JP2016124850A - Anti-obesity agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、天然有機化合物を有効成分として含有する抗肥満薬に関する。 The present invention relates to an anti-obesity drug containing a natural organic compound as an active ingredient.
海洋は地球上の表面積の約７１％を占め、地球全体の生物の約９０％が海洋に棲息するといわれている。海洋生物は、陸上生物と比較すると異なった環境で生存しており、海水という塩濃度の高い系に存在し、温度変化が比較的小さく、高い圧力を受けることがある。こうした特異な環境に生育する生物が生産する化学物質は多彩な構造を持ち、それらの中には、様々な生物活性を持つものが明らかになってきている。
現在、生物活性物質の探索源として有望視されている海洋生物として藍藻が挙げられる。藍藻は光合成を行う原核生物であり、淡水湖沼、汽水域、海洋、土壌など様々な環境下で生育している。生育環境によって特異な化学構造や生理活性を示す物質を生産することが知られており、例えば、発癌プロモーター活性を有するＬｙｎｇｂｙａｔｏｘｉｎ Ａ（非特許文献１）、骨吸収活性を阻害するＢｉｓｅｌｙｎｇｂｙａｓｉｄｅ（非特許文献２）、また強力なプロテインキナーゼの阻害活性を示すＢｉｓｅｂｒｏｍｏａｍｉｄｅ（非特許文献３）などが挙げられ、生物活性物質やそのリード化合物の探索源として藍藻が期待されている。
The ocean occupies about 71% of the surface area of the earth, and it is said that about 90% of all the creatures on the earth live in the ocean. Marine organisms live in a different environment compared to terrestrial organisms, exist in a high salt concentration system called seawater, have a relatively small temperature change, and are subject to high pressure. Chemical substances produced by organisms that grow in such unique environments have a variety of structures, some of which have various biological activities.
Currently, cyanobacteria are listed as promising marine organisms as a search source for bioactive substances. Cyanobacteria are prokaryotes that perform photosynthesis and grow in various environments such as freshwater lakes, brackish waters, oceans, and soil. It is known to produce a substance exhibiting a specific chemical structure or physiological activity depending on the growth environment. 2) and Bisebromide (Non-patent Document 3), which shows potent protein kinase inhibitory activity, and the like, and cyanobacteria are expected as a search source for bioactive substances and their lead compounds.
ヒトのからだの脂肪組織および種々の臓器における過度の脂肪の蓄積により引き起こされる肥満は、体質的因子、食餌性因子、精神的因子、代謝的因子、運動不足などが要因となり、結果的に摂取カロリーが消費カロリーを上回り、脂肪が蓄積して起こるものである。肥満は糖尿病、高血圧、脂質異常症など多くの生活習慣病の原因となっており、特に近年では高血圧や脂質異常症など複数の生活習慣病を合併していることをメタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）と呼称している。厚生労働省の平成１８年度国民健康調査において、４０〜７４歳のメタボリックシンドロームの該当者数が約９６０万人、予備群者数が約９８０万人とされている。そのため、効果的な治療法や予防法が求められている。
また、日本人の死因の第１位はがん、第２位は脳卒中（脳梗塞や脳出血）、第３位は心臓病（心筋梗塞や狭心症）であり、２位と３位はどちらも動脈硬化や高血圧、脂質異常症などが大きな危険因子であるが、これらには食事や肥満が大きく関わっている。さらに、日本人の間で急激に増えている糖尿病、高尿酸血症や痛風、脂肪肝、膵炎なども、肥満との関わりが深い病気といわれている。
肥満の状態では、生体内の脂肪細胞に存在する脂肪滴、すなわちトリグリセリド量が増加し、細胞が肥大している。さらに、最近になって、成人となってからでも脂肪細胞の数が増加することが報告されている。したがって、脂肪細胞への分化を阻害すること、および脂肪細胞内の脂肪滴に作用することの両面から肥満の進行を阻害する試みが期待されている。
Obesity caused by excessive fat accumulation in human body adipose tissue and various organs is caused by constitutional factors, dietary factors, mental factors, metabolic factors, lack of exercise, etc., resulting in calorie intake Is more than calories burned and fat is accumulated. Obesity is the cause of many lifestyle-related diseases such as diabetes, hypertension, and dyslipidemia. In particular, metabolic syndrome (visceral fat syndrome) that multiple lifestyle-related diseases such as hypertension and dyslipidemia are combined. It is called. According to the Ministry of Health, Labor and Welfare's 2006 National Health Survey, the number of people with metabolic syndrome aged 40 to 74 is about 9.6 million, and the number of reserve groups is about 9.8 million. Therefore, effective treatment and prevention methods are required.
The first cause of death among Japanese is cancer, the second is stroke (cerebral infarction and cerebral hemorrhage), the third is heart disease (myocardial infarction and angina), which is second or third? Arteriosclerosis, hypertension, dyslipidemia, etc. are major risk factors, but diet and obesity are greatly involved in these. In addition, diabetes, hyperuricemia, gout, fatty liver, pancreatitis, etc., which are rapidly increasing among Japanese, are said to be deeply related to obesity.
In the state of obesity, the amount of lipid droplets, that is, triglycerides present in fat cells in the body increases, and the cells are enlarged. Furthermore, recently, it has been reported that the number of fat cells increases even after becoming an adult. Therefore, an attempt to inhibit the progression of obesity is expected from both the viewpoint of inhibiting differentiation into fat cells and acting on fat droplets in fat cells.
本発明者らは、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化阻害または脂肪細胞の脂肪蓄積の阻害を通して抗肥満効果を示す医薬等について研究を続けており、特定のキノコ又は植物から抽出した成分を有効成分とする前駆脂肪細胞分化阻害剤（特許文献１）、環状ヘプタペプチドであるテルナチン：ｃｙｃｌｏ［−Ｄ−Ｉｌｅ１−（Ｎ−Ｍｅ）−Ｌ−Ａｌａ２−（Ｎ−Ｍｅ）−Ｌ−Ｌｅｕ３−Ｌ−Ｌｅｕ４−（Ｎ−Ｍｅ）−Ｌ−Ａｌａ５−（Ｎ−Ｍｅ）−Ｄ−Ａｌａ６−β―ＯＨ−Ｄ−Ｌｅｕ７−］を有効成分とする前駆脂肪細胞分化阻害剤（特許文献２）、および植物成分のビサボロールオキシド−Ａ−β−グルコシドを有効成分とする前駆脂肪細胞分化阻害剤（特許文献３）を見出すことに成功した。
また、公知の抗菌作用を有する天然有機化合物であるオーレオシンにはトリグリセリドの生合成阻害活性があり、血液中のトリグリセリド濃度を低下させることが報告されている（特許文献４）。
しかしながら、これまで得られた天然物からの抽出成分や天然有機化合物は、必ずしも抗肥満薬として満足のいくものではなく、とりわけ、脂肪細胞内の脂肪滴に作用することによる抗肥満薬といった観点からは満足のいくものではなかった。
The present inventors have continued research on drugs that exhibit an anti-obesity effect through inhibition of preadipocyte differentiation into adipocytes or inhibition of fat cell fat accumulation, and effective use of components extracted from specific mushrooms or plants Preadipocyte differentiation inhibitor as an ingredient (Patent Document 1), cyclic heptapeptide ternatin: cyclo [-D-Ile1- (N-Me) -L-Ala2- (N-Me) -L-Leu3-L A preadipocyte differentiation inhibitor (Patent Document 2) containing -Leu4- (N-Me) -L-Ala5- (N-Me) -D-Ala6-β-OH-D-Leu7-], and The inventors succeeded in finding a preadipocyte differentiation inhibitor (Patent Document 3) containing the plant component bisabolol oxide-A-β-glucoside as an active ingredient.
In addition, aureosin, which is a known natural organic compound having antibacterial action, has triglyceride biosynthesis inhibitory activity and has been reported to reduce the triglyceride concentration in blood (Patent Document 4).
However, the components extracted from natural products and natural organic compounds obtained up to now are not necessarily satisfactory as anti-obesity agents, especially from the viewpoint of anti-obesity agents by acting on lipid droplets in fat cells. Was not satisfactory.
一方、本発明者らは、藍藻類から単離した新規有機化合物であるヨシノンＡが脂肪細胞内の脂肪滴の縮小活性を有することを見出した（特願２０１４−１３７８９２号）が、抗肥満薬といった観点から、より優れた効果を発揮する天然有機化合物についての検討が必要であった。 On the other hand, the present inventors have found that Yoshinon A, which is a novel organic compound isolated from cyanobacteria, has the activity of reducing lipid droplets in fat cells (Japanese Patent Application No. 2014-137892). From such a viewpoint, it was necessary to study a natural organic compound that exhibits a superior effect.
本発明の課題は、上記に記載した背景の下、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化阻害活性および体重増加の抑制活性を有する天然有機化合物を有効成分として含有する医薬を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a medicament containing, as an active ingredient, a natural organic compound having an activity of inhibiting the differentiation of preadipocytes into adipocytes and an activity of suppressing weight gain under the background described above.
本発明者らは、藍藻由来の下記化学式（１）で示されるカリキピロン（Ｋａｌｋｉｐｙｒｏｎｅ）が前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化阻害活性および体重増加の抑制活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、上記化学式（１）で示されるカリキピロンを有効成分として含有することを特徴とする抗肥満薬に関する。 The present invention relates to an anti-obesity drug characterized by containing, as an active ingredient, calikipilone represented by the above chemical formula (1).
また、本発明は、体重増加を抑制することを特徴とする上記化学式（１）で示されるカリキピロンを有効成分として含有することを特徴とする抗肥満薬に関する。 The present invention also relates to an anti-obesity drug characterized by containing, as an active ingredient, calikipilone represented by the above chemical formula (1), which is characterized by suppressing weight gain.
本発明によれば、化学式（１）で示されるカリキピロンは、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化阻害活性および体重増加の抑制活性を有することから、脂肪の蓄積や肥満の予防、改善に寄与するものである。 According to the present invention, calikipirone represented by the chemical formula (1) has an activity of inhibiting differentiation of preadipocytes into adipocytes and an activity of suppressing weight gain, and thus contributes to the prevention and improvement of fat accumulation and obesity. Is.
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
化学式（１）で示されるカリキピロンは、藍藻類から単離・構造決定された化合物であり、γ−ピロン環という特徴的な構造を有し、アルテミア（ＬＤ５０ １μｇ／ｍＬ）および金魚（ＬＤ５０ ２μｇ／ｍＬ）に対して毒性を示すことが知られている。 Caliquipyrone represented by the chemical formula (1) is a compound isolated and structure-determined from cyanobacteria, having a characteristic structure of γ-pyrone ring, artemia (LD 50 1 μg / mL) and goldfish (LD 50 2 μg / mL) is known to be toxic.
化学式（１）で示されるカリキピロンは、天然物からの抽出・単離や合成によって得ることができ、例えば、Ｍｅｌｏｄｉｅ Ａ．Ｇｒａｂｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｈ．Ｇｅｒｗｉｃｋ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９９８，６１，６７７に記載される方法に従って、藍藻から抽出し、精製することにより得ることができる。 The calikipyrone represented by the chemical formula (1) can be obtained by extraction / isolation or synthesis from a natural product. Graber and William H. Gerwick, J. et al. Nat. Prod. According to the method described in 1998, 61, 677, it can obtain by extracting from a cyanobacteria and refine | purifying.
藍藻は光合成を行う原核生物であり、淡水湖沼、汽水域、海洋、土壌など様々な環境下で広く生育しているものであるが、化学式（１）で示されるカリキピロンを含有する藍藻またはその部位は、それ自身を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、それら自身を圧搾抽出することにより得られる搾汁、水あるいはアルコール、エーテル、アセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで段階的に精製して得られた抽出物画分など、すべてを利用することができる。これらは単独で用いてもよく、また２種以上混合してもよい。 Cyanobacteria are prokaryotes that carry out photosynthesis, and are widely grown under various environments such as freshwater lakes, brackish waters, oceans, and soils. Cyanobacteria containing calikipyrone represented by chemical formula (1) or parts thereof Distributes dried product, dried product, pulverized product, juice obtained by squeezing itself, crude extract with water or organic solvent such as alcohol, ether, acetone, etc., and crude extract All of the extract fractions obtained by stepwise purification by various chromatographies such as column chromatography can be used. These may be used alone or in combination of two or more.
例えば、藍藻を採取した後に冷凍保存し、含水メタノールにて粉砕・抽出し、粗抽出物を得、粗抽出物を酢酸エチル層と水層とに分配し、さらに、有機層としての酢酸エチル層をＯＤＳシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより画分することができる。 For example, the cyanobacteria are collected and stored frozen, crushed and extracted with water-containing methanol to obtain a crude extract, the crude extract is distributed into an ethyl acetate layer and an aqueous layer, and an ethyl acetate layer as an organic layer is further obtained. Can be fractionated by ODS silica gel column chromatography.
化学式（１）で示されるカリキピロンは、優れた前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化阻害活性および体重増加の抑制活性を有することから、抗肥満剤として使用可能である。 Caliquipyrone represented by the chemical formula (1) can be used as an anti-obesity agent because it has an excellent activity of inhibiting differentiation of preadipocytes into adipocytes and an activity of suppressing weight gain.
カリキピロンは、特に体重増加の抑制活性を有することから、体重増加を抑制させることによる抗肥満薬として使用可能である。 Since calikipyrone has an activity of suppressing weight gain, it can be used as an anti-obesity drug by suppressing weight gain.
化学式（１）で示されるカリキピロンを有効成分として含む医薬組成物は抗肥満薬として使用され得るものであるが、ここで「肥満」とは一般的には体内に脂肪組織が一定以上多量に蓄積した状態をいう。本明細書においては「肥満」は広義に解釈されるものとし、その概念に肥満症を含む。「肥満症」とは肥満に起因ないし関連する健康障害（合併症）を有するか又は将来的に有することが予測される場合であって、医学的に減量が必要とされる病態をいう。
肥満の判定法としては、通常、国際的に広く使用されているＢＭＩ（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ）を尺度としたものが用いられている。ＢＭＩは、体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の二乗で除した数値（ＢＭＩ＝体重（ｋｇ）／身長（ｍ）２）である。ＢＭＩ＜１８．５は低体重、１８．５≦ＢＭＩ＜２５は普通体重、２５≦ＢＭＩ＜３０は肥満（１度）、３０≦ＢＭＩ＜３５は肥満（２度）、３５≦ＢＭＩ＜４０は肥満（３度）、４０≦ＢＭＩは肥満（４度）と判定される。もっとも、標準体重（理想体重）は性別、年齢、職業または生活習慣の差異などによって個人ごとに相違するものであることから、肥満の判定をこの方法で一律に行い、本発明の抗肥満薬を厳格に適用することを意図するものではない。
The pharmaceutical composition containing calikipyrone represented by the chemical formula (1) as an active ingredient can be used as an anti-obesity agent. Here, “obesity” generally means that adipose tissue accumulates in a large amount in a certain amount. It means the state. In the present specification, “obesity” is to be interpreted broadly, and the concept includes obesity. “Obesity” refers to a medical condition that is or is predicted to have a health disorder (complication) due to or related to obesity, and that requires medical weight loss.
As a method for determining obesity, a method based on BMI (Body Mass Index), which is widely used internationally, is usually used. BMI is a numerical value obtained by dividing body weight (kg) by the square of height (m) (BMI = weight (kg) / height (m) 2 ). BMI <18.5 is low weight, 18.5 ≦ BMI <25 is normal weight, 25 ≦ BMI <30 is obesity (1 degree), 30 ≦ BMI <35 is obesity (2 degrees), 35 ≦ BMI <40 is Obesity (3 degrees), 40 ≦ BMI is determined to be obese (4 degrees). However, since the standard body weight (ideal body weight) is different for each individual due to differences in gender, age, occupation or lifestyle, obesity is uniformly determined by this method, and the anti-obesity drug of the present invention is used. It is not intended to be strictly applied.
本発明の抗肥満薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。 Formulation of the anti-obesity drug of the present invention can be performed according to a conventional method. In the case of formulating, other pharmaceutically acceptable ingredients (for example, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological Saline solution and the like). As the excipient, lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used. As the disintegrant, starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate and the like can be used. Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer. As the emulsifier, gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used. As the suspending agent, glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used. As the soothing agent, benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol and the like can be used. As the stabilizer, propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used. As preservatives, phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used. As preservatives, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、および座剤などとして本発明の医薬を提供できる。
本発明の医薬組成物には、期待される治療効果（予防効果も含む）を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の医薬組成物中の有効成分量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約０．１重量％〜約９５重量％の範囲内で設定する。
The dosage form for formulation is not particularly limited, and the medicament of the present invention can be provided as tablets, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, injections, external preparations, suppositories, and the like.
The pharmaceutical composition of the present invention contains an active ingredient in an amount necessary for obtaining an expected therapeutic effect (including a preventive effect) (that is, a therapeutically effective amount). The amount of the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention generally varies depending on the dosage form, but the amount of the active ingredient is set within a range of, for example, about 0.1 wt% to about 95 wt% so as to achieve a desired dose. .
本発明の抗肥満薬はその剤型に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって対象に適用される。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。）を含む。好ましい態様としては、本発明の抗肥満薬はヒトに対して適用される。 The anti-obesity drug of the present invention is applied to a subject by oral administration or parenteral administration (intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal injection, transdermal, nasal, transmucosal, etc.) depending on the dosage form. The The “subject” here is not particularly limited, and includes humans and non-human mammals (including pet animals, farm animals, and laboratory animals). In a preferred embodiment, the antiobesity agent of the present invention is applied to humans.
本発明の抗肥満薬（有効成分）の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に症状、患者の年齢、性別、および体重などが考慮される。なお、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能であり、例えば、成人（体重約６０ｋｇ）を対象として一日当たりの有効成分量が約１ｍｇ〜約６ｇ、好ましくは約６ｍｇ〜約６００ｍｇとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の病状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。 The dose of the anti-obesity drug (active ingredient) of the present invention is set so as to obtain the expected therapeutic effect. In setting a therapeutically effective dose, symptoms, patient age, sex, weight, etc. are generally considered. A person skilled in the art can set an appropriate dose in consideration of these matters. For example, the amount of active ingredient per day for an adult (body weight: about 60 kg) is about 1 mg to about 6 g. The dose can be set to be preferably about 6 mg to about 600 mg. As the administration schedule, for example, once to several times a day, once every two days, or once every three days can be adopted. In preparing the administration schedule, the patient's medical condition and the duration of effect of the active ingredient can be taken into consideration.
以下、実施例を挙げて、本発明の具体的態様を示すものであるが、本発明の技術的範囲は実施例の記載により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and the specific aspect of this invention is shown, the technical scope of this invention is not limited at all by description of an Example.
実施例１ 化学式（１）で示されるカリキピロンの細胞を用いた生物活性試験
化学式（１）で示されるカリキピロンの生物活性として、脂肪細胞への分化阻害を調べた。
実施例には、脂肪細胞への効率的な分化が実証されているマウス繊維芽細胞３Ｔ３−Ｌ１細胞を下記（Ａ）〜（Ｄ）のとおり調製して用いた。
（Ａ）３Ｔ３−Ｌ１細胞の増殖、保存
３Ｔ３−Ｌ１細胞は１００ｍｍディッシュ上で、５％ウシ血清を添加したＤＭＥＭ増殖用培地で５％炭酸ガス−空気、飽和水蒸気下、３７℃で培養した。なお、３Ｔ３−Ｌ１細胞は、最初に大量培養しておき、常法に従って、分注して凍結保存した。
（Ｂ）継代
ＰＢＳ（−）５ｍｌで細胞を洗浄し、０．２５％トリプシン１ｍＭ ＥＤＴＡ含有生理食塩水１ｍｌを加えて３７℃で３分間静置した。増殖用培地５ｍｌで細胞を懸濁して１５ｍｌの遠沈管に移して、１５００ｒｐｍ、３分間の遠心によって細胞を沈殿させた。１／４から１／５に希釈して、ディッシュにまいた。
（Ｃ）実施例用細胞の準備
上述と同様の方法でディッシュから剥離、遠心沈殿させた細胞は、適当な量の増殖用培地に懸濁し、細胞数を計測した。それをもとに、５×１０４個／ｗｅｌｌとなるように９６穴プレートに播種して４８時間培養した。
（Ｄ）分化誘導培地の調製
上記増殖用培地１００ｍｌに１ｍＭデキサメタゾン溶液１ｍｌ、３−イソブチル−１−メチルキサンテン１１．１ｍｇ、および５ｍｇ／ｍｌインスリン溶液０．１ｍｌを添加し、溶解することで調製した。
Example 1 Biological activity test using cells of calikipyrone represented by chemical formula (1) As a biological activity of calikipirone represented by chemical formula (1), inhibition of differentiation into adipocytes was examined.
In the examples, mouse fibroblast 3T3-L1 cells, which have been demonstrated to be efficiently differentiated into adipocytes, were prepared and used as shown in (A) to (D) below.
(A) Growth and storage of 3T3-L1 cells 3T3-L1 cells were cultured on a 100 mm dish in a DMEM growth medium supplemented with 5% bovine serum at 37 ° C. under 5% carbon dioxide-air and saturated water vapor. In addition, 3T3-L1 cells were first cultured in large quantities, and dispensed and stored frozen according to a conventional method.
(B) Passage Cells were washed with 5 ml of PBS (−), 1 ml of 0.25% trypsin 1 mM EDTA-containing physiological saline was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 3 minutes. The cells were suspended in 5 ml of growth medium, transferred to a 15 ml centrifuge tube, and precipitated by centrifugation at 1500 rpm for 3 minutes. Dilute from 1/4 to 1/5 and go to dish.
(C) Preparation of cells for examples The cells peeled from the dish and centrifuged by the same method as described above were suspended in an appropriate amount of growth medium, and the number of cells was counted. Based on this, it was seeded in a 96-well plate at 5 × 10 4 cells / well and cultured for 48 hours.
(D) Preparation of differentiation-inducing medium Prepared by adding 1 ml of 1 mM dexamethasone solution, 11.1 mg of 3-isobutyl-1-methylxanthene, and 0.1 ml of 5 mg / ml insulin solution to 100 ml of the above growth medium and dissolving. .
脂肪細胞への分化誘導率による分化阻害
３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導には、培地を増殖用培地から分化誘導培地に置き換えることで行った。この時、特定の濃度に調整した化学式（１）で示されるカリキピロンを分化誘導培地に添加し、ブランクとコントロールには分化誘導培地のみを添加した。プレートは５％炭酸ガス−空気、飽和水蒸気下、３７℃で培養した。４８時間後にインスリンを加えた新鮮な増殖培地に置き換えた。その後、２日おきに培地を新鮮な増殖培地に置き換えた。
上記の方法で分化誘導開始より７〜１０日間の培養後、細胞を顕微鏡で観察し、コントロールの細胞が十分に分化した時点で評価した。
脂肪細胞への分化誘導率は、細胞内に蓄積されたトリグリセリドの量を定量する事によって算出した。細胞をＰＢＳ（−）で洗浄して風乾させ、そこにラボアッセイトリグリセライドキットワコーを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。室温で３０〜６０分間静置し、６３０ｎｍの吸光度を測定してトリグリセリドを定量した。
結果を図１に示す。化学式（１）で示されるカリキピロンは濃度６７．５ｎＭで３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化を５０％阻害した。
Inhibition of differentiation by rate of induction of differentiation into adipocytes Induction of differentiation of 3T3-L1 cells into adipocytes was performed by replacing the medium for growth with a medium for inducing differentiation. At this time, the calikipyrone represented by the chemical formula (1) adjusted to a specific concentration was added to the differentiation induction medium, and only the differentiation induction medium was added to the blank and the control. The plate was cultured at 37 ° C. under 5% carbon dioxide gas-air and saturated water vapor. After 48 hours, it was replaced with fresh growth medium supplemented with insulin. Thereafter, the medium was replaced with fresh growth medium every two days.
After culturing for 7 to 10 days from the start of differentiation induction by the above method, the cells were observed with a microscope and evaluated when the control cells were sufficiently differentiated.
The induction rate of differentiation into fat cells was calculated by quantifying the amount of triglyceride accumulated in the cells. The cells were washed with PBS (−) and air-dried, and Lab Assay Triglyceride Kit Wako was added thereto at 100 μL / well. The mixture was allowed to stand at room temperature for 30 to 60 minutes, and the absorbance at 630 nm was measured to quantify triglycerides.
The results are shown in FIG. The calikipirone represented by the chemical formula (1) inhibited the differentiation of 3T3-L1 cells into adipocytes by 50% at a concentration of 67.5 nM.
実施例２ カリキピロンの高脂肪食摂食マウスの体重に及ぼす影響
カリキピロンの高脂肪食摂食マウスの体重に及ぼす影響を調べた。
（１）実験材料および方法
１．高脂肪食飼料の組成と調製
オリエンタル酵母工業株式会社の市販特注固形飼料ＨＦＤ−６０を用いた。また、対照群用の標準食固形飼料には、同社のＡＩＮ９３Ｍを用いた。各飼料の組成は下記表１に示した。
(1) Experimental materials and methods Composition and preparation of high-fat diet feed Commercially available custom-made solid feed HFD-60 from Oriental Yeast Co., Ltd. was used. Moreover, AIN93M of the company was used for the standard diet solid feed for the control group. The composition of each feed is shown in Table 1 below.
２．実験動物
日本エスエルシーより購入した雄性ｄｄＹ系マウス(ＳＰＦ)を用いた。マウスは４週齢で搬入後、５日間予備飼育して実験に供した。マウスは予備飼育期間および実験期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％の飼育室（照明時間８時〜２０時）で飼育した。
マウスは１匹／ケージとし、予備飼育期間中は標準食固形飼料を、また実験期間中は標準食固形飼料または高脂肪食固形飼料を自由摂取させた。飼料の補充は週２回(毎週月曜日、木曜日)行った。飲料水は滅菌蒸留水を給水瓶で自由に与えた。飼育室内におけるケージの位置は、１週間ごとにランダムに入れ替えた。
2. Experimental Animals Male ddY mice (SPF) purchased from Japan SLC were used. The mice were brought in at 4 weeks of age and preliminarily raised for 5 days for the experiment. Mice were raised in a breeding room (lighting time: 8 to 20 hours) at a room temperature of 24 ± 3 ° C. and a relative humidity of 55 ± 15% throughout the preliminary breeding period and the experiment period.
One mouse / cage was allowed to freely receive a standard diet solid diet during the preliminary breeding period and a standard diet high diet or high fat diet solid diet during the experimental period. Feed supplementation was performed twice a week (every Monday and Thursday). As drinking water, sterilized distilled water was freely given in a water bottle. The position of the cage in the breeding room was randomly changed every week.
３．被験物質の調製、投与
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したカリキピロン（ＫＡＬ）をプラスチックチューブに分注して−２０℃に凍結保存した。投与直前に解凍し、蒸留水で希釈して０．５ｍｇ／ｍｌの溶液を作製した。この溶液を５週齢時から１０週齢時まで毎日、マウス用経口ゾンデを用いて強制経口投与した。投与容量はマウスの体重１０ｇ当り０．１ｍｌとした。全ての実験群において投与溶液中のＤＭＳＯの終濃度は０．５％になるように調整し、投与は室温に戻した溶液を投与した。
なお、希釈した被験物質溶液が残った場合は−２０℃に凍結保存し、翌日に解凍して投与に用い、翌々日には使用しなかった。
3. Preparation and administration of test substance Caliquipyrone (KAL) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) was dispensed into a plastic tube and stored frozen at -20 ° C. Thawed immediately before administration and diluted with distilled water to prepare a 0.5 mg / ml solution. This solution was forcibly orally administered every day from the age of 5 to 10 weeks using an oral sonde for mice. The administration volume was 0.1 ml per 10 g of mouse body weight. In all experimental groups, the final concentration of DMSO in the administration solution was adjusted to 0.5%, and administration was performed by bringing the solution back to room temperature.
When the diluted test substance solution remained, it was stored frozen at −20 ° C., thawed the next day, used for administration, and not used the next day.
４．群構成
高脂肪食摂取期間：５週間
動物数：３または６匹／群
群構成：以下の表２に示す
５．観察および測定項目
１）一般状態
毎日１回症状を観察した。
２）体重
毎週２回、体重計にて体重を測定した。
３）飼料摂取量
毎週２回、飼料摂取量を測定し、新しい飼料を補充した。飼料摂取量は、群毎にｇ／ｄａｙ／ｍｏｕｓｅで表した。
5). Observation and measurement items 1) General condition Symptoms were observed once daily.
2) Body weight Body weight was measured twice a week with a scale.
3) Feed intake The feed intake was measured twice a week and supplemented with fresh feed. Feed intake was expressed in g / day / mouse for each group.
（２）結果
上記試験に供したマウスの摂食量の経時変化および水分摂取量の経時変化を測定した。平均摂食量の経時変化を図２に、平均水分摂取量の経時変化を図３に示す。図２および３において、ＨＦは高脂肪食固形飼料摂取群、ＫＡは高脂肪食固形飼料とカリキピロン摂取群、およびＮＣは標準食固形飼料摂取群を示す。標準食固形飼料のみの摂取による予備飼育期間が終了し、高脂肪食固形飼料のみの摂取および高脂肪食固形飼料とカリキピロンの摂取を開始した日を０日目（ｄａｙ０）とした。図２および図３から、カリキピロンは、マウスの摂食量および水分摂取量に影響を及ぼさない、すなわち、マウスの食欲に影響を及ぼさないことが判明した。
カリキピロン投与によるマウスの体重の経時変化を図４に示す。図４において、ＨＦは高脂肪食固形飼料摂取群、ＫＡは高脂肪食固形飼料とカリキピロン摂取群、およびＮＣは標準食固形飼料摂取群を示す。ＫＡは、ＨＦに比べて、高脂肪食固形飼料摂取による体重増加が抑制されることが判明した。
(2) Results The time course of food intake and time course of water intake of mice subjected to the above test were measured. The change over time in average food intake is shown in FIG. 2, and the change over time in average water intake is shown in FIG. 2 and 3, HF indicates a high fat diet solid feed intake group, KA indicates a high fat diet solid feed and calikipyrone intake group, and NC indicates a standard diet solid feed intake group. Day 0 (day 0) was defined as the day when the pre-breeding period with the intake of only the standard diet solid feed was completed and the intake of only the high fat diet solid feed and the intake of the high fat diet solid feed and calikipyrone was started. From FIG. 2 and FIG. 3, it was found that calikipyrone does not affect the food intake and water intake of the mouse, that is, does not affect the appetite of the mouse.
FIG. 4 shows the change in the body weight of the mice over time due to the administration of calikipirone. In FIG. 4, HF indicates a high fat diet solid feed intake group, KA indicates a high fat diet solid feed and calikipyrone intake group, and NC indicates a standard diet solid feed intake group. KA was found to suppress weight gain due to high fat diet solid feed intake compared to HF.
化学式（１）で示されるカリキピロンは、脂肪細胞への分化阻害活性を有することから、抗肥満剤としての医薬組成物として有用である。また、カリキピロンは食欲減退を招くことなく、高脂肪食の摂取による体重増加を抑制する作用を示すことから、抗肥満剤としての医薬組成物として有用である。 Caliquipyrone represented by the chemical formula (1) has an activity of inhibiting differentiation into adipocytes, and thus is useful as a pharmaceutical composition as an anti-obesity agent. In addition, calikipirone is useful as a pharmaceutical composition as an anti-obesity agent because it exhibits an action of suppressing weight gain due to ingestion of a high fat diet without causing a decrease in appetite.
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