JP2015527357A - 単一可変ドメインとカモスタットメシル酸塩（ｃｍ）とを含んでなる組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、特に、胃および腸などのプロテアーゼ豊富な環境において単一可変ドメインを安定化させる手段を提供する。単一可変ドメインとカモスタットメシル酸塩を含んでなる組成物、特に、医薬組成物が、前記組成物の薬剤としての、および処置方法における使用とともに提供される。本開示の組成物は、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎などの胃腸管病態の局所処置において、または胃腸管粘膜免疫系の直接的活性のために特に有用である。

Description

開示の背景
生物薬剤、特に、治療用抗体およびそれらのフラグメントの大多数は、非経口経路、例えば、静注または皮下注射によって投与される。これらの投与経路は、多くの場合、利便性がなく、痛みを伴い、特に１日に何回も注射が必要な場合には患者のコンプライアンスを引き下げる。それらはまた、スタッフの時間、保管および器具の点で、医療提供者にとってもコストがかかることになる。

生物薬剤の経口投与はこれらの欠点の多くを克服すると思われるが、それなりの難題がある。特に、このような分子は、胃や腸のプロテアーゼ豊富な環境でタンパク質分解を受ける。

重要なこととして、胃腸（ＧＩ）管の疾患を処置する経口治療薬の必要がある。特に、全身毒性のリスクを軽減するために使用される低用量の薬剤の必要がある。

よって、胃腸管のプロテアーゼ豊富な環境に耐えさせ、それにより生物薬剤の経口投与の成功を可能とするためにタンパク質を安定化させることが強く望まれる。

開示の概要
本開示は、カモスタットメシル酸塩と単一可変ドメインとを含んでなる組成物、場合により、医薬組成物を提供する。

薬剤として使用するための本開示の組成物が提供される。薬剤の製造のための本開示の組成物の使用も提供される。特に、本組成物は経口投与される。

本開示は、本開示の組成物をそれを必要とする患者に投与、場合により経口投与する工程を含んでなる胃腸管病態の処置方法を提供する。

本開示はさらに、プロテアーゼ豊富な溶液中で単一可変ドメインを安定化させる方法であって、カモスタットメシル酸塩を含んでなる組成物中に単一可変ドメインを配合した後にその組成物をプロテアーゼ豊富な溶液に曝すことを含んでなる方法を提供する。

図1は、人工腸液（ＳＩＦ）中でのインキュベーション時の、遷移中間点（Ｔｍ）の異なるｄＡｂ（商標）のパネルの半減期を示す。 図２は、ＳＩＦ中でのインキュベーション時の、高Ｔｍ ｄＡｂ（商標）のパネルの半減期を示す。 図３は、ＣＭの存在下および不在下、人工腸液（ＳＩＦ）中でのインキュベーション時の、遷移中間（Ｔｍ）の異なるｄＡｂ（商標）のパネルの半減期を示す。 図４は、ＣＭの存在下および不在下、ＳＩＦ中でのインキュベーション時の、高Ｔｍ ｄＡｂ（商標）のパネルの半減期を示す。 図５は、同じ推定トリプシン切断部位を有するが、Ｔｍの異なる２つのｄＡｂ（商標）の半減期を示す。ｄＡｂ（商標）をＣＭの存在下および不在下でトリプシンとともにインキュベートした。 図６は、ＣＭの不在下（ａ）、および存在下（ｂ）で、十二指腸内投与後の種々の時点で胃腸管組織から回収されたｄＡｂ（商標）ＤＯＭ１０１の量を示す。結果は組織１グラム当たりのナノグラムとして表す。 図７は、ＣＭの存在下および不在下での結腸内投与後の大腸から回収されたｄＡｂ（商標）ＤＯＭ１０１の量を示す。結果は組織１グラム当たりのナノグラムとして表す。

本発明の具体的説明

本開示は、上記に述べた問題に対する解決策を提供する。本開示は、単一可変ドメインを安定化させる手段を提供する。単一可変ドメインとカモスタットメシル酸塩とを含んでなる組成物、特に、医薬組成物が、前記組成物の薬剤としての、および処置方法としての使用とともに提供される。本明細書の例は、絶食下の人工腸液中ならびに小腸および大腸中の両方で単一可変ドメイン（例えば、ドメイン抗体（商標）またはｄＡｂ（商標））を安定化させるためにカモスタットメシル酸塩（ＣＭ）が使用可能であることを示し、従って、クローン病もしくは潰瘍性大腸炎などのＧＩ病態の局所処置のための、または胃腸管粘膜免疫系の直接的活性を目的とする生物薬剤の経口送達のためのＣＭの使用の裏付けとなる。

カモスタットメシル酸塩（ＣＡＳ Ｎｏ：５９７２１−２９−８）の化学名は、４−［［４−［（アミノイミノメチル）アミノ］ベンゾイル］オキシ］ベンゼン酢酸２−（ジメチルアミノ）−２−オキソエチルエステルメタンスルホネートであり、例えば、Ｓｅｑｕｏｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手できる。カモスタットメシル酸塩（ＣＭ）は、膵炎および術後逆流性食道炎の治療用として日本および韓国で認可されている経***性セリンプロテアーゼ阻害剤である(Foipan Product information sheet; Takasugi et al., Digestion 1982, 24:36-41; Kono et al., Am J Surg. 2005 Sep, 190(3): 412-7)。ＣＭは、トリプシン、トロンビン、カリクレインおよびプラスミンを含む広域の阻害を有する(Tamura et al., 1977, Biochimica et Biophysica Acta 484, 417-422)。胃腸管内でのＣＭの代謝は明らかではないが、ＣＭの代謝産物であるＧＢＰＡはそれ自体活性がある(Beckh et al., Res Exp Med, 1987, 187: 401-406)。

用語「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含んでなる折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。従って、単一可変ドメインには、ＶＨ、ＶＨＨおよびＶＬなどの完全な抗体可変ドメイン、および例えば１以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列で置換されている改変された抗体可変ドメイン、または末端切断されたもしくはＮ末端もしくはＣ末端延長を含んでなる抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持する可変ドメインのフラグメントが含まれる。単一可変ドメインは、異なる可変領域またはドメインとは独立に抗原またはエピトープに結合することができる。「ドメイン抗体（商標）」または「ｄＡｂ（商標）」は、「単一可変ドメイン」と同じと見なすことができる。単一可変ドメインはヒト単一可変ドメインであり得るが、齧歯類（例えば、ＷＯ００／２９００４号に開示の通り）、テンジクザメおよびラクダ科ＶＨＨ ｄＡｂ（商標）などの他種由来の単一可変ドメインも含む。ラクダ科ＶＨＨは、天然に軽鎖を欠いた重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインである。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準的技術に従ってヒト化してもよく、このようなドメインは「単一可変ドメイン」と見なされる。本明細書で使用する場合、ＶＨはラクダ科ＶＨＨドメインを含む。

抗標的単一可変ドメイン、例えば、抗ＴＮＦα単一可変ドメインは、前記標的、例えば、ＴＮＦαと結合する単一可変ドメインを意味する。標的はいずれの好適な標的であってもよい。一実施形態では、本開示の単一可変ドメインは、下記：ＴＮＦα、ＩＬ−２３、ＬＡＧ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＳＬＰ、ＣＤ３または前記のいずれか１つの受容体、例えば、ＴＮＦＲαＲＩもしくはＴＮＦＲαＲＩＩなどのＴＮＦα受容体、ＩＬ−２３受容体、ＬＡＧ−３受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体、ＴＳＬＰ受容体、またはＣＤ３受容体のうちいずれか１つを標的とする。一実施形態では、本開示の単一可変ドメインは、ケモカインまたはケモカイン受容体、例えば、グルタミン酸−ロイシン−アルギニン受容体、すなわち、ＥＬＲ受容体、例えば、配列番号１２および１９〜２２に示されるアミノ酸配列を含んでなるものを標的とする。

親和性は、ある分子、例えば、本開示の単一可変ドメインの、別の分子、例えば、その標的との、単一の結合部位での結合の強度である。単一可変ドメインの、その標的との結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または動態（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）によって決定することができる。

一実施形態では、単一可変ドメイン−標的相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）は、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下である。あるいは、ＫＤは、５〜１０ｎＭの間、または１〜２ｎＭの間であり得る。ＫＤは、１ｐＭ〜５００ｐＭの間、または５００ｐＭ〜１ｎＭの間であり得る。当業者ならば、ＫＤの数値が小さいほど結合が強いことが分かるであろう。ＫＤの逆数（すなわち、１／ＫＤ）は、Ｍ^−１を単位とする平衡会合定数（ＫＡ）である。当業者ならば、ＫＡの数値が大きいほど結合が強いことが分かるであろう。

解離速度定数（ｋｄ）または「解離速度」は、単一可変ドメイン−標的複合体の安定性、すなわち、１秒当たりに減衰する複合体の画分を表す。例えば、ｋｄ ０．０１秒^−１は、１秒当たりに１％の複合体が減衰することに相当する。一実施形態では、解離速度定数（ｋｄ）は、１×１０^−３秒^−１以下、１×１０^−４秒^−１以下、１×１０^−５秒^−１以下、または１×１０^−６秒^−１以下である。ｋｄは、１×１０^−５秒^−１〜１×１０^−４秒^−１の間、または１×１０^−４秒^−１〜１×１０^−３秒^−１の間であり得る。

用語「中和する」は、本明細書で使用する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、標的の生物活性が本明細書に記載されるような単一可変ドメインの存在下で、単一可変ドメインの不在下での標的の活性に比べて低くなることを意味する。中和は、標的のその受容体への結合を遮断すること、標的がその受容体を活性化するのを妨げること、標的もしくはその受容体をダウンレギュレートすること、またはエフェクター機能に影響を与えることのうちの１以上によるものであり得る。一実施形態では、本開示の単一可変ドメインは、その標的を中和する。

「遷移中間点」または「Ｔｍ」は、単一可変ドメインの５０％がその天然コンフォメーションにあり、他方の５０％が変性している温度である。一実施形態では、単一可変ドメインは高いＴｍを有する。特に、Ｔｍは約６６℃以上である。Ｔｍを含む単一可変ドメインの熱安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて測定することができる。

「経口投与」は、本明細書で使用する場合、口による本明細書に開示される組成物の投与を意味する。本開示の組成物は一般に嚥下され、それらが作用する胃腸（ＧＩ）管に移行する。少量が腸管粘膜から循環中に吸収され、全身作用に向けられる。吸収は口（口腔）および胃で始まり得るが、通常、小腸で起こる。

「胃腸（ＧＩ）管」は、上方ＧＩ管：口、咽頭、食道および胃；ならびに下方ＧＩ管：小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸（盲腸、結腸−上行結腸、横行結腸、下行結腸およびＳ字結腸を含む）、直腸および肛門；ならびに胆嚢、肝臓および膵臓を含む。本開示の組成物は、ＧＩ管の上述の領域のいずれか１以上を標的とし得る。一実施形態では、組成物は小腸を標的とする。一実施形態では、組成物は大腸を標的とする。

本明細書に開示される医薬組成物は、本明細書に記載のヒト疾患のいずれか１以上の処置を目的とし得る。一実施形態では、本医薬組成物は、単一可変ドメインを場合により１種類以上の薬学上許容される担体および／または賦形剤と組み合わせて含んでなる。

このような組成物は、許容医薬実務により知られている、また求められるような薬学上許容される担体を含んでなる（例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co.参照）。このような医薬組成物の製造方法は、当業者に周知である。

一実施形態では、本開示の医薬組成物は、経口投与される。液体（溶液、懸濁液（水性または油性）、およびエマルション）、半固体（ペースト）、フィルムおよび固体（錠剤、トローチ剤、カプセル剤、散剤、結晶および顆粒剤）を含む様々な投与形が企図される。

経口投与用の液体分散剤は、シロップ、エマルションおよび懸濁液であり得る。シロップは、担体、例えば、サッカロースまたはサッカロースをグリセリンおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトールとともに含有し得る。

懸濁液およびエマルションは、担体、例えば、天然ガム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有し得る。

医薬組成物、特に、錠剤およびカプセル剤などの固体組成物は、腸溶コーティングされてよい。腸溶コーティングに使用される材料としては、脂肪酸、ワックス、セラック、プラスチック、および植物繊維が含まれる。好適な腸溶コーティングは、EURDAGIT（商標）Application Guidelines (第11版, 09/2009)に開示されている。

単一可変ドメインを投与するための有効用量および処置計画は、患者の年齢、体重および健康状態、ならびに処置される疾患などの因子によって決まり得る。このような因子は担当の医師の裁量の範囲内である。適当な用量を選択する指針は、例えば、Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New Yorkに見出すことができる。

本開示の組成物中の単一可変ドメインとカモスタットメシル酸塩の比は、約１：０．１、１：１、１：１０、１：２５、１：５０、または１：１００であり得る。一実施形態では、本開示の組成物中の単一可変ドメインとカモスタットメシル酸塩の比は、約１：１００である。一実施形態では、本開示の組成物中の単一可変ドメインとカモスタットメシル酸塩の比は、約１：１０である。

本医薬組成物は、他の薬剤を伴う単一可変ドメインのパーツキットを場合により使用説明書とともに含んでなり得る。好都合には、本キットは、所定量の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。

本開示は、本開示の組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含んでなる、本明細書に開示される疾患の処置方法を提供する。

本開示はまた、本明細書に挙げられている疾患および障害の処置用薬剤の製造における、本明細書に記載されるような本開示の組成物の使用を提供する。本開示の組成物により処置可能な疾患および障害には、胃腸管障害が含まれる。

「胃腸管障害」は、ＧＩ管を侵す障害であり、腸炎、直腸炎、クローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎を含む大腸炎、セリアック病、ベーチェット症候群(Behet’s syndrome）および口腔粘膜炎が含まれる。一実施形態では、胃腸管障害はＩＢＤである。一実施形態では、胃腸管障害はクローン病である。一実施形態では、胃腸管障害は潰瘍性大腸炎である。

ＧＩ管を標的とすることにより処置され得る他のいずれの疾患も、本開示の方法により処置される疾患の範囲内に包含される。例えば、ＧＩ管内の標的に結合する本開示の単一可変ドメインは、ＧＩ管を超える効果、および全身性疾患の治療をもたらし得る。

用語「個体」、「被験体」および「患者」は、本明細書互換的に使用される。被験体は一般にヒトである。被験体はまた、マウス、ラットまたは霊長類（例えば、マーモセットまたはサル）などの哺乳類でもあり得る。被験体は、非ヒト動物であり得る。

処置は、治療的、予防的または防止的であり得る。被験体は、それを必要とするものである。処置を必要とするものとしては、特定の医学的疾患にすでに罹患している個体に加え、将来その疾患を発症する可能性のある個体を含み得る。本明細書に記載の単一可変ドメインの治療上有効な量は、その疾患の１以上の症状を改善もしくは軽減する、またはその疾患を予防もしくは治癒するために有効な量である。

プロテアーゼ豊富な溶液中で単一可変ドメインを安定化させる方法が提供される。この方法は、カモスタットメシル酸塩を含んでなる組成物中に単一可変ドメインを配合した後にその組成物をプロテアーゼ豊富な溶液に曝すことを含んでなる。

「プロテアーゼ豊富な」溶液は、プロテアーゼ、特に、ＧＩ管内に見られるプロテアーゼを、例えば、生理量で含んでなる溶液である。プロテアーゼは、ポリペプチド鎖の１以上のペプチド結合を加水分解することによってタンパク質分解を行う酵素である。ヒトでの空腹期トリプシンの生理量は２０〜５０Ｕ／ｍｌである。ヒトでの食後早期トリプシンの生理量は、６０〜１００Ｕ／ｍｌである。ヒトでの食後後期トリプシンの生理量は、５００〜１５００Ｕ／ｍｌ(McConnell et al., International Journal of Pharmaceutics 364: 213-226 (2008))。一実施形態では、プロテアーゼ豊富な溶液中のトリプシン量は、上述の範囲のいずれであってもよい。一実施形態では、プロテアーゼ豊富な溶液は、トリプシンを下記の量：２０Ｕ／ｍｌ、３０Ｕ／ｍｌ、４０Ｕ／ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌ、６０Ｕ／ｍｌ、７０Ｕ／ｍｌ、８０Ｕ／ｍｌ、９０Ｕ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌ、２００Ｕ／ｍｌ、３００Ｕ／ｍｌ、４００Ｕ／ｍｌ、５００Ｕ／ｍｌ、６００Ｕ／ｍｌ、７００Ｕ／ｍｌ、８００Ｕ／ｍｌ、９００Ｕ／ｍｌ、１０００Ｕ／ｍｌ、１１００Ｕ／ｍｌ、１２００Ｕ／ｍｌ、１３００Ｕ／ｍｌ、１４００Ｕ／ｍｌまたは１５００Ｕ／ｍｌのいずれかよりも高い量で含んでなる。一実施形態では、プロテアーゼ豊富な溶液は、キモトリプシンおよび／またはパンクレアチンをさらに含んでなり得る。一実施形態では、プロテアーゼ豊富な溶液は、トリプシン、キモトリプシンおよび／またはパンクレアチンを含んでなる。一実施形態では、プロテアーゼ豊富な溶液は、人工腸液（ＳＩＦ）である。ＳＩＦは、胆汁、パンクレアチンおよびトリプシンを含んでなる。ＳＩＦはまた、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムも含んでなり得る。一実施形態では、ＳＩＦは、実施例に記載のように、例えば、プロテアーゼを実施例１に明示される量で含んでなる。

本明細書内で、本開示は、実施形態に関して、明瞭かつ簡潔な明細を記載できる方法で記載してきた。実施形態は本開示から逸脱することなく、様々に組み合わせたり分離したりし得ることが意図され、理解されるべきである。

実施例１：人工腸液（ＳＩＦ）中でのドメイン抗体（商標）パネルの固有安定性
人工腸液（ＳＩＦ）は、下記のように容量を実質的にスケールダウンしたこと以外は、ＴＮＯ−ＴＩＭ（商標）胃腸管モデル系に使用される処方箋に基づいて処方した。

人工腸液（ＳＩＦ）の調製：
胆汁溶液は、２．０ｇ（＋／−０．０２ｇ）の胆汁粉末を２５０ｇ（＋／−５ｇ）の精製水に、透明な溶液が得られるまで、絶えず撹拌しながら徐々に加えることにより調製した。

パンクレアチン溶液は、２．１ｇ（＋／−０．２ｇ）のパンクレアチン粉末を１５０ｇ（＋／−３ｇ）の精製水に加えることにより調製した。スターラーを用い、泡立ちを最小限にするように留意した。均質な混合物が得られたところで、溶液を３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清を氷上で保存した。

小腸電解質溶液（ＳＩＥＳ）２５％（濃縮液）は、精製水を２５０ｇ（＋／−５ｇ）の塩化ナトリウム、３０ｇ（＋／−０．５ｇ）の塩化カリウム、および１５ｇ（＋／−０．３ｇ）の脱水塩化カルシウムを加えて合計２１７４ｇとすることにより作製した。これらの塩が溶けたところで、ｐＨを１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ７．０（＋／−０．５）に調整した。

次に、ＳＩＥＳ希釈液を、４３．５（＋／−１ｇ）のＳＩＥＳ濃縮液を用いて総重量１０００ｇとなるまで精製水に加えて調製した。

トリプシン溶液は、２００ｍｇ（＋／−５ｍｇ）のトリプシンを１００ｇ（＋／−２ｇ）のＳＩＥＳ希釈液に溶かすことにより調製した。次に、この溶液を１．５ｍｌのエッペンドルフ管（１ｍｌ／管）にピペットで移し、−２０℃で冷凍した。

次に、ＳＩＦを、２５ｇ（＋／−０．３ｇ）の胆汁溶液、１２．５ｇ（＋／−０．３ｇ）のパンクレアチン溶液および１２．５ｇ（＋／−０．５ｇ）のＳＩＥＳ希釈液（２：１：１比の胆汁／パンクレアチン／ＳＩＥＳ希釈液）を混合することにより調製した。その後、溶液使用する直前に１ｍｌのトリプシン溶液を加えた。

ドメイン抗体（商標）の調製
検討下のドメイン抗体（商標）（ｄＡｂ（商標））を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）５００ ３ｋＤ ＭＷＣＯカラムを用いておよそ２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。サンプル回収率を最大にするためにカラムを使用前にＰＢＳで予備洗浄した。濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）により、モル吸光係数および分子量オプションを用いて確認した。

反応アセンブリ
ＳＩＦ中でのｄＡｂ（商標）のインキュベーションは、終容量２５０μｌで行った。混合物中に添加されたｄＡｂ（商標）の容量は、終濃度１ｍｇ／ｍｌとなった。

２５μｌのアリコートをすぐに取り出し、ドライアイス上で保存した（０時点）。反応混合物を振盪しながら（１００ｒｐｍ）３７℃でインキュベートした。次に、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間および一晩で２５μｌアリコートを取り出した。サンプルをドライアイス上で急速冷凍し、分析まで−８０℃で保存した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
種々の時点でＳＩＦに残ったｄＡｂ（商標）の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび濃度計により測定した。簡単に述べれば、サンプルを水とサンプルローディングバッファーの混合物で１／１０希釈し、５分間８０℃に加熱した。サンプルを急冷した後、１０μｌを調製済みの標品（水中ｄＡｂ（商標））および分子量マーカーとともに、４〜１２％Ｎｏｖｅｘ（商標）ビス−トリスゲルにのせた。このゲルを１×ＭＥＳバッファー中、１５０Ｖ一定で４５分間泳動させ、Ｉｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ（商標）で一晩染色することによりタンパク質バンドを可視化した。得られたバンドの濃度測定は、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｌｉ−Ｃｏｒ（商標）ゲルイメージングシステムを用いて行い、存在するｄＡｂ（商標）の量を０時点のバンド（出発量）の濃度と比較して計算した。ｄＡｂ（商標）の出発量のパーセンテージに対する時間の指数曲線を作成し、ｄＡｂ（商標）の開始量の５０％が存在する時間を半減期と見なした。

上記の方法を使用し、表１に示されるように、遷移中間点（Ｔｍ）の異なるｄＡｂ（商標）のパネルをＳＩＦ中でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび濃度計により分析した。これらの例に関して、高Ｔｍ ｄＡｂ（商標）はＴｍ≧６６℃のｄＡｂ（商標）を意味し、低Ｔｍ ｄＡｂ（商標）はＴｍ≦５６℃のｄＡｂ（商標）を意味する。

結果を図１に示す。このグラフは、異なる３日に行ったＳＩＦ試験を組み合わせたものである。ＤＯＭ４、最高ＴｍのｄＡｂ（商標）は、明らかに、検討下の他のｄＡｂ（商標）よりもはるかに安定であった。これが閾値であるかどうかを調べるために、表２に示されるように、さらに４つの高Ｔｍ ｄＡｂ（商標）を上記の方法を用いて試験した。

高Ｔｍ ｄＡｂ（商標）のパネルの結果を図２に示す。

他のｄＡｂ（商標）のうちＤＯＭ８は、ＳＩＦ中で極めて安定であった。他の３つのｄＡｂ（商標）は安定ではなかった。しかしながら、試験したこれら５つの高Ｔｍ ｄＡｂ（商標）のうち４つは、Ｔｍ６６℃未満のｄＡｂ（商標）より安定であった。最も安定な２つのｄＡｂ（商標）（ＤＯＭ４およびＤＯＭ８）は両方ともＶκフレームワークを有していた。しかしながら、ＤＯＭ１１もＶκフレームワークを有していたが安定性ははるかに低かったことから、このフレームワークは安定性上、それほど重要ではない可能性がある。ＤＯＭ１１は、ここで試験した他の３つの高Ｔｍ ｄＡｂ（商標）とは異なる機会にＳＩＦ中でインキュベートした。

実施例２：カモスタットメシル酸塩を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏドメイン抗体（商標）の安定化
実施例１で試験したｄＡｂ（商標）のパネルをまた、ＳＩＦ中、カモスタットメシル酸塩（ＣＭ、Sequoia Research Products）の存在下でもインキュベートし、プロテアーゼの阻害がｄＡｂ（商標）をさらに安定化させる助けとなるかどうかを調べた。ＳＩＦ調製の節に上述した電解質溶液にＣＭを３５０ｍｇ／ｍｌの濃度で加え（ＣＭは高濃度ではあるが、飽和点未満であった）、５０℃に温めて溶解させた。ＣＭを終濃度１０ｍｇ／ｍｌでＳＩＦ／ｄＡｂ（商標）に加えた。使用した時点とその後の分析を実施例１の通りに行った。

結果は、図３および４に、比較のために実施例１からの結果の横に示す。ＳＩＦ／ｄＡｂ混合物へのＣＭの添加は、試験したｄＡｂ（商標）のうち１つ以外の総ての半減期を延長した。この半減期の延長は、試験した総ての分子で同じではなく、このことはｄＡｂ（商標）の固有の特性がそれらの安定化能に寄与することを示唆している。さらに、試験した高Ｔｍ ｄＡｂ（商標）の総てで半減期は２４時間を超えるまでに安定化したことから、高Ｔｍ ｄＡｂ（商標）は、それらの様々な半減期にも関わらず、ＣＭによる安定化に本質的により従順であるものと思われる。

実施例３：ｄＡｂ（商標）安定性のモデル化およびドメイン抗体（商標）の固有安定性に対するＴｍの重要性
トリプシンおよびキモトリプシン（パンクレアチン中に存在）切断部位のタンパク質配列をスキャンするためにｐｅｒｌスクリプトを欠いた。次に、半減期を推定切断部位と、またＴｍと相関させた。

弱い正の相関がＴｍと半減期の間に見られた（Ｓｐｅａｒｍａｎ、０．５８；Ｐｅａｒｓｏｎ、０．３１）。しかしながら、両相関測度を用い、ＣＭの存在下でＴｍと半減期の間に強い正の相関が見られた（Ｓｐｅａｒｍａｎ、０．７８；Ｐｅａｒｓｏｎ、０．９０）。このことは、Ｔｍが高いほどｄＡｂ（商標）はＣＭによる安定化に従いやすいことを示唆する。推定切断部位と半減期の間には、ＣＭの存在下でも不在下でも明らかな相関は見られなかった。

モデル化プロセス中、２つのＶκフレームワークｄＡｂ（商標）は、推定トリプシン切断部位は同じであるが、ＳＩＦ中での半減期が異なりＴｍも異なることが見出された。これらはＤＯＭ４（半減期６．１時間、Ｔｍ７２．８℃）およびＤＯＭ１（半減期０．１時間、Ｔｍ５５℃）であった。これら２つのｄＡｂ（商標）を、ＳＩＦの場合に用いたものと同じ濃度で、胆汁酸塩もパンクレアチンも含まずに、トリプシンとともにインキュベートした。半減期に見られる違いは、この場合にはＴｍによるものであろう。トリプシン／ｄＡｂ（商標）混合物にＣＭもまた加えた。半減期を従前のように算出し、結果を図５に示す。

トリプシン単独の存在下では、ＤＯＭ４の半減期は、ＤＯＭ１の半減期よりもかなり長かった。この場合、Ｔｍの違いは、おそらく分子の安定性の増強によるものである。

実施例４：カモスタットメシル酸塩の使用は、絶食させたハン・ウェスターラットの十二指腸に直接投与したＴＮＦＲ１特異的ｄＡｂ（商標）ＤＯＭ１０１（配列番号６）を安定化させる
ハン・ウィスターラットに１００ｍｇＣＭを含むまたは含まない１ｍｇのＤＯＭ１０１を投与し、ＣＭが胃腸管内でｄＡｂ（商標）を保存するかどうかを調べた。簡単に述べれば、ラットをイソフルラン麻酔薬によって麻酔し、投与処方物の直接十二指腸内注射（５００μｌ）のために十二指腸の位置決定を助けるために正中腹部切開を行った。投与後、腹部切開を閉じ、ラットを回復させた後に、試験ケージに戻した。十二指腸への直接投与は、胃内の胃液の酸性条件を迂回し、腸管の薬物動態の直接的分析を可能とした。

動物は、下記の時点：０．５、１．５、３、５、７および１８時間で屠殺した（３匹／群）。

血液サンプルを採取し、腸管を摘出し、その構成部分：十二指腸（×２）、空腸（×６）、回腸、盲腸、結腸（×２）、直腸に分けた。

ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）分離装置を用い、洗剤およびプロテアーゼ阻害剤を含有する溶解バッファー中で腸管サンプルをホモジネートした。ＴＮＦＲ１特異的ＭＳＤ（商標）アッセイを用い、サンプルをＤＯＭ１０１に関してスクリーニングした。要するに、ＭＳＤプレートをＴＮＦＲ１−Ｆｃでコーティングした。プレートを洗浄し、ウシ血清アルブミンでブロッキングした。組織サンプルを希釈し、ｄＡｂ（商標）の標準曲線とともにプレートに加えた後、室温でインキュベートして結合させた。プレートを洗浄し、スルホタグ結合抗Ｖｈ抗体を各ウェルに加えた。インキュベーション後、プレートを洗浄し、ＭＳＤリードバッファーでインキュベートした。得られた電気化学的発光シグナルをＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００で読み取った。

結果を図６に組織１グラム当たりのナノグラムとして表す。

図６（ａ）のＣＭの不在下、ｄＡｂ（商標）は、十二指腸では０．５時間にのみ、空腸では１．５時間までのみ検出できた。最高量は空腸で検出でき、回腸では少量で検出できるに過ぎなかった。

図６（ｂ）のＣＭの存在下では、ｄＡｂ（商標）は、投与７時間後にはＧＩ管の至る所で検出可能であった。ｄＡｂ（商標）は、後期の時点では、回腸、盲腸、結腸および直腸で検出できただけであった。従前のように、最高量のｄＡｂ（商標）は空腸から回収された。胃腸管移行の見込みにも関わらず、ｄＡｂ（商標）は７時間目に十二指腸および空腸でも検出可能であり、ｄＡｂ（商標）が胃腸管組織へ浸透したこと示唆された。十二指腸内投与後、ＤＯＭ１０１は血漿中に低レベル（総用量の０．１％未満）で検出可能であり、ｄＡｂ（商標）が組織へ浸透可能であることが確認された（データは示されていない）。

実施例５：カモスタットメシル酸塩の使用は、絶食させたハン・ウィスターラットの結腸に直接投与したＴＮＦＲ１特異的ｄＡｂ（商標）ＤＯＭ１０１（配列番号６）を安定化させる
ハン・ウィスターラットに、ＣＭを含むまたは含まない１ｍｇのＤＯＭ１０１を投与し、カモスタットメシル酸塩が大腸管でもｄＡｂ（商標）を保存するかどうかを調べた。簡単に述べれば、ラットをイソフルラン麻酔薬によって麻酔し、結腸の位置決定を助けるために正中腹部切開を行い、５００μｌ用量の投与処方物を直接結腸に注射した。投与後、腹部切開を粗く閉じ、イソフルラン麻酔下でラットを維持し、試験期間中モニタリングした。本実施例では、動物１匹当たり１００ｍｇ（実施例４の通り）および１０ｍｇの２種類のＣＭ用量を試験した。

動物を０．５および３時間で屠殺した（各時点３匹）。血液サンプルを採取し、腸管を摘出し、以下のような構成部分に分けた：盲腸、結腸（×２）、直腸。

実施例４で述べたように、サンプルをホモジネートし、スクリーニングした。結果を図７に組織１グラム当たりのナノグラムとして表す。

高レベルのｄＡｂ（商標）が、盲腸、結腸および直腸（１０ｍｇカモスタット群を除く）において、ＣＭの存在下または不在下の０．５時間で検出できた。ＧＩ管の下部ほど消化酵素のレベルが低いということで、これを説明できる。１０ｍｇカモスタット群における直腸の０．５時間でのｄＡｂ（商標）の欠如は、おそらくこれらの動物の盲腸の湿重が高いことによると思われ（データは示されていない）、従って、ｄＡｂ（商標）はこの切片にも保持されている可能性がある。しかしながら、ＣＭの不在下での３時間時点のｄＡｂ（商標）レベルは、特に盲腸および直腸では、２つのＣＭ群で見られたものに比べて実質的に低かった。低用量のＣＭ（１０ｍｇ）ほど、広範なＧＩ管において保存するｄＡｂ（商標）が高用量であるので有効であると思われた。

実施例１〜５の要約
これらの実施例は、カモスタットメシル酸塩とドメイン抗体（商標）の併用投与がこれらの分子の経口送達の新規なプラットフォームとして使用可能であることを実証する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した１１種のｄＡｂ（商標）のうち１０種がＣＭの添加により様々な程度で安定化された。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでモデル化したところ、ＣＭの存在下での半減期とＴｍの間に強い相関が見られ、Ｔｍが高いほど、ｄＡｂ（商標）はＣＭによる安定化に従いやすいことが示唆される。同一の推定トリプシン切断部位を有する２種類のｄＡｂ（商標）の比較でも、ＳＩＦ中でのｄＡｂ（商標）の固有安定性に関するＴｍの重要性が示される。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結果は、ｉｎ ｖｉｖｏ試験によって裏付けられ、カモスタットメシル酸塩とＤＯＭ１０１の併用投与は、十二指腸に送達した場合でも結腸に送達した場合でも、ＧＩ管から回収可能なｄＡｂ（商標）の量を実質的に増す。ＣＭの処方物への添加は、クローン病または潰瘍性大腸炎などの胃腸管病態の治療を目的とするｄＡｂ（商標）の十二指腸または結腸への局所送達を可能とするはずである。

シークエンスコンコーダンス（総ての配列はアミノ酸配列である）
配列番号 識別名
1 DOM1単一可変ドメイン
2 DOM2単一可変ドメイン
3 DOM3単一可変ドメイン
4 DOM6単一可変ドメイン
5 DOM7単一可変ドメイン
6 DOM101単一可変ドメイン
7 ヒトTNFα
8 ヒトIL-23
9 ヒトLAG-3
10 ヒトIL-6
11 ヒトIL-13
12 ヒトIL-18
13 ヒトTSLP
14 ヒトCD3D
15 ヒトCD3E
16 ヒトCD3G
17 ヒトCD3Z
18 ヒトTNFR1
19 ヒトCXCL2
20 ヒトCXCL5
21 ヒトGROA
22 ヒトCXCL3

Claims (17)

1. カモスタットメシル酸塩と単一可変ドメインとを含んでなる組成物。
2. 医薬組成物である、請求項１に記載の組成物。
3. 経口投与される、請求項１または請求項２に記載の組成物。
4. 単一可変ドメインが抗標的単一可変ドメインであり、標的がＴＮＦα、ＩＬ−２３、ＬＡＧ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＳＬＰ、ＣＤ３、前記のいずれか１つの受容体またはＥＬＲ受容体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 単一可変ドメインがＴＮＦα、ＩＬ−２３、ＬＡＧ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＳＬＰまたはＣＤ３を中和する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 単一可変ドメインが約６６℃以上の遷移中間点（Ｔｍ）を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 単一可変ドメインとカモスタットメシル酸塩の比が約１：０．１、１：１、１：１０、１：２５、１：５０または１：１００である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 腸溶コーティングされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 薬剤として使用するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 薬剤の製造のための請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
11. 薬剤が胃腸管病態を処置するためのものである、請求項９に記載の組成物または請求項１０に記載の使用。
12. 胃腸管病態がクローン病、潰瘍性大腸炎を含む大腸炎、セリアック病、ベーチェット症候群および口腔粘膜炎である、請求項１１に記載の組成物または使用。
13. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含んでなる、胃腸管病態を処置する方法。
14. プロテアーゼ豊富な溶液中で単一可変ドメインを安定化させる方法であって、カモスタットメシル酸塩を含んでなる組成物中に単一可変ドメインを配合した後にその組成物をプロテアーゼ豊富な溶液に曝すことを含んでなる、方法。
15. 単一可変ドメインとカモスタットメシル酸塩の比が約１：０．１、１：１、１：１０、１：２５、１：５０または１：１００である、請求項１４に記載の方法。
16. プロテアーゼ豊富な溶液が絶食下の人工腸液である、請求項１４または１５に記載の方法。
17. プロテアーゼ豊富な溶液が、トリプシン、キモトリプシンおよび／またはパンクレアチンを含んでなる溶液である、請求項１４または１５に記載の方法。

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