JP2015520733A - オリゴヌクレオチド送達のための、新規なジエステルおよびトリエステルベースの低分子量、生分解性カチオン性脂質 - Google Patents
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Abstract
Description
R1およびR2は、H、(C1〜C6)アルキル、ヘテロシクリル、およびポリアミンからなる群からそれぞれ独立に選択され、ここで前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、1〜3個のR’で任意選択的に置換されている;か、またはR1とR2は、それらが付いている窒素と統合して、窒素に加えて、N、OおよびSから選択される1個または2個の追加的ヘテロ原子を任意選択的に含む4〜7員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は1〜3個のR’で任意選択的に置換されている;
R3は、(C4〜C20)アルキルおよび(C4〜C20)アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは1〜3個のR’で任意選択的に置換されている;
R4は、(C1〜C16)アルキルおよび(C2〜C16)アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは1〜3個のR’で任意選択的に置換されている;
R5は、(C4〜C8)アルキルおよび(C4〜C8)アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、1〜3個のR’で任意選択的に置換されている;
R6は(C1〜C2)アルキルであり、前記アルキルは1〜3個のR’で任意選択的に置換されている;
Q1およびQ2はそれぞれ、独立に、結合、−OC(O)−、−C(O)O−、−SC(O)−、−C(O)S−、−OC(S)−、−S−S−、−C(R’’)=N−、−N=C(R’’)−、−C(R’’)=N−O−、−O−N=C(R’’)−、−C(O)(NR’’)−、−N(R’’)C(O)−、C(S)(NR’’)−、−N(R’’)C(O)−、−N(R’’)C(O)N(R’’)−、−OC(O)O−、OSi(R’’)2O−、−C(O)(CR’’2)C(O)O−および−OC(O)(CR’’2)C(O)−)からなる群から選択されるが、但し、Q1またはQ2のいずれかが結合であるとき、他方は結合ではない;
Xは、−OC(O)−、−C(O)O−、−SC(O)−、−C(O)S−、−OC(S)−、−S−S−、−C(R’’)=N−、−N=C(R’’)−、−C(R’’)=N−O−、−O−N=C(R’’)−、−C(O)(NR’’)−、−N(R’’)C(O)−、C(S)(NR’’)−、−N(R’’)C(O)−、−N(R’’)C(O)N(R’’)−、−OC(O)O−、OSi(R’’)2O−、−C(O)(CR’’2)C(O)O−および−OC(O)(CR’’2)C(O)−)からなる群から選択され、
R’の各出現は、ハロゲン、R’’、OR’’、SR’’、CN、CO2R’’およびCON(R’’)2からなる群から独立に選択される;
R’’の各出現は、Hおよび(C1〜C6)アルキルからなる群から独立に選択され、ここで前記アルキルはハロゲンおよびOHで任意選択的に置換されており;また
nは1、2、3、4または5である;)
で示されるか、またはそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体である。
(ここで
R1およびR2はそれぞれメチルであり;
nは3であり;
R3は(C4〜C20)アルキルおよび(C4〜C20)アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは1〜3個のR’で任意選択的に置換されている;
R4は(C1〜C16)アルキルおよび(C2〜C16)アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、R’から選択される1〜3個の置換基で任意選択的に置換されている;
R5は、(C4〜C8)アルキルおよび(C4〜C8)アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは1〜3個のR’で任意選択的に置換されている;
R6は(C1〜C2)アルキルであり、前記アルキルは1〜3個のR’で任意選択的に置換されている;
Q1およびQ2はそれぞれ、独立に、結合または−C(O)O−であるが、但しQ1またはQ2の何れかが結合であるとき、他方は結合ではない;
Xは−C(O)O−であり;そして
R’は上述の通りである;)
またはその薬学的に許容される塩または立体異性体
を特徴とする。
メチル(9Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタコス−9−エノアート(化合物1);
メチル8−[2−(9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物2);
メチル(9Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタコス−9−エノアート(化合物3);
メチル(9Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘキサコス−9−エノアート(化合物4);
メチル(9Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ペンタコス−9−エノアート(化合物5);
メチル(9Z)−21−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}トリアコント−9−エノアート(化合物6);
メチル(9Z)−21−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ノナコス−9−エノアート(化合物7);
メチル(9Z)−21−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタコス−9−エノアート(化合物8);
メチル(9Z)−21−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタコス−9−エノアート(化合物9);
メチル(11Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタコス−11−エノアート(化合物10);
メチル(7Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタコス−7−エノアート(化合物11);
メチル8−[2−(9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物12);
メチル8−[2−(9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘキサデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物13);
メチル8−[2−(9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ペンタデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物14);
メチル8−[2−(11−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}イコシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物15);
メチル8−[2−(11−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ノナデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物16);
メチル8−{2−[11−(ジメチルアミノ)オクタデシル]シクロプロピル}オクタノアート(化合物17);
メチル8−[2−(11−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物18);
メチル10−[2−(7−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘキサデシル)シクロプロピル]デカノアート(化合物19);
メチル6−[2−(11−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}イコシル)シクロプロピル]ヘキサノアート(化合物20);
エチル(7Z)−17−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘキサコス−7−エノアート(化合物21);
エチル6−[2−(9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタデシル)シクロプロピル]ヘキサノアート(化合物22);
(2Z)−ノナ−2−エン−1−イル10−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ノナデカノアート(化合物23);
(2−ヘキシルシクロプロピル)メチル10−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ノナデカノアート(化合物24);
(2Z)−ウンデク−2−エン−1−イル8−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタデカノアート(化合物25);
(2Z)−ヘプト−2−エン−1−イル12−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘニコサノアート(化合物26);
(2−オクチルシクロプロピル)メチル8−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタデカノアート(化合物27);
(2−ブチルシクロプロピル)メチル12−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘニコサノアート(化合物28);
メチル(19Z,22Z)−9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタコサ−19,22−ジエノアート(化合物29);
エチル(18Z,21Z)−8−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタコサ−18,21−ジエノアート(化合物30);
メチル9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}−16−(2−オクチルシクロプロピル)ヘキサデカノアート(化合物31);
エチル8−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}−15−(2−オクチルシクロプロピル)ペンタデカノアート(化合物32);
ジメチル(9Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタコス−9−エンジオアート(化合物33);および
1−メチル18−[(2Z)−ノナ−2−エン−1−イル]9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタデカンジオアート(化合物34);
またはそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体である。
DMFに溶解したアルコールの溶液をピリジニウムジクロマートで処理する。完了次第、反応を水でクエンチする。反応混合物を、水とヘキサンの間で分配し、有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過して真空で蒸発させ、粗酸(v)を生じさせる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。
下記の本発明の脂質ナノ粒子組成物(LNP)は、オリゴヌクレオチド、特にsiRNAおよびmiRNAの送達に有用である:
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG 56.6/38/5.4;
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG 60/38/2;
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG 67.3/29/3.7;
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG 49.3/47/3.7;
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG 50.3/44.3/5.4;
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−C−DMA/DSPC 40/48/2/10;
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG/DSPC 40/48/2/10;および
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG/DSPC 58/30/2/10。
脂質ナノ粒子(LNP)は、衝突ジェットプロセスで調製される。粒子は、アルコールに溶解した脂質を、クエン酸バッファに溶解したsiRNAと混合することによって形成される。脂質のsiRNAに対する混合比は、脂質45〜55%とsiRNA65〜45%を目標とする。脂質溶液は、本発明の新規なカチオン性脂質、ヘルパー脂質(コレステロール)、PEG(たとえばPEG−C−DMA、PEG−DMG)脂質、およびDSPCを、アルコール(たとえばエタノール)中に、9〜12mg/mLを目途に5〜15mg/mLの濃度で含むことができる。脂質の比率は、カチオン性脂質については35〜65を目途に25〜98モルパーセントの範囲を有することができ、ヘルパー脂質は30〜50を目途に0〜75モルパーセントの範囲を有することができ、PEG脂質は1〜6を目途に1〜15モルパーセントの範囲を有することができ、DSPCは0〜12を目途に0〜15モルパーセントの範囲を有することができる。siRNA溶液は、3.5〜5の範囲のpHを有するクエン酸ナトリウム緩衝塩溶液中に、0.3〜0.9mg/mLを目途に0.3〜1.0mg/mLの濃度範囲で、1つまたは複数のsiRNA配列を含むことができる。これらの2つの液体を、15〜40℃(目標30〜40℃)の範囲の温度まで加温し、次いで、衝突ジェットミキサー内で混合して直ちにLNPを形成する。ティー内径(teeID)は、0.25〜1.0mmの範囲および10〜600mL/分の全流量を有することができる。流量と管内径組合せは、LNPの粒径を30〜200nmに制御する効果がある。次いで、溶液を、より高いpHの緩衝化溶液と、1:1〜1:3容量:容量(1:2容量:容量を目途)の範囲の混合比で混合することができる。この緩衝化溶液は、15〜40℃の範囲(30〜40℃を目途)の温度である。混合されたLNPを、陰イオン交換濾過ステップの前に、30分〜2時間保持する。インキュベーション中の温度は、15〜40℃の範囲(目標30〜40℃)である。インキュベーション後、溶液を、陰イオン交換分離ステップを含む、0.8μmフィルターを通して濾過する。このプロセスは、1mm ID〜5mm IDの範囲の管内径および10〜2000mL/分の流量を使用することができる。LNPを濃縮し、限外濾過法(アルコールが除去され、クエン酸バッファが、たとえばリン酸緩衝食塩水等の、最終バッファ溶液に交換される)によって血液透析濾過する。限外濾過法は、タンジェント流濾過方式(TFF)を使用することができる。このプロセスは、30〜500KDの範囲の膜公称分画分子量を使用することができる。膜方式は、中空糸かまたはフラトシートカセットである。適切な分画分子量を用いたTFFプロセスは、LNPをリテンテート(retentate)中に保持することができ、濾液または透過水はアルコール;クエン酸バッファ;最終バッファ廃棄物を含む。TFFプロセスは、siRNA濃縮までの初期濃度が1〜3mg/mLの多段プロセスである。濃縮後、アルコールを除去し、バッファ交換を実施するために、LNP溶液を、10〜20容量の最終バッファに対して血液透析濾過する。材料を、さらに1〜3倍濃縮することができる。LNPプロセスの最終ステップは、濃縮LNP溶液を除菌濾過して生成物を瓶に入れることである。
1)siRNA濃度
siRNA二本鎖濃度は、2996PDA検出器を具備するWaters 2695 Alliance system(Water Corporation,Milford MA)を使用して、強陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ(SAX−HPLC)により測定する。LNP(別名RNAi送達媒体(RDV)と呼ばれる)を、0.5%Triton X−100で処理し、全siRNAを遊離させ、Dionex BioLC DNAPac PA200(4×250mm)カラムを使用し、254nmでUV検出して、SAX分離により分析する。移動相は、A:25mM NaClO4、10mM Tris、20%EtOH、pH7.0およびB:250mM NaClO4、10mM Tris、20%EtOH、pH7.0で構成され、0〜15分の線形勾配および流量1ml/分である。siRNA量は、siRNA標準曲線と比較することにより決定される。
蛍光試薬SYBR GoldをRNA定量化に使用して、RDVの封入率をモニターする。Triton X−100を含む、または含まない、RDVを使用して、遊離siRNA量および全siRNA量を決定する。このアッセイは、Molecular Devices(Sunnyvale,CA)製のSpectraMax M5eマイクロプレート分光光度計を使用して実施される。試料を485nmで励起し、蛍光発光を530nmで測定する。siRNA量は、siRNA標準曲線と比較することにより決定される。
封入率=(1−遊離siRNA/全siRNA)×100%
1μgのsiRNAを含有するRDVを、1×PBSで希釈して最終体積3mlにする。試料の粒径および多分散性は、ZetaPALS計器(Brookhaven Instruments Corporation,Holtsville,NY)を使用して、動的光散乱法により測定する。散乱強度は、25℃、散乱角90°で、He−Neレーザを用いて測定する。
1μgのsiRNAを含むRDVを、1mM Trisバッファ(pH7.4)で希釈して最終体積2mlにする。試料の電気泳動移動度は、電極および光源としてHe−Neレーザを具備するZetaPALS計器(Brookhaven Instruments Corporation,Holtsville,NY)を使用して決定する。スモルフスキー極限は、ゼータ電位の計算において仮定される。
個々の脂質濃度は、コロナ荷電化粒子検出器(CAD)(ESA Biosciences,Inc,Chelmsford,MA)を具備するWaters 2695 Alliance system(Water Corporation,Milford MA)を使用して、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)で決定される。RDV中の個々の脂質は、60℃で、CADを具備するAgilent Zorbax SB−C18(50×4.6mm,粒径1.8μm)カラムを使用して分析する。移動相は、A:H2O中0.1%TFAおよびB:IPA中0.1%TFAで構成される。勾配は、流量1ml/分で、0時における移動相A60%および移動相B40%から1.00分における移動相A40%および移動相B60%に;1.00〜5.00分における移動相A40%および移動相B60%;5.00分における移動相A40%および移動相B60%から10.00分における移動相A25%および移動相B75%に;10.00分における移動相A25%および移動相B75%から15.00分における移動相A5%および移動相B95%に;そして15.00における移動相A5%および移動相B95%から20.00分における移動相A60%および移動相B40%に、変えることができる。個々の脂質濃度は、二次曲線当てはめにより、RDV中の全脂質成分を含む標準曲線と比較することによって決定される。各脂質のモルパーセンテージは、その分子量に基づいて計算される。
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG 60/38/2
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG/DSPC 58/30/2/10
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG 60/38/2
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG/DSPC 40/48/2/10
カチオン性脂質/コレステロール/PEG−DMG/DSPC 58/30/2/10
有効性のマウス・インビボ評価
すぐ上に記述した組成式において、化合物1〜34を使用したLNPを、インビボ有効性について評価する。siRNAは、ホタル(フォチナス・ピラリス(Photinus pyralis))ルシフェラーゼ遺伝子(寄託番号M15077)のmRNA転写物をターゲットすることができる。ルシフェラーゼsiRNAの一次配列および化学修飾パターンは上に表示されている。インビボ ルシフェラーゼモデルは、ホタル ルシフェラーゼコード配列が全細胞に存在するトランスジェニックマウスを使用する。Dana Farber Cancer Instituteからライセンスを受けたROSA26−LoxP−Stop−LoxP−Luc(LSL−Luc)トランスジェニックマウスを、先ず組み換えAd−Creウイルス(VectorBiolabs)を用いてLSL配列を除去することにより、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するように誘導する。ウイルスの向臓器性のため、尾静脈注射により送達されるとき、発現は肝臓に限定される。肝臓におけるルシフェラーゼ発現レベルは、ルシフェリン基質(Caliper Life Sciences)の投与後に、IVISイメージャ(Xenogen)を使用して光出力を測定することにより定量化する。投与前発光レベルは、RDVの投与前に測定する。PBS中のルシフェリン(15mg/mL)を、150μLの量で腹腔内(IP)注射する。4分間インキュベートした後、マウスをイソフルランで麻酔し、IVISイメージャに入れる。PBS媒体中のRDV(siRNAを含有)を、0.2mLの量で尾静脈注射する。最終投与レベルは、0.1〜0.5mg/kg siRNAであり得る。コントロールとして、PBS媒体のみを投与する。投与後48時間に、上述の方法を使用してマウスを撮像する。ルシフェリン光出力の変化は、ルシフェラーゼmRNAレベルと直接的に相関があり、ルシフェラーゼsiRNA活性の間接的尺度を表す。インビボ有効性の結果は、投与前発光レベルと比較した、発光の%阻害として表される。
インビトロApoE結合アッセイ
LNPを、90%アカゲザル血清中、最終LNP濃度4μg/mLで、37℃でインキュベートする。インキュベーションは、軌道回転で、20分間である。インキュベーション後、試料をPBSで1:20希釈し、各希釈試料100μLを、抗−PEG抗体被覆96−ウェルプレート(Life Diagnosticsカタログ番号P−0001PL)のウェルに分取する。室温で1時間インキュベートした後、プレートをPBS 300μLで5回洗浄する。洗浄後、0.2%Triton X−100 50μLを各ウェルに加え、プレートを37℃で10分間インキュベートし、続いて、750rpmのプレートシェーカー上で1分間振盪する。試料のApoE ELISAおよびステム・ループPCR分析を実施する前に、試料を凍結する。
抗−PEG抗体プレートに結合したLNPの量に結合したApoEに正規化するために、抗−PEG抗体ウェルに保持されているsiRNAの量を、ステム・ループPCRで定量し、LNP当たりの封入されたsiRNA数と関連させ、結合した全LNP粒子のウェル当たりの近似測定値を与える。
コピー数を計算するために、siRNAの分子量(ApoB 17063では13693g/mol)を使用して、標準曲線を作成する。高標準は、3μl当たり1011コピーを含まなくてはならない。最低標準が3μl当たり102コピーを含むまで、アッセイプレートの一列全体に、10倍段階希釈を実施する。0.2%Triton X−100を水で1:80希釈し、希釈したTriton X−100 20μLを、96ウェルプレートの10ウェルにピペットで移す。30μLの段階希釈標準曲線およびミックスをプレートの各ウェルに加える。10μLの標準添加曲線を、逆転写反応で使用する。
PEG抗体プレート捕獲からのトリトン溶解物を無ヌクレアーゼ水で1:2000希釈する。10μLの「RT−Primer Mix」(Applied BiosystemのTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kitカタログ番号4366596)を96−ウェルMicro−AmpQPCRプレート(ABIカタログ番号N801−0560)の各ウェルに加える。
17063DC F3 GGCGCGAAATTTCAGGAATTGT(配列番号:12)
17063DC Pr2 CACTGGATACGACCTTTAACA(配列番号:13)
Universal R2 AGTGCAGGGTCCGAG(配列番号:14)
ヘパリンセファロースHI−TRAP(商標)結合アッセイ
中立表面電荷をもつ脂質ナノ粒子(LNP)は、泳動バッファとしての1X ダルベッコ(Dulbecco)リン酸緩衝食塩水(DPBS)と共にヘパリンセファロースに注入された後、保持されないが、カラム空隙容積中に溶離する。血清アポリポ蛋白質E(ApoE)はヘパリン硫酸と高親和性結合を示し、また精製されたおよび/または組み換え型のヒトApoEまたは血清試料とのインキュベーション後、LNPは、ApoEを結合するそれらの固有の能力に応じて(脂質ナノ粒子組成とApoE濃度の両方によって)ある程度、ヘパリンセファロースに結合することを示すことができる。高い親和性でヘパリンセファロースに結合する表面結合したApoEが付いた脂質ナノ粒子は、高塩(1M NaCl)でのみ溶離され得る。
最終siRNA濃度50μg/mL、37℃で20分間、脂質ナノ粒子を、1Xダルベッコのリン酸緩衝食塩水(DPBS)中の様々な濃度の精製されたまたは組み換え型のヒトアポリポ蛋白質Eかまたは0.1〜50%のラット/マウス/アカゲザル/ヒト血清のいずれかと共にインキュベートする。ApoEまたは血清LNPとインキュベートした後、試料を、1X DPBSを使用して10倍希釈し、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーで分析する。ApoE/血清とのインキュベーション後に高親和性ヘパリン相互作用にシフトするLNPのパーセンテージを決定するために、保持されたLNPのピーク面積(適切なブランクシグナルの減算後)を、ApoEおよび/または血清インキュベーションのないLNPコントロールの全ピーク面積と比較する。
ヘパリンセファロースHI−TRAP(商標)クロマトグラフィーカラム(GE Healthcare;1mLカラム床体積)を、1Xまたは2X ダルベッコのPBSのいずれかと平衡化させる;より高い2X塩濃度が、ヘパリンセファロースでの固有保持がより高いLNPに使用される(多分、より高い表面正電荷による)。
移動相A:1Xまたは2X DPBS
移動相B:10mMリン酸ナトリウムバッファ、pH7.0中、1M NaCl
100%Aが均一濃度で10分間送達され、続いて100%Bまで段階的勾配;さらに10分間保持;100%Aに戻るまで段階的勾配および次の試料を注入する前にさらに10分間再平衡化
流量:1mL/分
試料注入量:50μL
検出:UV@260nm
有効性および毒性のラットインビボ評価
上述の組成式の化合物を使用したLNPを、インビボ有効性およびアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増加について、Sprague−Dawley(Crl:CD(SD)メスラット(Charles River Labs)で評価する。siRNAは、ApoB遺伝子(寄託番号NM019287)のmRNA転写物をターゲットする。ApoB siRNAの一次配列および化学修飾パターンは上に表示されている。PBS媒体中のRDV(siRNAを含有)を、1〜1.5mLの量で尾静脈注射する。注入速度はおよそ3ml/分である。各投与群でラット5匹を使用した。LNP投与後、ラットを標準的な食餌および水のあるケージに入れる。投与後6時間に、飼料をケージから除去する。LNP投与の24時間後に動物の剖検を実施する。ラットをイソフルラン下で5分間麻酔し、次いで瀉血が完了するまで、イソフルランの送達を継続しながらラットをノーズコーンに入れることによって麻酔下で維持する。23ゲージ蝶形静脈穿刺セットを使用して血液を大静脈から採取し、血清化学分析のために、血清分離器バキュテナーに分取する。切除した肝葉のパンチを採取し、mRNA分析のためにRNALater(Ambion)に入れる。保存された肝組織をホモジナイズし、製造業者の取扱説明書に従って、QiagenビーズミルおよびQiagen miRNA−Easy RNA単離キットを使用して、総RNAを単離する。肝ApoB mRNAレベルを、定量的RT−PCRで測定する。ラットApoB市販プローブセット(Applied Biosystemsカタログ番号RN01499054_m1)を使用して、精製RNAからメッセージを増幅する。PCR反応は、96−ウェルFast Blockを具備するABI 7500計器で実施する。ApoB mRNAレベルを、ハウスキーピングPPIB(NM 011149)mRNAに正規化する。PPIB mRNAレベルは、市販のプローブセット(Applied Biosytemsカタログ番号Mm00478295_m1)を使用してRT−PCRで決定する。結果は、ApoB mRNA/PPIB mRNAの比率として表示される。全てのmRNAデータは、PBSコントロール用量と比較して表示される。血清ALTおよびAST分析は、Siemensアラニンアミノトランスフェラーゼ(カタログ番号03039631)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(カタログ番号03039631)試薬を使用して、Siemens Advia 1800 Clinical Chemistry Analyzerで実施する。
ラット/サル肝臓におけるカチオン性脂質の測定
肝組織を20mlバイアル内に秤量し、9v/wの水中で、GenoGrinder 2000(OPS Diagnostics、1600ストローク/分、5分)を使用してホモジナイズする。各組織ホモジネートのアリコート50μLを抽出/蛋白質沈降溶媒(500nM内部標準を含有する50/50アセトニトリル/メタノール)300μLと混合し、プレートを遠心分離して、沈降した蛋白質を沈殿させる。次いで、各上澄200μLを、96−ウェルプレートの別のウェルに移し、試料10μLをLC/MS−MSで直接分析する。
ApoB有効性のアカゲザルインビボ評価
上述の組成式の化合物を使用したLNPを、オスまたはメスのマカカ・ムラタ(Macaca mulatta)(アカゲザル)でインビボ有効性について評価する。siRNAは、ApoB遺伝子(寄託番号XM 001097404)のmRNA転写物をターゲットする。ApoB siRNAの一次配列および化学修飾パターンは上に表示されている。PBS媒体中のRDV(siRNAを含有)は、注入速度20mL/分、投与レベル0.25mg/kg siRNAで、伏在静脈における静脈注射により投与される。注入量は、1.9〜2.1mL/kgであり、サルは体重2.5〜4.5kgの範囲であってもよい。RDVまたはPBSコントロールを、サル3匹に投与する。投与後複数日に、血清化学分析用に血液試料1mLを大腿動脈から採取する。サルを、採血前に一晩絶食させる。有効性の尺度として、ApoB mRNA減少の下流代理マーカーとしてのLDL−Cをモニターする。
β−カテニン有効性のアカゲザルインビボ評価
試験−7日目に、腹腔鏡下外科的切除術(サル1匹について、ランダムに選択された1肝葉の外縁から、1生検試料の切除)によって、投与前肝生検試料(約0.5〜1g/試料)をオス・アカゲザルから採取する。各投与前生検から3つの隣接していない約50mg試料をサンプリングするために、5mm組織パンチを使用する。後のCTNNB1 mRNA分析のために、試料をRNAlater(商標)(Ambion)中で保存する。
BSA(m2)=0.11*体重(kgで)0.65
試験2日目および7日目に、LNP投与後48時間および168時間に、肝生検試料(約0.5〜1g/試料)を、腹腔鏡下外科的切除術によりサルから採取する(サル1匹につき2つの別々の、ランダムに選択された肝葉が切除される)。48時間および168時間外科的生検試料のそれぞれについて、3つの隣接していない約50mg試料をサンプリングするために、5mm組織パンチを使用する。後のCTNNB1 mRNA分析のために、試料をRNAlater(商標)(Ambion)中で保存する。
mRNA(%ノックダウン)=100−(100/2−ΔΔCt)
ALT上昇のアカゲザルインビボ評価
遠心分離後、凝固したサル全血から採取される血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)を測定する。Roche Modular System自動化学アナライザーは、国際臨床化学連合(International Federation of Clinical Chemistry)標準手順および試薬を使用することにより、血清中のALTの酵素活性を測定する。アナライザーのコンピュータは、標準曲線と比較して試料中のALT活性を計算するために、吸光度測定値を使用する。ALT活性は、リットル当たりの国際単位(IU/L)で報告される。
Claims (7)
- 式A:
(ここで:
R1およびR2は、H、(C1〜C6)アルキル、ヘテロシクリル、およびポリアミンからなる群からそれぞれ独立に選択され、ここで前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、1〜3個のR’で置換されていてもよく;
またはR1とR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、前記窒素に加えて、場合によりN、OおよびSから選択される1個または2個の追加的ヘテロ原子を含む、4〜7員の単環式複素環を形成することができ、前記単環式複素環は、1〜3個のR’で置換されていてもよく;
R3は、(C4〜C20)アルキルおよび(C4〜C20)アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、1〜3個のR’で置換されていてもよく;
R4は、(C1〜C16)アルキルおよび(C2〜C16)アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、1〜3個のR’で置換されていてもよく;
R5は、(C4〜C8)アルキルおよび(C4〜C8)アルケニルからなる群から選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、1〜3個のR’で置換されていてもよく;
R6は、(C1〜C2)アルキルであって、1〜3個のR’で置換されていてもよく;
Q1およびQ2は、それぞれ独立に、結合、−OC(O)−、−C(O)O−、−SC(O)−、−C(O)S−、−OC(S)−、−S−S−、−C(R’’)=N−、−N=C(R’’)−、−C(R’’)=N−O−、−O−N=C(R’’)−、−C(O)(NR’’)−、−N(R’’)C(O)−、C(S)(NR’’)−、−N(R’’)C(O)−、−N(R’’)C(O)N(R’’)−、−OC(O)O−、OSi(R’’)2O−、−C(O)(CR’’2)C(O)O−および−OC(O)(CR’’2)C(O)−)からなる群から選択され、但し、Q1またはQ2のいずれかが結合であるとき、他方は結合ではなく;
Xは、−OC(O)−、−C(O)O−、−SC(O)−、−C(O)S−、−OC(S)−、−S−S−、−C(R’’)=N−、−N=C(R’’)−、−C(R’’)=N−O−、−O−N=C(R’’)−、−C(O)(NR’’)−、−N(R’’)C(O)−、C(S)(NR’’)−、−N(R’’)C(O)−、−N(R’’)C(O)N(R’’)−、−OC(O)O−、OSi(R’’)2O−、−C(O)(CR’’2)C(O)O−および−OC(O)(CR’’2)C(O)−)からなる群から選択され、
R’の各出現は、ハロゲン、R’’、OR’’、SR’’、CN、CO2R’’およびCON(R’’)2からなる群から独立に選択され;
R’’の各出現は、Hおよび(C1〜C6)アルキルからなる群から独立に選択され、ここで前記アルキルは、ハロゲンおよびOHで置換されていてもよく;そして
nは1、2、3、4または5である)、
またはそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体。 - 請求項1に記載の式Aのカチオン性脂質、
(ここで:
R1およびR2は、それぞれメチルであり;
nは、3であり;
R3は、(C4〜C20)アルキルおよび(C4〜C20)アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、1〜3個のR’で置換されていてもよく;
R4は、(C1〜C16)アルキルおよび(C2〜C16)アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、1〜3個のR’で置換されていてもよく;
R5は、(C4〜C8)アルキルおよび(C4〜C8)アルケニルから選択され、前記アルキルまたはアルケニルは、1〜3個のR’で置換されていてもよく;
R6は、(C1〜C2)アルキルであり、1〜3個のR’で置換されていてもよく;
Q1およびQ2は、それぞれ独立に、結合または−C(O)O−であり、但しQ1またはQ2のいずれかが結合であるとき、他方は結合ではなく;そして
Xは、−C(O)O−である)、
またはそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体。 - メチル(9Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタコス−9−エノアート(化合物1);
メチル8−[2−(9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物2);
メチル(9Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタコス−9−エノアート(化合物3);
メチル(9Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘキサコス−9−エノアート(化合物4);
メチル(9Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ペンタコス−9−エノアート(化合物5);
メチル(9Z)−21−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}トリアコント−9−エノアート(化合物6);
メチル(9Z)−21−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ノナコス−9−エノアート(化合物7);
メチル(9Z)−21−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタコス−9−エノアート(化合物8);
メチル(9Z)−21−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタコス−9−エノアート(化合物9);
メチル(11Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタコス−11−エノアート(化合物10);
メチル(7Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタコス−7−エノアート(化合物11);
メチル8−[2−(9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物12);
メチル8−[2−(9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘキサデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物13);
メチル8−[2−(9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ペンタデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物14);
メチル8−[2−(11−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}イコシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物15);
メチル8−[2−(11−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ノナデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物16);
メチル8−{2−[11−(ジメチルアミノ)オクタデシル]シクロプロピル}オクタノアート(化合物17);
メチル8−[2−(11−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタデシル)シクロプロピル]オクタノアート(化合物18);
メチル10−[2−(7−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘキサデシル)シクロプロピル]デカノアート(化合物19);
メチル6−[2−(11−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}イコシル)シクロプロピル]ヘキサノアート(化合物20);
エチル(7Z)−17−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘキサコス−7−エノアート(化合物21);
エチル6−[2−(9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタデシル)シクロプロピル]ヘキサノアート(化合物22);
(2Z)−ノナ−2−エン−1−イル 10−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ノナデカノアート(化合物23);
(2−ヘキシルシクロプロピル)メチル 10−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ノナデカノアート(化合物24);
(2Z)−ウンデク−2−エン−1−イル 8−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタデカノアート(化合物25);
(2Z)−ヘプト−2−エン−1−イル 12−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘニコサノアート(化合物26);
(2−オクチルシクロプロピル)メチル 8−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタデカノアート(化合物27);
(2−ブチルシクロプロピル)メチル 12−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘニコサノアート(化合物28);
メチル(19Z,22Z)−9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタコサ−19,22−ジエノアート(化合物29);
エチル(18Z,21Z)−8−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタコサ−18,21−ジエノアート(化合物30);
メチル9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}−16−(2−オクチルシクロプロピル)ヘキサデカノアート(化合物31);
エチル8−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}−15−(2−オクチルシクロプロピル)ペンタデカノアート(化合物32);
ジメチル(9Z)−19−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}ヘプタコス−9−エンジオアート(化合物33);および
1−メチル18−[(2Z)−ノナ−2−エン−1−イル]9−{[4−(ジメチルアミノ)ブタノイル]オキシ}オクタデカンジオアート(化合物34);
から選択されるカチオン性脂質:
またはそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体。 - 請求項1に記載の式Aのカチオン性脂質、コレステロール、DSPCおよびPEG−DMGを含むLNP組成物。
- 脂質ナノ粒子の調製のための、請求項1に記載のカチオン性脂質の使用。
- オリゴヌクレオチド類の送達のための脂質ナノ粒子中の構成成分としての、請求項1に記載のカチオン性脂質の使用。
- 前記オリゴヌクレオチドがsiRNAである、請求項6に記載の使用。
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