JP2016049083A - Manufacturing method of temperature-responsive cell culture substrate having pattern - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、基材上に温度応答性領域と細胞非接着領域を有する細胞培養基材の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a cell culture substrate having a temperature-responsive region and a cell non-adhesion region on the substrate.
再生医療では細胞をシート状に加工した細胞シートによる治療が行われている。細胞培養基材を用いて培養された細胞を剥離させるためには、酵素処理のような方法で接着性タンパク質を破壊する必要があった。その際、結合していた細胞同士は離れてしまうという課題があった。これに対し、温度応答性を有する細胞培養基材を用いて細胞を培養した場合、低損傷で細胞を剥離させることが可能である。 In regenerative medicine, treatment with a cell sheet obtained by processing cells into a sheet shape is performed. In order to peel cells cultured using a cell culture substrate, it was necessary to destroy the adhesive protein by a method such as enzyme treatment. At that time, there was a problem that the cells that were bound to each other were separated. On the other hand, when cells are cultured using a cell culture substrate having temperature responsiveness, the cells can be detached with low damage.
特許文献１では、細胞培養基材に温度応答性ポリマーの原料であるモノマー水溶液を塗布し、放射線照射によって基材表面に温度応答性ポリマーを固定化している。この方法は、放射線重合で製造することで開始剤の添加が不要になっている点では優れているが、現在汎用的に使われている温度応答性ポリマーであるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのモノマーには神経毒性があるため製造環境の安全性担保が難しくなるという問題点がある。
In
パターンを有する温度応答性細胞培養基材の作製方法としては、温度応答性領域と細胞非接着性領域を二段階に分けて基材上に固定化する方法がある。しかし、製造プロセスが多いこと、パターン形成にフォトマスク等の特別な道具を要することなどから作製が容易ではない。特別な道具を使用せず容易にパターンを有する温度応答性細胞培養基材を作製する手法はこれまでに報告されていない。 As a method for producing a temperature-responsive cell culture substrate having a pattern, there is a method in which a temperature-responsive region and a cell non-adhesive region are immobilized on the substrate in two stages. However, it is not easy to manufacture because there are many manufacturing processes and a special tool such as a photomask is required for pattern formation. There has been no report on a technique for easily producing a temperature-responsive cell culture substrate having a pattern without using a special tool.
本発明は、フォトマスク等の特別な道具を使用せず、容易にパターンを有する温度応答性細胞培養基材を作製する手段を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a means for easily producing a temperature-responsive cell culture substrate having a pattern without using a special tool such as a photomask.
本発明者らは、基材上に塗工液を段階的に配置して温度応答性ポリマーを架橋剤を介して基材上に固定化することにより、温度応答性領域と細胞非接着性領域のパターンを有する細胞培養基材を容易に作製できることを見出し、本発明を完成させた。 The inventors of the present invention have arranged a temperature-responsive region and a cell non-adhesive region by arranging the coating solution stepwise on the substrate and immobilizing the temperature-responsive polymer on the substrate via a crosslinking agent. The present inventors have found that a cell culture substrate having the following pattern can be easily produced and completed the present invention.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）パターンを有する温度応答性細胞培養基材の製造方法であって、
温度応答性ポリマーと架橋剤と溶媒とを含む第１塗工液を基材上に配置することにより、第１塗工液の塗膜を形成する工程、
第１塗工液の塗膜上に、架橋剤と溶媒と場合により温度応答性ポリマーとを含む第２塗工液をパターン状に配置する工程、および
基材に配置された塗工液に放射線を照射することにより温度応答性ポリマーを基材に固定化する工程
を含み、
第１塗工液が配置され第２塗工液が配置されない領域は、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な温度応答性領域を形成し、
第１塗工液と第２塗工液が配置された領域は細胞非接着性領域を形成し、
細胞非接着性領域における温度応答性ポリマーの固定化量が、温度応答性領域における温度応答性ポリマーの固定化量より高い、
前記方法。
（２）温度応答性ポリマーが、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドであり、架橋剤が、ポリアルキレングリコールジアクリレートまたはポリアルキレングリコールジメタクリレートである、（１）に記載の方法。
（３）パターンを有する温度応答性細胞培養基材であって、
基材と、基材上に架橋剤を介して固定化された温度応答性ポリマー層とを含み、
温度応答性ポリマー層が、細胞非接着性領域と、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な温度応答性領域のパターンを有し、
細胞非接着性領域における温度応答性ポリマーの固定化量が、温度応答性領域における温度応答性ポリマーの固定化量より高い、
前記細胞培養基材。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for producing a temperature-responsive cell culture substrate having a pattern,
A step of forming a coating film of the first coating liquid by disposing a first coating liquid containing a temperature-responsive polymer, a crosslinking agent, and a solvent on the substrate;
A step of arranging a second coating liquid containing a cross-linking agent, a solvent, and optionally a temperature-responsive polymer on the coating film of the first coating liquid in a pattern, and radiation applied to the coating liquid disposed on the substrate A step of immobilizing a temperature-responsive polymer on a substrate by irradiating
The region where the first coating solution is disposed and the second coating solution is not disposed forms a temperature-responsive region capable of changing from cell adhesiveness to cell non-adhesiveness due to temperature change,
The area where the first coating liquid and the second coating liquid are arranged forms a cell non-adhesive area,
The immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the non-cell-adhesive region is higher than the immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the temperature-responsive region.
Said method.
(2) The method according to (1), wherein the temperature-responsive polymer is poly-N-isopropylacrylamide, and the crosslinking agent is polyalkylene glycol diacrylate or polyalkylene glycol dimethacrylate.
(3) A temperature-responsive cell culture substrate having a pattern,
A substrate and a temperature-responsive polymer layer immobilized on the substrate via a crosslinking agent,
The temperature-responsive polymer layer has a cell non-adhesive region and a pattern of the temperature-responsive region that can be changed from cell adhesive to cell non-adhesive by temperature change,
The immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the non-cell-adhesive region is higher than the immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the temperature-responsive region.
The cell culture substrate.
本発明によれば、毒性の高いモノマーを使用しないため、製造上の安全性が高い。また、温度応答性領域と細胞非接着性領域のパターンを有する細胞培養基材を、フォトマスク等の特別な道具を使用せず容易に作製することが可能になる。 According to the present invention, since a highly toxic monomer is not used, production safety is high. In addition, a cell culture substrate having a pattern of a temperature responsive region and a cell non-adhesive region can be easily produced without using a special tool such as a photomask.
本発明は、細胞を培養して細胞シートを形成し、これを非浸襲的に回収するのに好適な、温度応答性を有する細胞培養基材であって、温度応答性領域と細胞非接着性領域のパターンを有する細胞培養基材の製造方法に関する。 The present invention is a cell culture substrate having temperature responsiveness suitable for non-invasively collecting cells by culturing cells, and comprising a temperature responsive region and a cell non-adherent The present invention relates to a method for producing a cell culture substrate having a pattern of a sex region.
一実施形態において、本発明の細胞培養基材の製造方法は、例えば、図１および図２に示すように、
温度応答性ポリマーと架橋剤と溶媒とを含む第１塗工液１を基材３上に配置することにより、第１塗工液の塗膜を形成する工程ａ、
第１塗工液の塗膜上に、架橋剤と溶媒と場合により温度応答性ポリマーとを含む第２塗工液２をパターン状に配置する工程ｂ、および
基材に配置された塗工液に放射線を照射することにより温度応答性ポリマーを基材に固定化する工程ｃ
を含む。
In one embodiment, the method for producing a cell culture substrate of the present invention includes, for example, as shown in FIG. 1 and FIG.
A step of forming a coating film of the first coating liquid by disposing a
A step b of arranging a second coating solution 2 containing a crosslinking agent, a solvent and optionally a temperature-responsive polymer on the coating film of the first coating solution in a pattern; and a coating solution arranged on the substrate Immobilizing a temperature-responsive polymer on a substrate by irradiating the substrate with radiation c
including.
そして、第１塗工液が配置され第２塗工液が配置されない領域は、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な温度応答性領域４を形成し、
第１塗工液と第２塗工液が配置された領域は細胞非接着性領域５を形成し、
細胞非接着性領域５における温度応答性ポリマーの固定化量が、温度応答性領域４における温度応答性ポリマーの固定化量より高い、
ことを特徴とする。
And the area | region where the 1st coating liquid is arrange | positioned and the 2nd coating liquid is not arrange | positioned forms the temperature-responsive area | region 4 which can change from cell adhesiveness to cell non-adhesiveness by a temperature change,
The region where the first coating solution and the second coating solution are disposed forms a cell non-adhesive region 5,
The immobilized amount of the temperature-responsive polymer in the cell non-adhesive region 5 is higher than the immobilized amount of the temperature-responsive polymer in the temperature-responsive region 4;
It is characterized by that.
細胞接着性および細胞非接着性は、一の領域と他の領域における細胞の接着度合いの相対的な関係を示すものである。細胞接着性とは、細胞が接着しやすいことをいう。細胞接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりやすいか否かで決定される。 Cell adhesion and cell non-adhesion indicate a relative relationship between the degree of cell adhesion in one region and the other region. Cell adhesion means that cells are easily adhered. Cell adhesion is determined by whether or not cell adhesion or extension is likely to occur depending on the chemical or physical properties of the surface.
細胞接着性を判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本発明における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。 As an index for determining cell adhesion, the cell adhesion spreading rate when cells are actually cultured can be used. The cell adhesive surface is preferably a surface having a cell adhesion extension rate of 60% or more, and more preferably a surface having a cell adhesion extension rate of 80% or more. If the cell adhesion extension rate is high, cells can be cultured efficiently. The cell adhesion extension rate in the present invention is such that cells to be cultured within a seeding density of 4000 cells / cm 2 or more and less than 30000 cells / cm 2 are seeded on the surface to be measured, and in an incubator at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%. It is defined as the ratio of cells that have adhered and spread when cultured for 14.5 hours ({(number of cells adhered) / (number of cells seeded)} × 100 (%)).
一方、細胞非接着性とは、細胞が接着しにくい性質をいう。細胞非接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりにくいか否かで決定される。細胞非接着性の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が６０％未満の表面であることが好ましく、４０％未満の表面であることがより好ましく、５％以下の表面であることが更に好ましく、２％以下の表面であることが最も好ましい。 On the other hand, cell non-adhesiveness refers to the property that cells are difficult to adhere. Cell non-adhesiveness is determined by whether or not cell adhesion or extension is unlikely to occur due to the chemical or physical properties of the surface. The non-cell-adhesive surface is preferably a surface having a cell adhesion extension rate as defined above of less than 60%, more preferably less than 40%, and even more preferably 5% or less. The surface is preferably 2% or less, and most preferably.
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは細胞培養温度下（通常、３７℃程度）において疎水性を示し、培養した細胞シートの回収時の温度下において親水性を示すものである。なお、温度応答性ポリマーが、疎水性から親水性に変化する温度（水に対する臨界溶解温度（Ｔ））としては、特に限定されないが、培養後の細胞シートの回収の容易さの観点からは、細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。このような温度応答性ポリマー成分を含むことで、細胞培養時においては、細胞の足場（細胞接着性領域）が充分に確保されるため細胞培養を効率よく行うことができる。その一方、培養後の細胞シートの回収時においては、疎水性部分を親水性に変化させ、細胞非接着性に変化させることにより、培養された細胞シートを細胞培養基材から分離させることで、細胞シートの回収をより一層容易にすることができる。特に所定の臨界溶解温度未満の温度で親水性を示し、同温度以上の温度で疎水性を示す温度応答性ポリマーが好ましい。このような温度応答性ポリマーにおける臨界溶解温度を特に下限臨界溶解温度と呼ぶ。 The temperature-responsive polymer that can be suitably used in the present invention is hydrophobic at the cell culture temperature (usually about 37 ° C.) and hydrophilic at the temperature at the time of recovering the cultured cell sheet. The temperature at which the temperature-responsive polymer changes from hydrophobic to hydrophilic (critical solution temperature in water (T)) is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of recovery of the cell sheet after culture, The temperature is preferably lower than the cell culture temperature. By including such a temperature-responsive polymer component, a cell scaffold (cell adhesive region) is sufficiently secured during cell culture, so that cell culture can be performed efficiently. On the other hand, at the time of recovering the cell sheet after culturing, by changing the hydrophobic part to hydrophilic and changing to cell non-adhesive, the cultured cell sheet is separated from the cell culture substrate, The collection of the cell sheet can be further facilitated. In particular, a temperature-responsive polymer that exhibits hydrophilicity at a temperature lower than a predetermined critical dissolution temperature and exhibits hydrophobicity at a temperature equal to or higher than the same temperature is preferable. The critical solution temperature in such a temperature-responsive polymer is particularly called the lower critical solution temperature.
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーは具体的には下限臨界溶解温度Ｔが０〜８０℃、好ましくは０〜５０℃であるポリマーが好ましい。Ｔが８０℃を超えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。またＴが０℃より低いと、一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため好ましくない。そのような好適なポリマーとしてはアクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適なポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、およびポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。さらに、ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリメチルビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のアルキル置換セルロース誘導体や、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体や、ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体が挙げられる。これらのポリマーとその他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、あるいは他のポリマーとの混合物を用いてもよい。 Specifically, the temperature-responsive polymer that can be suitably used in the present invention is preferably a polymer having a lower critical solution temperature T of 0 to 80 ° C, preferably 0 to 50 ° C. It is not preferable that T exceeds 80 ° C. because cells may die. If T is lower than 0 ° C., the cell growth rate is generally extremely reduced, or the cells are killed, which is not preferable. Such suitable polymers include acrylic polymers or methacrylic polymers. Specific suitable polymers include, for example, poly-N-isopropylacrylamide (T = 32 ° C.), poly-Nn-propyl acrylamide (T = 21 ° C.), poly-Nn-propyl methacrylamide (T = 32 ° C.), poly-N-ethoxyethyl acrylamide (T = about 35 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl acrylamide (T = about 28 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (T = about 35 ° C.) ), And poly-N, N-diethylacrylamide (T = 32 ° C.). Furthermore, poly-N-ethylacrylamide, poly-N-isopropylmethacrylamide, poly-N-cyclopropylacrylamide, poly-N-cyclopropylmethacrylamide, poly-N-acryloylpyrrolidine, poly-N-acryloylpiperidine, polymethyl Examples include alkyl-substituted cellulose derivatives such as vinyl ether, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyalkylene oxide block copolymers represented by block copolymers of polypropylene oxide and polyethylene oxide, and polyalkylene oxide block copolymers. Can be mentioned. Graft or block copolymers of these polymers with other polymers, or mixtures with other polymers may be used.
温度応答性ポリマーの重量平均分子量は、特に制限されないが、１００万以下であることが好ましく、６０万以下であることがより好ましく、４０万以下であることが特に好ましく、かつ５０００以上であることが好ましい。分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、１〜６程度であることが好ましい。重量平均分子量が１００万を超えると粘度が著しく高くなるため、ポリマーの重合中の溶剤の撹拌や再沈殿などのポリマーの精製作業に支障がでる、あるいは希釈剤として用いる水や有機溶媒が多量に必要となる場合があり、また、重量平均分子量が５０００を下回ると耐水性や耐熱性が低下する場合がある。 The weight average molecular weight of the temperature-responsive polymer is not particularly limited, but is preferably 1,000,000 or less, more preferably 600,000 or less, particularly preferably 400,000 or less, and 5000 or more. Is preferred. The dispersity (weight average molecular weight / number average molecular weight) is preferably about 1 to 6. When the weight average molecular weight exceeds 1,000,000, the viscosity becomes extremely high, which may hinder the purification of the polymer such as stirring and reprecipitation of the solvent during polymerization of the polymer, or a large amount of water or organic solvent used as a diluent. It may be necessary, and when the weight average molecular weight is less than 5000, water resistance and heat resistance may be lowered.
架橋剤としては、放射線反応性官能基を２以上有する架橋剤が好ましく用いられる。放射線反応性官能基を２以上有する架橋剤として、好ましくは上記温度応答性ポリマーを形成するモノマーとは異なるものを用いる。例えば、温度応答性ポリマーとしてポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを用いる場合、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド以外の架橋剤を用いる。それにより、製造上のモノマーによる毒性の問題を回避できるとともに、機器分析による架橋点の数の定量が容易となる。 As the crosslinking agent, a crosslinking agent having two or more radiation-reactive functional groups is preferably used. As the crosslinking agent having two or more radiation-reactive functional groups, a different one from the monomer that forms the temperature-responsive polymer is preferably used. For example, when poly-N-isopropylacrylamide is used as the temperature-responsive polymer, a crosslinking agent other than N-isopropylacrylamide is used. Thereby, the problem of toxicity due to the monomer in production can be avoided, and the number of crosslinking points can be easily determined by instrumental analysis.
放射線反応性官能基、例えば電子線反応性官能基は、放射線（例えば電子線）を照射することにより、基材に共有結合で結合することができるものであれば特に制限されない。放射線反応性官能基は、高エネルギー照射下でラジカルを形成することができる部分であり、放射線源にさらされるとフリーラジカルを発生し、架橋およびグラフトを達成する。放射線反応性官能基は、用いる温度応答性ポリマーにより適宜選択されるが、例えば、アクリロイル基、メタクリロイル基、アクリルアミド基、メタクリルアミド基、アジ基、一級、二級または三級の脂肪族基、脂環式基、ベンジル基などの芳香族基などが挙げられる。架橋剤は、これらの放射線反応性官能基を１種類のみ有するものでもよいし、複数種有するものでもよい。 A radiation-reactive functional group, for example, an electron beam-reactive functional group, is not particularly limited as long as it can be covalently bonded to a substrate by irradiation with radiation (for example, an electron beam). Radiation-reactive functional groups are moieties that can form radicals under high energy irradiation, generate free radicals when exposed to a radiation source, and achieve crosslinking and grafting. The radiation-reactive functional group is appropriately selected depending on the temperature-responsive polymer to be used. For example, acryloyl group, methacryloyl group, acrylamide group, methacrylamide group, azide group, primary, secondary or tertiary aliphatic group, fatty acid An aromatic group such as a cyclic group and a benzyl group is exemplified. The crosslinking agent may have only one kind of these radiation-reactive functional groups, or may have a plurality of kinds.
架橋剤は、放射線反応性官能基を２以上、好ましくは２つ有する。放射線反応性官能基を２以上有する架橋剤を用いることにより、放射線照射により、架橋剤が、温度応答性ポリマーと基材の双方と共有結合を形成することができ、温度応答性ポリマーを基材に対し強固に固定化することができる。また、架橋剤が有する放射線反応性官能基の数を２とすることで、複数の分岐を持たない、より制御された表面を作製することが可能となる。 The cross-linking agent has two or more, preferably two, radiation-reactive functional groups. By using a cross-linking agent having two or more radiation-reactive functional groups, the cross-linking agent can form a covalent bond with both the temperature-responsive polymer and the base material by irradiation, and the temperature-responsive polymer is used as the base material. Can be firmly fixed. Further, by setting the number of radiation-reactive functional groups of the crosslinking agent to 2, it is possible to produce a more controlled surface that does not have a plurality of branches.
架橋剤の具体例として、ポリアルキレングリコール末端のヒドロキシル基に放射線反応性官能基が直接的または間接的に（リンカーを介して）導入された化合物が挙げられる。ポリアルキレングリコールは、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、すべての末端のヒドロキシル基に放射線反応性官能基が導入されていてもよく、一部の末端のヒドロキシル基に放射線反応性官能基が導入されていてもよい。 Specific examples of the crosslinking agent include compounds in which a radiation-reactive functional group is introduced directly or indirectly (via a linker) into a hydroxyl group at the end of a polyalkylene glycol. Polyalkylene glycol may be linear or branched, and may have a radiation-reactive functional group introduced at all terminal hydroxyl groups, or a radiation-reactive functional group introduced at some terminal hydroxyl groups. May be.
ポリアルキレングリコールの具体例としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられ、架橋剤の好ましい具体例としては、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレートなどが挙げられる。ポリエチレングリコールは細胞培養用途での使用実績が多いため、ポリエチレングリコール鎖が培養基材表面に導入されることによる細胞培養用途への悪影響の懸念が少ない。また、ポリエチレングリコールは細胞非接着性の物質として知られているため、導入量を変化させることで、細胞の接着性を制御することが可能となる。 Specific examples of the polyalkylene glycol include polyethylene glycol, polypropylene glycol, and a copolymer of ethylene glycol and propylene glycol. Preferred specific examples of the crosslinking agent include polyethylene glycol diacrylate and polyethylene glycol dimethacrylate. Since polyethylene glycol has many uses in cell culture applications, there are few concerns about adverse effects on cell culture applications due to the introduction of polyethylene glycol chains on the surface of the culture substrate. In addition, since polyethylene glycol is known as a non-cell-adhesive substance, it is possible to control cell adhesion by changing the amount of introduction.
架橋剤の別の例として、ビスアクリルアミド系架橋剤が挙げられる。ビスアクリルアミド系架橋剤は、（メタ）アクリルアミド基を２つ有する２官能性架橋剤である。（メタ）アクリルアミド基には、アクリルアミド基とメタクリルアミド基が含まれる。ビスアクリルアミド系架橋剤の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−１，２−ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。特に、溶剤への溶解性の観点から、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが好ましい。ビスアクリルアミド系架橋剤を用いることにより、放射線照射により、架橋剤が、温度応答性ポリマーと基材の双方と共有結合を形成することができ、温度応答性ポリマーを基材に対し強固に固定化することができる。 Another example of the crosslinking agent is a bisacrylamide-based crosslinking agent. The bisacrylamide-based crosslinking agent is a bifunctional crosslinking agent having two (meth) acrylamide groups. The (meth) acrylamide group includes an acrylamide group and a methacrylamide group. Specific examples of the bisacrylamide-based crosslinking agent include N, N′-methylenebisacrylamide, N, N′-methylenebismethacrylamide, N, N′-ethylenebisacrylamide, N, N′-ethylenebismethacrylamide, N , N′-1,2-dihydroxyethylenebisacrylamide, N, N′-hexamethylenebisacrylamide and the like. In particular, N, N′-methylenebisacrylamide is preferable from the viewpoint of solubility in a solvent. By using a bisacrylamide-based cross-linking agent, the cross-linking agent can form a covalent bond with both the temperature-responsive polymer and the substrate by irradiation, and the temperature-responsive polymer is firmly fixed to the substrate. can do.
ビスアクリルアミド系架橋剤は、エステル結合を持たず、加水分解に対して安定な架橋構造を形成することから、長期保存に適した安定な温度応答性ポリマー層を形成することができる。また、ビスアクリルアミド系架橋剤は低分子架橋剤であるため、長鎖の架橋剤に比べて反応性がゆるやかであり、良好な基材を製造するための濃度範囲を広く設定でき、製造管理がしやすくなる利点がある。 Since the bisacrylamide-based crosslinking agent does not have an ester bond and forms a crosslinked structure that is stable against hydrolysis, a stable temperature-responsive polymer layer suitable for long-term storage can be formed. In addition, since bisacrylamide-based cross-linking agents are low molecular cross-linking agents, their reactivity is moderate compared to long-chain cross-linking agents, and a wide concentration range can be set for manufacturing a good base material. There is an advantage that it becomes easy to do.
架橋剤のさらに別の例として、例えば、エトキシ化グリセリンジアクリレート、エトキシ化グリセリントリアクリレート、エトキシ化グリセリンジメタクリレート、およびエトキシ化グリセリントリメタクリレートなどが挙げられる。 Further examples of the crosslinking agent include, for example, ethoxylated glycerol diacrylate, ethoxylated glycerol triacrylate, ethoxylated glycerol dimethacrylate, and ethoxylated glycerol trimethacrylate.
第１塗工液は、温度応答性ポリマーと架橋剤を、溶媒に溶解することにより調製できる。第２塗工液は、架橋剤を、溶媒に溶解することにより調製できる。第２塗工液はさらに温度応答性ポリマーを含んでいてもよい。溶媒は、特に制限はないが、常庄下において沸点１２０℃以下、特に６０〜１１０℃のものが好ましい。好ましい溶媒としては、具体的にはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、および水等が挙げられ、これらは組み合わせて使用してもよい。その他の溶媒、例えば１−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−ブトキシエタノール、およびエチレン（もしくはジエチレン）グリコールまたはそのモノエチルエーテル等も使用可能であるが、好ましくはメタノール、エタノール、ｉ−プロパノールを用いる。ｉ−プロパノールは薄膜に塗布することで室温にて容易に揮発するため、特段の乾燥工程なしに、塗膜を形成できる点で好ましい。また、メタノール、エタノール、ｉ−プロパノールは、基材として細胞培養に汎用されるポリスチレンを選択した場合において表面を侵さないため好ましい。必要であれば、塗工液にはその他添加剤として、硫酸等で代表される酸類、モール塩等を配合してよい。 The first coating liquid can be prepared by dissolving a temperature-responsive polymer and a crosslinking agent in a solvent. The second coating liquid can be prepared by dissolving the crosslinking agent in a solvent. The second coating liquid may further contain a temperature-responsive polymer. The solvent is not particularly limited, but a solvent having a boiling point of 120 ° C. or lower, particularly 60 to 110 ° C. under ordinary conditions is preferable. Specific examples of preferred solvents include methanol, ethanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol, 2-butanol, and water, and these may be used in combination. Other solvents such as 1-pentanol, 2-ethyl-1-butanol, 2-butoxyethanol, and ethylene (or diethylene) glycol or monoethyl ether thereof can be used, but preferably methanol, ethanol, i -Propanol is used. Since i-propanol volatilizes easily at room temperature when applied to a thin film, i-propanol is preferable in that a coating film can be formed without a special drying step. Moreover, methanol, ethanol, and i-propanol are preferable because they do not attack the surface when polystyrene, which is widely used for cell culture, is selected as the base material. If necessary, an acid represented by sulfuric acid or the like, a Mole salt, or the like may be added to the coating solution as other additives.
第１塗工液における温度応答性ポリマーの濃度は、好ましくは０．４重量％以上、より好ましくは１重量％以上、さらに好ましくは２重量％以上であり、好ましくは８重量％以下、より好ましくは６重量％以下、さらに好ましくは４重量％以下である。 The concentration of the temperature-responsive polymer in the first coating liquid is preferably 0.4% by weight or more, more preferably 1% by weight or more, still more preferably 2% by weight or more, preferably 8% by weight or less, more preferably Is 6% by weight or less, more preferably 4% by weight or less.
第１塗工液における架橋剤の濃度は、好ましくは０．０２４重量％以上、より好ましくは０．０５０重量％以上であり、好ましくは０．４重量％以下、より好ましくは０．３６重量％以下、さらに好ましくは０．２５重量％以下である。 The concentration of the crosslinking agent in the first coating liquid is preferably 0.024% by weight or more, more preferably 0.050% by weight or more, preferably 0.4% by weight or less, more preferably 0.36% by weight. Hereinafter, it is more preferably 0.25% by weight or less.
第２塗工液における架橋剤の濃度は、第１塗工液における架橋剤の濃度との合計が、好ましくは０．３重量％以上、より好ましくは０．３５重量％以上であり、好ましくは１重量％以下、より好ましくは０．７重量％以下となるように調整する。第１塗工液と第２塗工液の合計の架橋剤の濃度を一定以上とすることで、温度応答性ポリマーを過剰に固定化させることができ、細胞非接着性の領域を形成することができる。 The concentration of the crosslinking agent in the second coating solution is preferably 0.3% by weight or more, more preferably 0.35% by weight or more, preferably the sum of the concentration of the crosslinking agent in the first coating solution. It is adjusted to be 1% by weight or less, more preferably 0.7% by weight or less. By making the concentration of the total cross-linking agent of the first coating solution and the second coating solution a certain level or more, the temperature-responsive polymer can be immobilized excessively and a cell non-adhesive region can be formed. Can do.
架橋剤を含む第２塗工液は、温度応答性ポリマーを含まない場合でも、第１塗工液に含まれる温度応答性ポリマーと第２塗工液に含まれる架橋剤とがさらに反応することにより、第２塗工液が配置されない領域と比較して、温度応答性ポリマーの固定化量を高めることができ、細胞非接着領域を形成することができる。 Even when the second coating liquid containing the crosslinking agent does not contain the temperature-responsive polymer, the temperature-responsive polymer contained in the first coating liquid and the crosslinking agent contained in the second coating liquid are further reacted. Thereby, compared with the area | region where a 2nd coating liquid is not arrange | positioned, the fixed amount of a temperature-responsive polymer can be raised, and a cell non-adhesion area | region can be formed.
第２塗工液が温度応答性ポリマーを含む場合、その濃度は、第１塗工液における温度応答性ポリマーの濃度との合計が、１．５重量％以上、好ましくは２重量％以上であり、好ましくは８重量％以下、より好ましくは６重量％以下、さらに好ましくは４重量％以下となるように調整する。第２塗工液における温度応答性ポリマーの濃度を一定以上とすることにより、架橋剤が少ない場合でも、温度応答性ポリマーを過剰に固定化させることができ、細胞非接着性の領域を形成することができる。また、第２塗工液における温度応答性ポリマーの濃度を一定以下とすることにより、塗工液の粘度を制御でき、塗工液の均一な膜を容易に形成することができる。 When the second coating liquid contains a temperature responsive polymer, the total concentration of the second coating liquid and the temperature responsive polymer in the first coating liquid is 1.5% by weight or more, preferably 2% by weight or more. , Preferably 8% by weight or less, more preferably 6% by weight or less, and further preferably 4% by weight or less. By setting the concentration of the temperature-responsive polymer in the second coating liquid to a certain level or more, the temperature-responsive polymer can be excessively immobilized even when the amount of the cross-linking agent is small, and a cell non-adhesive region is formed. be able to. Moreover, the viscosity of a coating liquid can be controlled by making the density | concentration of the temperature-responsive polymer in a 2nd coating liquid below fixed, and a uniform film | membrane of a coating liquid can be formed easily.
基材は、その表面が、架橋剤の放射線反応性官能基と放射線照射により共有結合し得る材料を含むものであることが好ましい。表面のみが、放射線反応性官能基と放射線照射により共有結合し得る材料を含むものであってもよいし、基材の全部がそのような材料を含むものであってもよい。このような基材の材料は、通常細胞培養に用いられるガラス類、プラスチック類、セラミックス、金属等が挙げられるが、細胞培養が可能な材料であれば特に限定されない。基材の表面または中間層に本発明の目的を妨げない限り任意の層を設けてもよいし、任意の処理を施してもよい。例えば、基材表面にオゾン処理、プラズマ処理、スパッタリング等の処理技術を用いて親水化を施すことができる。 The substrate preferably contains a material whose surface can be covalently bonded to the radiation-reactive functional group of the cross-linking agent by irradiation. Only the surface may contain a material that can be covalently bonded to the radiation-reactive functional group by irradiation, or the entire substrate may contain such a material. Examples of the material for the base material include glasses, plastics, ceramics, metals, and the like that are usually used for cell culture, but are not particularly limited as long as the material can be used for cell culture. An arbitrary layer may be provided on the surface of the substrate or the intermediate layer as long as the object of the present invention is not hindered, and an arbitrary treatment may be performed. For example, the substrate surface can be hydrophilized using a treatment technique such as ozone treatment, plasma treatment, sputtering, or the like.
基材を構成する材料であって、それ自体が放射線反応性官能基と共有結合を形成し得るものとしては、ポリスチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、ウレタンアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、ポリアミド(ナイロン)、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム、ポリシリコンを含有するシリコンゴム等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。 Materials that make up the substrate and can themselves form covalent bonds with radiation-reactive functional groups include polystyrene, low density polyethylene, medium density polyethylene, high density polyethylene, polyurethane, urethane acrylate, polymethyl Examples thereof include acrylic resins such as methacrylate, polyamide (nylon), polycarbonate, natural rubber having a conjugated bond, synthetic rubber having a conjugated bond, and silicon rubber containing polysilicon. The substrate may be composed of a blend polymer or polymer alloy containing two or more of these materials.
放射線反応性官能基と共有結合するように表面処理された基材としては、表面が易接着処理されたポリエチレンテレフタレート、表面がコロナ処理またはプラズマ処理された合成樹脂、表面がウレタンアクリレート等のアクリル系樹脂により被覆された合成樹脂等が挙げられる。基材はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。合成樹脂としてはナイロン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン等が挙げられる。合成樹脂はこれらの材料を２種以上含むブレンドポリマーまたはポリマーアロイからなるものであってもよい。 The base material surface-treated so as to be covalently bonded to the radiation-reactive functional group includes polyethylene terephthalate whose surface is easily adhered, synthetic resin whose surface is corona-treated or plasma-treated, and acrylic surface such as urethane acrylate. Examples thereof include a synthetic resin coated with a resin. The substrate may be composed of a blend polymer or polymer alloy containing two or more of these materials. Examples of the synthetic resin include nylon, low density polyethylene, medium density polyethylene, polypropylene or polyethylene terephthalate, polycarbonate, polystyrene, and the like. The synthetic resin may be composed of a blend polymer or polymer alloy containing two or more of these materials.
基材の形状としては、ディッシュ形状、フィルム形状、多孔質形状などが挙げられる。フィルム形状基材を用いる場合、フィルム形状基材表面に温度応答性ポリマーと架橋剤の層を形成した後、細胞培養に適した形状（例えばディッシュ形状）に加工することができる。また、ディッシュ形状の容器の細胞培養面に、フィルム形状の基材を接着剤などにより貼り付けてもよい。加工の際は、必要に応じて他の材料からなる部材を前記基材と組み合わせて使用することもできる。ディッシュ形状基材を用いる場合、少なくとも細胞接着面となるディッシュ内底面部分が温度応答性ポリマーと架橋剤の層により被覆されればよい。 Examples of the shape of the substrate include a dish shape, a film shape, and a porous shape. When a film-shaped substrate is used, a layer of a temperature-responsive polymer and a crosslinking agent is formed on the surface of the film-shaped substrate, and then processed into a shape suitable for cell culture (for example, a dish shape). Further, a film-shaped substrate may be attached to the cell culture surface of the dish-shaped container with an adhesive or the like. In processing, a member made of another material can be used in combination with the base material as necessary. When using a dish-shaped substrate, it is only necessary that at least the inner bottom portion of the dish serving as the cell adhesion surface is covered with a layer of a temperature-responsive polymer and a crosslinking agent.
本発明で用いる基材としては、細胞培養において実績のある、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、多孔質ポリエチレンテレフタレート、多孔質ポリカーボネートが特に適している。 As the substrate used in the present invention, polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, porous polyethylene terephthalate, and porous polycarbonate, which have a proven record in cell culture, are particularly suitable.
第１塗工液を配置することにより基材上に形成する塗膜の塗布量は温度応答性ポリマーが機能（例えば温度応答性）を発揮するのに必要な塗布量であればよい。具体的には、塗膜が乾固した後の重量（すなわち、温度応答性ポリマーと架橋剤の合計重量）で、３０ｍｇ／ｍ２以上あればよいが、より好ましくは４０ｍｇ／ｍ２以上が望ましい。上限は特にないが、２００ｍｇ／ｍ２未満が好ましく、１００ｍｇ／ｍ２以下がより好ましい。塗布量が２００ｍｇ／ｍ２以上である場合には、厚みが増して塗膜厚が安定しないこと、厚みが増して放射線の貫通・照射量が安定しないこと、並びに照射エネルギーに由来する膜内の対流によりポリマーの被覆量にムラが生じる場合がある。また、遊離のポリマーを洗浄するための洗浄時間を短くするためには塗膜量は１００ｍｇ／ｍ２以下が望ましい。 The coating amount of the coating film formed on the substrate by disposing the first coating solution may be a coating amount necessary for the temperature-responsive polymer to exhibit a function (for example, temperature responsiveness). Specifically, the weight after the coating film dries (that is, the total weight of the temperature-responsive polymer and the crosslinking agent) may be 30 mg / m 2 or more, more preferably 40 mg / m 2 or more. . There is no particular upper limit, but it is preferably less than 200 mg / m 2 and more preferably 100 mg / m 2 or less. When the coating amount is 200 mg / m 2 or more, the thickness is increased and the coating thickness is not stable, the thickness is increased and the radiation penetration / irradiation amount is not stable, and in the film derived from the irradiation energy Convection may cause unevenness in the coating amount of the polymer. In order to shorten the washing time for washing the free polymer, the coating amount is desirably 100 mg / m 2 or less.
第１塗工液の基材への小面積への塗布方法としては公知のいずれの方法でもよく、例えばスピンコーター、バーコーター等による塗布法、噴霧塗布法等が挙げられる。大面積への塗布方法としてはブレードコーティング法、グラビアコーティング法、ロッドコーティング法、ナイフコーディング法、リバースロールコーティング法、オフセットグラビアコーティング法等が使用できる。 As a method for applying the first coating liquid to the substrate on a small area, any known method may be used, and examples thereof include a coating method using a spin coater, a bar coater, and the like, and a spray coating method. As a coating method for a large area, a blade coating method, a gravure coating method, a rod coating method, a knife coding method, a reverse roll coating method, an offset gravure coating method and the like can be used.
ベタ形成においては、グラビアコート法、ロールコート法、スロットコート法、キスコート法、スプレーコート法、ファウンテンコーティング法等公知のコーティング法を用いることが出来る。塗布方法として連続のコート法または印刷法を使用することもできる。連続のコート法または印刷法としては、具体的にはホットメルトコート、ホットラッカーコート、グラビアダイレクトコート、グラビアリバースコート、ダイコート、マイクログラビアコート、スライドコート、スリットリバースコート、カーテンコート、ナイフコート、エアコート、ロールコート等の塗布方法が使用できるが、これらは例示に過ぎず、当業者であれば適用可能なものを使用することができる。 In the solid formation, a known coating method such as a gravure coating method, a roll coating method, a slot coating method, a kiss coating method, a spray coating method, or a fountain coating method can be used. As a coating method, a continuous coating method or a printing method can also be used. Specifically, the continuous coating method or printing method includes hot melt coating, hot lacquer coating, gravure direct coating, gravure reverse coating, die coating, micro gravure coating, slide coating, slit reverse coating, curtain coating, knife coating, and air coating. Application methods such as roll coating can be used, but these are merely examples, and those skilled in the art can use those applicable.
第２塗工液は、好ましくは第１塗工液の塗膜が乾燥した後に、より好ましくは第１塗工液の塗膜が乾固した後に、当該塗膜の上に配置する。第２塗工液を配置することにより基材上に形成する塗膜の塗布量は、細胞非接着性を発揮するのに必要な塗布量であればよい。具体的には、第１塗工液と第２塗工液の塗膜が乾固した後の合計重量（すなわち、第１塗工液と第２塗工液における温度応答性ポリマーと架橋剤の合計重量）で、３０ｍｇ／ｍ２以上あればよいが、より好ましくは４０ｍｇ／ｍ２以上が望ましい。上限については、第１塗工液単独の場合と同様である。 The second coating liquid is preferably disposed on the coating film after the coating film of the first coating liquid is dried, more preferably after the coating film of the first coating liquid is dried. The coating amount of the coating film formed on the substrate by disposing the second coating solution may be a coating amount necessary for exhibiting cell non-adhesiveness. Specifically, the total weight after the coating films of the first coating liquid and the second coating liquid are dried (that is, the temperature-responsive polymer and the crosslinking agent in the first coating liquid and the second coating liquid). The total weight) may be 30 mg / m 2 or more, more preferably 40 mg / m 2 or more. The upper limit is the same as that for the first coating liquid alone.
第２塗工液を、第１塗工液の塗膜上にパターン状に配置する方法としては公知のいずれの方法でもよく、例えばスピンコーター、バーコーター等による塗布法、噴霧塗布法等が挙げられる。グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法等の公知の印刷法を用いてもよい。第２塗工液を、第１塗工液の塗膜の一部に滴下することにより、第２塗工液をパターン状に配置してもよい。 As a method for arranging the second coating liquid in a pattern on the coating film of the first coating liquid, any known method may be used, and examples thereof include a coating method using a spin coater, a bar coater, and the like, and a spray coating method. It is done. A known printing method such as a gravure printing method, a screen printing method, or an offset printing method may be used. You may arrange | position a 2nd coating liquid in a pattern form by dripping a 2nd coating liquid in a part of coating film of a 1st coating liquid.
第２塗工液を配置するパターンは、二次元のパターンであれば特に制限されず、培養する細胞の種類、形成させる組織等によって選択することができる。例えば、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状、格子状、円形、四角形のパターン、円形および四角形等の図形の形状、あるいは上記図形が切り抜かれた形状（開口を有する形状）などが挙げられる。第１塗工液が配置され第２塗工液が配置されない領域は、温度応答性領域を形成し、第１塗工液と第２塗工液が配置された領域は細胞非接着性領域を形成することから、上記のパターン配置により、第２塗工液が配置された領域が細胞非接着性領域のパターンとなり、第２塗工液が配置されず第１塗工液のみが配置された領域が温度応答性領域となる。 The pattern in which the second coating solution is disposed is not particularly limited as long as it is a two-dimensional pattern, and can be selected depending on the type of cells to be cultured, the tissue to be formed, and the like. For example, a line shape, a tree shape (dendritic shape), a mesh shape, a lattice shape, a circular shape, a quadrangular pattern, a shape of a shape such as a circle and a quadrangle, or a shape in which the shape is cut out (a shape having an opening). It is done. The region where the first coating solution is disposed and the second coating solution is not disposed forms a temperature-responsive region, and the region where the first coating solution and the second coating solution are disposed is a cell non-adhesive region. From the formation, by the above pattern arrangement, the area where the second coating liquid is arranged becomes the pattern of the cell non-adhesive area, and the second coating liquid is not arranged and only the first coating liquid is arranged. The region becomes a temperature responsive region.
本発明の方法は、上記のとおり基材上に配置された温度応答性ポリマーおよび架橋剤に放射線を照射して、基材表面と温度応答性ポリマーとの架橋剤を介した結合反応を進行させる放射線照射工程を含む。ここでいう結合反応は、放射線照射によって、基材と架橋剤との間の共有結合や、架橋剤と温度応答性ポリマーとの間の共有結合が、放射線反応性官能基を介して形成される反応をさす。 In the method of the present invention, radiation is applied to the temperature-responsive polymer and the crosslinking agent disposed on the substrate as described above, and the binding reaction between the substrate surface and the temperature-responsive polymer via the crosslinking agent proceeds. Including a radiation irradiation step. As for the coupling reaction here, a covalent bond between the substrate and the crosslinking agent and a covalent bond between the crosslinking agent and the temperature-responsive polymer are formed through radiation-reactive functional groups by irradiation with radiation. Refers to a reaction.
放射線の照射は、第１塗工液、第２塗工液がともに乾固した後に実施することが好ましい。使用する放射線としては、α線、β線、γ線、電子線、紫外線等がある。本発明においては、γ線と電子線がエネルギー効率の点から好ましく、特に生産性の点から電子線が好ましい。紫外線に関しては適当な重合開始剤や基材とのアンカー剤を組合せることで使用できる。放射線の線量の範囲は、電子線であれば５０ｋＧｙ〜５００ｋＧｙが好ましく、８０ｋＧｙ〜３００ｋＧｙがより好ましい。照射する放射線の線量を一定以上とすることにより、温度応答性ポリマーを基材に固定化させるのに十分な量のラジカルを発生させることができる。照射する放射線の線量を一定以下とすることにより、基材へのダメージを抑制でき、また、過剰に温度応答性ポリマーが基材に固定化されるのを防ぐことができる。 The irradiation with radiation is preferably carried out after both the first coating liquid and the second coating liquid are dried. Examples of the radiation used include α rays, β rays, γ rays, electron beams, ultraviolet rays, and the like. In the present invention, γ rays and electron beams are preferable from the viewpoint of energy efficiency, and electron beams are particularly preferable from the viewpoint of productivity. With respect to ultraviolet rays, it can be used by combining an appropriate polymerization initiator and an anchor agent with a substrate. The range of the radiation dose is preferably 50 kGy to 500 kGy, more preferably 80 kGy to 300 kGy if it is an electron beam. By setting the dose of radiation to be irradiated to a certain level or more, a sufficient amount of radicals can be generated to fix the temperature-responsive polymer to the substrate. By setting the dose of radiation to be irradiated to a certain value or less, damage to the substrate can be suppressed, and the temperature-responsive polymer can be prevented from being excessively immobilized on the substrate.
放射線の照射としては、加速電圧の低い装置による電子線の照射が好ましい。加速電圧の低い装置は、小さく価格も安価であるため、コストの観点からも有利である。照射する電子線の線量を一定以上とすることにより、加速電圧が低い場合でも、乾固する前の塗工液の塗膜であっても十分な量のラジカルを発生させることができ、温度応答性ポリマーを基材表面に十分な量で固定化することが可能である。電子線照射における加速電圧は、好ましくは３００ｋＶ以下、より好ましくは２００ｋＶ以下である。 As the irradiation of radiation, irradiation of an electron beam by a device having a low acceleration voltage is preferable. A device with a low accelerating voltage is advantageous from the viewpoint of cost because it is small and inexpensive. By making the dose of the electron beam to be irradiated above a certain level, even when the acceleration voltage is low, a sufficient amount of radicals can be generated even in the coating liquid of the coating liquid before drying, and the temperature response It is possible to fix the functional polymer to the substrate surface in a sufficient amount. The acceleration voltage in electron beam irradiation is preferably 300 kV or less, more preferably 200 kV or less.
放射線照射後は、基材を洗浄することにより未反応の塗工液を除去する洗浄工程を更に実施することが好ましい。上述の各工程を経て形成された細胞培養基材には、溶媒だけでなく、固定化されていない遊離のポリマー分子や、未反応の架橋剤等が存在している。洗浄工程により、これらを除去することができる。洗浄方法としては特に限定されないが、典型的には、高圧水洗、浸漬洗浄、遥動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄等が挙げられる。また洗浄液としては典型的には各種水系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、酸・アルカリ洗浄液が挙げられる。洗浄方法と洗浄液の組み合わせは洗浄される細胞培養基材に応じて適宜選択すればよい。 After the irradiation, it is preferable to further carry out a cleaning step of removing the unreacted coating liquid by cleaning the substrate. The cell culture substrate formed through the above-described steps includes not only a solvent but also free polymer molecules that are not immobilized, an unreacted crosslinking agent, and the like. These can be removed by a washing process. Although it does not specifically limit as a washing | cleaning method, Typically, high-pressure water washing, immersion washing, swing washing, shower washing, spray washing, ultrasonic washing, etc. are mentioned. The cleaning liquid typically includes various water-based, alcohol-based, hydrocarbon-based, chlorine-based, acid / alkali cleaning liquids. The combination of the washing method and the washing solution may be appropriately selected according to the cell culture substrate to be washed.
洗浄後の細胞培養基材は、乾燥させることが好ましい。乾燥方法としては特に限定されないが、典型的にはドライエア乾燥法、熱風（温風）乾燥法、（遠）赤外乾燥法などが挙げられる。 The cell culture substrate after washing is preferably dried. Although it does not specifically limit as a drying method, Typically, a dry air drying method, a hot air (warm air) drying method, a (far) infrared drying method etc. are mentioned.
上記のようにして得られた細胞培養基材は、
基材と、基材上に架橋剤を介して固定化された温度応答性ポリマー層とを含み、
温度応答性ポリマー層が、細胞非接着性領域と、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な温度応答性領域のパターンを有し、
細胞非接着性領域における温度応答性ポリマーの固定化量が、温度応答性領域における温度応答性ポリマーの固定化量より高いことを特徴とする。第１塗工液のみが配置された領域に放射線を照射することにより、温度応答性ポリマーが適当な量で固定化され、温度応答性領域が形成される。一方、第１塗工液の塗膜上にさらに第２塗工液を配置した上で放射線を照射することにより、温度応答性ポリマーが過剰な量で固定化され、細胞非接着性領域が形成される。温度応答性ポリマーの固定化量とは、単位面積あたりの温度応答性ポリマーの量をさす。このような温度応答性ポリマーの固定化量は、フーリエ変換赤外分光計全反射法（ＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ法）を利用して求めることができる。
The cell culture substrate obtained as described above is
A substrate and a temperature-responsive polymer layer immobilized on the substrate via a crosslinking agent,
The temperature-responsive polymer layer has a cell non-adhesive region and a pattern of the temperature-responsive region that can be changed from cell adhesive to cell non-adhesive by temperature change,
The immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the non-cell-adhesive region is higher than the immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the temperature-responsive region. By irradiating the region where only the first coating liquid is disposed, the temperature-responsive polymer is fixed in an appropriate amount, and a temperature-responsive region is formed. On the other hand, the temperature-responsive polymer is fixed in an excessive amount by irradiating the second coating solution after further disposing the second coating solution on the coating film of the first coating solution, thereby forming a non-cell-adhesive region. Is done. The immobilization amount of the temperature-responsive polymer refers to the amount of the temperature-responsive polymer per unit area. The amount of such a temperature-responsive polymer immobilized can be determined using a Fourier transform infrared spectrometer total reflection method (FT-IR-ATR method).
基材由来の波長の吸光度に対する温度応答性ポリマー由来の波長の吸光度を求めることで基材上の単位面積あたりの温度応答性ポリマーの量を算出する（ポリスチレン基材の場合、Ａｂｓ１６５０ｃｍ−１／Ａｂｓ７５７ｃｍ−１）。 The amount of the temperature-responsive polymer per unit area on the substrate is calculated by determining the absorbance of the wavelength from the temperature-responsive polymer relative to the absorbance at the wavelength derived from the substrate (Abs1650 cm −1 / Abs757 cm in the case of a polystyrene substrate). -1 ).
温度応答性領域における温度応答性ポリマーの固定化量は、０．１０〜０．３０であることが好ましく、０．１５〜０．２５であることがより好ましい。固定化量が０．３０を超過すると細胞は温度応答性領域上に付着せず、逆に固定化密度が０．１０未満だと培養細胞を基材の温度応答性領域から剥離回収することが困難となる。したがって、細胞非接着性領域における温度応答性ポリマーの固定化量は０．３０以上が好ましい。 The amount of the temperature-responsive polymer immobilized in the temperature-responsive region is preferably 0.10 to 0.30, and more preferably 0.15 to 0.25. When the immobilization amount exceeds 0.30, the cells do not adhere to the temperature-responsive region, and conversely, when the immobilization density is less than 0.10, the cultured cells can be detached and recovered from the temperature-responsive region of the substrate. It becomes difficult. Therefore, the immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the non-cell-adhesive region is preferably 0.30 or more.
本発明の細胞培養基材は、接着性細胞の培養に、特に好適に使用される。接着性細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞などの骨細胞などが挙げられる。 The cell culture substrate of the present invention is particularly preferably used for culturing adherent cells. Adhesive cells include, for example, liver cells that are liver parenchymal cells, Kupffer cells, endothelial cells such as vascular endothelial cells and corneal endothelial cells, fibroblasts, osteoblasts, osteoclasts, periodontal ligament-derived cells, epidermis Epidermal cells such as keratinocytes, tracheal epithelial cells, gastrointestinal epithelial cells, cervical epithelial cells, epithelial cells such as corneal epithelial cells, mammary cells, pericytes, muscle cells such as smooth muscle cells and cardiomyocytes, kidney cells , Pancreatic islets of Langerhans, nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells, and bone cells such as chondrocytes.
これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。 These cells may be primary cells collected directly from tissues or organs, or may be passaged from one generation to another. Furthermore, these cells are undifferentiated embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as pluripotent mesenchymal stem cells, unipotent stem cells such as vascular endothelial progenitor cells that have unipotency, and differentiation has ended. Any of cells may be sufficient. In addition, the cells may be cultivated as a single species, or two or more types of cells may be co-cultured.
本発明の温度応答性細胞培養基材に接着性細胞を播種すると、細胞接着性を発現している温度応答性領域には細胞が接着して増殖するが、細胞非接着性領域には細胞は接着しない。したがって、細胞接着性を発現している温度応答性領域に細胞を播種して接着させ培養することにより細胞シートを形成し、温度変化により温度応答性領域を細胞非接着性を発現している状態に変化させることにより、細胞シートを剥離して取得することができる。細胞シートは、細胞間結合で細胞同士が少なくとも単層で結合され、シートを形成しているものである。播種した細胞は、細胞接着性を発現している温度応答性領域に接着することから、温度変化によって細胞を剥離した後に得られる細胞シートの形状は、温度応答性領域のパターンの形状、すなわち平面形状を反映したもの、好ましくは略同一または略相似形となる。 When adherent cells are seeded on the temperature-responsive cell culture substrate of the present invention, cells adhere to and proliferate in the temperature-responsive region expressing cell adhesion, but cells do not adhere to the non-cell-adhesive region. Does not adhere. Therefore, a cell sheet is formed by seeding, adhering and culturing cells to a temperature-responsive region that expresses cell adhesion, and a state in which cell non-adhesiveness is expressed in the temperature-responsive region due to temperature change By changing to, the cell sheet can be peeled off and obtained. The cell sheet is a sheet in which cells are bound to each other in at least a single layer by intercellular bonding. Since the seeded cells adhere to the temperature-responsive region expressing cell adhesiveness, the shape of the cell sheet obtained after peeling the cells by temperature change is the shape of the temperature-responsive region pattern, that is, the plane Reflecting the shape, preferably substantially the same or substantially similar.
こうして作製された細胞シートは表面の接着因子が損なわれていないことに加えて、細胞培養面に接した部分が均一な品質を有することから、再生医療などへの利用に適したものである。また、細胞シートを利用することでバイオセンサー等の検出デバイスへの応用へも展開できる。 The cell sheet thus prepared is suitable for use in regenerative medicine and the like because the adhesion factor on the surface is not impaired and the portion in contact with the cell culture surface has a uniform quality. In addition, the cell sheet can be applied to detection devices such as biosensors.
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to the scope of the examples.
＜比較例１＞
塗工液Ａの調製：
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰｏｌｙＮＩＰＡＡｍ）を最終濃度２重量％、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を最終濃度０．１２重量％になるようにイソ−プロパノールに溶解させて塗工液Ａを作製した。
<Comparative Example 1>
Preparation of coating liquid A:
Poly-N-isopropylacrylamide (PolyNIPAAm) was dissolved in iso-propanol to a final concentration of 2% by weight and polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) to a final concentration of 0.12% by weight to prepare a coating solution A.
塗工液Ｂの調製：
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰｏｌｙＮＩＰＡＡｍ）を最終濃度２重量％、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を最終濃度０．３６重量％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させて塗工液Ｂを作製した。
Preparation of coating liquid B:
Poly-N-isopropylacrylamide (PolyNIPAAm) was dissolved in isopropyl alcohol to a final concentration of 2% by weight and polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) to a final concentration of 0.36% by weight to prepare a coating solution B.
塗工液Ｃの調製：
ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を最終濃度０．５０重量％になるようにイソプロプルアルコールに溶解させて塗工液Ｃを作製した。
Preparation of coating liquid C:
Polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) was dissolved in isopropyl alcohol to a final concentration of 0.50% by weight to prepare a coating solution C.
塗工液の塗布：
基材として、３５ｍｍΦのポリスチレンディッシュ（Ｎｕｎｃ社製）を用いた。ディッシュに対して上記の塗工液Ａ、Ｂをそれぞれ１００μＬ滴下し、全体に塗り広げることで塗膜を形成させ、十分に乾燥させた。その後、電子線照射装置（岩崎電気社製）を用いて電子線照射を行い、ポリ−Ｎ−イソプロアクリルアミドをグラフト重合させ、ディッシュ表面にポリ−Ｎ−イソプロアクリルアミド層を固定化した（加速電圧：２００ｋＶ、照射電圧９０ｋＧｙ）。
Application of coating liquid:
A 35 mmφ polystyrene dish (manufactured by Nunc) was used as the substrate. 100 μL of each of the coating liquids A and B was dropped onto the dish and spread over the whole to form a coating film, which was sufficiently dried. Thereafter, electron beam irradiation was performed using an electron beam irradiation apparatus (manufactured by Iwasaki Electric Co., Ltd.), and poly-N-isoproacrylamide was graft-polymerized to immobilize the poly-N-isoproacrylamide layer on the dish surface (acceleration voltage: 200 kV, irradiation voltage 90 kGy).
固定化量測定：
フーリエ変換赤外分光光度計ＮＩＣＯＬＥＴ６７００（Thermo Scientific社製）を用いて、固定化表面の吸光度を測定した。
Immobilization measurement:
The absorbance of the immobilized surface was measured using a Fourier transform infrared spectrophotometer NICOLET6700 (manufactured by Thermo Scientific).
細胞接着評価：
ディッシュに対し、ウシ血管内皮細胞（ＪＣＲＢより入手）を、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように調整し、ディッシュ内に播種した。このとき、使用培地は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（シグマ製）であった。培養はＣＯ２インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２の条件にて行い、培養５日後顕微鏡観察し、細胞が接着しているかどうかを観察した。その後、ディッシュを２０℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターに入庫した。３０分後、２０℃のインキュベーターから出庫し、接着していた細胞が細胞シートとして剥離しているか観察した。
Cell adhesion evaluation:
Bovine vascular endothelial cells (obtained from JCRB) were adjusted to 2.0 × 10 5 cells / cm 2 and seeded in the dish. At this time, the medium used was DMEM containing 10% FBS (manufactured by Sigma). Cultivation was performed in a CO 2 incubator under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2. After 5 days of culturing, the cells were observed with a microscope to see whether the cells were adhered. Thereafter, the dish was stored in an incubator under the conditions of 20 ° C. and 5% CO 2 . After 30 minutes, the product was removed from the incubator at 20 ° C., and it was observed whether the adhered cells were detached as a cell sheet.
・塗工液Ａのサンプル
３７℃で細胞接着性を有し、２０℃の低温処理によって細胞が剥離した。固定化測定の結果、Ａｂｓ１６５０ｃｍ−１／Ａｂｓ７５７ｃｍ−１は０．１５０４であった。
-Sample of coating solution A It had cell adhesion at 37 ° C, and the cells were detached by low-temperature treatment at 20 ° C. As a result of the immobilization measurement, Abs1650 cm −1 / Abs757 cm −1 was 0.1504.
・塗工液Ｂのサンプル：
３７℃でも細胞が接着しなかった。固定化測定の結果、Ａｂｓ１６５０ｃｍ−１／Ａｂｓ７５７ｃｍ−１は０．３６８２であった。
・ Sample of coating liquid B:
Cells did not adhere even at 37 ° C. As a result of the immobilization measurement, Abs1650 cm −1 / Abs757 cm −1 was 0.3682.
＜実施例１＞
先述した塗工液Ａ〜Ｃを用いて下記の実験を行った。
塗工液の塗布：
基材として、３５Φｍｍfポリスチレンディッシュ（Ｎｕｎｃ社製）を用いた。ディッシュに対して第１塗工液として塗工液Ａを１００μＬ滴下し、全体に塗り広げることで塗膜を形成させ、十分に乾燥させた。その後、任意の箇所に第２塗工液（ＢまたはＣ）を微量滴下し、再度、塗膜を乾燥させた。電子線照射装置（岩崎電気社製）を用いて電子線照射を行いＮ−イソプロアクリルアミドをグラフト重合させ、ディッシュ表面にポリ−Ｎ−イソプロアクリルアミドを固定化した（加速電圧：２００ｋＶ、照射電圧９０ｋＧｙ）。
<Example 1>
The following experiment was performed using the coating liquids A to C described above.
Application of coating liquid:
As the substrate, a 35Φ mmf polystyrene dish (manufactured by Nunc) was used. 100 μL of coating liquid A was dropped as a first coating liquid on the dish and spread over the whole to form a coating film, which was sufficiently dried. Then, the 2nd coating liquid (B or C) was dripped at arbitrary places, and the coating film was dried again. Electron beam irradiation was performed using an electron beam irradiation apparatus (manufactured by Iwasaki Electric Co., Ltd.) to graft polymerize N-isoproacrylamide, and poly-N-isoproacrylamide was immobilized on the dish surface (acceleration voltage: 200 kV, irradiation voltage 90 kGy). .
固定化量測定：
フーリエ変換赤外分光光度計ＮＩＣＯＬＥＴ６７００（Thermo Scientific社製）を用いて、二つの領域の固定化表面の吸光度を測定した。
Immobilization measurement:
The absorbance of the immobilized surface in two regions was measured using a Fourier transform infrared spectrophotometer NICOLET 6700 (manufactured by Thermo Scientific).
細胞接着評価：
ディッシュに対し、ウシ血管内皮細胞（ＪＣＲＢより入手）を、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように調整し、ディッシュ内に播種した。このとき、使用培地は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（シグマ製）であった。培養はＣＯ２インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２の条件にて行い、培養５日後顕微鏡観察したところ、第２塗工液を滴下した領域には細胞が接着せず、その他の領域では細胞が接着している様子が確認された。
Cell adhesion evaluation:
Bovine vascular endothelial cells (obtained from JCRB) were adjusted to 2.0 × 10 5 cells / cm 2 and seeded in the dish. At this time, the medium used was DMEM containing 10% FBS (manufactured by Sigma). Cultivation was carried out in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 , and when observed under a microscope after 5 days of culture, the cells did not adhere to the area where the second coating solution was dripped, and the cells remained in the other areas. It was confirmed that they were adhered.
その後、ディッシュを２０℃、５％ＣＯ２条件下のインキュベーターに入庫した。３０分後、２０℃のインキュベーターから出庫し、接着していた細胞が細胞シートとして剥離している様子が確認された。このとき、第２塗工液を滴下した領域は孔となった形状で細胞シートが回収された。 Thereafter, the dish was stored in an incubator under the conditions of 20 ° C. and 5% CO 2 . After 30 minutes, the product was removed from the incubator at 20 ° C., and it was confirmed that the adhered cells were detached as a cell sheet. At this time, the cell sheet was collected in a shape in which the region where the second coating solution was dropped was a hole.
１：第１塗工液
２：第２塗工液
３：基材
４：温度応答性領域
５：細胞非接着性領域
1: First coating solution 2: Second coating solution 3: Base material 4: Temperature-responsive region 5: Cell non-adhesive region
Claims (3)
温度応答性ポリマーと架橋剤と溶媒とを含む第１塗工液を基材上に配置することにより、第１塗工液の塗膜を形成する工程、
第１塗工液の塗膜上に、架橋剤と溶媒と場合により温度応答性ポリマーとを含む第２塗工液をパターン状に配置する工程、および
基材に配置された塗工液に放射線を照射することにより温度応答性ポリマーを基材に固定化する工程
を含み、
第１塗工液が配置され第２塗工液が配置されない領域は、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な温度応答性領域を形成し、
第１塗工液と第２塗工液が配置された領域は細胞非接着性領域を形成し、
細胞非接着性領域における温度応答性ポリマーの固定化量が、温度応答性領域における温度応答性ポリマーの固定化量より高い、
前記方法。 A method for producing a temperature-responsive cell culture substrate having a pattern,
A step of forming a coating film of the first coating liquid by disposing a first coating liquid containing a temperature-responsive polymer, a crosslinking agent, and a solvent on the substrate;
A step of arranging a second coating liquid containing a cross-linking agent, a solvent, and optionally a temperature-responsive polymer on the coating film of the first coating liquid in a pattern, and radiation applied to the coating liquid disposed on the substrate A step of immobilizing a temperature-responsive polymer on a substrate by irradiating
The region where the first coating solution is disposed and the second coating solution is not disposed forms a temperature-responsive region capable of changing from cell adhesiveness to cell non-adhesiveness due to temperature change,
The area where the first coating liquid and the second coating liquid are arranged forms a cell non-adhesive area,
The immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the non-cell-adhesive region is higher than the immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the temperature-responsive region.
Said method.
基材と、基材上に架橋剤を介して固定化された温度応答性ポリマー層とを含み、
温度応答性ポリマー層が、細胞非接着性領域と、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な温度応答性領域のパターンを有し、
細胞非接着性領域における温度応答性ポリマーの固定化量が、温度応答性領域における温度応答性ポリマーの固定化量より高い、
前記細胞培養基材。 A temperature-responsive cell culture substrate having a pattern,
A substrate and a temperature-responsive polymer layer immobilized on the substrate via a crosslinking agent,
The temperature-responsive polymer layer has a cell non-adhesive region and a pattern of the temperature-responsive region that can be changed from cell adhesive to cell non-adhesive by temperature change,
The immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the non-cell-adhesive region is higher than the immobilization amount of the temperature-responsive polymer in the temperature-responsive region.
The cell culture substrate.
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| JP2019080561A (en) * | 2017-10-31 | 2019-05-30 | 東ソー株式会社 | Porous substrate for culturing pluripotent stem cells and method for culturing pluripotent stem cells while maintaining undifferentiation |
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