JP2015519890A - 幹細胞よりナチュラルキラー細胞を発生させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は概して幹細胞分化の分野に関する。より具体的には、本発明は癌細胞および/またはウイルス感染細胞の殺滅に使用することができるナチュラルキラー細胞を発生させるための方法に関する。
ナチュラルキラー細胞(NK)細胞は細胞傷害性リンパ球であり、自然免疫系における役割を果たす。例えば、NK細胞はウイルス感染細胞および腫瘍に応答することができる。NK細胞は獲得免疫応答における役割も果たす。一般に、NK細胞は骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃、および胸腺において分化および成熟する。
「分化」は培養中かインビボであまり特殊化していない細胞が、分化が無い同一条件下にあるときよりも特殊化した細胞種の細胞になって、少なくとも1つの新しい細胞種の子孫細胞を形成する過程のことである。ある特定の条件下では、その新しい細胞種の特徴を有する子孫細胞の割合は好ましい順に少なくとも約1%、5%、25%またはそれより高い割合であり得る。
「培養された(cultured)」という用語は、細胞に関して本明細書中において使用される場合、インビトロ環境において細胞***を行っている、または細胞***を行っていない1個以上の細胞を指すことができる。インビトロ環境は、例えば適切な液体培地または寒天培地などのインビトロでの細胞の維持に適切である当技術分野において公知のあらゆる培地のことであり得る。
多能性細胞は、本実施形態の分化プロトコルの前に様々な方法を用いて未分化状態で培養および維持され得る。ある特定の実施形態では、多能性細胞は、限定フィーダー非依存培養系を用いて、例えば、TeSR培地またはE8培地(例えば、参照により組み込まれるChen et al., Nat. Methods, 8(5):424−429, 2011を参照のこと)において基本的に未分化状態で培養および維持され得る。例えば、TeSR培地は未分化ヒト胚性幹細胞を培養するために使用され得る限定培地である。TeSR培地にはTeSR1培地とmTeSR培地の両方が含まれる。TeSRはbFGF、LiCl、γ‐アミノ酪酸(GABA)、ピペコリン酸およびTGFβを含み、TeSRを利用する様々な方法が以前に、例えば、参照により全体が組み込まれる米国特許出願公開第2006/0084168号およびLudwig et al. (2006a、2006b)に記載されている。あるいは、非限定条件を用いることができる。例えば、多能性細胞は、未分化状態で幹細胞を維持するために線維芽細胞フィーダー細胞上または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地上で培養され得る。
本明細書に開示される方法は、未分化幹細胞(hESC、iPSC)より造血細胞を発生させるための適切な条件を提供することを対象にする。幹細胞の分化は胚様体(EB)の形成によって誘導される。転写因子と細胞表面抗原の発現の分析から、その方法により幹細胞が通常のヒト個体発生の間に観察されるものと類似の発生カイネティクスに従うようにすることができると示唆される。
1.TrypLE適応未分化hESC/iPSCを低密度MEFフィーダー上またはフィーダー細胞の非存在下で維持する。遠心EB分化を始める1日または2日前にTrypLE適応hESC/iPSCを新しいMEF(または無フィーダー系)に1:1の比率で継ぎ、それにより分化開示日にそれらの細胞が80%〜90%の集密になる。
2.遠心EBの播種を準備するために各96ウェルプレートの外側の36ウェルに150μlの滅菌水をピペットで分注して蒸発によるウェル体積の減少を最小限にする。
3.hESC/iPSCから培地を吸引し、1.0mlの加熱済みTrypLE Selectを各ウェルに添加する。ES/iPSCがプレートから剥離し始めるまでプレートを恒温器(37℃)に設置する。TrypLEが加熱済みの場合、これには通常約5分かかり、プレートを5分よりも長く恒温器に設置したままにしないことが好ましい。
4.解離させた細胞をコニカルチューブに収集し、ピペット内で上げ下げして集塊を壊す。TrypLEを1倍体積のウシ血清アルブミン(BSA)ポリビニルアルコール基本脂質BPEL培地と少なくとも1倍体積のDPBSで希釈する。細胞を1500rpm、8℃で5分間遠心する。上清を除き、細胞を5mlのBPEL培地と5mlのDPBSに再懸濁する。細胞を再度遠心する。
5.上清を除き、細胞を5〜10mlのBPEL培地に再懸濁する。集塊を除去するために細胞を70μmのフィルターに通して新しい50mlのコニカルチューブに移す。フィルターに通した細胞の数を数え、播種のために使用される細胞を50mlのコニカルチューブに等分する。細胞を遠心し、そして、それらをステージI遠心EB分化培地で再懸濁して3×104細胞/mlにする。
6.外側のウェルに150μlの水を入れて準備した96ウェルプレートの内側の60ウェルのそれぞれに100μlの細胞アリコットを移す。96ウェルプレートを480g、8℃で4分間遠心する。プレートを37℃、5%CO2で8〜11日間、造血前駆CD34+CD45+細胞が作製されるまで保温する。EBが形成している分化の最初の3日の間はプレートを乱さないこと(注記5)。ある特定の条件下でCD34+細胞のパーセンテージは約40%〜60%であり得、CD34+CD45+細胞のパーセンテージは最大で20%〜40%であり得る。第11日までに好適な分化により初期EBの周囲により多くの造血細胞があるはずである。EB中に残っている大半の細胞は内皮/間葉系前駆細胞集団である。
1.半分ずつの培地の交換を5〜6日毎に実施する。最初の週の間にNK細胞分化培地は10ng/mlのIL−3を含み、最初の培地の交換でそれを取り除く。NK細胞発生の表現型解析はフローサイトメトリーにより実施され得る。
2.成熟CD45+CD56+NK細胞が得られる。それらの細胞はフローサイトメトリーにより表現型解析され得る。hES/iPS細胞由来NK細胞のインビトロ機能は標準51Cr放出アッセイまたは細胞傷害性顆粒もしくはサイトカインの放出についての免疫学的アッセイによる腫瘍細胞(例えば、K562)への直接細胞溶解活性の測定によって分析され得る。
上記のとおり、一連の方法を用いてさらにNK細胞の作製のための造血前駆細胞の集団を作製することができる。ある特定の好ましい態様では、造血前駆細胞は限定培養条件を用い、且つ、フィーダー細胞を使用することにより作製される。例えば、多能性細胞を部分的に、基本的に、または完全に解離または個別化した後にそれらの細胞を限定培地中でさらに培養して造血系分化を促進することができる。多能性細胞の造血前駆細胞と造血細胞系列への分化を実質的に促進することができるのは特別な組合せの増殖因子である。特別な組合せの増殖因子の順次適用を用いて多能性細胞の造血系分化をさらに促進することができる。ある特定の実施形態では、特別な組合せの増殖因子が多能性細胞の造血系分化に重要である。例えば、BMP4、VEGF、Flt3リガンド、IL−3、およびGMCSFの組合せを使用して造血系分化を促進することができる。ある特定の態様では、BMP4とVEGF(および所望によりFGF−2)を含む第1培地への細胞培養物の順次曝露と続くFlt3リガンド、IL−3、およびGMCSFを含む第2培地中での培養により多能性細胞の造血前駆細胞および造血細胞への造血系分化を増加させることができる。幾つかの態様では、BMP4とVEGFを含有する培地にFGF−2(例えば、50ng/ml)を含めて多能性細胞からの造血前駆細胞の作製効率を少なくとも2倍にすることができる。
本明細書に記載されるように、好都合にも1つ以上の限定培地を使用して多能性細胞の造血前駆細胞および/またはNK細胞への造血系分化を促進することができる。とりわけ、血清およびマウスフィーダー層などの動物製品の排除により動物製品への細胞の曝露に関するリスクを減少させることができ、より安全にヒト対象へ投与され得るだろう細胞の作製が可能になる。伝統的な幹細胞培養物の発生は幹細胞の様々な細胞種への分化に適した血清製品とマウスフィーダー層に依存していたので、これらの伝統的手法は分化が実施され得る規模を制限し、生物学的変動性と汚染物混入の可能性を上昇させ、且つ、他の場合であれば有用であることが分かるところであるES細胞の応用治療法における使用を非常に妨げてきている。本実施形態に従って使用され得る様々な培地成分が下に詳述される。
様々な増殖因子を使用して多能性細胞の造血前駆細胞への造血系分化を促進することができる。ある特定の実施形態では、本実施形態の限定培地は、例えば、(BMP−4およびVEGF)または(BMP−4、VEGF、FLT−3、IL−3、およびGMCSF)などの1つ、2つ、またはそれより多くの増殖因子を含有し得る。
骨形成タンパク質−4(BMP−4)は骨形成タンパク質グループのメンバーであり、腹部中肺葉誘導物質である。BMPは成体のヒト骨髄(BM)において発現し、且つ、骨再形成と骨成長に重要である。ある特定の実施形態では、BMP4を含むことは培養の最初の2〜3日に必要とされるだけであり、その後はその系から取り除くことができ、分化に有害な効果は無い。
血管内皮細胞増殖因子(VEGF)は胚循環系の形成と血管形成に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。VEGFは血管内皮および他の細胞種(例えば、ニューロン、癌細胞、腎臓上皮細胞)を含む様々な細胞種に影響を与え得る。インビトロではVEGFは内皮細胞の細胞***促進と細胞移動を刺激することができる。VEGF機能は癌、糖尿病、自己免疫疾患、および眼血管疾患を含む様々な疾患状態において重要であることも示されている。
塩基性線維芽細胞増殖因子はbFGFまたはFGF−2とも呼ばれ、四肢神経系の発生、創傷治癒、および腫瘍増殖を含む広範囲の生物学的プロセスに関係があるとされている増殖因子である。bFGFはヒト胚性幹細胞のフィーダー非依存増殖を支援するために使用されてきているが (Ludwig et al., 2006)、以前の研究より、bFGFが造血細胞の発生または生存に影響を与える可能性はないことが示されている (Ratajczak et al., 1996.)。ある特定の実施形態では、bFGFは分化誘導のために必要とされない。したがって、様々な実施形態では、それは本実施形態の培地に含まれ得る、または本実施形態の培地から除外され得る。
インターロイキン−3(IL−3)は多能性造血細胞の生存、増殖および分化に関与する造血性増殖因子である。ヒトを含む5種の哺乳類動物においてIL−3をコードする遺伝子が単離され、発現されて成熟型組換えタンパク質を産出している。ヒトIL−3遺伝子は2個の保存的システイン残基と2か所の可能性があるN−結合グリコシル化部位を有する133アミノ酸からなるタンパク質をコードする(Wagemaker et al., 1990)。
Flt3リガンドはFLT−3リガンドとも呼ばれ、FLT3の内在性リガンドである。FLT3は未成熟造血前駆細胞によって発現される受容体チロシンキナーゼである。FLT3のリガンドは経膜タンパク質または可溶性タンパク質であり、且つ、造血系細胞および骨髄間質細胞を含む様々な細胞によって発現される。他の増殖因子と組み合わせてFlt3リガンドは幹細胞、骨髄前駆細胞およびリンパ系前駆細胞、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞の増殖および発生を刺激することができる。受容体の活性化により、造血細胞における増殖、生存および他のプロセスを制御する様々なシグナル伝達経路に関与することが知られている様々な重要なアダプタータンパク質のチロシンリン酸化が引き起こされる。FLT3とFLT3に影響する突然変異は白血病の予後と治療など、病理学上の疾患にも重要である (Drexler et al., 2004)。
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子はGM−CSFまたはGMCSFと略記されることもあり、マクロファージ、T細胞、肥満細胞、内皮細胞および線維芽細胞によって分泌されるタンパク質である。GMCSFは白血球増殖因子として機能し得るサイトカインであり、GMCSFは幹細胞を刺激して顆粒球(好中球、好酸球、および好塩基球)および単球を産生することができる。単球は血液循環より退出し、マクロファージに成熟することができる。したがって、GMCSFは免疫/炎症カスケードにおける役割を果たすことができ、それによって少数のマクロファージの活性化が、感染に立ち向かうための重要なプロセスであるそれらの数の急速な増加を引き起こすことができる。活性型のGMCSFは通常インビボではホモ二量体として細胞外に見出される。GMCSFは酵母細胞内で発現されるとモルグラモスチムまたはサルグラモスチム(リューカイン)とも呼ばれる。ある特定の実施形態では、組換え技術により作製された増殖因子を使用して多能性細胞の造血系分化を促進することができる。
幹細胞因子(SCF)はCD117(c−Kit)に結合するサイトカインである。SCFは「KITリガンド」、「c−kitリガンド」、または「スチール因子」としても知られる。SCFは2つの形態で、すなわち、細胞表面結合型SCFと可溶性(または遊離型)SCFの形態で存在する。可溶性SCFは通常メタロプロテアーゼによる表面結合型SCFの切断によりインビボで産生される。SCFは造血幹細胞および他の造血前駆細胞の生存、増殖、および分化に重要であり得る。インビボではSCFは赤血球系における最初期の赤血球前駆細胞であるBFU−E(赤芽球バースト形成単位)細胞をCFU−E(赤血球コロニー形成単位)に変えることができる。
インターロイキン−6(IL−6)は炎症誘発性サイトカインである。インビボではIL−6はT細胞とマクロファージによって分泌され、且つ、炎症を引き起こす外傷または他の組織損傷に対する免疫応答を刺激する。IL−6はある特定の細菌に対する応答において役割を果たすこともでき、骨芽細胞はインビボでIL−6を分泌して破骨細胞形成を刺激する。ヒトでは数多くの血管の中膜における平滑筋細胞が炎症誘発性サイトカインとしてIL−6を産生することができ、IL−6は発熱の重要なインビボメディエーターである。
トロンボポエチンまたはTPOは主に肝臓と腎臓によってインビボで産生され、且つ、骨髄において血小板のインビボ産生に関与する糖タンパク質ホルモンである。ある特定の実施形態では、TPOは本実施形態の培地の中に約2.5〜約100ng/mLまで、5〜約75ng/mLまで、約10〜約50ng/mLまで、約15〜約35ng/mLまで、約25ng/ml、またはそれらの中に導き出せるあらゆる範囲の濃度で含まれる。ある特定の実施形態では、TPOは限定培地の中に約2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45または約50ng/mLの濃度で含まれる。
本発明の一層さらなる態様では、ES細胞のアポトーシスを減少させる、または(例えば、細胞集団の分割中またはEBの形成前の)細胞の解離の後に生存を促進する分子などの追加の培地成分をES細胞増殖培地の中に含めることができる。限定培地はES細胞の播種、培養、維持、または分化のために使用され得、且つ、Rho非依存性キナーゼの阻害剤および/またはタンパク質キナーゼC(PKC)の阻害剤を含有し得る。ある特定の実施形態では、ROCK阻害剤および/またはPKC阻害剤を使用して個別化後の多能性細胞の生存分化効率を向上させることができる。ある特定の実施形態では、ROCK阻害剤および/またはPKC阻害剤を、TeSRまたはmTeSR培地およびマトリックス成分を含む播種用培地に含めることができる。
限定培地は栄養素、アミノ酸、抗生物質、緩衝剤などのような追加の成分を含有することもできる。ある特定の実施形態では、本実施形態の限定培地は非必須アミノ酸、L−グルタミン、ペニシリン・ストレプトマイシン、およびモノチオグリセロールを含有し得る。
胚性幹細胞またはiPSCからの造血(例えば、CD34+、CD43+)前駆細胞の調製の後にその細胞集団からさらに進んだ細胞、または実質的に分化した細胞(例えば、造血前駆細胞、内皮細胞など)の1つ以上の亜集団を実質的に精製または分離することが望ましいことがあり得る。FACSなどのフローサイトメトリー、または磁気活性化細胞選別を用いる細胞分離の方法を用いて異種細胞集団から造血細胞を分離することができる。例となる細胞分離プロトコルも下の実施例に示されている。
磁気活性化細胞選別機(MACS)を使用して分化したhESCから細胞を単離することができる。MACSは通常抗CD34抗体などの抗体を磁性ビーズと組合せて利用してカラム上で細胞を分離する。MACSは、ある特定の実施形態では、おそらくはFACSに伴う細胞へのレーザー照射のため、FACSと比べて細胞に対してより穏やかであり、細胞の生存性と完全性に好適に影響し得る。
蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてCD34+細胞を分離することもできる。FACSは細胞を分離するために、例えば、蛍光タグを含む抗CD34抗体への結合に起因して細胞により示される程度または蛍光を活用する。この様にFACSは異種細胞集団から造血系CD34+細胞を分離するために使用され得る。
幹細胞の培養および/または多能性細胞からのNK細胞の分化のための1つ以上のステップを自動化することができる。ロボットまたは他のものによる自動化を用いる工程の自動化により細胞の生産、培養、および分化のためのより効率的で経済的な方法が可能になり得る。例えば、ロボットによる自動化はヒト胚性幹細胞の培養、継代、培地の添加、分化培地の添加、分化培地での培養、および、例えば磁気分離またはFACSを用いる細胞種の分離のうちの1つ以上に当たって活用され得る。
本実施形態の幾つか態様はaAPCおよびNK細胞組成物の調製におけるその使用に関連する。抗原提示系の調製と使用に関する全般的な案内については、例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,225,042号、第6,355,479号、第6,362,001号および第6,790,662号、米国特許出願公開第2009/0017000号および第2009/0004142号、および国際公開第2007/103009号)を参照のこと。
この系の効率の改善と成分の明確化によってhESC/iPSC由来細胞の臨床応用が実現可能になる。現在のNK細胞ベースの養子免疫療法はキログラム当たり約2×107細胞からなるNK細胞含有臨床製品(通常約50%のNK細胞を含む)を使用する (Miller et al., 2005)。我々のaAPCを含まない方法は約13×106個の未分化hESCまたはiPSC(約1枚の6ウェルプレート)からこの数のNK細胞を提供するだろう。aAPCを使用することは患者当たり106個未満の未分化hESC/iPSCしか現行のNK細胞用量で必要とされないことを意味するだろう。
次の実施例は本発明の好ましい実施形態を示すために含まれている。当業者は、これに続く実施例において開示される技術は本発明の実施においてよく機能すると発明者により発見された技術であり、したがって、本発明の実施の好ましい形態を構成すると考えられ得ることを理解すべきである。しかしながら、当業者は本開示に照らして、多くの変更を本発明の精神と範囲から逸脱することなく開示されている特定の実施形態に実行することができ、それでも同様または類似の結果を得ることができることを理解するべきである。
本実施形態の方法
図1は未分化幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法の実施形態の流れ図(100)を示す。方法(100)は未分化hESCまたはiPSCなどの未分化幹細胞を使用する。その方法は、第1無血清培地の中に未分化幹細胞を配置すること(102)、遠心凝集により、第1無血清培地の中で未分化幹細胞を凝集させ(104)、且つ遠心EBを形成すること、遠心EBから前駆細胞の産生を誘導するために第1無血清培地の中で遠心EBを培養すること(106)、および前駆細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための第2無血清培地の中で前駆細胞を培養すること(108)を含む。
癌治療のためのヒト多能性幹細胞からのナチュラルキラー細胞の臨床規模の誘導
hESC/iPSCの維持と間質細胞介在性分化
hESC(H9およびH1)およびiPSC(UCBiPS7、NHDF−iPS、BJ1−iPS)をマウス胚性線維芽細胞(MEF)上で維持した。M210−B4細胞(アメリカ培養細胞系統保存機関、マナサス、バージニア州)上での造血前駆細胞の間質細胞介在性分化を以前に記述されたように(Hill et al., 2010、Tian et al., 2009、Woll et al., 2009)実行した。簡単に説明すると、未分化hESCまたはiPSCを、RPMI1640(インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州)、15%の限定胎児ウシ血清(FBS)(ハイクローン社、ローガン、ユタ州)、2mMのL−グルタミン(セルグロ(Cellgro)社、マナサス、バージニア州)、1%の非必須アミノ酸(インビトロジェン社)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(インビトロジェン社)、および0.1mMのβ‐メルカプトエタノール(インビトロジェン社)を含有する培地中でM210−B4上に配置した。培地を週に3回交換し、18〜21日後にCD34+CD45+前駆細胞濃縮(Woll et al., 2009)のために細胞を回収した。100,000個のCD34+CD45+細胞を1mLのNK細胞惹起サイトカイン(インターロイキン[IL]−3、IL−7、IL−15、幹細胞因子[SCF]、fms様チロシンキナーゼ受容体−3リガンド[FLT3L]、全てニュージャージー州、ロッキーヒルのペプロテック社より)と共にEL08−1D2間質上に配置した。NK細胞培養物には4〜5日毎に0.5mLのサイトカイン含有培地が注がれた。成熟NK細胞をEL08−1D2上での培養から28〜35日の時点で測定した。
凝集しやすい遠心EBを作製するためにhESCおよびiPSCを低密度MEF(例えば、90,000細胞/ウェル)上のTrypLE Select(インビトロジェン社)中において最少でも10継代の間継代させた。遠心EB試験について、発明者らは将来のインビボ実験のために緑色蛍光タンパク質/ホタルルシフェラーゼコンストラクト(Tian et al., 2009) で改変されたH9株を使用した。iPSCについて、発明者らは臍帯血(UCB)CD34+造血前駆細胞に由来するUCBiP7株を試験した。TypLE適応hESCまたはiPSCを作製するため、約60%〜70%集密状態の培養物を解離させ、70μmの滅菌フィルターに通した。どのような分化の兆候も欠く純粋なhESCの培養物だけを使用した。細胞を通常hESC培地の中で低密度MEFと1:1で、細胞増殖によって通常10継代目辺りで起きる、より希釈された比率での継代が可能になるまで継代した。ステージIの遠心EBになるTrypLE通過hESCを樹立するために約70%の集密度の適応した細胞をTrypLEで解離させ、70μmのフィルターに通してあらゆる集塊を取り除いた。その後、細胞を計数し、丸底96ウェルプレートのウェル当たりSCF(40ng/ml)、血管内皮細胞増殖因子(20ng/ml)、および骨形成タンパク質4(20ng/ml)を含有するBPEL(ウシ血清アルブミンポリビニルアルコール基本脂質)培地中に3000細胞の濃度(100μlの体積)で配置した。BPEL培地は200mlの体積で作製され、且つ、イスコブの改変ダルベッコ培地(86ml;インビトロジェン社)、GlutaMAX I含有F12栄養混合物(86ml;インビトロジェン社)、10%の脱イオン化ウシ血清アルブミン(5mL;シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州)、5%ポリビニルアルコール(10ml;シグマ・アルドリッチ社)、リノール酸(1mg/ml溶液の20μL、シグマ・アルドリッチ社)、リノレン酸(1mg/ml溶液の20μL、シグマ・アルドリッチ社)、シンセコール500倍溶液(シグマ・アルドリッチ社)、α−モノチオグリセラル(シグマ・アルドリッチ社)、無タンパク質ハイブリドーマ混合物II(インビトロジェン社)、アスコルビン酸(5mg/ml、シグマ・アルドリッチ社)、GlutaMAX I(インビトロジェン社)、インスリン‐トランスフェリン‐セレニウム100倍溶液(インビトロジェン社)、ペニシリン/ストレプトマイシン(インビトロジェン社)を含有した。プレートの外側のウェルを滅菌水で満たして培地のあらゆる蒸発を防いだ。その後、プレートを室温で1,500RPM、5分間遠心して凝集させ、5%CO2を含む37℃の恒温器内で平静に設置した。プレートの中での遠心EBの形成を確実にするために細胞を少なくとも3日間取り出さなかった。
遠心EB分化の11日目に96ウェルプレートの6ウェルを上記のNK細胞惹起増殖因子の24ウェルプレートの1つのウェルに直接移した。最初、それらの24ウェルプレートはウェル当たり100,000個の放射線照射(3000rad)EL08−1D2細胞を含有した。完全限定条件について、6ウェルの遠心EBを未被覆24ウェルプレートに直接移した。分析日に各ウェルを回収、濾過、および洗浄した。
次の抗体を使用した:全てベクトン・ディッキンソン社(フランクリンレイクス、ニュージャージー州)からのCD34−APC、CD45−PE、CD31−PE、CD31−APC、CD−73PE、CD43−PE、NKp46−PE、NKp44−PE、CD56−APC、NKG2D−PE、TRAIL−PE、FASリガンド−PE、CD16−PercpCy5.5、およびCD117−PercpCy5.5、ベックマン・コールター社(フラートン、カリフォルニア州)から得たCD158a/h−PE、CD158j−PE、CD158i−PE、CD158e1/e2、およびCD159a−PEおよびCD159a−APC、eBioscience社(サンディエゴ、カリフォルニア州)から得たCD107aPercpCy5.5およびINF−γPacBlue。フローサイトメトリーはBD FACS CaliburまたはLSRII(BDバイオサイエンス社、サンディエゴ、カリフォルニア州)で実行され、データはFlowJo(ツリースター社、アシュランド、オレゴン州)を使用して解析された。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)のために全RNAがRNeasyミニキット(キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州)を使用して細胞から調製された。全RNAの単離に続いて相補性DNAがSuperscript III逆転写酵素(ライフテクノロジーズ社、グランドアイランド、ニューヨーク州)を使用して作製された。その後、RT−PCRがペルティア・サーマルサイクラー200を使用して表1に記載されるプライマーとサイクル数で生じたcDNAに対して実施された。アニーリング温度はOCT4を除く全てのプライマーについては55℃に設定され、OCT4は60℃のアニーリング温度を有した。その後、PCRの産物を電気泳動により0.9%アガロースゲルで分離した。
腫瘍標的(K562、SVP10、S2013、OPM2、RPMI8226、U266)をクロム51(51Cr)と共に37℃で2時間保温し、3回洗浄し、表示されているエフェクター対標的(E:T)比率でNK細胞と共培養した。4時間の期間の後に細胞を回収し、分析した。特異的な51Cr溶解が次の等式を使用して計算された:特異的溶解のパーセンテージ=100×(試験放出−自然放出)/(最大放出−自然放出)。リダイレクト抗体依存的細胞性細胞傷害(ADCC)アッセイについてP815標的を上記のように保温した。標的細胞へのNK細胞の添加の30分前にエフェクターをアイソタイプ対照(カタログ番号400153;バイオレジェンド社、サンディエゴ、カリフォルニア州)またはNKp46抗体(カタログ番号331904;バイオレジェンド社)のどちらかと保温した。5時間の保温の後に細胞を回収し、上記のように分析した。
NK細胞を1:1のエフェクター対標的比率でK562標的と共に、またはK562標的を含まずに保温した。CD107a−PerCPCy5.5抗体を各ウェルに添加し、1時間保温した。その後、GolgiStopとGolgiPlug(BDバイオサイエンス社)を各ウェルに添加し、さらに4時間保温した。保温の完了時に細胞を洗浄し、CD56APCで染色し、氷上において2%のパラホルムアルデヒドで10分間固定した。その後、細胞は1%のサポニンを4℃で20分間用いて透過処理され、洗浄され、IFNγについて染色された。
NK細胞培養物の中で得られた間質に特徴的な内皮細胞と間葉系間質細胞(MSC)を評価するため、非接着性細胞を最初に洗い流し、その後、接着層をトリプシン処理し、洗浄した。細胞を内皮マーカー(CD31)およびMSCマーカー(CD73)、ならびに造血系マーカー(CD45)、単球/マクロファージマーカー(CD14、CD15)、および樹状細胞マーカー(CD11c)で染色した。NK細胞発生を支援する間質細胞層(EL08−1D2、ヒト臍静脈内皮細胞[HUVEC]、無フィーダー間質)のそれぞれの能力を評価するため、それぞれを24ウェルプレートのウェル当たり100,000細胞の割合で配置し、放射線照射した(3,000rad)。HUVECを以前に記載されたように培養した(Hill et al., 2010)。その後、各ウェルに臍帯血に由来する500個のCD34+細胞を播種した。間質無しの条件はUCB由来CD34+細胞と培地のみを含有した。その後、細胞を上記の標準NK細胞条件下で培養した。
EL08−1D2またはフィーダー不使用条件からhESC由来NK細胞を増殖させるため、それぞれをクローン9.mbIL−21人工抗原提示細胞(aAPC) (Denman et al., 2012)との培養下に置いた。培養第1週の間にaAPCを10,000radで放射線照射し、2:1の比率でNK細胞に添加した(第0日)。その後のaAPCを用いる刺激(7日毎)では1:1の比率であった。培養物に週に3回栄養補給し(RPMI1640、15%のFBS、1%のペニシリン/ストレプトマイシン、50U/mlのインターロイキン−2)、最適な増殖のために細胞数を250,000細胞/mLに維持した。
群間の差異はPrism4(グラフパッド・ソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州)を使用するスチューデントのt検定ポストホック分析またはANOVAを用いて比較された。結果は0.05以下のP値で有意であると見なされた。
初期の研究は2つの異なるhESC株(H1およびH9)および3つの異なるiPSC株(BJ1−iPS12、UCBiPS7、およびDRiPS16)の造血細胞とNK細胞の発生能を比較するために間質細胞共培養モデル (Ni et al., 2011、Woll et al., 2009、Woll et al., 2005) を使用した。UCBiPS7とDRiPS16を発明者らの研究室で得て、特徴解析した。この方法では、hESCまたはiPSCはFBSのみを含有する培地の中でM210−B4間質細胞上で培養される。3週間の期間にわたって全てのhESC株およびiPSC株はCD34とCD45を共発現する造血前駆細胞を産生した(図8A、8B、および10)。H9細胞は最も高いパーセンテージのCD34とCD45を発現する造血前駆細胞(6.46±1.75%)を生じさせたが、他のhESC株およびiPSC株は一貫してより少ない数の造血前駆細胞を産出した:H1hESC株について1.45±0.18%、UCBiPS7株について2.46±1.71%、DRiPS16株について0.92±0.14%、およびBJ1−iPS株について1.43±0.35%(図8B)。これらの数は、間質細胞ベースの系を使用する造血系発生の効率が比較的制限される(Choi et al., 2009、Ledran et al., 2008) 、発明者らおよび他の者が以前に示したものと類似している。様々なiPSC株が様々な数の造血前駆細胞を生じさせることを示した後で、我々はhESC/iPSC由来CD34+CD45+細胞集団のそれぞれからNK細胞を作製した。ここで、CD34+CD45+細胞を選別し、マウス間質細胞株EL08−1D2およびサイトカイン(SCF、FLT3L、IL−15、IL−7、IL−3) (Woll et al., 2009)を含むヒトNK細胞発生を支援することが知られている条件で4週間培養した。hESCまたはiPSCの別個の株が様々な頻度で造血前駆細胞を生じさせたが、各細胞株は表現型が成熟した機能性NK細胞を産生することができた。hESC由来NK細胞とiPSC由来NK細胞の両方はCD56、キラー免疫グロブリン様受容体(KIR)、CD16、NKp44、NKp46、およびNKG2Dを発現する細胞の均一な集団からなる(図10)。また、5種全てのhESC/iPSC集団に由来するNK細胞が、末梢血から単離されたNK細胞(PB−NK)と同様に腫瘍細胞を殺滅することができた(図8C)。これらの結果は、個々のhESCおよびiPSCは造血前駆細胞を派生するそれらの能力に再現性がある差異を有するが、それぞれが成熟した細胞傷害性について活性があるNK細胞を作製することができることを示した。
hESCまたはiPSCからのNK細胞の誘導を仲介するために、および培養効率を改善するために必要とされる特定の刺激をより良く理解するための努力の中で、発明者らはこれらの方法を完全無フィーダーおよび無血清培養系に翻訳するための段階的アプローチをとった。まず、「遠心EB」方法 (Ng et al., 2008、Ng et al., 2005) を使用して造血前駆細胞を作製するために未分化hESCおよびiPSCを支援した。ここで、限定された数(3,000細胞)の未分化hESC(H9)またはiPSC(UCBiPS7)を96ウェル形式で無血清培地の中で遠心して凝集させた(図2)。11日の期間にわたってこれらの培養物は造血細胞発生と増殖を示した(図4A)。この方法はM210−B4マウス間質の必要性を取り除いただけではなく、発明者らはこの方法がhESCとiPSCの両方からの造血前駆細胞のより高頻度でより一貫した作製を可能にすることを見出した。hESCについて、発明者らは大部分の造血細胞がCD34を発現し(55.9±6.4%)、多くがCD43(41.8±9.51%)またはCD45(26.2±6.6%)を共発現することを見出した(図4Bおよび4C)。iPSCはCD34+細胞(12.06±5.40%)およびCD45+細胞(3.20±1.43%)も産生したが、通常hESCよりも少なかった。この方法はhESCとiPSCの両方についてM210−B4間質ベースの系に対する著しい改善をもたらす(図8A、8B、および10)。
hESCおよびiPSCからのNK細胞発生に必要とされる条件をより完全に明確化するため、発明者らは次にNK細胞促進サイトカイン(IL−3、IL−7、IL−15、SCF、FLT3L)を含有し、EL08−1D2または他の外来性間質細胞を含まない無フィーダーおよび無血清ステージII系における遠心EB由来細胞を試験した(図2)。移転後の最初の2週間以内にEL08−1D2間質を用いて見られるものと同様のレベルで遠心EBに由来する非接着性造血細胞の増殖があった(図12A)。なお、発明者らはこれらの細胞がそれら自体の接着性細胞を培養下で産生し始めることを見出した(図12B)。発明者らはhESCからの内皮細胞(EC)と間葉系間質細胞(MSC)の発生を以前に示している(Hill et al., 2010、Kopher et al., 2010)。ここで、発明者らはこれらの細胞種(CD34+CD31+ECとCD34+CD73+MSC)の両方(図16)が遠心EB培養物の中で日常的に産生されることを示した。骨髄に存在するECおよびMSCなどの非造血細胞はインビボでNK細胞を支援することが知られているので、発明者らはこれらの接着性細胞はインビトロでhESCからのNK細胞の成長を効率的に支援することができると仮説を立てた (Carson et al., 1997、Mrozek et al., 1996)。顕著なことに、発明者らは遠心EB間質細胞層がNK細胞発生とKIRの獲得に重要であることが知られているMHCクラスI分子(HLA−A、B、CおよびHLA−E)(Kim et al., 2005)に加えて高レベルのCD31およびCD73を発現することを見出した(図12C)。なお、これらの遠心EB由来間質細胞はEL08−1D2間質と同様に、且つ、ヒト臍静脈内皮細胞またはサイトカイン単独よりも効率的にUCB由来CD34+細胞からのNK細胞の発生を支援する(図12D)。
このEBベースのアプローチは顕著な増殖および臨床的実用可能性を示すが、発明者らは次に別の臨床的に操作可能な方法を介して作製されるNK細胞の数をさらに増加させることを目標とした。近年、幾つかのグループが養子免疫療法用のT細胞またはNK細胞の増殖にaAPCを使用している (Fujisaki et al., 2009、Denman et al., 2012)。このアプローチの1つの主要な障害は高レベルのインビトロ増殖がテロメアの短縮化と細胞老化を引き起こすことである。DenmanらはPB−NK細胞の顕著な増殖を引き起こすが、テロメアの長さとインビトロ活性を維持する膜結合型IL−21(クローン9.mbIL−21)を発現するaAPC株を作製した (Denman et al., 2012)。発明者らはこれらのaAPCがhESC由来NK細胞のさらなる増殖を引き起こし得るか試験し、クローン9.mbIL−21発現aAPCがEL08−1D2由来NK細胞と無フィーダー由来NK細胞の両方でさらに2〜3倍の対数増加を仲介することを見出した。aAPC増殖性細胞はそれらのNK細胞表現型ならびにインビトロ活性を維持した(図6Bおよび6C)。なお、これらのhESC由来NK細胞は2か月よりも長い間に培養状態で維持され得、断続的に増殖させられ得た。まとめると、遠心EB法とaAPC増殖は癌免疫療法のためにhPSCから充分なヒトNK細胞を作製するための直接的で応用可能なアプローチを提供する。
インビボ輸送と免疫療法を研究するための操作されたヒト胚性幹細胞由来リンパ球
hESC維持および造血系分化
hESCを低密度(90,000細胞/6ウェルプレートのウェル)のマウス胚性線維芽細胞(MEF)上に維持した。hESCからの造血前駆細胞の作製は確立された方法(Ng et al., 2008)を用いて達成された。凝集しやすい遠心胚様体(EB)を作製するためにhESCおよびiPSCを低密度MEF(90,000細胞/ウェル)上のTrypLE Select(インビトロジェン社)中において継代させた。hESC由来NK細胞をインビボで追跡するために我々はGFP/ホタルルシフェラーゼコンストラクトで改変されたH9株を使用した (Tian et al., 2009)。60%〜70%辺りの集密状態のTrypLE適応hESCを解離させ、70ミクロンの滅菌フィルターに通した。その後、細胞を計数し、丸底96ウェルプレートのウェル当たり幹細胞因子(SCF、40ng/mL)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF、20ng/mL)、および骨形成タンパク質4(BMP4、20ng/mL)を含有するBPEL培地(Ng et al., 2008)の中に3000細胞の濃度(100mLの体積)で配置した。プレートの外側のウェルを滅菌水で満たして培地のあらゆる蒸発を防いだ。その後、プレートを室温で1,500RPM、5分間遠心して凝集させ、5%CO2を含む37℃の恒温器内で平静に設置した。
分化第11日に96ウェルプレートの6ウェルを、NK細胞惹起サイトカイン(IL−3、IL−7、IL−15、SCF、fms様チロシンキナーゼ受容体−3リガンド(FLT3L)、全てペプロテック社より)の24ウェルプレートの1つのウェルに直接移した(Woll et al., 2009)。NK細胞培養物には4〜5日毎に0.5mLのサイトカイン含有培地が注がれた。成熟NK細胞を培養から28〜35日の時点で測定した。NK細胞培養の4週間後に人工抗原提示細胞(aAPC)を使用して細胞をさらに増殖した(Denman et al., 2012).
K562細胞をアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)から入手した。mbGLucを発現するK562細胞は次のように作製された。まず、膜結合型ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ(mbGluc)を、次のプライマーを使用してPCR増幅した:5’−CATACAGAATTCATGGCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTT−3’(配列番号15)および5’−CATACAGAATTCGGATCCCTATTATTGAATCCGCCTGTGGTT−3’(配列番号16)。EcoRI部位に下線が引いてある。次にmbGluc断片を消化し、EcoR1消化したmCAGsプロモーターと内部リボソーム侵入部位(IRES)の間にEcoRIスプライス部位を含有するpKT2−mCAGs−IRES−GFP:zeoコンストラクトにサブクローン化した。方向はサブクローン化されたmbGluc配列の遠位末端内部の部位における制限酵素消化により確認された。K562細胞を発現するturboFP650を作製するために我々はプライマー5’−CATACAATCGATATGGGAGAGGATAGCGA−3’(配列番号17)および5’−CATACAAGATCTATCAGTTATCTAGATCCGGT−3’(配列番号18)を使用してturboFP650(エブロジェン(Evrogen)社)を含有する配列を上記のようにPCR増幅した。ClaI部位とBglII部位に下線をそれぞれ引いてある。次にPCR断片をClaIとBglIIで消化し、pKT2−mbGluc−IRES−GFP:zeoコンストラクトへGFP:zeo融合タンパク質の代わりにライゲートした。その後、確認されたコンストラクトはLonza4Dヌクレオフェクター装置を使用してK562細胞に形質移入された。Turbo−FP650発現K562細胞をFACsAria細胞選別機(BDバイオサイエンス社)で選別した。
腫瘍接種の24時間前に6〜8週齢の非肥満糖尿病/γ鎖ノックアウト型重症複合免疫不全(NOD/SCID/gC−/−)マウス(ジャクソン・ラボラトリーズ社)に致死未満線量(225〜250cGy)の放射線照射を施した。総計で1×106個のmbGluc+ K562細胞またはmbGluc+/turboFP650+ K562細胞を20%のFBS(ライフテクノロジーズ社)が添加された200mLのイスコブの改変ダルベッコ培地(IMDM)(ハイクローン・ラボラトリーズ社)に再懸濁した。その後、細胞をマウスの左上胸部に皮下注射した。腫瘍を4日間(mbGluc+)または7日間(turboFP650+)生着させた。その後、20%のFBSが添加された300mLのIMDMに再懸濁された10×106個のhESC−NK細胞のIP注射をマウスに施した。全ての実験について、NK細胞点滴を受領しないマウスが陰性対照として含まれ、腫瘍のみのマウスが腫瘍移植の陽性対照として含まれた。全てのマウスがNK細胞注射後の最初の7日の間に毎日IL−2(1×104U/マウス)とIL−15(10ng/マウス)のIP注射を受け、続いてマウスが殺処理されるまで2〜3日毎にIL−2のみのIP注射を受けた。全てのマウスがミネソタ大学の動物実験委員会により表明されたガイドラインと米国国立衛生研究所の動物実験ガイドに従って飼育され、処置され、取り扱われた。腫瘍進行とNK細胞輸送を同時に追跡するために我々は二元画像法計画を活用した。mbGluc+ K562細胞とFluc+ hESC−NK細胞を追跡するために生物発光画像撮影がXenogen IVIS Spectrum画像撮影システム(カリパー(Caliper)ライフサイエンス社)を使用して実施された。画像撮影の前にマウスをイソフルランにより麻酔した。生物発光画像は、セレンテラジン(320mg;ナノライト・テクノロジー社)のIV注射から10〜15秒後に、またはD−ルシフェリン(150mg/kg;GOLDバイオテクノロジー社)のIP注射から10分後に1分の露光を用いて獲得された。マウスをセレンテラジンの注射後に個体ごとに画像撮影し、D−ルシフェリンの注射前に回復させた。光学画像はLiving Imageソフトウェア第4.2版(カリパー・ライフサイエンス社)を使用して解析された。
殺処理時に収集された腫瘍組織を10%ホルマリン中で24〜36時間固定し、パラフィンに包埋した。標準的なプロトコルに従って4ミクロンの切片がミクロトームを使用して切り出され、非帯電スライドグラスに貼り付けられ、再水和された。スライドはOsterスチーマー中で30分間pH6.0のクエン酸緩衝液を用いて前処理され、そして、15分間冷却させられた。一次抗体を次の濃度で使用した:ヒトNKp46(R&Dシステムズ社;AF1850、1:100)、IgG1κアイソタイプ対照(eBioscience社;カタログ番号14−4714−82、1:50)。抗体検出はホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンとDABクロマジェン(chromagen)(コーヴァンス社)によるものであった。組織切片をヘマトキシリン中で対比染色した。実験毎にヒト扁桃組織を陽性対照として染色し、且つ、NK細胞注射を受けていないマウスの腫瘍組織を陰性対照として染色した。画像は10倍、40倍、および63倍の対物レンズの倍率で撮影された。
マウス異種移植モデルにおけるリンパ球輸送を試験するために発明者らはhESCからNK細胞を誘導するよく特徴解析されている分化プロトコルを用いた (Woll et al., 2005、Ni et al., 2011、Woll et al., 2009)。hESC由来NK細胞はインビトロとインビボの両方で強力な抗腫瘍活性を有するが、腫瘍の消失はNK細胞輸送の直接的な結果であることが示されていた。ホタルルシフェラーゼとGFPを発現するように改変されたhESC(Tian et al., 2009) を使用して、発明者らは最初に造血前駆細胞に分化し、後にNK細胞に分化する能力を示した(図17)。hESC由来NK細胞の機能をインビボでさらに探索するために発明者らはNK細胞の存続性および輸送、ならびに腫瘍組織量をモニターするためのモデルを開発した。発明者らはIV経路またはIP経路を介して免疫不全マウスに移転されたときのhESC由来NK細胞の生存を比較した。通常、養子免疫療法のエフェクター細胞はIV投与されてきた。養子移入されたNK細胞を用いる白血病の治療にとって、これらのエフェクターが脾臓および骨髄を含む腫瘍病変部位に移動し得ることが重要である。しかしながら、これは卵巣癌などの全ての悪性腫瘍に最適な送達系ではあり得ない。なお、IPアプローチを使用する非造血系区画または非リンパ系区画へのNK細胞の注射はより厳密な輸送試験を提供し得る。マウスは最初の7日の間にIL−2(10,000単位/マウス)とIL−15(10ng/マウス)の注射も受け、続いて試験の終了まで1日おきにIL−2(10,000単位/マウス)の注射も受けた。NK細胞のIP送達を受けているマウスはIV注射されたマウスと比べて長くなった存続性を有した(図18)。NK細胞のIV送達は最初にマウスの肺に細胞を輸送したが、第4日までに無くなった。一方、NK細胞のIP送達は4週間よりも長い存続性を引き起こす。第19日にマウスを殺処理し、末梢血、脾臓、骨髄、および腹膜の中での生着を調査した。NK細胞送達の両方の経路が、GFP+とCD56+CD45+細胞表面抗原によって測定されると末梢血、骨髄、および脾臓の中で低レベルの生着を有した。しかしながら、IV注射したマウスまたは対照と比べてIP注射したマウスの腹膜において高レベルのNK細胞が存在した(図18)。これは生物発光画像法データと一致し、且つ、NK細胞のIP送達がインビボでNK細胞の改善された存続性を可能とし、輸送の研究に最適であろうという結論になった。
次に発明者らは、リンパ球存続性のよく特徴解析されているレポーターとして我々のhESC由来NK細胞によって安定して発現されるホタルルシフェラーゼ(Na et al., 2012、Negrin and Contag, 2006)をインビボで利用した。hESC由来NK細胞の強力な抗腫瘍活性をインビボで示す以前の研究はルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞を使用した。しかしながら、発明者らはNK細胞を同時に追跡することができなかった。NK細胞と腫瘍の両方を同じマウスで撮影するために発明者らはガウシアルシフェラーゼファミリーの別のルシフェラーゼレポーターを採用した。膜につながれるように改変された組み換え型のそのガウシアタンパク質(膜結合型ガウシアルシフェラーゼ、mbGluc)(Santos et al., 2009)を使用して、発明者らは2つの異なる基質を利用して腫瘍とNK細胞の両方を同じマウスで撮影することができた。発明者らはmCAGSプロモーターによって駆動されるスリーピング・ビューティー(Sleeping Beauty)骨格にmbGluc遺伝子を最初にサブクローン化した。発明者らはK562腫瘍細胞を安定的に形質導入し、ルシフェリン(ホタルルシフェラーゼによって活性化される)には応答しないが、基質であるセレンテラジン(ガウシアルシフェラーゼによって活性化される)に応答するルシフェラーゼ活性を有する細胞を選択することができた。
ホタルルシフェラーゼと併せてmbGlucを使用することにより、信頼できるが、技術的には困難であるNK細胞輸送を研究するためのモデルが提供された。これは主にガウシアルシフェラーゼの基質であるセレンテラジンが静脈内送達される必要があるからである。これは幾つかの理由のために困難であった。まず、基質の消失動態のため、限られた数のマウスしか同時に画像撮影することができなかった(Santos et al., 2009)。また、セレンテラジン基質を繰り返し注射することにより時間と共に尾静脈の損傷が引き起こされる。このことを打開するために発明者らは、インビボで画像撮影され得るつい最近記載された蛍光レポーター (Scherbo et al., 2010、Lin et al., 2009)を利用した。TurboFP650は赤色側に偏移した蛍光レポーター(励起592nm、発光650nm)であり、最適なインビボ画像撮影のための組織浸透性を有する。それは2つ目の基質の送達を必要することもない。発明者らはスリーピング・ビューティーを使用してK562細胞中でturboFP650タンパク質を発現させるために同様のクローニングアプローチを用いた。TurboFP650の安定な発現はフローサイトメトリーにより測定された。1週間よりも長い期間の安定的な形質導入を確認した後に上と同じパラメーターを用いて細胞を選別した。選別された細胞はTurboFP650タンパク質の発現を維持し、さらなるインビボ試験に使用した(図20)。
腫瘍部位におけるNK細胞を決定的に示すために発明者らはマウスから取り出された腫瘍をより詳しく調べた。腫瘍部位におけるヒトNK細胞の存在を確認するために発明者らは腫瘍を取り出し、それらをパラフィン包埋し、免疫組織化学をNK細胞輸送の定性的な確認手段として用いた。腫瘍のみ(NK細胞注射無し)の群およびアイソタイプ対照と比べて、生物発光画像法により示されたNK細胞輸送を有するマウスはIHCでNKp46により示されるように存在するヒトNK細胞を有した(図21)。ヒト扁桃組織を陽性対照として用いた。NKp46は、CD56が他の種類の組織も標識することができるので、ヒトNK細胞のより特異的なマーカーである。IHC染色で陽性のNK細胞は染色された各腫瘍組織切片全体に均一に散在しており、切片当たり15〜20個のhESC由来NK細胞が存在した。これらのデータはNK細胞の腫瘍部位への輸送、およびホタルルシフェラーゼを使用する生物発光画像法がリンパ球のインビボ輸送を研究するための有効なモデルであることをさらに支持する。
これらの研究により、hESC由来NK細胞の腫瘍部位への輸送を示し、且つ、hESC/iPSC由来NK細胞が腫瘍細胞をインビボで直接殺滅するという仮説を強力に支持することができたことが重要である。二元生物発光画像撮影モデルを活用しなかったら、輸送は識別するのがもっと困難であったろう。なお、生物発光画像法を用いることによりIHCよりも簡単で迅速な定量が可能となった。全てのマウスが生物発光画像法により輸送を大いに示したわけではなく、輸送の兆候は9〜12日にわたる範囲であった。しかしながら、生物発光定量は腫瘍領域においてNK細胞シグナルの蓄積に著しい差異を示す(図20)。いくらかのNK細胞の輸送は我々の検出限界未満である可能性がある。すなわち、NK細胞は実際に腫瘍に移動することができるが、腫瘍環境内に留まるための正確なシグナルを受け取らない。この場合では、腫瘍内存続性と活性を改善するために腫瘍特異的受容体を有するNK細胞を改変することができるだろう(Moon et al., 2011)。これは、ヒトT細胞においてキメラ抗原受容体を使用して近年達成された (Porter et al., 2011、Carpenito et al., 2009)。hESCおよびiPSCはそのような改変のために最適なプラットフォームを提供する。それらの研究は、非改変hESC由来NK細胞が疾患を消失させるために腫瘍部位に移動するという我々の最初の発見も確認する。
次の参照文献は、それらが本明細書において記載される細目を補完する例となる処置または他のことについての細目を提供する限り、特異的に参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許第6,225,042号明細書
米国特許第6,355,476号明細書
米国特許第6,362,001号明細書
米国特許第6,790,662号明細書
米国特許第6,815,450号明細書
米国特許第6,943,172号明細書
米国特許第7,348,339号明細書
米国特許第7,459,424号明細書
米国特許出願公開第2009/0017000号明細書
米国特許出願公開第2009/0004142号明細書
欧州特許出願公開第00187371号明細書
国際公開第98/30679号
国際公開第00/057913号
国際公開第00/078351号
国際公開第2007/103009号
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Claims (43)
- 未分化幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法であって、
無血清培地中に未分化幹細胞を配置すること、
遠心凝集により、前記無血清培地の中で前記未分化幹細胞を凝集させ、且つ遠心胚様体を形成すること、
前記遠心胚様体からの前駆細胞の産生を誘導するために前記無血清培地の中で前記遠心胚様体を培養すること、および
第2無血清培地の中で前記前駆細胞を培養して前記前駆細胞より前記ナチュラルキラー細胞を作製すること
を含む前記方法。 - 前記未分化幹細胞が未分化ヒト胚性幹細胞(hESC)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記未分化幹細胞が未分化人工多能性幹細胞(iPSC)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1無血清培地が前駆細胞の産生を誘導するための増殖因子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1無血清培地がSCF複合体、骨形成タンパク質4(BMP4)、および血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を含む、請求項1に記載の方法。
- マウス間質が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施する、請求項1に記載の方法。
- マウス間質細胞が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記第2無血清培地がナチュラルキラー細胞誘導性増殖因子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2無血清培地がインターロイキン3(IL3)、インターロイキン7(IL7)、インターロイキン15(IL15)、SCF複合体、およびFms関連チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3L)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2無血清培地の中で前記前駆細胞を培養する前記ステップが、外来性間質細胞が存在しない状態にある、請求項1に記載の方法。
- 前記第2無血清培地の中で前記前駆細胞を培養する前記ステップが、外来性間質細胞が存在しない状態にある、請求項1に記載の方法。
- 前記前駆細胞がCD34を発現するCD34+細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記前駆細胞がCD34とCD43を共発現するCD34+CD43+細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記前駆細胞がCD34とCD45を共発現するCD34+CD45+細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、前記前駆細胞が発現するタンパク質に基づいて前記前駆細胞を選別する細胞選別ステップを前記遠心胚様体培養ステップと前記前駆細胞の培養の間に含まない、請求項1に記載の方法。
- 作製される前記ナチュラルキラー細胞がCD56、キラー免疫グロブリン様受容体(KIR)、CD16、NKp44、NKp46、およびNKG2Dのうちの1つ以上を発現する、請求項1に記載の方法。
- 人工抗原提示細胞(aAPC)を不活性化して不活化aAPCを作製すること、および
前記ナチュラルキラー細胞を前記不活化aAPCと共培養すること
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記共培養ステップが1:1の前記不活化aAPCに対する前記ナチュラルキラー細胞の比率を有する、請求項17に記載の方法。
- 不活化aAPCを作製するための薬剤で人工抗原提示細胞(aAPC)を処理すること、および
インターロイキン2(IL2)を含む培地の中で前記ナチュラルキラー細胞を前記不活化aAPCと共培養すること
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記共培養ステップが約5:1から1:5の前記不活化aAPCに対する前記ナチュラルキラー細胞の比率を有する、請求項19に記載の方法。
- 多能性幹細胞よりナチュラルキラー細胞を作製するための方法であって、
(a)第1無血清培地の中で前記多能性幹細胞を凝集させ、それによって胚様体を形成すること、
(b)第2無血清培地の中で前記胚様体を培養し、それによって造血前駆細胞を作製すること、および
(c)インターロイキン3(IL−3)、インターロイキン7(IL−7)、インターロイキン15(IL−15)、SCF、およびFms関連チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3L)を含む第3無血清培地の中で前記造血前駆細胞を培養し、それによってナチュラルキラー細胞を作製すること
を含む前記方法。 - 前記多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞(hESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)である、請求項21に記載の方法。
- 遠心凝集によって前記の凝集を実施する、請求項21に記載の方法。
- 前記第2無血清培地がSCF、骨形成タンパク質4(BMP4)、および血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を含む、請求項21に記載の方法。
- マウス間質またはマウス間質細胞が存在しない状態で前記胚様体を培養する前記ステップを実施する、請求項21に記載の方法。
- 外来性の間質または間質細胞が存在しない状態で前記造血前駆細胞を培養する前記ステップを実施する、請求項21に記載の方法。
- 前記造血前駆細胞がCD34を発現する、請求項21に記載の方法。
- 前記造血前駆細胞がCD34とCD43を共発現する、請求項21に記載の方法。
- 前記造血前駆細胞がCD34とCD45を共発現する、請求項21に記載の方法。
- 前記方法が細胞選別ステップをステップ(b)とステップ(c)の間に含まない、請求項21に記載の方法。
- 作製される前記ナチュラルキラー細胞がCD56、キラー免疫グロブリン様受容体(KIR)、CD16、NKp44、NKp46、およびNKG2Dのうちの1つ以上を発現する、請求項21に記載の方法。
- 前記ナチュラルキラー細胞を不活化人工抗原提示細胞(aAPC)と共培養することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 約5:1から1:5の不活化aAPCに対するナチュラルキラー細胞の比率で前記共培養を実施する、請求項32に記載の方法。
- インターロイキン2(IL2)を含む培地の中で前記ナチュラルキラー細胞を不活化aAPCと共培養することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- ステップ(b)の培養を6〜20日間実行する、請求項21に記載の方法。
- ステップ(c)の培養を20〜60日間実行する、請求項21に記載の方法。
- 必要とする患者に請求項21に記載の方法によって作製されたナチュラルキラー細胞の有効量を投与することを含む、患者を治療する免疫療法。
- (a)請求項21に記載の方法によってナチュラルキラー(NK)細胞の集団を作製すること、および
(b)必要とする患者に前記NK細胞の有効量を投与すること
を含む、患者を治療する免疫療法。 - 前記患者が癌患者である、請求項38に記載の方法。
- 前記患者が感染症を有する、請求項39に記載の方法。
- 前記患者がウイルス感染症を有する、請求項40に記載の方法。
- 前記患者がヒト免疫不全ウイルス(HIV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、B型肝炎ウイルス(HBV)またはC型肝炎ウイルス(HCV)に感染している、請求項41に記載の方法。
- 前記多能性細胞が前記患者に由来する、請求項38に記載の方法。
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