JP2015512944A - 絹マイクロスフェアを調製するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、35U.S.C.119(e)の下で2012年4月13日に出願された米国特許仮出願第61/623,970号の恩典を主張する。この内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、米国立衛生研究所(NIH)により付与された助成金P41EB002520の下で政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
絹マイクロスフェアを調製するための方法および組成物ならびに絹マイクロスフェアの使用が本明細書において提供される。一部の態様において、絹マイクロスフェアは、治療剤などの活性作用物質のための薬物送達ビヒクルまたはリザーバーとして使用することができる。
粒径1〜1000μmのマイクロスフェアが薬物送達ビヒクルとして用いられてきた。組織に容易に浸透し、細胞に進入することができるナノスフェア(例えば、<1μm)と比較して、マイクロスフェアは容積が大きいため薬物ローディング能力が高いという利点を有する。さらに、マイクロスフェアはまたマトリックス全体に閉じ込められた薬物分子の均一な分布を示すことがあり、そのため、薬物の持続放出リザーバーとしての使用に適している。薬物分子の閉じ込めは一般的にマイクロスフェア調製中に達成され、その後の薬物放出は、通常、乾燥マイクロスフェアが水和された時に起こる。例えば、Chiellini F. et al. 「Micro/nanostructured polymeric systems for biomedical and pharmaceutical applications」 Nanomed (2008) 3:367-93(非特許文献1); Ranade VV et al. 「Drug delivery systems」 2nd ed. Boca Raton; CRC Press (2004)(非特許文献2)を参照されたい。マイクロスフェアが非分解性材料から作製されていれば、薬物放出は、一般的に、拡散だけで、例えば、マイクロスフェアから放出媒体への薬物濃度勾配による拡散だけで動かされる。同上。生分解性材料から調製されたマイクロスフェアの場合、薬物放出経路は材料分解および拡散の両方を含み得る(同上;および Ye M. et al. 「Issues in long-term protein delivery using biodegradable microparticles」 J Control Release (2010)146:241-260(非特許文献3))。
マイクロスフェア製造のための既存の方法に関連する主な懸念は、一般的に、高温および/または有機溶媒処理によるマイクロスフェアの低収率および薬物失活である。従って、これらのマイクロスフェアおよび/または製造方法は温度感受性薬物の送達に適さない場合があり、薬物封入により適した、マイクロスフェアを製造するための新規の方法を開発することが必要とされる。一般的に、絹ベース材料を調製する方法、絹ベース材料を調製する方法から得られた絹ベース材料、および絹ベース材料の使用、例えば、薬物送達のための絹ベース材料の使用が本明細書において提供される。一態様において、絹ベース材料はマイクロスフェアの形で製造される。従って、絹マイクロスフェアを調製する方法、絹マイクロスフェアを調製する方法から得られた絹マイクロスフェア、および絹マイクロスフェアの使用、例えば、薬物送達のための絹マイクロスフェアの使用も本明細書において提供される。一部の態様において、絹ベース材料(例えば、絹マイクロスフェア)は完全水性溶媒の中で調製することができ、従って、絹ベース材料にローディングされた治療剤を分解および/または失活させ得る有機溶媒または任意の刺激の強い化学薬品の使用を回避する、または最小限にすることができる。一部の態様において、有機溶媒、例えば、メタノールによるさらなる後処理なく、不溶性絹ベース材料を本明細書に記載の方法によって製造することができる。一部の態様において、絹ベース材料は調製中に高温に曝露される必要はなく、従って、絹ベース材料の中に封入された治療剤の生理活性が維持される。
高収率の薬物送達ビヒクルもしくはリザーバーを製造するための新規の方法、および/または封入プロセス中に薬物がその生理活性を維持できるような、これらのビヒクルもしくはリザーバーの中に薬物を封入するための方法を開発することが必要とされる。一般的に、絹マトリックスを調製するための方法およびその使用が本明細書において提供される。一部の態様において、絹マトリックスはマイクロスフェアの形で製造することができる。従って、絹マイクロスフェアを調製する方法、および絹マイクロスフェアの使用、例えば、持続放出などの薬物送達のための絹マイクロスフェアの使用も本明細書において提供される。一部の態様において、不溶性の絹マトリックスは、有機溶媒、例えば、メタノールによるさらなる後処理なく、本明細書に記載の方法によって製造することができる。さらに、絹マトリックスは完全水性溶媒の中で調製することができ、従って、その内部にローディングされた治療剤を分解および/または失活させ得る有機溶媒または任意の刺激の強い化学薬品の使用を回避する、または最小限にすることができる。他の態様において、絹マトリックスの調製は高温を必要とせず、従って、絹マトリックスの中に封入された治療剤の生理活性を維持することができる。従って、絹組成物の中に封入された治療剤の有効量を増やすための方法も本明細書において提供される。
従って、本明細書に記載の一局面は、絹ベース材料(または本明細書において同義に用いられる絹マトリックス)を調製する方法に関する。前記方法は、絹溶液中でのβシート構造の形成を誘導する工程;および絹溶液からの絹マトリックスの形成を誘導する工程を含む。一部の態様において、絹溶液中でのβシート構造の形成は絹溶液からの絹マトリックスの形成と同時に誘導されてもよい。絹マトリックスには、例えば、粒子(マイクロスフェアおよびナノスフェアを含む)、繊維、ロッド、ヒドロゲル、フィルム、ゲル様またはゲル粒子、およびこれらの任意の組み合わせを含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「βシート構造の形成を誘導する工程」という句は、絹溶液中に存在するβシート構造の最初の量と比較して、絹溶液中のβシート構造(例えば、絹IIβシート結晶性構造)の量を少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%以上増やすことを指す。一部の態様において、「βシート構造の形成を誘導する工程」という句は、絹溶液中に存在するβシート構造の最初の量と比較して、絹溶液中のβシート構造の量を少なくとも約1倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍以上増やすことを指すことがある。絹タンパク質の構造(例えば、ランダムコイル対βシート)を決定するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、円二色性であるが、これに限定されない。
絹溶液からのマイクロスフェアの形成は、例えば、乳化、霧化、沈降、分散、および沈殿方法であるが、これに限定されない当技術分野において公知の任意の方法によって誘導することができる。乳化では、例えば、乳化剤を含有する非水相中に絹水溶液を混合して、エマルジョン液滴を形成することができる。次いで、ゲル化剤、例えば、pH低下剤または絹ゲル化を誘導することができる任意の剤を用いて溶液をゲル化することができる。分散法では、架橋結合溶液、例えば、PEG溶液中に絹溶液を直接分散することによってマイクロスフェアを形成することができる。沈降/沈殿法では、絹ベースのイオノマー対を混合することによってマイクロスフェアを形成することができる(例えば、国際出願番号WO2011/109691を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
絹フィブロインタンパク質は、独特の化学的性質および物理的性質、例えば、調整可能な分解速度、疎水性βシートセグメントによる制御可能な結晶性-閉じ込められた薬物分子に理想的な拡散障壁、薬物封入のために不活性な微環境を提供するアミノ酸特性、ならびに感受性のある薬物分子に好ましい水性材料処理を有する。絹ベース生体材料は、他の生分解性材料、例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリ-乳酸-co-グリコール酸(PLGA)と比較可能な、またはこれより優れた、様々なインビボ用途のための生体適合性および生物学的安全性について以前に報告されている[参考文献4,5]。
絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)の様々な用途に応じて、例えば、封入および/またはコーティングによって、異なるタイプの活性作用物質が絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)に存在してもよい。拘束されるものではないが、例えば、絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)は、治療剤、画像化剤、またはこれらの任意の組み合わせを含むが、これに限定されない1種類または複数種の活性作用物質を含んでもよい。
さらに別の局面において、本明細書に記載の1つまたは複数(例えば、2つ以上)のマイクロスフェアおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、薬学的組成物は、本明細書において列挙される生体適合性ポリマーに埋め込まれた本明細書に記載の複数(例えば、2つ以上)の絹マイクロスフェアを含んでもよい。一部の態様において、薬学的組成物は、絹ヒドロゲルに埋め込まれた複数(例えば、2つ以上)のマイクロスフェアを含んでもよい。絹ヒドロゲルは当技術分野において公知の任意の方法によって製造することができる。様々な投与経路に応じて、一部の態様では、薬学的組成物は注射可能であるように製剤化されてもよい。
本明細書に記載の別の局面において、本明細書に記載の絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)および/または薬学的組成物は、例えば、医学的処置もしくは美容用途のための、空隙、例えば、創傷を充填するための充填剤、または活性作用物質、例えば、治療剤、診断剤を送達するための担体として、または補強材料、例えば、複合物中の補強材料としての用途があるが、これに限定されない様々な用途において使用することができる。
例えば、組成物の任意の態様の投与および/使用方法を容易にするために、薬物送達装置およびキットも本明細書において提供される。一部の態様において、薬物送達装置は本明細書に記載の組成物の任意の態様を含んでもよい。薬物送達装置は任意の形で存在してもよく、例えば、一部の態様では、装置は、注射針、例えば、ゲージが約25〜約34または約27〜約30の注射針が付いた注射器でもよい。絹マトリックス(例えば、絹マイクロスフェア)および/または薬学的組成物に適用するために使用することができる薬物送達装置の他の例には、コンタクトレンズ、点滴注入器、マイクロニードル(例えば、絹マイクロニードル)、移植片、およびこれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定されない。
1. 絹マイクロスフェアを調製する方法であって、
絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成を誘導する工程;および
該絹溶液からのマイクロスフェアの形成を誘導する工程
を含む、方法。
2. フィブロインのβシート構造の形成およびマイクロスフェアの形成が同時に誘導される、項1記載の方法。
3. 絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成が音波破砕によって誘導される、項1または2記載の方法。
4. 絹溶液からのマイクロスフェアの形成が該絹溶液の霧化によって誘導される、項1〜3のいずれか一項記載の方法。
5. 超音波駆動式のフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して絹溶液を流すことによって、フィブロインのβシート構造の形成およびマイクロスフェアの形成が同時に誘導される、項2記載の方法。
6. 絹溶液が約0.001mL/分〜約5mL/分の流速でフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して流される、項5記載の方法。
7. 絹溶液が約0.05mL/分〜約0.3mL/分の流速でフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して流される、項6記載の方法。
8. 音波破砕が少なくとも約10kHz、または約20kHz〜約40kHzの周波数で行われる、項3〜7のいずれか一項記載の方法。
9. 音波破砕の電力出力が約1ワット〜約50ワット、または約2ワット〜約20ワットである、項3〜8のいずれか一項記載の方法。
10. 絹マイクロスフェアを凍結させる工程をさらに含む、項1〜9のいずれか一項記載の方法。
11. 絹マイクロスフェアを零下温度に曝露することによって、該絹マイクロスフェアを凍結させることができる、項10記載の方法。
12. 冷却剤によって冷却された容器の中に絹マイクロスフェアを収集することによって、該絹マイクロスフェアが零下温度に曝露される、項10または11記載の方法。
13. 絹マイクロスフェアを凍結乾燥に供する工程をさらに含む、項1〜12のいずれか一項記載の方法。
14. 絹マイクロスフェアの多孔度が少なくとも約30%である、項1〜13のいずれか一項記載の方法。
15. 絹マイクロスフェアの孔サイズが約1nm〜約500μm、または10nm〜約50μmである、項1〜14のいずれか一項記載の方法。
16. 絹溶液が約1%(w/v)〜約30%(w/v)の濃度の絹フィブロインを含む、項1〜15のいずれか一項記載の方法。
17. 絹溶液が約5%(w/v)の濃度の絹フィブロインを含む、項16記載の方法。
18. 絹マイクロスフェアが活性作用物質を含む、項1〜17のいずれか一項記載の方法。
19. 活性作用物質が温度感受性の活性作用物質を含む、項18記載の方法。
20. 活性作用物質が治療剤である、項18または19記載の方法。
21. 治療剤が、有機低分子または無機低分子;糖類;オリゴ糖;多糖;生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体;ペプチド模倣体;核酸;核酸類似体および誘導体;抗体およびその抗原結合フラグメント;生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞から作製された抽出物;動物組織;天然組成物または合成組成物;ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項20記載の方法。
22. 治療剤がベバシズマブ、メマンチン、またはこれらの組み合わせを含む、項20または21記載の方法。
23. 活性作用物質が約0.1%(w/w)〜約50%(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、項18〜22のいずれか一項記載の方法。
24. 活性作用物質が約1%(w/w)〜約30%(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、項23記載の方法。
25. 活性作用物質が絹溶液中に存在する、項18〜24のいずれか一項記載の方法。
26. 絹マイクロスフェアが、マイクロスフェア総重量に対して約30%(w/w)〜約100%(w/w)の量の絹を含む、項1〜25のいずれか一項記載の方法。
27. 絹溶液が添加物をさらに含む、項1〜26のいずれか一項記載の方法。
28. 絹溶液中の添加物と絹の重量比が約1:100〜約100:1である、項27記載の方法。
29. 絹溶液中の添加物と絹の重量比が約1:10〜約10:1である、項27または28記載の方法。
30. 添加物が、生体高分子、ポロゲン、磁性粒子、可塑剤、検出標識、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項27〜29のいずれか一項記載の方法。
31. 添加物が可塑剤である、項27〜30のいずれか一項記載の方法。
32. 可塑剤が、絹中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成を誘導する、項30または31記載の方法。
33. 可塑剤が、グリセロール、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項30〜32のいずれか一項記載の方法。
34. 絹マイクロスフェアを後処理に供する工程をさらに含む、項1〜33のいずれか一項記載の方法。
35. 後処理が、絹マイクロスフェア中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成をさらに含む、項34記載の方法。
36. 後処理が、アルコール浸漬、水蒸気アニール、熱アニール、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項34〜35のいずれか一項記載の方法。
37. 後処理の前の絹マイクロスフェアの水溶解度が50%未満である、項34〜36のいずれか一項記載の方法。
38. 後処理の前の絹マイクロスフェアの水溶解度が30%未満である、項34〜37のいずれか一項記載の方法。
39. 絹マイクロスフェアのサイズが約10μm〜約1000μmである、項1〜38のいずれか一項記載の方法。
40. 絹マイクロスフェアのサイズが約50μm〜約100μmである、項1〜39のいずれか一項記載の方法。
41. 霧化が、液滴発生装置のスプレーノズルシステムを使用することを含む、項4〜40のいずれか一項記載の方法。
42. 霧化が、注射器押出し、同軸空気流法、機械的攪乱法、静電力法、または静電ビーズ発生法を含む、項4〜41のいずれか一項記載の方法。
43. 霧化が、空気駆動の液滴発生用封入ユニットのノズルを通して絹溶液を噴霧することを含む、項4〜42のいずれか一項記載の方法。
44. ノズル直径;スプレーの流速;スプレーの圧力;ノズルからの絹マイクロスフェア収集容器の距離;絹溶液の濃度;音波破砕波の出力;音波破砕処理の時間;およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数のパラメータを変化させることによって絹マイクロスフェアの形状またはサイズが変化する、項1〜43のいずれか一項記載の方法。
45. 項1〜44のいずれか一項記載の方法を用いて調製された、絹マイクロスフェア。
46. 内部にローディングされた活性作用物質の少なくとも約5%を少なくとも約10日間にわたって放出する、項45記載の絹マイクロスフェア。
47. 項45〜46のいずれか一項記載の絹マイクロスフェアおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
48. 注射可能であるように製剤化されている、項47記載の組成物。
49. 治療剤をインビボで持続送達する方法であって、項47〜48のいずれか一項記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
50. 約10μm〜約2000μmのサイズを有する絹マイクロスフェアを含む、組成物。
51. 絹マイクロスフェアのサイズが約30μm〜約1000μmである、項50記載の組成物。
52. 絹マイクロスフェアが水不溶性である、項50または51記載の組成物。
53. 水不溶性の絹マイクロスフェアのβシート結晶含有率が少なくとも約50%以上である、項50〜52のいずれか一項記載の組成物。
54. 絹マイクロスフェアが活性作用物質をさらに含む、項50〜53のいずれか一項記載の組成物。
55. 活性作用物質が、溶媒感受性および/または温度感受性の活性作用物質である、項54記載の組成物。
56. 活性作用物質が、有機低分子または無機低分子;糖類;オリゴ糖;多糖;生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体;ペプチド模倣体;核酸;核酸類似体および誘導体;抗体およびその抗原結合フラグメント;治療剤;生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞から作製された抽出物;動物組織;天然組成物または合成組成物;ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項50〜55のいずれか一項記載の組成物。
57. 治療剤がベバシズマブ、メマンチン、またはこれらの組み合わせを含む、項56記載の組成物。
58. 活性作用物質を含む絹マイクロスフェアが、5日間にわたって該活性作用物質の総ローディングに対して約1%放出〜約50%放出という放出プロファイルを有する、項54〜57のいずれか一項記載の組成物。
59. 放出プロファイルが持続放出を含む、項58記載の組成物。
60. 放出プロファイルが即時放出をさらに含む、項59記載の組成物。
61. 活性作用物質が約0.1%(w/w)〜約50%(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、項50〜60のいずれか一項記載の組成物。
62. 絹マイクロスフェアが、マイクロスフェア総重量に対して約10%(w/w)〜約100%(w/w)の量の絹フィブロインを含む、項50〜61のいずれか一項記載の組成物。
63. 絹マイクロスフェアが添加物をさらに含む、項50〜62のいずれか一項記載の組成物。
64. 絹マイクロスフェア中の添加物と絹フィブロインの重量比が約1:100〜約100:1である、項63記載の組成物。
65. 添加物が、生体高分子、ポロゲン、磁性粒子、可塑剤、検出標識、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項63または64記載の組成物。
66. 添加物が可塑剤を含む、項65記載の組成物。
67. 可塑剤が、絹中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成を誘導する、項66記載の組成物。
68. 可塑剤が、グリセロール、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、項66または67記載の組成物。
69. 添加物がグリセロールを含む、項68記載の組成物。
70. 絹マイクロスフェア中のグリセロールと絹フィブロインの比が約1:10〜約10:1である、項69記載の組成物。
71. 注射可能である、項50〜70のいずれか一項記載の組成物。
72. 薬学的組成物である、項50〜71のいずれか一項記載の組成物。
73. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項72記載の組成物。
74. 薬学的組成物が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、粉末、ペースト、顆粒、液体、溶液、ゲル、またはこれらの任意の組み合わせの形態である、項72または73記載の組成物。
75. 絹マイクロスフェアが多孔性である、項50〜74のいずれか一項記載の組成物。
特に定めのない限り、または文脈から暗に意味されない限り、以下の用語および句は以下で示される意味を含む。特に明示的に定められていない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および句は、この用語または句が属する当技術分野において獲得した意味を排除しない。定義は特定の態様の説明を助けるために示される。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、定義は本発明を限定することを目的としない。さらに、特に文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
材料:
デガミングされた絹繊維をSuho Biomaterials Technology (Suzhou, China)から購入した。ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標), Genentech, South San Francisco, CA)をCuraScript Inc. (Orlando, Fl)から購入した。メマンチン塩酸塩および他の全ての化学薬品をSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から購入した。
デガミングされた絹繊維から絹フィブロイン溶液を得るために、臭化リチウム溶解、透析、および遠心分離を含む複数の精製工程を行った。簡単に述べると、5gのデガミングされた繊維を秤量し、20mlの新鮮に調製された9.3M臭化リチウム溶液を含有する容器、例えば、ガラスビーカーに添加した。絹の最終濃度は約20%(w/v)であった。次いで、絹繊維が完全に溶解するまで、混合物を加熱した。例えば、容器をアルミニウム箔で覆い、絹繊維が完全に溶解するまで60℃のオーブンに4時間、入れた。臭化リチウム塩を除去するために、溶液を、例えば、Slide-a-Lyzer透析カセット(MWCO 3,500, Pierce/Thermo Scientific, Rockford, IL)を48時間、使用して超純水(例えば、約18.2MΩcmの電気固有抵抗を有する)に対して透析した。透析された溶液を、50mlコニカルチューブを用いてEppendorf 5804R遠心機の中で8,700rpmおよび4℃、約20分間で2回、遠心分離した。既知容積の溶液を60℃で一晩乾燥し、残留固体を秤量することによって測定した時に、絹フィブロイン水溶液の最終濃度は約8%(w/v)であった。8%絹原液を4℃で保管し、使用前に超純水で希釈した。
例示的なSCFD構成を実施例に記載したが、当業者の範囲内にある他の任意の変更も本明細書に記載の範囲内にある。一態様において、フロースルーホーンおよびシリンジポンプ(KDS230, KD Scientific, Holliston, MA)を備えたSONIFIER(登録商標)細胞粉砕器(Branson, Danbury, CT)を、絹溶液の霧化および絹フィブロイン中でのβシート結晶構造の形成の誘導を同時に行うための調製において使用した。絹溶液をシリンジポンプを介して望ましい流速でフロースルーホーンに注入し、ホーンから、直接、急速凍結容器(例えば、600ml急速凍結フラスコ。Labconco Corp., Kansas City, MOから入手することができる)を通して噴霧した。スプレーの即時凍結およびスプレーの均一性の両方を確かなものにするために、ホーンの先端とフラスコの底面との距離を調節しながら、フラスコを液体窒素中で浮いたままにした(図1)。噴霧後、フラスコをVirtis Genesis凍結乾燥器(SP Scientific, Warminster, PA)にすぐにローディングし、一晩、凍結乾燥した。
様々なSCFDマイクロスフェアを調製するために、絹溶液の組成、流速(シリンジポンプを介して制御した)、および音波破砕の電力出力を変化させた。様々なSCFDマイクロスフェア間での比較を容易にするために、溶液容積を全てのバッチについて5mLに一定に保ったのに対して、絹の量、添加物(例えば、絹マイクロスフェアの溶解度を下げるグリセロール)の量、流速、および音波破砕の出力などの他の変数を調節した。絹マイクロスフェアを製造するための変数のいくつかの例示的な値を表1に列挙した。
SCFDマイクロスフェアのサイズおよび表面形態は、例えば、倒立光学顕微鏡(Carl Zeiss, Jena, Germany)および走査型電子顕微鏡鏡(SEM, JSM 840A, JEOL Peabody, MA)を用いて、フリーズドライされた(粉末)形で、および超純水に乾燥粉末を懸濁した後に評価した。光学顕微鏡を用いたSCFDマイクロスフェア評価の場合、乾燥粉末または約20μLのマイクロスフェア水懸濁液をガラススライドの上部に直接添加した。SEMの場合、乾燥粉末を、導電性テープ(JEOL Peabody, MA)で覆ったSEMスタブ(stub)に直接適用したのに対して、マイクロスフェア水懸濁液を、導電性テープのあるSEMスタブにローディングし、周囲温度で一晩乾燥させた。SEM分析前に、試料を約20nmの金でスパッタリングによってコーティングした。
治療薬物がローディングされたSCFDスフェア(例えば、ベバシズマブがローディングされたSCFDスフェア:A-スフェア;またはメマンチン塩酸塩がローディングされたSCFDスフェア:M-スフェア)のために、噴霧前に、薬物溶液を絹およびグリセロール溶液と混合した。溶液総容積を5mLに一定に保ったのに対して、表2に示したように、異なる成分(例えば、薬物、絹、およびグリセロール)の混合比ならびに音波破砕の出力を変化させた。
放出研究の前に、絹マイクロスフェアを密閉ガラスバイアルに入れて4℃で保管した。使用前に、約10mgの粉末を秤量し、15mLプラスチックチューブに添加した。これに、0.02%(w/v)アジ化ナトリウムを含有する4mlのPBS緩衝液、pH7.4を添加した。次いで、マイクロスフェア懸濁液を37℃でインキュベートした。望ましい時点で、絹マイクロスフェアを含有するチューブを(例えば、Eppendorf 5804R遠心機を用いて)10,000rpmで約10分間、遠心分離し、上清を収集し、分析のために4℃で保管した。マイクロスフェアペレットを4mlのPBS/アジ化ナトリウム緩衝液、pH7.4を用いて再懸濁し、次の時点までインキュベートした。Suckow RF et al. 「Sensitive and selective liquid chromatographic assay of memantine in plasma with fluorescence detection after pre-column derivatization」 J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1999; 729:217-224において以前に述べられた方法の改良版を用いて、放出媒体中のメマンチン濃度を求めた。いくつかの改良には、塩化ダンシルを用いた蛍光標識反応、および逆相カラム(Agilent Eclipse plus C-18カラム、4.6mm I.D.x75mmL)を備えたAgilent1200シリーズHPLC(Agilent, Santa Clara, CA)機器を用いた高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)が含まれる。ベバシズマブ濃度は、Agilent Bio SEC-3カラム(300オングストローム孔サイズ、4.6mm I.D.x300mmL)を備えた同じHPLCシステムを用いて分析した。
例えば、Wang X et al. 「Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation」 Biomaterials 2008; 29:1054-64に報告されたように、絹フィブロインゲル化を誘導するために音波破砕が用いられてきた。絹ゲル化の時間は、絹溶液の濃度、音波破砕の電力出力、および音波破砕の持続時間に依存した。同上。しかしながら、Wang Xらの参考文献は、絹マイクロスフェアを製造するための音波破砕の使用について述べていない。絹マイクロスフェアを調製するための方法の一態様が本明細書において示されており、ここで、フロースルーホーンを備えたソニケーター(Branson SONIFIER(登録商標)細胞粉砕器)を利用して、絹溶液が、ホーンの内部流路を通過する時に連続的に音波破砕されつつ、付随的に、ホーンのノズル(例えば、先端)で微細なスプレーに霧化されることを可能にした(図1)。液体窒素によって少なくとも部分的に囲まれたフラスコの中に霧化スプレーを凍結粒子として収集し、その後に、凍結粒子を凍結乾燥して乾燥粒子にした。
次に、SCFD絹マイクロスフェアの溶解度に対する様々なβシート構造を誘導する添加物の効果を確かめることが求められた。相分離を介して水不溶性の絹ナノスフェア/マイクロスフェアを得るためにポリ(ビニルアルコール)(PVA)が以前に用いられている(例えば、Wang X. et al. 「Silk nanospheres and microspheres from silk/PVA blend films for drug delivery」 Biomaterials 2010;31:1025-1035を参照されたい)。しかしながら、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)は、本明細書に記載の方法によって製造されたマイクロスフェアの溶解度に有意に影響を及ぼさなかった。グリセロールは、不溶性および柔軟性の絹フィルムを製造するために以前に用いられた添加物である(Lu S. et al. 「Insoluble and flexible silk films containing glycerol」 Biomacromolecules 2010;11:143-150)。本発明者らは、PVAと異なり、グリセロールが水中での非凝集性の球状形態を保存しながら、本明細書に記載の方法によって製造された絹マイクロスフェアの溶解度を減少できることを証明した。表4は、マイクロスフェア製造の処理条件を最適化するために変化させた、いくつかの例示的なパラメータ(例えば、流速、音波破砕の出力、絹とグリセロールの比、ならびに絹およびグリセロールの濃度であるが、これに限定されない)を示す。
メマンチン-SCFD絹マイクロスフェア
図5は、約25%の音波破砕振幅および約0.17mL/分の流速で異なるグリセロール含有率(0%、約15%、および約25%グリセロール)を有する約5%絹溶液から調製されたSCFDマイクロスフェア(表2)からの、アルツハイマー病を治療するためにFDAにより認可された薬物(メマンチン、例えば、NAMENDA(登録商標);MW(メマンチン塩酸塩)=215.76g/mole、水溶解度約50mg/mL)の放出動態を示す。図5に示したように、評価された製剤について、メマンチン放出は少なくとも17日超にわたって持続した。初期バースト、例えば、SCFDマイクロスフェアから最初に放出された封入薬物のパーセント(例えば、図5に示したように第1の時点(3日)で測定した)および17日後に放出された薬物の累積パーセントは絹のみのSCFDスフェア(例えば、グリセロールを含まないSCFD絹スフェア)の場合に最も低かった。これに対して、グリセロール含有率が増加するにつれて、初期バースト(0%、約15%、および約25%グリセロールについては、それぞれ、約50.8%、約57.4%、および約67.3%)ならびに17日後の累積放出(0%、約15%、および約25%グリセロールについては、それぞれ、約66.4%、約76%、および約81.9%)はいずれも増加した。予想外なことに、SCFD絹/メマンチンマイクロスフェアは、例えば、放出媒体中で、メマンチンを含まずに調製されたSCFD絹マイクロスフェアより溶解度が低かった。このことから、SCFD絹マイクロスフェアに封入されたメマンチンは全βシート結晶含有率を増加できる、および/またはマイクロスフェアの水溶解度を減少できることが分かる。さらに、図5に示したデータから、少なくとも部分的に製剤中のグリセロール含有率を介して、薬物、例えば、FDAにより認可された低分子薬物の放出動態を効果的に制御できることが分かる。低分子薬物放出動態に影響を及ぼし得る他の要因には、薬物ローディング、絹濃度、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これに限定されない。
図6は、約25%の音波破砕振幅および約0.17mL/分の流速で異なるグリセロール含有率(0%、約15%、および約25%グリセロール)を有する約5%絹溶液から調製されたSCFDマイクロスフェア(表2)からの、加齢性(ウェット)黄斑変性を治療するためにFDAにより認可された薬物(ベバシズマブ、例えば、AVASTIN(登録商標);MW=149KDa、約25mg/ml原液)の放出動態を示す。メマンチンが封入されたSCFD絹マイクロスフェアの調製物と比較して、絹/ベバシズマブ溶液は、ベバシズマブが封入されたSCFD絹マイクロスフェアを作製する時に音波破砕中にゲル化または凝集する傾向が高かった。このことは絹とベバシズマブ分子との間の強力な分子間相互作用を示している。さらに、初期バースト(0%、約15%、および約25%グリセロールについて、それぞれ、13.8%、18.3%、および6.5%)ならびにベバシズマブ-絹マイクロスフェアからの13日後の累積放出(0%、約15%、および約25%グリセロールについて、それぞれ、15.6%、20%、および6.5%)はメマンチン-絹マイクロスフェアからのものよりかなり低かった(図6)。さらに、メマンチン-絹マイクロスフェアからの放出と比較して、ベバシズマブ-絹マイクロスフェア中のグリセロール含有率を約25%まで上げても薬物放出速度が増加する傾向は示されなかった。0%または約15%のグリセロール含有率を有するベバシズマブ-絹マイクロスフェアと比較して、最も高いグリセロール含有率(約25%)を有するベバシズマブ-絹マイクロスフェアは初期バーストのレベルが最も低く、13日後の持続放出が最も少なかった(図6)。理論に拘束されるものではないが、高濃度のグリセロール(豊富なヒドロキシル基)が水素結合を介してベバシズマブと絹との間の相互作用を補強することができた可能性が高い。タンパク質分子と絹材料との強力な結合は以前に報告されているが、基礎をなす機構はまだ明らかになっていない(Wang X. et al. 「Silk microspheres for encapsulation and controlled release」 J Control Release (2007)117:360-70 Wang X et al. 「Silk nanospheres and microspheres from silk/PVA blend films for drug delivery」 Biomaterials (2010) 31:1025-1035; Lu Q. et al. 「Stabilization and release of enzymes from silk films」 Macromol Biosci (2010) 10:359-368)。絹材料の全疎水性のために、疎水性相互作用は結合にとって最も重要な力であると考えられたが、静電相互作用(絹フィブロインのpI値は約3である)および水素結合も重要な役割を果たしている可能性がある(Lu Q. et al., 同上)。一部の態様において、絹濃度および/または親和性を妨げる添加物の存在を含むが、これに限定されない絹とタンパク質薬物(例えば、ベバシズマブ)との間の分子間相互作用に影響を及ぼし得る他の要因を調節すると、絹材料担体からのタンパク質薬物の放出を制御することができる。
凍結乾燥した絹マイクロスフェア、または絹-薬物マイクロスフェア(例えば、絹-メマンチンおよび絹-ベバシズマブマイクロスフェア)を約1%〜約3%カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液(CMC、水に溶解した4%溶液、25℃の場合、粘性=50〜200cP)に懸濁して、均一な懸濁液を形成することができた。絹-薬物マイクロスフェアを含む絹マイクロスフェアのCMC懸濁液は、絹マイクロスフェアのサイズに応じて針、例えば、21ゲージ針を通して注入することができる。このことは、臨床用途のために非侵襲的投与経路、例えば、皮下注射、筋肉内注射を介してSCFD絹マイクロスフェア製剤を適用する実現可能性を示している。
Claims (75)
- 絹マイクロスフェアを調製する方法であって、
絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成を誘導する工程;および
該絹溶液からのマイクロスフェアの形成を誘導する工程
を含む、方法。 - フィブロインのβシート構造の形成およびマイクロスフェアの形成が同時に誘導される、請求項1記載の方法。
- 絹溶液中でのフィブロインのβシート構造の形成が音波破砕によって誘導される、請求項1または2記載の方法。
- 絹溶液からのマイクロスフェアの形成が該絹溶液の霧化によって誘導される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 超音波駆動式のフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して絹溶液を流すことによって、フィブロインのβシート構造の形成およびマイクロスフェアの形成が同時に誘導される、請求項2記載の方法。
- 絹溶液が約0.001mL/分〜約5mL/分の流速でフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して流される、請求項5記載の方法。
- 絹溶液が約0.05mL/分〜約0.3mL/分の流速でフロースルーチャンバまたは超音波アトマイザを通して流される、請求項6記載の方法。
- 音波破砕が少なくとも約10kHz、または約20kHz〜約40kHzの周波数で行われる、請求項3〜7のいずれか一項記載の方法。
- 音波破砕の電力出力が約1ワット〜約50ワット、または約2ワット〜約20ワットである、請求項3〜8のいずれか一項記載の方法。
- 絹マイクロスフェアを凍結させる工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 絹マイクロスフェアを零下温度に曝露することによって、該絹マイクロスフェアを凍結させることができる、請求項10記載の方法。
- 冷却剤によって冷却された容器の中に絹マイクロスフェアを収集することによって、該絹マイクロスフェアが零下温度に曝露される、請求項10または11記載の方法。
- 絹マイクロスフェアを凍結乾燥に供する工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- 絹マイクロスフェアの多孔度が少なくとも約30%である、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- 絹マイクロスフェアの孔サイズが約1nm〜約500μm、または10nm〜約50μmである、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 絹溶液が約1%(w/v)〜約30%(w/v)の濃度の絹フィブロインを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- 絹溶液が約5%(w/v)の濃度の絹フィブロインを含む、請求項16記載の方法。
- 絹マイクロスフェアが活性作用物質を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- 活性作用物質が温度感受性の活性作用物質を含む、請求項18記載の方法。
- 活性作用物質が治療剤である、請求項18または19記載の方法。
- 治療剤が、有機低分子または無機低分子;糖類;オリゴ糖;多糖;生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体;ペプチド模倣体;核酸;核酸類似体および誘導体;抗体およびその抗原結合フラグメント;生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞から作製された抽出物;動物組織;天然組成物または合成組成物;ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項20記載の方法。
- 治療剤がベバシズマブ、メマンチン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項20または21記載の方法。
- 活性作用物質が約0.1%(w/w)〜約50%(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、請求項18〜22のいずれか一項記載の方法。
- 活性作用物質が約1%(w/w)〜約30%(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、請求項23記載の方法。
- 活性作用物質が絹溶液中に存在する、請求項18〜24のいずれか一項記載の方法。
- 絹マイクロスフェアが、マイクロスフェア総重量に対して約30%(w/w)〜約100%(w/w)の量の絹を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
- 絹溶液が添加物をさらに含む、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。
- 絹溶液中の添加物と絹の重量比が約1:100〜約100:1である、請求項27記載の方法。
- 絹溶液中の添加物と絹の重量比が約1:10〜約10:1である、請求項27または28記載の方法。
- 添加物が、生体高分子、ポロゲン、磁性粒子、可塑剤、検出標識、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
- 添加物が可塑剤である、請求項27〜30のいずれか一項記載の方法。
- 可塑剤が、絹中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成を誘導する、請求項30または31記載の方法。
- 可塑剤が、グリセロール、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項30〜32のいずれか一項記載の方法。
- 絹マイクロスフェアを後処理に供する工程をさらに含む、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
- 後処理が、絹マイクロスフェア中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成をさらに含む、請求項34記載の方法。
- 後処理が、アルコール浸漬、水蒸気アニール、熱アニール、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項34〜35のいずれか一項記載の方法。
- 後処理の前の絹マイクロスフェアの水溶解度が50%未満である、請求項34〜36のいずれか一項記載の方法。
- 後処理の前の絹マイクロスフェアの水溶解度が30%未満である、請求項34〜37のいずれか一項記載の方法。
- 絹マイクロスフェアのサイズが約10μm〜約1000μmである、請求項1〜38のいずれか一項記載の方法。
- 絹マイクロスフェアのサイズが約50μm〜約100μmである、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
- 霧化が、液滴発生装置のスプレーノズルシステムを使用することを含む、請求項4〜40のいずれか一項記載の方法。
- 霧化が、注射器押出し、同軸空気流法、機械的攪乱法、静電力法、または静電ビーズ発生法を含む、請求項4〜41のいずれか一項記載の方法。
- 霧化が、空気駆動の液滴発生用封入ユニットのノズルを通して絹溶液を噴霧することを含む、請求項4〜42のいずれか一項記載の方法。
- ノズル直径;スプレーの流速;スプレーの圧力;ノズルからの絹マイクロスフェア収集容器の距離;絹溶液の濃度;音波破砕波の出力;音波破砕処理の時間;およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数のパラメータを変化させることによって絹マイクロスフェアの形状またはサイズが変化する、請求項1〜43のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1〜44のいずれか一項記載の方法を用いて調製された、絹マイクロスフェア。
- 内部にローディングされた活性作用物質の少なくとも約5%を少なくとも約10日間にわたって放出する、請求項45記載の絹マイクロスフェア。
- 請求項45〜46のいずれか一項記載の絹マイクロスフェアおよび薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 注射可能であるように製剤化されている、請求項47記載の組成物。
- 治療剤をインビボで持続送達する方法であって、請求項47〜48のいずれか一項記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
- 約10μm〜約2000μmのサイズを有する絹マイクロスフェアを含む、組成物。
- 絹マイクロスフェアのサイズが約30μm〜約1000μmである、請求項50記載の組成物。
- 絹マイクロスフェアが水不溶性である、請求項50または51記載の組成物。
- 水不溶性の絹マイクロスフェアのβシート結晶含有率が少なくとも約50%以上である、請求項50〜52のいずれか一項記載の組成物。
- 絹マイクロスフェアが活性作用物質をさらに含む、請求項50〜53のいずれか一項記載の組成物。
- 活性作用物質が、溶媒感受性および/または温度感受性の活性作用物質である、請求項54記載の組成物。
- 活性作用物質が、有機低分子または無機低分子;糖類;オリゴ糖;多糖;生物学的高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチド類似体および誘導体;ペプチド模倣体;核酸;核酸類似体および誘導体;抗体およびその抗原結合フラグメント;治療剤;生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物細胞から作製された抽出物;動物組織;天然組成物または合成組成物;ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項50〜55のいずれか一項記載の組成物。
- 治療剤がベバシズマブ、メマンチン、またはこれらの組み合わせを含む、請求項56記載の組成物。
- 活性作用物質を含む絹マイクロスフェアが、5日間にわたって該活性作用物質の総ローディングに対して約1%放出〜約50%放出という放出プロファイルを有する、請求項54〜57のいずれか一項記載の組成物。
- 放出プロファイルが持続放出を含む、請求項58記載の組成物。
- 放出プロファイルが即時放出をさらに含む、請求項59記載の組成物。
- 活性作用物質が約0.1%(w/w)〜約50%(w/w)の量で絹マイクロスフェア内に存在する、請求項50〜60のいずれか一項記載の組成物。
- 絹マイクロスフェアが、マイクロスフェア総重量に対して約10%(w/w)〜約100%(w/w)の量の絹フィブロインを含む、請求項50〜61のいずれか一項記載の組成物。
- 絹マイクロスフェアが添加物をさらに含む、請求項50〜62のいずれか一項記載の組成物。
- 絹マイクロスフェア中の添加物と絹フィブロインの重量比が約1:100〜約100:1である、請求項63記載の組成物。
- 添加物が、生体高分子、ポロゲン、磁性粒子、可塑剤、検出標識、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項63または64記載の組成物。
- 添加物が可塑剤を含む、請求項65記載の組成物。
- 可塑剤が、絹中でのフィブロインのβシート結晶構造の形成を誘導する、請求項66記載の組成物。
- 可塑剤が、グリセロール、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項66または67記載の組成物。
- 添加物がグリセロールを含む、請求項68記載の組成物。
- 絹マイクロスフェア中のグリセロールと絹フィブロインの比が約1:10〜約10:1である、請求項69記載の組成物。
- 注射可能である、請求項50〜70のいずれか一項記載の組成物。
- 薬学的組成物である、請求項50〜71のいずれか一項記載の組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項72記載の組成物。
- 薬学的組成物が、錠剤、カプセル、ロゼンジ、粉末、ペースト、顆粒、液体、溶液、ゲル、またはこれらの任意の組み合わせの形態である、請求項72または73記載の組成物。
- 絹マイクロスフェアが多孔性である、請求項50〜74のいずれか一項記載の組成物。
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