JP2016059906A - Separation method and apparatus of particle, and capturing method of protoplast - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、誘電泳動によって細胞や細菌等の特定の粒子を他の粒子から分離する方法及び装置、並びにプロトプラストの捕捉方法に関する。 The present invention relates to a method and apparatus for separating specific particles such as cells and bacteria from other particles by dielectrophoresis, and a protoplast capturing method.
従来、溶液中に存在する細胞や細菌等の粒子を操作し、選択的に特定の粒子を分離・抽出する技術として誘電泳動を用いたものが知られている。誘電泳動とは、不均一交流電界中において電界により分極した粒子が、電界の勾配によって強電界側又は弱電界側に泳動する現象である。誘電泳動は、粒子自体が有している電荷に依存せず、印加する電圧や周波数の大きさ等に依存して泳動する。 Conventionally, a technique using dielectrophoresis is known as a technique for selectively separating and extracting specific particles by manipulating particles such as cells and bacteria present in a solution. Dielectrophoresis is a phenomenon in which particles polarized by an electric field in a non-uniform alternating electric field migrate to the strong electric field side or the weak electric field side due to the gradient of the electric field. Dielectrophoresis does not depend on the electric charge of the particle itself, but depends on the applied voltage, the magnitude of the frequency, or the like.
下記の特許文献１には、４極の電極間に電界を発生させることにより、４極の電極の中心位置に負の誘電泳動によって粒子を集め、又は正の誘電泳動によって各電極に粒子を引きつける技術が開示されている。また、特許文献１には、櫛形に形成された２極の電極を組合せ、両電極間に電界を発生させる技術も開示されている。 In Patent Document 1 below, by generating an electric field between four electrodes, particles are collected by negative dielectrophoresis at the center position of the four electrodes, or attracted to each electrode by positive dielectrophoresis. Technology is disclosed. Patent Document 1 also discloses a technique in which two electrodes formed in a comb shape are combined to generate an electric field between the two electrodes.
特許文献１には、負の誘電泳動によって４極の電極の中心位置に粒子を集めること、又は正の誘電泳動によって各電極に粒子を引きつけることが開示されているが、粒子を種類に応じて分離するための具体的手法については特に示されていない。
また、特許文献１記載の４極の電極や櫛形の電極はそれぞれ特殊な形状となっているため、より簡単な構造の電極を用いて粒子を分離することが望まれる。
Patent Document 1 discloses collecting particles at the center position of a four-pole electrode by negative dielectrophoresis, or attracting particles to each electrode by positive dielectrophoresis. No specific method for separation is shown.
Further, since the quadrupole electrode and the comb-shaped electrode described in Patent Document 1 have special shapes, it is desired to separate particles using an electrode having a simpler structure.
他方、生化学分野等においては、細胞壁を取り除いたプロトプラストを用いて細胞を融合させる処理が行われることがあるが、従来は、細胞壁を有する通常の細胞とプロトプラストとが十分に分離されずに混合された状態で処理が行われていた。そのため、融合の確実性が低下する可能性があった。したがって、このようなプロトプラストの処理のために、プロトプラストを他の細胞から分離することが望まれる。 On the other hand, in the biochemical field and the like, a process of fusing cells with protoplasts from which cell walls have been removed may be performed, but conventionally, normal cells having cell walls and protoplasts are mixed without being sufficiently separated. The process was being performed. As a result, the certainty of fusion may be reduced. Therefore, it is desirable to separate protoplasts from other cells for such protoplast processing.
本発明は、複数種類の粒子を分離することができる新たな方法及び装置を提供することを主目的とする。 The main object of the present invention is to provide a new method and apparatus capable of separating a plurality of types of particles.
本発明に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動により分離する方法であって、
所定の中心位置の周りに配設される少なくとも４極の電極に第１の周波数の交流電圧を印加することにより、前記複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる分離工程を含むものである。
The method for separating particles according to the present invention includes:
A method of separating a plurality of types of particles contained in a solution by dielectrophoresis,
By applying an alternating voltage of a first frequency to at least four electrodes arranged around a predetermined center position, at least one kind of particles among the plurality of kinds of particles is captured at the center position. And a separation step in which at least one other kind of particles is captured by the electrode.
本発明に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動によって分離する方法であって、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させるか又は前記電極と非接触の状態で捕捉させ、その他の粒子を、前記電極と非接触の状態で浮遊若しくは捕捉させるか、又は前記電極に捕捉させる分離工程を含むものである。
The method for separating particles according to the present invention includes:
A method for separating a plurality of types of particles contained in a solution by dielectrophoresis,
By applying an alternating voltage of a predetermined frequency to the electrode, the protoplast contained in the solution is captured by the electrode or in a non-contact state with the electrode, and other particles are not contacted with the electrode. It includes a separation step in which the electrode is floated or captured, or captured by the electrode.
本発明に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動により分離する方法であって、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させ、その他の粒子を前記電極と非接触の状態で浮遊又は捕捉させる分離工程を含むものである。
The method for separating particles according to the present invention includes:
A method of separating a plurality of types of particles contained in a solution by dielectrophoresis,
By applying an alternating voltage of a predetermined frequency to the electrode, it includes a separation step in which the protoplast contained in the solution is trapped by the electrode and other particles are floated or trapped in a non-contact state with the electrode.
本発明に係る粒子の分離装置は、
粒子を含む溶液を収容するための収容部と、
前記収容部内に配置され、所定の中心位置の周りに間隔をあけて配設される少なくとも４極の電極と、
前記電極に交流電圧を印加することによって隣接する電極間に電界を生じさせる電源部とを備え、
前記電源部は、誘電泳動により、複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる周波数の交流電圧を印加するものである。
The particle separation apparatus according to the present invention comprises:
A container for containing a solution containing particles;
At least four electrodes disposed within the housing and spaced about a predetermined center position;
A power supply unit that generates an electric field between adjacent electrodes by applying an alternating voltage to the electrodes;
The power supply unit applies an alternating voltage of a frequency that causes at least one type of particles among a plurality of types of particles to be captured at the center position and causes the electrode to capture at least one other type of particles by dielectrophoresis. Is.
本発明に係るプロトプラストの捕捉方法は、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することによって、誘電泳動により、溶液中に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させるか、又は前記電極と非接触の状態で捕捉させるものである。
The method for capturing protoplasts according to the present invention comprises:
By applying an alternating voltage of a predetermined frequency to the electrode, the protoplast contained in the solution is captured by the electrode by dielectrophoresis, or is captured in a non-contact state with the electrode.
本発明によれば、好適に複数種類の粒子を分離することができる。 According to the present invention, a plurality of types of particles can be preferably separated.
［本発明の実施形態の要旨］
最初に本発明の実施形態の要旨を列記して説明する。なお、以下に記載する実施形態の少なくとも一部を任意に組み合わせてもよい。
（１）本発明の実施形態に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動によって分離する方法であって、
所定の中心位置の周りに配設される少なくとも４極の電極に第１の周波数の交流電圧を印加することにより、前記複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる分離工程を含むものである。
[Summary of Embodiment of the Present Invention]
First, the gist of the embodiment of the present invention will be listed and described. In addition, you may combine arbitrarily at least one part of embodiment described below.
(1) A method for separating particles according to an embodiment of the present invention includes:
A method for separating a plurality of types of particles contained in a solution by dielectrophoresis,
By applying an alternating voltage of a first frequency to at least four electrodes arranged around a predetermined center position, at least one kind of particles among the plurality of kinds of particles is captured at the center position. And a separation step in which at least one other kind of particles is captured by the electrode.
このような方法により、誘電泳動を用いて複数種類の粒子を種類に応じて分離することができる。 By such a method, a plurality of types of particles can be separated according to the type using dielectrophoresis.
（２）上記の分離方法において、前記分離工程の前に、前記第１の周波数とは異なる第２の周波数の交流電圧を前記電極に印加することによって、複数種類の粒子を前記中心位置に捕捉させる工程を含んでいてもよい。
この構成によれば、複数種類の粒子を分離する前に一旦複数種類の粒子を前記中心位置に集め、その後、少なくとも１つの種類の粒子を電極に捕捉させることになる。したがって、電極間の中心位置の周辺で粒子を分離することが可能となり、分離後の粒子の取り扱いを容易にすることができる。
(2) In the separation method, a plurality of types of particles are captured at the central position by applying an alternating voltage having a second frequency different from the first frequency to the electrode before the separation step. The process of making it include may be included.
According to this configuration, a plurality of types of particles are once collected at the central position before the plurality of types of particles are separated, and then at least one type of particles is captured by the electrode. Therefore, particles can be separated around the center position between the electrodes, and handling of the particles after separation can be facilitated.
（３）上記の分離方法において、前記分離工程後に、前記中心位置に捕捉させた粒子を取り除く除去工程をさらに含んでいてもよい。
この構成によれば、電極に捕捉された粒子のみの処理を行いやすくすることができる。
(3) The above separation method may further include a removal step of removing the particles trapped at the central position after the separation step.
According to this configuration, it is possible to facilitate the processing of only the particles captured by the electrodes.
（４）前記除去工程は、流体の流れによって前記中心位置に捕捉させた粒子を取り除くものであってもよい。
粒子が電極に捕捉される場合と前記中心位置に捕捉される場合とでは、捕捉力に差があり、前者の方が後者よりも捕捉力が強くなる。したがって、後者の捕捉力よりも強い力で流体を流すことによって、電極に捕捉された粒子を残したまま、前記中心位置に捕捉された粒子を取り除くことが可能となる。
(4) The removing step may remove particles captured at the center position by a fluid flow.
There is a difference in the capturing force between the case where the particles are captured by the electrode and the case where the particles are captured at the central position, and the former has a stronger capturing force than the latter. Therefore, by flowing the fluid with a force stronger than the latter capturing force, it is possible to remove the particles captured at the central position while leaving the particles captured on the electrode.
（５）上記の分離方法において、前記除去工程後に、前記第１の周波数とは異なる第３の周波数の交流電圧を前記電極に印加することによって、前記電極に捕捉させていた粒子を、前記中心位置に捕捉させる工程をさらに含んでいてもよい。
このような構成によって、電極に捕捉させた粒子を、電極とは非接触の状態で集めることができる。そのため、当該粒子の一部を抽出したりする処理を容易に行うことができる。なお、第３の周波数と、前述の第２の周波数とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
(5) In the separation method, after the removing step, by applying an AC voltage having a third frequency different from the first frequency to the electrode, the particles captured by the electrode are collected in the center. It may further include a step of capturing the position.
With such a configuration, particles captured by the electrode can be collected in a non-contact state with the electrode. Therefore, it is possible to easily perform a process of extracting a part of the particles. Note that the third frequency and the second frequency described above may be the same or different.
（６）上記の分離方法において、前記複数種類の粒子が、プロトプラストと、その他の細胞とを含んでいてもよい。
このような構成によって、プロトプロストとその他の細胞とを好適に分離することができる。したがって、プロトプロストのみを用いて融合等の処理を確実に行うことができる。
(6) In the separation method, the plurality of types of particles may include protoplasts and other cells.
With such a configuration, protoprost and other cells can be suitably separated. Therefore, processing such as fusion can be reliably performed using only protoprost.
（７）上記の分離方法において、前記複数種類の粒子は、生細胞と死細胞とを含んでいてもよい。
このような構成によって、生細胞と死細胞とを好適に分離することができる。
(7) In the separation method, the plurality of types of particles may include living cells and dead cells.
With such a configuration, live cells and dead cells can be suitably separated.
（８）他の実施形態に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動によって分離する方法であって、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させるか又は前記電極と非接触の状態で捕捉させ、その他の粒子を、前記電極と非接触の状態で浮遊若しくは捕捉させるか又は前記電極に捕捉させる分離工程を含むものである。
このような構成によって、プロトプロストとその他の粒子とを好適に分離することができる。したがって、プロトプロストのみを用いて融合等の処理を確実に行うことができる。
(8) A method for separating particles according to another embodiment includes:
A method for separating a plurality of types of particles contained in a solution by dielectrophoresis,
By applying an alternating voltage of a predetermined frequency to the electrode, the protoplast contained in the solution is captured by the electrode or in a non-contact state with the electrode, and other particles are not contacted with the electrode. A separation step in which the electrode is floated or trapped or captured by the electrode.
With such a configuration, protoprost and other particles can be suitably separated. Therefore, processing such as fusion can be reliably performed using only protoprost.
（９）他の実施形態に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動によって分離する方法であって、
第１の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させ、その他の粒子を前記電極と非接触の状態で浮遊又は捕捉させる分離工程を含むものである。
このような構成によって、プロトプロストとその他の粒子とを好適に分離することができる。したがって、プロトプロストのみを用いて融合等の処理を確実に行うことができる。
(9) A method for separating particles according to another embodiment includes:
A method for separating a plurality of types of particles contained in a solution by dielectrophoresis,
By applying an alternating voltage of the first frequency to the electrode, a separation step is performed in which the protoplast contained in the solution is captured by the electrode, and other particles are floated or captured in a non-contact state with the electrode.
With such a configuration, protoprost and other particles can be suitably separated. Therefore, processing such as fusion can be reliably performed using only protoprost.
（１０）本発明の実施形態に係る粒子の分離装置は、
粒子を含む溶液を収容するための収容部と、
前記収容部内に配置され、所定の中心位置の周りに間隔をあけて配設される少なくとも４極の電極と、
前記電極に交流電圧を印加することによって隣接する電極間に電界を生じさせる電源部とを備え、
前記電源部は、誘電泳動により、複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる周波数の交流電圧を印加するものである。
(10) A particle separation apparatus according to an embodiment of the present invention includes:
A container for containing a solution containing particles;
At least four electrodes disposed within the housing and spaced about a predetermined center position;
A power supply unit that generates an electric field between adjacent electrodes by applying an alternating voltage to the electrodes;
The power supply unit applies an alternating voltage of a frequency that causes at least one type of particles among a plurality of types of particles to be captured at the center position and causes the electrode to capture at least one other type of particles by dielectrophoresis. Is.
このような装置により、誘電泳動を用いて複数種類の粒子を種類に応じて分離することができる。 With such an apparatus, a plurality of types of particles can be separated according to the type using dielectrophoresis.
（１１）上記分離装置は、四角形状に形成された４極の電極を備え、４極の電極が縦横に２極づつ配列され、各電極の１つの角部が前記中心位置に集中して配置されていることが好ましい。
このような構成によって、電極を簡単な構造にすることができる。また、４極の電極の中心位置に粒子を捕捉した後、周波数を変えた交流電圧を印加することによって当該粒子を電極に捕捉させる場合に、前記中心位置に集中して配置された各電極の角部付近に粒子を集めて捕捉することができる。
(11) The separation device includes a quadrupole electrode formed in a quadrangular shape, and the quadrupole electrode is arranged in two vertically and horizontally, and one corner of each electrode is concentrated at the central position. It is preferable that
With such a configuration, the electrode can have a simple structure. In addition, after capturing the particles at the center position of the four-pole electrode, when the particles are captured by applying an alternating voltage with a changed frequency, each of the electrodes arranged at the center position is concentrated. Particles can be collected and captured near the corners.
（１２）前記複数の電極は、１つの電極を複数に分割することによって形成されていてもよい。
このような構成によって、電極を簡単に作製することができる。
(12) The plurality of electrodes may be formed by dividing one electrode into a plurality of electrodes.
With such a configuration, the electrode can be easily manufactured.
（１３）前記１つの電極は、その一部が切除されることによって分割されていてもよい。
このような構成によって、電極をより簡単に作製することができる。
(13) The one electrode may be divided by cutting away a part thereof.
With such a configuration, the electrode can be manufactured more easily.
（１４）本発明の実施形態に係るプロトプラストの捕捉方法は、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することによって、誘電泳動により、溶液中に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させるか、又は前記電極と非接触の状態で捕捉させるものである。
このような構成によって、プロトプラストの処理等のため、所定の場所にプロトプラストを捕捉することができる。
(14) A method for capturing a protoplast according to an embodiment of the present invention includes:
By applying an alternating voltage of a predetermined frequency to the electrode, the protoplast contained in the solution is captured by the electrode by dielectrophoresis, or is captured in a non-contact state with the electrode.
With such a configuration, the protoplast can be captured at a predetermined place for processing the protoplast.
［本発明の実施形態の詳細］
以下、粒子の分離装置についてのより詳細な実施形態を説明する。
＜第１実施形態＞
図１に示すように、粒子の分離装置１０は、分離チップ（分離部）１１と、供給部１２と、排出部１３と、電源部１４と、撮像部１５と、操作部１６とを備えている。
分離チップ１１は、誘電泳動によって複数種類の粒子を種類に応じて分離するためのものであり、図２及び図３に示すように、基板２１と、基板２１上に設けられた電極２２とを備えている。また、基板２１には、電極２２のほか流路２３、供給ポート（インレットポート）２４、及び排出ポート（アウトレットポート）２５も設けられている。
[Details of the embodiment of the present invention]
Hereinafter, a more detailed embodiment of the particle separation apparatus will be described.
<First Embodiment>
As shown in FIG. 1, the particle separation device 10 includes a separation chip (separation unit) 11, a supply unit 12, a discharge unit 13, a power supply unit 14, an imaging unit 15, and an operation unit 16. Yes.
The separation chip 11 is for separating a plurality of types of particles according to the type by dielectrophoresis. As shown in FIGS. 2 and 3, the separation chip 11 includes a substrate 21 and an electrode 22 provided on the substrate 21. I have. In addition to the electrodes 22, the substrate 21 is also provided with a flow path 23, a supply port (inlet port) 24, and a discharge port (outlet port) 25.
流路２３は、図４にも示すように、基板２１の上面に設けられた一対の路壁２６の間に形成されている。一対の路壁２６は、シリコーンゴム等により形成され、基板２１の長手方向に沿って延びている。なお、流路２３は、複数種類の粒子を含む溶液が収容される収容部を構成する。 As shown in FIG. 4, the flow path 23 is formed between a pair of road walls 26 provided on the upper surface of the substrate 21. The pair of road walls 26 is formed of silicone rubber or the like and extends along the longitudinal direction of the substrate 21. In addition, the flow path 23 comprises the accommodating part in which the solution containing multiple types of particle | grains is accommodated.
図２及び図３に示すように、流路２３の長さ方向の一端部には供給ポート２４が設けられ、供給ポート２４には流路２３に連通する供給孔２４ａが形成されている。供給ポート２４は、図１に示すように、供給管２７を介して供給部１２に接続されている。
また、図２及び図３に示すように、流路２３の長さ方向の他端部には排出ポート２５が設けられ、排出ポート２５には、流路２３に連通する排出孔２５ａが形成されている。排出ポート２５は、図１に示すように、排出管２８を介して排出部１３に接続されている。
As shown in FIGS. 2 and 3, a supply port 24 is provided at one end of the flow path 23 in the length direction, and a supply hole 24 a communicating with the flow path 23 is formed in the supply port 24. As shown in FIG. 1, the supply port 24 is connected to the supply unit 12 via a supply pipe 27.
As shown in FIGS. 2 and 3, a discharge port 25 is provided at the other end in the length direction of the flow path 23, and a discharge hole 25 a communicating with the flow path 23 is formed in the discharge port 25. ing. As shown in FIG. 1, the discharge port 25 is connected to the discharge unit 13 via a discharge pipe 28.
図２及び図３に示すように、基板２１の上面には複数の電極２２が設けられている。この実施形態では、４極（４枚）の電極２２が設けられている。各電極２２は、基板２１の上面に薄膜状に形成され、平面視で四角形状に形成されている。４極の電極２２は、縦に２極、横に２極の四角状の配置で並べられている。また、隣接する電極２２の間には隙間が形成されている。したがって、４極の電極２２は、それぞれ１つの角部が中心の１点（中心位置Ｏ１）に集中して配置されている。 As shown in FIGS. 2 and 3, a plurality of electrodes 22 are provided on the upper surface of the substrate 21. In this embodiment, four electrodes (four sheets) of electrodes 22 are provided. Each electrode 22 is formed in a thin film shape on the upper surface of the substrate 21 and is formed in a quadrangular shape in plan view. The quadrupole electrodes 22 are arranged in a square arrangement with two poles vertically and two poles horizontally. A gap is formed between adjacent electrodes 22. Therefore, each of the four-pole electrodes 22 is arranged such that one corner portion is concentrated at one center point (center position O1).
電源部１４は、４極の電極２２に対して交流電圧を印加する。電源部１４は、電極２２に印加する電圧や交流の周波数を調整可能に構成されている。具体的に、電源部１４は、図５に示すように、斜めに対向する２極の電極２２が正極となり、他の斜めに対向する２極の電極２２が負極となるように、交流電圧を印加する。したがって、４極の電極２２は、縦方向及び横方向に正極と負極とが隣り合い、隣り合う電極２２間に電気力線Ｌが生じる、四重極の電極２２を構成している。また、隣り合う電極２２間では、電気力線Ｌ（電場）の勾配が強くなり、４極の電極２２の中心位置Ｏ１では電気力線Ｌ（電場）の勾配が弱くなる。 The power supply unit 14 applies an alternating voltage to the four-pole electrode 22. The power supply unit 14 is configured to be able to adjust a voltage applied to the electrode 22 and an AC frequency. Specifically, as shown in FIG. 5, the power supply unit 14 applies an AC voltage so that the diagonally opposed two-pole electrode 22 becomes a positive electrode, and the other diagonally opposed two-pole electrode 22 becomes a negative electrode. Apply. Therefore, the quadrupole electrode 22 constitutes a quadrupole electrode 22 in which the positive electrode and the negative electrode are adjacent to each other in the vertical direction and the horizontal direction, and electric lines of force L are generated between the adjacent electrodes 22. Further, the gradient of the electric force line L (electric field) is strong between the adjacent electrodes 22, and the gradient of the electric force line L (electric field) is weak at the center position O <b> 1 of the four-pole electrode 22.
図１に示すように、供給部１２は、粒子を含む溶液を供給管２７を介して供給するものである。供給部１２には、シリンジポンプを用いることができる。
一方、排出部１３は、分離チップ１１において分離等の処理が行われた後の溶液を排出管２８を介して排出するものである。この排出部１３にも、シリンジポンプを用いることができる。
As shown in FIG. 1, the supply unit 12 supplies a solution containing particles through a supply pipe 27. A syringe pump can be used for the supply unit 12.
On the other hand, the discharge unit 13 discharges the solution after separation or the like is performed in the separation chip 11 through the discharge pipe 28. A syringe pump can also be used for the discharge unit 13.
図１に示すように、撮像部１５は、分離チップ１１に存在する粒子を撮像するものであり、光源３１と撮像器３２と光学系３３とを備えている。光学系３３は、レンズ３４及びフィルタ３５を含んでいる。撮像器３２は、ＣＭＯＳ又はＣＣＤ等のイメージセンサを備えたものを用いることができる。光源３１には、ハロゲン光源やＬＥＤ光源を用いることができる。 As shown in FIG. 1, the imaging unit 15 images particles existing on the separation chip 11 and includes a light source 31, an imager 32, and an optical system 33. The optical system 33 includes a lens 34 and a filter 35. As the image pickup device 32, an image pickup device having an image sensor such as a CMOS or a CCD can be used. The light source 31 can be a halogen light source or an LED light source.
図１に示すように、操作部１６は、所謂マニピュレーターであり、撮像部１５による撮像箇所を調整するために、分離チップ１１を前後、上下、左右等に移動させる。 As shown in FIG. 1, the operation unit 16 is a so-called manipulator, and moves the separation chip 11 back and forth, up and down, left and right, etc., in order to adjust the imaging location by the imaging unit 15.
（電極の作製方法）
本実施形態の電極２２は以下のように作製することができる。
まず、図７（ａ）に示すように、ガラス製の基板２１上に、開口４２を有するマスク４１を施す。マスク４１にはビニールテープ等の粘着テープを用い、粘着テープをガラス基板２１上に貼り付ける。マスク４１として金属製等の板材を用いてもよい。
(Production method of electrode)
The electrode 22 of this embodiment can be manufactured as follows.
First, as shown in FIG. 7A, a mask 41 having an opening 42 is applied on a glass substrate 21. An adhesive tape such as a vinyl tape is used for the mask 41, and the adhesive tape is stuck on the glass substrate 21. A metal plate or the like may be used as the mask 41.
次いで、図示しないコーティング装置を用いて、マスク４１の開口４２を通して基板２１の上面に電極材料をコーティングする。具体的には、コーティング装置としてのイオンコーターによって基板２１上に電極材料を蒸着する。電極材料には、金又は銅等を用いることができる。 Next, an electrode material is coated on the upper surface of the substrate 21 through the opening 42 of the mask 41 using a coating apparatus (not shown). Specifically, an electrode material is deposited on the substrate 21 by an ion coater as a coating apparatus. Gold, copper, or the like can be used as the electrode material.
次に、蒸着によって基板２１に付着した薄膜状の電極２２’の一部を取り除くことによって複数の電極２２に分割する。具体的に、図７（ｂ）に１点鎖線で示すように、１つの電極２２’の縦方向の中心と横方向の中心を線状に切除する。これにより電極２２’には十字状の切れ目が形成され、切れ目によって４枚の電極２２に分割される。図６に、隣接する２つの電極２２と、その間の隙間Ｓを撮影した画像を示す。この例では、隙間Ｓの寸法が約２５μｍとされている。電極２２’の一部を切除するにはカッターナイフを用いることができる。 Next, a part of the thin film-like electrode 22 ′ attached to the substrate 21 by vapor deposition is removed to be divided into a plurality of electrodes 22. Specifically, as shown by a one-dot chain line in FIG. 7B, the vertical center and the horizontal center of one electrode 22 'are cut into a line. As a result, a cross-shaped cut is formed in the electrode 22 ′ and is divided into four electrodes 22 by the cut. FIG. 6 shows an image obtained by photographing two adjacent electrodes 22 and a gap S therebetween. In this example, the dimension of the gap S is about 25 μm. A cutter knife can be used to excise part of the electrode 22 '.
以上のような作製方法により、複雑なパターンのマスク４１が不要となり、容易に電極２２を形成することができる。また、電極２２の作製のために人体に悪影響のある薬剤を使用しなくてもよい。 With the above manufacturing method, the mask 41 having a complicated pattern is not necessary, and the electrode 22 can be easily formed. In addition, it is not necessary to use a drug that adversely affects the human body for the production of the electrode 22.
以上の構成において、供給部１２から分離チップ１１の流路２３内に粒子を含む溶液を供給し、電源部１４によって分離チップ１１の電極２２に交流電圧を印加すると、その周波数に応じて正の誘電泳動又は負の誘電泳動が生じ、粒子をトラップ（捕捉）することができる。正の誘電泳動が生じると、粒子には電極２２による引力が働き、粒子は電極２２に張り付くことによってトラップされる。他方、負の誘電泳動が生じると、粒子には電極２２からの斥力が働き、４枚の電極２２の角部が集中する箇所（中心位置Ｏ１）において、電極２２に非接触の状態でトラップされる。 In the above configuration, when a solution containing particles is supplied from the supply unit 12 into the flow path 23 of the separation chip 11 and an AC voltage is applied to the electrode 22 of the separation chip 11 by the power supply unit 14, a positive value is obtained according to the frequency. Dielectrophoresis or negative dielectrophoresis occurs and particles can be trapped. When positive dielectrophoresis occurs, the particles are attracted by the electrode 22, and the particles are trapped by sticking to the electrode 22. On the other hand, when negative dielectrophoresis occurs, repulsive force from the electrode 22 acts on the particles, and the particles 22 are trapped in a non-contact state at the location where the corners of the four electrodes 22 are concentrated (center position O1). The
したがって、溶液中に周波数による特性の異なる複数種類の粒子が含まれている場合、いずれかの粒子に正の誘電泳動を生じさせ、他の粒子に負の誘電泳動を生じさせることによって両粒子を分離することが可能である。また、いずれかの粒子に正又は負の誘電泳動を生じさせ、他の粒子を溶液中で浮遊させることによっても分離することが可能である。 Therefore, when multiple types of particles with different characteristics depending on frequency are contained in the solution, positive dielectrophoresis occurs in one of the particles, and negative dielectrophoresis occurs in the other particles. It is possible to separate. It is also possible to cause separation by causing positive or negative dielectrophoresis in any particle and suspending other particles in the solution.
また、ある特性の粒子を正の誘電泳動により電極２２にトラップし、他の粒子を負の誘電泳動により中心位置Ｏ１にトラップするか又は溶液中に浮遊させた場合、供給部１２から分離チップ１１内に溶液を流入しつつ排出部１３によって分離チップ１１内の溶液を排出することによって、中心位置Ｏ１にトラップした粒子や、溶液中に浮遊した粒子を排出することができる。このような操作によって、電極２２にトラップした特定の粒子のみを分離チップ１１内に残すことが可能である。そして、分離チップ１１内に残った粒子は、培養や融合等の特定の処理を行うために抽出することが可能となる。 In addition, when particles having certain characteristics are trapped on the electrode 22 by positive dielectrophoresis and other particles are trapped at the central position O1 by negative dielectrophoresis or suspended in the solution, the separation chip 11 is supplied from the supply unit 12. By discharging the solution in the separation chip 11 by the discharge unit 13 while the solution is flowing in, particles trapped at the central position O1 and particles suspended in the solution can be discharged. By such an operation, it is possible to leave only specific particles trapped on the electrode 22 in the separation chip 11. The particles remaining in the separation chip 11 can be extracted for performing a specific process such as culture or fusion.
周波数による特性の異なる粒子として、生細胞と、死細胞とを挙げることができる。誘電泳動力を用いた細胞の分離は、細胞の大きさ、誘電率や導電率に依存した区別を行うことができる。誘電率は、細胞の各器官によって異なり、生細胞と死細胞との間でも異なる。したがって、生細胞と死細胞とを誘電泳動を用いて分離することが可能となる。生死細胞の分離については、後述する実施例４及び５において説明する。 Examples of the particles having different characteristics depending on the frequency include living cells and dead cells. Separation of cells using dielectrophoretic force can be performed depending on cell size, dielectric constant or conductivity. The dielectric constant is different for each organ of the cell, and is different between a living cell and a dead cell. Therefore, live cells and dead cells can be separated using dielectrophoresis. The separation of viable and dead cells will be described in Examples 4 and 5 described later.
また、周波数による特性の異なる粒子として、細胞壁を有する細胞と、細胞壁を除去したプロトプラストとを挙げることができる。両者は、周波数に応じた誘電率が異なるため、誘電泳動を用いて分離することが可能である。プロトプラストと他の細胞との分離については、後述する実施例６において説明する。 Examples of the particles having different characteristics depending on the frequency include cells having a cell wall and protoplasts from which the cell wall has been removed. Since both have different dielectric constants depending on the frequency, they can be separated using dielectrophoresis. Separation of protoplasts from other cells will be described in Example 6 described later.
＜第２実施形態＞
図８は、第２実施形態に係る分離装置１０を示す。この分離装置１０は、第１実施形態のような供給部１２及び排出部１３を備えず、光ピンセット部１７を新たに備えている。この光ピンセット部１７は、集光したレーザー光により粒子をその焦点位置の近傍に捕捉し、移動させることができるものである。光ピンセット部１７は、レーザー発振器５１と、ピンセット本体５２と、操作部５３とを備える。レーザー発振器５１によって発生したレーザー光は、ピンセット本体５２から発射され、ピンセット本体５２の先端部で粒子を捕捉する。操作部５３は、所謂マニピュレータであり、ピンセット本体５２を前後、左右、及び上下等に移動させることができる。
Second Embodiment
FIG. 8 shows a separation apparatus 10 according to the second embodiment. The separation device 10 does not include the supply unit 12 and the discharge unit 13 as in the first embodiment, but newly includes an optical tweezer unit 17. The optical tweezers 17 can capture and move particles in the vicinity of the focal position by the condensed laser light. The optical tweezer unit 17 includes a laser oscillator 51, a tweezer main body 52, and an operation unit 53. The laser light generated by the laser oscillator 51 is emitted from the tweezer body 52 and captures particles at the tip of the tweezer body 52. The operation unit 53 is a so-called manipulator, and can move the tweezer main body 52 back and forth, left and right, and up and down.
本実施形態の分離チップ１１は、供給部１２及び排出部１３を備えていないが、図９に示すように、電極２２上に溶液を収容し、貯留することができるように収容部５４が設けられている。この収容部５４は、シリコーンゴム等によって形成され、電極２２を囲うように配置された四角形状の周壁５５を備えている。したがって、収容部５４内において、粒子の分離を行うことが可能となり、分離された粒子を光ピンセット部１７によって捕捉・抽出することができる。また、収容部５４内において培養や融合等の処理を行うことも可能である。 The separation chip 11 according to the present embodiment does not include the supply unit 12 and the discharge unit 13, but as illustrated in FIG. 9, the storage unit 54 is provided so that the solution can be stored and stored on the electrode 22. It has been. The housing portion 54 is formed of a silicone rubber or the like, and includes a rectangular peripheral wall 55 disposed so as to surround the electrode 22. Therefore, the particles can be separated in the accommodating portion 54, and the separated particles can be captured and extracted by the optical tweezers 17. It is also possible to perform processing such as culture and fusion in the accommodating portion 54.
＜実施例＞
以上のような分離装置１０における作用及び効果を実証するため、特定の粒子を用いた実施例について説明する。
（実施例１）
実施例１は、上述の方法により作製した電極２２の有効性を確認するために、粒子として、ハイプレシカ球（ＵＦ Ｎ２Ｎ、Ｎ３Ｎ 宇部日東化成株式会社製）と出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae、BY4741）との２つの試料を用い、それぞれを純水で数十倍に希釈した溶液を分離装置の分離チップに充填し、交流電圧を印加した。ハイプレシカ球は円形で直径１０μｍ、酵母菌は楕円形で５〜８μｍである。そして、交流電圧を印加しているときとしていないとき、又は交流電圧の周波数を変化させたときの粒子の挙動を撮像部によって撮像した。その結果を図１０〜図１２に示す。
<Example>
In order to demonstrate the operation and effect of the separation apparatus 10 as described above, an example using specific particles will be described.
Example 1
In Example 1, in order to confirm the effectiveness of the electrode 22 produced by the above-described method, as particles, high plethysmocytes (UF N2N, N3N manufactured by Ube Nitto Kasei Co., Ltd.) and budding yeast (Saccharomyces cerevisiae, BY4741) These two samples were used, each of which was diluted several tens of times with pure water, filled in a separation chip of a separation device, and an alternating voltage was applied. Hyplesica spheres are circular and 10 μm in diameter, and yeasts are oval and 5 to 8 μm. Then, the behavior of the particles when the AC voltage was not applied or when the frequency of the AC voltage was changed was imaged by the imaging unit. The results are shown in FIGS.
図１０（ａ）は、交流電圧を印加していないときのハイプレシカ球（Ｎ２Ｎ）（画像中に符号Ｐで示す）の状態を示し、図１０（ｂ）は、交流電圧を印加しているときの同ハイプレシカ球Ｐの状態を示す。交流電圧を印加していないときは、ハイプレシカ球Ｐは、電極２２上を浮遊している。一方、交流電圧を印加しているとき、ハイプレシカ球Ｐは、負の誘電泳動によって、４極の電極２２間の中心位置Ｏ１にトラップされていることがわかる。 FIG. 10A shows the state of the high pressure sphere (N2N) (indicated by symbol P in the image) when no AC voltage is applied, and FIG. 10B shows the state when the AC voltage is applied. The state of the same high plethysmic sphere P is shown. When an AC voltage is not applied, the high plethysmic sphere P is floating on the electrode 22. On the other hand, when an alternating voltage is applied, it can be seen that the high pressure sphere P is trapped at the center position O1 between the four-pole electrodes 22 by negative dielectrophoresis.
図１１（ａ）は、交流電圧を印加していないときのハイプレシカ球（Ｎ３Ｎ）（画像中に符号Ｐ出示す）の状態を示し、図１１（ｂ）は、交流電圧を印加しているときの同ハイプレシカ球Ｐの状態を示す。交流電圧を印加していないときは、ハイプレシカ球Ｐは、電極２２上を浮遊している。一方、交流電圧を印加しているとき、ハイプレシカ球Ｐは、負の誘電泳動によって、４極の電極２２間の中心位置にトラップされていることがわかる。 FIG. 11A shows the state of the high pressure sphere (N3N) (reference sign P is shown in the image) when no AC voltage is applied, and FIG. 11B shows the state when the AC voltage is applied. The state of the same high plethysmic sphere P is shown. When an AC voltage is not applied, the high plethysmic sphere P is floating on the electrode 22. On the other hand, when an alternating voltage is applied, it can be seen that the high pressure sphere P is trapped at the center position between the four-pole electrodes 22 by negative dielectrophoresis.
図１２（ａ）は、高周波数の交流電圧を印加しているときの酵母菌の状態を示し、図１２（ｂ）は、低周波数の交流電圧を印加しているときの酵母菌の状態を示している。図１２においては、酵母菌を白丸で囲って示している。酵母菌は、高周波数の電圧を印加しているとき、正の誘電泳動により電極に張り付き、トラップされていることがわかる。他方、低周波数の電圧を印加しているとき、酵母菌は、負の誘電泳動により４極の電極２２間の中心位置にトラップされていることがわかる。 FIG. 12 (a) shows the state of the yeast when a high frequency alternating voltage is applied, and FIG. 12 (b) shows the state of the yeast when a low frequency alternating voltage is applied. Show. In FIG. 12, the yeast is shown surrounded by white circles. It can be seen that the yeast is trapped and trapped on the electrode by positive dielectrophoresis when a high frequency voltage is applied. On the other hand, when a low frequency voltage is applied, it can be seen that the yeast is trapped at the center position between the four-pole electrodes 22 by negative dielectrophoresis.
酵母菌は、４Ｖｐ−ｐの一定電圧を印加した場合、周波数が約３００ｋＨｚで誘電泳動の正負が切り替わった。すなわち、約３００ｋＨｚを超える周波数の交流電圧を印加することにより正の誘電泳動により酵母菌をトラップすることができ、３００ｋＨｚよりも小さい周波数の交流電圧を印加することによって負の誘電泳動によって酵母菌をトラップすることができた。 When a constant voltage of 4 Vp-p was applied to yeast, the polarity of dielectrophoresis was switched at a frequency of about 300 kHz. That is, the yeast can be trapped by positive dielectrophoresis by applying an alternating voltage having a frequency exceeding about 300 kHz, and the yeast can be removed by negative dielectrophoresis by applying an alternating voltage having a frequency lower than 300 kHz. I was able to trap.
以上の実施例１により、交流電圧の印加により粒子のトラップが可能であることが実証された。また、交流電圧の周波数を変化させることにより、トラップの形態（誘電泳動の正負）を変更可能であることがわかった。 From the above Example 1, it was proved that particles can be trapped by applying an alternating voltage. It was also found that the trap form (positive or negative of dielectrophoresis) can be changed by changing the frequency of the AC voltage.
（実施例２）
上記の実施例１において、負の誘電泳動によって酵母菌をトラップしている状態で、流路２３内に流量を変化させながら溶液を流した。印加する交流電圧の周波数は、１０ｋＨｚ，５０ｋＨｚ，１００ｋＨｚ，１５０ｋＨｚとした。これにより、負の誘電泳動によるトラップ力を定量的に評価した。その結果を図１３に示す。
(Example 2)
In Example 1 above, the solution was allowed to flow while changing the flow rate in the flow path 23 in a state where the yeast was trapped by negative dielectrophoresis. The frequency of the applied AC voltage was 10 kHz, 50 kHz, 100 kHz, and 150 kHz. Thereby, the trapping force by negative dielectrophoresis was quantitatively evaluated. The result is shown in FIG.
図１３のグラフには、トラップ力の最大値に相当する溶液の流速がプロットされている。つまり、流速が大きいほどトラップ力が大きいことになる。図１３によれば、印加する交流電圧の周波数が大きくなるほど、トラップ力が減少していることがわかる。したがって、交流電圧の周波数と、負の誘電泳動によるトラップ力との間には密接な関係があることがわかる。 In the graph of FIG. 13, the flow rate of the solution corresponding to the maximum value of the trapping force is plotted. That is, the larger the flow velocity, the greater the trapping force. As can be seen from FIG. 13, the trapping force decreases as the frequency of the applied AC voltage increases. Therefore, it can be seen that there is a close relationship between the frequency of the AC voltage and the trapping force due to negative dielectrophoresis.
（実施例３）
図９に示す分離チップ１１を用い、負の誘電泳動によって４極の電極２２の中心位置にトラップされた酵母菌をそのまま培養させた。図１４に、時間の経過に伴う酵母菌の培養の様子を示す。観察対象とする酵母菌を白丸で囲って示す。溶液は、培養液（ＹＰＤ）と水とを１対１で混合し、液温を２４℃とした。そして、５００ｋＨｚ、１Ｖｐ−ｐの交流電圧を電極に印加した。隣接する電極２２の隙間は約２５μｍである（図１６，図１９の電極２２も同様）。前述した実施例１においては溶液が純水の場合に誘電泳動の正負が切り替わる周波数が３００ｋＨｚであった。培養液と水との混合溶液の場合、１５００ｋＨｚ前後で誘電泳動の正負が切り替わった。
(Example 3)
Using the separation chip 11 shown in FIG. 9, the yeast trapped at the center position of the quadrupole electrode 22 by negative dielectrophoresis was cultured as it was. FIG. 14 shows how yeast is cultured over time. Yeasts to be observed are shown surrounded by white circles. The solution was a one-to-one mixture of a culture solution (YPD) and water, and the solution temperature was 24 ° C. Then, an AC voltage of 500 kHz and 1 Vp-p was applied to the electrodes. The gap between adjacent electrodes 22 is about 25 μm (the same applies to the electrodes 22 in FIGS. 16 and 19). In Example 1 described above, when the solution is pure water, the frequency at which the polarity of dielectrophoresis switches is 300 kHz. In the case of a mixed solution of a culture solution and water, the polarity of dielectrophoresis was switched around 1500 kHz.
図１４に示すように、時間の経過によって酵母菌に娘細胞が出芽し、培養が行えることが確認された。培養時間は、基準時間から４０分程度であった（図１４（ｅ）参照）。
なお、図１４には、培養の対象となる酵母菌以外にも、負の誘電泳動により４極の電極２２の中心位置にトラップされた他の酵母菌が示されている。このように他の酵母菌がトラップされるのをできるだけ抑制するため、実施例３では、１Ｖｐ−ｐに下げた交流電圧を印加した。交流電圧が小さい程トラップ力が小さくなるからである。
As shown in FIG. 14, it was confirmed that daughter cells budding into the yeast over time and culture was possible. The culture time was about 40 minutes from the reference time (see FIG. 14 (e)).
In addition to the yeast to be cultured, FIG. 14 shows other yeasts trapped at the center position of the quadrupole electrode 22 by negative dielectrophoresis. Thus, in order to suppress trapping of other yeasts as much as possible, in Example 3, an alternating voltage lowered to 1 Vp-p was applied. This is because the trapping force decreases as the AC voltage decreases.
（実施例４）
実施例１において、酵母菌の生細胞は約３００ｋＨｚで誘電泳動の正負が切り替わることがわかったが、死細胞は、水中下において１０ｋＨｚ〜１５０００ｋＨｚの周波数で終始負の誘電泳動の挙動を行う。実施例４では、このような生死細胞の周波数特性を利用して、生細胞と死細胞とを分離できるかを検証した。
Example 4
In Example 1, it was found that the positive and negative dielectrophoresis of live cells of yeast was switched at about 300 kHz, but the dead cells behaved in a negative dielectrophoresis at a frequency of 10 kHz to 15000 kHz in water. In Example 4, it was verified whether live cells and dead cells could be separated using such frequency characteristics of live cells.
図２又は図９に示す分離チップ１１に、生細胞と死細胞とが混合して含まれる溶液を充填し、電極に交流電圧を印加した。生細胞と死細胞を視覚的に区別するため、メチレンブルーにより染色を行った。生細胞は、デハイドロゲナーゼという脱水素酵素により還元反応が起こり、還元型のロイコメチレンブルーとなり、無色になる。一方、死細胞は、メチレンブルーのまま青色に発色した。図１５には、生細胞中に含まれる、メチレンブルーで染色された死細胞を丸で囲って示している。 The separation chip 11 shown in FIG. 2 or 9 was filled with a solution containing a mixture of living cells and dead cells, and an AC voltage was applied to the electrodes. To visually distinguish between live and dead cells, staining was performed with methylene blue. A living cell undergoes a reduction reaction by a dehydrogenase called dehydrogenase, and becomes reduced leucomethylene blue and becomes colorless. On the other hand, dead cells developed blue in methylene blue. In FIG. 15, the dead cells stained with methylene blue contained in the living cells are circled.
図１６（ａ）は、電極２２に周波数１００ｋＨｚのＶｐ−ｐ４Ｖの交流電圧を印加した状態を示す。周波数１００ｋＨｚの場合、生細胞も死細胞も、負の誘電泳動により４極の電極２２の中心位置にトラップされた。
その後、交流電圧の周波数を１０００ｋＨｚにまで徐々に上げると、図１６（ｂ）に示すように、染色された死細胞Ｐ２は、４極の電極２２の中心位置にトラップされたまま残り、生細胞Ｐ１は、その周囲の電極２２の角部付近に貼り付くことによってトラップされた。これにより、生細胞Ｐ１と死細胞Ｐ２とを好適に分離することができた。
FIG. 16A shows a state in which an AC voltage of Vp-p4V having a frequency of 100 kHz is applied to the electrode 22. When the frequency was 100 kHz, both living cells and dead cells were trapped at the center position of the quadrupole electrode 22 by negative dielectrophoresis.
Thereafter, when the frequency of the AC voltage is gradually increased to 1000 kHz, the stained dead cells P2 remain trapped at the center position of the quadrupole electrode 22 as shown in FIG. P1 was trapped by sticking near the corner of the surrounding electrode 22. Thereby, the living cell P1 and the dead cell P2 were able to be isolate | separated suitably.
なお、実施例４においては、最初に生細胞及び死細胞を負の誘電泳動により４極の電極２２の中心位置にトラップし、その後周波数を上げることによって、生細胞を電極２２の角部付近にトラップした。そのため、生細胞も死細胞も広範囲に分散することなく、比較的狭い範囲に集めた状態で分離することができた。そのため、前述した光ピンセット部１７等を用いて、特定の細胞を抽出する作業を容易に行うことが可能となる。 In Example 4, first, live cells and dead cells are trapped at the center position of the quadrupole electrode 22 by negative dielectrophoresis, and then the frequency is increased to bring the live cells near the corners of the electrode 22. Trapped. Therefore, the living cells and dead cells could be separated in a relatively narrow range without being dispersed over a wide range. For this reason, it is possible to easily perform the operation of extracting specific cells using the optical tweezers 17 or the like described above.
（実施例５）
前述の実施例４により、生細胞と死細胞とを分離可能であることが実証された。実施例５では、生細胞と死細胞とを分離するだけでなく、分離した死細胞を除去し、生細胞のみを分離チップ１１に残す操作を行った。死細胞を除去するには溶液を流す力を利用した。
(Example 5)
Example 4 described above demonstrated that live and dead cells can be separated. In Example 5, not only the live cells and the dead cells were separated, but also the operation of removing the separated dead cells and leaving only the live cells on the separation chip 11 was performed. The force of flowing the solution was used to remove dead cells.
生細胞と死細胞との分離には、生細胞を正の誘電泳動によりトラップし、死細胞を負の誘電泳動によりトラップするので、この状態で死細胞のみを取り除くには、死細胞のトラップ力を超えるが、生細胞のトラップ力を超えない流速で溶液を流す必要がある。したがって、死細胞のトラップ力を超える溶液の流速を測定した。具体的には、周波数を１００ｋＨｚ（０．１ＭＨｚ），５００ｋＨｚ（０．５ＭＨｚ）、１０００ｋＨｚ（１ＭＨｚ）とした場合の、死細胞をトラップすることができる最大の流速を３回ずつ測定した。その結果を図１７の表と図１８のグラフに示す。 To separate live and dead cells, live cells are trapped by positive dielectrophoresis and dead cells are trapped by negative dielectrophoresis. To remove only dead cells in this state, dead cell trapping force is used. However, it is necessary to flow the solution at a flow rate that does not exceed the trapping force of living cells. Therefore, the flow rate of the solution exceeding the trapping force of dead cells was measured. Specifically, the maximum flow rate at which dead cells can be trapped when the frequency is 100 kHz (0.1 MHz), 500 kHz (0.5 MHz), and 1000 kHz (1 MHz) was measured three times. The results are shown in the table of FIG. 17 and the graph of FIG.
この結果から、周波数が小さいほど死細胞を流すことができる溶液の流速が低くなり、死細胞のトラップ力が小さくなるといえる。
一方、生細胞に対して同様の実験を行ったところ、例えば周波数５００ｋＨｚでは流速１００００μＬ／ｍｉｎであっても生細胞はトラップされたままであった。したがって、正の誘電泳動と負の誘電泳動とでは、約１０倍のトラップ力の差があることがわかった。
From this result, it can be said that the smaller the frequency, the lower the flow rate of the solution through which dead cells can flow, and the lower the trapping power of dead cells.
On the other hand, when a similar experiment was performed on live cells, for example, at a frequency of 500 kHz, the live cells remained trapped even at a flow rate of 10,000 μL / min. Therefore, it was found that there is a difference in trapping force of about 10 times between positive dielectrophoresis and negative dielectrophoresis.
実施例５では、生細胞と死細胞とを分離した後、このトラップ力の差を利用して、死細胞のみを取り除き生細胞のみを残す処理を行った。図１９にその過程を示す。なお、図１９においては、生細胞を白丸で囲って示し、死細胞を黒丸で囲って示している。
図１９（ａ）は、電源部１４によって周波数１００ｋＨｚ、４Ｖｐ−ｐの交流電圧を印加した状態を示す。この場合、生細胞も死細胞も、負の誘電泳動によって４極の電極２２の中心にトラップされた。
In Example 5, after the living cells and the dead cells were separated, a process of removing only the dead cells and leaving only the living cells was performed using the difference in trapping power. FIG. 19 shows the process. In FIG. 19, live cells are surrounded by white circles, and dead cells are surrounded by black circles.
FIG. 19A shows a state in which an AC voltage having a frequency of 100 kHz and 4 Vp-p is applied by the power supply unit 14. In this case, both live and dead cells were trapped at the center of the quadrupole electrode 22 by negative dielectrophoresis.
図１９（ｂ）は、徐々に周波数を上げていき、１０００ｋＨｚになったときの状態を示す。このとき、生細胞は正の誘電泳動によって電極２２に貼り付いた。一方、死細胞は、負の誘電泳動によって４極の電極２２間の中心位置にトラップされたままとなった。
図１９（ｃ）は、分離チップ１１の流路２３に溶液を流した状態を示す。溶液の流速は、正の誘電泳動によるトラップ力を超えず、負の誘電泳動によるトラップ力を超える流速である。これにより死細胞は流されて排出され、電極２２には生細胞がトラップされたまま残った。
FIG. 19B shows a state when the frequency is gradually increased to 1000 kHz. At this time, the living cells were attached to the electrode 22 by positive dielectrophoresis. On the other hand, the dead cells remained trapped at the center position between the quadrupole electrodes 22 by negative dielectrophoresis.
FIG. 19 (c) shows a state in which a solution is flowed through the flow path 23 of the separation chip 11. The flow rate of the solution is a flow rate that does not exceed the trapping force by positive dielectrophoresis and exceeds the trapping force by negative dielectrophoresis. As a result, dead cells were flushed and discharged, and live cells remained trapped on the electrode 22.
図１９（ｄ）は、周波数１００ｋＨｚに下げた状態を示す。生細胞は、負の誘電泳動によって４極の電極２２の中心位置にトラップされた。つまり、電極２２に非接触の状態で、生細胞のみを取得することができた。
以上の手順により、メチレンブルー等の試薬を用いることなく生細胞のみを識別し、分離・取得を行うことができるので、生細胞を培養したり融合させたりする処理を好適に行うことができる。また、第２実施形態で示した光ピンセット部１７を用いて特定の生細胞のみを抽出し、培養や融合させる操作も容易に行うことができる。
FIG. 19D shows a state where the frequency is lowered to 100 kHz. The living cells were trapped at the center position of the quadrupole electrode 22 by negative dielectrophoresis. That is, only living cells could be obtained in a non-contact state with the electrode 22.
According to the above procedure, only living cells can be identified and separated / acquired without using a reagent such as methylene blue, so that a process of culturing or fusing the living cells can be suitably performed. In addition, it is possible to easily perform an operation of extracting, culturing or fusing only specific living cells using the optical tweezers 17 shown in the second embodiment.
（実施例６）
実施例６では、誘電泳動によるプロトプラストの挙動について検証した。細胞から細胞壁を取り除いたプロトプラストをソルビトール液中に分散させた溶液を、分離チップに供給し、電極に交流電圧を印加した。その結果を図２０に示す。図２０において隣接する電極２２の隙間は約５０μｍである。
(Example 6)
In Example 6, the behavior of protoplasts by dielectrophoresis was verified. A solution in which protoplasts obtained by removing cell walls from cells were dispersed in a sorbitol solution was supplied to a separation chip, and an alternating voltage was applied to the electrodes. The result is shown in FIG. In FIG. 20, the gap between adjacent electrodes 22 is about 50 μm.
周波数１０ｋＨｚ、４Ｖｐ−ｐの交流電圧を電極２２に印加したとき、図２０（ａ）に示すように、プロトプラストは、負の誘電泳動によって４極の電極２２の中心位置に捕捉された。
その後、周波数１２０ｋＨｚ、４Ｖｐ−ｐの交流電圧を電極２２に印加すると、図２０（ｂ）に示すように、プロトプラストは、正の誘電泳動によって各電極２２の角部近傍に貼り付くことによって捕捉された。
When an AC voltage having a frequency of 10 kHz and 4 Vp-p was applied to the electrode 22, the protoplast was captured at the center position of the quadrupole electrode 22 by negative dielectrophoresis, as shown in FIG.
Thereafter, when an AC voltage having a frequency of 120 kHz and 4 Vp-p is applied to the electrodes 22, the protoplasts are captured by sticking in the vicinity of the corners of the electrodes 22 by positive dielectrophoresis, as shown in FIG. It was.
したがって、プロトプラストについても印加する交流電圧の周波数に応じて正の誘電泳動又は負の誘電泳動により捕捉可能であることがわかった。また、プロトプラスト以外の他の細胞（例えば、上記実施例４及び５で示した生細胞や死細胞等）とは、捕捉特性が異なることが確認された。そのため、上記実施例５と略同様に、プロトプラストと他の細胞とが含まれる溶液からプロトプラストのみを分離して取得することが可能である。例えば、次のような手順（１）〜（３）でプロトプラストを取得することができる。 Therefore, it was found that protoplasts can also be captured by positive dielectrophoresis or negative dielectrophoresis depending on the frequency of the applied AC voltage. In addition, it was confirmed that the capture characteristics were different from other cells than protoplasts (for example, live cells and dead cells shown in Examples 4 and 5 above). Therefore, in substantially the same manner as in Example 5, it is possible to obtain only protoplasts separated from a solution containing protoplasts and other cells. For example, protoplasts can be obtained by the following procedures (1) to (3).
（１）まず、電極２２に１２０ｋＨｚの交流電圧を電極２２に印加することでプロトプラストのみを電極２２に捕捉させ、その他の細胞は、電極２２間の中心位置に捕捉させるか、溶液中に浮遊させる。
（２）その後、シリンジポンプ等を用いて溶液を流し、プロトプラスト以外の他の細胞を排出する。
（３）電極２２に印加する交流電圧を１０ｋＨｚに変更することでプロトプラストのみを電極２２間の中心位置に捕捉する。
(1) First, by applying an AC voltage of 120 kHz to the electrode 22, only the protoplast is captured by the electrode 22, and other cells are captured at the central position between the electrodes 22 or suspended in the solution. .
(2) Thereafter, the solution is poured using a syringe pump or the like, and cells other than the protoplast are discharged.
(3) By changing the alternating voltage applied to the electrodes 22 to 10 kHz, only the protoplast is captured at the center position between the electrodes 22.
また、電極２２に印加する周波数を調整することによって、生細胞と死細胞とプロトプラストとが含まれる溶液において、プロトプラストと、生細胞及び死細胞とを分離する操作だけでなく、プロトプラスト及び生細胞と、死細胞とを分離し、その後、プロトプラストと生細胞とを分離するような操作も可能となる。 In addition, by adjusting the frequency applied to the electrode 22, not only the operation of separating the protoplast from the living cell and the dead cell in the solution containing the living cell, the dead cell and the protoplast, but also the protoplast and the living cell. Thus, an operation of separating dead cells and then separating protoplasts and living cells becomes possible.
本発明は、上記の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内において変更することができる。
上記実施形態では、４極の電極を用いたが、それ以上の多極の電極を用いることが可能である。また、プロトプラストと他の細胞とを分離する方法及び装置には、２極の電極を用いてもよい。
The present invention is not limited to the above-described embodiment, and can be modified within the scope of the invention described in the claims.
In the above-described embodiment, a quadrupole electrode is used. However, it is possible to use more multipolar electrodes. Moreover, you may use a bipolar electrode for the method and apparatus which isolate | separate a protoplast and another cell.
粒子の分離等のために電極に印加した交流電圧や周波数の具体的数値はあくまで一例であり、分離の対象となる粒子の特性や溶液の種類等に応じて適宜変更されるものである。 Specific numerical values of the AC voltage and frequency applied to the electrodes for the separation of the particles and the like are merely examples, and may be appropriately changed according to the characteristics of the particles to be separated, the type of the solution, and the like.
１０ ：分離装置
１１ ：分離チップ（分離部）
１４ ：電源部
２２ ：電極
５４ ：収容部
Ｏ１ ：中心位置
10: Separation device 11: Separation chip (separation part)
14: Power supply unit 22: Electrode 54: Housing unit O1: Center position
Claims (14)
所定の中心位置の周りに配設される少なくとも４極の電極に第１の周波数の交流電圧を印加することにより、前記複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる分離工程を含む、粒子の分離方法。 A method of separating a plurality of types of particles contained in a solution by dielectrophoresis,
By applying an alternating voltage of a first frequency to at least four electrodes arranged around a predetermined center position, at least one kind of particles among the plurality of kinds of particles is captured at the center position. A method for separating particles, comprising a separation step of capturing at least one other kind of particles on the electrode.
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させるか又は前記電極と非接触の状態で捕捉させ、その他の粒子を、前記電極と非接触の状態で浮遊若しくは捕捉させるか又は前記電極に捕捉させる分離工程を含む、粒子の分離方法。 A method for separating a plurality of types of particles contained in a solution by dielectrophoresis,
By applying an alternating voltage of a predetermined frequency to the electrode, the protoplast contained in the solution is captured by the electrode or in a non-contact state with the electrode, and other particles are not contacted with the electrode. A method for separating particles, comprising a separation step of floating or capturing in a state or capturing on the electrode.
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させ、その他の粒子を前記電極と非接触の状態で浮遊又は捕捉させる分離工程を含む、粒子の分離方法。 A method for separating a plurality of types of particles contained in a solution by dielectrophoresis,
By applying an alternating voltage of a predetermined frequency to the electrode, the protoplast contained in the solution is captured by the electrode, and a separation step of floating or capturing other particles in a non-contact state with the electrode is included. Separation method.
前記収容部内に配置され、所定の中心位置の周りに間隔をあけて配設される少なくとも４極の電極と、
前記電極に交流電圧を印加することによって隣接する電極間に電界を生じさせる電源部とを備え、
前記電源部は、誘電泳動により、複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる周波数の交流電圧を印加する、粒子の分離装置。 A container for containing a solution containing particles;
At least four electrodes disposed within the housing and spaced about a predetermined center position;
A power supply unit that generates an electric field between adjacent electrodes by applying an alternating voltage to the electrodes;
The power supply unit applies an alternating voltage of a frequency that causes at least one type of particles among a plurality of types of particles to be captured at the center position and causes the electrode to capture at least one other type of particles by dielectrophoresis. , Particle separation device.
A method for capturing a protoplast, wherein an alternating voltage having a predetermined frequency is applied to an electrode to cause the protoplast contained in a solution to be captured by the electrode or to be captured in a non-contact state with the electrode by dielectrophoresis.
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