JP2016086736A - Production method of liquid containing rare cells in blood - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血液中の希少細胞、特に血中循環がん細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＴｕｍｏｒＣｅｌｌ、以下、ＣＴＣという）を効率良く濃縮した希少細胞含有液を製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a rare cell-containing solution in which rare cells in blood, particularly circulating tumor cells (hereinafter referred to as CTC) are efficiently concentrated.
がん細胞濃縮の研究・臨床的意義は極めて大きく、血液中のがん細胞を濃縮することもできれば、がんの診断に応用することができる。例えば、がんの予後および治療の最も重要な要因は、初診時および処置時におけるがん細胞の転移の有無である。がん細胞の初期の拡散が抹消血中に及んだ場合、ＣＴＣを検出することは、がんの病状進行を判断する有用な手段である。しかしながら、血液中には、赤血球や白血球などの血液成分が圧倒的に多く存在するため、極めて少量のＣＴＣの検出は困難な状況にある。 Research and clinical significance of cancer cell enrichment is extremely great, and if cancer cells in blood can be concentrated, it can be applied to cancer diagnosis. For example, the most important factor in cancer prognosis and treatment is the presence or absence of cancer cell metastasis at the first visit and treatment. When the initial spread of cancer cells reaches into the peripheral blood, detecting CTC is a useful means for judging the progression of cancer pathology. However, since blood components such as red blood cells and white blood cells are predominantly present in blood, it is difficult to detect an extremely small amount of CTC.
近年、パリレンを用いた樹脂フィルターを使用することで、少量のＣＴＣを効率的に検出する方法が提案されている（特許文献１）。 In recent years, a method for efficiently detecting a small amount of CTC by using a resin filter using parylene has been proposed (Patent Document 1).
或いは、樹脂の代わりに金属を用いたフィルターを使用することで、フィルターの強度を向上させ、白血球とがん細胞変形能の違いにより分離する方法も提案されている（特許文献２）。 Alternatively, a method of improving the strength of the filter by using a filter using a metal instead of a resin and separating the leukocyte by the difference in leukocyte and cancer cell deformability has been proposed (Patent Document 2).
フィルターを用いて希少細胞を分離する方法（以下フィルター法と呼ぶ）は血液中の白 The method of separating rare cells using a filter (hereinafter referred to as the filter method) is white in blood.
血球や赤血球、血小板を効率よく除去できるが、血液状態は個人の体質や、採血後の経過時間により異なる。 Blood cells, red blood cells, and platelets can be removed efficiently, but the blood state varies depending on the individual constitution and the elapsed time after blood collection.
フィルター法は白血球の大きさと希少細胞の大きさの違い、変形能の違いで分離する方法である。この方法において、フィルターの材質、孔形状、孔径、開口率、流速を工夫することで、白血球と希少細胞をかなり分離可能である。 The filter method is a method of separation based on the difference in leukocyte size and rare cell size and deformability. In this method, leukocytes and rare cells can be separated considerably by devising the filter material, pore shape, pore diameter, aperture ratio, and flow rate.
しかしながら、血液の状態が悪くなり凝集が進行すると、フィルターの孔を凝集物が塞ぎ、血液がそれ以上濾過できなくなる。又、濾過できても白血球がフィルター上に大量に残留し、希少細胞との分離ができない傾向がある。 However, if the blood condition worsens and aggregation proceeds, the aggregates block the pores of the filter, and blood cannot be filtered any further. Moreover, even if it can be filtered, there is a tendency that leukocytes remain in a large amount on the filter and cannot be separated from rare cells.
通常、血液凝集を防ぐため、採血管にはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（以下、ＥＤＴＡ−２Ｎａという）や、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム等の抗凝固剤が用いられるが、これらの抗凝固剤を用いても、採血後長時間経過すると血液の凝集が進行する。 Usually, in order to prevent blood aggregation, an anticoagulant such as ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (hereinafter referred to as EDTA-2Na), heparin, sodium citrate, sodium fluoride or the like is used for the blood collection tube. Even when a coagulant is used, blood aggregation proceeds after a long time after blood collection.
本発明は、以上のような問題点を鑑みてなされたものであり、凝集した血液からでも、希少細胞含有液を製造する方法を提供するものである。 The present invention has been made in view of the above problems, and provides a method for producing a rare cell-containing solution from aggregated blood.
発明者らが鋭意検討した結果、ＥＤＴＡ採血管により採血した血液は、採血後４８時間まではフィルターにて濾過可能であるが、４８時間以降はフィルター孔が目詰まりし濾過不能、もしくはフィルター上に白血球が３００００個以上残留し、希少細胞との効率良い分離ができないことが分かった。 As a result of intensive studies by the inventors, blood collected by an EDTA blood collection tube can be filtered with a filter until 48 hours after blood collection, but after 48 hours, the filter hole is clogged and cannot be filtered, or on the filter. It was found that 30000 or more leukocytes remained and could not be efficiently separated from rare cells.
フィルターの上に目詰まりした凝集物を顕微鏡観察したところ、繊維状物質に希少細胞と白血球が吸着し、凝集塊を形成していることが分かり、本発明に至った。 When the aggregate clogged on the filter was observed with a microscope, it was found that rare cells and leukocytes were adsorbed on the fibrous material to form aggregates, and the present invention was achieved.
すなわち本発明は、血液に血栓溶解薬を添加した後、フィルターを用いて希少細胞を捕捉する工程を含む希少細胞含有液の製造方法に関する。発明者が鋭意観察した結果、採血後、血液は時間の経過と共に繊維素が生成し、繊維素と希少細胞及び白血球が絡まりあい、希少細胞と白血球の分離が困難になることを見出した。そのような血液に血栓溶解薬を添加することによって、繊維素が溶解し、白血球と希少細胞が分離し、フィルター法によって希少細胞を選択的に捕捉することが可能となると考えている。 That is, the present invention relates to a method for producing a rare cell-containing solution, which comprises a step of capturing rare cells using a filter after adding a thrombolytic drug to blood. As a result of intensive observation by the inventor, it has been found that after blood collection, fibrin is generated with the passage of time, and fibrin, rare cells and leukocytes are entangled, making it difficult to separate rare cells and leukocytes. It is believed that by adding a thrombolytic drug to such blood, fibrin dissolves, leukocytes and rare cells are separated, and the rare cells can be selectively captured by the filter method.
なお、採血後間もない新鮮な血液であったとしても、抗凝固剤との混合が不十分な場合があり、そのような場合に対しても本発明の血栓溶解薬を加えることによって、支障なく希少細胞を捕捉することが可能となる。 Even if it is fresh blood just after blood collection, mixing with the anticoagulant may be insufficient, and even in such a case, there is a problem by adding the thrombolytic agent of the present invention. It becomes possible to capture rare cells.
なお、前記希少細胞ががん細胞である場合、好ましく適用できる。又、フィルターが金属フィルターである場合、強度が向上し、白血球と希少細胞の変形能の違いにより分離することが可能となるため好ましい。金属フィルター表面は、細胞毒性が低い金めっきであることが好ましい。 In addition, when the said rare cell is a cancer cell, it can apply preferably. In addition, it is preferable that the filter is a metal filter because strength is improved and separation is possible due to the difference in deformability between leukocytes and rare cells. The metal filter surface is preferably gold plating with low cytotoxicity.
本発明によって、凝集した血液からでも、希少細胞含有液を得ることが可能となる。 According to the present invention, a rare cell-containing solution can be obtained even from aggregated blood.
本発明の製造方法は、希少細胞を含む血液を遠心分離した後、該血液から血漿又は血清を除去する工程、残渣に血栓溶解薬を添加した後、フィルターを用いて希少細胞を捕捉する工程を含むことを特徴とする。このような製造方法にすることによって、凝集した血液からでも、フィルター法を用いて希少細胞を捕捉し、希少細胞含有液を得ることができるようになる。 The method of the present invention includes a step of centrifuging blood containing rare cells and then removing plasma or serum from the blood, and adding a thrombolytic agent to the residue and then capturing the rare cells using a filter. It is characterized by including. By adopting such a production method, it becomes possible to capture rare cells even from aggregated blood using a filter method and obtain a rare cell-containing solution.
本発明にかかる希少細胞について説明する。本発明の製造方法において、希少細胞は、血液中を循環する白血球、赤血球及び血小板以外の細胞を指す。希少細胞としては、ＣＴＣ、血中循環上皮細胞、がん幹細胞等が挙げられる。 The rare cell according to the present invention will be described. In the production method of the present invention, rare cells refer to cells other than leukocytes, erythrocytes and platelets circulating in the blood. Examples of rare cells include CTC, circulating blood epithelial cells, cancer stem cells and the like.
本発明にかかる遠心分離について説明する。遠心分離は、試料を高速で回転させて遠心力を加え、試料中の特定の成分を分離又は分画する方法である。 The centrifugation according to the present invention will be described. Centrifugation is a method for separating or fractionating specific components in a sample by applying a centrifugal force by rotating the sample at a high speed.
血液を試料として用いた場合、回転数は１００〜１５００×ｇであることが好ましく、２００〜１３００×ｇがより好ましく、３００〜１０００×ｇがさらに好ましい。回転数が１００×ｇ以上であれば、血液より血球成分の分離ができ、１５００×ｇ以下であれば細胞が遠心力で破壊されるリスクを抑えることができる。 When blood is used as a sample, the number of rotations is preferably 100 to 1500 × g, more preferably 200 to 1300 × g, and even more preferably 300 to 1000 × g. If the rotational speed is 100 × g or more, blood cell components can be separated from blood, and if it is 1500 × g or less, the risk of cells being destroyed by centrifugal force can be suppressed.
遠心時間は１〜６０分が好ましく、３〜３０分がより好ましく、５〜１５分がさらに好ましい。遠心時間が１分以上であれば、血液より血球成分の分離ができ、６０分以下であれば、作業時間の観点から好ましい。 The centrifugation time is preferably 1 to 60 minutes, more preferably 3 to 30 minutes, and further preferably 5 to 15 minutes. If the centrifugation time is 1 minute or more, blood cell components can be separated from the blood, and if it is 60 minutes or less, it is preferable from the viewpoint of working time.
本発明にかかる血漿及び血清について説明する。血漿は、抗凝固剤入り採血管で採血して放置又は遠心分離した場合に、血球成分の沈殿によりできる上澄みである。この血漿は凝固因子を含む。一方で、抗凝固剤の入らない採血管又はシリンジで採血して放置した場合、抗凝固剤が入らないため、血球成分が凝固因子により凝血する。その後更に放置又は遠心分離をした場合の上澄みが血清であり、血清は凝固因子を欠く。 The plasma and serum according to the present invention will be described. Plasma is a supernatant formed by precipitation of blood cell components when collected in a blood collection tube containing an anticoagulant and left or centrifuged. This plasma contains clotting factors. On the other hand, when the blood is collected with a blood collection tube or syringe that does not contain an anticoagulant and left as it is, the anticoagulant does not enter and the blood cell component clots due to a coagulation factor. The supernatant is serum after further standing or centrifugation, and the serum lacks clotting factors.
血液を採取する際の採血管は、抗凝固剤が入ったものが好ましい。こうしたものの中にはＥＤＴＡ−２ＮａやＥＤＴＡ−２Ｋ、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、ヘパリン等が挙げられる。 A blood collection tube for collecting blood preferably contains an anticoagulant. Among these are EDTA-2Na, EDTA-2K, sodium citrate, sodium fluoride, heparin and the like.
本発明にかかる血栓溶解薬について説明する。血栓溶解薬は、血液中に生じた血栓を溶解する試薬である。血栓溶解薬は、繊維素分解酵素であるプラスミンの前駆体であるプラスミノーゲンを活性化するか、プラスミノーゲンを活性化する作用を持つ因子を活性化することで、血栓を溶解する。繊維素溶解作用を持つ試薬として、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、モンテプラーゼ、パミテプラーゼ、Ａｎｔｉ Ｃｌｏｔｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ （Ｇｅｎｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）等が挙げられる。 The thrombolytic drug according to the present invention will be described. A thrombolytic drug is a reagent that dissolves a thrombus formed in blood. The thrombolytic drug dissolves the thrombus by activating plasminogen, which is a precursor of plasmin, which is a fibrinolytic enzyme, or activating a factor having an action of activating plasminogen. Examples of the reagent having a fibrinolytic action include urokinase, alteplase, monteplase, pamiteplase, Anti Clotting Reagent (Generic Genetics) and the like.
本発明において、使用する血栓溶解薬は、プラスミノーゲンを活性化する作用、或いはプラスミノーゲン活性化因子を活性化する作用、またはその両方の作用を及ぼす成分を備えることが好ましい。 In the present invention, the thrombolytic agent to be used preferably comprises a component that exerts an action of activating plasminogen, an action of activating a plasminogen activator, or both.
血栓溶解薬の反応時間は１〜６０分が好ましく、３〜３０分がより好ましく、５〜１５分がさらに好ましい。反応時間が１分以上であれば繊維素溶解反応が進行して、繊維素を溶解することができ、６０分以下であれば、作業時間の観点から好ましい。 The reaction time of the thrombolytic drug is preferably 1 to 60 minutes, more preferably 3 to 30 minutes, and further preferably 5 to 15 minutes. If the reaction time is 1 minute or more, the fibrin dissolution reaction proceeds to dissolve the fibrin, and if it is 60 minutes or less, it is preferable from the viewpoint of working time.
血栓溶解薬の反応温度は２０〜３７℃が好ましく、２５〜３７℃がより好ましく、３０〜３７℃がさらに好ましい。反応温度が２０℃以上であれば血液中の繊維素を溶解することができ、３７℃以下であれば血栓溶解薬の成分の変性を抑え、特性を落とすことなく反応させることができる。 The reaction temperature of the thrombolytic drug is preferably 20 to 37 ° C, more preferably 25 to 37 ° C, and still more preferably 30 to 37 ° C. If the reaction temperature is 20 ° C. or higher, fibrin in the blood can be dissolved, and if it is 37 ° C. or lower, denaturation of the components of the thrombolytic drug can be suppressed and the reaction can be performed without degrading the characteristics.
繊維素溶解反応を行う際は、血液試料を遠心分離し、血漿又は血清を除き、残渣に血栓溶解薬を加えたときに、マイクロピペットにより５〜３０秒間ピペッティングすることで、繊維素溶解反応を促進することができる。 When performing a fibrinolysis reaction, the blood sample is centrifuged, plasma or serum is removed, and when a thrombolytic drug is added to the residue, the fibrinolysis reaction is carried out by pipetting for 5 to 30 seconds with a micropipette. Can be promoted.
遠心分離後の残渣に加える血栓溶解薬の量は、血液３ｍＬに対して２〜１０ｍＬが好ましく、３〜８ｍＬがより好ましく、４〜６ｍＬがさらに好ましい。加える量が２ｍＬ以上であれば、血液中の繊維素を溶解することができ、１０ｍＬ以下であれば、コスト及びフィルターを用いた捕捉の際の処理時間が短縮されるという観点から好ましい。 The amount of the thrombolytic drug added to the residue after centrifugation is preferably 2 to 10 mL, more preferably 3 to 8 mL, and even more preferably 4 to 6 mL with respect to 3 mL of blood. If the amount to be added is 2 mL or more, fibrin in the blood can be dissolved, and if it is 10 mL or less, it is preferable from the viewpoint that the cost and the processing time at the time of capture using a filter are shortened.
本発明にかかるフィルターについて説明する。本発明におけるフィルターは、血液から赤血球、白血球、及び血小板等の血液成分を取り除き、前記血液成分とは異なる性質を持つ希少細胞を捕捉するフィルターである。形状は、プラスチック又は金属の薄膜に、多数の貫通孔が形成されている。 The filter according to the present invention will be described. The filter in the present invention is a filter that removes blood components such as red blood cells, white blood cells, and platelets from blood and captures rare cells having properties different from those of the blood components. The shape is such that a large number of through holes are formed in a plastic or metal thin film.
フィルターを作製するための基板として使用する材料は銅（めっきが銅の場合はニッケル）が好ましい。銅は薬液による化学的溶解で容易に除去可能であり、フォトレジストとの密着力においても他の材料に比べると優れている。 The material used as the substrate for producing the filter is preferably copper (nickel when the plating is copper). Copper can be easily removed by chemical dissolution with a chemical solution, and is superior to other materials in adhesion to the photoresist.
フィルターの材質は金属からなることが好ましい。金属は加工性に優れている為、フィルターの加工精度を高めることができる。これにより、捕捉対象とする成分の捕捉率を更に向上させることができる。また、金属はプラスチックなどの他の材料と比べて剛直である為、外部から力が加わってもそのサイズや形状が維持される。この為、貫通孔よりも若干大きな成分を変形させて通過させる場合、より高精度の分離・濃縮が可能となる。 The material of the filter is preferably made of metal. Since metal is excellent in workability, the processing accuracy of the filter can be increased. Thereby, the capture rate of the component to be captured can be further improved. In addition, since metal is more rigid than other materials such as plastic, its size and shape are maintained even when external force is applied. For this reason, when a component slightly larger than the through hole is deformed and allowed to pass, separation / concentration can be performed with higher accuracy.
金属の主成分としては、ニッケル、銀、パラジウム、銅、イリジウム、ルテニウム、クロムのいずれか、もしくはこれらの合金が好ましい。 As the main component of the metal, nickel, silver, palladium, copper, iridium, ruthenium, chromium, or an alloy thereof is preferable.
パラジウムやイリジウムは酸化還元電位が高く、難溶性で特性が良好だが高価である。ニッケルは水素よりも酸化還元電位が低いため、溶解しやすいが安価である。銀やパラジウムは貴金属であり、パラジウムやイリジウムに比べると比較的安価である。 Palladium and iridium have a high redox potential, are hardly soluble, have good characteristics, but are expensive. Since nickel has a lower redox potential than hydrogen, it is easy to dissolve but is inexpensive. Silver and palladium are noble metals and are relatively inexpensive compared to palladium and iridium.
貫通孔の開口形状は長方形或いは角丸長方形であることが好ましい。角丸長方形とは２つの等しい長さの長辺と２つの半円形からなる形状である。この形状であることにより、貫通孔に目詰まりしにくく、捕捉対象とする成分の捕捉率を更に向上させることができる。 The opening shape of the through hole is preferably a rectangle or a rounded rectangle. A rounded rectangle is a shape composed of two long sides of equal length and two semicircles. By being this shape, it is hard to clog a through-hole, and the capture rate of the component made into the capture object can further be improved.
本発明にかかる希少細胞の捕捉及び濃縮について説明する。本発明における捕捉とは、血液中より、通常の血液成分とは異なる性質を持つ希少細胞を、血液をフィルターで濾過することにより、血液成分と分離し、フィルター上に残留させることをいう。濃縮とは、ある溶液中における希少細胞の血液細胞に対する比率を高めることをいう。即ち、フィルターによる希少細胞の捕捉は、濃縮の一形態である。
The capture and concentration of rare cells according to the present invention will be described. Capture in the present invention means that rare cells having properties different from those of normal blood components are separated from blood components by filtering the blood from the blood and remain on the filter. Concentration means increasing the ratio of rare cells to blood cells in a solution. That is, the capture of rare cells by a filter is a form of concentration.
フィルター上に捕捉した希少細胞は、フィルター上より回収を行い、希少細胞含有液を得ることができる。回収方法としては、逆洗、マイクロマニピュレーション、ピペッティング等が挙げられ、何れを用いても構わない。 The rare cells captured on the filter can be recovered from the filter to obtain a rare cell-containing solution. Examples of the recovery method include backwashing, micromanipulation, pipetting and the like, and any of them may be used.
逆洗について説明する。逆洗とは、フィルターの細胞捕捉面の反対側より液を流し、フィルター上に捕捉された希少細胞をはがし取ることをいう。 Backwashing will be described. Backwashing refers to removing the rare cells trapped on the filter by flowing liquid from the opposite side of the cell capture surface of the filter.
マイクロマニピュレーションについて説明する。マイクロマニピュレーションとは、ピコピペットを用いて希少細胞１つ１つを回収することをいう。 The micro manipulation will be described. Micromanipulation means collecting rare cells one by one using a pico pipette.
ピペッティングについて説明する。本発明の製造方法におけるピペッティングによる回収とは、フィルター上の液体をマイクロピペットを用いて混合し、フィルター上に捕捉された細胞をはがし取ることをいう。 Pipetting will be described. The recovery by pipetting in the production method of the present invention means that the liquid on the filter is mixed using a micropipette, and the cells captured on the filter are peeled off.
（フィルター１） (Filter 1)
感光性樹脂組成物（ＰＨＯＴＥＣ ＲＤ−１２２５：厚さ２５μｍ、日立化成株式会社製）を２５０ｍｍ角の基板（ＭＣＬ−Ｅ６７９Ｆ：ＭＣＬの表面にピーラブル銅箔を貼り合わせた基板、日立化成株式会社製）の片面にラミネートした。ラミネート条件はロール温度９０℃、圧力０．３ＭＰａ、コンベア速度２．０ｍ／分で行った。 Photosensitive resin composition (PHOTEC RD-1225: thickness 25 μm, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.) 250 mm square substrate (MCL-E679F: substrate in which peelable copper foil is bonded to the surface of MCL, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.) Laminated on one side. Lamination conditions were performed at a roll temperature of 90 ° C., a pressure of 0.3 MPa, and a conveyor speed of 2.0 m / min.
次に、光の透過部の形状が角丸長方形、サイズが７．８（短孔径）×１００（長孔径）ｍで開口率６．７％となるように設計したガラスマスクを基板のフォトレジストラミネート面に静置した。本実施例においては同一の方向を向いた角丸長方形が長軸及び短軸方向に一定のピッチで整列したガラスマスクを使用した。
続いて、６００ｍｍＨｇ以下の真空下において、ガラスマスクを載置した基板上部から紫外線照射装置によって露光量３０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射した。
Next, a glass mask designed so that the light transmitting portion has a rounded rectangular shape, a size of 7.8 (short hole diameter) × 100 (long hole diameter) m, and an aperture ratio of 6.7% is used as a substrate photoresist. It was left to stand on the laminate surface. In this embodiment, a glass mask in which rounded rectangles facing in the same direction are arranged at a constant pitch in the major axis and minor axis directions was used.
Subsequently, under a vacuum of 600 mmHg or less, ultraviolet rays having an exposure amount of 30 mJ / cm 2 were irradiated from above the substrate on which the glass mask was placed by an ultraviolet irradiation device.
短孔径、長孔径、開口率は図１のように定義する。即ち、角丸長方形の長辺が長孔径、短辺が短孔径であり、開口率（％）＝開口部分の面積／総面積×１００％とし、総面積とは、最も外側の開口部端部同士を結んでなり、全ての貫通孔を含むように形成された領域の面積を指す。 The short hole diameter, long hole diameter, and aperture ratio are defined as shown in FIG. That is, the long side of the rounded rectangle has a long hole diameter and the short side has a short hole diameter, and the opening ratio (%) = area of the opening portion / total area × 100%, and the total area is the outermost opening end. It refers to the area of a region formed by connecting each other and including all the through holes.
次に、１．０％炭酸ナトリウム水溶液で現像を行い、基板上に長方形のフォトレジストが垂直に立ったレジスト層を形成した。このレジスト付き基板の銅露出部分にｐＨが４．５になるように調整したニッケルめっき液中温度５５℃、約２０分間約２０μｍめっきを行った。ニッケルめっき液の組成を表１に示す。 Next, development was performed with a 1.0% aqueous sodium carbonate solution to form a resist layer with a rectangular photoresist standing vertically on the substrate. The exposed copper portion of the resist-coated substrate was plated for about 20 μm at a temperature of 55 ° C. for about 20 minutes in a nickel plating solution adjusted to a pH of 4.5. Table 1 shows the composition of the nickel plating solution.
次に、得られたニッケルめっき層を基板のピーラブル銅箔とともに剥離し、このピーラブル銅箔を温度４０℃で約１２０分間、攪拌処理での薬液による化学的溶解（メックブライトＳＦ−５４２０Ｂ、メック株式会社）によって除去することにより金属フィルターとなる自立膜（２０ｍｍ×２０ｍｍ）を取り出した。 Next, the obtained nickel plating layer is peeled off together with the peelable copper foil of the substrate, and this peelable copper foil is chemically dissolved by a chemical solution in a stirring process at a temperature of 40 ° C. for about 120 minutes (MEC BRIGHT SF-5420B, MEC stock). The self-supporting membrane (20 mm × 20 mm) to be a metal filter was removed by removing it by the company.
最後に、自立膜内に残ったフォトレジストを温度６０℃で約４０分間、超音波処理でのレジスト剥離（Ｐ３ Ｐｏｌｅｖｅ、Ｈｅｎｋｅｌ）によって除去し、微細貫通孔を有する金属フィルターを作製した。
これによって、シワ・折れ・キズ・カール等のダメージはなく、十分な精度の貫通孔を有する金属フィルターを作製した。
Finally, the photoresist remaining in the self-supporting film was removed by resist stripping (P3 Poleve, Henkel) by ultrasonic treatment at a temperature of 60 ° C. for about 40 minutes to produce a metal filter having fine through holes.
As a result, there was no damage such as wrinkles, creases, scratches, curls, etc., and a metal filter having through holes with sufficient accuracy was produced.
次に、酸性脱脂液Ｚ−２００（ワールドメタル製：商品名）に金属フィルターを浸漬し、金属フィルター上の有機物の除去を行った（４０℃３分）。 Next, the metal filter was immersed in acidic degreasing solution Z-200 (manufactured by World Metal: trade name), and organic substances on the metal filter were removed (40 ° C. for 3 minutes).
水洗後、非シアン系の無電解金めっきであるＨＧＳ―１００（日立化成製商品名）から金供給源である亜硫酸金を抜いた液により８０℃１０分の条件で置換金めっき前処理を行った。 After washing with water, pretreatment for substitution gold plating was performed at 80 ° C for 10 minutes with a solution obtained by removing gold sulfite as a gold supply source from HGS-100 (trade name, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.), a non-cyan electroless gold plating. It was.
次に非シアン系の置換型無電解金めっきであるＨＧＳ―１００（日立化成製商品名）に８０℃２０分浸漬し、置換金めっきを行った。置換金めっきの厚みは０．０５μｍであった。 Next, immersion gold plating was performed by immersing in HGS-100 (trade name, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.), which is a non-cyan substitutional electroless gold plating, at 80 ° C. for 20 minutes. The thickness of the displacement gold plating was 0.05 μm.
水洗後、非シアン系還元型無電解金めっきであるＨＧＳ―５４００（日立化成製商品名）に６５℃１０分浸漬し、金めっきを行い、水洗後乾燥を行った。金めっきのトータル厚みは０．２μｍであった。
（実験）
（非小細胞肺がん細胞株の調製）
After washing with water, it was immersed in HGS-5400 (trade name, manufactured by Hitachi Chemical Co., Ltd.) that is non-cyan reduction type electroless gold plating for 10 minutes at 65 ° C., gold-plated, washed with water and dried. The total thickness of the gold plating was 0.2 μm.
(Experiment)
(Preparation of non-small cell lung cancer cell lines)
非小細胞がん細胞株であるＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて、３７℃、５％ ＣＯ２条件下にて静置培養した。トリプシン処理により培養皿から細胞を剥離させて回収し、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）を用いて洗浄後、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下洗浄液という。）に懸濁し、細胞懸濁液を得た。尚、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水であり和光純薬工業製製品コード１６６−２３５５５を用いた。ＢＳＡはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎａｍｅ ： Ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ−Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ， Ｂｉｏ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）のものを用いた。ＥＤＴＡは２Ｎａ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸二ナトリウム塩二水和物）（和光純薬工業製製品コード３４５−０１８６５）を用いた。
（血栓溶解薬処理した血液サンプル中のＣＴＣの捕捉・濃縮）
NCI-H358 cells, which are non-small cell carcinoma cell lines, were statically cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37 ° C. and 5% CO 2 . Cells were detached from the culture dish by trypsin treatment and collected, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then PBS containing 2 mM EDTA and 0.5% bovine serum albumin (BSA) (hereinafter referred to as washing solution). To obtain a cell suspension. PBS is phosphate buffered saline, and product code 166-23555 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used. BSA manufactured by Sigma-Aldrich (Product Name: Albumin from bovine serum-Lyophilized powder, Bio Reagent for cell culture) was used. As the EDTA, 2Na (ethylenediamine-N, N, N ′, N′-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) (product code 345-01865 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
(Capture and concentrate CTCs in blood samples treated with thrombolytic agents)
３ｍＬの血液サンプルとして、ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有真空採血管に採血し、７２時間以上経過した健常者血液に、がん細胞が１０００個となる量の細胞懸濁液を加え、血液サンプル１を得た。 As a 3 mL blood sample, blood was collected in an EDTA-2Na-containing vacuum blood collection tube, and a cell suspension of an amount of 1000 cancer cells was added to the blood of a healthy person who had passed 72 hours or more to obtain a blood sample 1 .
３ｍＬの血液サンプル１を４００×ｇ、１０分間遠心し、血漿成分と血球成分に分離し、血漿成分をマイクロピペットにて取り除いた。 A 3 mL blood sample 1 was centrifuged at 400 × g for 10 minutes to separate into a plasma component and a blood cell component, and the plasma component was removed with a micropipette.
血液サンプル１の残渣に、血栓溶解薬としてＡｎｔｉ Ｃｌｏｔｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを５ｍＬ加え、マイクロピペットで３０秒間よく混合し、混合液を調製した。 To the residue of blood sample 1, 5 mL of Anti Clotting Reagent as a thrombolytic agent was added and mixed well with a micropipette for 30 seconds to prepare a mixed solution.
前記混合液を３７℃に設定したウォーターバスを用いて１０分加温し、繊維素溶解反応を行い、サンプル１を得た。 The mixed solution was heated for 10 minutes using a water bath set at 37 ° C., and a fibrinolysis reaction was performed to obtain Sample 1.
実施例で作製したフィルター１をカートリッジにセットした図２に示すＣＴＣ捕捉装置を用いて実験を行った。 An experiment was conducted using the CTC capturing apparatus shown in FIG. 2 in which the filter 1 produced in the example was set in a cartridge.
ＣＴＣ捕捉装置は、被検液となる血液をフィルターによってろ過することで血液中に含まれるＣＴＣを捕捉する装置である。また、フィルターにより捕捉されたＣＴＣについて、染色液等の処理液を用いて染色することで、ＣＴＣの特定及びがん細胞の個体数のカウント等が行われる。 The CTC capture device is a device that captures CTC contained in blood by filtering blood to be a test solution through a filter. In addition, the CTC captured by the filter is stained using a treatment liquid such as a staining liquid, whereby the CTC is identified and the number of cancer cells is counted.
図２に示すように、ＣＴＣ捕捉装置１００は、ＣＴＣを捕捉するためのフィルターが内部に設けられたフィルターユニット１、フィルターユニット１に対して処理液（試薬）を供給するための軟質チューブからなる流路３（処理液流路／下流側流路）、フィルターユニット１に対して血液を供給するための軟質チューブからなる流路４（血液流路）が設けられている。流路３の上流側には、複数の処理液収納容器５に対して互いに異なる処理液（試薬）が入れられている。処理液収納容器５に投入される処理液としては、ＣＴＣを染色するための染色液、フィルターに捕捉されたＣＴＣ等を洗浄するための洗浄液、リンス液等が挙げられる。これらの複数の処理液収納容器５に対してはそれぞれ軟質チューブ６が挿入されて個別の流路（処理液流路／上流側流路）を形成している。そして、これらの流路が選択バルブ８に対して接続されており、選択バルブ８（選択バルブ）を回転させることにより流路３に対して接続する処理液（処理液収納容器５）が選択される。 As shown in FIG. 2, the CTC capturing device 100 includes a filter unit 1 in which a filter for capturing CTC is provided, and a soft tube for supplying a processing liquid (reagent) to the filter unit 1. A flow path 3 (treatment liquid flow path / downstream flow path) and a flow path 4 (blood flow path) made of a soft tube for supplying blood to the filter unit 1 are provided. Different processing liquids (reagents) are placed in the plurality of processing liquid storage containers 5 on the upstream side of the flow path 3. Examples of the processing liquid charged into the processing liquid storage container 5 include a staining liquid for staining CTC, a cleaning liquid for cleaning CTC captured by a filter, a rinse liquid, and the like. A soft tube 6 is inserted into each of the plurality of processing liquid storage containers 5 to form individual flow paths (processing liquid flow path / upstream flow path). These flow paths are connected to the selection valve 8, and the processing liquid (processing liquid storage container 5) to be connected to the flow path 3 is selected by rotating the selection valve 8 (selection valve). The
フィルターユニット１に対して接続する流路４には、内部に血液が納められた血液収納容器１０（以下リザーバーとする）が接続されている。フィルターユニット１に対しては、処理液及び血液を同時に供給するのではなくいずれか一方を供給する構成となっているが、処理液及び血液のうちいずれの液体を供給するかの制御は流路３、４のそれぞれに対して取り付けられたバルブ１２、１３よって切り替える。例えば、血液をフィルターユニット１に対して供給する流す場合は、バルブ１２を閉とし、バルブ１３を開とする。バルブ１２、１３としては、軟質チューブを加圧変形させてその流れを遮断するピンチバルブを用いることができる。 The flow path 4 connected to the filter unit 1 is connected to a blood storage container 10 (hereinafter referred to as a reservoir) in which blood is stored. The filter unit 1 is configured to supply either one of the treatment liquid and the blood instead of supplying the treatment liquid and the blood at the same time. Switching is performed by valves 12 and 13 attached to 3 and 4 respectively. For example, when supplying blood to the filter unit 1, the valve 12 is closed and the valve 13 is opened. As the valves 12 and 13, pinch valves that pressurize and deform the soft tube to block the flow can be used.
また、フィルターユニット１に対して処理液及び血液のうちのいずれかの液体を供給する場合、フィルターユニット１の下流に設けられたポンプ１４（供給手段）によって吸引することで液体の供給が行われる。ポンプ１４は回転数変化により流路中の液体の流速を変えることが可能な構造となっている。ポンプ１４としては、例えば軟質チューブに対する加圧による蠕動点を順次移動させる蠕動ポンプ（ペリスタルティックポンプ）を用いることができる。ポンプ１４の駆動により、試薬・血液等の液体は流路３又は流路４の内部をフィルターユニット１に向かう方向に流れフィルターユニット１に供給される。そして、フィルターユニット１を通過した液体は、廃液タンク１６に流れ込む構造となっている。これらの構造により、血液中のＣＴＣがフィルターユニット１内の流路上に設けられたフィルターによって捕捉されると共に、染色液によりＣＴＣが染色される。 Further, when any one of the processing liquid and blood is supplied to the filter unit 1, the liquid is supplied by being sucked by a pump 14 (supply means) provided downstream of the filter unit 1. . The pump 14 has a structure capable of changing the flow rate of the liquid in the flow path by changing the rotation speed. As the pump 14, for example, a peristaltic pump (peristaltic pump) that sequentially moves a peristaltic point by pressurizing the soft tube can be used. By driving the pump 14, a liquid such as a reagent or blood flows in the direction toward the filter unit 1 through the flow path 3 or the flow path 4 and is supplied to the filter unit 1. The liquid that has passed through the filter unit 1 flows into the waste liquid tank 16. With these structures, CTC in blood is captured by a filter provided on the flow path in the filter unit 1, and CTC is stained with a staining solution.
上記の各部の制御は、制御部４８（選択手段、送液手段）による制御により行われる。具体的には、選択バルブ８の制御は、制御部４８からの指示に基づいて選択バルブドライバ４９により行われる。また、バルブ１２、１３については、それぞれに対して接続された２つのバルブドライバ５０により制御が行われる。また、ポンプ１４の駆動についても、ポンプドライバ５１により制御が行われ、例えば、ポンプの回転数を変更させることで流量を可変とし、決められた最適な流量をフィルターユニット１に供給することで、血液中のＣＴＣの捕捉、捕捉したＣＴＣの染色を最適な流量条件で行うことを可能としている。制御部４８には、選択バルブ８、バルブ１２、１３、ポンプ１４のそれぞれについて駆動／停止等の制御を可能とするプログラムを入力するためのプログラム入力機能が備えられていて、これにより入力されたプログラムによって上記したように各機器を順に動作させる駆動機構が付加されている。
The above-described control of each unit is performed by control by the control unit 48 (selection unit, liquid feeding unit). Specifically, the selection valve 8 is controlled by the selection valve driver 49 based on an instruction from the
まず、リザーバーに洗浄液を導入し、フィルター上を満たした。続いて、サンプル１をリザーバーに導入し、ペリスタルティックポンプを使用して流速２００μＬ／分で送液を開始した。約１５分後、処理液収納容器５から３ｍＬの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。 First, a cleaning solution was introduced into the reservoir to fill the filter. Subsequently, Sample 1 was introduced into the reservoir, and liquid feeding was started using a peristaltic pump at a flow rate of 200 μL / min. After about 15 minutes, 3 mL of a cleaning solution was introduced from the processing solution storage container 5 to wash the cells.
次にＰＢＳに４％ ＰＦＡを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。洗浄液で洗浄後、ＰＢＳに０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。 Next, a solution obtained by dissolving 4% PFA in PBS was put in a cartridge, and the cells were immersed for 15 minutes. After washing with the washing solution, a solution obtained by dissolving 0.2% Triton X-100 (manufactured by Sigma-Aldrich) in PBS was placed in a cartridge, and the cells were immersed for 15 minutes.
洗浄液で洗浄後、処理液収納容器５から、２ｍＬの細胞染色液（ＦＩＴＣ標識抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体、１ μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）を導入し、フィルター上のがん細胞又は白血球を蛍光染色した。フィルター上に捕捉された細胞に対して３０分間染色を行った後、処理液収納容器５より３ｍＬの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。 After washing with the washing solution, 2 mL of cell staining solution (FITC-labeled anti-Cytokeratin antibody, PE-labeled anti-CD45 antibody, 1 μg / mL Hoechst 33342) is introduced from the treatment solution storage container 5 to remove cancer cells or leukocytes on the filter. Fluorescently stained. The cells captured on the filter were stained for 30 minutes, and then 3 mL of washing solution was introduced from the treatment solution storage container 5 to wash the cells.
続いて、コンピューター制御式電気ステージ及び冷却デジタルカメラ（ＤＰ７０、オリンパス株式会社）を装備した蛍光顕微鏡（ＢＸ６１、オリンパス株式会社）を使用してフィルターを観察し、フィルター上のがん細胞及び白血球の数をカウントした。
ＦＩＴＣ、ＰＥ及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２由来の蛍光を観察するために、それぞれＢＮＡ、ＧＷ及びＵＮＡフィルター（オリンパス株式会社）を用いて画像を取得した。画像取得及び解析ソフトにはＬｕｍｉｎａ Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事株式会社）を用いた。結果を表１に示す。細胞回収率（％）＝フィルターに回収されたＦＩＴＣ陽性細胞数／血液サンプルに混合したがん細胞数×１００％。白血球の数はＰＥで染色された細胞数とした。
Subsequently, the filter was observed using a fluorescence microscope (BX61, Olympus Corporation) equipped with a computer-controlled electric stage and a cooled digital camera (DP70, Olympus Corporation), and the number of cancer cells and white blood cells on the filter Counted.
In order to observe the fluorescence derived from FITC, PE and Hoechst 33342, images were acquired using BNA, GW and UNA filters (Olympus Corporation), respectively. Lumina Vision (Mitani Corporation) was used as image acquisition and analysis software. The results are shown in Table 1. Cell recovery rate (%) = FITC positive cells recovered in filter / number of cancer cells mixed in blood sample × 100%. The number of leukocytes was the number of cells stained with PE.
前記の血液サンプル１を用い、遠心分離及び血漿除去を行わなかったサンプル２を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。 The same procedure as in Example 1 was performed, except that the blood sample 1 was used and the sample 2 that was not subjected to centrifugation and plasma removal was used.
前記の血液サンプル１を用い、加える血栓溶解薬の量を２ｍＬとしたサンプル３を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。 The same procedure as in Example 1 was performed, except that the blood sample 1 was used and the sample 3 was added with 2 mL of thrombolytic drug added.
前記の血液サンプル１を用い、加える血栓溶解薬の量を１０ｍＬとしたサンプル４を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。 The same procedure as in Example 1 was performed, except that the blood sample 1 was used and the sample 4 in which the amount of the thrombolytic drug added was 10 mL was used.
前記の血液サンプル１を用い、血栓溶解薬の反応時間を１分としたサンプル５を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。 The procedure was the same as in Example 1 except that the blood sample 1 was used and the sample 5 was used with a thrombolytic drug reaction time of 1 minute.
前記の血液サンプル１を用い、血栓溶解薬の反応時間を６０分としたサンプル６を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。 The procedure was the same as in Example 1 except that the blood sample 1 was used and the sample 6 was used in which the reaction time of the thrombolytic drug was 60 minutes.
前記の血液サンプル１を用い、血栓溶解薬の反応温度を２０℃としたサンプル７を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。 The same procedure as in Example 1 was performed, except that the blood sample 1 was used and the sample 7 having a thrombolytic drug reaction temperature of 20 ° C. was used.
前記の血液サンプル１を用い、血栓溶解薬を加えたときにピペッティングを行わなかったサンプル８を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。 The same procedure as in Example 1 was performed except that the blood sample 1 was used and the sample 8 that was not pipetted when the thrombolytic drug was added was used.
前記の血液サンプル１を用い、血栓溶解薬を加えず、反応、ピペッティング等を行わなかったサンプル９を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。 The same procedure as in Example 1 was performed, except that the blood sample 1 was used and the sample 9 was used without adding a thrombolytic drug and without performing reaction, pipetting, or the like.
サンプルとして、ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有真空採血管でし、採血後６時間以内の健常者血液に、がん細胞が１０００個となる量の細胞懸濁液を加え、血栓溶解薬処理を行わなかったサンプル１０を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
（結果）
The sample was a EDTA-2Na-containing vacuum blood collection tube, and a cell suspension with an amount of 1000 cancer cells was added to healthy blood within 6 hours after blood collection, and the thrombolytic drug treatment was not performed. The procedure was the same as in Example 1 except that 10 was used.
(result)
各実験例の実験条件を表２に示す。また、評価結果を表３に示す。実施例１に示すように、遠心分離の後、血漿を除去し、血栓溶解薬と反応させてフィルターにより処理を行うと、がん細胞の回収率が高く、白血球の残りも少ない。 Table 2 shows the experimental conditions of each experimental example. The evaluation results are shown in Table 3. As shown in Example 1, when the plasma is removed after centrifugation and reacted with a thrombolytic drug and treated with a filter, the recovery rate of cancer cells is high and the remaining leukocytes are small.
実施例１及び２は、血漿除去の有無を変更した場合である。血漿を除去しない場合、血漿を除去したものと比較して若干特性が劣るが、フィルター法に適用可能であり、依然良好な特性を示す。 Examples 1 and 2 are cases where the presence or absence of plasma removal was changed. When plasma is not removed, the characteristics are slightly inferior to those from which plasma is removed, but it is applicable to the filter method and still exhibits good characteristics.
実施例１、３及び４は添加する血栓溶解薬の量を変更した場合である。５ｍＬ程度以上の添加量の場合、がん細胞回収率が高く、フィルター上に残存する白血球数が少ない。採血後の経過時間が短く、凝集の起きていない血液を使用した参考例と比較して、より濃縮の程度が高く、良好な特性を示す。添加量を２ｍＬまで減少させると、添加量が多い場合と比較して若干特性が劣るものの、依然として良好な特性を示す。反応に関与するプラスミノーゲン活性化因子濃度が一定度以上必要であることが示唆される。 Examples 1, 3 and 4 are cases in which the amount of thrombolytic drug added was changed. When the addition amount is about 5 mL or more, the cancer cell recovery rate is high, and the number of white blood cells remaining on the filter is small. The elapsed time after blood collection is short, and compared with the reference example using the blood which has not aggregated, the degree of concentration is higher and shows good characteristics. When the addition amount is reduced to 2 mL, although the characteristics are slightly inferior to those in the case where the addition amount is large, the characteristics are still good. It is suggested that the plasminogen activator concentration involved in the reaction needs to be higher than a certain level.
実施例５及び６は繊維素溶解反応の反応時間を変更した場合である。反応時間が１０分程度以上の場合、良好な特性を示す。１分の場合、良好な特性を示すものの効果が小さい。これは、プラスミノーゲン活性化因子により、プラスミノーゲンがプラスミンに活性化され、プラスミンが繊維素を溶解する反応に必要な時間が５〜１０分程度であるためと考えられる。 Examples 5 and 6 are cases where the reaction time of the fibrinolysis reaction was changed. When the reaction time is about 10 minutes or more, good characteristics are exhibited. In the case of 1 minute, although showing good characteristics, the effect is small. This is considered to be because plasminogen is activated to plasmin by the plasminogen activator, and the time required for plasmin to dissolve fibrin is about 5 to 10 minutes.
実施例７は、反応温度を３７℃から２０℃に変更した場合である。この場合、３７℃で反応させた場合よりも若干効果は劣るが、依然良好な特性を示す。 In Example 7, the reaction temperature was changed from 37 ° C to 20 ° C. In this case, the effect is slightly inferior to the case of reaction at 37 ° C., but still shows good characteristics.
実施例８は、ピペッティングによる繊維素溶解反応の促進を行わなかった場合である。この場合、良好な特性を示すもののピペッティングを行った場合よりも特性は劣る。これは、ピペッティングによる機械刺激を与えることが、繊維素溶解に有用であることを示唆している。 Example 8 is a case where the fibrinolysis reaction was not promoted by pipetting. In this case, although the characteristic is shown, the characteristic is inferior to the case of pipetting. This suggests that mechanical stimulation by pipetting is useful for fibrinolysis.
比較例は処理を何も行わずにフィルター処理を行った場合である。この場合、血液の凝集物によってフィルターが目詰まりし、液が流れなくなるため、測定不可能である。 The comparative example is a case where the filter process is performed without performing any process. In this case, the filter is clogged with blood agglomerates and the liquid does not flow, so measurement is impossible.
参考例は採血からの経過時間が６時間以内と短く、血栓溶解薬で処理しない場合である。この場合、血液の凝集が起きていないため、良好な特性を示す。 A reference example is a case where the elapsed time from blood collection is as short as 6 hours or less and is not treated with a thrombolytic drug. In this case, since blood aggregation does not occur, good characteristics are exhibited.
以上示したように、本発明で示した血液への血栓溶解薬の添加とフィルターを用いた濾過の組み合わせにより、従来使用不可能であった凝集血液を使用可能とし、希少細胞の濃縮の程度が向上する。 As described above, the combination of the addition of a thrombolytic agent to blood and the filtration using a filter shown in the present invention makes it possible to use aggregated blood that could not be used conventionally, and the degree of concentration of rare cells improves.
１・・・フィルターユニット、３、４、６・・・流路、５・・・処理液収納容器、８・・・選択バルブ、１０・・・血液収納容器、１２、１３・・・バルブ、１４・・・ポンプ、１６・・・廃液タンク、４８・・・制御部、４９・・・選択バルブドライバ、５０・・・バルブドライバ、５１・・・ポンプドライバ、１００・・・ＣＴＣ捕捉装置 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Filter unit 3, 4, 6 ... Flow path, 5 ... Treatment liquid storage container, 8 ... Selection valve, 10 ... Blood storage container, 12, 13 ... Valve, DESCRIPTION OF SYMBOLS 14 ... Pump, 16 ... Waste liquid tank, 48 ... Control part, 49 ... Selection valve driver, 50 ... Valve driver, 51 ... Pump driver, 100 ... CTC capture device
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