JP2016146789A - Novel ogataea yeast and production method of heterologous protein using the same - Google Patents

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輝之 西
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide novel means for improving heterologous protein secretion productivity by inactivating Ogataea yeast genes with unknown function.SOLUTION: Disclosed are an Ogataea yeast in which heterologous protein secretion productivity is improved by inactivating a specific gene of Ogataea yeast and a vector for inactivating the gene. Further provided is a production method of heterologous protein such as a fully humanized anti-TNF-α Fab antibody using the Ogataea yeast as a host.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、特定の遺伝子を不活性化することにより異種タンパク質の分泌生産性が向上した新規オガタエア属酵母、該遺伝子を不活性化するためのベクター、該新規オガタエア属酵母を宿主として用いた異種タンパク質の製造方法に関する。   The present invention relates to a novel Ogataea yeast whose secretion productivity of a heterologous protein is improved by inactivating a specific gene, a vector for inactivating the gene, and a heterologous species using the novel Ogataea yeast as a host The present invention relates to a method for producing a protein.

近年、遺伝子組換え法によって異種タンパク質を生産するための宿主として、ＣＨＯ等の動物細胞や、カイコ等の昆虫及び昆虫細胞、ニワトリや牛などの動物、大腸菌や酵母などの微生物が用いられている。中でも、酵母は安価な培地で大規模高密度培養が可能であり、タンパク質を低コストで生産することができる。また、シグナルペプチド等を利用すれば培養液中への分泌発現も可能なためタンパク質の精製過程も容易となる。特に、酵母は真核生物であるため糖鎖付加などの翻訳後修飾も可能であるという長所が期待でき、様々な研究が行われている。   In recent years, animal cells such as CHO, insects and insect cells such as silkworms, animals such as chickens and cattle, microorganisms such as Escherichia coli and yeast have been used as hosts for producing heterologous proteins by genetic recombination methods. . Among them, yeast is capable of large-scale high-density culture with an inexpensive medium, and can produce proteins at low cost. In addition, if a signal peptide or the like is used, the protein can be purified easily because it can be secreted into the culture medium. In particular, since yeast is a eukaryote, it can be expected to have post-translational modifications such as glycosylation, and various studies have been conducted.

例えば、非特許文献１には、メタノール資化性酵母を用いて、緑色蛍光タンパク質、ヒト血清アルブミン、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ヒト上皮成長因子、ヒルジンなどを生産する方法が報告されている。また、非特許文献２には、アルコールオキシダーゼ（Ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ、ＡＯＸ）プロモーターの下流に低分子化抗体をコードする塩基配列を連結した遺伝子を酵母に導入し、低分子化抗体を生産する方法が報告されている。上述のように、遺伝子組換え法によってタンパク質を生産する宿主として酵母を使用した場合、その生産性の向上のために、異種タンパク質をコードする遺伝子へのシグナル配列の付加、強力なプロモーターの利用、コドン改変、シャペロン遺伝子の共発現、宿主の培養条件の検討など様々な試みがなされている。   For example, Non-Patent Document 1 reports a method for producing green fluorescent protein, human serum albumin, hepatitis B virus surface antigen, human epidermal growth factor, hirudin and the like using methanol-assimilating yeast. Non-Patent Document 2 reports a method for producing a low molecular weight antibody by introducing a gene in which a base sequence encoding a low molecular weight antibody is linked downstream of an alcohol oxidase (AOX) promoter into yeast. Has been. As described above, when yeast is used as a host for producing a protein by a genetic recombination method, in order to improve its productivity, a signal sequence is added to a gene encoding a heterologous protein, a strong promoter is used, Various attempts have been made such as codon modification, co-expression of chaperone genes, and examination of host culture conditions.

一方、培養液中への異種タンパク質分泌生産においては、上述の育種改良の他に、遺伝子の不活性化による生産性向上が報告されている。
例えば、特許文献１には、宿主酵母由来のプロテアーゼ遺伝子及びＶＰＳ遺伝子（Ｖａｃｕｏｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｒｔｉｎｇ）の不活性化による生産性向上が報告されている。 On the other hand, in the production of heterologous proteins secreted into the culture medium, productivity improvement due to gene inactivation has been reported in addition to the above-mentioned breeding improvement.
For example, Patent Document 1 reports an improvement in productivity due to inactivation of a protease gene derived from a host yeast and a VPS gene (Vacular Protein Sorting).

国際公開第２０１２／１２４５６７号International Publication No. 2012/124567

Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００ Ｄｅｃ；５４（６）：７４１−５０．Appl Microbiol Biotechnol. 2000 Dec; 54 (6): 741-50. Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３ Ｄｅｃ；１３４（６）：８１３−７．J Biochem. 2003 Dec; 134 (6): 813-7.

本発明は、オガタエア属酵母の機能未知な遺伝子を不活性化することで、異種タンパク質の分泌生産性を向上させる新たな手段を提供する。 The present invention provides a new means for improving the secretion productivity of heterologous proteins by inactivating a gene whose function is unknown in the genus Ogataea.

本発明者らは、上記課題を解決すべく、オガタエア属酵母の染色体ＤＮＡの塩基配列の網羅的解析により、ある機能未知な遺伝子を不活性化することで異種タンパク質の分泌生産性が向上したオガタエア属酵母を見出した。また、前記遺伝子とは異なる機能未知な遺伝子をさらに不活性化することで異種タンパク質の分泌生産性がより向上したオガタエア属酵母を見出し、本発明を完成するに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have carried out comprehensive analysis of the base sequence of chromosomal DNA of the genus Ogataea, which has improved the secretion productivity of heterologous proteins by inactivating a gene whose function is unknown. A genus yeast was found. Further, the present invention has been completed by finding a yeast of the genus Ogataea in which the secretion productivity of heterologous proteins is further improved by further inactivating a gene whose function is unknown from that of the above gene.

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの遺伝子：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２７に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号２７に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化されたオガタエア属酵母。
（２）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターを形質転換することにより得られる（１）に記載の酵母。
（３）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを形質転換することにより得られる（１）又は（２）に記載の酵母。
（４）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる（１）又は（２）に記載の酵母。
（５）
さらに、以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のいずれかの遺伝子：
（ｅ）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｆ）配列番号３０に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｇ）配列番号３０に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｈ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化された（１）〜（４）のいずれか１項に記載の酵母。
（６）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られる（５）に記載の酵母。
（７）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られる（６）に記載の酵母。
（８）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる（６）に記載の酵母。
（９）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、及び異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる（６）に記載の酵母。
（１０）
オガタエア属酵母が、オガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ ａｎｇｕｓｔａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、又はオガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の群より選ばれる少なくとも１種である（１）〜（９）のいずれか１項に記載の酵母。
（１１）
（３）又は（４）に記載の酵母及び／又は（７）〜（９）のいずれか１項に記載の酵母を培養して、異種タンパク質を回収する工程を含む異種タンパク質の製造方法。
（１２）
炭素原として、グルコース、グリセロール、及び／又はメタノールを用いて培養することを特徴とする（１１）に記載の製造方法。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1)
Any of the following genes (a), (b), (c) or (d):
(A) a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27;
(B) a gene comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 27;
(C) a gene comprising a base sequence having 85% or more sequence identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 27;
(D) a gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31;
Ogataea yeast that has been inactivated.
(2)
A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and The yeast according to (1), obtained by transforming a vector containing at least one of the base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any of (a) to (d).
(3)
A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A polypeptide comprising at least one base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and comprising an amino acid sequence of a heterologous protein upstream or downstream of the base sequence The yeast according to (1) or (2), which is obtained by transforming a vector containing a base sequence that encodes.
(4)
A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A vector containing at least one of the base sequences having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and a base sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein; Yeast as described in (1) or (2) obtained by transforming the containing vector.
(5)
Furthermore, any of the following genes (e), (f), (g) or (h):
(E) a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30;
(F) a gene comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 30;
(G) a gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30;
(H) a gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32;
The yeast according to any one of (1) to (4), wherein is inactivated.
(6)
A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A vector containing at least one of the base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and the gene according to any one of the above (e) to (h) And a nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any one of (e) to (h), and a gene sequence according to any of the above (e) to (h) The yeast according to (5), obtained by transforming a terminator and a vector containing at least one of base sequences having a homologous region.
(7)
A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A polypeptide comprising at least one base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and comprising an amino acid sequence of a heterologous protein upstream or downstream of the base sequence A vector containing a base sequence encoding the gene, a base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (e) to (h), and the gene according to any one of (e) to (h) Contains at least one of a base sequence having a homologous region with the promoter and a base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (e) to (h) above Yeast according that a vector obtained by transforming (6).
(8)
A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A vector containing at least one of the base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and the gene according to any one of the above (e) to (h) And a nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any one of (e) to (h), and a gene sequence according to any of the above (e) to (h) Contains at least one base sequence having a homologous region with the terminator, and contains a base sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein upstream or downstream of the base sequence Yeast according that a vector obtained by transforming (6).
(9)
A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A vector containing at least one of the nucleotide sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), the gene according to any one of the above (e) to (h), and A base sequence having a homologous region, a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any one of (e) to (h), and the gene terminator according to any of the above (e) to (h) A vector containing at least one base sequence having a homologous region, and a vector containing a base sequence encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence of a heterologous protein Yeast according to obtain (6) by quality conversion.
(10)
Ogataea yeast is at least one selected from the group of Ogataea angsta (Ogataea angusta), Ogataea polymorpha, or Ogataea parapolymorpha (1) to any one of 9 (1) The yeast according to item.
(11)
A method for producing a heterologous protein comprising a step of culturing the yeast according to (3) or (4) and / or the yeast according to any one of (7) to (9) and recovering the heterologous protein.
(12)
The production method according to (11), wherein culture is performed using glucose, glycerol, and / or methanol as a carbon source.

本発明によれば、本発明に記載の遺伝子を不活性化することにより異種タンパク質の分泌生産性が向上したオガタエア属酵母及び該遺伝子を不活性化するためのベクターが提供される。さらに、該オガタエア属酵母を宿主として用いる異種タンパク質の製造方法が提供される。 According to the present invention, there are provided Ogataae yeast whose secretion productivity of heterologous proteins is improved by inactivating the gene described in the present invention, and a vector for inactivating the gene. Furthermore, a method for producing a heterologous protein using the Ogataea yeast as a host is provided.

以下に、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
本発明のオガタエア属酵母は、
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの遺伝子：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２７に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号２７に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化されていることを特徴とする。 Hereinafter, the present invention will be described in detail using preferred embodiments.
Ogataea yeast of the present invention,
Any gene of (a), (b), (c) or (d):
(A) a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27;
(B) a gene comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 27;
(C) a gene comprising a base sequence having 85% or more sequence identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 27;
(D) a gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31;
Is inactivated.

本発明において「オガタエア属酵母」とは、オガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ ａｎｇｕｓｔａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が好ましい。これら３つは近縁種であり、いずれも、別名ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、または別名ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）でも表される。
具体的に使用できる菌株として、オガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５（ＡＴＣＣ１４７５４）、オガタエア・ポリモルファ８Ｖ（ＡＴＣＣ３４４３８）、オガタエア・パラポリモルファＤＬ−１（ＡＴＣＣ２６０１２）などの菌株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション等から入手することができる。また、本発明においては、これらオガタエア属酵母の菌株からの誘導株も使用でき、例えばロイシン要求性株であれば、ＮＣＹＣ４９５由来のＢＹ４３２９、８Ｖ由来のＢＹ５２４２、ＤＬ−１由来のＢＹ５２４３などが挙げられ、これらはＮａｔｉｏｎａｌ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔから分譲可能である。 In the present invention, “Ogataea yeast” is preferably Ogataea angusta, Ogataea polymorpha, Ogataea parapolymorpha. These three are closely related species, all of which are also known as Hansenula polymorpha or Pichia angsta.
Specific strains that can be used include strains such as Ogata Air Angsta NCYC495 (ATCC 14754), Ogata Air Polymorph 8V (ATCC 34438), Ogata Air Parapolymorph DL-1 (ATCC 26012), and the like. These strains can be obtained from the American Type Culture Collection. In the present invention, derived strains from these strains of the genus Ogataea can also be used. For example, in the case of a leucine-requiring strain, NCYC495-derived BY4329, 8V-derived BY5242, DL-1-derived BY5243 and the like can be mentioned. These can be sold from the National BioResource Project.

本発明において「不活性化」とは、遺伝子の機能が失われている状態、または機能が減少している状態を指し、当該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるポリペプチドの発現量が低下している状態やｍＲＮＡやタンパク質として正常に機能しない状態も包含する。なお、ｍＲＮＡの発現量はリアルタイムＰＣＲ法、ノーザンハイブリダイゼーション又はＤＮＡアレイを利用したハイブリダイゼーション法等を用いて定量することができ、ポリペプチドの発現量は、ポリペプチドを認識する抗体やポリペプチドと結合性を有する染色化合物等を用いて定量することができる。また、上記に挙げた定量方法以外にも、当業者で用いられている従来法であってもよい。   In the present invention, “inactivation” refers to a state in which the function of a gene is lost or a state in which the function is decreased, and the expression level of mRNA that is a transcription product of the gene or polypeptide that is a translation product It also includes a state in which the level is decreased and a state that does not function normally as mRNA or protein. The mRNA expression level can be quantified using a real-time PCR method, Northern hybridization, hybridization method using a DNA array, or the like, and the polypeptide expression level is determined based on the antibody or polypeptide that recognizes the polypeptide. It can be quantified using a staining compound or the like having binding properties. In addition to the quantitative methods listed above, conventional methods used by those skilled in the art may be used.

不活性化させる手段としては、薬剤や紫外線を用いたＤＮＡ変異処理、ＰＣＲを用いた部分特異的変異導入、ＲＮＡｉ、プロテアーゼ、相同組み換え等を利用することができ、遺伝子を不活性化させる場合は、当該遺伝子のＯＲＦ内の塩基配列の改変（欠失、置換、付加、挿入）、及び／又はプロモーター領域、エンハンサー領域、ターミネーター領域などの転写開始または停止を制御する領域内の塩基配列の改変（欠失、置換、付加、挿入）により行う。なお、前記欠失、置換、付加、挿入を行う部位や、欠失、置換、付加、挿入される塩基配列は、当該遺伝子の正常な機能が欠損し得る限り、特に限定されない。  As a means for inactivation, DNA mutation treatment using drugs and ultraviolet rays, partial specific mutagenesis using PCR, RNAi, protease, homologous recombination, etc. can be used. , Modification of the nucleotide sequence in the ORF of the gene (deletion, substitution, addition, insertion) and / or modification of the nucleotide sequence in the region that controls the start or stop of transcription such as promoter region, enhancer region, terminator region ( Deletion, substitution, addition, insertion). In addition, the site | part which performs the said deletion, substitution, addition, and insertion, and the base sequence inserted in deletion, substitution, addition, and insertion are not specifically limited as long as the normal function of the said gene can be deleted.

本発明における「塩基配列の改変」とは、相同組換えを利用した遺伝子の挿入や部位特異的変異導入の手法を使用して実施することができる。例えば、遺伝子上流プロモーターのより活性の低いプロモーターへの置換や、宿主細胞に適していないコドンへの改変等、また、欠失させたい遺伝子の上流配列、選択マーカー遺伝子配列及び欠失させたい遺伝子の下流配列を連結させたベクターの導入などが挙げられる。  “Modification of the base sequence” in the present invention can be carried out by using a method of gene insertion or site-directed mutagenesis utilizing homologous recombination. For example, replacement of a gene upstream promoter with a less active promoter, modification to a codon not suitable for the host cell, etc., and upstream sequences of genes to be deleted, selectable marker gene sequences and genes to be deleted Examples thereof include introduction of a vector in which a downstream sequence is linked.

本発明において発現量低下の度合は、異種タンパク質の分泌生産性が向上すれば特に限定されないが、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上低下していることが好ましい。なお、発現量が低下していなくとも、上述のとおり、遺伝子産物の正常な機能が欠損し得る限り、不活性化することができることは、当業者であれば周知であるから、発現量の低下の度合は、あくまで不活性化の判断基準の１つにすぎない。  In the present invention, the degree of expression reduction is not particularly limited as long as the secretion productivity of the heterologous protein is improved, but it is 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60 % Or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, preferably 95% or more. Even if the expression level does not decrease, as described above, it is well known to those skilled in the art that the gene product can be inactivated as long as the normal function of the gene product can be lost. This degree is only one of the criteria for determining inactivation.

本発明において「配列番号２７に示す塩基配列」は、オガタエア・アングスタの染色体ＤＮＡの網羅的解析により見出された遺伝子であり、該遺伝子を不活性化させることで異種タンパク質の分泌生産性が向上する。例えば、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化する例として、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の上流に位置するプロモーターの８０ｂｐと１００％の配列同一性を有する塩基配列（例えば、配列番号２５の１〜８０番目の塩基配列）及び、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の下流に位置するターミネーターの相補配列８０ｂｐと１００％の配列同一性を有する塩基配列（例えば、塩基配列２６の１〜８０番目の塩基配列）をそれぞれプライマー１６および１７の内部配列として用いてＰＣＲ産物を調製し、該ＰＣＲ産物をベクターとしてオガタエア属酵母に形質転換する方法が挙げられる。
また、配列番号２７に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子、配列番号２７に示す塩基配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子も不活性化させることで、配列番号２７に示す塩基配列の場合と同様に異種タンパク質の分泌生産性が向上する。 In the present invention, the “base sequence shown in SEQ ID NO: 27” is a gene found by comprehensive analysis of chromosomal DNA of Ogataair Angsta, and the secretion productivity of heterologous proteins is improved by inactivating the gene. To do. For example, as an example of inactivating the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27, the base sequence having 100% sequence identity with 80 bp of the promoter located upstream of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 ( For example, the base sequence having 100% sequence identity with the complementary sequence 80 bp of the terminator located downstream of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27) and the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 Examples include a method of preparing a PCR product using the 1st to 80th base sequences of the base sequence 26 as the internal sequences of the primers 16 and 17, respectively, and transforming the PCR product into Ogataea yeast as a vector.
Further, a gene comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 27, 85% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 27, more preferably 90% or more, More preferably, a gene consisting of a base sequence having a sequence identity of 95% or more, most preferably 99% or more and a gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 are also inactivated. Thus, the secretory productivity of the heterologous protein is improved as in the case of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27.

本発明において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば、コロニーまたはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡの塩基配列を挙げることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡの塩基配列のことを指す。   In the present invention, the “base sequence that hybridizes under stringent conditions” means, for example, 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques is immobilized. After hybridization, the filter is washed under a condition of 65 ° C. using a 2 × concentration SSC solution (the composition of the 1 × concentration SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). The base sequence of DNA that can be obtained by: It is preferably washed with an SSC solution of 0.5 times concentration at 65 ° C., more preferably washed with an SSC solution of 0.2 times concentration at 65 ° C., and more preferably washed with an SSC solution of 0.1 times concentration at 65 ° C. It refers to the base sequence of DNA that can be obtained by

本発明において「配列同一性」とは、２つ以上の塩基配列を整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだ塩基配列において同一部位に同一の塩基が出現する頻度を％で表示した値である。なお、配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができ、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムのｂｌａｓｔｎプログラムやＦＡＳＴＡアルゴリズムのｆａｓｔａプログラムが挙げられる。   In the present invention, “sequence identity” refers to a gap when two or more base sequences are aligned (aligned) and a gap is introduced as necessary so that the base coincidence between the two becomes the highest. In the base sequence including the portion, this is a value expressed in% as the frequency of occurrence of the same base at the same site. The sequence identity can be determined using methods well known to those skilled in the art, sequence analysis software, and the like, and examples thereof include the BLAST algorithm blastn program and the FASTA algorithm fasta program.

本発明において「配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子」とは、配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコドン表に基づいて設計される塩基配列からなる遺伝子のことを指し、例えば、配列番号２７に示す遺伝子が挙げられる。そして、当該遺伝子を不活性化させることで、異種タンパク質の分泌生産性を向上させることができる。   In the present invention, the “gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31” refers to a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 from a base sequence designed based on the codon table. For example, the gene shown in SEQ ID NO: 27 can be mentioned. And the secretion productivity of a heterologous protein can be improved by inactivating the said gene.

また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターを形質転換することにより得られることを特徴とする。
本発明は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列を少なくとも１つ含有するベクターを形質転換することで、オガタエア属酵母の染色体上における前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子を不活性化させることができる。また、ベクターは、各々の相同領域を有する塩基配列をすべて組み込んだベクターを用いても良いし、各々の相同領域を有する塩基配列を、それぞれ１つずつ組み込んだベクターを用いても良い。 The yeast of the genus Ogataea of the present invention is a base sequence having a homologous region with the gene described in any of (a) to (d) above, and the promoter of the gene described in any of (a) to (d) above. And / or transforming a vector containing at least one of a base sequence having a homologous region and / or a terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above and a base sequence having a homologous region. It is obtained by these.
The present invention provides a nucleotide sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d) above, and a base having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d) above By transforming a vector containing at least one base sequence having a sequence and a homologous region with the terminator of the gene described in any one of (a) to (d) above, the above-mentioned (a ) To (d) can be inactivated. Further, as the vector, a vector in which all the base sequences having the respective homologous regions are incorporated may be used, or a vector in which each of the base sequences having the respective homologous regions is incorporated may be used.

本発明において「ベクター」とは核酸分子であって、所定の塩基配列（上述した前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列、後で詳述する（ｅ）〜（ｈ）のいずれかの塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列、或いは、これらの塩基配列のうち複数が連結（適当な長さの他の塩基配列を介して連結する場合を含む）した塩基配列に加えて、１つ以上の制限酵素認識部位を含むクローニングサイト、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＩｎ−ＦｕｓｉｏｎクローニングシステムやＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社のＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ システム等を利用するためのオーバーラップ領域、内在性遺伝子の塩基配列、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、選択マーカー遺伝子（栄養要求性相補遺伝子、薬剤耐性遺伝子など）の塩基配列等を含むことができる。上記ベクターの形態としては、直鎖の塩基配列、プラスミド、人工染色体等が挙げられる。直鎖の塩基配列の例としては、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子などの栄養要求性相補遺伝子やＧ４１８耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子の塩基配列を有するＰＣＲ産物、またはプラスミドを適当な制限酵素によって切断し、直鎖状としたものなどが挙げられる。プラスミドの例としては、ＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐなどが挙げられる。オガタエア属酵母の場合はｐＰＩＣＨＯＬＩ、ｐＨＩＰ、ｐＨＲＰ、ｐＨＡＲＳなどが挙げられる。人工染色体の例としては、一般に、セントロメアＤＮＡ配列、テロメアＤＮＡ配列、自律複製配列（ＡＲＳ）を含む人工染色体ベクターを指し、酵母であれば酵母人工染色体（ＹＡＣベクター）などが挙げられ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなどにおいて開発されている。   In the present invention, the “vector” is a nucleic acid molecule, and is a predetermined base sequence (any one of the above-described base sequences (a) to (d), any one of (a) to (d) described above). A nucleotide sequence having a homologous region with a promoter of the gene, a nucleotide sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of the above (a) to (d), any of (e) to (h) described in detail later A base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any one of (e) to (h), a terminator and a homologous region with the gene according to any of (e) to (h) Or a base sequence in which a plurality of these base sequences are linked (including cases where they are linked via other base sequences of appropriate length), and one or more restriction enzyme recognition sites Cloning sites including Overlapping region, base sequence of endogenous gene, base sequence encoding polypeptide consisting of amino acid sequence of heterologous protein, selection to use Clontech's In-Fusion cloning system or New England Biolabs' Gibson Assembly system It can contain the base sequence of a marker gene (such as an auxotrophic complementary gene or drug resistance gene) etc. Examples of the vector include a linear base sequence, a plasmid, an artificial chromosome, etc. Examples of sequences include nucleotide sequences of auxotrophic complementary genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, HIS4 gene, and drug resistance genes such as G418 resistance gene, zeocin resistance gene, and hygromycin resistance gene. Examples of plasmids include YEp, YRp, YCp, etc. In the case of Ogataae yeast, pPICHOLI, pHIP, pHRP, pHARS, etc. Examples of artificial chromosomes generally refer to artificial chromosome vectors containing a centromeric DNA sequence, a telomeric DNA sequence, and an autonomously replicating sequence (ARS). Vector) and the like, and has been developed in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.

本発明において「形質転換」とは、上記ベクターを細胞に導入することを指す。ベクターを宿主細胞へ導入する方法は公知の方法を適宜用いることができ、例えば宿主として酵母細胞を用いる場合、エレクトロポレーション法や酢酸リチウム法、スフェロプラスト法などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。例えば、オガタエア・アングスタの形質転換法としては、Ｈｉｇｈｌｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ．（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ ２５：３０５．３１０．）に記載されているエレクトロポレーション法が一般的である。   In the present invention, “transformation” refers to introducing the vector into a cell. As a method for introducing a vector into a host cell, a known method can be appropriately used. For example, when a yeast cell is used as a host, an electroporation method, a lithium acetate method, a spheroplast method and the like can be mentioned. It is not limited. For example, as a method for transforming Ogata Air Angsta, High-efficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha. The electroporation method described in (Curr Genet 25: 305.310.) Is common.

また、本発明において、ベクターをオガタエア属酵母に形質転換する場合、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を用いることが好ましい。選択マーカーは特に限定されないが、オガタエア属酵母であれば、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子などの栄養要求性相補遺伝子であれば、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により選択することができる。また、Ｇ４１８耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子であれば、それぞれＧ４１８、ゼオシン、ハイグロマイシンを含む培地上における耐性により選択することができる。なお、形質転換する時に用いた栄養要求性選択マーカーは、該選択マーカーが破壊されていない場合は、用いることができない。この場合、該選択マーカーを破壊させればよく、その方法は従来法を用いることができる。   In the present invention, when a vector is transformed into Ogataea yeast, it is preferable to use a selection marker gene such as an auxotrophic complementary gene or a drug resistance gene. The selectable marker is not particularly limited, but in the case of yeasts belonging to the genus Ogataea, auxotrophic strains of uracil, leucine, adenine and histidine, respectively, as long as they are auxotrophic complementary genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene and HIS4 gene Can be selected by recovery of the prototrophic phenotype. In addition, drug resistance genes such as a G418 resistance gene, a zeocin resistance gene, and a hygromycin resistance gene can be selected based on resistance on a medium containing G418, zeocin, and hygromycin, respectively. Note that the auxotrophic selection marker used at the time of transformation cannot be used if the selection marker is not destroyed. In this case, the selection marker may be destroyed, and a conventional method can be used.

また、本発明において、ベクターを染色体に組み込む場合、本実施例のように染色体の相同領域を同時に有するＤＮＡとして作成することが好ましい。染色体上へのベクターの組み込みの方法は、相同領域を利用しない非特異的な組み込みでもよいし、１箇所の相同領域を利用した組み込みでもよいし、２箇所の相同領域を利用したダブルクロスオーバー型の組み込みでもよい。   In the present invention, when a vector is incorporated into a chromosome, it is preferably prepared as a DNA having a chromosome homologous region simultaneously as in this example. The method of integrating the vector onto the chromosome may be non-specific integration without using the homologous region, integration using one homologous region, or double crossover type using two homologous regions. May be incorporated.

また、本発明において、相同領域を利用した組み込みの場合、例えば本実施例のように、選択マーカー遺伝子配列の両末端に相同領域が来るようにして形質転換を行うことが出来る。例えば、遺伝子欠失させたい場合、選択マーカー遺伝子の上流に欠失させたい遺伝子のプロモーター、下流には欠失させたい遺伝子のターミネーターを連結させたベクターを利用して組み込むことが出来る。   In the present invention, in the case of integration using a homologous region, for example, as in this example, transformation can be performed so that the homologous region is located at both ends of the selection marker gene sequence. For example, when gene deletion is desired, it can be incorporated using a vector in which the promoter of the gene to be deleted upstream of the selectable marker gene and the terminator of the gene to be deleted downstream are linked.

本発明において、染色体あたりのベクターのコピー数は特に限定されない。また、染色体上にベクターが組み込まれている位置は、本発明の遺伝子が不活性化されている限り、特に限定されない。なお、２コピー以上のベクターが組み込まれている形質転換体の組み込み位置については、同じ位置に複数が組み込まれている状態でもよいし、異なる位置に１コピーずつ組み込まれている状態でもよい。   In the present invention, the number of copies of the vector per chromosome is not particularly limited. Further, the position where the vector is integrated on the chromosome is not particularly limited as long as the gene of the present invention is inactivated. In addition, about the integration position of the transformant in which two or more copies of the vector are integrated, a plurality may be integrated at the same position, or one copy may be integrated at different positions.

本発明の「相同領域を有する塩基配列」とは、目的とする塩基配列の少なくとも一部の塩基配列を有し、５０％以上の配列同一性を有する塩基配列であればよく、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは８５％以上、よりさらに好ましくは９０％以上、より特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％である。また、該相同領域を有する塩基配列の長さは、目的とする塩基配列と相同領域を有する２０ｂｐ以上の塩基配列であれば、相同組み換えすることができるため特に限定されないが、具体的には、目的とする塩基配列の長さの０．１％以上が好ましく、０．５％以上、１％以上、１．５％以上、２％以上、２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、６％以上、６．５％以上、７％以上、７．５％以上、８％以上、８．５％以上、９％以上、９．５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、１００％が好ましい。  The “base sequence having a homologous region” of the present invention may be any base sequence having at least a part of the target base sequence and having 50% or more sequence identity, more preferably 70. % Or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, more particularly preferably 95% or more, and most preferably 100%. In addition, the length of the base sequence having the homologous region is not particularly limited since homologous recombination can be performed as long as it is a base sequence of 20 bp or more having the homologous region with the target base sequence. 0.1% or more of the length of the target base sequence is preferable, 0.5% or more, 1% or more, 1.5% or more, 2% or more, 2.5% or more, 3% or more, 3.5 % Or more, 4% or more, 4.5% or more, 5% or more, 5.5% or more, 6% or more, 6.5% or more, 7% or more, 7.5% or more, 8% or more, 8.5 % Or more, 9% or more, 9.5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55 % Or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more , Preferably 100%.

本発明の「（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーター」とは、染色体上で（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の上流に存在し、該遺伝子産物の発現量を調整する塩基配列であり、具体的には、（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の開始コドンより上流の５０００ｂｐまでの塩基配列を指す。
本発明の「（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーター」とは、染色体上で（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の下流に存在し、該遺伝子産物の発現量を調整する塩基配列であり、具体的には、（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の終始コドンより下流の５０００ｂｐまでの塩基配列を指す。 The “promoter of the gene according to any one of (a) to (d)” of the present invention is present upstream of the gene according to any one of (a) to (d) on the chromosome, and the gene product Specifically, it refers to a base sequence up to 5000 bp upstream from the start codon of the gene described in any of (a) to (d).
The term “terminator of the gene according to any one of (a) to (d)” of the present invention is present on the chromosome downstream of the gene according to any one of (a) to (d), and the gene product Specifically, it refers to a base sequence up to 5000 bp downstream from the start codon of the gene described in any of (a) to (d).

また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを形質転換することにより得られることを特徴とする。
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列の上流又は下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列が配置されたベクターを形質転換することで、異種タンパク質の生産性が向上したオガタエア属酵母を得ることができる。さらに、各々の相同領域を有する塩基配列を含有したベクターに、該塩基配列の上流及び／又は下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を配置することで、形質転換の操作性を向上させることができる。 The yeast of the genus Ogataea of the present invention is a base sequence having a homologous region with the gene described in any of (a) to (d) above, and the promoter of the gene described in any of (a) to (d) above. And / or at least one of the base sequence having a homologous region and the terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above, and upstream of the base sequence Alternatively, it is obtained by transforming a vector containing a base sequence encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence of a heterologous protein downstream.
A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and / or Or a vector in which a base sequence encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence of a heterologous protein is arranged upstream or downstream of a base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d). By transforming, Ogataea yeast with improved productivity of heterologous proteins can be obtained. Furthermore, transformation operations are carried out by arranging a base sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein upstream and / or downstream of the base sequence in a vector containing a base sequence having each homologous region. Can be improved.

本発明において「異種タンパク質」とは、微生物由来の酵素類、多細胞生物である動物や植物が産生するタンパク質等である。例えば、フィターゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ、トリプシン、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定はされない。特に、ヒト及び／又は動物治療用タンパク質が好ましい。  In the present invention, “heterologous protein” refers to microorganism-derived enzymes, proteins produced by animals and plants that are multicellular organisms, and the like. Examples include phytase, protein A, protein G, protein L, amylase, glucosidase, cellulase, lipase, protease, glutaminase, peptidase, nuclease, oxidase, lactase, xylanase, trypsin, pectinase, isomerase, fluorescent protein, etc. It is not limited to. In particular, human and / or animal therapeutic proteins are preferred.

ヒト及び／又は動物治療用タンパク質として、具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ヒルジン、抗体、ヒト抗体、部分抗体、ヒト部分抗体、血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、上皮成長因子、ヒト上皮成長因子、インシュリン、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、ＩＬ−１、ＩＬ−６、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、レプチン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などが挙げられる。   Specific examples of human and / or animal therapeutic proteins include hepatitis B virus surface antigen, hirudin, antibody, human antibody, partial antibody, human partial antibody, serum albumin, human serum albumin, epidermal growth factor, human epithelial growth Factor, insulin, growth hormone, erythropoietin, interferon, blood coagulation factor VIII, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), thrombopoietin, IL-1, IL-6, Examples include tissue plasminogen activator (TPA), urokinase, leptin, stem cell growth factor (SCF), and the like.

ここで「抗体」とは、Ｌ鎖とＨ鎖の各２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合して構成されるヘテロテトラマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。   Here, the “antibody” refers to a heterotetrameric protein constituted by disulfide bonds between two polypeptide chains of L and H chains, and has the ability to bind to a specific antigen. There is no particular limitation.

ここで「部分抗体」とは、Ｆａｂ型抗体、（Ｆａｂ）２型抗体、ｓｃＦｖ型抗体、ｄｉａｂｏｄｙ型抗体や、これらの誘導体等のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。Ｆａｂ型抗体とは、抗体のＬ鎖とＦｄ鎖がＳ−Ｓ結合で結合したヘテロマータンパク質、または抗体のＬ鎖とＦｄ鎖がＳ−Ｓ結合を含まず会合したヘテロマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
上記異種タンパク質を構成するアミノ酸は天然のものでもよいし、非天然のものでもよいし、修飾を受けていてもよい。また、タンパク質のアミノ酸配列は、人為的な改変が施されていてもよいし、ｄｅ−ｎｏｖｏで設計されたものでもよい。 As used herein, the term “partial antibody” refers to a Fab type antibody, a (Fab) type 2 antibody, a scFv type antibody, a diabody type antibody, or a derivative thereof, and has the ability to bind to a specific antigen. There is no particular limitation. The Fab-type antibody refers to a heteromeric protein in which the L chain and Fd chain of the antibody are bound by an SS bond, or a heteromeric protein in which the L chain and Fd chain of the antibody are associated without an SS bond. As long as it has an ability to bind to a specific antigen, it is not particularly limited.
The amino acids constituting the heterologous protein may be natural, non-natural, or modified. The amino acid sequence of the protein may be artificially modified or may be designed de-novo.

また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られることを特徴とする。
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することで、異種タンパク質の生産性が向上したオガタエア属酵母を得ることができる。さらに、不活性化するベクターと異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを別にすることで、該異種タンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターを前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の位置以外に１コピー以上導入して発現量を増大させること、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列が１コピー以上存在するプラスミドや人工染色体を導入して発現量を増大させること、また、育種改良において前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の不活性化に用いた栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子の破壊時に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列も同時に破壊させてしまうことを防ぐため、効率よく異種タンパク質の生産性を向上させることができる。 The yeast of the genus Ogataea of the present invention is a base sequence having a homologous region with the gene described in any of (a) to (d) above, and the promoter of the gene described in any of (a) to (d) above. A vector comprising at least one of a base sequence having a homologous region and / or at least one of a base sequence having a homologous region and the terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above, It is obtained by transforming a vector containing a base sequence encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence.
A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and / or Or a vector containing at least one of the base sequences having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above, and a base encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence of a heterologous protein By transforming a vector containing the sequence, Ogataea yeast with improved productivity of the heterologous protein can be obtained. Furthermore, the vector containing the base sequence encoding the heterologous protein is separated from the vector to be inactivated and the vector containing the base sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of the heterologous protein. Introducing one or more copies other than the position of the gene described in (d) to increase the expression level, plasmids or artificially containing one or more base sequences encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein Introducing a chromosome to increase the expression level, or disrupting the auxotrophic complementary gene or drug resistance gene used for inactivation of the gene according to any one of (a) to (d) above in breeding improvement Prevents simultaneous destruction of the base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of a heterologous protein Therefore, it is possible to improve the productivity of efficiently heterologous protein.

さらに、本発明のオガタエア属酵母は、
以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のいずれかの遺伝子：
（ｅ）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｆ）配列番号３０に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｇ）配列番号３０に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｈ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化されたことを特徴とする。 Furthermore, the Ogataea yeast of the present invention,
Any of the following genes (e), (f), (g) or (h):
(E) a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30;
(F) a gene comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 30;
(G) a gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30;
(H) a gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32;
Is inactivated.

本発明において「配列番号３０に示す塩基配列」は、オガタエア・アングスタの染色体ＤＮＡの網羅的解析により見出された遺伝子であり、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化されたオガタエア属酵母に対して、さらに該遺伝子を不活性化させることで異種タンパク質の分泌生産性がより向上する。なお、配列番号３０に示す塩基配列のみを不活性化させても、異種タンパク質の分泌生産性は向上せず、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と併せて不活性化させることで分泌生産性が向上するという特異性を有す。配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化する例としては、配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の上流に位置するプロモーターの８０ｂｐと１００％の配列同一性を有する塩基配列（例えば、配列番号２８の１〜８０番目の塩基配列）及び、配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の下流に位置するターミネーターの相補配列７８ｂｐと１００％の配列同一性を有する塩基配列（例えば、配列番号２９の１〜７８番目の塩基配列）をそれぞれプライマー１８および１９の内部配列として用いてＰＣＲ産物を調製し、該ＰＣＲ産物をベクターとしてオガタエア属酵母に形質転換する方法が挙げられる。なお、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子を１つのベクターに組み込んでも良いし、それぞれ別々のベクターに組み込んでも良い。
また、配列番号３０に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子、配列番号３０に示す塩基配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子も配列番号２７に示す塩基配列と併せて不活性化させることで、配列番号３０に示す塩基配列の場合と同様に異種タンパク質の分泌生産性がより向上する。 In the present invention, the “base sequence shown in SEQ ID NO: 30” is a gene found by exhaustive analysis of the chromosomal DNA of Ogata Air Angsta, and the gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 is inactivated. By further inactivating the gene from the genus yeast, the secretory productivity of the heterologous protein is further improved. Inactivation of only the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 does not improve the secretion productivity of the heterologous protein, and inactivation together with the gene described in any of (a) to (d) above. It has the specificity that secretory productivity improves by doing. As an example of inactivating the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30, a base sequence having 100% sequence identity with 80 bp of the promoter located upstream of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 (for example, , And the base sequence having 100% sequence identity with the complementary sequence 78 bp of the terminator located downstream of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 (SEQ ID NO: 28) A PCR product is prepared using the 1st to 78th nucleotide sequences of No. 29 as the internal sequences of primers 18 and 19, respectively, and the PCR product is used as a vector to transform Ogataae yeast. The gene described in any of (a) to (d) and the gene described in any of (e) to (h) may be incorporated into one vector, or may be incorporated into separate vectors. good.
Further, a gene consisting of a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 30, 85% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 30, more preferably 90% or more, More preferably, a gene consisting of a base sequence having a sequence identity of 95% or more, most preferably 99% or more and a gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 are also shown in SEQ ID NO: 27 By inactivating together with the base sequence, the secretion productivity of the heterologous protein is further improved as in the case of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30.

本発明において「配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子」とは、配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコドン表に基づいて設計される塩基配列からなる遺伝子のことを指し、例えば、配列番号３０に示す遺伝子が挙げられる。そして、当該遺伝子と前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子を併せて不活性化させることで、異種タンパク質の分泌生産性をより向上させることができる。   In the present invention, “a gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32” refers to a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32 from a base sequence designed based on the codon table. For example, the gene shown in SEQ ID NO: 30 can be mentioned. And the secretion productivity of heterogeneous protein can be improved more by inactivating together the said gene and the gene in any one of said (a)-(d).

また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られることを特徴とする。上記とおり、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列と前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列を別々のベクターに組み込んで形質転換することによって、染色体上に離れて存在する前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子を同時に且つ効率的に不活性化することができる、つまり別々のベクターにする事で一方の遺伝子のみが不活性化された形質転換体を選択する可能性を軽減することができるため好ましい。   The yeast of the genus Ogataea of the present invention is a base sequence having a homologous region with the gene described in any of (a) to (d) above, and the promoter of the gene described in any of (a) to (d) above. And / or a vector containing at least one of a base sequence having a homologous region and a base sequence having a homologous region and / or a terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above, ) To (h) a base sequence having a homologous region with the gene according to any one of the above, (e) to (h) a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any one of It is obtained by transforming the terminator of the gene according to any one of e) to (h) and a vector containing at least one of the base sequences having a homologous region. . As described above, a base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d) above, and a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d) above And / or a base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d) and a base having a homologous region with the gene according to any of (e) to (h) above A sequence, a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (e) to (h), and / or a terminator and a homologous region of the gene according to any of (e) to (h) The gene according to any one of (a) to (d) and any one of (e) to (h) that are separated from each other on a chromosome by incorporating and transforming a base sequence having a sequence into a separate vector Crab Can be simultaneously and efficiently inactivate gene, only one of the genes in other words it into separate vectors is preferred because it is possible to reduce the possibility of selecting the inactivation transformants.

また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られることを特徴とする。
上記とおり、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターと前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターをそれぞれ形質転換することによって、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の位置に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを導入し、生育や分泌生産等に必須な他の遺伝子を不活性化させることがないため効率よく異種タンパク質を分泌生産することができる。 The yeast of the genus Ogataea of the present invention is a base sequence having a homologous region with the gene described in any of (a) to (d) above, and the promoter of the gene described in any of (a) to (d) above. And / or at least one of the base sequence having a homologous region and the terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above, and upstream of the base sequence Or a vector containing a base sequence encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence of a heterologous protein downstream, and a base sequence having a region homologous to the gene of any one of (e) to (h), (e) A nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any one of (h) and / or the terminator and homologous region of the gene according to any of (e) to (h) above Any one of the nucleotide sequences and a vector comprising at least one, characterized in that it is obtained by transforming.
As described above, a base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d) above, and a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d) above And / or at least one base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above, and an amino acid of a heterologous protein upstream or downstream of the base sequence A vector containing a base sequence encoding a polypeptide comprising a sequence, a base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (e) to (h), and any of the above (e) to (h) Any of a nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of the gene described above and / or a nucleotide sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (e) to (h) above A base sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein at the position of the gene according to any one of (a) to (d) above by transforming a vector containing at least one of Since a vector is introduced and other genes essential for growth, secretion production, etc. are not inactivated, heterologous proteins can be efficiently secreted and produced.

また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られることを特徴とする。
上記とおり、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターをそれぞれ形質転換することによって、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子の位置に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを導入し、生育や分泌生産等に必須な他の遺伝子を不活性化させることがないため効率よく異種タンパク質を分泌生産することができる。 The yeast of the genus Ogataea of the present invention is a base sequence having a homologous region with the gene described in any of (a) to (d) above, and the promoter of the gene described in any of (a) to (d) above. And / or a vector containing at least one of a base sequence having a homologous region and a base sequence having a homologous region and / or a terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above, ) To (h) a base sequence having a homologous region with the gene according to any one of the above, (e) to (h) a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any one of e) containing at least one base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (h) to (h), and an amino acid sequence of a heterologous protein upstream or downstream of the base sequence A vector containing a base sequence encoding the Ranaru polypeptide characterized in that it is obtained by transforming.
As described above, a base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d) above, and a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d) above And / or a vector containing at least one of the base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and any of (e) to (h) above A nucleotide sequence having a homologous region with the gene according to any one of the above, a nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of the above (e) to (h), and / or the above (e) to (h) A polypeptide comprising at least one base sequence having a homologous region with the terminator of any of the genes, and comprising an amino acid sequence of a heterologous protein upstream or downstream of the base sequence A base sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein at the position of the gene according to any one of (e) to (h) by transforming a vector containing the base sequence to be loaded. Since the contained vector is not introduced to inactivate other genes essential for growth, secretory production, etc., the heterologous protein can be efficiently secreted and produced.

また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、及び異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られることを特徴とする。
上記とおり、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、及び異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターをそれぞれ形質転換することによって、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の位置以外や前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子の位置以外に１コピー以上導入して発現量を増大させること、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列が１コピー以上存在するプラスミドや人工染色体を導入して発現量を増大させること、また、育種改良において前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子や前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子の不活性化に用いた栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子の破壊時に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列も同時に破壊させてしまうことを防ぐため、効率よく異種タンパク質を分泌生産することができる。 The yeast of the genus Ogataea of the present invention is a base sequence having a homologous region with the gene described in any of (a) to (d) above, and the promoter of the gene described in any of (a) to (d) above. And / or a vector containing at least one of the base sequence having a homologous region and the terminator of the gene according to any one of (a) to (d) above, (e) To (h) a nucleotide sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (h), a nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (e) to (h), and / or the (e ) To (h), a vector comprising at least one of the base sequences having a homologous region with the terminator of the gene, and a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein A vector containing a nucleotide sequence encoding a de characterized in that it is obtained by transforming.
As described above, a base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d) above, and a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d) above And / or a vector containing at least one of the base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), any of (e) to (h) Any one of the base sequence having a homologous region with the gene according to any one of the above, (e) to (h), the base sequence having the homologous region with the promoter of the gene according to any one of the above (e) to (h) A vector containing at least one of the base sequences having a homologous region with the terminator of the gene described above, and a base sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein A vector containing a base sequence encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence of a heterologous protein, respectively, by transforming a vector containing a protein other than the position of the gene according to any one of the above (a) to (d) Introducing one or more copies other than the position of the gene according to any one of (e) to (h) to increase the expression level, and one or more base sequences encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein Introducing an existing plasmid or artificial chromosome to increase the expression level, or in breeding improvement, the gene according to any one of (a) to (d) above or any one of (e) to (h) above A polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein upon disruption of an auxotrophic complementary gene or drug resistance gene used for inactivation of the gene described To prevent base sequence encoding also would not be destroyed at the same time, it is possible to secrete efficiently produce the heterologous protein.

本発明の異種タンパク質の製造方法は、上記ベクターにより形質転換された酵母を培養し、培養物から異種タンパク質を回収する工程を含む。ここで、「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、培養菌体、または細胞若しくは菌体の破砕物を意味する。よって、本発明の形質転換酵母を用いて異種タンパク質を生産する方法としては、上記の形質転換酵母を培養し、その菌体中または培養上清中に蓄積させる方法が挙げられる。  The method for producing a heterologous protein of the present invention includes a step of culturing a yeast transformed with the vector and recovering the heterologous protein from the culture. Here, “culture” means cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells in addition to the culture supernatant. Therefore, as a method for producing a heterologous protein using the transformed yeast of the present invention, a method of culturing the above-described transformed yeast and accumulating it in the cells or the culture supernatant can be mentioned.

形質転換酵母を培養する方法は、その酵母の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。酵母の場合、培養する培地としては、酵母が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類等を含有し、形質転換酵母の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該酵母が資化し得るものであればよく、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等が挙げられ、窒素源としては、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等が挙げられ、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、培養はバッチ培養や連続培養のいずれでも可能である。
本発明の好ましい態様として、酵母にオガタエア属酵母を用いた場合、上記炭素源は、グルコース、グリセロール、メタノールの１種でもよく、または２種以上であってもよい。また、これらの炭素源は培養初期から存在していてもよいし、培養途中に添加してもよい。
形質転換体の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、酵母の場合、ｐＨ２．５〜１０．０、温度範囲１０℃〜４８℃の範囲で、好気的に１０時間〜１０日間培養することにより行うことができる。 The method for culturing the transformed yeast can be carried out according to the usual method used for culturing the yeast. In the case of yeast, the culture medium for culturing includes a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, vitamins and the like that can be assimilated by the yeast, so long as it is capable of efficiently cultivating transformed yeast. Either a medium or a synthetic medium may be used. The carbon source may be anything that can be assimilated by the yeast, sugars such as glucose, sucrose and maltose, organic acids such as lactic acid, acetic acid, citric acid and propionic acid, and alcohols such as methanol, ethanol and glycerol. , Hydrocarbons such as paraffin, oils and fats such as soybean oil and rapeseed oil, or mixtures thereof, etc., and nitrogen sources include ammonium sulfate, ammonium phosphate, urea, yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor Examples of inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate. Further, the culture can be either batch culture or continuous culture.
As a preferred embodiment of the present invention, when Ogataae yeast is used as the yeast, the carbon source may be one of glucose, glycerol, and methanol, or two or more thereof. Moreover, these carbon sources may exist from the beginning of the culture, or may be added during the culture.
The transformant can be cultured under ordinary conditions. For example, in the case of yeast, the pH is 2.5 to 10.0, and the temperature range is 10 ° C. to 48 ° C., aerobically 10 hours to 10 days. It can be performed by culturing.

本発明の形質転換酵母を用いて生産された異種タンパク質は、培養上清に存在する状態であってもよいし、菌体内に蓄積している状態であってもよいし、そこから任意の方法で回収したものでもよい。培養上清や菌体内からの異種タンパク質の回収は、公知のタンパク質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、まず、当該形質転換酵母を適当な培地で培養し、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除く。得られた培養上清を、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該培養上清から異種タンパク質を回収する。
回収された異種タンパク質は、そのまま使用することもできるが、その後ＰＥＧ化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用してもよい。
異種タンパク質を菌体外に分泌させる場合には、該異種タンパク質遺伝子の５’末端にシグナル配列をコードする塩基配列を導入すればよい。シグナル配列をコードする塩基配列は、酵母が分泌発現できるシグナル配列をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエのＭａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ α（ＭＦα）やオガタエア・アングスタの酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、コマガタエラ・パストリスの酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、サッカロマイセス・セレビシエのインベルターゼ（ＳＵＣ２）、サッカロマイセス・セレビシエのＰＬＢ１、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリンのシグナル配列をコードする塩基配列などが挙げられる。 The heterologous protein produced using the transformed yeast of the present invention may be present in the culture supernatant, may be accumulated in the microbial cells, or any method therefrom. The one collected in step 1 may be used. The recovery of the heterologous protein from the culture supernatant or the microbial cells can be carried out by using an appropriate combination of known protein purification methods. For example, first, the transformed yeast is cultured in an appropriate medium, and the cells are removed from the culture supernatant by centrifugation of the culture solution or filtration. The obtained culture supernatant is subjected to salting out (ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (protein fraction precipitation with acetone or ethanol, etc.), dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography. A heterologous protein is recovered from the culture supernatant by using techniques such as chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, ultrafiltration alone or in combination.
The recovered heterologous protein can be used as it is, but it can also be used after adding a modification that causes a pharmacological change such as PEGylation or a function that adds a function such as an enzyme or an isotope. Various formulation treatments may also be used.
When a heterologous protein is secreted outside the microbial cell, a base sequence encoding a signal sequence may be introduced at the 5 ′ end of the heterologous protein gene. The base sequence encoding the signal sequence is not particularly limited as long as it is a base sequence encoding a signal sequence that can be secreted and expressed by yeast. However, Saccharomyces cerevisiae Mating Factor α (MFα), Ogata Air Angsta acid phosphatase (PHO1), Komagataela pastoris acid phosphatase (PHO1), Saccharomyces cerevisiae invertase (SUC2), Saccharomyces cerevisiae PLB1, bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), nucleotide sequence encoding immunoglobulin signal sequence, etc. Is mentioned.

本発明における異種タンパク質のプロモーターは、形質転換酵母内において異種タンパク質を発現させるプロモーターであれば特に限定されない。好ましくはメタノール誘導性プロモーターである。
本発明のメタノール誘導性プロモーターは、炭素源がメタノールの際に転写活性を有するプロモーターであれば特に制限されないが、好ましくはＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＣＡＴプロモーター、ＤＨＡＳプロモーター、ＦＤＨプロモーター、ＦＭＤプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＭＯＸプロモーターなどが挙げられる。 The promoter of the heterologous protein in the present invention is not particularly limited as long as it is a promoter that allows the heterologous protein to be expressed in the transformed yeast. A methanol-inducible promoter is preferred.
The methanol-inducible promoter of the present invention is not particularly limited as long as it is a promoter having transcription activity when the carbon source is methanol. Preferably, the AOX1 promoter, AOX2 promoter, CAT promoter, DHAS promoter, FDH promoter, FMD promoter, GAP Examples include promoters and MOX promoters.

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited by these. Detailed operation methods relating to the recombinant DNA technology used in the following examples are described in the following documents:
Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocolsin Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience), Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience).

また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築した抗体発現ベクターを大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）にそれぞれ導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。   In the following examples, the plasmid used for yeast transformation is the constructed antibody expression vector expressed by E. coli E. coli. Each was introduced into E. coli DH5α competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.), and the resulting transformant was cultured and amplified. Preparation of the plasmid from the plasmid-carrying strain was performed using QIAprep spin miniprep kit (manufactured by QIAGEN).

抗体発現ベクターの構築において利用したＭＯＸプロモーター（配列番号１）、ＭＯＸターミネーター（配列番号２）、ＬＥＵ２遺伝子（配列番号３）は、オガタエア・ポリモルファ ８Ｖ株の染色体ＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。Ｍａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒαプレプロシグナル遺伝子（ＭＦα、配列番号４）は、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８ｃ株の染色体ＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。   The MOX promoter (SEQ ID NO: 1), MOX terminator (SEQ ID NO: 2), and LEU2 gene (SEQ ID NO: 3) used in the construction of the antibody expression vector were prepared by PCR using the chromosomal DNA of Ogata Air polymorpha 8V strain as a template. The mating factor α prepro signal gene (MFα, SEQ ID NO: 4) was prepared by PCR using the chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae S288c strain as a template.

抗体遺伝子は、完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α 抗体の配列（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ；ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））の公開配列情報に基づいて、Ｌ鎖遺伝子（配列番号５）、Ｆｄ鎖遺伝子（配列番号６）を化学合成した（特開２００９−０８２０３３）ものをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。
遺伝子不活性化用ベクターの構築において利用したプロモーターで制御されたＧ４１８耐性遺伝子（配列番号７）、プロモーターで制御されたＺｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子（配列番号８）はオガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５株の染色体ＤＮＡ、合成ＤＮＡ等をテンプレートにしてＰＣＲで調製した。 Based on the public sequence information of the fully humanized anti-TNF-α antibody sequence (adalimumab; HUMIRA (registered trademark)), the antibody gene is the L chain gene (SEQ ID NO: 5) and Fd chain gene (SEQ ID NO: 6). It was prepared by PCR using a chemically synthesized product (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-082033) as a template.
The G418 resistance gene (SEQ ID NO: 7) controlled by the promoter used in the construction of the vector for gene inactivation and the Zeocin (registered trademark) resistance gene (SEQ ID NO: 8) controlled by the promoter are the chromosomes of the Ogata Air Angsta NCYC495 strain. It was prepared by PCR using DNA, synthetic DNA or the like as a template.

ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体ＤＮＡの調製は、各菌株からＧｅｎとるくん（登録商標）タカラバイオ社製）等を用いて、これに記載の条件で実施した。   For PCR, Prime STAR HS DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) or the like was used, and the reaction conditions were as described in the attached manual. Chromosomal DNA was prepared from each strain using Gen Toru-kun (registered trademark) Takara Bio Inc.) and the like under the conditions described therein.

（実施例１）完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現ベクターの構築
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＭｕｎＩ−ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片（配列番号９）を全合成し、これをｐＵＣ１９（タカラバイオ社製、Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ３２１９）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイト間に挿入して、ｐＵＣ−１を調製した。また、ＬＥＵ２遺伝子の両側にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー１および２（配列番号１０および１１）を用いたＰＣＲにより調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ処理後にｐＵＣ−１のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−２を調製した。次に、ＭＯＸプロモーターの両側にＢａｍＨＩ認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー３および４（配列番号１２および１３）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後にｐＵＣ−２のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−Ｐｍｏｘを調製した。ＭＯＸプロモーターの両側にＭｕｎＩ認識配列を付加した遺伝子断片をプライマー５および６（配列番号１４および１５）を用いたＰＣＲにより調製し、ＭｕｎＩ処理後にｐＵＣ−ＰｍｏｘのＭｕｎＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＰｍｏｘを調製した。ＭＯＸターミネーターの両側にＸｂａＩ認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー７および８（配列番号１６および１７）を用いたＰＣＲにより調製し、ＸｂａＩ処理後にｐＵＣ−ＰｍｏｘＰｍｏｘのＸｂａＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＰｍｏｘＴｍを調製した。ＭＦαの上流にＳｐｅＩ認識配列を付加した遺伝子断片をプライマー９および１０（配列番号１８および１９）を用いたＰＣＲにより調製した。Ｌ鎖の上流にＭＦαの３’末端１９ｂｐを付加し、下流にＳｐｅＩ認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー１１および１２（配列番号２０および２１）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにして、プライマー９および１２を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＬ鎖の融合遺伝子の両側にＳｐｅＩ認識配列を付加した遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＳｐｅＩ処理後、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＰｍｏｘＴｍのＳｐｅＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＴｍを構築した。一方、ＭＦαの上流にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した遺伝子断片をプライマー１３（配列番号２２）および１０を用いたＰＣＲにより調製した。Ｆｄ鎖の上流にＭＦαの３’末端１９ｂｐを付加し、下流にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー１４および１５（配列番号２３および２４）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにし、プライマー１３および１５を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＦｄ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを構築した。このｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖がＭＯＸプロモーター制御下で発現するように設計されている。 (Example 1) Construction of fully humanized anti-TNF-α Fab antibody expression vector Total synthesis of a gene fragment (SEQ ID NO: 9) having a multiple cloning site of HindIII-NotI-BamHI-SpeI-MunI-BglII-XbaI-EcoRI This was inserted between the HindIII-EcoRI sites of pUC19 (Takara Bio, Code No. 3219) to prepare pUC-1. In addition, a gene fragment having HindIII recognition sequences added to both sides of the LEU2 gene was prepared by PCR using primers 1 and 2 (SEQ ID NOs: 10 and 11), inserted into the HindIII site of pUC-1 after HindIII treatment, pUC-2 was prepared. Next, a gene fragment having a BamHI recognition sequence added on both sides of the MOX promoter was prepared by PCR using primers 3 and 4 (SEQ ID NOs: 12 and 13), and after BamHI treatment, inserted into the BamHI site of pUC-2. PUC-Pmox was prepared. A gene fragment having MunI recognition sequences added to both sides of the MOX promoter was prepared by PCR using primers 5 and 6 (SEQ ID NOs: 14 and 15), inserted into the MUC site of pUC-Pmox after treatment with MUNI, and pUC-PmoxPmox. Was prepared. A gene fragment having an XbaI recognition sequence added on both sides of the MOX terminator was prepared by PCR using primers 7 and 8 (SEQ ID NOs: 16 and 17), inserted into the XbaI site of pUC-PmoxPmox after treatment with XbaI, and pUC- PmoxPmoxTm was prepared. A gene fragment having a SpeI recognition sequence added upstream of MFα was prepared by PCR using primers 9 and 10 (SEQ ID NOs: 18 and 19). A gene fragment in which 19 bp of MFα was added upstream of the L chain and a SpeI recognition sequence was added downstream was prepared by PCR using primers 11 and 12 (SEQ ID NOs: 20 and 21). These gene fragments were mixed to form a template, and a gene fragment in which a SpeI recognition sequence was added to both sides of the fusion gene of MFα and L chain was prepared by PCR using primers 9 and 12. This gene fragment was treated with SpeI and then inserted into the SpeI site of pUC-PmoxPmoxTm to construct pUC-PmoxLPmoxTm. On the other hand, a gene fragment having a BglII recognition sequence added upstream of MFα was prepared by PCR using primers 13 (SEQ ID NO: 22) and 10. A gene fragment in which 19 bp of MFα was added upstream of the Fd chain and a BglII recognition sequence was added downstream was prepared by PCR using primers 14 and 15 (SEQ ID NOs: 23 and 24). These gene fragments were mixed to form a template, and a gene fragment in which BglII recognition sequences were added to both sides of the fusion gene of MFα and Fd chain was prepared by PCR using primers 13 and 15. This gene fragment was treated with BglII and inserted into the BglII site of pUC-PmoxLPmoxTm to construct pUC-PmoxLPmoxFdTm. This pUC-PmoxLPmoxFdTm is designed so that the L chain and Fd chain of the Fab-type antibody are expressed under the control of the MOX promoter.

（実施例２）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターの構築
プロモーターで制御されたＧ４１８耐性遺伝子（配列番号７）の両側に形質転換のための相同領域を付加した遺伝子断片を、プライマー１６および１７（配列番号２５および２６）を用いたＰＣＲにより調製した。
本ベクターはオガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５株の配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の上流８０塩基配列及び下流８０塩基配列を相同領域として、プロモーターで制御されたＧ４１８耐性遺伝子の両側に付加されたベクターであり、酵母に形質転換することで配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化されるように設計されている。 (Example 2) Construction of a vector for inactivating a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 Gene having a homologous region for transformation added to both sides of a G418 resistance gene (SEQ ID NO: 7) controlled by a promoter Fragments were prepared by PCR using primers 16 and 17 (SEQ ID NOs: 25 and 26).
This vector is a vector added on both sides of a promoter-controlled G418 resistance gene using the upstream 80 base sequence and downstream 80 base sequence of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 of Ogata Air Angsta NCYC495 strain as homologous regions. Yes, it is designed so that the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 is inactivated by transformation into yeast.

（実施例３）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターの構築
プロモーターで制御されたＺｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子（配列番号８）の両側に形質転換のための相同領域を付加した遺伝子断片を、プライマー１８および１９（配列番号２８および２９）を用いたＰＣＲにより調製した。
本ベクターはオガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５株の配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の上流８０塩基配列及び下流７８塩基配列を相同領域として、プロモーターで制御されたＺｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子の両側に付加されたベクターであり、酵母に形質転換することで配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化されるように設計されている。 (Example 3) Construction of a vector for inactivating a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 A homologous region for transformation on both sides of a Zeocin (registered trademark) resistance gene (SEQ ID NO: 8) controlled by a promoter The gene fragment to which was added was prepared by PCR using primers 18 and 19 (SEQ ID NOs: 28 and 29).
This vector is added to both sides of a promoter-controlled Zeocin® resistance gene using the 80 base sequence upstream and 78 base sequence downstream of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 of the Ogata Air Angsta NCYC495 strain as homologous regions. This vector is designed to inactivate the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 when transformed into yeast.

（実施例４）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母の取得
実施例２で構築した配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター及び実施例３で構築した配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターを用いて、以下のようにオガタエア・アングスタを形質転換した。オガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５ロイシン要求性株を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％ ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで３７℃で振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー， ｐＨ７．５に再懸濁した。この懸濁液を３７℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム，ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５ｍｌの氷冷ＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。ベクターは実施例２及び３で調製したものをＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）を用いて精製し、溶液を調製した。コンピテントセル溶液６０μｌと配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター溶液３μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωのパルスに供した後、菌体をＹＰＤ培地１ｍｌで懸濁し、３７℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、上清９５０μｌを廃棄した。残った溶液で再懸濁し、ＹＰＤＧ４１８選択寒天プレート（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％ ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％アガロース、０．０５％Ｇ４１８二硫酸塩（ナカライテスク社製））に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択した。また、コンピテントセル溶液６０μｌと配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター溶液１．５μｌと配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター溶液１．５μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωのパルスに供した後、菌体をＹＰＤ培地１ｍｌで懸濁し、３７℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、上清９５０μｌを廃棄した。残った溶液で再懸濁し、ＹＰＤＧ４１８Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）選択寒天プレート（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％ ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％アガロース、０．０５％Ｇ４１８二硫酸塩（ナカライテスク社製）、０．０１％Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択した。これにより、オガタエア・アングスタ配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母、オガタエア・アングスタ配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母を取得した。 (Example 4) Obtaining a gene inactive yeast consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27, a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27, and a gene inactive yeast consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 constructed in Example 2 Using the gene inactivation vector consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and the gene inactivation vector consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 constructed in Example 3, Angsta was transformed. Ogata Air Angsta NCYC495 leucine-requiring strain was inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% glucose) Thus, a preculture solution was obtained. 500 μl of the obtained preculture solution was inoculated into 50 ml of YPD medium, and after shaking culture at 37 ° C. until OD600 became 1 to 1.5, cells were collected (3000 × g, 10 minutes, 20 ° C.), and 250 μl of Resuspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 1 M DTT (final concentration 25 mM). This suspension was incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and then collected (3000 × g, 10 minutes, 20 ° C.), and ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) 5). The washings were collected (3000 × g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of ice-cold STM buffer, and then collected (3000 × g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 μl of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution. The vector prepared in Examples 2 and 3 was purified using FastGene Gel / PCR Extraction Kit (manufactured by Nippon Genetics) to prepare a solution. Mix 60 μl of the competent cell solution and 3 μl of the vector inactivation vector solution for the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27, and transfer to a cuvette for electroporation (disposed cuvette electrode, electrode spacing 2 mm; manufactured by BM Instruments). 7.5 kV / cm, 10 μF, 900Ω pulse, and then the cells were suspended in 1 ml of YPD medium and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. After standing for 1 hour, the cells were collected (3000 × g, 5 minutes, room temperature), and 950 μl of the supernatant was discarded. Resuspended with the remaining solution, YPDG418 selective agar plate (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Japan Pharmaceutical), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.05% G418 A strain that was applied to sulfate (manufactured by Nacalai Tesque) and grown by static culture at 30 ° C. for 3 days was selected. Further, 60 μl of a competent cell solution and 1.5 μl of a gene inactivation vector solution consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and 1.5 μl of a gene inactivation vector solution consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 Mix, transfer to a cuvette for electroporation (dispo cuvette electrode, electrode spacing 2 mm; manufactured by BM Instruments Co., Ltd.), and subject to a pulse of 7.5 kV / cm, 10 μF, 900Ω, then suspend the cells in 1 ml of YPD medium. It became cloudy and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. After standing for 1 hour, the cells were collected (3000 × g, 5 minutes, room temperature), and 950 μl of the supernatant was discarded. Resuspended with the remaining solution, YPDG418 Zeocin (registered trademark) selection agar plate (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical), 2% glucose, 1.5% agarose, 0. A strain that was applied to 05% G418 disulfate (manufactured by Nacalai Tesque) and 0.01% Zeocin (registered trademark) (manufactured by Life Technologies) was selected by growing at 30 ° C. for 3 days. Thereby, a gene inactive yeast consisting of the base sequence shown in Ogata Air Angsta SEQ ID NO: 27, a gene consisting of the base sequence shown in Ogata Air Angsta SEQ ID NO: 27, and a gene inactive yeast consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 were obtained. .

（比較例１）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母の取得
実施例３で構築した配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターを用いて、以下のようにオガタエア・アングスタを形質転換した。オガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５ロイシン要求性株を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％ ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで３７℃で振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー， ｐＨ７．５に再懸濁した。この懸濁液を３７℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５ｍｌの氷冷ＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。ベクターは実施例３で調製したものをＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）を用いて精製し、溶液を調製した。コンピテントセル溶液６０μｌとベクター溶液３μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωのパルスに供した後、菌体をＹＰＤ培地１ｍｌで懸濁し、３７℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、上清９５０μｌを廃棄した。残った溶液で再懸濁し、ＹＰＤＺｅｏｃｉｎ選択寒天プレート（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％ ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％アガロース、０．０１％Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択した。これにより、オガタエア・アングスタ配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母を取得した。 (Comparative Example 1) Obtaining a gene inactive yeast consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 Using the gene inactivation vector consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 constructed in Example 3, as follows Ogata Air Angsta was transformed. Ogata Air Angsta NCYC495 leucine-requiring strain was inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% glucose) Thus, a preculture solution was obtained. 500 μl of the obtained preculture solution was inoculated into 50 ml of YPD medium, and after shaking culture at 37 ° C. until OD600 became 1 to 1.5, cells were collected (3000 × g, 10 minutes, 20 ° C.), and 250 μl of Resuspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 1 M DTT (final concentration 25 mM). This suspension was incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and then collected (3000 × g, 10 minutes, 20 ° C.) and pre-ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) 5). The washings were collected (3000 × g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of ice-cold STM buffer, and then collected (3000 × g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 μl of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution. The vector prepared in Example 3 was purified using FastGene Gel / PCR Extraction Kit (manufactured by Nippon Genetics) to prepare a solution. 60 μl of the competent cell solution and 3 μl of the vector solution were mixed, transferred to an electroporation cuvette (dispo cuvette electrode, electrode spacing 2 mm; manufactured by BM Instruments), and subjected to a pulse of 7.5 kV / cm, 10 μF, 900Ω. Thereafter, the cells were suspended in 1 ml of YPD medium and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. After standing for 1 hour, the cells were collected (3000 × g, 5 minutes, room temperature), and 950 μl of the supernatant was discarded. Resuspended in the remaining solution, YPDZeocin selection agar plate (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.01% Zeocin ( (Registered trademark) (manufactured by Life Technologies)), and a strain that grows by static culture at 30 ° C. for 3 days was selected. As a result, a gene-inactive yeast consisting of the base sequence represented by Ogata Air Angsta SEQ ID NO: 30 was obtained.

（実施例５）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母の取得、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母の取得
実施例１で構築したｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を５ｍｌの２ＹＴ培地（１．６％ ｔｒｙｐｔｏｎｅ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．０％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％ ＮａＣｌ）で培養し、得られた菌体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを取得した。本プラスミドをＭＯＸターミネーター遺伝子内のＥｃｏＲＶサイトで切断して直鎖状にした。この直鎖状のｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを用いて、以下のようにオガタエア・アングスタを形質転換した。実施例４で取得したオガタエア・アングスタ配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母、実施例４で取得したオガタエア・アングスタ配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母、またはオガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５ロイシン要求性株を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％ ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで３７℃で振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．５に再懸濁した。この懸濁液を３７℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １ｍＭ塩化マグネシウム， ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５ｍｌの氷冷ＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。このコンピテントセル溶液６０μｌと直鎖状のｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍ 溶液３μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωに供した後、菌体を１ｍｌのＹＰＤ培地で懸濁し、３７℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、１ｍｌのＹＮＢ培地（０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製））に懸濁後、再度集菌（３０００×ｇ、５分、室温）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で再懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレート（０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．５％アガロース、２％グルコース）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母、完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母を取得した。 (Example 5) Acquisition of a gene-inactive fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27, a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 30 Obtaining a gene-inactive fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast comprising pUC-PmoxLPmoxFdTm constructed in Example 1 and transforming the resulting transformant into 5 ml of 2YT medium (1 .6% tryptone bacto (manufactured by Difco), 1.0% yeast extract bacto (manufactured by Difco), 0.5% NaCl), and QIAprep spin miniprep kit (manufactured by QIAGEN) from the resulting cells. Used to obtain pUC-PmoxLPmoxFdTm. This plasmid was linearized by cutting at the EcoRV site in the MOX terminator gene. Ogata Air Angsta was transformed with this linear pUC-PmoxLPmoxFdTm as follows. Gene inactive yeast consisting of the base sequence shown in Ogata Air Angsta SEQ ID NO: 27 obtained in Example 4, the gene consisting of the base sequence shown in Ogata Air Angsta SEQ ID NO: 27 obtained in Example 4 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 3% YPD medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Difco), 2% polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose) is inoculated with a gene-inactive yeast consisting of or Ogataea Angsta NCYC495 leucine-requiring strain The preculture was obtained by shaking culture at 37 ° C. overnight. 500 μl of the obtained preculture solution was inoculated into 50 ml of YPD medium, and after shaking culture at 37 ° C. until OD600 became 1 to 1.5, cells were collected (3000 × g, 10 minutes, 20 ° C.), and 250 μl of Resuspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 1 M DTT (final concentration 25 mM). This suspension was incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and then collected (3000 × g, 10 minutes, 20 ° C.), and ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) 5). The washings were collected (3000 × g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of ice-cold STM buffer, and then collected (3000 × g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 μl of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution. 60 μl of this competent cell solution and 3 μl of linear pUC-PmoxLPmoxFdTm solution were mixed and transferred to an electroporation cuvette (dispos cuvette electrode, electrode spacing 2 mm; manufactured by BM Instruments), 7.5 kV / cm, 10 μF The cells were suspended in 1 ml of YPD medium and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. After standing for 1 hour, the cells were collected (3000 × g, 5 minutes, room temperature), suspended in 1 ml of YNB medium (0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid (manufactured by Difco)), and then collected again ( 3000 × g, 5 minutes, room temperature). The cells were resuspended in an appropriate amount of YNB medium and then applied to a YNB selective agar plate (0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid (manufactured by Difco), 1.5% agarose, 2% glucose). A strain that grows in static culture at 3 ° C. for 3 days is selected, and a gene-inactive fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27, consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 A gene-inactive fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast and a fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast comprising the gene and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 were obtained.

（比較例２）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母の取得
実施例１で構築したｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を５ｍｌの２ＹＴ培地（１．６％ ｔｒｙｐｔｏｎｅ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．０％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％ ＮａＣｌ）で培養し、得られた菌体からＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを取得した。本プラスミドをＭＯＸターミネーター遺伝子内のＥｃｏＲＶサイトで切断して直鎖状にした。この直鎖状のｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを用いて、以下のようにオガタエア・アングスタを形質転換した。比較例１で取得したオガタエア・アングスタ配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％ ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで３７℃で振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．５に再懸濁した。この懸濁液を３７℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５ｍｌの氷冷ＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。このコンピテントセル溶液６０μｌと直鎖状のｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍ 溶液３μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωに供した後、菌体を１ｍｌのＹＰＤ培地で懸濁し、３７℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、１ｍｌのＹＮＢ培地（０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製））に懸濁後、再度集菌（３０００×ｇ、５分、室温）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で再懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレート（０．６７％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．５％アガロース、２％グルコース）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母を取得した。 (Comparative Example 2) Obtaining a gene-inactive fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 transformed with E. coli using the pUC-PmoxLPmoxFdTm constructed in Example 1 The resulting transformant was cultured in 5 ml of 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Difco), 1.0% yeast extract bacto (Difco), 0.5% NaCl), and the resulting bacteria PUC-PmoxLPmoxFdTm was obtained from the body using QIAprep spin miniprep kit (manufactured by QIAGEN). This plasmid was linearized by cutting at the EcoRV site in the MOX terminator gene. Ogata Air Angsta was transformed with this linear pUC-PmoxLPmoxFdTm as follows. 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Difco), 2% polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2 ml of a gene-inactive yeast consisting of the base sequence represented by Ogata Air Angsta SEQ ID NO: 30 obtained in Comparative Example 1 % Glucose) and cultured overnight at 37 ° C. with shaking to obtain a preculture. 500 μl of the obtained preculture solution was inoculated into 50 ml of YPD medium, and after shaking culture at 37 ° C. until OD600 became 1 to 1.5, cells were collected (3000 × g, 10 minutes, 20 ° C.), and 250 μl of Resuspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 1 M DTT (final concentration 25 mM). This suspension was incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and then collected (3000 × g, 10 minutes, 20 ° C.) and pre-ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) 5). The washings were collected (3000 × g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of ice-cold STM buffer, and then collected (3000 × g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 μl of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution. 60 μl of this competent cell solution and 3 μl of linear pUC-PmoxLPmoxFdTm solution were mixed and transferred to an electroporation cuvette (dispos cuvette electrode, electrode spacing 2 mm; manufactured by BM Instruments), 7.5 kV / cm, 10 μF The cells were suspended in 1 ml of YPD medium and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. After standing for 1 hour, the cells were collected (3000 × g, 5 minutes, room temperature), suspended in 1 ml of YNB medium (0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid (manufactured by Difco)), and then collected again ( 3000 × g, 5 minutes, room temperature). The cells were resuspended in an appropriate amount of YNB medium and then applied to a YNB selective agar plate (0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid (manufactured by Difco), 1.5% agarose, 2% glucose). A strain that grows in static culture at 3 ° C. for 3 days was selected, and a gene-inactive fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 was obtained.

（実施例６）完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母の培養
実施例５、比較例２で得られた配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び／又は配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母、完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母を２ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、０．３４％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ、０．４ｍｇ／ｌ Ｂｉｏｔｉｎ、１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、２％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、また、ＢＭＧＭＹ培地（１％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％ ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、０．３４％ ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ、０．４ｍｇ／ｌ Ｂｉｏｔｉｎ、１００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に接種し、これを３０℃、１７０ｒｐｍ、７２時間振盪培養後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分、４℃）により培養上清を回収した。菌体濃度はＯＤ６００にて測定した。 (Example 6) Culture of yeast expressing fully humanized anti-TNF-α Fab antibody Example 5 and the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 obtained in Comparative Example 2 and / or the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 A gene-inactive fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast, and a fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast in 2 ml of BMGY medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Difco), 2% polypeptone (Manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (manufactured by Difco), 1% Ammonium Sulfate, 0.4 mg / l Biotin, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0), 2% Glycerol) Also, BMGMY medium (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.34% yeast nitrogen base, Without Acid and Ammumum Sulfum (1%). 0.4 mg / l Biotin, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0), 1% Glycerol, 2% methanol) was inoculated and shake-cultured at 30 ° C., 170 rpm, 72 hours, followed by centrifugation (12,000 rpm, 5 Min, 4 ° C.). The bacterial cell concentration was measured at OD600.

（実施例７）ＥＬＩＳＡ法による完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体の分泌量の測定
実施例６の培養上清への抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体分泌発現量は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法により以下に示す方法で行った。ＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ＮＵＮＣ社製）に固定化バッファー（０．１Ｎ重炭酸ナトリウム溶液，ｐＨ９．６）にて２５００倍希釈したＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｆｄ） Ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ（ＭＢＬ社製）を各ウェル５０μｌずつ添加し、終夜４℃でインキュベートした。インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、イムノブロック（大日本住友製薬社製）２００μｌでブロッキングし、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴバッファー（８ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．２ｇ／Ｌ塩化カリウム、１．１５ｇ／Ｌリン酸一水素ナトリウム（無水）、０．２ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム（無水）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、系列希釈した標準Ｆａｂ抗体（Ａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＩｇＧ Ｆａｂ；ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）と希釈した培養上清を各ウェル５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応した。ＰＢＳＴバッファーで４回洗浄後、ＰＢＳＴバッファーにて８０００倍希釈した二次抗体溶液（二次抗体：Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆａｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製））を各ウェル５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴバッファーで４回洗浄後、５０μｌのＴＭＢ−１ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＳｕｒｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ社製）を添加し、室温で２０分静置した。５０μｌのＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ社製）を添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。培養上清中のＦａｂ抗体の定量は、標準Ｆａｂ抗体の検量線を用いて行った。この方法により得られた抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体分泌発現量と各々の菌体濃度（ＯＤ６００）を表１に示した。 (Example 7) Measurement of secreted amount of fully humanized anti-TNF-α Fab antibody by ELISA method The amount of secreted anti-TNF-α Fab antibody secreted into the culture supernatant of Example 6 was determined by sandwich ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent). (Assay) method was carried out by the following method. Anti-Human IgG (Fd) Sheep IgG Fraction (manufactured by MBL) diluted 2500 times with an immobilization buffer (0.1N sodium bicarbonate solution, pH 9.6) on an ELISA plate (Maxisorp; manufactured by NUNC) 50 μl of each well was added and incubated overnight at 4 ° C. After incubation, the solution in the well was removed, blocked with 200 μl of immunoblock (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.), and allowed to stand at room temperature for 1 hour. PBST buffer (8 g / L sodium chloride, 0.2 g / L potassium chloride, 1.15 g / L sodium monohydrogen phosphate (anhydrous), 0.2 g / L potassium dihydrogen phosphate (anhydrous), 0.1% Tween 20 ) 3 times, serially diluted standard Fab antibody (Anti-HumanIgG Fab; manufactured by Rockland) and diluted culture supernatant were added by 50 μl per well and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 4 times with PBST buffer, a secondary antibody solution (secondary antibody: Anti-Human IgG (Fab Specific) HRP conjugate Antibody (manufactured by SIGMA)) diluted 8000 times with PBST buffer was added to each well 50 μl, The reaction was allowed to proceed for 1 hour at room temperature. After washing 4 times with PBST buffer, 50 μl of TMB-1 Component Microwell Peroxidase Substrate SureBlue (manufactured by KPL) was added and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. After stopping the reaction by adding 50 μl of TMB Stop Solution (manufactured by KPL), the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (BenchMark Plus; manufactured by Bio-Rad). The Fab antibody in the culture supernatant was quantified using a standard Fab antibody calibration curve. The anti-TNF-α Fab antibody secretion expression levels obtained by this method and the respective bacterial cell concentrations (OD600) are shown in Table 1.

その結果、２．配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性／完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母は、明らかに、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化していない１．完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母より高い分泌発現量を示した。３．配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性／完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母は、配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化していない１．完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母と比較して分泌発現量は変わっていない。しかし、４．配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性／完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母は、明らかに２．配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性／完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α Ｆａｂ抗体発現酵母より高い分泌量を示した。これは、配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子が配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子との二重不活性により特段の効果を得ることを示している。   As a result, 2. The gene inactive / fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 clearly has not inactivated the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27. The secretion expression level was higher than that of the fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast. 3. The gene inactive / fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 has not inactivated the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30. The amount of secretory expression is not changed as compared with the fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast. However, 4. The gene-inactive / fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 is clearly 2. The secretion amount was higher than that of a gene-inactive / fully humanized anti-TNF-α Fab antibody-expressing yeast consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27. This indicates that the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 obtains a special effect by double inactivation with the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27.

Figure 2016146789
Figure 2016146789

Claims (12)

以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの遺伝子：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２７に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号２７に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化されたオガタエア属酵母。 Any of the following genes (a), (b), (c) or (d):
(A) a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27;
(B) a gene comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 27;
(C) a gene comprising a base sequence having 85% or more sequence identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 27;
(D) a gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31;
Ogataea yeast that has been inactivated. 前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターを形質転換することにより得られる請求項１に記載の酵母。 A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and The yeast according to claim 1, obtained by transforming a vector containing at least one of the base sequences having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d). 前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを形質転換することにより得られる請求項１又は２に記載の酵母。 A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A polypeptide comprising at least one base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and comprising an amino acid sequence of a heterologous protein upstream or downstream of the base sequence The yeast of Claim 1 or 2 obtained by transforming the vector containing the base sequence which codes. 前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる請求項１又は２に記載の酵母。 A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A vector containing at least one of the base sequences having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and a base sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein; The yeast of Claim 1 or 2 obtained by transforming the containing vector. さらに、以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のいずれかの遺伝子：
（ｅ）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｆ）配列番号３０に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｇ）配列番号３０に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｈ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化された請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母。 Furthermore, any of the following genes (e), (f), (g) or (h):
(E) a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30;
(F) a gene comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 30;
(G) a gene comprising a nucleotide sequence having 85% or more sequence identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30;
(H) a gene consisting of a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32;
The yeast according to any one of claims 1 to 4, wherein is inactivated. 前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られる請求項５に記載の酵母。 A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A vector containing at least one of the base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and the gene according to any one of the above (e) to (h) And a nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any one of (e) to (h), and a gene sequence according to any of the above (e) to (h) The yeast according to claim 5, which is obtained by transforming a terminator and a vector containing at least one of the base sequences having a homologous region. 前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られる請求項６に記載の酵母。 A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A polypeptide comprising at least one base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and comprising an amino acid sequence of a heterologous protein upstream or downstream of the base sequence A vector containing a base sequence encoding the gene, a base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (e) to (h), and the gene according to any one of (e) to (h) Contains at least one of a base sequence having a homologous region with the promoter and a base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (e) to (h) above Yeast according that the vector to claim 6 which is obtained by transforming. 前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる請求項６に記載の酵母。 A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A vector containing at least one of the base sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), and the gene according to any one of the above (e) to (h) And a nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any one of (e) to (h), and a gene sequence according to any of the above (e) to (h) Contains at least one base sequence having a homologous region with the terminator, and contains a base sequence encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence of a heterologous protein upstream or downstream of the base sequence Yeast according that the vector to claim 6 which is obtained by transforming. 前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、及び異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる請求項６に記載の酵母。 A base sequence having a homologous region with the gene according to any one of (a) to (d), a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any of (a) to (d), and A vector containing at least one of the nucleotide sequence having a homologous region with the terminator of the gene according to any one of (a) to (d), the gene according to any one of the above (e) to (h), and A base sequence having a homologous region, a base sequence having a homologous region with the promoter of the gene according to any one of (e) to (h), and the gene terminator according to any of the above (e) to (h) A vector containing at least one base sequence having a homologous region, and a vector containing a base sequence encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence of a heterologous protein Yeast according to Claim 6 obtained by quality conversion. オガタエア属酵母が、オガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ ａｎｇｕｓｔａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、又はオガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜９のいずれか１項に記載の酵母。 The Ogataea genus yeast is at least one selected from the group consisting of Ogataea angusta, Ogataea polymorpha, or Ogataea parapolymorpha. The yeast described. 請求項３又は４に記載の酵母及び／又は請求項７〜９のいずれか１項に記載の酵母を培養して、異種タンパク質を回収する工程を含む異種タンパク質の製造方法。 A method for producing a heterologous protein comprising a step of culturing the yeast according to claim 3 or 4 and / or the yeast according to any one of claims 7 to 9 and recovering the heterologous protein. 炭素原として、グルコース、グリセロール、及び／又はメタノールを用いて培養することを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。 The production method according to claim 11, wherein culture is performed using glucose, glycerol, and / or methanol as a carbon source.
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