JP2015514811A - 特異的免疫グロブリン遺伝子組み換えワクシニアウイルスに感染している細胞の選択を容易にするための融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年4月26日に出願された米国仮出願第61/639,046号、2012年12月3日に出願された米国仮出願第61/732,776号、および2013年3月15日に出願された米国非仮出願第13/844,388号の優先の恩典を主張し、各出願の内容は、これによって、参照によりその全体が組み入れられる。
本明細書と共に出願されたASCIIテキストファイル(名称:"1843....071PC02_SequenceListing_ascii.txt"、サイズ:30,863バイト、作成日:2013年4月25日)内の電子的に提出された配列表の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本発明は、ワクシニアウイルス粒子上、例えばEEVビリオン上、および/または宿主細胞上に免疫グロブリン分子を発現させる効率の高い方法、ワクシニアウイルス粒子、例えばEEVビリオン、および/または真核細胞における発現のための免疫グロブリン重鎖ライブラリーおよび軽鎖ライブラリーを産生する方法、特異的抗原と結合する免疫グロブリンを単離する方法、ならびにこれらの方法のいずれかによって産生された免疫グロブリンに関する。本発明は、また、ワクシニアウイルス粒子上、例えばEEVビリオン上、または宿主細胞上に免疫グロブリン分子を発現させるために使用される融合タンパク質に関する。
免疫グロブリンの産生
確定した特異性の抗体は、ますます多くの多様な治療応用に利用されつつある。ヒトの治療的使用に有用な抗体を得るために、いくつかの方法が用いられている。これらには、キメラ抗体およびヒト化抗体、ならびにライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーより選択された、またはトランスジェニック動物由来の完全ヒト抗体が含まれる。バクテリオファージにおいて構築された免疫グロブリンライブラリーは、ナイーブな個体または特異的に免疫処置された個体の抗体産生細胞から得ることができ、原則として、ヒト免疫グロブリン重鎖と軽鎖が新しく多様に対形成したものを含む。この戦略は、内因性レパートリーの制限を受けないものの、発現された免疫グロブリンフラグメントの相補性決定領域(CDR)が細菌細胞内で合成され、正しくフォールディングされる必要がある。しかし、多くの抗原結合領域は、細菌細胞内で融合タンパク質として正確に集合することが困難である。加えて、そのタンパク質は、通常の真核生物性翻訳後修飾を受けない。結果として、この方法は、得ることができる抗体の特異性に異なる選択フィルターを課するものである。あるいは、完全ヒト抗体は、真核細胞系、例えば酵母ディスプレイ、レトロウイルスディスプレイでのライブラリー、またはポックスウイルスなどのDNAウイルスでの発現から単離することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,858,559号(特許文献1)を参照されたい。
本発明は、広く、細胞外エンベロープワクシニアウイルス(EEV)特異的膜タンパク質の膜貫通ドメインを含むポリペプチドセグメントとの融合体としてEEVの表面にディスプレイされた、真核細胞系において機能的な抗原特異的免疫グロブリン分子またはその抗原特異的フラグメント(すなわち抗原結合フラグメント)を同定および/または産生する方法に関する。加えて、本発明は、抗原特異的免疫グロブリン分子またはその抗原特異的フラグメントをコードするポリヌクレオチドの複合発現ライブラリーから、そのような免疫グロブリン分子またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドを同定する方法に関し、ここで、ライブラリーは、細胞外エンベロープワクシニアウイルス(EEV)特異的膜タンパク質の膜貫通ドメインを含むポリペプチドセグメントとの融合体としてEEVの表面にディスプレイされた真核細胞系において構築およびスクリーニングされる。さらなる態様には、(a)ヒト重鎖CH1ドメインを含む第1のポリペプチドセグメント、および(b)ワクシニア細胞外エンベロープウイルス(EEV)特異的膜タンパク質の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む第2のポリペプチドセグメントを含む融合タンパク質が含まれる。さらなる態様において、本明細書に開示される融合タンパク質は、結合分子、例えば免疫グロブリンの抗原特異的部分またはその部分、例えば適切な免疫グロブリン軽鎖と対形成したときに関心のある抗原に結合する重鎖可変領域を含みうる。
本明細書において使用されるように、「免疫グロブリン分子」は、完全な2分子免疫グロブリンとして、すなわち一般に4個の「サブユニットポリペプチド」、すなわち2個の同一な重鎖および2個の同一な軽鎖を含む免疫グロブリンとして定義される。いくつかの場合、例えば、ラクダ科種由来の免疫グロブリン分子またはラクダ免疫グロブリンに基づき加工された免疫グロブリン分子では、完全免疫グロブリン分子は重鎖のみからなり、軽鎖を有さないことができる。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)を参照。したがって、「免疫グロブリンサブユニットポリペプチド」は、一本鎖重鎖ポリペプチドまたは一本鎖軽鎖ポリペプチドを意味する。免疫グロブリン分子は、「抗体」とも呼ばれ、これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。「単離された免疫グロブリン」は、タンパク質および他の物質の環境から実質的に取り出された、特異的抗原と結合する1つの免疫グロブリン分子、または2つ以上の免疫グロブリン分子を表す。
ポックスウイルスは、核外である宿主細胞の細胞質中でのみ複製するので、DNAウイルスの中でユニークである。ワクシニアウイルスは、その複製サイクルの間に、その外膜が異なる4つの感染形態、すなわち細胞内成熟ビリオン(IMV)、細胞内エンベロープビリオン(IEV)、細胞関連エンベロープビリオン(CEV)および細胞外エンベロープビリオン(EEV)を産生する。一般的な見解は、IMVは単一のリポタンパク質膜からなり、一方CEVおよびEEVは2つの膜層によって囲まれ、IEVは3つのエンベロープを有するというものである。EEVは、宿主細胞の形質膜から排出され、EEV膜はトランスゴルジ由来である。
伝統的に、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルスベクターは、複合ライブラリーからこれまで未知の関心のある遺伝子を同定するために使用されていない。その理由は、ワクシニアに関してライブラリーを構築およびスクリーニングする高効率で高力価の産生方法が存在しなかったからである。ワクシニアウイルスにおける異種タンパク質発現の標準方法は、インビボ相同組み換えおよびインビトロ直接連結反応を含む。相同組み換えを用いたとき、組み換えウイルスの産生効率は約0.1%以下の範囲である。直接連結反応を用いた組み換えウイルスの産生効率の方が高いものの、得られる力価は相対的に低い。したがって、ワクシニアウイルスベクターの使用は、タンパク質発現およびワクチン開発のための予め単離されたDNAのクローニングに限定されてきた。
二重下線 - H5プロモーター
一重下線 - リーダーペプチド
波下線 - 代表的重鎖可変領域
太下線 - IgG CH1ドメイン
下線なし - ワクシニアA56R
太斜体 - BssHIIおよびBstEII可変遺伝子クローニング部位
を含むpJEM1である。PCR増幅された様々な異なる重鎖可変領域は、上記に太斜体字で表示されるBssHIIおよびBstEIIユニーク部位にフレーム内挿入することができる。
ワクシニアウイルスH5プロモーター
リーダーペプチド
可変重鎖をクローニングするための5'BssHIIクローニング部位
重鎖可変領域
可変重鎖をクローニングするための3'BstEIIクローニング部位
IgG CH1ドメイン
ワクシニアA56R
を含むpVKEである。PCR増幅されたκ軽鎖可変領域は、上に太字で表示されるユニークApaLI)およびXhoI部位にフレーム内挿入することができる。
を含むpVLEである。PCR増幅されたλ軽鎖可変領域は、上に太字で表示されるユニークApaLIおよびHindIII部位にフレーム内挿入することができる。
CH1-A56R融合タンパク質の調製
重鎖融合タンパク質を、組み換えワクシニアウイルスの細胞表面に発現された特異的免疫グロブリンセグメントの選択を容易にするように構築した。
本明細書において「pJEM1」と称する、ヒトγ免疫グロブリン定常領域(CH1)、ワクシニアA56Rのフラグメントおよびヒト重鎖可変領域(例えばH2124)の挿入用カセットをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築した。簡潔に言うと、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるPCT公報WO00/028016に記載のように産生されたp7.5/tkを以下の方法によってpJEM1に変換した。
ヒトIgG重鎖をコードするcDNAは、骨髄RNAから、Clontech, Palo Alto, CAから入手可能なSMART(商標)RACE cDNA Amplification Kitを使用して単離した。PCRは、5'プライマー
および3'プライマー
を使用して実施した。PCR産物は以下の要素を含んでいた:BamHI-BstEII-(VHのアミノ酸番号111〜113をコードするヌクレオチド)-(Cγ1のアミノ酸番号114〜478をコードするヌクレオチド)-TGA-SalI。この産物をBamHIおよびSalI部位でpBluescriptII/KS内にサブクローニングし、Cγ1のCH1ドメイン内のアミノ酸番号191および192に対応する第2のBstEII部位を、アミノ酸配列に変化を加えずに部位特異的突然変異誘発によって除去した。プラスミドpBluescriptII/KSをBstEIIおよびSalIで消化し、小さい方の約1KbのDNAフラグメントをゲル精製した。次に、この小さい方のフラグメントを、フォワードプライマー
(BstEII制限部位を斜体および下線付きで示す)およびリバースプライマー
を使用するPCR反応でのテンプレートとして使用した。得られた約320塩基対のPCR産物をゲル精製した。
ヒトIgG重鎖をコードするcDNAは、Clontech, Palo Alto, CAから入手可能なSMART(商標) RACE cDNA Amplification Kitを使用して骨髄RNAから単離した。PCRは、5'プライマーhuCγ1-5B:(SEQ ID NO:4)および3'プライマーhuCγ1-3S:(SEQ ID NO:5)を使用して実施した。PCR産物は以下の要素を含んでいた:BamHI-BstEII-(VHのアミノ酸番号111〜113をコードするヌクレオチド)-(Cγ1のアミノ酸番号114〜478をコードするヌクレオチド)-TGA-SalI。この産物をBamHIおよびSalI部位でpBluescriptII/KS内にサブクローニングし、Cγ1のCH1ドメイン内のアミノ酸番号191および192に対応する第2のBstEII部位を、アミノ酸配列に変化を加えずに部位特異的突然変異誘発によって除去した。プラスミドpBluescriptII/KSをBstEIIおよびSalIで消化し、完全長IgG1に対応する993塩基対のDNAフラグメントをゲル精製した。
ストーク、膜貫通、および細胞内ドメイン(Genbank受託番号YP_233063)を含むワクシニアウイルス(ウエスタンリザーブ)由来A56Rヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸番号108〜314をコードするDNAフラグメントは、単離後のウエスタンリザーブワクシニアウイルスDNAからフォワードプライマー
およびリバースプライマー
(SalI制限部位を斜体および下線付きで示す)を用いて増幅した。得られた約660塩基対のPCR産物をゲル精製した。
ストーク、膜貫通、および細胞内ドメイン(Genbank受託番号YP_233063)を含むワクシニアウイルス(ウエスタンリザーブ)由来A56Rヘマグルチニンタンパク質のアミノ酸番号240〜314をコードするDNAフラグメントは、単離後のウエスタンリザーブワクシニアウイルスDNAからフォワードプライマー
およびリバースプライマーA56R(R)(SEQ ID NO:9)を用いて増幅した。得られた約263塩基対のPCR産物をゲル精製した。
次に、5'産物についてフォワードプライマーCH1(F)(SEQ ID NO:6)およびリバースプライマー
ならびに3'産物についてA56R(F)(SEQ ID NO:8)をA56R(R)(SEQ ID NO:9)と組み合わせて使用して、320および660塩基対フラグメントとをSOE PCRによって組み合わせた。次に、これらの2つの産物を組み合わせて約980塩基対の融合フラグメントを産生した。このフラグメントをBstEIIおよびSalIで消化し、得られた934塩基対のフラグメントをゲル精製した。
5'産物についてフォワードプライマーCH1(F):(SEQ ID NO:6)およびリバースプライマー
ならびに3'産物について
をA56R(R):(SEQ ID NO:9)と組み合わせて使用して、993および263塩基対フラグメントとをSOE PCRによって組み合わせた。次に、これらの2つ産物を組み合わせて約1256塩基対の融合フラグメントを産生した。このフラグメントをBstEIIおよびSalIで消化し、得られた1235塩基対のフラグメントをゲル精製した。
5'産物についてフォワードプライマー
およびリバースプライマー
ならびに3'産物について
をA56R(R)(SEQ ID NO:9)と組み合わせて使用して、993および660塩基対フラグメントとをSOE PCRによって組み合わせた。次に、これらの2つの産物を組み合わせて約1653塩基対の融合フラグメントを産生した。このフラグメントをBstEIIおよびSalIで消化し、得られた1632塩基対のフラグメントをゲル精製した。
Hela細胞の表面でのA56R融合タンパク質の発現
HeLa細胞に免疫グロブリン融合構築物である可変重鎖(H2124)CH1-A56R(上記実施例に記載)およびIg-K(「A56R H + L」)またはscFv-A56R(「A56R scFv」)を発現している組み換えEEVワクシニアウイルスを感染または同時感染させた。細胞に組み換えEEVワクシニアウイルスを感染させるための一般戦略およびその後のライブラリー選択工程の説明を図2に示す。本実施例において、ライブラリーを使用する代わりに、HeLa細胞にVH (H2124) CH1-A56R融合体を発現している組み換えワクシニアウイルスおよびIg-K(A56R H + L)を発現している組み換えワクシニアウイルスを同時感染させるか、またはscFv-A56Rを発現している組み換えワクシニアウイルスを感染させた。EEV組み換えワクシニアウイルスに感染している細胞のC35染色およびCD100染色について蛍光活性化細胞分類(FACS)分析を行った。簡潔に言うと、1μg/ml CD100-Hisまたは1μg/ml C35-Hisを試料に加え、氷上で30分間インキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、抗his APCを加え、試料を氷上で30分間インキュベーションし、次に試料を洗浄し、固定し、分析した。FACSのデータを図3A〜Cに示す。これらの結果は、A56R融合タンパク質が細胞表面に発現されたことを示している。
プレートに基づく、および溶液に基づく融合タンパク質の選択
パンニングに基づくアッセイを用いて、公知のC35とのA56R融合体およびVEGF結合分子を発現している組み換えワクシニアウイルスを標的分子への結合についてテストした。C35(scFv2408-A56R、H2124-L517-A56R二重遺伝子、およびL517 + H2124-A56R同時感染)またはVEGF(L7000 + H7000-A56R)に特異的であることが知られている免疫グロブリン分子を発現している組み換えEEVをBSCl細胞において産生させた(約24時間)。同じウイルスが二重遺伝子からIg-HおよびIg-K遺伝子をコードし、H2124-A56R同時感染のために使用した別々のウイルスがIg-HおよびIg-K遺伝子をコードしたことを除いて、H2124-L517-A56R二重遺伝子は、L517 + H2124-A56Rと同じ抗体を産生した。
MAb2408(H2124-A56R + L517(C35特異的))またはMAb7000(H7000-A56R + L7000(VEGF特異的))を発現している組み換えEEVを使用して、磁気ビーズに基づく選択をテストした。2つのT175フラスコ中でHela細胞に様々なウイルス構築物を2日間感染させ、上清を収集し、細胞をペレットにした。SA-600ローターに入れて15,000RPMで1時間回転させることによってEEVをペレットにした。10% FBSを補充したDMEM、1ml中にEEVのペレットを再懸濁した。各組み換えウイルスについて上清500μl(約107pfu)を使用した。次に、1μgのビオチン-C35を含有するDMEM、500μlを各試料に加えた(濃度1μg/mの溶液、体積1mlが生じる)。低温室内の回転装置上で溶液を2時間インキュベーションした。M280ストレプトアビジン(SAV)磁気ビーズ200μlをEEV/C35溶液に加えた(SAVビーズ濃度はビオチン-C35の全てと結合するには十分高く、したがって洗浄工程は必要なかった)。溶液を室温で20分間回転させ、ビーズをビオチン-C35に結合させた。上記のように調製したウイルス構築物をビーズに加えた。磁石を使用してビーズを収集し、未結合のウイルスを別個に収集した。ビーズをPBS、1mlで5回洗浄した。未結合ウイルスを有する洗浄液の全てをプールした(「未結合物」)。ビーズを磁石から取り出した。2.5% FBSを補充したDMEM、1mlを加え、その溶液を新しいチューブに移した(「結合物」)。「未結合物」および「結合物」を力価検定した。結果を表1に示す。これらの結果は、C35特異的2408抗体を発現しているEEVはビーズに結合したが、VEGF特異的7000抗体を発現しているEEVは結合しなかったことを示している。
6ウェルプレート中でHela細胞の小規模感染で産生されたEEV(力価約5×105/ml)を使用した。プロテインGビーズ選択は、2368-A56R(H2090-A56R + L512、VHおよびVLの両方がワクシニアにおいて発現)を発現しているEEV、ウイルス1ml(約5×105pfu)および2408-A56R(H2124-A56R + L517、VHおよびVLの両方がワクシニアにおいて発現)を発現しているEEV、ウイルス1ml(5×105pfu))を使用してテストした。プロテインGビーズに結合しているCD100は以下のように調製した:プロテインGビーズ300μl(2×標準量/試料)を使用し、磁石でプルダウンを行った。PBS 600μl + CD100-Fc 18μl(=36μg)をビーズに加え、それを室温で20分間(回転装置上で)インキュベーションし、CD100-FcをプロテインGビーズと結合させた。磁石でビーズをプルダウンし、PBS 1mlで1回洗浄した。次に、10%補充したDMEM 300μl中にビーズを再懸濁した。CD100-Fc/ProGビーズ100μlを各ウイルス試料に加えた(Pro-Gビーズの標準量の約2倍)。これは、約12μg/ml CD100-Fcであった。この溶液を室温で2時間インキュベーションした。ビーズ550μl(約50%)を取り出し、標準的な5×PBS 1ml洗浄後に未結合物を収集した。ビーズを磁石から取り出し、2.5%補充したDMEM 1mlを加え、この溶液を新しいチューブに移した(「結合物」)。「未結合物」および「結合物」を力価検定した。残りの550μlに、室温でさらに1.5時間(合計3.5時間)、次に4度で18時間インキュベーションを続けさせ、その後上記のように採取した。
上記プロテインGビーズ選択実験に使用されたものと同じ2408(C35特異的)抗体および2368(CD100特異的)抗体を発現しているEEVを、トシル活性化磁気ビーズ選択のために使用した。PBSまたはELISAコーティング緩衝液(CB)中でトシル活性化磁気ビーズに100μgのC35-Hisをコンジュゲーションさせた。この溶液を37度で一晩インキュベーションし、PBS、10% FBS、0.5% BSAで37で1時間ブロッキングした。ビーズを1回洗浄し、10%補充したDMEM 160μl中に再懸濁した。各ビーズ試料50μlを各ウイルス試料に加え、室温で5時間インキュベーションした。標準的な5×PBS 1ml洗浄後に未結合物を収集した。ビーズを磁石から取り出し、2.5%補充したDMEM 1mlを加え、ビーズを新しいチューブに移した(「結合物」)。「未結合物」および「結合物」を力価検定した。
CH1-A56融合タンパク質ライブラリーの創出
免疫グロブリンセグメントをコードするポリヌクレオチドのライブラリーは、以下のように産生された。「ナイーブ重鎖-A56R融合体」と呼ばれる組み換えワクシニアライブラリーは、商業的供給業者(Life Technologies)から購入した、100人を超えるドナーを表現する骨髄RNAを使用して創出した。ヒト免疫グロブリンγまたはμのいずれかの定常領域に特異的なアンチセンスプライマーを使用して逆転写を行った。得られたcDNAをPCR用のテンプレートとして使用し、そのPCRには、様々な生殖細胞系列ヒトJセグメントに結合しBstEII制限部位を導入したアンチセンスプライマーのプールと組み合わせて、ヒト可変重鎖フレームワーク領域1の開始部に結合しBssHII制限部位を導入した2つのセンスプライマーの一方を用いた。これらのプライマーの配列は、以下のとおりであった:
CD100抗体選択のためのCH1-A56R融合タンパク質ライブラリーのスクリーニング
前の実施例に記載のナイーブ重鎖-A56Rライブラリー(「ライブラリー3」とも呼ぶ)+軽鎖クローン(L48、L116およびL9021)からの約1,200,000のクローンを使用して、新しいCD100抗体の選択を行った。
2368-A56Rを発現しているEEV(ウイルス1ml(約5×105pfu))および2408-A56Rを発現しているEEV(ウイルス1ml(5×105pfu))を対照として使用し、ライブラリー3(ウイルス1ml(約108pfu))を選択アッセイのために使用した。最初に、プロテインGビーズ300μl(2×標準量/試料)を磁石でプルダウンし、PBS 600μl + CD100-Fc 18μl(=36μg)をビーズに加えた。溶液を室温で20分間インキュベーションして(回転装置上)、CD100-FcをプロテインGビーズと結合させた。ビーズを磁石でプルダウンし、PBS 1mlで1回洗浄し、10%補充したDMEM 300μl中に再懸濁した。
6ウェルプレート中でHelaの小規模感染によって産生されたEEV(力価約5×105/ml)を使用した。ライブラリー3.1Aおよび3.1Bを1つの試料中に一緒にプールした。2368-A56Rを発現しているEEV(ウイルス1ml(約5×105pfu))、2408-A56Rを発現しているEEV(ウイルス1ml(5×105pfu))および3.1A/Bライブラリー(ウイルス1ml(約5×105pfu))をそれぞれプロテインGビーズ300μl(標準量の2倍/試料)と組み合わせた。PBS 600μl + CD100-Fc 18μl(=36g)をビーズに加えた。この溶液を室温で20分間(回転装置上で)インキュベーションし、CD100-FcにプロテインGビーズと結合させた。ビーズを洗浄し、ラウンド1について上に記載したように再懸濁した。1つの試料あたりCD100-Fc/ProG 100μl(約12μg/ml CD100-Fc)をウイルス試料に加え、室温で4.5時間インキュベーションした。「未結合物」および「結合物」を収集し、力価検定した。結合物ライブラリーをT75中のBSC1で増幅した(ラウンド2の選択を「CD100 3.2」と名付けた)。ラウンド2の選択の結果を表6に示す。
第3のラウンドの選択は、「ライブラリー3.2A」を使用して上記と同じ方法を用いて行った(ラウンド1および2=CD100-Fc/ProG)。結合物ライブラリーをT75中のBSC1で増幅した(ラウンド3の選択物を「CD100 3.3A」と名付けた)。ラウンド3Aの選択の結果をフローサイトメトリーによってテストした。第2のラウンド3の選択を、上に開示された方法を用いて、PBS中でトシル活性化磁気ビーズにコンジュゲーションしたCD100-His 100μgで行った。CD100 3.3A(2368-A56R(ウイルス1ml(約5×105pfu))、2408-A56R(ウイルス1ml(5×105pfu))および3.2A(ウイルス1ml(約5×105pfu))のために使用したウイルスと同じロットのウイルスを使用して、選択のために1試料あたり50μlを加えた。この溶液を室温で4時間インキュベーションした。「未結合物」および「結合物」を収集し、力価検定した。結合物ライブラリーをT75中のBSC1で増幅した(ラウンド3のトシル活性化選択物を「CD100 3.3B」と名付けた)。ラウンド3Bの選択の結果をフローサイトメトリーによってテストした。CD100抗体の選択戦略を要約する図を図6に示す。
Her2抗体の選択のためのCH1-A56R融合タンパク質ライブラリーのスクリーニング
ナイーブ重鎖A56R融合ライブラリー(「ライブラリー3」とも呼ぶ)からのクローン1,200,000+軽鎖クローン(L48、L116およびL9021)を使用して、新しいHer2抗体のための選択を行った。このライブラリーは、上述のCD100選択のために使用したものと同じである。
ライブラリー3(ウイルス1ml(約108pfu))をこの選択のために使用した。最初に、PBS 100μl + Her2-Fc(R&D Systems)100μl(=10μg)をプロテインGビーズに加えた。この溶液を室温で25分間(回転装置上で)インキュベーションして、Her2-FcをプロテインGビーズに結合させた。磁石でビーズをプルダウンし、PBS 1mlで1回洗浄し、10%補充したDMEM100μl中に再懸濁した。
増幅後のHer2.3.1を力価検定し、6ウェルプレート形式で増幅し(L48、L116およびL9021と同時感染)、上記方法を用いてHer2-Fc/ProG選択の追加的なサイクルを行った。結合物ライブラリーをT75中のBSC1で増幅した(ラウンド2の選択を「Her2.3.2」と名付けた)。
増幅後のHer2.3.2を力価検定し、6ウェルプレート形式で再増幅し(L48、L116およびL9021と同時感染)、上記の方法を用いて追加的なサイクルのHer2-Fc/ProG選択を行った。結合物ライブラリーをT75中のBSC1で増幅した(ラウンド3の選択を「Her2.3.3」と名付けた)。Her2.3.2およびHer2.3.3選択の結果をフローサイトメトリーによってテストした。この実験において、3μg/ml C35-Hisまたは10μg/ml Her2-Hisを抗His-APC MABと共に氷上で30分間インキュベーションして複合体を形成させた。次に、抗Fab-FITCを加え、氷上で抗原-抗His複合体を細胞に30分間加えた。次に、細胞をPBS、0.5% BSA、2nM EDTA 2mlで洗浄した。次に、氷上で抗his-APCおよび抗Fab-FITCを30分間加え、次に細胞を洗浄し、固定し、フローサイトメトリーアッセイを行った。図8に示すように、3種の軽鎖の全てはHer2特異的抗体が濃縮されていた。
6ウェルプレート形式のHela細胞にHer2.3.3およびL116のみを同時感染させ、上記のようにEEVを単離し、上記の方法を用いてHer2-Fc/ProG選択の追加的なサイクルを行った。結合物ライブラリーをT75中のBSC1で増幅した(ラウンド4の選択を「Her2.3.4」と名付けた)。Her2抗体の選択戦略を要約する図を図9に示す。
C35抗体選択のためのCH1-A56R融合タンパク質ライブラリーのスクリーニング
ナイーブ重鎖A56R融合ライブラリー(「ライブラリー3」とも呼ばれる)+軽鎖クローン(L48、L116およびL9021)からの約1,200,000のクローンを使用して新しいC35抗体ための選択を行った。ライブラリーは、上述のCD100およびHer2選択のために使用したものと同じである。
100μgのC35をPBSまたはELISA被覆緩衝液(CB)中でトシル活性化磁気ビーズにコンジュゲーションさせた。溶液を37℃で一晩インキュベーションし、PBS、10% FBS、0.5% BSAで37℃で1時間ブロッキングした。ビーズを1回洗浄し10%補充したDMEM 160μl中に再懸濁した。各ビーズ試料50μlを各ウイルス試料に加え、室温で3.5時間インキュベーションした。標準的な5回のPBS 1ml洗浄後に未結合物を収集した。ビーズを磁石から取り出し、2.5%補充DMEM 1mlを加え、ビーズを新しいチューブに移した(「結合物」)。「未結合物」および「結合物」を力価検定した。
増幅後のC35 3.1を力価検定し、L48、L116およびL9021と共にC35 3.1を同時感染することによって6ウェルプレート形式で組み換えEEV(力価約5×105/ml)を産生させるためにそれを使用し、上記方法を用いてトシル活性化C35選択の追加的なサイクルを行った。ラウンド1の3.5時間の代わりに、溶液を室温で3.0時間インキュベーションした。結合物および未結合のウイルスの力価を表7に示す。結合物ライブラリーをT75中のHelaで増幅し(ラウンド2の選択を「C35 3.2」と名付けた)、結合を上記のフローサイトメトリーによってテストした。
増幅後のC35 3.2を力価検定し、L48、L116およびL9021を同時感染させることによって6ウェルプレート形式で組み換えEEVを産生するために使用し(力価約5×105/ml)、ラウンド2について上記の方法を用いてトシル活性化C35選択の追加的なサイクルを行った。結合物および未結合のウイルスの力価を表8に示す。結合物ライブラリーをT75中のHelaで増幅し、上記フローサイトメトリーによってC35結合についてテストした(ラウンド3の選択を「C35 3.3」と名付けた)。
重鎖または軽鎖を発現しているワクシニアウイルスの選択的増幅
重鎖または軽鎖免疫グロブリンのいずれかを内部にもつ別々の組み換えワクシニアウイルスによる組み合わせ感染は、選択用の抗体を発現させる効果的な方法である。しかし、選択後、増幅および採取の間に重鎖含有ウイルスと軽鎖含有ウイルスを分離するためのメカニズムは今のところない。したがって、重鎖感染および軽鎖感染の両方が1よりも大きな複雑度(complexity)で行われ、デコンボリューションポスト選択(deconvolution post-selection)が必要な場合のように、重鎖含有ワクシニアウイルスおよび軽鎖含有ワクシニアウイルスを別々に増幅できることが有利であろう。この理由から、薬物選択マーカーと結合している重鎖または軽鎖のいずれかを発現している組み換えワクシニアウイルス(ネオマイシン耐性を有する重鎖およびハイグロマイシン耐性を有する軽鎖)が産生された。以下の実験は、重鎖または軽鎖を含有する組み換えワクシニアウイルスを独立して選択的に増幅する有用性を実証するものである。
Hela細胞の表面でのA56R融合タンパク質の発現
HeLa細胞に免疫グロブリン融合構築物を発現している組み換えEEVワクシニアウイルスを12ウェルプレート中で同時感染させた。融合構築物は、一緒になって抗体のFabフラグメント(「Fab」)をコードする可変重鎖(H8000)CH1-A56RおよびL8000 Ig-K、一緒になって完全長(「FL」)IgGをコードする可変重鎖(H8000)FL-A56RおよびL8000 Ig-K、一緒になって完全長IgGおよび短鎖A56R(「TR」)をコードする可変重鎖(H8000)FL-短縮型A56RおよびL8000 Ig-K、可変重鎖(H2124)FL-A56RおよびL517 Ig-K(2408「FL」)、ならびに可変重鎖(H2124)FL-短縮型A56RおよびL517 Ig-K(2408「TR」)であった。「Fab」、「TR」および「IgG」構築物を示す略図を図12に示す。組み換えワクシニアウイルスに感染している細胞のC35染色およびHer2染色のための蛍光活性化細胞分類(FACS)分析を行った。約18時間後に、細胞をC35-His/His-APCおよびHer2-His/His-APC、ならびに抗Fab-FITCで染色し、CantoのFLOW分析によって検出した。簡潔には、細胞をトリプシン処理し、試料毎に2群に分け、洗浄緩衝液2mLで洗浄し、10μg/ml Her2-Hisまたは4μg/ml C35-Hisを2つの試料の一方に加え、氷上で30分間インキュベーションした。次に細胞を洗浄し、抗His APCを加え、試料を氷上で30分間インキュベーションし、二次検出試薬である抗Fab-FITCで染色し、次に試料を洗浄し、固定し(1:100PIを有する0.5%パラホルムアルデヒドで氷上20分間)、CantoのFLOWによって分析した。FACSデータを図13〜15に示す。これらの結果は、Fabまたは完全長IgGのいずれかを発現しているA56R融合タンパク質が細胞表面に発現されたこと、およびA56Rの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインだけがIgGの表面発現に必要であることを示している。
溶液に基づくVac-Ig選択
トシル活性化ビーズ選択
C35特異的(H2124)「Fab」、「FL」および「TR」VHを発現しているEEVをL517と共に6ウェルプレート中のHela細胞に同時感染させ、感染約48時間後に1200rpmで回転させ、上清(EEV)を収集することによって、EEVを上清から採取した。対照としてHer2特異的H8000-Fab + L8000を同様に産生した。ビーズ選択のために、100μg C35-HisをPBS中でトシル活性化磁気ビーズにコンジュゲーションした。溶液を37℃で一晩インキュベーションし、37℃のPBS、10% FBS、0.5% BSAで1時間ブロッキングした。ビーズを1回洗浄し、10%補充したDMEM 160μl中に再懸濁した。各ビーズ試料50μlを各ウイルス試料に加え、室温で2時間インキュベーションした。未結合のEEVを標準的な5回のPBS 1mlの洗浄で収集した。ビーズを磁石から取り出し、2.5%補充DMEM 1mlを加え、ビーズを新しいチューブに移した(「結合物」)。「未結合物」および「結合物」を力価検定した。
CD100抗体選択のためのCH1-A56R融合タンパク質ライブラリーのスクリーニング
ナイーブVH配列および合成VH配列の組み合わせを含有する約7,000,000個のクローンからなる重鎖ライブラリーを用いた新しいCD100抗体の選択を、A56R-Fabベクターにおいて産生させた。EEV表面にIgのライブラリーを発現しているワクシニアを産生するために、A56R融合ライブラリー(「ライブラリー10」とも呼ばれる)を、9つの軽鎖クローンのカクテルと共に1×109個のHela細胞に同時感染させた(κ鎖:L48、L116、L122、L7110、およびL9021;ならびにλ鎖:L3-1、L151、L214、およびL223)。重鎖ウイルスの合計moiは1であり、軽鎖ウイルスの合計moiは1であり、各軽鎖は、加えた軽鎖ウイルスの合計の約1/9を含んでいた。
2368-A56Rを発現しているEEV(約5×105pfuを有するウイルス1ml)および2408-A56Rを発現しているEEV(約5×105pfuを有するウイルス1ml)を対照として使用し、ライブラリー10(約108pfuを有するウイルス1ml)を選択アッセイのために使用した。最初に、プロテインGビーズ300μl(2×標準量/試料)を磁石でプルダウンし、PBS 600μl + CD100-Fc 18μl(=36μg)をビーズに加えた。溶液を室温で20分間(回転装置上で)インキュベーションし、CD100-FcにプロテインGビーズに結合させた。ビーズを磁石でプルダウンし、PBS 1mlで1回洗浄し、10% FBSを補充したDMEM 300μl中に再懸濁した。
10.1+9個の軽鎖の新鮮なアリコートからのEEVは、細胞スタッカー中のHela細胞にmoi=1でそれぞれ2日間感染させ、上記のように採取することによって産生した。採取されたウイルスを半分に分け、50%をProGビーズで選択し、50%をCD100被覆トシル活性化ビーズで選択した。
上記と同じ方法を用いて第3ラウンドの選択を行った。第3ラウンドについてCD100-Fc/ProGを用いて10.2/ProGを選択し、第3ラウンドについてCD100-His/トシルを用いて10.2/トシルを選択した。10.2/ProG+9つの軽鎖の新鮮なアリコートからのEEVは、全部の重鎖組み換えウイルスおよび全部の軽鎖組み換えウイルスのそれぞれについてT175中でHela細胞にmoi=1で2日間感染させ、上記のように採取することによって産生した。10.2/トシル+9つの軽鎖の新鮮なアリコートからのEEVは、全部の重鎖組み換えウイルスおよび全部の軽鎖組み換えウイルスのそれぞれについてT175フラスコ中でHela細胞にmoi=1で2日間感染させ、上記のように採取することによって産生した。力価を表14A〜Bに示す。
を用いてPCR増幅した。得られたPCR産物を、分泌型完全長ヒトIgG1を含有するプラスミドベクター(EFVH)にクローニングし、次に、得られたコロニー中に含有されるV遺伝子を配列決定した。配列決定の結果の概要を表15に示す。10.3/ProGから188個のクローンを配列決定後、44個のユニークなクローンを同定し、10.3/トシルから188個のクローンを配列決定後、46個のユニークなクローンを同定した。
Her2抗体選択のためのCH1-A56R融合タンパク質ライブラリーのスクリーニング
ナイーブVH配列および合成VH配列の組み合わせを含有する約3,000,000のクローンからなる重鎖ライブラリーを、IRES-ネオマイシンとの融合体としてA56R-Fabベクターにおいて産生させた。EEV表面にIgのライブラリーを発現しているワクシニアを産生するために、A56R融合ライブラリー(「ライブラリー9」とも呼ぶ)を、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する1,000のκ軽鎖クローンのライブラリーと共に5×109個のHela細胞に同時感染させた。軽鎖ライブラリーは、ヒト骨髄(ナイーブ)から単離されたVK配列からなっていた。重鎖ウイルスの合計moiは1で、軽鎖ウイルスの合計moiは1であった。
この選択のためにライブラリー9を使用した。最初に、PBS 100μl + 24μg Her2-FcをプロテインGビーズ600μlに加えた。この溶液を室温で20分間(回転装置上で)インキュベーションし、Her2-FcをプロテインGビーズに結合させた。磁石でビーズをプルダウンし、PBS 1mlで1回洗浄し、10% FBSを補充したDMEM 400μl中に再懸濁した。
増幅したHer.9.1を力価検定し、2つのCellStacker中でHela細胞にHer.9.1VHおよびVK1000ライブラリーの新鮮なアリコートを2日間同時感染させることによって第2ラウンドの選択を行った。上記のようにウイルスを採取し、上記方法を用いて追加的なサイクルのHer2-Fc/ProG選択を行った。結合したウイルスの50%を、1mg/ml G418(重鎖の選択用)を有する2個のT175フラスコ中のBSC1で増幅し、結合したウイルスの50%を、0.030mg/mlハイグロマイシン(軽鎖の選択用)を有する2個のT175フラスコ中のBSC1で増幅した。力価の結果を表17に示す。増幅したウイルスをHer.9.2/VHおよびHer9.2/VKと名付けた。
増幅したHer.9.2/VHおよびHer9.2/VKを力価検定し、CellStacker中のHela細胞に2日間同時感染させ、上記のようにEEVを精製し、上記の方法を用いて追加的なサイクルのHer2-Fc/ProG選択を行った。
Claims (28)
- (a)重鎖定常領域ドメインを含む第1のポリペプチドセグメント、および(b)ワクシニア細胞外エンベロープウイルス(EEV)特異的膜タンパク質の膜貫通ドメインを含む第2のポリペプチドセグメントを含む、融合タンパク質。
- 免疫グロブリン重鎖可変領域またはそのフラグメントを含む第3のポリペプチドセグメントをさらに含む、請求項1記載の融合タンパク質。
- EEVの表面での融合ポリペプチドの発現を容易にするためのシグナルペプチドをさらに含む、請求項2記載の融合タンパク質。
- ワクシニアEEV特異的膜タンパク質がA56Rである、請求項1記載の融合タンパク質。
- 第2のポリペプチドセグメントが、EEV特異的膜タンパク質の細胞外ドメインまたはその部分をさらに含む、請求項1記載の融合タンパク質。
- 第2のポリペプチドセグメントが、EEV特異的膜タンパク質の細胞内ドメインまたはその部分をさらに含む、請求項1記載の融合タンパク質。
- 定常領域がCH1ドメインまたはその部分を含む、請求項1記載の融合タンパク質。
- 定常領域がIgG-γ重鎖を含む、請求項1記載の融合タンパク質。
- 融合タンパク質がSEQ ID NO:11のアミノ酸番号215〜421を含む、請求項1記載の融合タンパク質。
- 請求項1記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- ウエスタンリザーブワクシニアウイルス株由来A56Rのアミノ酸番号108〜314またはSEQ ID NO:11のアミノ酸番号215〜421をコードするSEQ ID NO:10のヌクレオチドを含む、請求項10記載のポリヌクレオチド。
- 請求項10記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項10記載のポリヌクレオチドまたは請求項12記載のベクターを含む組み換えワクシニアウイルス。
- 請求項13記載の組み換えワクシニアウイルスに感染している宿主細胞。
- 複数の免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする、ワクシニアウイルスベクター内に構築されたポリヌクレオチドの第1のライブラリーを含む組み換えワクシニアライブラリーであって、ワクシニアウイルスベクターが、(a)重鎖CH1ドメインを含む第1のポリペプチドセグメントをコードする第1のポリヌクレオチド、(b)CH1ドメインの下流に位置する、ワクシニアウイルスEEV特異的膜タンパク質の膜貫通ドメインを含む第2のポリペプチドセグメントをコードする第2のポリヌクレオチド、および(c)CH1ドメインの上流に位置する、免疫グロブリン重鎖可変領域またはそのフラグメントをコードする第3のポリヌクレオチドを含む、組み換えワクシニアライブラリー。
- EEVの表面での融合ポリペプチドの発現を容易にするためのシグナルペプチドをさらに含む、請求項15記載の第1のライブラリー。
- EEV特異的膜タンパク質がA56Rである、請求項15記載の第1のライブラリー。
- ワクシニアEEV特異的膜タンパク質がA56Rである、請求項15記載の第1のライブラリー。
- 第2のポリペプチドセグメントが、EEV特異的膜タンパク質の細胞外ドメインまたはその部分をさらに含む、請求項15記載の第1のライブラリー。
- 第2のポリペプチドセグメントが、EEV特異的膜タンパク質の細胞内ドメインまたはその部分をさらに含む、請求項15記載の第1のライブラリー。
- 定常領域がCH1ドメインまたはその部分を含む、請求項15記載の第1のライブラリー。
- 定常領域が完全長IgGを含む、請求項15記載の第1のライブラリー。
- 第1のポリペプチドセグメントが、SEQ ID NO:11のアミノ酸番号215〜421を含む、請求項1記載の融合タンパク質または請求項15記載の第1のライブラリー。
- 第2のポリペプチドセグメントが、SEQ ID NO:11のアミノ酸番号215〜421を含む、請求項1記載の融合タンパク質または請求項15記載の第1のライブラリー。
- (a)免疫グロブリン融合タンパク質をコードする請求項15記載の第1のライブラリーをワクシニアウイルス感染許容性の宿主細胞集団に導入する工程、
(b)免疫グロブリン軽鎖をコードする1または複数のポリヌクレオチドを宿主細胞集団に導入する工程であって、免疫グロブリン融合タンパク質は、免疫グロブリン軽鎖と組み合わさって免疫グロブリン分子の抗原結合ドメインを形成することが可能である、工程、
(c)宿主細胞から細胞外エンベロープウイルス(EEV)を放出させる工程、
(d)放出されたEEVを上清から収集する工程、
(e)放出されたEEVを抗原と接触させる工程、そして
(f)EEVの膜表面に発現された、抗原に特異的な免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする第1のライブラリーのポリヌクレオチドを回収する工程
を含む、抗原特異的免疫グロブリン重鎖可変領域またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを選択するための方法。 - (g)(f)において回収されたポリヌクレオチドをワクシニアウイルス感染許容性の第2の宿主細胞集団に導入する工程、
(h)免疫グロブリン軽鎖をコードする1または複数のポリヌクレオチドを宿主細胞集団に導入する工程、
(i)宿主細胞から細胞外エンベロープウイルス(EEV)を放出させる工程、
(j)放出されたEEVを上清から収集する工程、
(k)放出されたEEVを抗原と接触させる工程、そして
(l)EEVの膜表面に発現された、抗原に特異的な免疫グロブリン融合ポリペプチドをコードする第1のライブラリーのポリヌクレオチドを回収する工程
をさらに含む、請求項25記載の方法。 - 工程(g)〜(l)を1回または複数回繰り返し、それにより抗原と特異的に結合する免疫グロブリン融合ポリペプチドの部分として免疫グロブリン重鎖可変領域またはその抗原特異的フラグメントをコードする第1のライブラリーのポリヌクレオチドを濃縮する工程をさらに含む、請求項26記載の方法。
- 第1のライブラリーから回収されたポリヌクレオチドを単離する工程をさらに含む、請求項25記載の方法。
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