JP2016082879A - Cell disruption apparatus and cell disruption method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞破砕装置および細胞破砕方法に関する。 The present invention relates to a cell disruption apparatus and a cell disruption method.
従来、キャビテーションを利用して液体中の細胞を破砕したり、汚泥やバラスト水の殺菌処理を行ったりする装置として、超音波振動子によりキャビテーションを発生させるもの（例えば、特許文献１または２参照）や、プランジャポンプやホースポンプを利用して流動キャビテーションを発生させるものがある（例えば、特許文献３乃至５参照）。これらの装置は、キャビテーション気泡の消滅の際に生じる機械的な衝撃により、微生物や細菌を破砕するよう構成されている。 2. Description of the Related Art Conventionally, as an apparatus for crushing cells in a liquid using cavitation or sterilizing sludge or ballast water, an apparatus that generates cavitation with an ultrasonic vibrator (see, for example, Patent Document 1 or 2) There are also those that generate flow cavitation using a plunger pump or a hose pump (see, for example, Patent Documents 3 to 5). These devices are configured to crush microorganisms and bacteria by mechanical impacts that occur when cavitation bubbles disappear.
細胞内のたんぱく質を抽出する目的等で細胞を破砕する場合には、大量の汚泥やバラスト水の殺菌処理を行う場合とは異なり、少量の液体中でキャビテーションを発生させる必要がある。特許文献１および２に記載のような超音波振動子を使用する装置では、少量の液体を処理する場合、振動子で発生する熱により液体の温度が上昇しやすくなるため、液体中の細胞や、細胞から抽出されるたんぱく質が変質してしまうという課題があった。 When cells are disrupted for the purpose of extracting intracellular proteins, cavitation must be generated in a small amount of liquid, unlike the case of sterilizing a large amount of sludge or ballast water. In an apparatus using an ultrasonic vibrator as described in Patent Documents 1 and 2, when processing a small amount of liquid, the temperature of the liquid is likely to rise due to heat generated by the vibrator. However, there is a problem that the protein extracted from the cells is altered.
特許文献３乃至５に記載のようなプランジャポンプやホースポンプを使用する装置では、ポンプの内部も液体で充填する必要があるため、所定量以上の液体が必要となり、それより少量の液体中の細胞を破砕するのは困難であるという課題があった。また、特許文献３乃至５の装置では、細胞の破砕効率を上げるために、液体を循環させて何度もキャビテーションを発生させたり、多段でキャビテーションを発生させたりしている。このため、液体を流す流路が長くなり、それを充填するために所定量以上の液体が必要となり、やはり少量の液体中の細胞を破砕するのは困難であるという課題があった。 In an apparatus using a plunger pump or a hose pump as described in Patent Documents 3 to 5, it is necessary to fill the inside of the pump with a liquid. There was a problem that it was difficult to disrupt cells. In addition, in the apparatuses of Patent Documents 3 to 5, in order to increase the efficiency of cell disruption, the liquid is circulated to generate cavitation many times or multiple stages of cavitation are generated. For this reason, the flow path through which the liquid flows becomes long, and a predetermined amount or more of liquid is required to fill it, and there is still a problem that it is difficult to crush cells in a small amount of liquid.
本発明は、このような課題に着目してなされたもので、キャビテーションを利用して、温度上昇を抑えつつ、比較的少量の液体中の細胞を高効率で破砕することができる細胞破砕装置および細胞破砕方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made paying attention to such a problem, and a cell disruption apparatus capable of efficiently disrupting cells in a relatively small amount of liquid while suppressing an increase in temperature using cavitation and An object is to provide a cell disruption method.
上記目的を達成するために、本発明に係る細胞破砕装置は、両端から中央に向かって徐々に内径が小さくなるよう形成された、細胞を含む液体を流すための流路と、前記流路を一方に向かって流れる前記液体中、および、前記流路を他方に向かって流れる前記液体中にキャビテーション気泡が発生するよう、前記液体を前記流路中で往復移動させる駆動手段とを、有することを特徴とする。 In order to achieve the above object, a cell disruption apparatus according to the present invention comprises a flow path for flowing a liquid containing cells, formed so that the inner diameter gradually decreases from both ends toward the center, and the flow path. Drive means for reciprocating the liquid in the flow path so that cavitation bubbles are generated in the liquid flowing toward the one side and in the liquid flowing toward the other side of the flow path. Features.
本発明に係る細胞破砕方法は、両端から中央に向かって徐々に内径が小さくなるよう形成された流路に、細胞を含む液体を供給し、前記流路を一方に向かって流れる前記液体中、および、前記流路を他方に向かって流れる前記液体中にキャビテーション気泡が発生するよう、前記液体を前記流路中で往復移動させることを特徴とする。 In the cell disruption method according to the present invention, the liquid containing the cells is supplied to the flow path formed so that the inner diameter gradually decreases from both ends toward the center, and the liquid that flows toward the one side in the flow path, In addition, the liquid is reciprocated in the flow path so that cavitation bubbles are generated in the liquid flowing in the flow path toward the other side.
本発明に係る細胞破砕装置および細胞破砕方法は、両端から中央に向かって徐々に内径が小さくなるよう流路が形成されているため、内径が小さい中央の小径部を、所定の圧力および流速で液体が通過する際に、液体中にキャビテーション気泡を発生させることができる。このため、液体を流路中で往復移動させることにより、流路を一方に向かって流れるとき、および、流路を他方に向かって流れるときに、液体中にキャビテーション気泡を発生させることができ、そのキャビテーション気泡を利用して液体中の細胞を破砕することができる。液体を往復移動させるたびに、細胞を破砕することができるため、液体の量を増やさなくとも、往復移動の回数を増やすことにより、細胞の破砕率を高めることができる。このように、本発明に係る細胞破砕装置および細胞破砕方法は、比較的少量の液体中の細胞を高効率で破砕することができる In the cell crushing apparatus and the cell crushing method according to the present invention, since the flow path is formed so that the inner diameter gradually decreases from both ends toward the center, the central small-diameter portion having a small inner diameter is formed at a predetermined pressure and flow rate. As the liquid passes, cavitation bubbles can be generated in the liquid. Therefore, by reciprocating the liquid in the flow path, cavitation bubbles can be generated in the liquid when flowing toward the one side of the flow path and when flowing toward the other side of the flow path, The cavitation bubbles can be used to disrupt cells in the liquid. Since the cells can be crushed each time the liquid is reciprocated, the cell crushing rate can be increased by increasing the number of reciprocating movements without increasing the amount of liquid. Thus, the cell crushing apparatus and the cell crushing method according to the present invention can crush cells in a relatively small amount of liquid with high efficiency.
本発明に係る細胞破砕装置および細胞破砕方法は、比較的少量の液体中の細胞を破砕できるため、例えば、細胞内のたんぱく質を抽出するために好適に使用することができる。本発明に係る細胞破砕装置および細胞破砕方法は、液体を往復移動してキャビテーション気泡を発生させるため、機械的な熱の発生源となる超音波振動子等が不要である。このため、液体の温度上昇を抑えることができ、熱により液体中の細胞等が変質するのを防ぐことができる。 The cell disruption apparatus and the cell disruption method according to the present invention can be suitably used for, for example, extracting proteins in cells because cells in a relatively small amount of liquid can be disrupted. The cell crushing apparatus and the cell crushing method according to the present invention generate cavitation bubbles by reciprocating the liquid, so that an ultrasonic vibrator or the like serving as a mechanical heat generation source is unnecessary. For this reason, the temperature rise of a liquid can be suppressed and it can prevent that the cell in a liquid denatures with a heat | fever.
本発明に係る細胞破砕装置および細胞破砕方法では、液体を流路中で往復移動させる駆動手段として、例えば、シリンジや圧送ポンプなどを用いることができる。シリンジを用いる場合、シリンジを流路の一端側に配置し、シリンジを押したとき、流路の一方から他方に液体を流し、シリンジを引いたとき、流路の他方から一方に液体を流すことができる。また、圧送ポンプを用いた場合、圧送ポンプを流路の両端に配置し、一端側の圧送ポンプを駆動して流路の一方から他方に液体を流し、他端側の圧送ポンプを駆動して流路の他方から一方に液体を流すことができる。 In the cell crushing apparatus and the cell crushing method according to the present invention, for example, a syringe or a pressure pump can be used as a driving means for reciprocating the liquid in the flow path. When using a syringe, place the syringe on one end of the flow path, and when the syringe is pushed, the liquid flows from one side of the flow path to the other, and when the syringe is pulled, the liquid flows from the other side of the flow path to the other side. Can do. In addition, when a pressure pump is used, the pressure pumps are arranged at both ends of the flow path, the pressure pump on one end side is driven to flow liquid from one side of the flow path to the other, and the pressure pump on the other end side is driven. Liquid can flow from one of the other channels to the other.
本発明に係る細胞破砕装置は、前記液体を前記流路に供給可能に、前記流路に連通した供給部と、前記流路に供給される前記液体を加圧するよう、前記供給部と前記流路との間に設けられた加圧手段とを、有することが好ましい。本発明に係る細胞破砕方法は、前記液体を前記流路に供給する前に、前記液体を加圧することが好ましい。この場合、加圧により細胞内に多量の空気を溶け込ませることができ、その状態でキャビテーション気泡を発生させることにより、細胞内でのキャビテーション気泡の発生確率を高めることができる。このため、液体中で発生したキャビテーション気泡の消滅の際に生じる機械的な衝撃により細胞を破砕する場合と比べて、細胞の破砕効率を高めることができる。また、液体を往復移動させる際に、より低い圧力および速度で、細胞を破砕することができる。 The cell disruption apparatus according to the present invention includes a supply unit that communicates with the flow path, and the supply unit and the flow so as to pressurize the liquid that is supplied to the flow path so that the liquid can be supplied to the flow path. It is preferable to have a pressurizing means provided between the passages. In the cell disruption method according to the present invention, it is preferable to pressurize the liquid before supplying the liquid to the flow path. In this case, a large amount of air can be dissolved in the cells by pressurization, and the generation probability of cavitation bubbles in the cells can be increased by generating cavitation bubbles in that state. For this reason, compared with the case where a cell is crushed by the mechanical impact which arises at the time of extinction of the cavitation bubble which generate | occur | produced in the liquid, the crushing efficiency of a cell can be improved. Further, when the liquid is reciprocated, the cells can be crushed at a lower pressure and speed.
本発明に係る細胞破砕装置で、前記加圧手段は、所定の長さを有し、前記流路の両端の内径より大きい内径を有するパイプから成り、前記流路に連通していてもよい。この場合、内径が大きいパイプからそれより内径が小さい流路に液体が流入する際に、液体の圧力および流速が高くなるため、液体を容易に加圧することができる。 In the cell disruption apparatus according to the present invention, the pressurizing means may be a pipe having a predetermined length, an inner diameter larger than the inner diameters at both ends of the flow path, and communicating with the flow path. In this case, when the liquid flows from the pipe having the larger inner diameter into the flow path having the smaller inner diameter, the pressure and flow velocity of the liquid are increased, so that the liquid can be easily pressurized.
本発明に係る細胞破砕装置は、それぞれ前記流路の両端に接続され、前記流路との接続位置での前記流路の断面形状と同じ断面形状で、前記流路とは反対側に伸びる１対の管状の残留気泡除去部を有し、前記駆動手段は、前記液体を前記流路および各残留気泡除去部の内部で往復移動させるよう構成されていてもよい。本発明に係る細胞破砕方法は、それぞれ前記流路の両端に接続され、前記流路との接続位置での前記流路の断面形状と同じ断面形状で、前記流路とは反対側に伸びる１対の管状の残留気泡除去部の内部、および前記流路の内部で、前記液体を往復移動させてもよい。この場合、往復移動させるたびに、残留気泡除去部で液体中に残留するキャビテーション気泡を除去することができるため、液体中ではなく、細胞内でキャビテーション気泡が発生するのを促進することができ、細胞の破砕効率を高めることができる。特に、液体を流路に供給する前に加圧する構成と組み合わせることにより、細胞の破砕効率を飛躍的に高めることができる。 The cell disruption device according to the present invention is connected to both ends of the flow channel, has the same cross-sectional shape as the cross-sectional shape of the flow channel at the connection position with the flow channel, and extends to the opposite side of the flow channel 1 A pair of tubular residual bubble removing sections may be provided, and the driving means may be configured to reciprocate the liquid within the flow path and each residual bubble removing section. The cell disruption method according to the present invention is connected to both ends of the flow channel, has the same cross-sectional shape as the cross-sectional shape of the flow channel at the connection position with the flow channel, and extends to the opposite side of the flow channel 1 The liquid may be reciprocated inside the pair of tubular residual bubble removing portions and inside the flow path. In this case, since the cavitation bubbles remaining in the liquid can be removed by the residual bubble removal unit each time the reciprocating movement is performed, it is possible to promote the generation of cavitation bubbles in the cells, not in the liquid, Cell disruption efficiency can be increased. In particular, by combining with a configuration in which the liquid is pressurized before being supplied to the flow path, the cell crushing efficiency can be dramatically increased.
本発明に係る細胞破砕装置および細胞破砕方法で、前記流路は、中央の最も内径が小さい小径部に対して、一端側と他端側とが対称形状を成していることが好ましい。この場合、液体を流路中で往復移動させるとき、往路と復路とで同じ条件でキャビテーション気泡を発生させることができる。このため、効率良く細胞を破砕することができる。 In the cell crushing apparatus and the cell crushing method according to the present invention, it is preferable that one end side and the other end side of the channel have a symmetrical shape with respect to the small diameter portion having the smallest inner diameter at the center. In this case, when the liquid is reciprocated in the flow path, cavitation bubbles can be generated under the same conditions in the forward path and the return path. For this reason, a cell can be crushed efficiently.
本発明によれば、キャビテーションを利用して、温度上昇を抑えつつ、比較的少量の液体中の細胞を高効率で破砕することができる細胞破砕装置および細胞破砕方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cell crushing apparatus and the cell crushing method which can crush the cell in a comparatively small amount of liquid with high efficiency can be provided, suppressing a temperature rise using cavitation.
以下、図面に基づいて、本発明の実施の形態について説明する。
図１乃至図１０は、本発明の実施の形態の細胞破砕装置および細胞破砕方法を示している。
図１に示すように、細胞破砕装置１０は、破砕処理管１１と供給部１２と駆動手段１３と回収タンク１４とを有している。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
1 to 10 show a cell crushing apparatus and a cell crushing method according to an embodiment of the present invention.
As shown in FIG. 1, the cell disruption apparatus 10 includes a disruption tube 11, a supply unit 12, a driving unit 13, and a collection tank 14.
破砕処理管１１は、ベンチュリ管から成っており、円形の断面形状を有している。破砕処理管１１は、両端から中央に向かって徐々に内径が小さくなるよう形成された流路２１と、流路２１の両端に接続された１対の残留気泡除去部２２とを有している。流路２１は、中央の最も内径が小さい小径部２１ａに対して、一端側と他端側とが対称形状を成している。各残留気泡除去部２２は、流路２１の両端の内径と同じ内径を有する円筒形状を成し、流路２１と一体的に形成されている。残留気泡除去部２２は、流路２１と滑らかに連通している。 The crushing processing tube 11 is composed of a venturi tube and has a circular cross-sectional shape. The crushing processing tube 11 has a flow path 21 formed so that the inner diameter gradually decreases from both ends toward the center, and a pair of residual bubble removal units 22 connected to both ends of the flow path 21. . The flow path 21 has a symmetrical shape on one end side and the other end side with respect to the small diameter portion 21a having the smallest inner diameter at the center. Each residual bubble removing unit 22 has a cylindrical shape having the same inner diameter as the inner diameter of both ends of the channel 21 and is formed integrally with the channel 21. The residual bubble removing unit 22 communicates smoothly with the flow path 21.
供給部１２は、貯留タンクから成り、破砕したい細胞を含む液体から成る原料液体が収納されている。供給部１２は、破砕処理管１１の一方の端部側に接続され、収納する原料液体を破砕処理管１１の内部に供給可能に設けられている。 The supply part 12 consists of a storage tank, and the raw material liquid which consists of the liquid containing the cell which wants to crush is accommodated. The supply unit 12 is connected to one end side of the crushing processing tube 11 and is provided so as to be able to supply the raw material liquid to be stored into the crushing processing tube 11.
駆動手段１３は、シリンジを有し、供給部１２と破砕処理管１１との間に配置されている。駆動手段１３は、供給部１２から破砕処理管１１に供給される原料液体を、破砕処理管１１の内部で往復移動させるよう構成されている。すなわち、駆動手段１３は、シリンジを押したとき、破砕処理管１１の一方から他方に原料液体を流し、シリンジを引いたとき、破砕処理管１１の他方から一方に原料液体を流すようになっている。これにより、細胞破砕装置１０は、流路２１を一方に向かって流れる原料液体中、および、流路２１を他方に向かって流れる原料液体中にキャビテーション気泡が発生するようになっている。 The drive unit 13 includes a syringe and is disposed between the supply unit 12 and the crushing processing tube 11. The drive unit 13 is configured to reciprocate the raw material liquid supplied from the supply unit 12 to the crushing tube 11 inside the crushing tube 11. That is, when the syringe is pushed, the driving means 13 causes the raw material liquid to flow from one side of the crushing tube 11 to the other, and when the syringe is pulled, the raw material liquid flows from the other side of the crushing tube 11 to the other side. Yes. Thereby, the cell crushing apparatus 10 generates cavitation bubbles in the raw material liquid flowing in one direction through the flow path 21 and in the raw material liquid flowing in the other direction in the flow path 21.
回収タンク１４は、破砕処理管１１の内部を往復移動して処理された後の原料液体を回収可能に、破砕処理管１１の他方の端部側に接続されている。 The recovery tank 14 is connected to the other end side of the crushing processing tube 11 so that the raw material liquid after being processed by reciprocating inside the crushing processing tube 11 can be recovered.
本発明の実施の形態の細胞破砕方法は、細胞破砕装置１０により好適に実施される。すなわち、まず、破砕したい細胞を含む液体から成る原料液体を供給部１２に収納し、その原料液体を破砕処理管１１の内部に供給する。次に、駆動手段１３により、破砕処理管１１の内部の原料液体を、破砕処理管１１の流路２１および残留気泡除去部２２の内部で往復移動させる。このとき、破砕処理管１１の流路２１を一方に向かって流れる原料液体中、および、流路２１を他方に向かって流れる原料液体中に、それぞれ流路２１の小径部２１ａの下流側でキャビテーション気泡が発生するよう、所定の圧力および流速で原料液体を往復移動させる。これにより、原料液体中で発生したキャビテーション気泡を利用して、原料液体中の細胞を破砕することができる。 The cell disruption method of the embodiment of the present invention is preferably performed by the cell disruption apparatus 10. That is, first, a raw material liquid composed of a liquid containing cells to be crushed is stored in the supply unit 12, and the raw material liquid is supplied into the crushing tube 11. Next, the raw material liquid inside the crushing tube 11 is reciprocated inside the flow path 21 and the residual bubble removing unit 22 of the crushing tube 11 by the driving unit 13. At this time, cavitation is performed on the downstream side of the small diameter portion 21a of the flow path 21 in the raw material liquid flowing in one direction through the flow path 21 of the crushing treatment tube 11 and in the raw material liquid flowing in the flow path 21 in the other direction. The raw material liquid is reciprocated at a predetermined pressure and flow rate so that bubbles are generated. Thereby, the cells in the raw material liquid can be crushed using the cavitation bubbles generated in the raw material liquid.
原料液体を、破砕処理管１１の内部で所望の回数（１回〜複数回）、往復移動させたならば、回収タンク１４まで移動させて回収する。これにより、内部の細胞が高効率で破砕された液体を得ることができる。 If the raw material liquid is reciprocated a desired number of times (one to several times) inside the crushing tube 11, the raw material liquid is moved to the collection tank 14 and collected. Thereby, the liquid in which the internal cell was crushed with high efficiency can be obtained.
本発明の実施の形態の細胞破砕装置１０および細胞破砕方法は、原料液体を往復移動させるたびに、細胞を破砕することができるため、プランジャポンプやホースポンプを使用するときのように液体の量を増やさなくとも、往復移動の回数を増やすことにより、細胞の破砕率を高めることができる。また、残留気泡が原料液体中に存在する場合、その残留気泡がキャビテーション核となって、原料液体中でキャビテーション気泡が発生しやすくなるため、相対的に細胞内でキャビテーション気泡が発生しにくくなる。しかし、本発明の実施の形態の細胞破砕装置１０および細胞破砕方法は、往復移動させるたびに、残留気泡除去部２２で原料液体中に残留するキャビテーション気泡を除去することができるため、細胞内でキャビテーション気泡が発生するのを促進することができ、細胞の破砕効率を高めることができる。このように、本発明の実施の形態の細胞破砕装置１０および細胞破砕方法は、比較的少量の液体中の細胞を高効率で破砕することができる。 Since the cell crushing apparatus 10 and the cell crushing method according to the embodiment of the present invention can crush the cells each time the raw material liquid is reciprocated, the amount of liquid is the same as when using a plunger pump or a hose pump. Without increasing the number of cells, the rate of cell disruption can be increased by increasing the number of reciprocating movements. Further, when residual bubbles are present in the raw material liquid, the residual bubbles become cavitation nuclei, and cavitation bubbles are likely to be generated in the raw material liquid, so that cavitation bubbles are relatively less likely to be generated in the cells. However, since the cell disruption apparatus 10 and the cell disruption method of the embodiment of the present invention can remove the cavitation bubbles remaining in the raw material liquid by the residual bubble removal unit 22 every time the cell is reciprocated, Generation of cavitation bubbles can be promoted, and cell crushing efficiency can be increased. Thus, the cell crushing apparatus 10 and the cell crushing method of the embodiment of the present invention can crush cells in a relatively small amount of liquid with high efficiency.
本発明の実施の形態の細胞破砕装置１０および細胞破砕方法は、液体を往復移動してキャビテーション気泡を発生させるため、機械的な熱の発生源となる超音波振動子等が不要である。このため、液体の温度上昇を抑えることができ、熱により液体中の細胞等が変質するのを防ぐことができる。また、破砕処理管１１や駆動手段１３のシリンジ、供給部１２、回収タンク１４は、比較的簡単な構造のものを使用することができ、使用のたびに行う洗浄が容易である。駆動手段１３のシリンジとして安価なものを使用することができ、シリンジを使い捨てにすることもできる。 The cell crushing apparatus 10 and the cell crushing method according to the embodiment of the present invention generate cavitation bubbles by reciprocating the liquid, so that an ultrasonic vibrator or the like serving as a mechanical heat generation source is unnecessary. For this reason, the temperature rise of a liquid can be suppressed and it can prevent that the cell in a liquid denatures with a heat | fever. In addition, the crushing tube 11, the syringe of the driving means 13, the supply unit 12, and the recovery tank 14 can have a relatively simple structure, and can be easily cleaned each time they are used. An inexpensive thing can be used as the syringe of the drive means 13, and a syringe can also be made disposable.
本発明の実施の形態の細胞破砕装置１０および細胞破砕方法は、比較的少量の液体中の細胞を破砕できるため、例えば、細胞内のたんぱく質を抽出するために好適に使用することができる。また、液体中の大腸菌などの細胞を破砕して殺菌するのにも使用することができる。 Since the cell crushing apparatus 10 and the cell crushing method according to the embodiment of the present invention can crush cells in a relatively small amount of liquid, it can be suitably used, for example, to extract intracellular proteins. It can also be used to disrupt and sterilize cells such as E. coli in a liquid.
なお、駆動手段１３は、破砕処理管１１の両端に配置された１対の圧送ポンプから成っていてもよい。この場合、破砕処理管１１の一端側の圧送ポンプを駆動して流路２１の一方から他方に原料液体を流し、他端側の圧送ポンプを駆動して流路２１の他方から一方に原料液体を流すことができる。 In addition, the drive means 13 may consist of a pair of pumping pumps arranged at both ends of the crushing treatment tube 11. In this case, the pressure feed pump on one end side of the crushing tube 11 is driven to feed the raw material liquid from one side of the flow path 21 to the other side, and the pressure feed pump on the other end side is driven to drive the raw material liquid from the other side of the flow path 21 to one side. Can flow.
また、図２（ａ）に示すように、細胞破砕装置１０は、破砕処理管１１に供給される原料液体を加圧するよう、供給部１２と破砕処理管１１との間に設けられた加圧手段を有していてもよい。図２（ａ）に示す構成では、加圧手段は加圧タンク３１から成り、供給部１２と駆動手段１３との間に配置されている。また、供給部１２と加圧タンク３１とを接続する管、および、加圧タンク３１と駆動手段１３とを接続する管に、それぞれバルブ３２が設けられ、加圧タンク３１に原料液体を収納したとき、バルブ３２を閉めて加圧タンク３１の内部で原料液体を加圧し、加圧後、バルブ３２を開けて原料液体を破砕処理管１１に供給するようになっている。 Further, as shown in FIG. 2A, the cell crushing apparatus 10 is a pressurization provided between the supply unit 12 and the crushing processing tube 11 so as to pressurize the raw material liquid supplied to the crushing processing tube 11. You may have a means. In the configuration shown in FIG. 2A, the pressurizing unit includes a pressurizing tank 31 and is arranged between the supply unit 12 and the driving unit 13. Further, a valve 32 is provided in each of the pipe connecting the supply unit 12 and the pressurized tank 31 and the pipe connecting the pressurized tank 31 and the driving means 13, and the raw material liquid is stored in the pressurized tank 31. At this time, the valve 32 is closed to pressurize the raw material liquid inside the pressurized tank 31, and after pressurization, the valve 32 is opened to supply the raw material liquid to the crushing processing tube 11.
この場合、加圧により原料液体中の細胞内に多量の空気を溶け込ませることができ、その状態でキャビテーション気泡を発生させることにより、細胞内でのキャビテーション気泡の発生確率を高めることができ、細胞の破砕効率を飛躍的に高めることができる。また、原料液体を往復移動させる際に、より低い圧力および速度で、細胞を破砕することができる。 In this case, a large amount of air can be dissolved in the cells in the raw material liquid by pressurization, and by generating cavitation bubbles in that state, the probability of occurrence of cavitation bubbles in the cells can be increased. The crushing efficiency can be dramatically increased. Further, when the raw material liquid is reciprocated, the cells can be crushed at a lower pressure and speed.
図２（ｂ）に示すように、加圧手段は、所定の長さを有し、破砕処理管１１の両端の内径より大きい内径を有するパイプ３３から成り、破砕処理管１１に連通していてもよい。この場合、内径が大きいパイプ３３からそれより内径が小さい破砕処理管１１に原料液体が流入する際に、原料液体の圧力および流速が高くなるため、原料液体を容易に加圧することができる。加圧の効果を高めるために、パイプ３３の内径は、流路２１の小径部２１ａの内径の１０倍以上であることが好ましい。 As shown in FIG. 2 (b), the pressurizing means includes a pipe 33 having a predetermined length and having an inner diameter larger than the inner diameters at both ends of the crushing treatment tube 11, and communicates with the crushing treatment tube 11. Also good. In this case, when the raw material liquid flows from the pipe 33 having a larger inner diameter into the crushing treatment tube 11 having a smaller inner diameter, the pressure and flow velocity of the raw material liquid are increased, so that the raw material liquid can be easily pressurized. In order to enhance the effect of pressurization, the inner diameter of the pipe 33 is preferably 10 times or more the inner diameter of the small diameter portion 21 a of the flow path 21.
図１に示す細胞破砕装置１０を用いて、液体中の細胞を破砕する実験を行った。実験では、細胞の数の測定に、ベックマンコールター社製の「Cell Viability Analyzer」を使用した。細胞には293細胞を用い、ベックマンコールター社製「Cell Viability Analyzer」の測定範囲の5×104 〜 1×107 cells/mLとなるように、培養した293細胞を培養液で希釈して原料液体とした。また、破砕処理管１１として、流路２１の小径部２１ａの内径が0.8 mm、各残留気泡除去部２２の内径が4 mmのものを使用し、駆動手段１３のシリンジとして、2.5 mlシリンジを使用した。原料液体を往復移動させる際には、原料液体を2.5 mlずつ吸い上げ、シリンジ出口部での圧力が0.2 MPa、流速が20 m／秒となるよう、手動でシリンジを往復させた。 An experiment for crushing cells in a liquid was performed using the cell crushing apparatus 10 shown in FIG. In the experiment, “Cell Viability Analyzer” manufactured by Beckman Coulter was used to measure the number of cells. 293 cells were used as the cells, and the cultured 293 cells were diluted with the culture solution so that the measurement range was 5 × 10 4 to 1 × 10 7 cells / mL using the Beckman Coulter Cell Viability Analyzer. It was liquid. Further, as the crushing tube 11, a small diameter portion 21 a of the flow path 21 having an inner diameter of 0.8 mm and each remaining bubble removing portion 22 having an inner diameter of 4 mm is used, and a 2.5 ml syringe is used as the syringe of the driving means 13. did. When reciprocating the raw material liquid, the syringe was reciprocated manually so that the raw material liquid was sucked up 2.5 ml at a time and the pressure at the syringe outlet was 0.2 MPa and the flow rate was 20 m / sec.
実験では、当初の原料液体中の細胞の数、および、原料液体を破砕処理管１１の内部で１往復、２往復、４往復、８往復させたときの細胞の数を測定した。測定結果を、表１および図３に示す。なお、表１中の「細胞の総数」は、画像処理で細胞と認識された細胞の個数、「生存する細胞の数」は、「細胞の総数」からトレパンブルーで染色された細胞の数（死滅した細胞の数）を差し引いた数、「平均直径」は、画像処理で認識された細胞の直径を表している。また、各測定時の液体中の細胞の様子を示す顕微鏡写真を図４に、破砕処理管１１の小径部２１ａ付近でキャビテーション気泡が発生する様子を図５に示す。 In the experiment, the number of cells in the original raw material liquid and the number of cells when the raw material liquid was reciprocated once, twice, four times, and eight times inside the crushing tube 11 were measured. The measurement results are shown in Table 1 and FIG. In Table 1, “total number of cells” is the number of cells recognized as cells by image processing, and “number of surviving cells” is the number of cells stained with trepan blue from “total number of cells” ( The number obtained by subtracting the number of dead cells), “average diameter”, represents the diameter of the cells recognized by the image processing. Further, FIG. 4 shows a photomicrograph showing the state of cells in the liquid during each measurement, and FIG. 5 shows a state in which cavitation bubbles are generated near the small diameter portion 21a of the crushing tube 11.
図３中の近似曲線は、１往復で全体のａ％の細胞が処理されると仮定し、ｎ往復目にはｎ−１往復で残っていた細胞がａ％の確率で処理される、と仮定して求めたものである。図３に示す実験では、ａ＝４６．２（％）であり、破砕確率が非常に高いことが確認された。表１および図３に示すように、往復移動の回数を増やすことにより、より多くの細胞を破砕することができ、破砕率を高めることができることが確認された。また、図４からも、往復移動の回数を増やすことにより、細胞（図４中の黒い点状のもの）が減少していくのを確認することができる。なお、図５に示すように、小径部２１ａより下流側でキャビテーション気泡が発生しているのが確認できる。 The approximate curve in FIG. 3 assumes that a total of a% cells are processed in one round trip, and the cells remaining in n-1 round trips are processed with a probability of a% in the nth round trip. It is obtained on the assumption. In the experiment shown in FIG. 3, a = 46.2 (%), and it was confirmed that the crushing probability was very high. As shown in Table 1 and FIG. 3, it was confirmed that by increasing the number of reciprocations, more cells can be crushed and the crushing rate can be increased. Also from FIG. 4, it can be confirmed that the number of cells (black dots in FIG. 4) decreases by increasing the number of reciprocating movements. In addition, as shown in FIG. 5, it can confirm that the cavitation bubble has generate | occur | produced downstream from the small diameter part 21a.
図２（ａ）に示す細胞破砕装置１０を用いて、液体中の細胞を破砕する実験を行った。細胞は、単細胞の乾燥出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用い、25℃の蒸留水40 mlに、乾燥酵母0.5 gを投入して原料液体とした。また、破砕処理管１１として、流路２１の小径部２１ａの内径が約0.96 mmのものを使用し、駆動手段１３のシリンジとして、20 mlシリンジを使用した。 An experiment for crushing cells in a liquid was performed using the cell crushing apparatus 10 shown in FIG. As cells, single-cell dry budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) was used, and 0.5 g of dry yeast was added to 40 ml of distilled water at 25 ° C. to obtain a raw material liquid. In addition, a crushing tube 11 having a small diameter portion 21a of the flow path 21 having an inner diameter of about 0.96 mm was used, and a 20 ml syringe was used as the syringe of the driving means 13.
実験では、細胞破砕の機構解明を行うために、原料液体に対して、未処理のもの（Contorol）、減圧のみを行うもの（Vacuum）、加圧のみを行うもの(Pressure)、加圧後に減圧を行うもの（Pre.→Vac.）、キャビテーション処理のみを行うもの（Cavitation）、加圧後にキャビテーション処理を行うもの（Pre.→Cavi.）の６種類の処理を行った。 In order to elucidate the mechanism of cell disruption, the raw material liquid is untreated (Contorol), only decompressed (Vacuum), only pressurized (Pressure), and decompressed after pressurization. 6 types of processing were performed: one that performs cavitation processing (Pre. → Vac.), One that performs only cavitation processing (Cavitation), and one that performs cavitation processing after pressurization (Pre. → Cavi.).
図６（ａ）に示すように、加圧処理は、容器（Container）に入れた原料液体を、圧力計（Pressure gage）で圧力を確認しながら、ポンプ（Pump）で加圧することにより行った。また、図６（ｂ）に示すように、減圧処理は、容器（Container）に入れた原料液体を、圧力計（Pressure gage）で圧力を確認しながら、吸入器（Aspirator）で減圧することにより行った。キャビテーション処理は、原料液体を20 mlずつ吸い上げて、シリンジ出口部での圧力が0.2 MPa、流速が20 m／秒となるよう、キャビテーションを発生させる操作（破砕処理管１１の内部を往復させる操作）を繰り返した。キャビテーション処理は、室温が23℃の室内で行った。 As shown to Fig.6 (a), the pressurization process was performed by pressurizing the raw material liquid put into the container (Container) with a pump (Pump), confirming a pressure with a pressure gauge (Pressure gage). . In addition, as shown in FIG. 6 (b), the decompression process is performed by decompressing the raw material liquid in the container (Container) with an inspirator (Aspirator) while confirming the pressure with a pressure gauge (Pressure gage). went. Cavitation treatment is an operation to suck up the raw material liquid 20 ml at a time, and generate cavitation so that the pressure at the syringe outlet is 0.2 MPa and the flow rate is 20 m / second (operation to reciprocate inside the crushing treatment tube 11) Was repeated. The cavitation treatment was performed in a room having a room temperature of 23 ° C.
実験は、それぞれ以下の条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃの元で、それぞれ６種類の処理を行った。条件Ａでは、加圧は0.3 MPaで１時間行い、キャビテーション処理は100回繰り返した（100往復）。条件Ｂでは、加圧は0.3 MPaで30分間行い、キャビテーション処理は100回繰り返した（100往復）。条件Ｃでは、加圧は0.3 MPaで30分間行い、キャビテーション処理は50回繰り返した（50往復）。また、減圧は、全ての条件で、-0.098 MPaで10分間行った。 In the experiment, six types of treatments were performed under the following conditions A, B, and C, respectively. Under condition A, pressurization was performed at 0.3 MPa for 1 hour, and the cavitation treatment was repeated 100 times (100 reciprocations). Under condition B, pressurization was performed at 0.3 MPa for 30 minutes, and the cavitation treatment was repeated 100 times (100 reciprocations). Under condition C, pressurization was performed at 0.3 MPa for 30 minutes, and the cavitation treatment was repeated 50 times (50 reciprocations). Depressurization was performed at −0.098 MPa for 10 minutes under all conditions.
破砕された細胞（細胞死滅）を評価するために、出芽酵母によるアルコール発酵を利用した。アルコール発酵の化学反応式は、以下のように表される。
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2↑ （１）
（１）式に示すように、ショ糖を加水分解することにより生じるグルコースC6H12O6 を出芽酵母が分解することにより、エタノールと二酸化炭素が発生する。この二酸化炭素は泡として発生するため、その泡の高さを比較することにより、出芽酵母の死滅具合を評価することができる。すなわち、泡の高さが低いほど、多くの細胞が破砕されて死滅していると評価できる。
In order to evaluate the disrupted cells (cell killing), alcoholic fermentation using budding yeast was used. The chemical reaction formula of alcohol fermentation is expressed as follows.
C 6 H 12 O 6 → 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 ↑ (1)
As shown in the formula (1), budding yeast decomposes glucose C 6 H 12 O 6 produced by hydrolyzing sucrose to generate ethanol and carbon dioxide. Since this carbon dioxide is generated as bubbles, the degree of death of the budding yeast can be evaluated by comparing the heights of the bubbles. That is, it can be evaluated that as the height of the bubble is lower, more cells are crushed and killed.
評価の際には、まず、出芽酵母を凝縮するために、処理後の液体を遠心分離機にかけ、上澄み液を30 ml取り除き、そこに100 g/lの砂糖水10 mlを加え、よく撹拌した。これらを40℃に保った恒温槽に浸け、取り出して撮影した。40℃に保つのは、アルコール発酵を促すのに適した温度だからである。撮影した写真から、画像解析ソフトにより泡の高さを計測した。泡の高さの基準面は、砂糖水を加えた後の液面である20 mlの目盛りとした。また、泡の積み上がり方に差があるため、泡の頂点から、泡の最も高い水平面までの間の中央値を測定値とし、その幅を誤差として表した。 In the evaluation, first, in order to condense the budding yeast, the treated liquid was centrifuged, 30 ml of the supernatant was removed, and 10 ml of 100 g / l sugar water was added thereto and stirred well. . These were immersed in a thermostat kept at 40 ° C., taken out and photographed. The reason why the temperature is kept at 40 ° C. is that the temperature is suitable for promoting alcoholic fermentation. From the photograph taken, the height of the foam was measured by image analysis software. The reference surface for the height of the foam was a scale of 20 ml, which is the liquid level after adding sugar water. Moreover, since there is a difference in how the bubbles are piled up, the median value from the top of the bubbles to the highest horizontal surface of the bubbles was taken as the measured value, and the width was expressed as an error.
図７に、実際にアルコール発酵により二酸化炭素が発生している一例を示す。恒温槽に浸けて５分程度で泡が発生し始め、40分経過後に、図７に示すような高さにまで到達する。泡の上に膜が形成され、山のように積み上がっているものもある。 FIG. 7 shows an example in which carbon dioxide is actually generated by alcohol fermentation. Bubbles start to be generated in about 5 minutes after soaking in a thermostatic bath, and reach a height as shown in FIG. 7 after 40 minutes. Some films are piled up on top of the foam, forming a film.
条件Ａによる実験結果を、図８に示す。図８に示すように、６種類とも全て、泡の高さhは恒温槽に浸けた時間tとともに上昇しているが、キャビテーション処理を行った「Cavitation」と「Pre.→Cavi.」の２種類は、明らかに泡の高さhが他のものと比べて低く、多くの出芽酵母が死滅していることがわかる。また、「Pre.→Cavi.」は、「Cavitation」よりも泡の高さhが低くなっており、より多くの出芽酵母が死滅していることがわかる。また、残りの４種類の中でも、加圧を行ったもの(「Pressure」と「Pre.→Vac.」）は、他のもの（「Contorol」と「Vacuum」）よりも泡の高さhが低くなっていることがわかる。 The experimental results under condition A are shown in FIG. As shown in FIG. 8, in all six types, the height h of the bubbles increases with the time t immersed in the thermostatic bath. However, the two cavities “Cavitation” and “Pre. → Cavi.” As for the kind, the height h of the foam is clearly lower than the others, and it can be seen that many budding yeasts have been killed. In addition, “Pre. → Cavi.” Has a lower bubble height h than “Cavitation”, indicating that more budding yeast have been killed. Also, among the remaining four types, those with pressure ("Pressure" and "Pre. → Vac.") Have a bubble height h higher than the others ("Contorol" and "Vacuum"). You can see that it is lower.
条件Ｂによる実験結果を、図９に示す。図９に示すように、６種類とも全て、泡の高さhは恒温槽に浸けた時間tとともに上昇しているが、条件Ａと同様に、キャビテーション処理を行った「Cavitation」と「Pre.→Cavi.」の２種類は、明らかに泡の高さhが他のものと比べて低く、多くの出芽酵母が死滅していることがわかる。また、「Pre.→Cavi.」は、「Cavitation」よりも泡の高さhが低くなっており、より多くの出芽酵母が死滅していることがわかる。条件Ｂでは、加圧時間を条件Ａの半分の30分にして実験を行ったが、条件Ａの場合と同様の結果が得られている。このことから、細胞死滅の因子が加圧によるものではないと考えられる。 The experimental results under condition B are shown in FIG. As shown in FIG. 9, in all six types, the height h of the bubbles increases with the time t immersed in the thermostat. However, as in the case of condition A, “Cavitation” and “Pre. → Cavi. ”Clearly shows that the foam height h is lower than other types, and many budding yeasts have been killed. In addition, “Pre. → Cavi.” Has a lower bubble height h than “Cavitation”, indicating that more budding yeast have been killed. Under the condition B, the experiment was performed with the pressurization time being 30 minutes, half of the condition A, and the same result as in the case of the condition A was obtained. From this, it is considered that the factor of cell death is not due to pressurization.
条件Ｃによる実験結果を、図１０に示す。図１０に示すように、６種類とも全て、泡の高さhは恒温槽に浸けた時間tとともに上昇しているが、条件Ａおよび条件Ｂと同様に、キャビテーション処理を行った「Cavitation」と「Pre.→Cavi.」の２種類は、明らかに泡の高さhが他のものと比べて低く、多くの出芽酵母が死滅していることがわかる。また、「Pre.→Cavi.」と「Cavitation」は、泡の高さhにほとんど差は認められない。また、他の４種類の泡の高さhについても、ほとんど差は認められない。 The experimental results under condition C are shown in FIG. As shown in FIG. 10, in all six types, the height h of the bubbles increases with the time t immersed in the thermostat. However, as in the case of the conditions A and B, “Cavitation” was obtained by performing the cavitation treatment. In the two types of “Pre. → Cavi.”, The height h of the bubbles is clearly lower than the others, and it can be seen that many budding yeasts have been killed. In addition, “Pre. → Cavi.” And “Cavitation” show almost no difference in bubble height h. Also, there is almost no difference in the height h of the other four types of bubbles.
図８〜図１０に示すように、すべての実験において、「Pre.→Cavi.」と「Cavitation」の泡の高さhが、他の４種類よりも明らかに低い結果が得られた。これは、キャビテーション処理を行うことによって出芽酵母が死滅し、グルコースを分解する能力が弱まって他の４種類よりも泡の高さhが低くなったものと考えられる。また、「Pre.→Cavi.」は、「Cavitation」よりも泡の高さhが低くなる傾向が得られた。これは、キャビテーション処理を行う前に加圧することによって、細胞内に多量の空気が溶け込んだ状態でキャビテーション処理を行うため、細胞内でキャビテーションが発生して細胞が膨張し易くなり、死滅効率が上がったためであると考えられる。以上の実験結果から、キャビテーションの処理回数や加圧時間、破砕処理管１１の形状などを変えることにより、細胞の破砕効率を上げることができると考えられる。 As shown in FIGS. 8 to 10, in all the experiments, the result was that the foam heights “Pre. → Cavi.” And “Cavitation” were clearly lower than the other four types. This is considered to be because the budding yeast was killed by performing the cavitation treatment, the ability to decompose glucose was weakened, and the height h of bubbles was lower than the other four types. In addition, “Pre. → Cavi.” Tended to have a lower bubble height h than “Cavitation”. This is because the cavitation treatment is performed in a state where a large amount of air is dissolved in the cells by applying pressure before the cavitation treatment, so that the cavitation occurs in the cells and the cells are easily expanded, and the killing efficiency is increased. This is probably because From the above experimental results, it is considered that the cell crushing efficiency can be increased by changing the number of cavitation processes, pressurization time, the shape of the crushing tube 11, and the like.
１０ 細胞破砕装置
１１ 破砕処理管
２１ 流路
２１ａ 小径部
２２ 残留気泡除去部
１２ 供給部
１３ 駆動手段
１４ 回収タンク
３１ 加圧タンク
３２ バルブ
３３ パイプ
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 Cell crushing apparatus 11 Crushing processing tube 21 Flow path 21a Small diameter part 22 Residual bubble removal part 12 Supply part 13 Driving means 14 Recovery tank
31 Pressurized tank 32 Valve 33 Pipe
Claims (9)
前記流路を一方に向かって流れる前記液体中、および、前記流路を他方に向かって流れる前記液体中にキャビテーション気泡が発生するよう、前記液体を前記流路中で往復移動させる駆動手段とを、
有することを特徴とする細胞破砕装置。 A flow path for flowing a liquid containing cells, formed so that the inner diameter gradually decreases from both ends toward the center;
Driving means for reciprocating the liquid in the flow path so that cavitation bubbles are generated in the liquid flowing in the flow path toward one side and in the liquid flowing in the flow path toward the other side; ,
A cell disruption device comprising:
前記流路に供給される前記液体を加圧するよう、前記供給部と前記流路との間に設けられた加圧手段とを、
有することを特徴とする請求項１記載の細胞破砕装置。 A supply unit communicating with the flow path so that the liquid can be supplied to the flow path;
A pressurizing means provided between the supply unit and the flow path so as to pressurize the liquid supplied to the flow path;
The cell disruption device according to claim 1, wherein
前記駆動手段は、前記液体を前記流路および各残留気泡除去部の内部で往復移動させるよう構成されていることを
特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞破砕装置。 A pair of tubular residual bubble removing portions that are respectively connected to both ends of the flow channel, have the same cross-sectional shape as the cross-sectional shape of the flow channel at the connection position with the flow channel, and extend to the opposite side of the flow channel Have
The cell disruption apparatus according to any one of claims 1 to 3, wherein the driving unit is configured to reciprocate the liquid within the flow path and each residual bubble removing unit.
前記流路を一方に向かって流れる前記液体中、および、前記流路を他方に向かって流れる前記液体中にキャビテーション気泡が発生するよう、前記液体を前記流路中で往復移動させることを
特徴とする細胞破砕方法。 Supply the liquid containing the cells to the channel formed so that the inner diameter gradually decreases from both ends toward the center,
The liquid is reciprocated in the flow path so that cavitation bubbles are generated in the liquid flowing in the flow path toward the one side and in the liquid flowing in the flow path toward the other side. Cell disruption method.
9. The flow path according to claim 6, wherein one end side and the other end side are symmetrical with respect to the small-diameter portion having the smallest inner diameter at the center. Cell disruption method.
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