまた、鋳型として使
用する相同構造が認められなかったため問題となった。これらは鋳型制約なしにループと
して(本質的にアブイニシオで)モデル化し、モデル化後に構造上の違反を評価した。こ
こに提示するいずれの場合にも、ループがAvibodyの全体的な構造又はフレームワ
ーク領域に影響を及ぼすことはないと考えられたため、CDR3ループは低い信頼水準で
モデル化し、及び一部の分析には含めない。
Avibody二量体の「未変異の」立体配置に相当する。
AVP02−60 Avibody(配列番号61)は、理論的pI/Mw:8.47
/50.1kDaの、VL鎖κ及びサブグループIII VH鎖を有する組換えダイアボ
ディである。これはMUC1遺伝子によりコードされる乳癌関連ムチンを認識する一次マ
ウスモノクローナルC595抗体であるCD227に基づく(Gendlerら、199
0年)。これはムチンのタンパク質コア内のエピトープRPAP(配列中で約40回反復
するモチーフ)を認識する。
ンを含んだ高い同一性スコアを有するいくつかの鋳型が明らかとなった。しかしながら、
CDRH3をモデル化するのに配列の同一性及び長さが十分なVHを有する鋳型は1つの
みであった。従ってVH及びVLモデリング用に2つの鋳型を選択した一方、1つの追加
的な鋳型をVHのみのモデリング用に選択した。選択された鋳型は、a)1MHP VH
及びVL(86.9%の同一性、89.6%の相同性;Karpusasら、2003年
)、b)2B2X VH及びVL(85.7%の同一性、88.3%の相同性;Clar
kら、2006年)及びc)2ADG VH:(86.8%の同一性、96.5%の相同
性;Zhouら、2005年)(これはCDRH3用のギャップなしアラインメントでの
唯一の鋳型であった、このFvのVLドメインはモデリングでは使用しなかった)であっ
た。
を有した。上記に記載される1LMKダイアボディを鋳型Fvの四次空間アラインメント
に使用して、上記に記載される方法でAVP02−60(「未変異の」)ダイアボディを
形成した。
のAvibody二量体の「未変異の」立体配置に相当する。
定及びその分子モデリング
免疫グロブリンVドメインの構造におけるフレームワーク1(FR1)は、2つのβシ
ートの一方の縁端に位置し、そのため、保存されたドメイン間ジスルフィド結合に隣接す
る残基を除いては概して溶媒に十分に露出しているため、システイン置換の操作に好まし
い候補である。従ってこの領域は、ジスルフィドを含有するコンストラクトとのコンジュ
ゲーション化学に自由に利用可能なはずである。
オール化Avibody」と称する。
を典型的トポロジー及び連結度で含む免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであ
る。これらのドメインは、第二に、ドメイン軸の範囲内でBシートの対称性を示すVタイ
プ免疫グロブリン(immmunoglobulin)のメンバーである(Halaby
ら、1999年)。抗体Vタイプ又はVセットドメインは、SCOP(http://s
cop.mrc−lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.c
.b.b.b.html、Murzinら、1995年)、InterPro(http
://www.ebi.ac.uk/interpro/IEntry?ac=IPR0
13106、Hunterら、2009年)及びPfam(http://pfam.s
bc.su.se/family/PF07686、Batemanら、2004年)な
どのオンラインデータベースではVH(1〜4型)、VLκ、VLλドメインに分けられ
る。
において同定されるフレームワーク1内システインペア置換変異の全ての候補をVH(1
〜4型)ドメイン及びVLλドメインの双方に構造的に移すことが可能なはずであると仮
定することは妥当である。
、且つ還元及び続くペイロードとのコンジュゲーションに利用可能である残基ペアについ
て、作成されたAVP04−07のモデルのVLドメインを画像ワークステーションで調
べた。FR1における残基ペアであって、概して互いに向かって傾いた側鎖を有し、概し
て溶媒に露出した側鎖原子を有し、且つ約6〜7Å離れたCα炭素原子を有するペアが、
ジスルフィド結合を形成可能なフレームワーク1内システイン挿入に好ましい候補と考え
られた。
インメント(Gelfandら、1998年a;Gelfandら、1998年b)を生
成した。続いてこれらのアラインメントしたVL及びVHコアを使用して、各未変異Fv
ドメインモデルからのVH及びVLドメインをアラインメントした。この構造アラインメ
ントを、同定されたシステイン変異ペアのVLからVH配列へのマッピングに使用し、次
にそれをVHドメインシステイン挿入変異のモデリングに使用した。いずれの場合も、単
一のモデリング実行を用いて、VL及びVHドメインの各々に単一の類似したシステイン
変異ペアを含む二重システイン挿入変異モデルを作成した。
るために同定されたフレームワーク1システイン挿入位置及び分子モデリング
未変異AVP04−07モデルを、上記のとおりのフレームワーク1内システイン挿入
変異をマッピングするための出発点とした。このマッピングから、同定されたVLシステ
イン挿入位置が、実際にVHドメインに対して構造的に容易にマッピングされ得たこと、
及びこれらの残基がジスルフィド結合を形成する可能性が高いことが示された。
フレームワーク1 VH(Kabat残基1から30を含む)において、フレームワーク
1内システイン挿入に好ましい位置を以下のとおり同定した:
・軽鎖フレームワーク1 Kabat残基L8及びL11(AVP04−50、配列番
号57)
・重鎖フレームワーク1 Kabat残基H7−H10(AVP04−84、配列番号
63)
・軽鎖フレームワーク1 Kabat残基L14及びL17(AVP04−78、配列
番号77)
・重鎖フレームワーク1 Kabat残基H13−H16(AVP04−85、配列番
号75)
しい変異を反映した配列入力を除き同じ入力パラメータを使用してモデリングを繰り返し
た。モデル評価もまたAVP04−07モデルと同様に行った。
Hシステインペア変異を各モデリング実行に含めた。AVP04−07 FR1構造に対
するシステイン挿入モデリングの結果を図4A及び図4Bに示す。図4Bは、ジスルフィ
ド結合が形成された場合にも、操作的フレームワーク1内システイン変異の近傍に構造の
変化がほとんどないことを示している。
異可能な残基ペアを定義する目的において、各システイン変異ペアについての溶媒露出表
面積(ASA)の値は、高度に保存された、且つ構造的に埋もれたシステインペアH22
−H92及びL23−L88より著しく高く、構造的に露出したCDR残基と同程度であ
ったことが示された(図5)。
システイン置換変異を操作するために同定されたフレームワーク1システイン挿入位置及
び分子モデリング
上記に概説されるとおり、全抗体ファミリーにわたるVH(1〜4型)、VLκ、VL
λドメインの間の構造的類似性は公知であり、認められている。この構造的類似性によっ
て、AVP04−07のモデルから同定されたシステイン挿入位置をAVP02−xx及
びAVP07−xxシステイン挿入Avibodyモデルに構造的に移した。
7の位置と同じであり、すなわち以下のとおりであった:
・軽鎖フレームワーク1 Kabat残基L8及びL11(AVP02−101、配列
番号79)
・重鎖フレームワーク1 Kabat残基H7−H10(AVP02−104、配列番
号81)
・軽鎖フレームワーク1 Kabat残基L14及びL17(AVP02−102、配
列番号83)
・重鎖フレームワーク1 Kabat残基H13−H16(AVP02−105、配列
番号85)
07及びAVP07−17のVH I型ドメインと構造的に少し異なるVH III型ド
メインを有する。しかしながら、a)H7及びH10のCα位置が極めて類似していた、
及びb)間にあるH8及びH9残基位置は異なっていたものの、それらの残基の双方とも
が、他のアミノ酸と比べて小さく、且つ柔軟性がより高い残基であるGlyであったため
、AVP04−07システイン挿入の構造移動はなお実現することができた。オンライン
免疫遺伝学データベース;IMGT(http://imgt.cines.fr)によ
り提供されるV遺伝子生殖細胞系列配列に基づけば、ヒト配列の98%がH8にGlyを
有し、48%がH9にGlyを有する。この柔軟性により、H7−H10ジスルフィドを
AVP04−84からAVP02−104に構造的に移すことが可能であった。AVP0
2−60 FR1構造に対するフレームワーク1内システイン挿入/ジスルフィド結合形
成モデリングの結果を図6A及び図6Bに示す。
、VLκを含むAVP04−50 Avibody及びAVP02−101 Avibo
dyの双方に見られるKabat位置L8−L11でのシステイン挿入は、構造的にL7
−L11に移る。従ってAVP07では、好ましいフレームワーク1内システイン挿入位
置は以下のとおり同定された:
・軽鎖フレームワーク1 Kabat残基L7及びL11(AVP07−88、配列番
号87)
・重鎖フレームワーク1 Kabat残基H7−H10(AVP07−90、配列番号
89)
・軽鎖フレームワーク1 Kabat残基L14及びL17(AVP07−89、配列
番号91)
・重鎖フレームワーク1 Kabat残基H13−H16(AVP07−91、配列番
号93)
及びWu、2000年)、上述のとおり付番し直す必要があった。しかしながら構造的に
は、本発明との関連において、VLκ L8−L11はVLλ L7−L11と等価であ
り、残基の欠損はない。これは、図4のAVP04−07 VL FR1と図7のAVP
07−17 VL FR1とのモデルを比較すると明確に認めることができ、これらの特
定の場合に配列における残基の欠失はN末端のシステイン挿入である。
て、AVP02 Avibody(図8)及びAVP07 Avibody(図9)にお
ける各好ましいシステイン挿入についての露出表面積(ASA)の値が、高度に保存され
た、且つ構造的に埋もれた/到達不可能なシステインペアH22−H92及びL23−L
88と比べて著しく高く、構造的に露出したCDR残基と同程度であることが示された。
VH I〜IV型及びVLκ及びVLλに細分化されていた。これらのサブタイプは主と
してそれらのドメインのFR1配列及び構造の違いに基づく(Lefranc、2001
年a;LeFranc、2001年b;Pallares、1999年)。本研究は、こ
の細区分にも関わらず、好ましいジスルフィド挿入位置を、未変異モデルのフレームワー
クを大幅に歪めることなく様々なこれらのサブタイプのモデルに容易に移すことができる
ことを示している。
L/VHサブタイプが、概して上記に概説した好ましいジスルフィド挿入位置を1〜2残
基だけN末端側に(例えばAVP02−103、FR1 H6−H9変異を含む、配列番
号95)又は1〜2残基だけポリペプチド鎖のC末端側に(例えば対応するクローンAV
P07−63(配列番号65)及びAVP07−68(配列番号97)、FR1 L8−
L12を含む)シフトさせることによりフレームワーク1内システイン挿入を置くことの
できる追加的な(代替的な)位置を含んだことを注記する。
挿入に適合すると特定された好ましい及び/又は代替となる位置は全て、実施例1.5に
概説した主要なモデリング制約を満たした。
2.1 フレームワーク1内ジスルフィド挿入を操作しない「未変異の」Avibody
の合成
TAG72に特異的なマウスmAb(配列番号54)、HER2に特異的なヒトmAb
(配列番号58)及びMUC1に特異的なネズミ科動物mAb(配列番号60)のVH及
びVL領域をコードするDNAコンストラクトを適切な制限部位と合成し、GenScr
ipt(Piscataway,NJ,米国)によりpUC57にクローニングした。A
vibodyはV領域のいずれの向きでも、すなわちVH−リンカー−VLでも、及びV
L−リンカー−VHでも単離されているが(Carmichaelら、2003年)、本
明細書に記載される全てのコンストラクトはVH−リンカー−VLとして並べた。
A,米国)から購入した試薬による標準的なプロトコルに従い行った。ダイアボディをコ
ードするDNAコンストラクトをpUC57から適切な制限酵素で切り取り、1%(w/
v)アガロースゲル上で解像し、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen)を使
用してゲルから精製した。コンストラクトを、同様に調製したpET22b発現ベクター
にライゲートし、ライゲーション混合物を電気穿孔法により大腸菌(E.coli)XL
1−Blue細胞に形質転換した。Qiagenミニプレップスピンキットを使用して形
質転換体からミニプレップDNAを抽出し、ダイターミネーターサイクルシーケンシング
キットをAmpliTaqと用いてT7プロモーター及びターミネータープライマーで配
列決定することにより、組換えクローンを同定した。VH−Gly4Ser−VLの向き
の抗TAG72 mAbのV領域を含むクローンをAVP04−07と命名した(配列番
号54)。VH−Gly4Ser−VLの向きの抗HER2 mAbのV領域を含むクロ
ーンをAVP07−17と命名した(配列番号58)。VH−Gly4Ser−VLの向
きの抗MUC1 mAbのV領域を含むクローンをAVP02−60と命名した(配列番
号60)。これらの3つのクローンが基本となる親配列を形成し、これらから他の全ての
チオール化Avibodyを誘導した。
pelBリーダー配列、及びカルボキシ末端(His)6タグ又はカルボキシ末端Myc
+(His)6タグのいずれかの挿入を可能にする。(His)6などのアフィニティー
タグの付加をルーチン的に用いて下流精製プロセスを能率化した。この付加は生物活性上
中立的であることが知られている。
6タグ及びカルボキシ末端Myc+(His)6の双方のバージョンで構築した。この一
例は、Myc+(His)6タグを含むAVP07−63(配列番号64)、及び(Hi
s)6タグのみを含むAVP07−68(配列番号96)である。これらの2つのAvi
bodyは異なるカルボキシ末端タグを有したが、VH及びVL配列は完全に同じで、従
ってこれらの2つのコンストラクトは互換的に使用した。
N末端セリン置換
作成したモデリングデータに基づき、フレームワーク1内操作的システイン挿入変異を
AVP04−07、AVP07−17及びAVP02−60の未変異Avibody配列
に導入し、以下のチオール化Avibodyを形成した:
AVP04−xxファミリー鋳型配列(TAG72特異的):
本明細書において考察されるとおり、Avibody名との関連における記号「xx」
の使用は、同じ系列のAvibodyが多数存在し、記載が当該の系列中の全てのAvi
bodyに関連することを示す。「xx」が特定の数字に置き換えられると、記載がその
数を有するAvibody(本明細書で使用される命名法に基づく)を参照することを示
す。
・AVP04−50ダイアボディ核酸配列(配列番号56)、Kabat残基L8及び
L11が変異したAvibody(配列番号57)を形成する。
・AVP04−51ダイアボディ核酸配列(配列番号98)、Kabat残基L13及
びL19が変異したAvibody(配列番号99)を形成する。
・AVP04−78ダイアボディ核酸配列(配列番号76)、Kabat残基L14及
びL17が変異したAvibody(配列番号77)を形成する。
・AVP04−84ダイアボディ核酸配列(配列番号62)、Kabat残基H7及び
H10が変異したAvibody(配列番号63)を形成する。
・AVP04−85ダイアボディ核酸配列(配列番号74)、Kabat残基H13及
びH16が変異したAvibody(配列番号75)を形成する。
・AVP04−70 scFv核酸配列(配列番号100)、Kabat残基L8及び
L11が変異したAvibody(配列番号101)を形成する。
・AVP04−74トリアボディ核酸配列(配列番号102)、Kabat残基L8及
びL11が変異したAvibody(配列番号103)を形成する。
AVP07−xxファミリー鋳型配列(HER2特異的):
・AVP07−88ダイアボディ核酸配列(配列番号86)、Kabat残基L7及び
L11が変異したAvibody(配列番号87)を形成する。
・AVP07−71 scFv核酸配列(配列番号104)、Kabat残基L8及び
L12が変異したAvibody(配列番号105)を形成する。
・AVP07−63ダイアボディ核酸配列(配列番号64)、Kabat残基L8及び
L12が変異したAvibody(配列番号65)を形成する。
・AVP07−63と同じだが、カルボキシ末端(His)6タグを含み、且つカルボ
キシ末端Myc+(His)6タグを含まないAVP07−68ダイアボディ核酸配列(
配列番号96)、Kabat残基L8及びL12が変異したAvibody(配列番号9
7)を形成する。
AVP02−xxファミリー鋳型配列(MUC1特異的):
・AVP02−101ダイアボディ核酸配列(配列番号78)、Kabat残基L8及
びL11が変異したAvibody(配列番号79)を形成する。
能と示唆されるとおり(実施例1.7を参照のこと)、好ましいフレームワーク1内操作
的システイン挿入変異が、a)VL及びVHドメイン及びその異なるサブタイプの間で機
能的に移すことが可能であり、b)単一の(scFv)又は複数の(ダイアボディ/トリ
アボディ)Fvドメインを含むタンパク質(例えば、Avibody)と適合し、且つc
)好ましいフレームワーク1内ジスルフィド位置のいずれの側への(例えば、+/−1〜
2残基の)移動も、機能を無効にすることなく可能にするのに十分なロバスト性を有する
ことを示すことを例証した。
tratagene)を指示どおりに用いて目的の特定のアミノ酸をコードするヌクレオ
チド配列を変化させることによりシステイン残基を導入した。例としてAVP04−07
Avibodyを用いると、Kabat L8位(FR1 VL領域)のプロリン残基
が配列CCGによりコードされ、Kabat L11位(FR1 VL領域)のロイシン
残基が配列CTGによりコードされる。QuikChange(登録商標)部位特異的突
然変異誘発技法を用いて、これらのヌクレオチド配列を、システインをコードするTGC
に変えた。
イマーとしての所望の変異と鋳型としてのプラスミドDNAとを含む2つの相補的な合成
オリゴヌクレオチドを使用して二本鎖変異PCR産物を合成する。上記の例を用いると、
システイン残基をAVP04−07におけるVL鎖のFR1領域のKabat L8位及
びL11位に導入するため、以下の配列5’−GAT ATC GTG ATG ACC
CAG AGC TGC AGC AGC TGC CCG GTG AGC GTG
GGC GAA AAA G−3’(配列番号106)をフォワードプライマーとして
使用し、5’−C TTT TTC GCC CAC GCT CAC CGG GCA
GCT GCT GCA GCT CTG GGT CAT CAC GAT ATC
−3’(配列番号107)をリバースプライマーとして使用した。配列において以下の条
件を用いて増幅を行った:95℃で30秒間;95℃で30秒間、55℃で30秒間及び
68℃で13分間からなるサイクルを18回;68℃で7分間の最終伸長。鋳型を37℃
で1時間、DpnIで消化した。製造者の指示に従い形質転換体を得て、上記のとおりの
DNA配列決定により同定した。
の手法を用いてタンパク質の天然のN末端残基をセリン残基に置き換えた。N末端セリン
置換は、フレームワーク1内ジスルフィド変異の導入前又は導入後のいずれかに実施した
。AVP04−07のN末端GlnのSer残基との置換に使用した例示的なヌクレオチ
ド配列は、配列番号66及び配列番号67に示される。
記載されるDNA配列に対する他の全ての修飾には、当業者に公知の標準的な分子生物
学的技術を用いた。Avibody配列が、超可変CDR領域の、モデリングデータ(図
5、図8及び図9を参照)により示唆されるとき表面露出する可能性の高い位置に「天然
の」システイン残基を含んだ場合、それらの残基は、本質的に上記のとおりの部位特異的
突然変異誘発により代替的な非チオール含有アミノ酸に変異させた。例として、AVP0
7ファミリーの親クローンであるAVP07−17は、VH CDR3領域内に2つのか
かるシステイン残基、すなわちCys104(Kabat付番H100)及びCys10
9(H100E)を含んだ。これらの残基を、変異原性プライマー配列番号68及び配列
番号69を使用した標準的なQuikchange(登録商標)部位特異的突然変異誘発
を用いてアラニンに置換し、AVP07−86(配列番号109)を形成した。全てのA
VP07−xxチオール化AvibodyはVH CDR3のこの追加的な修飾を含み、
これによりAVP07−xxファミリーがフレームワーク1内ジスルフィド変異戦略に適
合する。
るため、リンカー長さの修飾を伴い生成された。抗体分野の既刊の文献から、リンカーの
組成及び長さを修飾すると、Avibody多量体の形成に影響し得ることが周知されて
いる(Korttら 1997年)。追加の残基をコードする変異原性プライマーを用い
て、ダイアボディ親のリンカー長さを、5残基、典型的にはGGGGS(配列番号135
)から15残基、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号53)に修飾することによ
り、scFv形成の促進を操作した。
可変ドメインの最大2残基を除去することにより、トリアボディ形成を促進した。例えば
、AVP04−74 Avibody(配列番号102)をコードする核酸は、リンカー
領域の代わりに残基「VTVSS−DIVM」を有するトリアボディをコードする。この
クローンは、上記の所望の配列をコードする変異原性プライマーを用いた欠失突然変異誘
発により、親AVP04−50から操作した。
及び精製
製造者の標準的なプロトコル(Stratagene)を用いて、個々のAvibod
yコンストラクトのDNAを化学的にコンピテントな大腸菌(E.coli)BL21細
胞に形質転換した。大腸菌(E.coli)BL21発現株は、例示する全てのAvib
odyについての主要な発現株として機能した。発現には、見込まれる収率要件に応じて
2つの互換的な手法、すなわち細菌振盪フラスコ発現又は細菌流加発酵のいずれかを用い
た。いずれかの方法によるタンパク質Avibodyに対する品質評価から、2つの方法
が相互に代替可能で、タンパク質品質及び特性は同程度であることが明確に示された。
単一の形質転換体コロニーを500mlの2×YT含有1%D−グルコース及び100
μg/mlアンピシリンに接種し、220rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベ
ートした。18Lの同じ培地に一晩培養物を最終OD600が0.1となるよう播種し、
OD600が約0.6〜0.8となるまで30℃でインキュベートした。培養物を12℃
に移し、誘導温度に達するまで振盪を続けた。0.2mMのIPTGを添加してタンパク
質発現を誘導し、培養物を12℃で15時間インキュベートした。10,000×gで遠
心することにより細菌ペレットを調製し、回収して計量し、−20℃で保存した。
地)であった。
500mLの複合培地を含む2Lバッフル付き三角フラスコ中で種培養物を成長させ、
200rpmで振盪しながら16時間、37℃でインキュベートした;複合培地は(1L
当たり)、トリプトン、16g;酵母エキス、5g;NaCl、5g;アンピシリン、2
00mgを含有した。タンパク質発現には限定培地を使用し、この培地は(1L当たり)
、KH2PO4、10.64g;(NH4)2HPO4、4.0g;及びクエン酸一水和
物、1.7g;グルコース 25g;MgSO4.7H2O、1.25g;PTM4微量
塩(trace salt)、5mL;アンピシリン、200mg;チアミン−HCl、
4.4mgを含有した。PTM4微量塩は(1L当たり)、CuSO4.5H2O、2.
0g;NaI、0.08g;MnSO4.H2O、3.0g;NaMoO4.2H2O、
0.2g;H3BO3、0.02g;CoCl2.6H2O、0.5g;ZnCl2、7
.0g;FeSO4.7H2O、22.0g;CaSO4.2H2O、0.5g;H2S
O4、1mLを含有した。全ての培地及び添加剤は、ろ過滅菌したPTM4微量塩、塩酸
チアミン及びアンピシリンを除き、オートクレーブ処理により121℃で30分間滅菌し
た。
rtorius Stedim Biotech,独国)の中でタンパク質発現を完了さ
せた。溶存酸素濃度は、撹拌速度を500〜1,200rpmで、及び曝気速度(5%酸
素を給気)を0.3〜1.5L分−1で自動的に変えることにより、20%に維持した。
必要に応じて空気流の酸素補給量を手動で増加させた。培養物のpHは、10%(v/v
)H3PO4又は10%(v/v)NH3溶液を自動的に添加することにより7.0に制
御し、及び泡は、消泡剤[10%(v/v)ポリプロピレン2025)]を自動的に添加
することにより制御した。特に指定のない限り、容器温度は37℃に維持した。0.25
の出発光学濃度(600nmで計測)に達するよう、バイオリアクターに種培養物を接種
した。
O4.7H2O 22.4g(1L当たり)を含む栄養液(フィード)を40mL時−1
の流量でバイオリアクターに圧送した。フィードの開始2時間後、容器温度を20℃まで
2.5時間の時間をかけて徐々に低下させ(6.8℃時間−1)、その後0.2mMのI
PTGを添加することによりタンパク質発現を誘導し、供給速度を6mL時間−1に下げ
た。誘導12時間後に培養物を回収し、典型的には光学濃度(600nmで計測)は11
0に達し、及び各2L培養物から約330gの湿った細胞ペーストが回収された。
実施した発現手法に関わりなく、Avibodyタンパク質はいずれも、本質的に以下
に概説するとおり精製した。
せて、タンパク質を抽出し、続いて標準的なクロマトグラフ技法により精製した。細菌ペ
レット1グラムにつき5mLのHis−Tagアフィニティークロマトグラフィー溶解緩
衝液(20mM リン酸、500mM NaCl、20mM イミダゾール、0.25m
g/ml リゾチーム、1mM PMSF、50ug/ml DNAseI、pH7.4
)を用いて細胞ペレットを再懸濁した後、機械的に均質化し、次に超音波処理(氷上での
6×30秒パルス)することによるか、或いはEmulsiflex−C5細胞破壊器(
AVESTIN Inc.、カナダ)に3回通すことによって溶解させた。続いて細菌ラ
イセートを室温で1時間インキュベートした後、遠心(16,000×g、30分間)及
びろ過(0.45μmフィルター膜)を行った。
agアフィニティークロマトグラフィー精製を用いてろ過した細菌ライセートからダイア
ボディを精製した。精製の規模に応じて1〜4本の5mL HisTrap(商標)(G
E LifeSciences)粗精製FFカラムを精製のため直列で用いた。ライセー
トを外部P960ポンプを介してHisTrap(商標)カラムに通した。HisTra
p(商標)カラムを10カラム容量のHis−Tagアフィニティークロマトグラフィー
抽出緩衝液(20mM リン酸ナトリウム、500mM NaCl、20mM イミダゾ
ール、pH7.4)で洗浄した。精製したタンパク質を、50%His−Tagアフィニ
ティークロマトグラフィー溶出緩衝液(20mM リン酸ナトリウム、500mM Na
Cl、500mM イミダゾール、pH7.4)及び50%His−Tagアフィニティ
ークロマトグラフィー抽出緩衝液(260mM イミダゾールの最終濃度)で溶出させた
。溶出したタンパク質を含む画分(AKTA Unicornソフトウェアで280mM
吸光度により決定されるとおり)を回収し、プールし、タンパク質濃度を決定し、及び適
切なイオン交換緩衝液で透析した。TAG72特異的AVP04−50(配列番号57)
ダイアボディを使用した典型的なHis−Tagアフィニティークロマトグラフィー溶出
プロファイルを図10Aに示す。本明細書に記載されるAvibodyは全て、同様の溶
出プロファイルを示した。
いて)又はタンパク質のpIより1.0〜1.5pH単位高い(陰イオン交換について)
緩衝液に、部分的に精製したAvibodyを透析した。典型的には、7.0〜8.0の
pIのAvibodyはMES緩衝液(50mM MES、陽イオン交換についてpH6
.0)に透析し、8.0〜9.0のpIのAvibodyはリン酸緩衝液(50mM リ
ン酸、陽イオン交換についてpH7.0)に透析し、及び5.0〜6.5のpIのAvi
bodyはトリス緩衝液(20mMトリス−HCl、陰イオン交換についてpH8)に透
析した。AvibodyのpI値は全て、これらの範囲内に収まった。Avibodyは
200×超の容量の緩衝液に、2時間以上を空けることなく緩衝液を3回交換して透析し
た。透析は、Spectrapor 6−8000Da MWカットオフ透析管を使用し
て4℃で実施した。
ット状にした後イオン交換を行った。イオン交換の実施にはAKTA精製装置10を使用
し、最大2本の5mL HiTrap(商標)SP HPカラムを直列で用いて、清澄化
した透析材料をP960外部ポンプを介してカラムに通過させた。このステップの後、カ
ラムを10カラム容量のイオン交換緩衝液で洗浄してから線形緩衝液勾配(塩勾配)を開
始し、カラムからタンパク質を溶出させた。このプロセスでイオン交換緩衝液は、線形勾
配にわたり同じ緩衝液で交換し、NaClを1Mの最終濃度まで添加した。300mLに
対して600mM NaClの最終濃度で溶出勾配を実施した。
により決定されるとき)に対応する画分をプールし、定量化した。AVP04−50につ
いての典型的なイオン交換溶出プロファイルを図10Bに提供する。AVP04−50ダ
イアボディは、約37mS/cm又は32%Bの塩濃度でルーチン的に溶出し、ここでA
VP04−50の主要な二量体アイソフォーム(矢印)は、電荷及びサイズの変異型と容
易に分離することができた。ダイアボディクローンは、異なるファミリー由来のものであ
っても、塩勾配における同様の時点でルーチン的に溶出された。ある場合には、1×PB
S緩衝液(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4、
1.47mM KH2PO4、pH7.4)中でのキャリブレートされたSuperde
x 200 10/300カラム(GE LifeSciences)を使用した分析的
サイズ排除法を実施して、特定の画分の所望の種又は組成のピークアイデンティティをプ
ールする前に確認した。目的とする主要なアイソフォームを含む溶出画分を、下流精製の
ためプールした。
した。ゲルろ過は、AKTA精製装置10でPBS中のPharmacia Amers
ham(GE LifeSciences)Superdex(登録商標)75 26/
60プレップグレードカラムを使用して実施した。例としてAVP04−50ダイアボデ
ィを用いると、ダイアボディは注入後約140ml(又は53.5分間)で溶出した(図
10C)。ダイアボディ変異型は、AVP04ファミリー内のものも、他のものも、分子
量が約54kDaの任意の球状タンパク質についての予想どおり同様の溶出容量でルーチ
ン的に溶出された。溶出したAVP04−50二量体に対応する、図10Cに輪郭が示さ
れる範囲内の画分をプールし、10K MWCOを備えたAmicon Ultrafr
eeスピンコンセントレータ(Millipore,米国)を3200×g、4℃で使用
して0.5〜3mg/mlに濃縮した。
のゲルろ過クロマトグラフィー法及びSDS−PAGE電気泳動法によりルーチン的に評
価した。例として、AVP04−50の精製方法では、ゲルろ過で単一のクリーンな溶出
ピーク(図10D)を、及びSDS−PAGE電気泳動法で単一の定義された種(図10
E)を生じる純度を有するタンパク質がルーチン的に回収された。
に大きい違いはなかった。図11A〜図11Cは、本明細書に記載され、及び図に示され
るとおりのAvibodyの最終的なサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを取り
上げる。予想どおり、Avibodyファミリー内及び異なるAvibodyファミリー
間の双方における僅かな差異は別として、Avibodyの溶出時間は予想される分子サ
イズと十分に対応した;トリアボディはダイアボディより早く溶出し、ダイアボディはs
cFvより遅く溶出した。本明細書に記載されるAvibodyは全て、機能的に発現さ
せて、実質的に均質となるよう精製することができた。フレームワーク1内システイン置
換変異の存在が、Avibodyを機能的に発現させて実質的に均質となるよう精製する
能力に影響を与えなかったことから、チオール化Avibodyのフレームワーク1内に
操作的システインを置くことが、Avibodyの不安定化につながる有害な構造的コン
ホメーション上の変化を引き起こさなかったことを示唆するモデリングデータが、部分的
に確認された。
可溶性抗原に対する結合活性を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いたカラムシフト
アッセイにより確立した。AVP04−xx Avibodyに対する抗原は、ウシ顎下
腺ムチン(BSM)(Sigma)から可溶形態で利用可能なTAG72である。AVP
07−xx Avibodyについては、可溶性抗原は組換えHER2エクトドメインで
ある。AVP02−xx Avibodyについては、可溶性抗原は組換え完全長MUC
1である。Avibody又は抗原に関わりなく、カラムシフトアッセイは本質的に以下
に記載するとおり実施した。
度で1時間インキュベートした。得られたAvibody−抗原複合体ピークを遊離ダイ
アボディピークと比較することにより、結合活性を決定した。インキュベーション後の遊
離Avibodyに対応するピークの減少、及び/又はAvibody−抗原複合体に対
応するピークのサイズ増加を陽性の結合結果と見なした。Avibody又はAvibo
dy−抗原複合体の溶出プロファイルを、280nmの吸光度によりモニタリングした。
いずれの場合にも、Avibody単独では28〜33分に溶出し、Avibody−抗
原複合体は10〜25分に溶出した。
疫活性を評価し、結果を図12A〜図12Cに示した。いずれの場合にも、ゲルろ過にお
ける溶出時間の大幅な短縮、及び/又は未結合のAvibodyの量の減少から明らかな
とおりの、Avibody−抗原複合体の形成が観察されたことから、Avibodyが
免疫反応性であることが示される。scFv Avibodyは各分子に結合部位を1つ
のみを有し、そのため複数の結合部位を有することで活発な結合性を呈するダイアボディ
及びトリアボディと比べて弱い結合特性を呈するものと予想される。予想どおり、異なる
SECプロファイルにより明らかなとおり、AVP04−70 scFvはダイアボディ
又はトリアボディクローンと比べて安定性が低いAvibody:抗原複合体を形成する
。しかしながら、「未結合の」AVP04−70ピークの減少及びAvibody:抗原
複合体ピークの形成はプロファイル上明らかで、それが免疫反応性であることが示される
。
なかったことから、特異的な結合相互作用が生じたことが示される。
不在が結合を無効にすることはなかったことから、フレームワーク1内システイン置換変
異部位が、Avibodyの機能特性に影響をほとんど又は全く与えない適切な位置で操
作されたことがさらに示される。
チオール化Avibodyをルーチン的に発現させ、実質的に均質になるよう精製し、
及び機能的に活性を有することを示した。チオール化Avibodyにおける操作的フレ
ームワーク1内ジスルフィド架橋の存在、及びその還元に対する利用可能性を、比色アッ
セイにより評価した。
)ホスフィン塩酸塩)(Pierce、Rockford,IL,米国)と共にPBS中
室温で25分間インキュベートした。還元後、100mMリン酸緩衝液+1mMのEDT
A pH6.5で予め平衡化したPD10脱塩カラムによりTCEPを除去し、0.5m
Lの画分を回収した。ピークタンパク質画分をUV分光法により特定し、プールした。
/mL エルマン試薬(5,5’−ジチオ−ビス(2−ニトロ安息香酸);DTNB)(
Pierce、Rockford,Il)を含む100mM リン酸ナトリウム緩衝液、
1mM EDTA、pH8.0に希釈した。反応を周囲温度で15分間進めた。反応性ス
ルフヒドリル濃度を分光法により定量化し、この緩衝系における412nmでのTNBの
モル吸光係数は14,150M−1cm−1と仮定した。スルフヒドリルのモル濃度をダ
イアボディのモル濃度で除すことにより、ダイアボディ当たりの反応性スルフヒドリル基
の推定値を得た。インタクトなIgG及びフレームワーク1内システイン置換変異を含ま
ない非チオール化Avibody(AVP04−07又はAVP02−60のいずれかと
同義)を標準化対照として使用した。
及び不変のKabat H22位とH92位との間の保存されたジスルフィド結合は反応
性を示さず、コンジュゲーションには利用できない。
れたとおり(データは示さず)、還元後に平均して8個の反応性チオールを示した。対照
的に、AVP04−07及びAVP02−60などの対照Avibodyは、一貫して遊
離又は反応性チオールを示さなかった。
L7−L11)にフレームワーク1内システイン置換変異を有するAVP04−xx、A
VP02−xx及びAVP07−xxチオール化Avibodyの一部を示す。いずれの
場合にも、フレームワーク1内システイン置換変異を含む非還元Avibodyが表面上
に有する反応性チオールは0.5個未満であると見られたことから、フレームワーク1内
システイン置換変異が、還元されていない状態では、確かにジスルフィド架橋を形成した
ことを明確に示している。
能であった。還元された状態では、フレームワーク1内システイン置換変異を含む全ての
Avibodyが平均4個の反応性チオールを呈した。
ドコンジュゲーション
チオール化Avibodyにおける操作的フレームワーク1内ジスルフィド架橋の還元
に対する利用可能性から、多数のチオール反応性ペイロードのいずれかを、露出していて
、且つ還元されているシステインとコンジュゲート可能であることが示された。
本明細書に記載されるとおりの還元した操作的フレームワーク1内システインとコンジュ
ゲートした。
24−メトキシ(mal−PEG24−OMe)(Quanta Biodesign、
OH,米国)をAvibody当たり20当量で添加し、4℃で一晩反応させた。ペグ化
後、反応しなかったPEGを十分な透析により除去し、PEG負荷の成功をSDS−PA
GE及び質量分析により判断した。
S−SDS緩衝液(Invitrogen)中のNuPAGE4〜12%ビス−トリスゲ
ルを用いて解像した。得られたタンパク質バンドを、クマシーブルー染色を用いて可視化
した。成功したペグ化は、単量体鎖当たり5kDaの近似質量増加を再現性のある形で示
した(図13A〜図13C)。
s Corporation,米国)を備えたAgilent esiTOF質量分析器
を使用してPEG化Avibodyの質量スペクトルを記録した。このシステムは5%の
CH3CNで1分間平衡化し、続いて5〜95%のアセトニトリルの溶出勾配を9分間に
わたり行った。PEG化Avibodyは、典型的には7分に溶出した。MassHun
terソフトウェアを使用して、生成された関連m/z電荷ピークのデコンボリューショ
ンにより試料の平均質量を決定した。データを表3に報告し、これは質量スペクトルのデ
コンボリューション後に得られた平均単量体鎖Avibody質量を要約する。PEG2
4の式量は1239.44g/molと報告され、従って少なくとも2478.88質量
単位の増加が、操作的システインとの完全なコンジュゲーションを示す。AVP07−7
1、AVP04−50、AVP07−88及びAVP02−101についての典型的な質
量スペクトルの例を、それぞれ図14A〜図14Dに示す。
反応性評価
チオール化Avibodyを発現させて精製することができ、その未変性の(コンジュ
ゲートされていない)状態で免疫反応性であることが示された。上記に報告されるデータ
は、操作的システインとの化学量論的に定義されたコンジュゲーションが高効率で起こっ
ていたことを明確に示した。以下のデータは、フレームワーク1内システイン置換変異を
選択的に還元して小さいチオール反応性ペイロードをコンジュゲートしたとき、免疫活性
が無効にならなかったことを示す。
オール化Avibodyについて、本質的に実施例4に記載のとおり免疫活性を評価した
。
Avibody−抗原複合体形成が観察された(図15A〜図15C)。いずれの場合に
も、Avibody単独では28〜33分間で溶出し、Avibody−抗原複合体は1
0〜25分で溶出した。予想どおり、Avibodyを無関係な抗原と共にインキュベー
トしたときには、複合体形成は観察されなかった。この結果から、チオール化Avibo
dyの還元したフレームワーク1内システイン置換変異に対する比較的小さいペイロード
のコンジュゲーションが、結合性を無効にしないことが示された。
荷は、PEG又はPEG様分子に限定されるものではない。
るPEGコンジュゲートと大きく異なるペイロードとコンジュゲートし得ることを示すた
め、AVP04−50に検出可能標識ユウロピウムのペイロードを負荷した。
N3,N3−ペンタ酢酸(DTPA)(PerkinElmer、Turku,フィンラ
ンド)のEu3+キレートを使用して、製造者の指示に従いAVP04−50の還元した
フレームワーク1内システイン置換変異とコンジュゲートした。簡潔には、タンパク質を
50〜100mMの炭酸水素ナトリウム緩衝液+4mMのEDTA、pH8.5中、3m
g/mlに濃縮した。Eu−DTPAを30倍(Eu−DTPA:タンパク質)モル過剰
で添加してAVP04−50を還元した。4℃で3〜16時間後、反応を完了した。未反
応のEu−DTPAを、トリス−緩衝生理食塩水、pH7.4で予め平衡化したSupe
rdex(登録商標)200 10/300カラムでのゲルろ過によりタンパク質と分離
した。得られた画分の各々をエンハンスメント溶液(PerkinElmer、Turk
u,フィンランド)に希釈し、ユウロピウムカウントについてVictor時間分解蛍光
光度計(flurometer)を使用して評価した。ピークタンパク質画分に対応する
ピークユウロピウムカウントをプールし、0.1%の高純度BSAで安定化させ、及び4
℃で遮光保存した。キットにより供給された100nMのEu標準に対する試料のEuカ
ウントを計算することにより、組み込まれたEu−DTPAの濃度を測定した。
載のとおりの方法により、免疫反応性であることが示された。Eu3+−DTPAをコン
ジュゲートしたAVP04−50は、抗原:Avibody複合体の形成により示される
とおり、BSMに対する特異性を示した。この複合体形成は、Superdex(登録商
標)200 10/300カラムでのゲルろ過クロマトグラフィーにおけるタンパク質溶
出時間の短縮から明らかであった(図16)。
ッセイにより測定した。標識したAvibodyをTAG72陽性細胞系(LS174T
)及び陰性細胞系(SK−OV−3)と共にインキュベートした。インキュベーション期
間後(1時間、周囲温度)、細胞を十分に洗浄し、ユウロピウム活性についてアッセイし
た。ユウロピウム標識したAVP04−50は、SK−OV3(TAG72陰性)細胞系
と比較してLS174T(TAG72陽性)に関する蛍光強度の大幅な増加により示され
るとおり、インタクトな免疫活性及び抗原特異性を示した(図17)。
をチオール化Avibodyにおける操作的フレームワーク1内システイン置換変異に部
位特異的にコンジュゲートすることが可能であることを示唆している。
チオール化Avibody AVP04−50をマウス異種移植モデルにおいてインビ
ボで使用して、チオール化Avibodyのフレームワーク1内操作システイン変異が生
体内安定性又は効力に影響を与えないことを示した。AVP04−50の(125I又は
111In)を用いた生体分布を、「未変異の」親AVP04−07のものと比較した。
標準的なヨードジェン法(Yazakiら、2001年)を用いて、AVP04−07
及びAVP−04−50 Avibodyの125I(Perkin Elmer)によ
る放射性ヨウ素化を実施した。所要量(5〜10μL)のNa125I(26mBq)を
、20μgのヨードジェン(Pierce)により予めコーティングした試験管中の20
0μgのAvibodyに添加した。室温で3分間インキュベートした後、上記のとおり
FPLCによりSuperdex−75又は200カラムを使用して標識材料を精製した
。カラム溶出物を分画して計数し、その後ピーク画分をプールしてインビトロ及びインビ
ボ試験に使用した。放射標識収率は、典型的には80〜100%であった。
る放射標識
AVP04−07をNHS−DOTA[1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン
−1,4,7,10−四酢酸モノ(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)]とコンジ
ュゲートした。AVP04−07及びAVP04−50を、Amicon Centri
con YM−10(10kDa MWCO)遠心ろ過装置(Millipore Co
rp、Bedford,MA,米国)を使用して、4℃、4,000rpmで遠心するこ
とにより(Allegra X15R、SX4750ローター、Beckman Cou
lter)、3〜6mg/mLに濃縮した。金属夾雑物を取り除くため、タンパク質(0
.4mL)を、Biomax限外ろ過膜(Millipore、PBQK02510)を
備えた改良型限外ろ過セルを使用して、14容量のコンジュゲーション緩衝液(0.1M
重炭酸ナトリウム、5mMの9ジエチレントリアミン五酢酸(diethylenetr
iamene pentaacetate)(DTPA)、pH8.5)で2時間透析し
た。プラスマグレードの水(plasmagrade water)(Fisher S
cientific、Waltham,MA,米国)の中で10mg/mL(0.19m
g、250nモル)の19μLのNHS−DOTA(B−280;Macrocycli
cs、Dallas,TX,米国)を、限外ろ過セル中の5倍モル過剰のAvibody
(2.5mg、48nモル)に添加し、室温で1時間撹拌した。続いてタンパク質を14
容量の250mM酢酸ナトリウム、pH7.2で透析し、4℃で保存した。
TX,米国)を使用して、DOTAコンジュゲート化Avibody(AVP04−07
−DOTA及びAVP04−50−DOTA)の放射性金属標識を実施した。典型的な実
験では、19mBqの111InCl2をさらなる0.1MのHClにより希釈し、0.
25Mの酢酸アンモニウム pH7.0(最終pHは5.5に調整)中の125μgのD
OTAコンジュゲート化AVP04−07に添加した。43℃で45分間インキュベート
した後、溶液を0.1mM DTPAに調整して任意の残存111Inを結合させ、室温
でさらに10分間インキュベートした。放射標識収率は、典型的には70〜90%であっ
た。次にSuperdex−75又は200カラムを使用して標識した材料をHPLCに
より精製し、カラム溶出物を分画して計数した。
マウス異種移植モデルのため、6〜8週齢の雌性無胸腺nu/nuマウス(Charl
es River Laboratories)に対してLS−174T細胞(ATCC
)(106個)を側腹部に皮下注射し、腫瘍を試験前の約10日間成長させた。生体分布
試験のため、LS−174T異種移植片を有するマウスに対し、370kBqの125I
標識及び150kBqの111In標識AVP04−07又はAVP04−50(2〜6
μgの総タンパク量)の混合物(200μl)を静脈内注射した。様々な時間点でマウス
(4〜6匹のマウス/群)を安楽死させ、腫瘍、血液及び主要臓器を採取し、計量及び計
数した。カウントは、125Iチャネルにおける111Inカウントの重複について補正
した。放射性核種ごとに組織のグラム当たりの注射量の割合(%ID/g)を計算した。
LS−174T異種移植片を有する無胸腺マウスにおいて125I−及び111In−
DOTA標識Avibodyの生体分布を計測した。
であったことから、モデリングにより定義されるフレームワーク1内ジスルフィド架橋が
Avibody効力を不安定化させることも、又はそれに負の影響を及ぼしたりすること
もなかったことが示唆される(図18A及び図18B)。
し、AVP04−50とAVP04−07とのクリアランスには僅かな差しか認められな
かった。注入後1時間までに約50%が除去され、4時間目で循環中になお約6〜12%
が残存した。このサイズのタンパク質について予想されるとおり、111In標識AVi
bodyについては相当量の腎取り込み(24時間目で>100%ID/g)があったが
、125I標識AVibodyについてはなく、腎臓がクリアランスの主要な経路であっ
たことを実証している。
の早い段階で25%ID/g超が観察され、48時間目にも20%ID/gより多く腫瘍
に残存した。111In−AVP04−50の腫瘍取り込みは、注射後0〜4時間の期間
では111In−AVP04−07の取り込みと一致したが、その後111In−AVP
04−07の取り込みを超え、24時間目に最大腫瘍取り込みの30%ID/g超に達し
た。腫瘍取り込みは、111In−AVP04−07及び111In−AVP04−50
の双方について注射後48時間目で同程度のままであった。111In−AVP04−0
7の腫瘍対血液比は24時間目に>50:1であった。111In−AVP04−50の
場合、腫瘍対血液比は24時間目に>60:1に上昇した。ヨウ素125標識Avibo
dyはいくらか低い腫瘍対血液比及び腫瘍取り込みを示した(AVP04−07について
4時間目及び48時間目にそれぞれ約17%及び10%ID/g、及びAVP04−50
について4時間目及び48時間目にそれぞれ19%及び10%ID/g)。予想どおり、
一部の111Inは脾臓、肝臓及びカーカス(carcass)に貯留し、一方125I標識A
Vibodyはこれらの組織には貯留しなかった。
特異的AvibodyであるAVP07−63(配列番号65)もまた、その非チオール
化親AVP07−17と同程度に生体内で有効であることが示された。
れるとおり(Adamsら 1993年)、クロラミンT法(125I:タンパク質比、
1:10)を用いて125Iで放射標識した。放射性医薬品の品質及び免疫活性は、記載
されるとおり(Adamsら 1993年)、SDS−PAGEにより、及び生細胞結合
アッセイで評価した。6〜8週齢のCB.17 Icr scidマウスに対し、SKO
V3細胞(2.5×106個)を腹部に皮下移植した。腫瘍が50〜200mgのサイズ
に達したとき(約8週)、その飲用水にルゴール液を入れて放射性ヨウ素の甲状腺蓄積を
阻止し、生体分布試験を開始した。各マウスに対し、20マイクログラム(100ml)
の放射性ヨウ素化AVP07−17又はAVP07−63を尾静脈注射により静脈内投与
した。注射後24時間目に、125I−Avibodyを投与されたコホートの5匹のマ
ウスを犠牲にした。組織中(%ID/g)及び血液中(%ID/ml)における各放射性
医薬品の残留の平均値及びSEMを、記載されるとおり(Adamsら 1993年)、
崩壊補正したカウントから決定した。
は、3.0〜3.6%ID/gの範囲で(図19)、極めて類似していることが示された
。チオール化Avibody及び非チオール化Avibodyの腫瘍取り込みは極めて類
似していたが、他の全ての組織では、24時間目のAVP07−63取り込みは有利には
、親の非チオール化AVP07−17の取り込みより少なかった。
安定性又は機能に負の影響を及ぼすことのないフレームワーク1領域のロバスト性を明確
に示している。さらに、好ましいフレームワーク1内ジスルフィド挿入の追加(AVP0
4−50の場合など)は、コアモデリング制約をなお満たす限り、Avibodyの効力
又はジスルフィド形成に影響することなく1〜2残基だけ僅かにシフトさせることができ
る(AVP07−63の場合など)。
異」Avibodyより優れている。
Fv含有タンパク質との部位特異的な、且つ化学量論的に定義されたペイロードコンジ
ュゲーションを可能にするようにジスルフィド挿入変異を設計した。操作的なフレームワ
ーク1内ジスルフィド架橋の挿入は、インビトロ及びインビボの双方でチオール化Avi
bodyの効力に影響しないことが示された。
位特異的及び化学量論的に定義されたペイロードコンジュゲーションが、リジンなどの他
のAvibody表面残基に対するペイロードのランダムコンジュゲーションと比べてイ
ンビボで利点を提供したことを示すため、48−PEGリピートのサイズ単分散ポリエチ
レングリコール(dPEG48、Quanta Biodesign Ltd、OH,米
国)を、操作的フレームワーク1内部位を介してAVP04−50にコンジュゲートした
。この試薬(PEG48−AVP04−50)の生体分布を、PEGが表面リジンにコン
ジュゲートされたAVP04−07のPEGコンジュゲート(PEG3400−AVP0
4−07)で観察されたインビボ生体分布の結果と比較した。
コンジュゲートの生成
NHS−PEG3400−VSを、これまでに記載されるとおり(Liら 2008年
)15:1のモル比及びpH6.0でAVP04−07ダイアボディにコンジュゲートし
た。簡潔には、NHSPEG3400−VS(3.1mg、800nモル)を1mLのp
H7.5 PBS中の2.75mg(50nモル)のダイアボディ(52,500ダルト
ンの二量体分子量に基づく)と混合し、0.1MのNaOHでpHを6.0に調整し、混
合物を室温で2時間反応させた。SDSゲルにより反応をモニタすると、2時間までに7
0%超が完了しているものと思われた。2時間後、反応混合物全体をSuperdex
75カラムに加え、16.3分に溶出したコンジュゲートを回収した。コンジュゲート(
8mL)を10,000kDaカットオフVivaspin(Sartorius St
edim Biotech、独国)において0.35mlに濃縮し、1.4mg(2.7
6μモル)のシステインアミド−DOTAと混合し(Lewisら 1998年)、pH
を8.5に調整し、試料ロータにおいて混合物を室温で17時間反応させた。試料を0.
25Mの酢酸アンモニウムで透析し、10,000kDaカットオフVivaspinで
1〜3mg/Lに濃縮し、無菌ろ過した。得られたコンジュゲートを、本質的に実施例8
.2に記載するとおり111Inで放射標識した。
成
N−FMOC−アミド−PEG48−酸(0.1mモル)を、N−メチルピロリジン/
ジクロロメタン中のDCC/HOBtにより室温で90分間活性化し、DCUをろ去し、
活性化N−FMOC−PEG48−酸をCys−ポリスチレンWang樹脂(0.3mモ
ルcys/g樹脂)と75℃で3分間カップリングした。FMOC基をエタノール/DM
F(13:200、v/v)中の0.5Mピペラジンにより65℃で3分間除去し、DM
F、エタノール、及びDCMで洗浄し、次に上記のとおりトリ−t−ブチル−DOTAの
活性エステル(0.5mモル)とカップリングした。樹脂を5mLのTFA(5%水、5
%トリイソプロピルシラン、5%エタンジチオール)により40℃で60分間処理した。
粗生成物をDCM/ヘキサン(5mL、2:5v/v、5×)で抽出し、−20℃の10
mLのt−ブチルメチルエーテルで沈澱させ、PRP−1カラム(Hamilton、R
eno,NV、10×250mm)において、100%A(0.1TFA、94.9水、
5MeCN)から100%B(0.1TFA、29.9水、70MeCN)への勾配を用
いて15分間にわたり8mL/分の流量でクロマトグラフ処理した。DMF中のDOTA
−PEG48−Cysにビニルスルホン及びトリエチルアミンを添加し、反応混合物をア
ルゴン下室温で23時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、残留物を再度水中に溶解し、G
emini C18カラム(Phenomenex、CA)における逆相HPLCにより
精製し、凍結乾燥した。DOTA−PEG48−Cys−VSをダイアボディと20:1
〜50:1のモル比でコンジュゲートした。簡潔には、AVP04−50をDOTA−P
EG48−Cys−VSに対して記載される比で添加し、0.1NaOHでpHを9.0
に調整した。ロータにおいて混合物を室温で18時間反応させた。試料を0.25Mの酢
酸アンモニウムで透析し、10,000kDaカットオフVivaspin(Sarto
rius Stedim Biotech、独国)において1〜4mg/mLに濃縮し、
無菌ろ過した。アリコートを取り出し、SDS及びIEFゲル電気泳動並びに質量分析法
によりコンジュゲーションを確認した。
体分布
PEG3400を使用した生体分布では、非PEG化AVP04−07と比較して腎取
り込みが大幅に低減した。PEG3400−AVP04−07は24時間目に約8.4%
ID/gの腎取り込みを示した(図20パネルA)。ペグ化による腎取り込みの大幅な低
減は、24時間目に22%ID/gから46%ID/gへの腫瘍取り込みの増加(図18
に示されるとおりの非PEG化AVP04−07と比べたとき)を伴った。腫瘍貯留の増
加は、明らかにPEG化ダイアボディの血中クリアランス(t1/2b、36時間)が非
PEG化ダイアボディ(t1/2b、18時間)と比べて長いことに起因する。
変異に対するPEG化)は、PEG3400−AVP04−07と比べて腫瘍取り込みの
さらなる全般的な向上、より速い血中クリアランス及びより高い腫瘍対血液比を示した(
図20パネルB)。PEG48−AVP04−50の腫瘍取り込みは70%ID/gまで
さらに上昇し、腫瘍対血液比は24時間目に11:1となり、48時間目には19:1の
高さにまで上昇した。
、PEG48−AVP04−50については腫瘍対血液比の向上、より高い腫瘍取り込み
及び許容できる非特異的な腎取り込みが観察されたことから、操作的フレームワーク1内
システイン置換変異に対するペイロードのコンジュゲーションが生体内効力又は機能に影
響しないことが明らかに示された。
ETイメージング
本質的に他に記載されるとおり(Liら 2008年)、比較PETイメージングを実
施した。要約すれば、腫瘍を有するマウスに対し、64Cu標識AVP04−07又はA
VP04−07ダイアボディ−PEGコンジュゲート(リジンにコンジュゲートした)又
はAVP04−50ダイアボディ−PEGコンジュゲート(操作的フレームワーク1内シ
ステイン置換変異にコンジュゲートした)を静脈内注射し、1、4、21〜22、及び4
5〜46時間目に小動物用PETスキャナ(microPET モデルR4;Sieme
ns/CTIMI)で画像化した。マウスはイソフルランで麻酔し、1時間目及び4時間
目の時間点では20分間;21〜22時間目には45分間、及び45〜46時間目には6
0分間走査した。データはフーリエリビニング法を用いて2次元サイノグラムに並べ替え
、走査内放射性崩壊、検出器の不均一性、及び偶発同時ノイズについて補正した。画像は
、反復的オーダードサブセット期待値最大化法(4反復、16サブセット)により再構成
した。
のタンパク質について予想されるとおりの著しい腎取り込みを示した(図21A)。これ
は、上記の図18に報告されるAVP04−07の111In生体分布と同等である。2
7残基のサイズ単分散PEG(可能な最良のインビボ生体分布を提供するよう最適化した
サイズ)をランダム表面AVP04−07リジンに付加すると、腫瘍取り込みが増加し、
且つ腎取り込みが大幅に低下した(図21A)ことによって、全体的な生体分布が劇的に
向上した。
散PEGの部位特異的且つ化学量論的に定義された付加はまた、非PEG化AVP04−
07と比べた生体分布も改良し(図21B)、望ましくない腎取り込みの大幅な低減及び
腫瘍特異的取り込みの全般的な増加を実証した。リジンにPEG化されたAVP04−0
7と操作的チオールにPEG化されたAVP04−50とは、生成されたPET像が極め
て類似していたが、操作的フレームワーク1内システイン置換変異に対する再現性のある
形での部位が定義され、且つ化学量論的に定義されたコンジュゲーションは生体内効力に
負の影響を及ぼすことなくロバストな臨床的利点を提供する。
10.1 実験手順
材料、放射標識、質量分析法
ATCCからLS−174T細胞を入手し、10%熱失活ウシ胎仔血清(FBS)(O
mega Scientific、Tarzana,CA,米国)、1%L−グルタミン
、10mMピルビン酸ナトリウム及び0.1mM非必須アミノ酸を補足したイーグル最小
必須培地1×(EMEM)(Cellgro、Herndon,VA,米国)からなる無
菌成長培地に維持した。Macrocyclics,Inc.、Dallas,TXから
1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリス(酢酸t−ブチル)
−10−酢酸を入手した。Nektar(San Carlos,CA)からNHS−P
EG3400−VS(カタログ番号4M5B0F02)を購入した。Novabioch
em(EMD Biosciences、San Diego,CA)からN−FMOC
−アミド−dPEG−27酸を入手し、Quanta Biodesign Ltd(P
owell,OH)からN−FMOC−アミド−dPEG−12酸を購入した。キレート
コンジュゲート化抗体を、実質的にこれまでに記載されるとおり(Lewisら、199
4年)111In塩化物(Amersham、2〜9mCi/mgのタンパク質)若しく
は64Cu(Washington University School of Me
dicine、10mCi/mgの抗体)で、又はヨードジェン法(実質的にYazak
iら、2001年に記載されるとおり)により125I(Perkin Elmer、3
〜9mCi/mgの抗体)で放射標識した。標識化率はITLC又はサイズ排除クロマト
グラフィー(SEC)によりSuperdex 75又は200カラム(1×30cm、
GE Healthcare)で決定した。放射標識抗体をSECにより同じカラムで精
製した(生理食塩水中、流量0.5mL/分、画分サイズは0.5mLであった)。Ag
ilent 6520四重極飛行時間型液体クロマトグラフィー質量分析装置で質量スペ
クトルを記録した。
抗TAG72ダイアボディをコードする配列を、CC49モノクローナル抗体をコード
する配列から誘導し、大腸菌(E.coli)発現用にコドン最適化した。Vドメインの
向き(VH−VL)が保存され、且つ5残基リンカー(G4S)により連結されたDNA
コンストラクトを設計した。DNA配列を適切な制限部位(NcoI及びNotI)と合
成し、GenScript Corp(Piscataway,NJ,米国)によってp
UC57にクローニングした。配列をNcoI及びNotIによりpUC57から切り取
り(New England Biolabs、Ipswich,MA,米国)、精製し
、pET22b(+)発現ベクター(Novagen、Madison,WI,米国)に
クローニングし、及び大腸菌(E.coli)XL1−Blue(recA1 endA
1 gyrA96 thi−1 hsdR17 supE44 relA1 lac[F
’proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)])(Stratagen
e、La Jolla,CA,米国)に電気穿孔処理した。配列決定により陽性クローン
を同定し、AVP04−07と命名した(このダイアボディをコードする配列は配列番号
54に示す)。
標準的なプロトコルを用いてAVP04−07を大腸菌(E.coli)BL21(D
E3)(F− ompT hsdSB(rB − mB −)gal dcm(DE3))(
Novagen)にサブクローニングした。単一コロニーを使用して1%(v/v)D−
グルコースと100mg/mLアンピシリンとを含有する500mLの2×YTに接種し
、振盪しながら37℃で一晩インキュベートした。18リットルの同じ培地(グルコース
は0.1%に低減)に、最終A600nmが0.1となるよう一晩培養物を播種し、30
℃でインキュベートしてOD600が0.6〜0.8になった時点で培養物を12℃に移
した。0.2mMイソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)(Pro
mega、Madison,WI,米国)を添加してAVP04−07発現を誘導し、培
養物を12℃で一晩インキュベートした。細菌ペレットを遠心により回収し、計量し、精
製まで−20℃で保存した。
(Sigma Aldrich、St Louis,MO,米国)と1mM PMSF(
Sigma)と25U Benzonase(Merck、Darmstadt,独国)
とを含有するHisTrap抽出緩衝液(20mMリン酸塩、500mM NaCl、2
0mMイミダゾール、pH7.4)中に再懸濁し、Misonix S−4000ソニケ
ーター(Misonix、Farmingdale,NY,米国)を使用した音波処理に
より4℃で溶解した。細菌ライセートを37℃で30分間インキュベートした後、遠心(
16,000×g、30分間)及び0.45μmのろ過により清澄化した。発現したAV
P04−07を含有する清澄化ライセートを、AKTA精製装置10(GE Healt
hcare、Uppsala,スウェーデン)を使用した三段階精製法により精製した。
精製FFカラム(2×5mL)(GE Healthcare)に負荷した。未結合のタ
ンパク質をHisTrap抽出緩衝液による洗浄で取り除いた後、HisTrap溶出緩
衝液(20mM リン酸、500mM NaCl、260mM イミダゾール)中でカラ
ムからAVP04−07を溶出した。溶出したAVP04−07を4℃の50mM ME
S、pH6.0で透析し、遠心により全ての沈澱物を除去した。透析したAVP04−0
7を、50mM MES、pH6.0中の予め平衡化したHiTrap SP HPカラ
ム(2×5mL)(GE Healthcare)に負荷した。カラムを50mM ME
S、pH6.0中で洗浄することにより未結合のタンパク質を除去した後、線形的に増加
するNaCl勾配下(0〜600mM NaCl)で50mM MES、pH6.0中の
結合したAVP04−07を溶出した。溶出したAVP04−07ダイアボディを含有す
る画分をプールし、定量化し、濃縮した後、PBS pH7.2中でSuperdex
75(26/60プレップ等級)カラム(GE Healthcare)を使用してサイ
ズ排除クロマトグラフィーに供した。280nmの単一ピークに対応する画分をプールし
、定量化し、約3mg/mLに濃縮し、PBSで透析して4℃で保存した。
精製したAVP04−07について、分析的超遠心法により二量体であることを確認し
た。BeckmanモデルXL−I分析的超遠心機(Fullerton、CA,米国)
を使用して20℃で沈降速度実験を行った。精製したAVP04−07を20mMトリス
、150mM NaCl、pH7.4で透析し、ダブルセクタ石英セルに負荷し、Bec
kman4穴An−60 Tiロータに装着した。AVP04−07及び参照溶液を40
,000rpmのロータ回転数で遠心し、300秒間の時間間隔及び0.003cmの刻
み幅を用いて連続モードでA290nmのデータを収集し、平均化は行わなかった。溶媒
密度(20℃で1.00499g/mL)、溶媒粘度(1.0214cp)の推定値、並
びにAVP04−07の偏比容の推定値を、プログラムSEDNTERPを使用して計算
した。複数の時間点における沈降速度データを、プログラムSEDFITを使用して連続
サイズ分布モデルにフィットさせた。
ウシ顎下腺ムチン(BSM、Aldrich−Sigma(St.Louis,MO)
)に存在する可溶性抗原TAG72を結合するAVP04−07の能力を、カラムシフト
アッセイにより評価した。2つのモル過剰のBSMを55℃に5分間加熱し、遠心により
清澄化してからAVP04−07ダイアボディを添加し、室温で1時間インキュベートし
た。試料をSuperdex 200カラムにおけるゲルろ過により直ちに解像した。溶
出プロファイルを関連する対照と比較することにより、ダイアボディ−抗原複合体の形成
を判断した。
AVP04−07をNHS−DOTA[1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン
−1,4,7,10−四酢酸モノ(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)]にコンジ
ュゲートした。AVP04−07は、Amicon Centricon YM−10(
10kDa MWCO)遠心ろ過装置(Millipore Corp、Bedford
,MA,米国)を使用して、4℃、4,000rpmで遠心することにより(Alleg
ra X15R、SX4750ロータ、Beckman Coulter)、5.8mg
/mLに濃縮した。金属夾雑物を除去するため、タンパク質(0.5mL)を、Biom
ax限外ろ過膜(Millipore、PBQK02510)を備えた改良型限外ろ過セ
ルを使用して14容量のコンジュゲーション緩衝液(0.1M重炭酸ナトリウム、5mM
ジエチレントリアミン五酢酸(diethylenetriamene pentaac
etate)(DTPA)、pH8.5)で2時間透析した。プラスマグレードの水(F
isher Scientific、Waltham,MA,米国)の中で10mg/m
LのNHS−DOTA(B−280;Macrocyclics、Dallas,TX,
米国)を、限外ろ過セル中の15倍モル過剰のAVP04−07に添加し、室温で1時間
撹拌した。続いてタンパク質を14容量の250mM酢酸ナトリウム、pH7.2で透析
し、カセットから取り出し、4℃で保存した。
DOTA−Cys−VS−PEG3400−ダイアボディ。NHS−PEG3400−
VSを、これまでに記載されるとおり(Liら、2008年)、AVP04−07ダイア
ボディに30:1のモル比及びpH6.0でコンジュゲートした。簡潔には、NHS−P
EG3400−VS(3.1mg、800nモル)を1mLのpH7.5 PBS中の2
.75mg(50nモル)のダイアボディと混合し、pHを0.1MのNaOHで6.0
に調整し、混合物を室温で2時間反応させた。反応をSDSゲルによりモニタすると、2
時間が経った時点で70%超が完了したものと思われた。2時間が経った時点で全ての反
応混合物をSuperdex 75カラム(1×30cm、0.5ml/分、Pharm
acia)に加え、16.3分に溶出したコンジュゲートを回収した。コンジュゲート(
8mL)を10,000kDaカットオフVivaspin(Sartorius St
edim Biotech、独国)において0.35mlに濃縮し、1.4mg(2.7
6μモル)のシステインアミド−DOTAと混合し、pHを8.5に調整し、試料ロータ
で混合物を室温で17時間反応させた。試料を0.25M酢酸アンモニウムで透析し、1
0,000kDaカットオフVivaspinで1〜3mg/Lに濃縮し、無菌ろ過した
。コンジュゲートをSDS及びIEFゲル電気泳動により特性決定した。
27−酸(0.1mモル)を、N−メチルピロリジン/ジクロロメタン中のDCC/HO
Btにより室温で90分間活性化し、DCUをろ去し、及び活性化N−FMOC−PEG
酸をCys−ポリスチレンWang樹脂(0.3mモルcys/g樹脂)と75℃で3分
間カップリングした。FMOC基を上記のとおりエタノール/DMF(13:200、v
/v)中の0.5Mピペラジンにより65℃で3分間除去し、DMF、エタノール、及び
DCMにより洗浄し、次にトリ−t−ブチル−DOTA(0.5mモル)の活性エステル
とカップリングした。樹脂を5mLのTFA(5%水、5%トリ−イソプロピルシラン、
5%エタンジチオール)により40℃で60分間処理した。DCM/ヘキサン(5mL、
2:5v/v、5×)で粗生成物を抽出し、−20℃で10mLのt−ブチルメチルエー
テルにより沈澱させ、PRP−1カラム(10×250mm)において100%A(0.
1TFA、94.9水、5MeCN)から100%B(0.1TFA、29.9水、70
MeCN)への勾配を使用して15分間、8mL/分の流量でクロマトグラフ処理した。
DMF中の200μLのDOTA−PEG27−Cys(30mg、16.6μmol)
に対し、ビニルスルホン(12μl、116μmol)及びトリエチルアミン(6μl、
43μmol)を添加し、反応混合物をアルゴン下に室温で23時間撹拌した。溶媒を蒸
発させた後、残基を再び300μlの水に溶解させ、逆相HPLCによりGemini
C18カラム(Phenomenex、CA)で精製し、凍結乾燥した(収率55%)。
DOTA−PEG27−Cys−VSをダイアボディに50:1のモル比でコンジュゲー
トした。簡潔には、2mg(38nモル)のダイアボディ(PBS中2.75mg/mL
)を22μLのDOTA−PEG27−Cys−VS(水中0.175mg/mL、2μ
モル)に添加し、pHを0.1 NaOHで9.0に調整し、混合物をロータにおいて室
温で18時間反応させた。試料を0.25M酢酸アンモニウムで透析し、10,000k
DaカットオフVivaspin(Sartorius stedim biotech
、独国)において1〜4mg/mLに濃縮し、無菌ろ過した。アリコートを取り出し、S
DS及びIEFゲル電気泳動及び質量分析法によりコンジュゲーションを確認した。
のダイアボディとの20:1及び50:1のモル比での合成及びコンジュゲーションを、
上記のとおり実施した。
IEFプレキャストゲル(pH3〜10)(Novex)又はPharmacia P
hastGelのいずれかにおいて製造者の指示どおりに等電点ゲル電気泳動法を実行し
た。
標準的なヨードジェン法(Yazakiら、2001年)を用いてAVP04−07及
びそのコンジュゲートの125I(Perkin Elmer)による放射性ヨウ素化を
実施した。所要量(5〜10μL)のNa 125I(26mBq)を、20μgのヨー
ドジェン(Pierce)で予めコーティングした試験管内の200μgのAVP04−
07に添加した。室温で3分間インキュベートした後、標識された材料をHPLCにより
Superdex−75又は200 10/300 GL FPLCカラム(GE He
althcare)を使用して精製した。カラム溶出物を分画して計数し、その後ピーク
画分をプールしてインビトロ及びインビボ試験に使用した。放射標識収率は、典型的には
80〜100%であった。
米国)又は64CuCl2(Washington University、St.Lo
uis,MO.)を使用してDOTA−AVP04−07の放射性金属標識を実施した。
典型的な実験では、19mBqの111InCl2をさらなる0.1M HClにより希
釈し、0.25Mの酢酸アンモニウム(ammonium actetate) pH7
.0(最終pHは5.5に調整)中の125μgのDOTAコンジュゲート化AVP04
−07に添加した。43℃で45分間インキュベートした後、溶液を0.1mM DTP
Aに調整して任意の残存111Inを結合させ、室温でさらに10分間インキュベートし
た。64Cu標識も同じように実施した。放射標識収率は、典型的には70〜90%であ
った。次に標識された材料をHPLCによりSuperdex−75又は200 10/
300 GL FPLCカラムを使用して精製し、カラム溶出物を分画して計数した。
300 GLカラム(GE Healthcare)を使用して分析した。放射標識タン
パク質(4kBq)を1%HSA/PBSに希釈し、カラムに0.5ml/分で注入した
。フロースルー検出器を使用して放射活性及びUV吸光度を検出した。
6〜8週齢の雌性無胸腺nu/nuマウス(Charles River Labor
atories)に対し、LS−174T細胞(ATCC)(106個)を側腹部に皮下
注射し、試験前の約10日間、腫瘍を成長させた。生体分布試験のため、LS−174T
異種移植片を有するマウスに対し370kBqの125I標識AVP04−07と150
kBqの111In標識AVP04−07との混合物(200μl)(2〜6μgの総タ
ンパク量)を静脈内注射した。様々な時間点でマウスを犠牲にし、腫瘍、血液及び主要臓
器を採取し、計量及び計数した。カウントは、バックグラウンド及び125Iチャネルに
含まれる111Inカウントについて補正した。放射性核種ごとに組織1グラム当たりの
注入量の割合(%ID/g)を計算した。
腫瘍を有するマウス(21〜25g)に64Cu標識ダイアボディ又はダイアボディ−
PEGコンジュゲートを静脈内注射し、小動物用PETスキャナ(microPETモデ
ルR4;Siemens/CTIMI、Knoxvillle,TN)で1.0時間目か
ら始まり、4時間目、21〜22時間目及び45〜46時間目に画像化した。注入した活
性及びタンパク質負荷は、それぞれ63〜169kBq/g及び0.4〜0.7μg/g
の範囲であった。走査の少し前に、マウスをイソフルランで麻酔し、腹臥位に保定し、機
器の視野の中心に置いた。走査時間は、1時間及び4時間の時間点について20分間、2
1〜22時間の時間点について45分間、及び45〜46時間の時間点について60分間
とした。各走査において、microPETのレーザー位置合わせツールを使用して尾の
基部を8.0cm長の視野の軸方向中心から約4.0cmのところに位置決めした。
犠牲にし、腫瘍及び様々な主要な臓器を切除し、計量し、及び計数した。計測した活性は
注射後の放射性崩壊について補正し、各標本について%ID/gを計算した。犠牲時の腫
瘍重量は107〜275mgの範囲であった。
リエリビニング法を用いて二次元サイノグラムに並べ替え、走査内放射性崩壊、検出器の
不均一性及び偶発同時ノイズについて補正した。画像は、反復的オーダードサブセット期
待値最大化(OSEM)法(4反復、16サブセット)により再構成した。
AVP04−07ダイアボディの構築、発現及び特性決定
大腸菌(E.coli)BL21(DE3)においてAVP04−07を可溶性タンパ
ク質として産生し、三段階精製法により精製した。精製した産物は、Superdex
200ゲルろ過カラムから単一種として溶出した。連続質量c(M)分布分析からは、残
留物のランダムな分布及びベストフィットの結果となる統計的パラメータ(すなわち、全
てのrmsd値<0.0054及びRuns検定Z値<14.4)により表されるとおり
、優れたフィットが得られた。AVP04−07のc(M)分布分析からは、それが、見
かけの分子質量が52.5kDaの、単分散二量体(すなわちダイアボディ)として存在
することが示唆される。
セイにより、インビトロで可溶性抗原を結合することが示された。BSMとの関連におい
てその抗原と複合体化したとき、AVP04−07の溶出プロファイルは、AVP04−
07単独の溶出プロファイルから大幅に変化した。主要タンパク質ピークは、精製したA
VP04−07単独での予想される31分の溶出時間と比較して、約16分にカラムから
溶出した。ダイアボディ−抗原複合体の形成を示す同様の溶出時間の短縮は、関連のない
ダイアボディ又は関連のない抗原では認められなかった。
−AVP04−07の生体分布及びイメージング
125I−又は111In−DOTA−AVP04−07を注入したLS174T異種
移植片を有する無胸腺マウスにおいて生体分布を計測した。2つの放射性トレーサーは同
様の方法で血液中から除去し、注入後1時間までに約50%が除去され、4時間目で循環
中になお約10%が残存した(図22A及び図22B)。このサイズのタンパク質につい
て予想されるとおり、111In標識ダイアボディについては相当量の腎取り込み(24
時間目に100%ID/g)があったが、125I標識ダイアボディについてはなく、腎
臓が主要なクリアランス経路であったことを実証している。
の早い段階で25%ID/g超が観察され、48時間目にもなお20%ID/gより多く
腫瘍に残存した。111In−AVP04−07の腫瘍対血液比は24時間目に>50:
1であった。ヨウ素125標識AVP04−07はいくらか低い腫瘍対血液比及び腫瘍取
り込みを示した(4時間目及び48時間目にそれぞれ約17%及び10%ID/g)。予
想どおり、一部の111Inは脾臓、肝臓及びカーカスに貯留し、一方125I−AVP
04−07はこれらの組織には貯留しなかった。
AVP04−07を、本質的にこれまでに記載されるとおり(Liら、2006年)、
DOTA−Cys−VS−PEG3400−NHSにコンジュゲートした。VS−PEG
3400−NHSは、初めにタンパク質の表面リジンに(活性エステルを介して)コンジ
ュゲートし、次に反応性チオールを有する試薬と(ビニルスルホンを介して)反応させる
ことのできるヘテロ二官能性ペグ化剤である。チオール型のDOTA、すなわちDOTA
−Cys(Lewisら、1998年)をVS−PEG3400−AVP04−07にコ
ンジュゲートし、そのコンジュゲートをIEF及びSDSゲル電気泳動により分析した(
図23)。結果は、酸性DOTAが加わったことによるより低いpIへのシフト(IEF
ゲル、図23A)と、PEG3400が加わったことによるより大きい見かけの分子サイ
ズへのシフト(SDSゲル、図23B)とを示す。コンジュゲートを111Inで放射標
識し、Superdex 75でクロマトグラフ処理し、コンジュゲート化していないA
VP04−07と比較した(図23A〜図23B)。コンジュゲート化していないダイア
ボディの50kDaと比較して、PEG3400誘導体の見かけの分子サイズは80kD
aであった。見かけの分子サイズの増加は、ペグ化がタンパク質のストークス半径に影響
を及ぼしたことに起因し得る。
。腎取り込みは、未修飾ダイアボディについて24時間目で98%ID/g(図7A)で
あり、及びPEG化ダイアボディについて24時間目で8.4%ID/g(図22C)で
あった。この腎取り込みの大幅な低減は、24時間目における腫瘍取り込みの23%から
47%ID/gへの増加及び腫瘍/血液比の低下(24時間目に>46:1から2:1)
を伴った。腫瘍貯留の増加は、明らかに、PEG化ダイアボディの血中クリアランス(t
1/2=36時間)が未コンジュゲート化ダイアボディ(t1/2=18時間)と比べて
長いことに起因する。意外にも、腎取り込みの低下は、111In−DOTA−Cys−
VS−PEG3400抗CEA−ダイアボディ(Liら、2006年)で既に認められて
いるもの(Liら、2006年)よりはるかに大きい。
AVP04−07のPEG3400部分とのコンジュゲーションにより所望の腎取り込
みの低下が実現されたが、PEG3400は固有の多分散性を有し、結果として化学的に
容易に特徴付けられる製品を製造できないため、臨床用生成物としては欠点を有し得る。
この点で、ペプチド合成法を用いてヘテロ二官能性試薬に変換することのできるいくつか
の単分散PEG構成要素が市販されている。このカテゴリーで利用可能な最大のPEGの
一つである市販の単分散PEG FMOC−NH−PEG27−酸を使用して、ヘテロ二
官能性単分散ペグ化剤を生成した。初めに標準的なペプチド合成プロトコルによりこのP
EG誘導体の活性エステルをCys−ポリスチレンWang樹脂にカップリングし、FM
OCを除去し、市販のトリ−t−ブチル保護モノ酸誘導体を使用してDOTAにカップリ
ングした。DOTA−PEG27−CysをTFAで樹脂から切断し、精製し、過剰のビ
ニルスルホンと反応させ、逆相HPLCを用いて再度精製した。生成物の合成を図10に
示す。DOTA−PEG27−Cys−VSは予想分子量がPEG3400のほぼ半分の
1928.6であるため、さらなる分子サイズが腎クリアランスにおいて低下をもたらす
のに十分かどうかは明確ではなかった。それにもかかわらず、それをダイアボディの表面
リジンにpH9.5及び50:1のモル比でコンジュゲートした。コンジュゲートをIE
F及びSDSゲル電気泳動により特性決定すると(図8)、pI及び分子サイズの予想さ
れたシフトが観察された。111In及び125I二重放射標識生成物をSuperde
x 75でクロマトグラフ処理し(図24)、主要ピークを補正し、生体分布試験を実施
した。クロマトグラムを調べ、コンジュゲート化していないダイアボディと比較すること
により、PEG3400−ダイアボディ誘導体と同等の見かけの分子サイズのシフトが明
らかである。
誘導体と比較して分子サイズが低いにもかかわらず、ほぼ同等の結果が得られた。24時
間目、111In標識コンジュゲートの腎取り込みは8.3%ID/g、腫瘍取り込みは
49%ID/g、及び腫瘍対血液比は4.2:1であった。PEG27誘導体の意外な好
結果をふまえてPEG12誘導体を作製した。
上記と同じ化学(図25)によりFMOC−NH−PEG12−カルボキシルをDOT
A−PEG12−Cys−VSに変換し、pH9.0で20:1及び50:1のモル比を
用いてAVP04−07にコンジュゲートした。高解像度ナノスプレー質量分析法により
未修飾及び2つのコンジュゲートを分析し、それらの置換度を決定した。未修飾ダイアボ
ディからは、デコンボリューション処理したときにアミノ酸配列からの予測と良好に一致
する質量である26,869の質量計算値が得られる一連のm/z種が得られた。DOT
A−PEG12−Cys−VSに20:1のモル比でコンジュゲートすると、一連のデコ
ンボリューション後ピークが得られ、それらのピークは全て、DOTA−PEG12−C
ys−VSの予想質量である1225質量単位だけ異なった。同様に、質量の差は50:
1モル比のコンジュゲーションについても同じであるが、より高い置換度のほうにシフト
する。この種の反応については予想ガウス分布が得られるため、ピーク高さが、存在する
各種の実際の量に対応すると仮定することは妥当である。ピーク高さを推定値として用い
ると、20:1コンジュゲートについてダイアボディ当たり平均1.7PEG、及び50
:1コンジュゲートについてコンジュゲート当たり平均3.0PEGと推定された。各コ
ンジュゲートを111In(178mBq/mg)で試験標識したとき、20:1コンジ
ュゲートは8.3%の放射標識取り込み、及び50:1は92%の取り込みを示した。こ
れらの結果は、より高い置換度が得られるより高いモル比ほど、放射標識について優れた
結果をもたらすことを示している。
07で生体分布試験を実施した。総じて、腫瘍取り込み及び腎取り込み、血中クリアラン
ス、及び腫瘍対血液比は、PEG3400誘導体及びPEG27誘導体と同等であった(
図26B)。特に腎取り込みは、最初はPEG12においてPEG27コンジュゲートよ
り高かったが(13.4%ID/g)、96時間までにより低いレベル(6.1%ID/
g)に降下した。しかしながら、腫瘍取り込みレベル及び血中クリアランス曲線は2つの
コンジュゲート間でほぼ同じであった。
半減期が13時間の陽電子放射体である64Cuは、PEG化AVP04−07の血中
クリアランス動態(t1/2β=18時間)と良好に適合する。AVP04−07のDO
TA−PEGコンジュゲートに対するPETイメージング特性をLS174T異種移植モ
デルを使用して評価した。図27Aに示される非PEG化ダイアボディについての結果か
ら、2日間のイメージング実験の時間経過にわたる比較的少量の腫瘍取り込み及び極めて
高い腎取り込みが実証される。対照的に、PEG12及び27コンジュゲートは、全体を
通じて比較的少ない腎取り込み及び21〜22時間の早い段階での高い腫瘍取り込みを示
した。PEG27コンジュゲートで計測された腫瘍取り込みは、46時間目の腫瘍につい
て45.1%ID/gで、腫瘍対血液比が7.9:1であり(図27B)、PEG12に
ついての計測された腫瘍取り込みは、46時間目の腫瘍について49±3%ID/gで、
腫瘍対血液比は(9±4):1であった(値は平均値±SDである、n=2)(図27C
)。これらの結果は、111In標識コンジュゲートについての生体分布の結果と緊密に
一致し、放射性金属の選択は生体分布にほとんど影響を与えないことが示唆される。
理想的な放射標識抗体ベースの造影剤の探求では、抗体断片の急速な血中クリアランス
がインタクトなIgGと比べてより早い段階での腫瘍対血液比の改善につながるため、抗
体断片に焦点が置かれた。しかしながら、血中クリアランスを増加させる通常の機序は腎
臓を介した***であり、放射性金属標識断片の場合、腎中の正味蓄積量によりその主要な
利点が消失する。さらに、血中クリアランスの経過が過度に急速であると、腫瘍を標的化
するのに十分な時間がなく、従って十分な画像を得るために高用量の放射標識の投与が必
要となる。ペグ化は魅力的な腎蓄積低減方法である。Yazakiら(2001年)は、
比較的大きい多分散PEG3400を抗CEAダイアボディにコンジュゲートすることに
より、24時間目の腎取り込みを200%ID/gから50%ID/gに低下させること
ができたことを示している。この低下は、大きいものではあるが、なお容認できない腎取
り込みをもたらす。ここでは、ダイアボディをより小さい単分散PEGとPEG化して、
24〜48時間目に12%ID/gを下回るレベルまで腎取り込みを低下させることが可
能であることを初めて実証する。この結果は、いずれのPEG化コンジュゲートも未修飾
ダイアボディより優れていることを実証している。インビボで得られた結果から、以下の
順序のインビボ改良を結論付けることができる:インタクト<<PEG3400<PEG
27<PEG12。
理想的な放射標識抗体ベースの造影剤の探求では、抗体断片の急速な血中クリアランスがインタクトなIgGと比べてより早い段階での腫瘍対血液比の改善につながるため、抗体断片に焦点が置かれた。しかしながら、血中クリアランスを増加させる通常の機序は腎臓を介した***であり、放射性金属標識断片の場合、腎中の正味蓄積量によりその主要な利点が消失する。さらに、血中クリアランスの経過が過度に急速であると、腫瘍を標的化するのに十分な時間がなく、従って十分な画像を得るために高用量の放射標識の投与が必要となる。ペグ化は魅力的な腎蓄積低減方法である。Yazakiら(2001年)は、比較的大きい多分散PEG3400を抗CEAダイアボディにコンジュゲートすることにより、24時間目の腎取り込みを200%ID/gから50%ID/gに低下させることができたことを示している。この低下は、大きいものではあるが、なお容認できない腎取り込みをもたらす。ここでは、ダイアボディをより小さい単分散PEGとPEG化して、24〜48時間目に12%ID/gを下回るレベルまで腎取り込みを低下させることが可能であることを初めて実証する。この結果は、いずれのPEG化コンジュゲートも未修飾ダイアボディより優れていることを実証している。インビボで得られた結果から、以下の順序のインビボ改良を結論付けることができる:インタクト<<PEG3400<PEG27<PEG12。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1]
フレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステイン残基を含む免疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって、前記システイン残基の少なくとも2つが化合物にコンジュゲートされない場合に、前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパク質。
[2]
免疫グロブリン重鎖可変領域(V H )と免疫グロブリン軽鎖可変領域(V L )とを含む単離されたタンパク質であって、前記可変領域の少なくとも1つがフレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステイン残基を含み、前記システイン残基の少なくとも2つが別の化合物にコンジュゲートされない場合に前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、タンパク質。
[3]
前記ジスルフィド結合が非還元条件下で存在する、[1]又は[2]に記載のタンパク質。
[4]
前記システイン残基が、Kabat付番方式により付番して残基2と相補性決定領域(CDR)1との間に位置する、[1]〜[3]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[5]
前記システイン残基がV H 内にあり、且つKabat付番方式による残基2から30の間に位置する、[2]〜[4]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[6]
前記システイン残基が、Kabat付番方式により付番して残基7から20の間及び/又は残基24から30の間に位置する、[5]に記載のタンパク質。
[7]
前記システイン残基が、Kabat付番方式により付番して残基7から20の間に位置する、[6]に記載のタンパク質。
[8]
前記システイン残基がV L 内にあり、且つKabat付番方式により付番して残基2から22の間に位置する、[2]〜[4]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[9]
前記システイン残基が、Kabat付番方式により付番して残基7から20の間に位置する、[8]に記載のタンパク質。
[10]
前記システイン残基が、前記可変領域の前記保存されたシステイン残基に対して追加的なものである、[1]〜[9]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[11]
前記保存されたシステイン残基が、Kabat付番方式により付番して、前記V L において残基23にあり及び/又は前記V H において残基22にある、[10]に記載のタンパク質。
[12]
前記システイン残基が、前記保存されたシステイン残基に対してN末端側に位置する、[10]又は[11]に記載のタンパク質。
[13]
前記システイン残基が、以下:
(i)Kabat付番方式により付番してκ V L の残基8及び残基11;
(ii)Kabat付番方式により付番してκ V L の残基14及び残基17;
(iii)Kabat付番方式により付番してλ V L の残基7及び残基11;
(iv)Kabat付番方式により付番してλ V L の残基14及び残基17;
(v)Kabat付番方式により付番してλ V L の残基8及び残基12;
(vi)Kabat付番方式により付番してV H の残基7及び残基10;
(vii)Kabat付番方式により付番してV H の残基13及び残基16
の1つ又は複数に位置する、[1]〜[12]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[14]
前記システイン残基が、以下:
(i)Kabat付番方式により付番してκ V L の残基13及び残基19;
(ii)Kabat付番方式により付番してλ V L の残基13及び残基19;
(vi)Kabat付番方式により付番してV H の残基6及び残基9;及び/又は
(vii)Kabat付番方式により付番してV H の残基12及び残基18
の1つ又は複数に位置する、[1]〜[12]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[15]
少なくとも1つの[2]〜[14]のいずれか一項に記載のタンパク質を含むFvを含む単離されたタンパク質であって、少なくとも1つのV L が少なくとも1つのV H と結合して抗原結合部位を形成する、タンパク質。
[16]
前記抗原結合部位を形成する前記V L と前記V H とが単一のポリペプチド鎖にある、[15]に記載のタンパク質。
[17]
(i)単鎖Fv断片(scFv);
(ii)二量体scFv(di−scFv);又は
(iii)Fc又は重鎖定常ドメイン(C H )2及び/又はC H 3に連結された(i)及び/又は(ii)の少なくとも1つ
である、[16]に記載のタンパク質。
[18]
前記抗原結合部位を形成する前記V L とV H とが異なるポリペプチド鎖にある、[15]に記載のタンパク質。
[19]
(i)ダイアボディ;
(ii)トリアボディ;又は
(iii)テトラボディ
である、[18]に記載のタンパク質。
[20]
免疫グロブリンである、[18]に記載のタンパク質。
[21]
前記システイン残基がジスルフィド結合によって連結される、[1]〜[20]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[22]
前記システイン残基の少なくとも1つにコンジュゲートした化合物を含む、[1]〜[20]のいずれか一項に記載のタンパク質であって、前記化合物のコンジュゲーションが前記タンパク質の抗原との結合を妨害しない、タンパク質。
[23]
前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される、[22]に記載のタンパク質。
[24]
少なくとも1つのN末端スレオニン残基又はセリン残基をさらに含む、[1]〜[23]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[25]
前記スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした化合物を含む、[24]に記載のタンパク質。
[26]
前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される、[25]に記載のタンパク質。
[27]
前記システイン残基の少なくとも1つにコンジュゲートした第1の化合物と、前記スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした第2の化合物であって、前記第1の化合物と異なる第2の化合物とを含む、[25]又は[26]に記載のタンパク質。
[28]
前記タンパク質が、配列番号57に示される配列と少なくとも約80%同一の配列を含む少なくとも1つのポリペプチドを含み、前記化合物が単分散PEGである、[22]に記載のタンパク質。
[29]
前記単分散PEGが48個以下のエチレングリコール単位を有する、[28]に記載のタンパク質。
[30]
前記単分散PEGが約24個のエチレングリコール単位を有する、[28]又は[29]に記載のタンパク質。
[31]
ヒト上皮成長因子(Her)2、腫瘍関連糖タンパク質TAG72、MUC1又は前立腺特異的膜抗原(PSMA)に特異的に結合する、[1]〜[30]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[32]
フレームワーク領域(FR)1内に位置する2つ以上のシステイン残基を含むように修飾された、配列番号55、59、61又は109のいずれか1つに示される配列と少なくとも約80%同一の配列を含む、[31]に記載のタンパク質。
[33]
配列番号57、63、65、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103又は105、119、121、123、125、127、129、131又は133のいずれか1つ又は複数に示される配列と少なくとも約80%同一の配列を含む、[32]に記載のタンパク質。
[34]
免疫グロブリン重鎖可変領域(V H )と免疫グロブリン軽鎖可変領域(V L )とを含む単離されたタンパク質であって、前記可変領域の少なくとも1つがN末端スレオニン残基又はセリン残基を含む、タンパク質。
[35]
少なくとも1つの[31]に記載のタンパク質を含むFvを含む単離されたタンパク質であって、少なくとも1つのV L が少なくとも1つのV H と結合して抗原結合部位を形成する、タンパク質。
[36]
前記抗原結合部位を形成する前記V L と前記V H とが単一のポリペプチド鎖にある、[35]に記載のタンパク質。
[37]
(i)単鎖Fv断片(scFv);
(ii)二量体scFv(di−scFv);又は
(iii)Fc又は重鎖定常ドメイン(C H )2及び/又はC H 3に連結された(i)及び/又は(ii)の少なくとも1つ
である、[36]に記載のタンパク質。
[38]
前記抗原結合部位を形成する前記V L と前記V H とが異なるポリペプチド鎖にある、[35]に記載のタンパク質。
[39]
(i)ダイアボディ;
(ii)トリアボディ;又は
(iii)テトラボディ
である、[38]に記載のタンパク質。
[40]
免疫グロブリンである、[38]に記載のタンパク質。
[41]
前記スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした化合物をさらに含む、[34]〜[40]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[42]
前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される、[41]に記載のタンパク質。
[43]
前記N末端スレオニン残基又はセリン残基を含むように修飾された、配列番号55、59、61又は109のいずれか1つに示される配列と少なくとも約80%同一の配列を含む、[34]〜[43]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[44]
[1]〜[43]のいずれか一項に記載のタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
[45]
[1]〜[21]、[24]、[31]〜[40][43]のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする単離核酸。
[46]
プロモーターに作動可能に連結された[45]に記載の核酸を含む発現コンストラクト。
[47]
[45]に記載の外因性核酸及び/又は[46]に記載の発現コンストラクトを含む単離細胞であって、前記タンパク質を発現する細胞。
[48]
細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞である、[47]に記載の細胞。
[49]
[1]〜[21]、[24]、[31]〜[40][43]のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、[46]に記載の発現コンストラクトを、前記コードされたタンパク質が作製されるのに十分な条件下に維持するステップを含む方法。
[50]
前記コードされたタンパク質が作製されるのに十分な(sufficient the encoded for the protein to be produced)条件下で[47][48]に記載の細胞を培養するステ
ップを含む、[49]に記載の方法。
[51]
前記タンパク質を単離するステップを含む、[49][50]に記載の方法。
[52]
[22]〜[30]のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、
(i)[1]〜[21]、[24]又は[31]〜[33]のいずれか一項に記載のタンパク質を得るステップと、
(ii)前記タンパク質のFR1における前記システイン残基の少なくとも1つに化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップと、
を含む方法。
[53]
(i)で得られた前記タンパク質における前記システイン残基がジスルフィド結合によって連結され、及び前記方法が、前記化合物を1つ又は複数の前記システイン残基にコンジュゲートする前に、前記ジスルフィド結合を還元するか又はその他の分解するステップをさらに含む、[52]に記載の方法。
[54]
前記ジスルフィド結合を還元するか又はその他の分解するステップにより前記タンパク質に遊離チオール基が生成され、及び前記化合物が、前記化合物の前記タンパク質とのコンジュゲーションを可能にするチオール反応基を有する、[53]に記載の方法。
[55]
前記タンパク質が少なくとも1つのN末端セリン残基又はスレオニン残基を含み、及び前記方法が、化合物を前記セリン残基又はスレオニン残基にコンジュゲートするステップをさらに含む、[52]〜[54]のいずれか一項に記載の方法。
[56]
[26]、[27]又は[41]〜[43]のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、
(i)[24]又は[34]〜[40]のいずれか一項に記載のタンパク質を得るステップと、(ii)前記タンパク質の前記N末端にある少なくとも1つのセリン残基又はスレオニン残基に化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップと、
を含む方法。
[57]
医薬における[1]〜[43]のいずれか一項に記載のタンパク質又は[44]に記載の組成物の使用。
[58]
対象における病態の治療又は予防方法であって、[1]〜[43]のいずれか一項に記載のタンパク質又は[44]に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
[59]
細胞への化合物の送達方法であって、[22]〜[30]、[41]又は[42]のいずれか一項に記載のタンパク質又は[44]に記載の組成物に前記細胞を接触させるステップを含む方法。
[60]
対象に前記タンパク質又は組成物を投与することによって前記細胞を接触させる、[59]に記載の方法。
[61]
対象における抗原を位置特定又は検出する方法であって、
(i)[22]〜[30]、[41]又は[42]のいずれか一項に記載のタンパク質が抗原に結合するのに十分な時間にわたり、且つそのような条件下で、前記タンパク質又は[44]に記載の組成物を対象に投与するステップであって、前記タンパク質が検出可能標識にコンジュゲートされる、ステップと、
(ii)前記検出可能標識をインビボで検出又は位置特定するステップと、
を含む方法。
[62]
対象における病態の診断又は予後判定方法であって、[1]〜[43]のいずれか一項に記載のタンパク質が抗原に結合して複合体を形成するのに十分な時間にわたり、且つそのような条件下で、前記対象からの試料を前記タンパク質又は[44]に記載の組成物と接触させるステップと、前記複合体を検出するステップであって、前記複合体の検出が前記対象における前記病態の診断又は予後判定をもたらすステップとを含む方法。
[63]
前記複合体のレベルを測定するステップであって、前記複合体のレベルの亢進又は低下が、前記対象における前記病態の診断又は予後判定をもたらすステップを含む、[62]に記載の方法。
[64]
免疫グロブリン重鎖可変領域(V H )と免疫グロブリン軽鎖可変領域(V L )との互いの会合を可能にするには不十分な数のアミノ酸を含む領域によって連結された前記V H と前記V L とを各々が含む複数のポリペプチドを含む単離されたタンパク質であって、
(i)前記ポリペプチドの少なくとも1つが、配列番号111に示される配列又はそれと少なくとも約60%同一の配列を含むV H を含み;及び
(ii)少なくとも別の前記ポリペプチドが、配列番号113に示される配列又はそれと少なくとも約60%同一の配列を含むV L を含み、
(i)における前記ポリペプチドの前記V H と(ii)における前記ポリペプチドの前記V L とが会合して、腫瘍抗原TAG−72との特異的な結合能を有するFvを形成する、タンパク質。
[65]
前記V H と前記V L とを連結する前記領域が6個以下のアミノ酸を含む、[64]に記載のタンパク質。
[66]
前記V L が、Kabat付番方式により付番して5位にスレオニン及び/又はKabat付番方式による53位にスレオニン及び/又はKabat付番方式により付番して79位にグルタミン酸を含む、[64]又は[65]に記載のタンパク質。
[67]
前記V H が、Kabat付番方式により付番して80位にロイシンを含む、[64]〜[66]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[68]
(i)配列番号111に示される配列又はそれと少なくとも約60%同一の配列を含むV H と、
(ii)配列番号113に示される配列又はそれと少なくとも約60%同一の配列を含むV L と、
を各々が含む少なくとも2つのポリペプチドを含む、[64]〜[67]のいずれか一項に記載のタンパク質であって、
一つのポリペプチドの前記V H と別のポリペプチドの前記V L とが会合して、TAG72との特異的な結合能を有するFvを形成する、タンパク質。
[69]
ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディである、[64][68]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[70]
(i)前記ポリペプチドの少なくとも1つが、配列番号111に示される配列を含むV H の相補性決定領域(CDR)を含むV H を含み;及び
(ii)少なくとも別の前記ポリペプチドが、配列番号113に示される配列を含むV L のCDRを含むV L を含む、
[64]〜[69]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[71]
(i)配列番号111に示される配列又はそのヒト化若しくは脱免疫化(deimmunized
)形態を含むV H と、
(ii)配列番号113に示される配列又はそのヒト化若しくは脱免疫化形態を含むV L と、
を双方が含む少なくとも2つのポリペプチドを含む、[64][70]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[72]
配列番号55に示される配列と少なくとも80%同一の配列を各々が含む少なくとも2つのポリペプチドを含む、[64]〜[71]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[73]
前記ポリペプチドの少なくとも1つが、フレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステイン残基を含み、前記システイン残基の少なくとも2つが化合物にコンジュゲートされない場合に、前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能である、[64][73]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[74]
前記ポリペプチドの少なくとも1つがN末端セリン残基及び/又はスレオニン残基を含む、[64][73]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[75]
配列番号57、63、75、77、99、101、103、119、121、123、125、127、129、131又は133のいずれか1つ又は複数に示される配列を含む、[73]又は[74]に記載のタンパク質。
[76]
それにコンジュゲートした化合物を含む、[64]〜[75]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[77]
前記化合物が、前記ポリペプチドの少なくとも1つにおけるシステイン残基又はセリン残基又はリジン残基にコンジュゲートされる、[76]に記載のタンパク質。
[78]
前記ポリペプチドの少なくとも1つが、フレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステイン残基を、前記システイン残基の少なくとも2つが化合物にコンジュゲートされない場合に前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能であるように位置して含み、及び/又は、前記ポリペプチドの少なくとも1つがN末端セリン残基及び/又はスレオニン残基を含み、及び前記化合物が前記システイン残基の少なくとも1つ及び/又は前記セリン残基にコンジュゲートされる、[76]又は[77]に記載のタンパク質。
[79]
前記ポリペプチドが前記システイン残基及び前記N末端セリン残基及び/又はスレオニン残基を含み、及び前記化合物が前記システイン残基の少なくとも1つにコンジュゲートされ、場合により異なる化合物が前記セリン残基にコンジュゲートされる、[78]に記載のタンパク質。
[80]
前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群から選択される、[76]〜[79]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[81]
前記化合物が生理学的に許容可能なポリマーである、[76]〜[80]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[82]
前記化合物がポリエチレングリコール(PEG)である、[76]〜[81]のいずれか一項に記載のタンパク質。
[83]
前記PEGが単分散PEGである、[82]に記載のタンパク質。
[84]
前記PEGが4000Da以下の分子量を有する、[82]又は[83]に記載のタンパク質。
[85]
前記PEGが2000Da以下の分子量を有する、[82]〜[84]に記載のタンパク質。
[86]
前記PEGが1,500Da以下の分子量を有する、[82]〜[85]に記載のタンパク質。
[87]
[64]〜[86]のいずれか一項に記載のタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む組成物。
[88]
[64]〜[75]のいずれか一項に記載のタンパク質における前記ポリペプチドの1つ又は複数をコードする単離核酸。
[89]
プロモーターに作動可能に連結された[88]に記載の核酸を含む発現コンストラクト。
[90]
[64]〜[75]のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する単離細胞。
[91]
[88]に記載の核酸及び/又は[89]に記載の発現コンストラクトを含む、[90]に記載の細胞。
[92]
[64]〜[75]のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、[89]に記載の発現コンストラクトを、前記コードされたポリペプチド及び前記タンパク質が作製されるように維持するステップを含む方法。
[93]
前記コードされたタンパク質が作製されるのに十分な(sufficient the encoded for t
he protein to be produced)条件下で[90]又は91に記載の細胞を培養するステ
ップを含む、[92]に記載の方法。
[94]
前記システイン残基の少なくとも1つにコンジュゲートした化合物を含む[76]〜[86]のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、
(i)[73]又は[75]のいずれか1項に記載のタンパク質を得るステップと、
(ii)1つ又は複数の前記ポリペプチドのFR1における前記システイン残基の少なくとも1つに化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップと、
を含む方法。
[95]
N末端セリン残基又はスレオニン残基にコンジュゲートした化合物を含む[78]又は[79]に記載のタンパク質の作製方法であって、
(i)[74]又は[75]に記載のタンパク質を得るステップと、
(ii)前記ポリペプチドのN末端にある少なくとも1つのセリン残基又はスレオニン残基に化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップと、
を含む方法。
[96]
前記化合物がポリエチレングリコール(PEG)である、[94]又は[95]に記載の方法。
[97]
対象における癌を位置特定及び/又は検出及び/又は診断及び/又は予後判定する方法であって、
(i)[64]〜[86]のいずれか一項に記載のタンパク質又は[87]に記載の組成物を、前記タンパク質が存在する場合には腫瘍抗原TAG−72に結合するように、対象に投与するステップと、
(ii)前記TAG72に結合した前記タンパク質をインビボで検出するステップであって、前記結合したタンパク質の検出により前記癌が位置特定及び/又は検出及び/又は診断及び/又は予後判定されるステップと、
を含む方法。
[98]
対象における癌の診断又は予後判定方法であって、
(i)前記対象からの試料を[64]〜[86]のいずれか一項に記載のタンパク質又は[87]に記載の組成物と、前記タンパク質が存在する場合には腫瘍抗原TAG−72に結合するように接触させるステップと、
(ii)前記TAG72に結合した前記タンパク質を検出するステップであって、前記結合したタンパク質の検出が前記癌の診断又は予後判定をもたらすステップと、
を含む方法。
[99]
前記タンパク質が検出可能標識にコンジュゲートされ、及び前記方法が、TAG72に結合した前記タンパク質を検出するために前記標識を検出するステップを含む、[97]又は[98]に記載の方法。
[100]
癌の治療方法であって、[64]〜[86]のいずれか一項に記載のタンパク質又は[87]に記載の組成物を、それが癌細胞上の腫瘍抗原TAG−72に結合して前記癌を治療するように投与するステップを含む方法。
[101]
前記タンパク質又はそれにコンジュゲートした化合物が前記癌細胞の死滅を誘導する、[100]に記載の方法。
[102]
前記タンパク質が、前記癌細胞の死滅を誘導する化合物にコンジュゲートされる、[100]又は[101]に記載の方法。
Claims (102)
- フレームワーク領域(FR)1内に位置する少なくとも2つのシステイン残基を含む免
疫グロブリン可変領域を含む単離されたタンパク質であって、前記システイン残基の少な
くとも2つが化合物にコンジュゲートされない場合に、前記システイン残基間にジスルフ
ィド結合が形成可能である、タンパク質。 - 免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)とを含む
単離されたタンパク質であって、前記可変領域の少なくとも1つがフレームワーク領域(
FR)1内に位置する少なくとも2つのシステイン残基を含み、前記システイン残基の少
なくとも2つが別の化合物にコンジュゲートされない場合に前記システイン残基間にジス
ルフィド結合が形成可能である、タンパク質。 - 前記ジスルフィド結合が非還元条件下で存在する、請求項1又は2に記載のタンパク質
。 - 前記システイン残基が、Kabat付番方式により付番して残基2と相補性決定領域(
CDR)1との間に位置する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記システイン残基がVH内にあり、且つKabat付番方式による残基2から30の
間に位置する、請求項2〜4のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記システイン残基が、Kabat付番方式により付番して残基7から20の間及び/
又は残基24から30の間に位置する、請求項5に記載のタンパク質。 - 前記システイン残基が、Kabat付番方式により付番して残基7から20の間に位置
する、請求項6に記載のタンパク質。 - 前記システイン残基がVL内にあり、且つKabat付番方式により付番して残基2か
ら22の間に位置する、請求項2〜4のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記システイン残基が、Kabat付番方式により付番して残基7から20の間に位置
する、請求項8に記載のタンパク質。 - 前記システイン残基が、前記可変領域の前記保存されたシステイン残基に対して追加的
なものである、請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記保存されたシステイン残基が、Kabat付番方式により付番して、前記VLにお
いて残基23にあり及び/又は前記VHにおいて残基22にある、請求項10に記載のタ
ンパク質。 - 前記システイン残基が、前記保存されたシステイン残基に対してN末端側に位置する、
請求項10又は11に記載のタンパク質。 - 前記システイン残基が、以下:
(i)Kabat付番方式により付番してκ VLの残基8及び残基11;
(ii)Kabat付番方式により付番してκ VLの残基14及び残基17;
(iii)Kabat付番方式により付番してλ VLの残基7及び残基11;
(iv)Kabat付番方式により付番してλ VLの残基14及び残基17;
(v)Kabat付番方式により付番してλ VLの残基8及び残基12;
(vi)Kabat付番方式により付番してVHの残基7及び残基10;
(vii)Kabat付番方式により付番してVHの残基13及び残基16
の1つ又は複数に位置する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記システイン残基が、以下:
(i)Kabat付番方式により付番してκ VLの残基13及び残基19;
(ii)Kabat付番方式により付番してλ VLの残基13及び残基19;
(vi)Kabat付番方式により付番してVHの残基6及び残基9;及び/又は
(vii)Kabat付番方式により付番してVHの残基12及び残基18
の1つ又は複数に位置する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 少なくとも1つの請求項2〜14のいずれか一項に記載のタンパク質を含むFvを含む
単離されたタンパク質であって、少なくとも1つのVLが少なくとも1つのVHと結合し
て抗原結合部位を形成する、タンパク質。 - 前記抗原結合部位を形成する前記VLと前記VHとが単一のポリペプチド鎖にある、請
求項15に記載のタンパク質。 - (i)単鎖Fv断片(scFv);
(ii)二量体scFv(di−scFv);又は
(iii)Fc又は重鎖定常ドメイン(CH)2及び/又はCH3に連結された(i)
及び/又は(ii)の少なくとも1つ
である、請求項16に記載のタンパク質。 - 前記抗原結合部位を形成する前記VLとVHとが異なるポリペプチド鎖にある、請求項
15に記載のタンパク質。 - (i)ダイアボディ;
(ii)トリアボディ;又は
(iii)テトラボディ
である、請求項18に記載のタンパク質。 - 免疫グロブリンである、請求項18に記載のタンパク質。
- 前記システイン残基がジスルフィド結合によって連結される、請求項1〜20のいずれ
か一項に記載のタンパク質。 - 前記システイン残基の少なくとも1つにコンジュゲートした化合物を含む、請求項1〜
20のいずれか一項に記載のタンパク質であって、前記化合物のコンジュゲーションが前
記タンパク質の抗原との結合を妨害しない、タンパク質。 - 前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペ
プチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれ
らの混合物からなる群から選択される、請求項22に記載のタンパク質。 - 少なくとも1つのN末端スレオニン残基又はセリン残基をさらに含む、請求項1〜23
のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした化合物を含む、請求項24に
記載のタンパク質。 - 前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペ
プチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれ
らの混合物からなる群から選択される、請求項25に記載のタンパク質。 - 前記システイン残基の少なくとも1つにコンジュゲートした第1の化合物と、前記スレ
オニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした第2の化合物であって、前記第1の化合
物と異なる第2の化合物とを含む、請求項25又は26に記載のタンパク質。 - 前記タンパク質が、配列番号57に示される配列と少なくとも約80%同一の配列を含
む少なくとも1つのポリペプチドを含み、前記化合物が単分散PEGである、請求項22
に記載のタンパク質。 - 前記単分散PEGが48個以下のエチレングリコール単位を有する、請求項28に記載
のタンパク質。 - 前記単分散PEGが約24個のエチレングリコール単位を有する、請求項28又は29
に記載のタンパク質。 - ヒト上皮成長因子(Her)2、腫瘍関連糖タンパク質TAG72、MUC1又は前立
腺特異的膜抗原(PSMA)に特異的に結合する、請求項1〜30のいずれか一項に記載
のタンパク質。 - フレームワーク領域(FR)1内に位置する2つ以上のシステイン残基を含むように修
飾された、配列番号55、59、61又は109のいずれか1つに示される配列と少なく
とも約80%同一の配列を含む、請求項31に記載のタンパク質。 - 配列番号57、63、65、75、77、79、81、83、85、87、89、91
、93、95、97、99、101、103又は105、119、121、123、12
5、127、129、131又は133のいずれか1つ又は複数に示される配列と少なく
とも約80%同一の配列を含む、請求項32に記載のタンパク質。 - 免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)とを含む
単離されたタンパク質であって、前記可変領域の少なくとも1つがN末端スレオニン残基
又はセリン残基を含む、タンパク質。 - 少なくとも1つの請求項31に記載のタンパク質を含むFvを含む単離されたタンパク
質であって、少なくとも1つのVLが少なくとも1つのVHと結合して抗原結合部位を形
成する、タンパク質。 - 前記抗原結合部位を形成する前記VLと前記VHとが単一のポリペプチド鎖にある、請
求項35に記載のタンパク質。 - (i)単鎖Fv断片(scFv);
(ii)二量体scFv(di−scFv);又は
(iii)Fc又は重鎖定常ドメイン(CH)2及び/又はCH3に連結された(i)
及び/又は(ii)の少なくとも1つ
である、請求項36に記載のタンパク質。 - 前記抗原結合部位を形成する前記VLと前記VHとが異なるポリペプチド鎖にある、請
求項35に記載のタンパク質。 - (i)ダイアボディ;
(ii)トリアボディ;又は
(iii)テトラボディ
である、請求項38に記載のタンパク質。 - 免疫グロブリンである、請求項38に記載のタンパク質。
- 前記スレオニン残基又はセリン残基にコンジュゲートした化合物をさらに含む、請求項
34〜40のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペ
プチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれ
らの混合物からなる群から選択される、請求項41に記載のタンパク質。 - 前記N末端スレオニン残基又はセリン残基を含むように修飾された、配列番号55、5
9、61又は109のいずれか1つに示される配列と少なくとも約80%同一の配列を含
む、請求項34〜43のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 請求項1〜43のいずれか一項に記載のタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む
組成物。 - 請求項1〜21、24、31〜40又は43のいずれか一項に記載のタンパク質をコー
ドする単離核酸。 - プロモーターに作動可能に連結された請求項45に記載の核酸を含む発現コンストラク
ト。 - 請求項45に記載の外因性核酸及び/又は請求項46に記載の発現コンストラクトを含
む単離細胞であって、前記タンパク質を発現する細胞。 - 細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞である、請求項47に記載の細胞。
- 請求項1〜21、24、31〜40又は43のいずれか一項に記載のタンパク質の作製
方法であって、請求項46に記載の発現コンストラクトを、前記コードされたタンパク質
が作製されるのに十分な条件下に維持するステップを含む方法。 - 前記コードされたタンパク質が作製されるのに十分な(sufficient the encoded for t
he protein to be produced)条件下で請求項47又は48に記載の細胞を培養するステ
ップを含む、請求項49に記載の方法。 - 前記タンパク質を単離するステップを含む、請求項49又は50に記載の方法。
- 請求項22〜30のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、
(i)請求項1〜21、24又は31〜33のいずれか一項に記載のタンパク質を得るス
テップと、
(ii)前記タンパク質のFR1における前記システイン残基の少なくとも1つに化合物
をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製するステップ
と、
を含む方法。 - (i)で得られた前記タンパク質における前記システイン残基がジスルフィド結合によ
って連結され、及び前記方法が、前記化合物を1つ又は複数の前記システイン残基にコン
ジュゲートする前に、前記ジスルフィド結合を還元するか又はその他の分解するステップ
をさらに含む、請求項52に記載の方法。 - 前記ジスルフィド結合を還元するか又はその他の分解するステップにより前記タンパク
質に遊離チオール基が生成され、及び前記化合物が、前記化合物の前記タンパク質とのコ
ンジュゲーションを可能にするチオール反応基を有する、請求項53に記載の方法。 - 前記タンパク質が少なくとも1つのN末端セリン残基又はスレオニン残基を含み、及び
前記方法が、化合物を前記セリン残基又はスレオニン残基にコンジュゲートするステップ
をさらに含む、請求項52〜54のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項26、27又は41〜43のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であっ
て、
(i)請求項24又は34〜40のいずれか一項に記載のタンパク質を得るステップと、
(ii)前記タンパク質の前記N末端にある少なくとも1つのセリン残基又はスレオニン
残基に化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製
するステップと、
を含む方法。 - 医薬における請求項1〜43のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項44に記載
の組成物の使用。 - 対象における病態の治療又は予防方法であって、請求項1〜43のいずれか一項に記載
のタンパク質又は請求項44に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与するステッ
プを含む方法。 - 細胞への化合物の送達方法であって、請求項22〜30、41又は42のいずれか一項
に記載のタンパク質又は請求項44に記載の組成物に前記細胞を接触させるステップを含
む方法。 - 対象に前記タンパク質又は組成物を投与することによって前記細胞を接触させる、請求
項59に記載の方法。 - 対象における抗原を位置特定又は検出する方法であって、
(i)請求項22〜30、41又は42のいずれか一項に記載のタンパク質が抗原に結合
するのに十分な時間にわたり、且つそのような条件下で、前記タンパク質又は請求項44
に記載の組成物を対象に投与するステップであって、前記タンパク質が検出可能標識にコ
ンジュゲートされる、ステップと、
(ii)前記検出可能標識をインビボで検出又は位置特定するステップと、
を含む方法。 - 対象における病態の診断又は予後判定方法であって、請求項1〜43のいずれか一項に
記載のタンパク質が抗原に結合して複合体を形成するのに十分な時間にわたり、且つその
ような条件下で、前記対象からの試料を前記タンパク質又は請求項44に記載の組成物と
接触させるステップと、前記複合体を検出するステップであって、前記複合体の検出が前
記対象における前記病態の診断又は予後判定をもたらすステップとを含む方法。 - 前記複合体のレベルを測定するステップであって、前記複合体のレベルの亢進又は低下
が、前記対象における前記病態の診断又は予後判定をもたらすステップを含む、請求項6
2に記載の方法。 - 免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)との互い
の会合を可能にするには不十分な数のアミノ酸を含む領域によって連結された前記VHと
前記VLとを各々が含む複数のポリペプチドを含む単離されたタンパク質であって、
(i)前記ポリペプチドの少なくとも1つが、配列番号111に示される配列又はそれと
少なくとも約60%同一の配列を含むVHを含み;及び
(ii)少なくとも別の前記ポリペプチドが、配列番号113に示される配列又はそれと
少なくとも約60%同一の配列を含むVLを含み、
(i)における前記ポリペプチドの前記VHと(ii)における前記ポリペプチドの前
記VLとが会合して、腫瘍抗原TAG−72との特異的な結合能を有するFvを形成する
、タンパク質。 - 前記VHと前記VLとを連結する前記領域が6個以下のアミノ酸を含む、請求項64に
記載のタンパク質。 - 前記VLが、Kabat付番方式により付番して5位にスレオニン及び/又はKaba
t付番方式による53位にスレオニン及び/又はKabat付番方式により付番して79
位にグルタミン酸を含む、請求項64又は65に記載のタンパク質。 - 前記VHが、Kabat付番方式により付番して80位にロイシンを含む、請求項64
〜66のいずれか一項に記載のタンパク質。 - (i)配列番号111に示される配列又はそれと少なくとも約60%同一の配列を含む
VHと、
(ii)配列番号113に示される配列又はそれと少なくとも約60%同一の配列を含
むVLと、
を各々が含む少なくとも2つのポリペプチドを含む、請求項64〜67のいずれか一項に
記載のタンパク質であって、
一つのポリペプチドの前記VHと別のポリペプチドの前記VLとが会合して、TAG7
2との特異的な結合能を有するFvを形成する、タンパク質。 - ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディである、請求項64〜68のいずれか一
項に記載のタンパク質。 - (i)前記ポリペプチドの少なくとも1つが、配列番号111に示される配列を含むV
Hの相補性決定領域(CDR)を含むVHを含み;及び
(ii)少なくとも別の前記ポリペプチドが、配列番号113に示される配列を含むV
LのCDRを含むVLを含む、
請求項64〜69のいずれか一項に記載のタンパク質。 - (i)配列番号111に示される配列又はそのヒト化若しくは脱免疫化(deimmunized
)形態を含むVHと、
(ii)配列番号113に示される配列又はそのヒト化若しくは脱免疫化形態を含むV
Lと、
を双方が含む少なくとも2つのポリペプチドを含む、請求項64〜70のいずれか一項に
記載のタンパク質。 - 配列番号55に示される配列と少なくとも80%同一の配列を各々が含む少なくとも2
つのポリペプチドを含む、請求項64〜71のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記ポリペプチドの少なくとも1つが、フレームワーク領域(FR)1内に位置する少
なくとも2つのシステイン残基を含み、前記システイン残基の少なくとも2つが化合物に
コンジュゲートされない場合に、前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能で
ある、請求項64〜73のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 前記ポリペプチドの少なくとも1つがN末端セリン残基及び/又はスレオニン残基を含
む、請求項64〜73のいずれか一項に記載のタンパク質。 - 配列番号57、63、75、77、99、101、103、119、121、123、
125、127、129、131又は133のいずれか1つ又は複数に示される配列を含
む、請求項73又は74に記載のタンパク質。 - それにコンジュゲートした化合物を含む、請求項64〜75のいずれか一項に記載のタ
ンパク質。 - 前記化合物が、前記ポリペプチドの少なくとも1つにおけるシステイン残基又はセリン
残基又はリジン残基にコンジュゲートされる、請求項76に記載のタンパク質。 - 前記ポリペプチドの少なくとも1つが、フレームワーク領域(FR)1内に位置する少
なくとも2つのシステイン残基を、前記システイン残基の少なくとも2つが化合物にコン
ジュゲートされない場合に前記システイン残基間にジスルフィド結合が形成可能であるよ
うに位置して含み、及び/又は、前記ポリペプチドの少なくとも1つがN末端セリン残基
及び/又はスレオニン残基を含み、及び前記化合物が前記システイン残基の少なくとも1
つ及び/又は前記セリン残基にコンジュゲートされる、請求項76又は77に記載のタン
パク質。 - 前記ポリペプチドが前記システイン残基及び前記N末端セリン残基及び/又はスレオニ
ン残基を含み、及び前記化合物が前記システイン残基の少なくとも1つにコンジュゲート
され、場合により異なる化合物が前記セリン残基にコンジュゲートされる、請求項78に
記載のタンパク質。 - 前記化合物が、放射性同位体、検出可能標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペ
プチド、タンパク質、対象における前記タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれ
らの混合物からなる群から選択される、請求項76〜79のいずれか一項に記載のタンパ
ク質。 - 前記化合物が生理学的に許容可能なポリマーである、請求項76〜80のいずれか一項
に記載のタンパク質。 - 前記化合物がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項76〜81のいずれか
一項に記載のタンパク質。 - 前記PEGが単分散PEGである、請求項82に記載のタンパク質。
- 前記PEGが4000Da以下の分子量を有する、請求項82又は83に記載のタンパ
ク質。 - 前記PEGが2000Da以下の分子量を有する、請求項82〜84に記載のタンパク
質。 - 前記PEGが1,500Da以下の分子量を有する、請求項82〜85に記載のタンパ
ク質。 - 請求項64〜86のいずれか一項に記載のタンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含
む組成物。 - 請求項64〜75のいずれか一項に記載のタンパク質における前記ポリペプチドの1つ
又は複数をコードする単離核酸。 - プロモーターに作動可能に連結された請求項88に記載の核酸を含む発現コンストラク
ト。 - 請求項64〜75のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する単離細胞。
- 請求項88に記載の核酸及び/又は請求項89に記載の発現コンストラクトを含む、請
求項90に記載の細胞。 - 請求項64〜75のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、請求項89
に記載の発現コンストラクトを、前記コードされたポリペプチド及び前記タンパク質が作
製されるように維持するステップを含む方法。 - 前記コードされたタンパク質が作製されるのに十分な(sufficient the encoded for t
he protein to be produced)条件下で請求項90又は91に記載の細胞を培養するステ
ップを含む、請求項92に記載の方法。 - 前記システイン残基の少なくとも1つにコンジュゲートした化合物を含む請求項76〜
86のいずれか一項に記載のタンパク質の作製方法であって、
(i)請求項73又は75のいずれか1項に記載のタンパク質を得るステップと、
(ii)1つ又は複数の前記ポリペプチドのFR1における前記システイン残基の少なく
とも1つに化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を
作製するステップと、
を含む方法。 - N末端セリン残基又はスレオニン残基にコンジュゲートした化合物を含む請求項78又
は79に記載のタンパク質の作製方法であって、
(i)請求項74又は75に記載のタンパク質を得るステップと、
(ii)前記ポリペプチドのN末端にある少なくとも1つのセリン残基又はスレオニン残
基に化合物をコンジュゲートするステップであって、それにより前記タンパク質を作製す
るステップと、
を含む方法。 - 前記化合物がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項94又は95に記載の
方法。 - 対象における癌を位置特定及び/又は検出及び/又は診断及び/又は予後判定する方法
であって、
(i)請求項64〜86のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項87に記載の組成
物を、前記タンパク質が存在する場合には腫瘍抗原TAG−72に結合するように、対象
に投与するステップと、
(ii)前記TAG72に結合した前記タンパク質をインビボで検出するステップであっ
て、前記結合したタンパク質の検出により前記癌が位置特定及び/又は検出及び/又は診
断及び/又は予後判定されるステップと、
を含む方法。 - 対象における癌の診断又は予後判定方法であって、
(i)前記対象からの試料を請求項64〜86のいずれか一項に記載のタンパク質又は請
求項87に記載の組成物と、前記タンパク質が存在する場合には腫瘍抗原TAG−72に
結合するように接触させるステップと、
(ii)前記TAG72に結合した前記タンパク質を検出するステップであって、前記結
合したタンパク質の検出が前記癌の診断又は予後判定をもたらすステップと、
を含む方法。 - 前記タンパク質が検出可能標識にコンジュゲートされ、及び前記方法が、TAG72に
結合した前記タンパク質を検出するために前記標識を検出するステップを含む、請求項9
7又は98に記載の方法。 - 癌の治療方法であって、請求項64〜86のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求
項87に記載の組成物を、それが癌細胞上の腫瘍抗原TAG−72に結合して前記癌を治
療するように投与するステップを含む方法。 - 前記タンパク質又はそれにコンジュゲートした化合物が前記癌細胞の死滅を誘導する、
請求項100に記載の方法。 - 前記タンパク質が、前記癌細胞の死滅を誘導する化合物にコンジュゲートされる、請求
項100又は101に記載の方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6136311A (en) | 1996-05-06 | 2000-10-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Treatment and diagnosis of cancer |
US8940871B2 (en) | 2006-03-20 | 2015-01-27 | The Regents Of The University Of California | Engineered anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting |
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EP2448966B1 (en) * | 2009-07-03 | 2018-11-14 | Avipep Pty Ltd | Immuno-conjugates and methods for producing them |
CA3040276A1 (en) | 2009-12-02 | 2011-06-09 | Imaginab, Inc. | J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use |
SG181814A1 (en) | 2009-12-23 | 2012-07-30 | Avipep Pty Ltd | Immuno-conjugates and methods for producing them 2 |
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AU2012301793A1 (en) | 2011-08-30 | 2014-03-20 | Quanta Biodesign, Ltd. | Branched discrette PEG constructs |
US10112988B2 (en) | 2012-01-09 | 2018-10-30 | Icb International, Inc. | Methods of assessing amyloid-beta peptides in the central nervous system by blood-brain barrier permeable peptide compositions comprising a vab domain of a camelid single domain heavy chain antibody against an anti-amyloid-beta peptide |
US10112987B2 (en) * | 2012-01-09 | 2018-10-30 | Icb International, Inc. | Blood-brain barrier permeable peptide compositions comprising a vab domain of a camelid single domain heavy chain antibody against an amyloid-beta peptide |
MX2017006167A (es) | 2014-11-12 | 2018-03-23 | Siamab Therapeutics Inc | Compuestos que interactúan con glicanos y métodos de uso. |
WO2016187571A2 (en) * | 2015-05-20 | 2016-11-24 | Viventia Bio Inc. | Her2 immunotoxins and methods of using the same |
CN108136012B (zh) | 2015-08-07 | 2022-10-04 | 伊麦吉纳博公司 | 靶向分子的抗原结合构建体 |
JP6865209B2 (ja) | 2015-08-12 | 2021-04-28 | ファイザー・インク | キャップ付加および非キャップ付加抗体システイン、および抗体−薬物コンジュゲーションにおけるそれらの使用 |
CN108367004B (zh) | 2015-09-21 | 2022-09-13 | 阿帕特夫研究和发展有限公司 | Cd3结合多肽 |
MX2018005061A (es) | 2015-11-12 | 2019-02-28 | Siamab Therapeutics Inc | Compuestos de interacción con glicanos y métodos de uso. |
CN109152824B (zh) * | 2015-11-27 | 2022-12-06 | 卡瑟里克斯私人有限公司 | 经遗传修饰的细胞及其用途 |
US20190031780A1 (en) * | 2016-01-27 | 2019-01-31 | Siamab Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for targeting cancer stem cells |
EP3541847A4 (en) | 2016-11-17 | 2020-07-08 | Seattle Genetics, Inc. | COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE |
US11266745B2 (en) | 2017-02-08 | 2022-03-08 | Imaginab, Inc. | Extension sequences for diabodies |
MX2019010202A (es) | 2017-03-03 | 2019-10-02 | Seattle Genetics Inc | Compuestos que interactuan con glicano y metodos de uso. |
CN108862289B (zh) * | 2018-07-26 | 2021-10-15 | 南京邮电大学 | 一种小粒径大孔径的介孔二氧化硅纳米粒子及其制备方法 |
WO2020081493A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding proteins |
BR112021026663A2 (pt) * | 2019-07-02 | 2022-04-12 | Telix Int Pty Ltd | Anticorpos para ligação a psma com afinidade reduzida para o receptor fc neonatal |
CN117683133A (zh) * | 2019-09-03 | 2024-03-12 | 百奥泰生物制药股份有限公司 | 一种抗tigit免疫抑制剂及应用 |
JP2022548078A (ja) | 2019-09-18 | 2022-11-16 | モレキュラー テンプレーツ,インク. | 志賀毒素aサブユニット足場を含むpd-l1結合分子 |
US11918649B2 (en) | 2019-09-18 | 2024-03-05 | Molecular Templates, Inc. | PD-L1-binding molecules comprising Shiga toxin a subunit scaffolds |
TW202241934A (zh) * | 2020-12-23 | 2022-11-01 | 美商再生元醫藥公司 | 編碼錨定修飾抗體之核酸及其用途 |
EP4308242A1 (en) | 2021-03-17 | 2024-01-24 | Molecular Templates, Inc. | Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens |
CN115850449A (zh) * | 2022-09-29 | 2023-03-28 | 苏州智核生物医药科技有限公司 | 抗体和缀合物 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003050531A2 (en) * | 2001-12-11 | 2003-06-19 | Algonomics N.V. | Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts |
WO2007108559A1 (ja) * | 2006-03-23 | 2007-09-27 | Kirin Pharma Kabushiki Kaisha | ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体 |
JP2008506659A (ja) * | 2004-07-16 | 2008-03-06 | マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト | 発現増強ポリペプチド |
JP2008539237A (ja) * | 2005-04-28 | 2008-11-13 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | Tab分子 |
WO2009012268A1 (en) * | 2007-07-16 | 2009-01-22 | Genentech, Inc. | Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use |
JP2012531212A (ja) * | 2009-07-03 | 2012-12-10 | アビペップ ピーティーワイ リミテッド | イムノコンジュゲート及びその作製方法 |
Family Cites Families (101)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US623322A (en) | 1899-04-18 | Turret-lathe | ||
US4631190A (en) | 1981-06-26 | 1986-12-23 | Shen Wei C | Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers |
GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US5807715A (en) | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
US4542225A (en) | 1984-08-29 | 1985-09-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Acid-cleavable compound |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US5618920A (en) | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
US5583024A (en) | 1985-12-02 | 1996-12-10 | The Regents Of The University Of California | Recombinant expression of Coleoptera luciferase |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5260203A (en) | 1986-09-02 | 1993-11-09 | Enzon, Inc. | Single polypeptide chain binding molecules |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
DE68913658T3 (de) | 1988-11-11 | 2005-07-21 | Stratagene, La Jolla | Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US6291158B1 (en) | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for tapping the immunological repertoire |
US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
NZ238473A (en) | 1990-06-19 | 1993-11-25 | Keith James Ross | Lever lock having levers protected by an internal lever housing |
US5194594A (en) | 1990-09-07 | 1993-03-16 | Techniclone, Inc. | Modified antibodies |
US5252714A (en) | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
JPH04334377A (ja) | 1990-12-31 | 1992-11-20 | Akzo Nv | 酸−不安定性リンカー分子 |
DK0590058T3 (da) | 1991-06-14 | 2004-03-29 | Genentech Inc | Humaniseret heregulin-antistof |
WO1994004679A1 (en) | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
MX9204374A (es) | 1991-07-25 | 1993-03-01 | Idec Pharma Corp | Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion. |
ATE463573T1 (de) | 1991-12-02 | 2010-04-15 | Medimmune Ltd | Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken |
ZA932522B (en) | 1992-04-10 | 1993-12-20 | Res Dev Foundation | Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens |
ATE427968T1 (de) | 1992-08-21 | 2009-04-15 | Univ Bruxelles | Immunoglobuline ohne leichtkette |
SG41929A1 (en) | 1992-09-25 | 1997-08-15 | Commw Scient Ind Res Org | Target binding polypeptide |
CA2126967A1 (en) | 1992-11-04 | 1994-05-11 | Anna M. Wu | Novel antibody construct |
DK0669836T3 (da) | 1992-11-13 | 1996-10-14 | Idec Pharma Corp | Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom |
US5556623A (en) | 1993-03-30 | 1996-09-17 | Eli Lilly And Company | Antibody-drug conjugates |
WO1996016673A1 (en) | 1994-12-02 | 1996-06-06 | Chiron Corporation | Method of promoting an immune response with a bispecific antibody |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
JPH08336393A (ja) | 1995-04-13 | 1996-12-24 | Mitsubishi Chem Corp | 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法 |
AUPO591797A0 (en) | 1997-03-27 | 1997-04-24 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | High avidity polyvalent and polyspecific reagents |
US5837234A (en) | 1995-06-07 | 1998-11-17 | Cytotherapeutics, Inc. | Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane |
US5672662A (en) | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
US20020193567A1 (en) | 1995-08-11 | 2002-12-19 | Genetics Institute, Inc. | Secreted proteins and polynucleotides encoding them |
EP0859841B1 (en) | 1995-08-18 | 2002-06-19 | MorphoSys AG | Protein/(poly)peptide libraries |
JP2000515002A (ja) | 1996-06-27 | 2000-11-14 | フラームス・インテルウニフェルジテール・インスティテュート・フォール・ビオテヒノロジー・ヴェーゼットウェー | 標的分子の活性部位またはクレフトと特異的に相互作用する認識分子 |
US5922845A (en) | 1996-07-11 | 1999-07-13 | Medarex, Inc. | Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies |
US5990237A (en) | 1997-05-21 | 1999-11-23 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines |
US6602677B1 (en) | 1997-09-19 | 2003-08-05 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
US5985263A (en) | 1997-12-19 | 1999-11-16 | Enzon, Inc. | Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates |
WO1999058658A2 (en) | 1998-05-13 | 1999-11-18 | Epimmune, Inc. | Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same |
US6306610B1 (en) | 1998-09-18 | 2001-10-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Biological applications of quantum dots |
CA2342967A1 (en) | 1998-12-08 | 2000-06-15 | Biovation Limited | Modifying protein immunogenicity |
US20030129192A1 (en) | 1999-09-10 | 2003-07-10 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
AU1807401A (en) | 1999-11-30 | 2001-06-12 | Corixa Corporation | Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer |
US20060228364A1 (en) | 1999-12-24 | 2006-10-12 | Genentech, Inc. | Serum albumin binding peptides for tumor targeting |
US20030104562A1 (en) | 2000-02-11 | 2003-06-05 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US20040005561A1 (en) | 2000-03-01 | 2004-01-08 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies |
IL153760A0 (en) | 2000-07-12 | 2003-07-06 | California Inst Of Techn | Method for determining three-dimensional protein structure from primary protein sequence |
AR030612A1 (es) | 2000-09-12 | 2003-08-27 | Smithkline Beecham Corp | Procedimiento e intermedios |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US8178098B2 (en) | 2001-04-03 | 2012-05-15 | National Jewish Health | Method to inhibit airway hyperresponsiveness using aerosolized T cell receptor antibodies |
US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
WO2003016475A2 (en) | 2001-08-14 | 2003-02-27 | The General Hospital Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain |
US20050123925A1 (en) | 2002-11-15 | 2005-06-09 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
WO2003042661A2 (en) | 2001-11-13 | 2003-05-22 | Protein Design Labs, Inc. | Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer |
EP1504099A4 (en) | 2001-12-10 | 2006-05-10 | Nuvelo Inc | NEW NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES |
US6716821B2 (en) | 2001-12-21 | 2004-04-06 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same |
US7452675B2 (en) | 2002-01-25 | 2008-11-18 | The Queen's Medical Center | Methods of screening for TRPM4b modulators |
US20030202975A1 (en) | 2002-02-21 | 2003-10-30 | Tedder Thomas F. | Reagents and treatment methods for autoimmune diseases |
WO2004000997A2 (en) | 2002-03-19 | 2003-12-31 | Curagen Corporation | Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use |
CA2481503A1 (en) | 2002-04-05 | 2003-10-23 | Agensys, Inc. | Nucleic acid and corresponding protein entitled 98p4b6 useful in treatment and detection of cancer |
EP1571968A4 (en) | 2002-04-16 | 2007-10-17 | Genentech Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF TUMORS |
WO2003101283A2 (en) | 2002-06-04 | 2003-12-11 | Incyte Corporation | Diagnostics markers for lung cancer |
CA2488404C (en) | 2002-06-06 | 2012-11-27 | Oncotherapy Science, Inc. | Genes and polypeptides relating to human colon cancers |
ATE328906T1 (de) * | 2002-06-28 | 2006-06-15 | Domantis Ltd | Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit |
JP2004121218A (ja) | 2002-08-06 | 2004-04-22 | Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk | 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法 |
AU2003259163B2 (en) | 2002-08-16 | 2008-07-03 | Immunogen, Inc. | Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs |
AU2003259913A1 (en) | 2002-08-19 | 2004-03-03 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
AU2002951346A0 (en) | 2002-09-05 | 2002-09-26 | Garvan Institute Of Medical Research | Diagnosis of ovarian cancer |
CN1691964A (zh) | 2002-09-06 | 2005-11-02 | 曼康公司 | 表位序列 |
CA2498264A1 (en) | 2002-09-09 | 2004-05-13 | Nura, Inc. | G protein coupled receptors and uses thereof |
US7217797B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
AU2003298650B2 (en) | 2002-11-15 | 2010-03-11 | Musc Foundation For Research Development | Complement receptor 2 targeted complement modulators |
WO2004045553A2 (en) | 2002-11-15 | 2004-06-03 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Ca125 gene and its use for diagnostic and therapeutic interventions |
CA2507044A1 (en) | 2002-11-21 | 2004-06-10 | Mary Lucero | Purinergic modulation of smell |
WO2004048938A2 (en) | 2002-11-26 | 2004-06-10 | Protein Design Labs, Inc. | Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators |
AU2003299819A1 (en) | 2002-12-23 | 2004-07-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Neutrokine-alpha conjugate, neutrokine-alpha complex, and uses thereof |
EP1597558A2 (en) | 2003-01-08 | 2005-11-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators |
US7355008B2 (en) | 2003-01-09 | 2008-04-08 | Macrogenics, Inc. | Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same |
US20050227301A1 (en) | 2003-01-10 | 2005-10-13 | Polgen | Cell cycle progression proteins |
EP1583820A4 (en) | 2003-01-14 | 2007-07-18 | Bristol Myers Squibb Co | ASSOCIATED POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES ASSOCIATED WITH THE NF-KB WAY |
US7501494B2 (en) | 2003-01-15 | 2009-03-10 | United Biomedical, Inc. | Designed deimmunized monoclonal antibodies for protection against HIV exposure and treatment of HIV infection |
EP1594893A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-11-16 | Sagres Discovery, Inc. | Therapeutic targets in cancer |
US20030224411A1 (en) | 2003-03-13 | 2003-12-04 | Stanton Lawrence W. | Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells |
CA2527726A1 (en) | 2003-06-02 | 2004-12-16 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | De-immunized anti-cd3 antibody |
JP2007531707A (ja) | 2003-10-15 | 2007-11-08 | ピーディーエル バイオファーマ, インコーポレイテッド | IGの重鎖定常領域の位置250、314および/または428の変異誘発によるFc融合タンパク質血清半減期の改変 |
JP2008500830A (ja) | 2004-06-01 | 2008-01-17 | ドマンティス リミテッド | 増加した血清半減期を有する二重特異性融合抗体 |
DK1751181T3 (da) | 2004-06-02 | 2012-11-26 | Adalta Pty Ltd | BINDINGSDELE, DER ER BASERET PÅ HAJ IgNAR-DOMÆNER |
ES2579805T3 (es) | 2004-09-23 | 2016-08-16 | Genentech, Inc. | Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína |
US8802820B2 (en) | 2004-11-12 | 2014-08-12 | Xencor, Inc. | Fc variants with altered binding to FcRn |
JP5838021B2 (ja) | 2005-04-15 | 2015-12-24 | マクロジェニクス,インコーポレーテッド | 共有結合型ダイアボディとその使用 |
US20060263367A1 (en) | 2005-05-23 | 2006-11-23 | Fey Georg H | Bispecific antibody devoid of Fc region and method of treatment using same |
ES2636089T3 (es) | 2006-10-27 | 2017-10-05 | Genentech, Inc. | Anticuerpos e inmunoconjugados y usos para los mismos |
PE20090481A1 (es) | 2007-07-16 | 2009-05-18 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados humanizados y metodos de uso |
EP3269737B1 (en) | 2008-01-31 | 2024-06-19 | Genentech, Inc. | Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use |
KR20180056805A (ko) * | 2009-06-04 | 2018-05-29 | 노파르티스 아게 | IgG 콘쥬게이션을 위한 자리의 확인 방법 |
-
2010
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-
2016
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003050531A2 (en) * | 2001-12-11 | 2003-06-19 | Algonomics N.V. | Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts |
JP2008506659A (ja) * | 2004-07-16 | 2008-03-06 | マイクロメット アクツィエン ゲゼルシャフト | 発現増強ポリペプチド |
JP2008539237A (ja) * | 2005-04-28 | 2008-11-13 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | Tab分子 |
WO2007108559A1 (ja) * | 2006-03-23 | 2007-09-27 | Kirin Pharma Kabushiki Kaisha | ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体 |
WO2009012268A1 (en) * | 2007-07-16 | 2009-01-22 | Genentech, Inc. | Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use |
JP2012531212A (ja) * | 2009-07-03 | 2012-12-10 | アビペップ ピーティーワイ リミテッド | イムノコンジュゲート及びその作製方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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