JP2015512371A - 免疫調節性作用物質およびその使用 - Google Patents

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Abstract

関節損傷の治療または予防のために有用な免疫調節性作用物質を開示する。特に、アグリカンポリペプチドおよびそのシトルリン型に対する抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起して、早期ＲＡまたは初期ＲＡ患者の関節損傷を含む関節損傷を治療または予防するための免疫調節剤を開示する。

Description

本発明は、概ね関節損傷の治療または予防に有効な免疫調節性作用物質に関するものである。特に、本発明は、アグリカンポリペプチドおよびそのシトルリン化型に対して抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起し、早期ＲＡまたは初期ＲＡを含む関節損傷を治療または防止する免疫調節剤の使用に関するものである。
炎症性関節炎は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群および多発性筋炎を含む多くの自己免疫病において目立つ臨床的症状である。これらの患者の大部分には身体検査で関節の変形が見られる。しかし一般的にＲＡおよびＰｓＡ患者については画像検査で骨の侵食が明らかになる。
ＲＡのような慢性炎症性骨疾患の病因は十分には解明されていない。このような疾患は、破骨組織の吸収の増加により損傷関節周囲の骨喪失を伴うが、これには炎症性サイトカイン類の局所的産生増加が大きく関与している（Teitelbaum, 2000. Science 289:1504-1508; Goldring and Gravallese, 2000. Arthritis Res. 2(1):33-37)。これらのサイトカインは、破骨細胞系の細胞類に直接作用することができるが、必須破骨細胞分化因子、ＮＦ‐κＢリガンドのレセプタアクチベータ（ＲＡＮＫＬ）、および／またはその可溶性ｄｅｃｏｙレセプタ、オステオプロテグリン（ＯＰＧ）の産生に影響を与えることによって間接的に作用することもできる（Hossbauerら, 2000. J. Bone Min. Res. 15(1):2-12）。
ＲＡは全身性炎症性疾患であり、北ヨーロッパおよび北米では成人人口の約０．５‐１％が、世界のその他の地域ではこれよりわずかに低い割合が罹患している（Alamanos and Drosos, 2005. Autoimmun. Rev. 4: 130-136)。その特徴は関節滑膜組織の慢性炎症であり、最終的には慢性的な疼痛および疲労によって日常の生活機能の喪失に至る。それは慢性炎症性疾患である。患者の大部分は冒された関節の軟骨および骨の漸進的悪化も経験し、最終的には永久的障害に至ることもある。ＲＡの長期的予後は悪く、診断時から１０年以内に患者の約５０％が顕著な機能障害をきたす。
ＲＡでは数種の自己抗原が報告されている。これには疾病関節においてシトルリン化された種々の蛋白質も含まれる。シトルリン化はアポプトーシスおよび、炎症中に起きる、アルギニン脱イミン化の生理学的過程である。この過程はアルギニン含有蛋白の変異を起こす。すなわち、ＨＬＡ対立遺伝子のリスクをもった人々においてneo-self抗原の組み合わせを生じ得る（Vossenaar ERら, 2004. Arthritis Res. Ther. 6:107-11）。ＤＲβ鎖の第三高可変領域のアミノ酸７０‐７４に位置づけられる特異的ＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子変異体はＲＡと高度に関連している（Gregersen PKら, 1987. Arthritis Rheum. 30:1205-1213）。この領域はＨＬＡ‐ＤＲ抗原結合溝に第四アンカリング（つなぎとめ）ポケット（Ｐ４）を形成する保存されたアミノ酸配列をコード化する。この「共通感受性エピトープ」（Shared susceptibility epitope: SE）は、コーカサス人のＤＲＢ１*０４０１、ＤＲＢ１*０４０４、ＤＲＢ*０１０１を含めて、多数のＲＡ関連ＤＲ対立遺伝子に見出される（Gregersen PKら, 1987, supra）。ＳＥをコードするＨＬＡ対立遺伝子は特にＡＣＰＡ‐陽性ＲＡと関連する（Klareskog Lら, 2006. Arthritis Rheum. 54:38-46; van Gaalen FAら, 2004. Arthritis Rheum. 50:2113-21; Hida Sら, 2004. J. Autoimmun. 23:141-50; Hill JAら, 2003. J. Immunol. 171:538-41）。
ＳＥは高度に正に帯電し、結合リガンドのＰ４アミノ酸の特異性に影響を与えるＤＲβ鎖の領域に位置しているため、この位置の負に帯電したまたは無極性のアミノ酸を含むペプチドに好んで結合するであろう。シトルリン化は帯電したアルギニンアミノ側鎖基を、帯電していないカルボニル基に置換し、ヒトビメンチンペプチドエピトープの、ＳＥ＋ ＨＬＡ ＤＲ分子への結合親和性を高める (Hill JAら, 2003, supra; Snir Oら, 2011. Arthritis Rheum. n/a-n/a)。
ＲＡ患者の血清の７０％は抗シトルリン化蛋白自己抗体（ＡＣＰＡ）を含む（Meyer Oら, 2006. Arthritis Res. Ther. 8:R40)。この反応は翻訳後に改変されたシトルリン化自己抗原の群（フィブリノーゲン、ビメンチン、コラーゲンII型およびエノラーゼを含む）の方向へ向かう自己抗体産生を反映する(Wegner Nら, 2010. Immunol. Rev. 233:34-54)。ＡＣＰＡは、ＲＡの発病の１５年前までに発現し、発病が近づくにつれて滴定値およびペプチド反応性は増加する(van de Stadt LAら, 2011. Arthritis Rheum. n/a-n/a)。ＲＡの炎症組織にシトルリン化蛋白質の存在が明らかにされており、炎症性関節炎のマウスモデルの多数にＡＣＰＡが誘起されている（Masson-Bessiere Cら, 2001. J. Immunol. 166:4177-84; Vossenaar ERら, 2003. Arthritis Rheum. 48:2489-500; Kuhn KAら, 2006. J. Clin. Invest. 116:961-73; Glant TTら, 2011. Arthritis Rheum. 63:1312-1321.）。シトルリン化はストレスや炎症に応じて広く存在するとはいえ、ＡＣＰＡはＲＡに高度に特異的であり、よりひどい関節損傷およびＸ線写真の結果と関連している（Klareskog Lら, 2006, supra; van Gaalen FAら, 2004, supra; Meyer Oら, 2006, supra）。
ＨＬＡ‐ＤＲＢ１*０４０１トランスジェニックマウスを、天然フィブリノーゲンではなくシトルリン化フィブリノーゲンで免疫すると、炎症性関節炎（シトルリン化および天然ＨＬＡ‐ＤＲ限定フィブリノーゲンエピトープに対するＢ細胞およびＴ細胞同時の自己反応性を特徴とする）が誘起された。これは天然のＨＬＡ‐ＤＲＢ１*０４０１トランスジェニックマウスでは見られなかった。天然フィブリノーゲンよりむしろシトルリン化フィブリノーゲンの方が、関節炎を誘起する能力が大きいということは、一つ以上のシトルリン化ｎｅｏ‐ｓｅｌｆエピトープが、プライミング中かまたはエピトープ スプレデイングに起因して、対応する天然エピトープに比較してＴ細胞の免疫寛容原性を破壊したことを示唆する（Hill JAら, 2008. J. Exp. Med. 205:967-979）。さらに、最近の研究では、アバタセプトの運搬がシトルリン化抗原に対する免疫寛容を回復させる可能性があることが示唆されている(Yue Dら, 2010. Arthritis Rheum. 62:2941-2952)。トランスジェニックマウスにおけるこれらの研究に反して、シトルリン特異的自己反応性Ｔ細胞をＲＡ患者において発現させることは困難であった。それはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける自己反応性エフェクターメモリーによりなされる増殖反応が弱いことによる。しかし、いくつかの最近の論文では、ＲＡ患者においてシトルリン化ビメンチンおよびアグリカンエピトープに応答してＲＡ患者のＴ細胞による確かなサイトカイン反応が起こることが示されている（Snir Oら, 2011, supra; von Delwig Aら, 2010. Arthritis Rheum. 62:143-149）。ビメンチンの場合、エピトープの免疫原性はそのペプチド配列のシトルリン改変部位に依存する(Snir Oら, 2011, supra)。
本発明者らはＳＥ＋の健康対照者とＲＡ患者との、一組のシトルリン化および不変(天然)の自己抗原に対する反応をここにプロファイルし、そして反応するＴ細胞を特徴づけた。それらの目的は：（１）ＡＣＰＡ＋ＲＡに特に関連する可能性のあるシトルリン化エピトープを同定すること；（２）シトルリン化自己抗原性Ｔ細胞反応のなかで個々の変異の程度を測定すること；（３）ＡＣＰＡ＋ＲＡの発生に関与する可能性のあるＴ細胞を確認することであった。
本発明は、長期の疾患をもつＲＡ患者は複数のシトルリン化自己抗原に対するＴリンパ球反応をより生じやすく、それに対して最近ＲＡに罹った患者（これまで治療しなかった患者も含む）は、無抗原またはシトルリン化アグリカンのみに対して、より反応しやすい、という予期せざる発見に、部分的に起因する。これらの考察に基づき、シトルリン化アグリカンを含むアグリカンに全体的にまたは部分的に対応する抗原類は、早期ＲＮ患者(例えば関節の腫脹や疼痛といった臨床症状がまだ起きていない場合など）、またはＲＡが進行するリスクがある人々（例えば初期ＲＡ）を含めて、関節損傷の治療または予防のための免疫治療的戦略に有用であろうと考案された。
よって一側面において、本発明は被検体における関節損傷を治療または予防するための方法を提供する。これらの方法は、一般的に、その被検体にアグリカン ポリペプチド（例えばシトルリン化アグリカンポリペプチドがあり、ここでは「ｃｉｔ‐アグリカン」または「ｃｉｔ‐ａｇｇ」ポリペプチドとも表記する）に対する抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起し、それによって関節損傷を治療または予防することを含み、または上記のことからなり、あるいは本質的に上記のことからなる。幾つかの実施態様において、その被検体は早期ＲＡまたは初期ＲＡとしているが、同様の例証的実施例において、これらの方法はさらに、好適にこの被検体が抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起する前に、早期ＲＡまたは初期ＲＡを有することを確認することを含む。幾つかの実施態様において、その被検体は共通エピトープ（ＳＥ）陽性であるが、同様の例証的実施例において、これらの方法は、その被検体が抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起する前に、その被検体がＳＥ陽性であることを確認することを含む。好適には、その被検体はアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐ａｇｇポリペプチド）またはその断片に対するエフェクター免疫反応（非制限的に、ＣＤ４＋エフェクターＴリンパ球のようなエフェクターＴリンパ球反応）を含む免疫反応を有するか、またはその免疫反応が発生するリスクを有する。非制限的実施例において、その免疫反応は、インターロイキン‐６（ＩＬ‐６）、インターフェロン‐γ（ＩＦＮ‐γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン‐１０（ＩＬ‐１０）からなる群から選択される少なくとも一種類のサイトカインの産生（例えば、分泌）を含む。幾つかの実施態様において、その免疫反応は炎症性Ｔリンパ球反応（ＩＬ‐６、ＩＦＮ‐γ、およびＴＦＮからなる群から選択される少なくとも一種類のサイトカインの産生（例えば分泌）からなり、または前記からなり、あるいは本質的に前記からなる）を含む。同様の例証的実施例において、炎症性Ｔリンパ球反応は、ＩＬ‐６の産生（例えば分泌）を含み、または前記からなり、あるいは本質的に前記からなる。好適には、上記免疫反応は少なくとも一部はＣＤ４＋ＣＤ２８−Ｔリンパ球によって行われる。幾つかの実施態様において、上記免疫反応は少なくとも一部はＣＤ４＋ＣＤ２８＋Ｔリンパ球によって行われる。特定の実施態様において、免疫反応は少なくとも一部はＣＤ４＋ＣＤ２８−Ｔリンパ球およびＣＤ４＋ＣＤ２８＋Ｔリンパ球によって生起される。
抗原特異的免疫寛容原性反応は任意の適切な戦略を用いて達成することができ、その例証的実施例は以下を含む。
（１）被検体においてアグリカンポリペプチドの一部分に対応するペプチド（例えば自己抗原）を与える免疫寛容原性抗原提示細胞（ここでは「アグリカン特異的免疫寛容原性抗原提示細胞」または「ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣ」とも言う）の数を増やすこと。ここで上記部分はアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐ａｇｇポリペプチド）に対する炎症性または自己反応性Ｔリンパ球反応に関連する。
（２）被検体の炎症性または自己反応性Ｔリンパ球（例えばエフェクターＴリンパ球）（これらはアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐ａｇｇポリペプチド）またはその部分に対して反応性を有する）にアネルギーまたはアポトーシスを生起すること。
（３）被検体において調節性または抑制性Ｔリンパ球の数を増やすこと（これらのリンパ球はアグリカンポリペプチドに対する炎症性または自己反応性Ｔリンパ球反応を抑制または減少させる）。
こうして幾つかの実施態様において、本発明の方法は、関節損傷を治療または阻止しようとしている被検体におけるａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣの数を増やすことを含み、または増やすことからなり、あるいは本質的に増やすことからなる。幾つかの実施態様において、ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣは、アグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対する炎症性または自己反応性Ｔリンパ球の反応を抑制または減少させる調節性またはサプレッサーＴリンパ球の産生を刺激する。好適には、調節性または抑制性Ｔリンパ球は、構成的調節性またはサプレッサーＴリンパ球（例えばＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ４から選択される少なくとも１つのマーカー）の少なくとも１つ（例えば１、２、３、４、５など）のマーカーおよび転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）を発現する。例証的な調節性またはサプレッサーＴリンパ球は、非制限的に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔリンパ球、Ｔｒｌリンパ球、Ｔｈ３リンパ球、およびＣＤ８＋調節性Ｔリンパ球を含む。特定の実施態様において、調節性Ｔリンパ球はＣＤ４＋ＣＤ２５＋である。非制限的な抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、Ｂリンパ球および人工的抗原提示細胞を含む。
アグリカン特異的免疫寛容原性抗原提示細胞は任意の適切な戦略を用いて産生できる。幾つかの実施態様において、それら細胞は、抗原提示細胞（例えば樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、Ｂ細胞など）を、（１）抗原提示細胞のＮＦ‐κＢ経路を阻止するのに十分な量の少なくとも１つのＮＦ‐κＢインヒビターと、および／または（２）抗原提示細胞のｍＴＯＲを阻止するのに十分な量の少なくとも１種類のｍＴＯＲと、および／または（３）抗原提示細胞のＳｙｋ経路を十分阻止する量の少なくとも１種類のＳｙｋインヒビターと接触させることによって産生できる。そしてまた全体的にまたは一部分アグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に、またはその抗原を発現し得る核酸分子に全体的に、または一部対応する抗原から選択される抗原性分子の、抗原提示細胞がその抗原を与えるのに十分な量、またはそれらの表面で操作された形の上記抗原を与えるのに十分な量と接触させる。同様の例証的実施例において、これらの方法は、被検体（例えば初期ＲＡまたは早期ＲＡのある人など、関節損傷のある、またはそのリスクがある人）に、ＮＦ‐κＢインヒビター、および、全体的にまたは一部分アグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）またはその抗原を発現し得る核酸分子に対応する抗原から選択される抗原性分子を同時投与することを含み、または上記からなり、あるいは本質的に上記からなる。その際上記インヒビターは、被検体の抗原提示細胞のＮＦ‐κＢ活性を十分に阻止する量が投与され、上記抗原性分子は、ＮＦ‐κＢ活性インヒビテド‐抗原提示細胞が被検体の免疫系に上記抗原またはその操作された形のものを現すのに十分な量が投与される。その他の例証的実施例において、上記方法は、被検体（例えば初期ＲＡおよび早期ＲＡのある人のような、関節損傷が発生している人またはそのリスクのある人）にｍＴＯＲインヒビターと、全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）またはその抗原を発現し得る核酸分子から選択される抗原性分子とを同時投与することを含み、または上記からなり、あるいは本質的に上記からなる。その際上記インヒビターは被検体の抗原提示細胞のｍＴＯＲ活性を十分阻止する量が投与され、上記抗原分子は、上記ｍＴＯＲ活性‐インヒビテド‐抗原提示細胞が、その抗原またはその操作された形のものを被検体の免疫系に現すのに十分な量が投与される。また別の例証的実施例において、これらの方法は、被検体（例えば初期ＲＡまたは早期ＲＡのある人のような関節損傷のある人またはそのリスクのある人）に、Ｓｙｋインヒビターと、全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）または上記抗原を発現し得る核酸分子とを同時投与することを含み、または上記からなり、あるいは本質的に上記からなる。その際上記インヒビターは、被検体の抗原提示細胞におけるＳｙｋ活性を十分阻止する量が投与され、上記抗原分子は、ＮＦ‐κＢ活性‐インヒビテド‐抗原提示細胞が、上記抗原またはその操作された形のものを被検体の免疫系に現すのに十分な量が投与される。好適には、抗原性分子がその抗原を発現し得る核酸分子である場合、その核酸分子は概してその抗原をコードするヌクレオチド配列であって、上記抗原提示細胞において操作可能な調節要素に操作によって結合する上記ヌクレオチド配列を含む核酸構成物の形である。これらの実施態様において、一つ以上のインヒビター（例えば少なくとも１種類のＮＦ‐κＢインヒビターおよび／または少なくとも１種類のｍＴＯＲインヒビターおよび／または少なくとも１種類のＳｙｋインヒビター）および／または上記抗原分子は概して抗原提示細胞またはそれらの前駆体に挿入する（例えば形質転換、インターナリゼーション、エンドサイトーシス、または食細胞活動）のに適した形である。すなわち上記インヒビターおよび／または抗原分子の可溶性および粒状の形を含む。
幾つかの実施態様において、抗原提示細胞を、ＮＦ‐κＢ経路の少なくとも１種類のインヒビターと接触させる。この例証的実施例を下表２、３Ａ、３Ｂまたは４に列挙する。特定の実施態様において、ＮＦ‐κＢインヒビターはクルクミンまたはクルクミン誘導体である。
アグリカン抗原は、推定的に全長のシトルリン化アグリカンポリペプチド（その操作しない形、部分的に操作した形およびその成熟形を含む）に対応するアミノ酸配列を含み、または上記配列からなり、あるいは本質的に上記配列からなってよい。代替的に、上記アグリカン抗原は、非制限的にＧ１、Ｇ２およびＧ３ドメインのようなシトルリン化アグリカンポリペプチドのドメインを含み、またはそれらからなり、あるいは本質的にそれらからなってよい。幾つかの実施態様において、上記抗原はＴ‐細胞エピトープに対応するアミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなってよい。その他の実施態様において、上記抗原は複数のペプチド類（ここで個々のペプチド類はアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンに対応するアミノ酸配列の、異なる諸部分を含む）を含み、またはそれらからなり、あるいは実質的にそれらからなる。同様の例証的実施例において、これらのペプチドはオーバーラッピング ペプチドである。
関連する実施態様において、インヒビター（例えばＮＦ‐κＢインヒビター、ｍＴＯＲインヒビターおよび／またはＳｙｋインヒビター）および抗原分子は、可溶性または粒状形で同時投与される（例えば抗原分子およびインヒビターは両方共可溶性形であるか、または抗原分子またはインヒビターの一つが可溶性形でその他が粒状形であるか、または抗原分子およびインヒビターが両方共粒状形である）。特定の実施態様において、インヒビターおよび抗原分子の両方が粒状形で同時投与される。例えば、インヒビターおよび抗原分子が一つ以上の粒子（例えばリポソームのようなナノ粒子またはミクロ粒子、および重合粒子）に含まれてもよく、それら粒子は抗原提示細胞に好適に取り込まれることが可能である。特定の実施態様において、インヒビターおよび抗原性分子は同じ粒子内に含まれる。上記インヒビターおよび抗原性分子は、注射によって、局所適用によって、または持続的放出投与法を含む経鼻または経口ルートによって、アグリカンポリペプチドに対するＴリンパ球反応を抑制または減らし、またはＲＡの症状を改善するために好適に有効である量が、ある適切な時間にわたって投与される。特定の実施態様においては、インヒビターおよび抗原分子は皮下に同時投与される。
その他の実施態様において、ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣは、全体的にまたは部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原をコードする核酸分子をＢリンパ球に発現させることによって作られる。その際、上記核酸分子の発現は、Ｂリンパ球の表面上の抗原または操作された形の抗原の出現に通ずる。好ましくは、これらの実施例において、核酸分子は、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）または上記抗原に（例えば抗原のＣ末端の近くに）直接または間接的に融合した免疫グロブリンの断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２免疫グロブリン断片、免疫グロブリン重鎖など）をさらにコードする。
幾つかの実施態様において、上記方法は、被検体にａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣまたはその前駆体を、アグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対する炎症性または自己反応性Ｔリンパ球反応を抑制または軽減するために有効な、またはその反応の発生を阻止するために有効な量、投与することを含み、またはこれらからなり、あるいは本質的にこれらからなる。同様の例証的実施例において、ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣまたはそれらの前駆体は、被検体から、または組織適合性ドナーから抗原提示細胞または抗原提示細胞前駆体を採取し、それらをｅｘ ｖｉｖｏで（Ａ１）抗原提示細胞のＮＦ‐κＢ経路を阻害するのに十分な量の少なくとも一種類のＮＦ‐κＢインヒビター；および／または（Ａ２）抗原提示細胞のｍＴＯＲを阻害するのに十分な量の少なくとも一種類のｍＴＯＲインヒビター；および／または（Ａ３）抗原提示細胞のＳｙｋ経路を阻害するのに十分な量の少なくとも一種類のＳｙｋインヒビターにさらし、および（Ｂ）アグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に全体的にまたは一部対応する抗原、または上記抗原を発現し得る核酸分子から選択される抗原性分子であって、抗原提示細胞またはその前駆体が上記抗原または操作された形の上記抗原を被検体の免疫系に与えるのに十分な量の抗原性分子にさらすことによって作出される。
その他の例証的実施例において、ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣまたはそれらの前駆体は、Ｂリンパ球またはＢリンパ球前駆体を被検体からまたは組織適合性ドナーから採取し、それらに、調節性要素に操作可能に結合し、且つアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に全体的または一部対応する抗原をコードする核酸分子をｅｘ ｖｉｖｏで挿入することによって作られるが、その際上記核酸分子の発現はＢリンパ球の表面上の上記抗原および操作された形の抗原の具現に通ずる。特定の実施態様において、上記核酸分子はさらに、その抗原に直接または間接に融合した免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片をコードする。前駆体を用いる場合、その前駆体を、抗原提示細胞が前駆体から分化するのに十分な条件下で、十分な時間培養するのが適切である。
その他の実施態様において、これらの方法は、被検体に、本質的に全体的および部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原と、抗原‐結合部位を有する分離した（例えば可溶性の）ＭＨＣ成分とからなるＭＨＣ‐ペプチド複合体であって、上記抗原は上記抗原結合部位と結合する上記ＭＨＣ‐ペプチド複合体を被検体に投与することを含み、または前記投与からなり、あるいは本質的に前記投与からなる。
また別の実施態様において、これらの方法は、免疫調節性ペプチドと免疫‐またはＴ細胞‐結合リガンド（Ｉ／ＴＣＢＬ）とを含むキメラ構成物を被検体に投与することを含み、または前記からなり、あるいは本質的に前記からなり、この場合上記免疫調節性ペプチドはアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）の一部分（例えば自己抗原）に対応するアミノ酸配列を含み、または上記配列からなり、あるいは本質的に上記配列からなる。上記部分はリウマチ性関節炎（ＲＡ）と関連し、それは炎症性または自己反応性Ｔリンパ球上の抗原レセプタ（例えばＴ細胞レセプタ）に結合する。その際Ｉ／ＴＣＢＬはヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および細胞毒性Ｔ細胞からなる群から選択されるＴ細胞のクラスまたはサブクラスに結合し、Ｔ細胞の活性を調節する。好適には、Ｉ／ＴＣＢＬはＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子、β２-ミクログロブリンのようなアクセサリー分子、リンパ球機能関連分子‐３（ＬＦＡ‐３）、免疫グロブリン分子の重鎖のＦｃ領域、Ｉａ＋分子、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、レクチンに対する抗体、リンホカイン、から選択される分子の少なくとも一部を含む。
その他の実施態様において、上記方法は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）と好適に関連し、炎症性または自己反応性Ｔリンパ球上の抗原レセプタ（例えばＴ細胞レセプタ）に結合するアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）の一部分（例えば自己抗原）に対応するアミノ酸配列を含み、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは本質的に上記アミノ酸配列からなる、変化したペプチドリガンド（ＡＰＬ）を被検体に投与することを含み、上記投与からなり、本質的に上記投与からなる。ここでＡＰＬアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸置換、欠失、または付加によってその部分のアミノ酸配列と区別され、抗原レセプタを通過する正常な暗号化を妨害し、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）より選択される少なくとも一つの活性を有する。（ｉ）アグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対するＴリンパ球の反応に拮抗すること （ｉｉ）アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的Ｔリンパ球にアネルギーを引き起こすこと （iii）アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的Ｔリンパ球にアポトーシスを引き起こすこと （ｉｖ）アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的Ｔｈ２免疫反応を刺激または誘起すること （ｖ）炎症性サイトカインの産生の抑制を含む、アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的Ｔｈ２免疫反応の発生を抑制すること（炎症性サイトカイン類の産生の抑制を含む） （ｖｉ）アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的調節性リンパ球（例えばＴ調節性リンパ球（Ｔｒｅｇ））の活性化を刺激すること、または（ｖｉｉ）炎症性刺激によるアグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的抗原提示細胞の活性化を防止または阻害すること。
関連する側面において、本発明は関節疾患（例えば早期ＲＡまたは初期ＲＡ）の治療または予防のための作用物質の使用、または関節疾患（例えば早期ＲＡまたは初期ＲＡ）を治療または予防する薬剤の製造にまで広がる。ここで上記作用物質は次の（１）〜（８）より選択される。（１）ＮＦ‐κＢ経路のインヒビターおよび全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）または上に広く記載されたように、上記抗原を発現し得る核酸分子 （２）ｍＴＯＲインヒビターおよび上に広く記載されたように、全体的にまたは部分的にアグリカンポリペプチド(例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原、または抗原を発現し得る核酸分子から選択される抗原性分子 （３）Ｓｙｋ経路のインヒビター、および全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原、または上に広く記載されたように抗原を発現し得る核酸分子から選択される抗原性分子 （４）上に広く記載されたように、全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原をコード化してＢリンパ球に導入する核酸分子 （５）本質的に、全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応し、Ｂリンパ球に導入されるための抗原をコード化する核酸分子 （５）本質的に、全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原および、抗原結合部位を有する分離した（例えば可溶性の）ＭＨＣ成分からなるＭＨＣ‐ペプチド複合体、ここで上記抗原は上に広く記載されたように抗原結合部位に結合する （６）上に広く記載されたようなキメラ構成物 （７）上に広く記載されたアグリカン特異的免疫寛容原性抗原提示細胞、または （８）上に広く記載されたアグリカンポリペプチド(例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド)の一部分に対応するアミノ酸配列を含み、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは本質的に上記アミノ酸配列からなるＡＰＬ。
本発明のもう一つの面は、被検体における関節損傷を治療または予防するのに好適に有用な組成物に関するものである。これらの組成物は概ね、以下（１）〜（６）より選択される作用物質を含み、またはそれらの作用物質からなり、あるいは本質的にそれらの作用物質からなる。（１）ＮＦ‐κＢ経路のインヒビターおよび、全体的にまたは一部アグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原、または上に広く記載されているように抗原を発現し得る核酸分子 （２）ｍＴＯＲインヒビター、および全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原、または上に広く記載されているような抗原を発現し得る核酸分子 （３）Ｓｙｋ経路のインヒビターおよび、全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原、または上に広く記載されているような上記抗原を発現し得る核酸分子から選択される抗原性分子 （４）上に広く記載されているように、全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原をコード化し、Ｂリンパ球に導入する核酸分子 （５）本質的に、全体的または部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原と、抗原結合部位を有する分離した(例えば可溶性の)ＭＨＣ成分とからなるＭＨＣ‐ペプチド複合体であって、上記抗原が抗原結合部位に結合している上記複合体(上に広く記載されている) （６）上に広く記載されているようなキメラ構成物 （７）上に広く記載されているようなアグリカン特異的免疫寛容原性抗原提示細胞、または （８）上に広く記載されたように、アグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）の一部に対応するアミノ酸配列を含み、または上記アミノ酸配列からなり、あるいは本質的に上記アミノ酸からなるＡＰＬ。
シトルリン化ペプチドおよび天然ペプチドで刺激した健康対照およびＲＡ患者のＴ細胞増殖反応を示すグラフである。図に示すように、２０名のＲＡ患者および６名の健康対照のＰＢＭＣおよびＳＦＭＣを、０、３または３０μg／ｍＬペプチドまたは４Ｌｆｉ／ｍＬ破傷風毒素と共に５日間インキュベートした。ＲＡにおける未刺激サイトカイン分泌および正味ＩＬ‐６分泌と、シトルリン化および天然ペプチド類で刺激した健康対照の単球との比較を示すグラフである。図に示すように、２０名のＲＡ患者および６名の健康対照のＰＢＭＣおよびＳＦＭＣを０、３または３０μg／ｍＬペプチドまたは４Ｌｆｉ／ｍＬ破傷風毒素と共にインキュベートした。Ｔ細胞の増殖を「３Ｈ」チミジンの取り込みによって分析した。各点は１個人をあらわす。ＲＡ患者では＊＊＊ｐ＜０．００１、健康な対照では＊＊ｐ＜０．０１は、複数の手段を比較する（Kruskal-Wallisテスト）。＊＊ｐ＜０．０１は破傷風毒素に対する反応に関して健康対照およびＲＡ患者のＰＢＭＣを比較する（Mann-Whitneyテスト）。＊ｐ＜０．０５はシトルリン化および天然アグリカンペプチドに対するＲＡ患者の反応を比較する（Mann-Whitneyテスト）。 ＲＡによる未刺激サイトカイン分泌および正味ＩＬ‐６分泌と、シトルリン化および天然ペプチドで刺激した健康対照における単核球細胞との比較を示すグラフである。Ａ：１７名のＲＡ患者と６名の健康対照からのＰＢＭＣを培地中で５日間インキュベートし、上澄液中のサイトカイン類をＣＢＡによって試験した。＊＊ｐ＜０．０１ ＩＦＮ‐γの産生をその他のそれと比較した場合（Kruskal-Wallisテスト、Dunns post-hoc補正あり）。Ｂ：１７名のＲＡと６名の健康対照のＰＢＭＣを、示したように０、３、または３０μg／ｍＬのペプチドと共にインキュベートし、上澄液中のＩＬ‐６をＣＢＡによって測定した。正味サイトカイン分泌を、［ペプチド刺激をしたＩＬ‐６濃度］−［ペプチド刺激をしないＩＬ‐６］として計算した。各点は１個人をあらわす。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１は、シトルリン化および天然ペプチド類に対するＩＬ‐６の反応を比較する（Wilcoxon signed rankテスト）。 図２−１に続く図である。 図２−２に続く図である。 シトルリン化および天然ペプチドで刺激したＲＡおよび健康対照のＰＢＭＣによる正味ＴＮＦ、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐１０、およびＩＬ‐１７分泌を示すグラフである。１７名のＲＡおよび６名の健康対照のＰＢＭＣを、示したように、０、３、または３０μｇ／ｍＬペプチドと共にインキュベートし、上澄液中のサイトカイン類をＣＢＡによって測定した。正味サイトカイン分泌を図２Ｂにおけるように計算した。各点は１個人をあらわす。＊ｐ＜０．０５は、シトルリン化および天然アグリカンに対するＩＬ‐１０の反応を比較する（Wilcoxon signed rankテスト）。 図３−１に続く図である。 図３−２に続く図である。 図３−３に続く図である。 ＲＡ患者および健康対照によって産生されるサイトカイン類の出現を示すグラフである。各サイトカインについて、陽性反応をもったＲＡ患者および健康対照のパーセンテージ（平均反応は、対応する天然ペプチドの方に高くなる＞２ＳＤ）を計算し、シトルリン化フィブリノーゲン、アグリカン、およびコラーゲンＩＩ型に対する反応についてプロットする。 ＲＡ患者および健康対照のシトルリン化ペプチド反応性ＩＬ‐６の反応の変化を示すグラフである。Ａ：１７名のＲＡ患者および６名の健康対照のＰＢＭＣおよびＳＦＭＣを、示したように０、３または３０μg／ｍＬペプチドと共にインキュベートし、各個人の上澄液中のＩＬ‐６反応をプロットした。疾病期間およびＨＬＡ型を記載する。Ｂ：各ペプチドについて陽性反応（平均反応が対応する天然ペプチドの方向に高くなる、＞２ＳＤ）の頻度を、最近発病したかまたは長期にわたって罹患しているＲＡ患者について示す。 ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットによるサイトカイン分泌を示すグラフである。ＨＬＡ‐ＤＲ ＳＥ＋ＲＡ患者および健康対照からのＰＢＭＣを、０または３０μｇ／ｍＬのシトルリン化フィブリノーゲンまたはシトルリン化アグリカンと共にインキュベートし、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐６（Ａ）、またはＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ、ＩＬ‐６およびＩＦＮ‐γ（Ｅ）に対するｍＡｂで着色し、それからフローサイトメトリーによって分析した。Ｂ：ゲーテイング法の概略を示す。Ｃ：ＣＤ４＋Ｔ細胞上にゲート化される細胞内サイトカイン染色のためのバックグラウンド着色を示すフルオレッセンス‐マイナス‐ワン（ＦＭＯ）プロット。Ｄ：ゲートされたＣＤ４‐ｎｏｎ‐Ｔ細胞のＩＬ‐６染色。ＩＬ‐６＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の（Ｅ）における比率が２．２％、５．３％、および７．１％、およびＩＬ‐６＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞の比率が０．８％、２．１％、および４％であった。これらの数字は、ペプチドなしのインキュベーション、シトルリン化フィブリノーゲンおよびシトルリン化アグリカンそれぞれを伴うインキュベーションにおける反応である。２名のＲＡ患者および１名の健康対照者が示されている。データは２名の健康ドナーおよび５名のＲＡ患者のものである。 図６−１に続く図である。 図６−２に続く図である。 図６−３に続く図である。 ＮＦ‐κＢ、ｍＴＯＲ、またはＳｙｋのインヒビターでＲＡ患者の抗原提示細胞を阻害すると、シトルリン化アグリカンペプチドに反応してＴ細胞サイトカインを誘発するそれらの能力が抑制されることを示すグラフである。 ＲＡ患者におけるシトルリン化アグリカンＧ１エピトープに対するサイトカインの反応を示すグラフである。 テトラマー染色によって測定した場合、リウマチ性関節炎患者の末梢血液中にシトルリン化アグリカン特異的Ｔ細胞が存在することを示すグラフである。 末梢血液中のｃｉｔ‐アグリカン特異的Ｔ細胞の数および蛍光強度を示すグラフである。
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１．定義
他に定義されない限り、ここに使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明に関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。ここに記載するものと類似または同様の任意の方法および材料を本発明の実施および予備試験に用い得るが、ここではより好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
冠詞「a」および「an」は、ここでは冠詞の文法的目的の１または１より多い（すなわち、少なくとも１）を言うために用いられる。例として、「an element」は１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
用語「約（about）」は、ここでは、明記されている条件（例えば、量、濃度、時間等）に対して１５％程度の差異がある条件、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の差異がある条件を言うために用いられる。
用語「同時投与（administration concurrently, administering concurrently, coadministering」は、２種類以上の活性作用物質を含む単一組成物を投与すること、あるいは全ての活性作用物質を単一組成物として投与した場合に相当する結果が得られるような十分短い時間内に、各活性作用物質を別々の組成物として、または別々の経路によって、同期間内に／同時に／逐次的に、投与することを言う。「同時に（simultaneouly）」とは、活性作用物質が実質的に同じ時間に投与されること、好ましくは共に一つの組成物中に含まれることを意味する。「同期間内に（contemporaneously）」とは、上記活性作用物質類が時間を空けずに投与される、例えば一作用物質が、他の作用物質の投与前または投与後約１分〜１日以内に投与されることを言う。その期間はどれほどであっても良い。しかし同時に投与しない場合でも、それらの作用物質は約１分〜８時間以内に投与されることが多く、約１〜４時間以内に投与されることが好ましい。同期間内に投与する場合、それらの作用物質は被検体の同じ部位に投与するのが適切である。用語「同じ部位」とは、正確な位置を含むものの、約０．５〜１５ｃｍ以内で良く、好ましくは約０．５〜５ｃｍ以内が良い。ここで用いられる用語「別々に（separately）」は、作用物質類が間隔を空けて、例えば約１日から数週間または数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。これらの活性作用物質はどの順序で投与してもよい。ここに用いられる用語「逐次的に（sequentially）」は、これら作用物質が逐次、例えば分、時間、日、または週の間隔で（またはこれらの複数の間隔で）投与されることを意味する。場合によってはこれら活性作用物質を規則的な反復サイクルで投与してもよい。
ここに用いられる用語」アネルギー（anergy）」は、免疫系による、特定の抗原または抗原群に対する反応の抑制、または反応のない状態を言う。例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球が、それらが最良の刺激条件下でそれらの特異抗原に反応できないときはアネルギーである。
用語「抗原（antigen）」は、脊椎動物、特に哺乳動物において免疫反応を誘起可能な蛋白質、ペプチド、またはその他の分子または巨大分子の全部、または一部を意味する。このような抗原類は上記の蛋白質、ペプチド、またはその他の分子または巨大分子で免疫した動物からの抗体類とも反応する。
「抗原結合分子（antigen-binding molecule）」とは、標的抗原に対して結合親和性を有する分子を意味する。この用語は免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、および抗原結合活性を有する非免疫グロブリン誘導性の蛋白質フレームワークにも拡大されることは理解されるであろう。
「自己（autologous）」は、同じ生体から誘導されるもの(例えば細胞、組織など）を意味する。
ここに用いられる用語「同種異型の（allogeneic）」は、異なる遺伝子構造である細胞、組織、生体などについて言う。
用語「同種抗原（alloantigen）」は種の幾つかのメンバーにのみ見出される、血液群抗原のような抗原を意味する。これに対して「異種抗原（xenoantigen）」は、一つの種のメンバーには存在するが他のメンバーには存在しない抗原を言う。同様に「同種移植片」は同じ種のメンバー間の移植片であり、「異種移植片」は異なる種のメンバー間の移植片である。
ここに用いられる用語「生理学的サンプル」は、ある被検体から引き出され、処理されず、または処理され、希釈され、または濃縮されるサンプルを言う。生理学的サンプルは、全血、血清、血漿、唾液、尿、汗、腹水、腹膜液、滑液、羊水、脳脊髄液、組織生検材料などのような生物学的液体を含むことができる。ある実施態様において、上記生体サンプルは滑液および、末梢血を含める血液から選択される。
「臨床的改善（Clinical improvement）」とは、Ｘ線検査を含む種々の試験によって測定して、治療の結果、ＲＡまたは関節損傷のさらなる進行が阻止され、ＲＡまたは関節損傷に何らかの改善があることを言う。このように、例えば軟化したまたは腫れた関節を評価すること、疾病活性スコア（ＤＡＳ）あるいは米国リウマチ病大学（ＡＣＲ）スコアを調べること、被検体の全体的臨床的評価、赤血球沈降速度、あるいはＣ‐反応性蛋白質レベルを評価することによって、臨床的評価改善を判定することができる。
本明細書全体を通じて、内容がその他を要求しない限り、用語「〜を含む（comprise, comprises, comprising）」は、記載されたステップまたは要素、あるいはステップまたは要素の群を含むことを意味するが、いかなるその他のステップまたは要素、あるいはステップまたは要素の群も排除するものではないことを意味するものと理解してよい。このように、用語「〜を含む」の使用は、記載された要素が必要または必須であるが、その他の要素は任意であり、存在してもしなくてもよいことを示している。「〜からなる（consisting of）」は、それに続くいかなるものをも含み、それに制限されることを意味する。こうして用語「〜からなる」は、記載された要素の群が必要または必須であり、その他の要素は存在していないことを示す。「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」は、そのフレーズ後に記載される任意の要素を含み、列挙された要素について明細書に記載された活性または作用を妨害せず、またはその活性または作用に寄与するその他の要素群に制限されることを意味する。したがってフレーズ「本質的に〜からなる」は、列挙された要素は必要または必須であるが、その他の要素は任意であり、それらが記載された要素群の活性または作用に影響を与えるかどうかによって、存在してもしなくても良いことを示す。
「〜に対応する（corresponds to, corresponding to）」は、標的抗原の或るアミノ酸配列に対する実質的類似性をあらわすアミノ酸配列をコードする抗原を意味する。概してその抗原は標的抗原の少なくとも一部に対する約３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の類似性をあらわす。
「シトルリン」および「Ｃｉｔ」は２‐アミノ‐５‐（カルバモイルアミノ）バレリン酸を言い、構造式：H2NC(O)NH(CH2)3CH(NH2)CO2Hを有するα‐アミノ酸である。
表現「有効量（effective amount）」は、ＲＡまたは関節損傷を治療または予防するのに有効な（単回量としてまたは連続投与の一部として)作用物質の量または薬剤量を言う。これは、そのような量の投与前に例えばＸ線検査またはその他の検査によって測定したベースラインに比較して、ＲＡまたは関節損傷の減少に達するのに有効な量を含む。有効量は、治療すべき個体の健康および身体条件、治療すべき個体の分類群、組成物の処方、医学的状態の評価およびその他の関連因子によって変動するであろう。その量は日常的試験によって測定できる比較的広い範囲内にあることが期待される。
ここに用いられる「遺伝子治療」は、単数あるいは複数の遺伝子を個々の細胞または細胞群(組織または器官など)にex vivoまたはin vivoで挿入し、それによって細胞または細胞群におけるその遺伝子／遺伝子類の発現が治療効果をもたらすことを言う。このような治療遺伝子は概してベクターを用いて運搬される。遺伝子治療が被検体とする細胞は、体細胞または胚細胞または細胞系である。遺伝子治療は、一つの細胞または細胞群における過剰発現または異所性発現を必要とする遺伝子をex vivoまたはin vivoで運搬するベクター類の使用を含む。ベクターは新しい遺伝子の、核への統合を容易にし、またはその遺伝子のエピソーマル発現を導き得る。
「免疫エフェクター細胞」は、抗原に結合でき、その抗原に選択的な免疫反応を仲介する細胞を言う。これらの細胞は非制限的に、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）、例えばＣＴＬライン、ＣＴＬクローン、および腫瘍、炎症、またはその他の浸潤物からのＣＴＬ類を含む。
ここで「免疫‐相互作用性」は、分子間の何らかの相互作用、反応、またはその他の形の関係性を含む。分子の一つ、またはその模造物が免疫系の一成分である場合は特にそうである。
「関節損傷」はここでは最も広い意味で用いられ、結合組織および軟骨を含む１つ以上の関節のあらゆる部分の損傷または部分的または完全な破壊を言う。この場合損傷とは任意の原因による構造的および／または機能的損傷を含み、関節の痛み／関節痛を起こすこともあり、起こさないこともある。それは、炎症性関節疾患並びに非炎症性関節疾患と関連する、またはそれらに起因する関節損傷を含めるが、これらに制限されない。この損傷は自己免疫疾患、特に関節炎、さらには特にＲＡのような任意の状態によって引き起こされ得る。同様の典型的状態には、急性および慢性関節炎、若年型ＲＡを含むＲＡ、若年特発性関節炎（ＪＩＡ）、または若年性ＲＡ（ＪＲＡ）およびリウマチ性滑膜炎、通風性関節炎、急性免疫学的関節炎、慢性炎症性関節炎、変性関節炎、ＩＩ型コラーゲン‐誘起性関節炎、感染性関節炎、敗血症性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スチルス病、脊椎関節炎、骨関節炎、慢性進行性関節炎、変形性関節炎、原発性慢性関節炎、反応性関節炎、更年期関節炎、エストロゲン欠失関節炎、および強直性脊椎炎／リウマトイド脊椎炎）、ＲＡ以外のリウマチ性自己免疫疾患、ＲＡに二次的におこる顕著な全身性関連症状(非制限的に、血管炎、肺線維症、またはフェルテイー症候群など）がある。ここにおける目的では、関節は骨格（動物のような脊椎動物の骨格）の諸要素と、それを取り巻き、支える部分との接触点であり、例えば臀部、脊柱の椎骨間の部分、脊椎と骨盤との間の関節（仙腸関節）、腱と靭帯が骨に付着している関節、肋骨と脊柱との間の関節、肩、膝、足、肘、手、指、足および足指、特に手および足の関節を含めるが、これらに制限されない。
特定の細胞によって産生される遺伝子発現物質（例えば蛋白質または転写体）の範囲内での「レベルまたは機能的活性」とは、ここでは広い意味に取るべきであり、単細胞あるいは複数の細胞／細胞集団において産生される発現生成物のレベルまたは機能的活性を含む。そこで後者の場合、このフレーズは、複数の細胞／細胞集団によって産生される蛋白質の平均レベルまたは機能的活性を含むことは理解されるであろう。
「薬剤的に容認される担体」とは、局所的または全身的投与に安全に使用できる固体、または液体フィラー、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。
用語「多発性関節炎」および」滑膜炎」は、被検体の炎症、すなわち１つ以上の関節における腫脹、圧痛、または温感覚を言う際に交換可能に用いられる用語である。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「蛋白質」は、ここでは交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマー、およびその変異体および合成類縁化合物を指す。そこで、これらの用語は、一つ以上のアミノ酸残基が、合成された非天然発生性アミノ酸であるようなアミノ酸ポリマー、例えば、対応する天然発生アミノ酸の化学的類似物にも、天然発生アミノ酸ポリマーにも使える。
ここに用いられる「防止」または「予防」は、予防的または防御的手段について言う。防止または予防を必要とする人とは、ＲＡまたは関節損傷を予防しなければならない人を含み、ある実施態様において、ＲＡまたは関節損傷にかかりやすいかも知れない例えばＲＡの家族歴がある人、またはＨＬＡ‐ＳＥおよび抗シトルリン化ペプチド抗体をもち、ＲＡのＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ２０１０基準に合わない人が含まれる。ここで、免疫寛容原性がない場合におけるＲＡまたは関節／構造の損傷の発生に比較して、ＲＡまたは関節損傷の発生が完全に防止またはスローダウンする場合、予防または防止は成功である。
「調節性リンパ球」とは、その他の細胞の反応および作用を調節または抑制し、特に、Ｂリンパ球、Ｔヘルパーおよび生来の（ＮＫＴおよびガンマ-デルタＴを含む）リンパ球のようなその他の免疫細胞類の反応および作用の調節または抑制に関するリンパ球を意味する。
ここに用いる「リウマチ性関節炎」または「ＲＡ」は、分類のために２０００年に改定されたアメリカン・リウマトイド・アソシエーション基準、または任意の同様な基準によって診断される、明確に認められる疾患を言う。この用語は以下に定義されるように、活性な早期ＲＡのみならず、初期ＲＡも含める。ＲＡの生理学的インジケータとして対称的関節腫脹がある。これはＲＡにおいて不変ではないとはいえ、特徴的である。手の近位指節間関節（ＰＩＰ）並びに中手指節関節（ＭＣＰ）、腕、肘、膝。足首、および中足指節関節（ＭＴＰ）の紡錘状腫脹が一般的に影響を受け、腫脹は容易に発見される。受動的動きの際の痛みが関節炎の最も敏感な検査である。そして炎症および構造的変形が冒された関節の運動範囲を制限することはよくある。典型的な外観上の変化はＭＣＰ関節における指の尺骨の異常、ＭＣＰおよびＰＩＰ関節の過伸長、または過屈曲、肘の屈曲、萎縮、および手根骨および足指の亜脱臼などである。ＲＡは例えば若年発症性ＲＡ、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）または若年性ＲＡ（ＪＲＡ）を含む。「活性リウマチ関節炎患者」とは、活性で、非潜伏性のＲＡ症状を有する患者である。「早期リウマチ関節炎」の人とは、４年以内、３年以内、２年以内、１年以内、６ヶ月以内に確定的ＲＡ患者であると診断される人である。ここで確定的ＲＡと診断されるのは、ＲＡ分類のための改定２０１０ アメリカン・カレッジ・オブ・リューマトロジー（ＡＣＲ）／ヨーロピアン・リーグ・アゲインスト・リューマチズム（ＥＵＬＡＲ）基準（Aletanaら,2010 Arthritis & Rheumatism 62(9);2569-2581、参照により全体を本明細書に組み込む）によって、その被検体の臨床的パラメータが６／１０以上のスコアとなる場合である。「初期ＲＡ」の患者は、確定的ＲＡの診断のためのＡＣＲ／ＥＵＬＡ基準を完全には満たさない（例えばスコア６／１０未満）、早期多発性関節炎（滑膜炎）を示す。特定の実施例において、多発性関節炎は、抗‐環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）抗体およびＳＥ＋のよううなＲＡ特異的予後バイオマーカーの存在と関連している。
ここで用いられる「共通エピトープ」または「ＳＥ」または「リウマトイドエピトープ」は、ＲＡ素因における対立遺伝子ＨＬＡ‐ＤＲＢ１*０４０１、*０４０４／０４０８、*０４０５、*０４０９、*０４１０、*０４１３、*０４１６、*０１０１、*０１０２、*０１０４、*１００１、*１４０２、および*１４０６によってコードされるＨＬＡ‐ＤＲＢ１鎖の第三高可変領域の残基７０‐７４の配列モチーフを意味する。詳細に言うならば、これらの配列モチーフは、主要組織適合性複合体クラスＩＩ分子のＨＬＡ‐ＤＲＢ１鎖のアミノ酸残基７０‐７４を取り巻く第三高可変領域の配列ＱＫＲＡＡ（配列ＩＤ番号：４６）またはＱＲＲＡＡ（配列ＩＤ番号：４７）またはＲＲＲＡＡ（配列ＩＤ番号：４８）をコードするアミノ酸によって特徴づけられる。ＤＮＡタイピングは与えられた座における対立遺伝子を検査するため、その座の名称（アスタリスクにより分けられた２項による表記）は上記特異的対立遺伝子の設計に先行して決められる。例えばＨＬＡ‐ＤＲＢ１*０４０１は、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１座の０４０１対立遺伝子を言う。一つの特定のＨＬＡ‐ＤＲ特異性は、ＨＬＡ‐ＤＲＡ１座の生成物と関連する数種のＨＬＡ‐ＤＲＢ１対立遺伝子によってコードされる。例えば１１以上の対立遺伝子（ＨＬＡ‐ＤＲＢ１*０４０１〜*０４１１）がＨＬＡ‐ＤＲ４特異性のＢ鎖をコードできる。ここにおける目的のために、アグリカン特異的免疫寛容原性治療によるＲＡ治療に対する反応を、ヘテロ接合またはホモ接合であるＳＥの対立遺伝子をもった患者におけるこの遺伝的バイオマーカの発生または存在と肯定的に関連づけることができる。
ここでは交換可能に用いられる用語「被検体（subject）」、「患者（patient）」「個体（individual）」は、治療または予防するのに好ましい脊椎動物、特に哺乳動物である。本発明の範囲内に入る適した脊椎動物は、非制限的に、ヒト並びに非ヒト霊長類、齧歯動物（マウス、ラット、モルモットなど）、ウサギ目（ウサギ、野ウサギなど）、ウシ属(家畜など)、羊類（ヒツジなど）ヤギ類（ヤギなど）、ブタ類（ブタなど）、ウマ科（ウマなど）、イヌ科（イヌ）など、ネコ科（ネコなど）、鳥類（にわとり、七面鳥、アヒル、ガチョウ、カナリヤ、セキセイインコなどのコンパニオン‐バード）、海洋哺乳類（イルカ、クジラなど）、爬虫類（ヘビ、カエル、トカゲなど）、および魚類を含む脊索動物亜門のいかなるメンバーをも含む。特定の実施態様において、「被検体」、「患者」または「個体」は、早期ＲＡを有する被検体、またはＲＡ発生リスクのある被検体（例えば早期ＲＡ）を含む、関節損傷の治療および予防を必要とする人である。特定の実施態様において、用語「被検体」「患者」または「個体」は、ＲＡまたは関節損傷の一つ以上の徴候、症状、またはその他の診断を現在経験しているかまたは以前に経験した、あるいはＲＡまたは関節損傷のリスクにある、治療に適した患者を含む任意の個人を言う。ここでは例えば、新たに／以前に診断された、あるいは現在、再発／ぶり返しを経験したなどの原因は問わない。疾患の徴候を何ら示さずに臨床研究試験の対象となった人々、疫学的研究の対象となった人々、あるいは一度は管理対象として扱われた人々は全て「被検体」、「患者」あるいは「個体」として含まれる。「被検体」、「患者」、「個体」はこれまでにＲＡまたは関節損傷に対する薬治療を受けていても受けていなくても良い。
「抑制（suppression, suppressing）」は、抗原または抗原群に対するＢリンパ球およびＴリンパ球免疫反応を含む免疫反応の弱化または調節を意味する。幾つかの実施態様において、上記弱化は少なくとも一部はサプレッサーＴリンパ球によって仲介される（例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔリンパ球）。
ここで使用される用語「界面活性剤」は、好ましくは不混和性の２つの相の界面、例えば水と有機ポリマー溶液との界面、水／空気の界面、または有機溶媒／空気などの界面に吸着する任意の作用物質を言う。界面活性剤は概して親水部と親油部を有し、ミクロ粒子に吸着する際、同種の被覆粒子を引きつけない部分を外側に向ける傾向があり、それにより粒子が凝集されにくくなる。また、界面活性剤は治療／診断に用いる薬剤の吸収を促進し、その作用物質のバイオアベイラビリティーを高める。
ここに用いる「界面活性剤と結合している」粒子とは、少なくともその粒子の表面に界面活性剤を有する粒子である。その界面活性剤は、粒子形成中にその粒子全体あるいは表面に結合してもよいし、粒子形成後にその粒子に結合してもよい。その界面活性剤は粒子表面に対し、吸着、イオン結合、あるいは共有結合により結合してもよいし、周囲の基質により物理的に補足されてもよい。界面活性剤は例えば高分子ミクロスフェアのような調節された放出粒子に結合させることもできる。
ＲＡまたは関節損傷の「症状」は、被検体が経験する何らかの病的現象、または正常な構造、機能、または感覚からの乖離、そして上記のような軟化または腫脹した関節を含むＲＡおよび関節損傷を示すものである。
「全体的に改変されたシャープスコア（Total modified Sharp score）」は、ゲナント（1983,Am.J.Med.30:35-47）によって改変されたシャープによる方法を用いてＸ線検査を評価するためのスコアを意味する。一次評価は、スクリーニングから得られる総シャープ‐ゲナント‐スコアの変化であろう。シャープ‐ゲナント‐スコアは、侵食スコアと、手および足両方の関節スペース狭化スコアとの組み合わせである。関節損傷は、このテストスコアリングでは、基準線のスコア以下の平均変化によって測定される（患者はここに開示される免疫寛容原性組成物の最初の投与前にスクリーニング、または検査される）。
ここに用いられる用語「形質導入」または「形質導入された」は、ある細胞に外来性または外因性核酸、普通はＤＮＡを導入することに使われ、「安定的導入」および「安定的に導入された」は、外来性または外因性核酸の、形質導入された細胞のゲノムへの導入および同化を言う。用語「安定トランスダクタント（形質導入体）」は異種ＤＮＡがゲノムＤＮＡに安定的に統合された細胞を言う。反対に、「一過性形質導入」または「一過性に導入された」は、外来性または異種核酸がある細胞に導入されたが、その外来性または異種ＤＮＡは上記導入される細胞のゲノムに同化することができなかった場合の形質導入を言う。外来性または異種ＤＮＡは導入された細胞の核内で数週間存続する。この期間中に外来または異種ＤＮＡは染色体中で、内因性遺伝子の発現を取り仕切る調節性制御を受ける。用語「一過性形質導入」は、外来性または異種ＤＮＡを取り込んだが、このＤＮＡを同化することができなかった細胞について言う。
ここで被検体の処置とは、治療的処置を言う。処置を必要とする被検体としては、すでにＲＡおよび関節損傷がある被検体、並びにＲＡまたは関節損傷を防止しなければならない被検体が含まれる。その被検体はＲＡまたは関節損傷をもつ場合もあるし、処置をしなければ進行しそうなＲＡまたは関節損傷をもつ場合もあるし、あるいは被検体は無症状であるが、ＲＡの発生リスク因子をもつ場合もある（例えば陽性の家族歴がある場合、および／またはＡＣＰＡのような自己抗体、リウマチ因子、末梢血中に炎症性表現型の証拠がある場合など）。ＲＡまたは関節損傷が、その徴候、症状、および／または構造的損傷を含めて、投与前のその被検体の状態に比較して軽減されるか快復した場合、または保持されるかスローダウンしたとき、処置は成功である。さらに、関節または構造の損傷の発生を完全にまたは部分的に防止した場合も処置が成功したと言う。ここでは、ＲＡ／関節損傷／関節損傷の進行、のスローダウンまたは軽減は、ＲＡ／関節損傷の阻止、減少、または回復と同義である。
用語「野生型」および「正常な」は、天然にあらわれる種のメンバーの大部分に特徴的な表現型について、突然変異型と対照するために交換可能に用いられる。
ここに用いられるように、遺伝子名について下線を引いたり、イタリック体にしている場合、その蛋白質産物とは対照的に、下線／イタリック体を除いた名前が指す遺伝子そのものを示している。例えば、「ＡＣＡＮ」はＡＣＡＮ遺伝子（すなわちアグリカンをコードする遺伝子）を意味し、「ＡＣＡＮ」は「ＡＣＡＮ」遺伝子の転写、翻訳、および選択的スプライシングにより生成する蛋白質産物の類を示す。
２．略語
下記の略語は本出願全体に用いられる。
ａａ：アミノ酸(類)
ＡＣＡＮ：アグリカン遺伝子
ＡＣＡＮ：アグリカンポリペプチド
ＡＣＰＡ：抗シトルリン化ペプチド抗体
ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣ：アグリカン特異的抗原提示細胞
ＡＰＣ：抗原提示細胞(類)
ｃｉｔ‐ａｇｇ：シトルリン化アグリカン
ｄ：日
ＧＭ‐ＣＳＦ：顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子
ｈ：時間
ＩＬ‐２：インターロイキン２
ＩＬ‐３：インターロイキン３
ＩＬ‐６：インターロイキン６
ＩＬ‐１０：インターロイキン１０
ＩＬ‐１２：インターロイキン１２
ＩＬ‐１７：インターロイキン１７
ｋｂ：キロベース（ｓ）またはキロベースペア（ｓ）
ｋＤａ：キロダルトン（ｓ）
ｎｔ：ヌクレオチド
ｎｔｓ：ヌクレオチド類
ＰＢ：末梢血
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞類
ＲＡ：リウマチ性関節炎
ｓ：秒
ＳＥ：共通エピトープ
ＴＣＲ：Ｔ細胞レセプタ
ｔｏｌＡＰＣ：免疫寛容原性抗原提示細胞
ＴＮＦ：腫瘍壊死因子
３．発明の実施形態
本発明は一部、次のような知見に基づいている。すなわち、早期ＲＡ患者は非自己抗原またはシトルリン化アグリカン単独に対して、炎症性Ｔリンパ球反応を含むＴリンパ球反応をより生じやすく、一方長期ＲＡ患者は多数の自己抗原に対して、炎症性Ｔリンパ球反応を含むＴリンパ球反応をより生じやすい。これらの結果は、炎症性Ｔリンパ球反応を含む、シトルリン化アグリカンに対するＴリンパ球反応が、ＲＡの進行につれて起こるその他のシトルリン化自己エピトープに対するＴリンパ球の不均一な成熟に先行することを示唆する。任意の疾病持続期間をもつ患者は、その他のシトルリン化自己エピトープよりも、シトルリン化アグリカンに対して反応しやすいことも見出された。これらの知見に基づき、本発明者らは、全体的または一部、アグリカンポリペプチドに対応する抗原類およびそれらのシトルリン化型はこの病気に罹った人またはその素因のある人(初期ＲＡ患者、およびＲＡ発症リスクのある人を含む)における関節損傷のより早い治療的および／または予防的処置、好適にはその疾患においてＲＡの慢性化／衰弱化が進行する前に、上記治療的および／予防的処置を可能とすることを提起し、またシトルリン化アグリカンを治療的に適用することは、その他のシトルリン化抗原類を適用することに比べて、ＲＡ人口全体をより広くカバーできると主張している。
そこで本発明は、アグリカンポリペプチドに対する免疫反応の抗原特異的反応（ここでは「抗原特異的免疫寛容原性反応」とも言う）の抗原特異的抑制によって被検体における関節損傷を治療または予防するための方法を提供する。
３．１．アグリカン特異的免疫反応および罹患被検体
アグリカンポリペプチドは一般的にはシトルリン化（アグリカン配列中の少なくとも１つのアルギニン残基がシトルリンに変換）されている。必要の際には、シトルリン化アグリカンポリペプチドの存在は、シトルリン化アグリカンを直接検出するアッセイを用いて明確にされる。その例証的実施例は例えばGoebら(2009, Arthritis Research & Therapy 11:R38), Stenslandら(2009, Rapid Commun Mass Spectrom. 23(17):2754-2762), Hermanssonら(2010, Proteomics Clin Appl. 4(5):511-518), van Beersら(2010, Arthritis Res Ther. 12(6):R219), および De Ceuleneerら(2011, Rapid Commun Mass Spectrom. 25(11):1536-1542)に記載される質量分光分析を含み、これらはその全部が引例によりここに組み入れられる。代替的には、イムノアッセイが用いられる。これは被検体の抗原中のシトルリン残基を検出するための抗‐変形シトルリン抗体、および任意に、その被検体の抗原そのもの（シトルリン化されていてもいなくても）を検出するための抗原特異的抗体類を用いる。同様の非制限的イムノアッセイは、Tillemanら(2008, Rheumatology 47:597-604)、 Tabushiら(2008, Annals of Clinical Biochemistry 45:413-417)によって記載され、米国特許出願第２０１１／０２４４４９２号に記載されている。これらはその全体が引例によりここに組み入れられる。その他の実施例において、シトルリン化アグリカンの存在は、シトルリン化アグリカンに特異的なＡＣＰＡを検出することによって、間接的に確認できる。同様の代表的アッセイは、シトルリン化アグリカンポリペプチドに対応する１つ以上のペプチド類（ｃｉｔ‐ａｇｇ‐特異的ペプチド類）または抗原としてのシトルリン化アグリカンポリペプチドに対応する蛋白を用い、適した手段によって、サンプル中に含まれるｃｉｔ‐ａｇｇ‐ペプチドとペプチド抗原との結合を検出することによって組み立てられてもよい。ＡＣＰＡは、均質アッセイ・フォーマットによって（例えばｃｉｓ‐ａｇｇペプチドでコーテイングしたラテックス粒子の凝集によって）、不均質イムノアッセイによって(例えばｃｉｔ‐ａｇｇペプチドを固体相に直接または間接的にコーテイングし、その固体相をｃｉｓ‐ａｇｇ特異的ＡＣＰＡを含むことが知られている、または予想されているサンプルと共に、ＡＣＰＡ抗体とペプチド抗原との結合を可能とする条件の下でインキュベートし、結合したＡＣＰＡを直接または間接的に検出することに基づく）、または二重抗原‐架橋アッセイ（ここではｃｉｔ‐ａｇｇペプチドが固相側にもこのイムノアッセイの検出側にも用いられる）を用いて検出できる。同様の非制限的抗原特異的ＡＣＰＡアッセイは、例えばWegnerら(2010, supra)およびここに記載の参考文献に記載されている。これらはその全体が引例によりここに組み入れられる。
特定の実施態様において、被検体は、ここに定義されるように、早期ＲＡまたは初期ＲＡから選択されるＲＡ層別化を行うものとして定義され、同様の例証的実施例において、上記の方法はさらに、この被検体が、抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起する前に、ＲＡ層別化を有することを明らかにすることを含む。ＲＡ層別化は当業者には公知の任意の適切な臨床的パラメータを用いることによって確認される。その非制限的な例としては、１）年齢、２）性別、３）炎症のある関節の分類、４）朝のこわばりの持続時間、５）軟化した関節の数（例えば中手指節間関節）または中足指節間関節を横切る陽性圧迫）、６）腫脹した関節の数、７）関節痛、８）前回発現した症状、９）ＲＡの家族歴、１０）全身的インフルエンザ的特徴および疲労の有無、１１）手足の対称的関節異常、１２）赤血球沈降速度、１３）Ｃ‐反応性蛋白の濃度、１４）高感受性Ｃ蛋白の濃度、１５）リウマチ因子（ＲＦ）の濃度、１６）ＡＣＰＡ抗体の有無および濃度、１７）変異したシトルリン化ビメンチンに対する抗体（抗ＭＣＶ抗体）の有無および濃度、１８）ＳＥの有無、１９）Ｊ蛋白、Ｈｄｊ２（例えば滑液中）の有無および濃度、２０）リューマチ性結節、２１）Ｘ線の変化、がある。特定の実施態様においてＲＡがあるかないかは、ＲＡのための２０１０ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ分類基準を用いて評価される。これはAletahaら（2010, supra）において開示され、これを表１にまとめる。
Figure 2015512371
 記号*、†、‡、§、#、**、††、‡‡、§§は、Aletahaら (2010, supra)の文献におけるものと同じ意味を有する。
例証的実施例において、被検体が４年以内、３年以内、２年以内、６ヶ月以内に「確定的」ＲＡであると診断された場合、その被検体は早期ＲＡに罹患していることが確認される。その際その患者の評価臨床パラメータが、２０１０ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ基準によって６／１０以上のスコアであるとき、確定的ＲＡと判断される。その他の例証的実施例において、被検体が多発性関節炎（滑膜炎）を有するものの、確定的ＲＡの診断のためのＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ基準に完全には合わない場合、その被検体は初期ＲＡを有すると判断される。特定の実施例において、多発性関節炎は、ＡＣＰＡ抗体とか共通エピトープ陽性（ＳＥ＋）のようなＲＡ特異的予知的バイオマーカーの存在と関係する。早期ＲＡ患者には、多発性関節炎をもつＡＣＰＡ抗体陽性患者を含み、その時点で確定的ＲＡの診断をされていないとしても、２０１０ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ基準による確定的ＲＡに進行するリスクが高い（例えば９５％の確率）。
特定の実施態様において、被検体はＳＥ＋である。共通エピトープ陽性は、任意の適切なアッセイ、すなわちその被検体をＲＡに罹りやすくするような、腫瘍組織適合性複合体クラスII分子のＨＬＡ‐ＤＲＢ１鎖の第三高バリアブル領域の残基７０‐７４にある配列モチーフを確認するための任意の適切なアッセイを用いて試験できる。例えば、その配列モチーフはアミノ酸コーデイング配列ＱＫＲＡＡ（配列ＩＤ番号：４６）またはＱＲＲＡＡ（配列ＩＤ番号：４７）またはＲＲＲＡＡ（配列ＩＤ番号：４８）によって特徴づけられる。これらの諸配列は例えばＨＬＡ‐ＤＲＢ１*０４０１、*０４０４／０４０８、*０４０５、*０４０９、*０４１０、*０４１３、*０４１６、*０１０１、*０１０２ *０１０４、*１００１、*１４０２、および*１４０６ 対立遺伝子によってコードされている。そのアッセイは例えば当業者には公知の配列分析、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）タイピングまたはオリゴヌクレオチド・プローブ・ハイブリダイゼーション（例えば逆ハイブリダイゼーション）およびイムノアッセイを用いる遺伝子型決定（ジーンタイピング）を含むことができる。これらの実施態様において、上記方法はさらに、抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起する前にその被検体がＳＥ＋であることを確認することをさらに含む。
本発明者らは、早期ＲＡまたはＲＡ発生リスクをもつ被検体において、シトルリン化アグリカンを含むシトルリン化自己エピトープに対するＴリンパ球（例えばＣＤ４＋Ｔリンパ球）の反応が、少なくとも１、２、３種類のサイトカイン（類）の産生（分泌）を含むことも見出した。特定の実施態様において、上記サイトカイン（類）はＩＬ‐６，ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦおよびＩＬ‐１０から選択される。Ｔリンパ球反応は広く、少なくとも１、２、または３の炎症性(例えば、Ｔｈ１またはＴｈ１７)サイトカイン(類)の産生（例えば分泌）によって特徴づけられる炎症性または自己反応性Ｔリンパ球反応を含む。特定の実施態様において、炎症性サイトカイン(類)は、ＩＬ‐６、ＩＦＮ‐γ、およびＴＮＦから選択される。そこで、幾つかの実施態様においては、本発明の方法は、被検体が抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起する前に、炎症性Ｔリンパ球反応（例えば、ＩＬ‐６，ＩＦＮ‐γ、およびＴＮＦから選択される少なくとも１，２、または３種類の炎症性サイトカインの産生）を起こすことを確認することをさらに含む。しかし本発明者らは、早期ＲＡをもつ、またはＲＡ発生のリスクのある被検体が、無エピトープまたはシトルリン化アグリカンのみに対してＩＬ‐６をより産生しやすいことも見出した。したがって、これらの被検体におけるＴリンパ球反応は、実質上、ＩＬ６の産生によって特徴づけられる。よって特定の実施態様において、本発明の方法は、前記被検体が抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起する前にＩＬ‐６を産生することを確認することをさらに含む。
被検体がＴリンパ球反応を起こしつつあるかどうかを確認するために、本発明の方法は、放出されたサイトカイン類の検出または評価のためのアッセイを行うことができる。それらのサイトカインは、任意の適切な方法を用いてアッセイできる。サイトカインレベルを測定するための標準的アッセイは、非制限的に以下のような機能的活性プロトコルを含む：（ａ）インジケータ細胞系のサイトカイン誘起性増殖；（ｂ）サイトカイン誘起性アポトーシス；（ｃ）サイトカインによるウイルス感染防御；（ｄ）サイトカインによって誘起されるサイトカイン産生。このようなアッセイは熟練せる当業者にはよく知られており、例えば「Cytokine Bioasseys（サイトカイン バイオアッセイ）」（www.ebioscience.com/ebioscience/appls/BAC.htm）に見出される。これは参照によりここに組み入れられる。別法として、サイトカインレベルは、一般的サイトカイン放出アッセイ、細胞内サイトカイン分泌アッセイ、Ｙ細胞レセプタの下流のシグナル トランスダクション経路の活性化の検出および例えばサイトカインｍＲＮＡ、ＥＬＩＳＡｓ、ビードアレイまたは多重アッセイのような、Ｔ細胞反応を示す種類の蛋白類のためのｍＲＮＡのミクロアレイ検出を用いても測定できる。これらは熟練せる当業者には公知である。ＩＬ‐６、ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦｏｙｏｂｉＩＬ‐１０に関する非制限的バイオアッセイが実施例に開示されている。
本発明者らは、早期ＲＡ患者またはＲＡ発生リスクのある被検体におけるＴリンパ球反応が、少なくとも一部はＣＤ４＋ＣＤ２８−Ｔリンパ球、および／またはＣＤ４＋ＣＤ２８＋Ｔリンパ球によって産生されることも確認した。このようなＴリンパ球類は例えばフローサイトメトリー（例えば蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いる）、イムノヒストケミストリー、イムノマグネテイック分離などを含む標準的イムノアッセイを用いて機械的に検出できる。同様の非制限的イムノアッセイは実施例に開示されている。分析のためのＴリンパ球は被検体からの任意の適した生体サンプルから得ることができ、その代表的サンプルは血液（例えば末梢血）および滑膜液などである。
３．２．アグリカン特異的免疫寛容原性反応を生成するための免疫モジュレーター
抗原特異的免疫寛容原性反応は、任意の適切な戦略を用いて誘起することができ、その例証的実施例として、次のものを含む。（１）被検体において、アグリカンポリペプチド（ここでは「アグリカン特異的免疫寛容原性抗原提示細胞」あるいは「ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣ」とも呼ぶ）の一部に対応するペプチド（自己抗原）を示す免疫寛容原性抗原提示細胞の数を増やす。ここで、前記部分はアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐ａｇｇポリペプチド）に対する炎症性または自己反応性Ｔリンパ球反応と関連している。（２）被検体におけるアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐ａｇｇ‐ポリペプチド）またはその一部に対して反応する自己反応性エフェクターリンパ球にアネルギーまたはアポトーシスを誘起する。（３）調節性またはサプレッサーＴリンパ球の数を増やし、自己反応性Ｔリンパ球反応を抑制あるいは減らす。
アグリカン特異的ｔｏｌＡＰＣの生成は、抗原提示細胞（例えば樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞など）を、抗原提示細胞のＮＦ‐κＢ経路を十分阻止できる量のＮＦ‐κＢ経路インヒビターと接触させ、さらに、アグリカンポリペプチド(例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）または抗原を発現し得る核酸分子の全体または一部に相当する量の抗原から選択された、上記抗原提示細胞がそれらの表面上の抗原またはその形成を示すのに十分な量の抗原分子を接触させることにより、得られる。免疫寛容原性ＡＰＣをｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで産生するための非制限的方法は、米国特許出願公開第２００３０１５３５１８号、第２００６０１８２７２６号、第２０１００１５１０００号、およびヨーロッパ特許出願第１４６２１１１号に記載されている。その他の実施態様において、アグリカン特異的ｔｏｌＡＰＣは、抗原提示細胞を、上記のように抗原分子と共に、抗原提示細胞のｍＴＯＲまたはＳｙｋ経路を阻害するために十分な量のｍＴＯＲインヒビターまたはＳｙｋ経路インヒビターと接触させることによって作られる。
抗原提示細胞は専門的タイプおよび通性タイプの抗原提示細胞を含む。専門的抗原提示細胞は、非制限的にマクロファージ、単球、Ｂリンパ球、脊髄性系列の細胞（単球‐顆粒球‐ＤＣ前駆体、辺縁帯クッファー細胞、濾胞細胞を含む）、Ｔ細胞、ランゲルハンス細胞、および指状嵌合樹状細胞、および小胞子性樹状細胞を含む。通性抗原提示細胞の例としては、非制限的に、活性化Ｔ細胞、星状膠細胞，濾胞細胞、内皮、および線維芽細胞を含む。幾つかの実施態様において、抗原提示細胞は、単球、マクロファージ、Ｂリンパ球、脊髄系列の細胞類、樹状細胞、またはランゲルハンス細胞を含む。
３．２．１ アグリカン抗原
アグリカン抗原は、推定的全長アグリカンポリペプチド(例えば、配列ＩＤ番号：２または４、およびそのシトルリン化型）に対応するアミノ酸配列を含み、またはそれからなり、あるいは本質的にそれからなる。あるいは、その抗原は、成熟アグリカンポリペプチド(例えば、配列ＩＤ番号：３７または３９、およびそのシトルリン化型)に、または非制限的にＧ１ドメイン（例えば、配列ＩＤ番号：４１およびそのシトルリン化型）、Ｇ２ドメイン（例えば、配列ＩＤ番号：４３およびそのシトルリン化型）、Ｇ３ドメイン(例えば、配列ＩＤ番号：４３およびそのシトルリン化型）などのドメインに対応するアミノ酸配列を含み、またはそれらからなり、あるいは本質的にそれらからなる。その他の実施態様において、上記抗原は、アグリカンポリペプチド（例えば、配列ＩＤ番号：５〜３５のいずれか、およびそのシトルリン化型）のＴ細胞エピトープ（例えば自己抗原）に対応するアミノ酸配列を含み、またはそれからなり、あるいは本質的にそれからなる。特定の実施態様において、その抗原は配列ＩＤ番号：３２〜３５のいずれかを含み、またはそれからなり、あるいは本質的にそれからなる。非制限的実施例において、上記抗原はＨＬＡ ＤＲに制限され、上記被検体ではＨＬＡ ＤＲ対立遺伝子が好適に陽性である。これらの実施例において、ＨＬＡ ＤＲ結合ペプチド（例えばＨＬＡ‐ＤＲＢ結合ペプチド類）は例えばJamesら(2009, J Immunol 183:3249-3258; and 2010, Arthritis Rheum. 62(10):2909-2918), Knappら(2011, BMC Bioinformatics 12:241), Honeymanら(1997, Ann. Med. 29:401-404) and Huら(2010, Nucleic Acids Research 38:Web Server issue W474-W479)に記載された推定的アルゴリズムの使用を含む任意の適切なアプローチを用いて予想できる。
幾つかの実施態様において、上記抗原はアグリカンポリペプチドあるいはそのシトルリン化型の全体あるいは一部に対応する１つ以上のペプチドである。通常、そのようなペプチド類は、長さが少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０のアミノ酸残基であり、好適には約５００、２００、１００、８０、６０、５０、４０を超えないアミノ酸残基の長さである。２つ以上のペプチドが使用されている幾つかの実施態様において、これらペプチド類は複数の隣接するオーバーラッピングペプチド類であり、その配列は、アグリカンポリペプチドおよびそれらのシトルリン化型の少なくとも一部分だけ間隔が空いている。好適には、それらのペプチド配列はアグリカンポリペプチドに対応する配列の少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％から誘導される。幾つかの実施態様において、複数の隣接オーバーラッピングペプチド断片の各ペプチドは、３０〜９０のアミノ酸の長さであり、例えば３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７３、７５、８０、８１、８５、８６、９０のアミノ酸の長さである。種々の実施態様において、複数の隣接オーバーラッピングペプチド断片のアミノ酸配列は、約１０〜１５のアミノ酸だけ（例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５のアミノ酸だけ）オーバーラップする。好適には、それらペプチドの長さは、細胞溶解性Ｔリンパ球（長さ約８〜１０のアミノ酸のペプチド）を提示するため、あるいはＴ‐ヘルパーリンパ球（例えば長さ約１２〜２０のアミノ酸の長さのペプチド）を提示するために選択する。このようなペプチド抗原を生成する典型的な方法が、たとえばAstoriら(2000, J. Immunol. 165:3497-3505（およびここに記載の参考文献）、および米国特許出願第２００４／０２４１１７８号に記載されている。所望ならばアグリカン抗原を例えば脂質変形によって改変し、その物理化学的性質を変えることができる。アグリカンポリペプチドのほぼ全長を連結するオーバーラッピングペプチド類の非制限的な例は配列ＩＤ番号：４９〜５３１に示される。
アグリカン抗原(類)は、天然ソース（例えば被検体）から分離される。あるいは、それらは例えば次に記載される実施例の標準的プロトコルを用いて組換え型に作られる：Sambrookら, MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, 1989)、特に１６章および１７章；Ausubelら, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998)、特に１０章および１６章；Coliganら, CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997)、特に１章、５章、６章 に記載されている。代表的実施例において、アグリカン抗原(類)は（ａ）アグリカン抗原をコードするヌクレオチド配列を発現できる発現ベクターを作り（ｂ）そのベクターを適した宿主細胞に導入し（ｃ）そのベクターから組換えポリペプチドを発現させるために宿主細胞を培養し（ｄ）組換え抗原を分離する という諸段階を含む操作によって作られる。特定の実施態様において、上記アグリカン抗原(類)は、被検体が属する動物種によって作られるアグリカンポリペプチド（シトルリン化の有無は問わない）の配列に対応する。
代替的には、アグリカン抗原(類)は、Atherton and Sheppard (Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, 1989)、および Robergeら (1995, Science 269:202)に記載されたように、溶液合成または固相合成を用いて合成される。
幾つかの実施態様において、上記アグリカン抗原は少なくとも一つのシトルリン残基を含む。シトルリン化抗原は例えば、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）の作用によって、天然型、組換え型または合成型のアグリカンから得ることができるが、それらはペプチド合成によって、１つ以上のシトルリン残基を、合成されたアグリカンペプチドに直接導入することによっても作られる。これらの方法は熟練せる当業者には公知である。シトルリン化抗原を作るためのＰＡＤ酵素を用いる例証的方法は、米国特許出願公開第２０１１／００２８３９９号に記載されている。シトルリン化抗原を合成する典型的方法はPerezら, 2006. Chem Biol Drug Des 68:194-200に記載されている。
その他の実施態様において、アグリカン抗原(類)は、概ねその抗原（類)をコード化するヌクレオチド配列を操作によってプロモータに連結することによって、核酸型で提供される。そのプロモータは構成的で誘導性であり、関心とする抗原提示細胞において操作可能であって、核酸構成物を形成する。抗原提示細胞またはその前駆体への上記核酸構成物の運搬は、患者をその核酸構成物に直接さらすことによって、または最初に抗原提示細胞またはそれらの前駆体を上記核酸構成物でｉｎ ｖｉｖｏで変換し、次にその変換された抗原提示細胞または前駆体をその患者に移植することによって達せられる。
その核酸構成物は、例えば抗原提示細胞と核酸構成物との接触、エレクトロポレーション、形質転換、形質導入、結合またはトリパレンタル メーテイング（交配）、トランスフェクション、カチオン性脂質との感染膜融合、ＤＮＡ‐コーテド‐マイクロプロジェクタイルとの高速ボンバード、燐酸カルシウム‐ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、単一細胞への直接マイクロインジェクションなどを含む任意の適切な手段によって、抗原提示細胞に導入される。その他の方法も適用でき、熟練せる当業者には公知である。特定の実施態様において、核酸構成物はカチオン性脂質、例えばリポソームによって、導入される。このようなリポソームは市販されている(例えばLipofectin（登録商標）, Lipofectamine（TM）など、Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, Mdにより提供される)。
上記構成物の抗原コーデイング ヌクレオチド配列は、天然に発生する配列またはその変異体（これは組換え技術を用いて設計される）を含むことができる。変異体の一例において、抗原コーデイング ヌクレオチド配列は、関心とする抗原提示細胞における抗原の発現を高めるように最適化されたコドンである。コドン最適化のための例示的方法は、例えば米国特許第５７９５７３７号、ＷＯ第９９／０２６９４号およびＷＯ第００／４２２１５号に記載されている。
アグリカン抗原の、抗原提示細胞またはその前駆体への送達は、当業者には公知の方法によって高めることができる。例えば、抗原提示細胞、特に樹状細胞の内因性プロセッシング経路に外因性抗原を送達するために、数種の異なる戦略が開発されている。これらの方法は、ｐＨ‐感受性リポソームへの抗原の挿入（Zhou and Huang, 1994. Immunomethods 4:229-235）、可溶性抗原の飲細胞取り込み後の、ピノソームの浸透性分解（Mooreら, 1988. Cell 54:777-785）、抗原と能力のあるアジュバントとのカップリング（Aicheleら, 1990. J. Exp. Med. 171:1815-1820; Gaoら, 1991. J. Immunol. 147:3268-3273; Schulzら, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:991-993; Kuzuら, 1993. Euro. J. Immunol. 23:1397-1400; Jondalら, 1996. Immunity 5:295-302）、エキソソーム類（Zitvogelら, 1998. Nat Med. 4:594-600; 2002, Nat Rev Immunol. 2:569-79）、および、抗原のアポプトテイック細胞送達（Albertら, 1998. Nature 392:86-89; Albertら, 1998, Nature Med. 4:1321-1324; および国際公開ＷＯ第99/42564号、ＷＯ第01/85207号）を含む。組換え細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）またはトランスフェクションされた宿主哺乳動物細胞が樹状細胞（特殊抗原、またはアポプトテイック体として）に適用され、抗原を送達する。組換えキメラ状ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）も、樹状細胞系列の外因性異種抗原をＭＨＣクラスＩプロセッシング経路に送達するためのビヒクルとして使用されている（Bachmannら, 1996. Eur. J. Immunol. 26(11):2595-2600）。
あるいは、またはそれに加えて、アグリカン抗原は、サイトリシンに結合し、またはそれと関連し、その抗原の、本発明の抗原提示細胞のサイトゾルへの移動を高め、ＭＨＣクラスＩ経路に送達される。例示的サイトリシンとしてはサポニン含有‐免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ）（Cox and Coulter, 1997. Vaccine 15(3):248-256および米国特許第６３２６９７号を参照）、ホスホリパーゼ類（例えばCamilliら, 1991. J. Exp. Med. 173:751-754参照）、ポア‐フォーミング毒素類（例えばアルファ‐トキシン）、グラム陽性菌の天然サイトリシン類、例えばリステリオリシンＯ（ＬＬＯ，Mengaudら, 1988. Infect. Immun. 56:766-772 および Portnoyら, 1992. Infect. Immun. 60:2710-2717）、ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ，例えばPalmerら, 1998. Biochemistry 37(8):2378-2383）およびペルフリンゴリシンＯ（ＰＦＯ、例えばRossjohnら, Cell 89(5), 685-692）などを含める。抗原提示細胞が食胞である場合，酸活性化サイトリシンが有利に使用できる。例えばリステリオリシンは弱い酸性ｐＨでより大きいポア‐フォーミング能力をあらわし、それによって小胞（ファゴソームおよびエンドソームなど）内容物の細胞質への送達を容易にする（例えばPortnoyら, 1992. Infect. Immun. 60:2710-2717を参照）。
サイトリシンは、アグリカン抗原と共に単一の組成物として、または別々の組成物として提供され、抗原提示細胞と接触する。一実施態様において、その抗原に融合、または結合するが、その融合または結合により、その抗原が標的細胞の細胞質へ送達され得る。別の実施態様においては、そのサイトリシンおよび抗原は、運搬ビヒクル、例えば非制限的に、ウイルス、細菌、酵母から選択されるリポソームまたは細菌性運搬ビヒクルの形で提供される。運搬ビヒクルが細菌性運搬ビヒクルである場合、その運搬ビヒクルは、無毒性細菌であることが好ましい。このようなタイプ（運搬ビヒクルが無毒性細菌）の好ましい実施例としては、例えば、Portnoyらによる米国特許第６２８７５５６号があり、ここでは、細菌内にサイトリシンを発現する調節性ポリヌクレオチドに操作可能に結合した非分泌性機能的サイトリシンをコードする第一のポリヌクレオチド、および１つ以上の選択前抗原類をコードする第二のポリヌクレオチドが含まれる。非分泌性サイトリシンは、種々のメカニズムによって提供される（例えば機能的シグナル配列の欠如、分泌不能の細菌、例えば遺伝的欠陥（例えば機能的シグナル配列変異）を有する細菌、または毒のある細菌など）。種々の非ウイルス性、非病原性細菌が使用できるが、好ましい細菌としては、比較的よく特徴づけられた種、特にＭＣ４１００，ＭＣ１０６１，ＤＨ５αなどのＥ．ｃｏｌｉの実験室的菌種がある。本発明のために処理することができるその他の細菌としては、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、マイコバクテリウム、サルモネラ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのよく特徴づけられた、非ウイスル性、非病原性の菌種を含む。特定の実施態様において、細菌は衰弱し、複製不可能となり、宿主細胞ゲノムに統合されず、および／または細胞間または細胞内で不動性となる。
上記の運搬ビヒクルを用いて、被検体のビヒクルのエンドサイトーシスが可能である実質的に全ての抗原提示細胞（食細胞の、および非食細胞の抗原提示細胞を含む）に１つ以上のアグリカン抗原を運搬することができる。運搬ビヒクルが細菌である実施態様において、主題の方法は概ね、標的細胞による細菌の取り込み、およびその後の抗原提示細胞の空胞（ファゴソーム、およびエンドソームを含む）内における溶解を必要とする。
３．２．２．改変されたペプチドリガンド
幾つかの実施態様において、改変されたペプチドリガンド（ＡＰＬ）を用いてアグリカン特異的免疫寛容原性を刺激する。ＡＰＬは、好適には、アグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）の一部（例えば自己抗原）に対応するアミノ酸配列を含み、またはそれからなり、あるいは本質的にそれからなる。このポリペプチドはリウマチ性関節炎（ＲＡ）と好適に関連し、炎症性または自己反応性Ｔリンパ球上の抗原レセプタ（例えばＴ細胞レセプタ）に結合する。改変ＡＰＬアミノ酸配列は、概して少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または付加によって、アルレカンポリペプチド部分のアミノ酸配列とは区別され、好適には抗原レセプタを通る正常なシグナリングを妨害する。
ＡＰＬは、当業者には公知の任意の方法を用いて、同定された天然アグリカンペプチドエピトープに基づいて設計することができる。例えば、抗原提示細胞からＭＨＣ分子を分離し、アッセイすることを含む方法を用いて、ＭＨＣ分子に結合したペプチド類を確認することができる（Chicz and Urban, 1994. Immunol. Today 1-5:155-160）。バクテリオファージ「ファージデイスプレー」ライブラリーも作成することができる。「ファージ法」を用いて（Scott and Smith, 1990. Science 249:386-390; Cwirlaら, 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Devlinら, 1990. Science 249:404-406）、非常に大きいライブラリーを構成することができる（１０６‐１０８の化学物質）。使用できるペプチドエピトープを確認する他の方法には、主として化学的方法があり、例えばＧｅｙｓｅｎ法（Geysenら, 1986. Molecular Immunology 23:709-715; Geysenら, 1987. J. Immunologic Method 102:259-274）、およびＦｏｄｏｒらの方法（Fodorら, 1991. Science 251:767-773）がある。他には、Furkaら, 1988. 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5. Abstract FR:013; Furka, 1991. Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493がある。Ｈｏｕｇｈｔｏｎ（米国特許第４６３１２１１号）およびＲｕｔｔｅｒら（米国特許第５１０１１７５号）は、アゴニストまたはアゴニスト類として試験できるペプチドの混合物を生成する方法を記載する。使用できるその他の方法は、合成ライブラリーの使用を含む。（Needelsら, 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4; Ohlmeyerら, 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Lam ら 国際特許出願番号WO第92/00252号、この各々は引例によりここに組み入れられる）。そして同類のものが、レセプタ‐リガンドを保護するために用いられる。ｃＤＮＡサブトラクションまたは鑑別的デイスプレーに基づく方法が文献に豊富に記載され、使用することもできる（例えばHedrickら, 1984. Nature 308:149; and Lian and Pardee, 1992. Science 257:967）。発現された配列タグ（ＥＳＴ）法は、遺伝子発見のための貴重なツールである。それらはノーザンブロッテイング、ＲＮａｓｅプロテクション、および逆トランスクリプターゼ‐ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）分析などである（Alwineら, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5350; Zinnら, 1983. Cell 34:865; Veresら, 1987. Science 237:415）。使用できるその他の技術は、「ペプスカン」法である（Van der Zee, 1989. Eur. J. Immunol. 19:43-47）。ここでは数ダースのペプチドが、９６ウェルマイクロタイタープレート型上に並んだポリエチレンの棒上で同時に合成される。この型は、その上で各ピンの位置が合成歴を決める、というインデックス化されたライブラリーに似ている。その後ペプチドは固体支持体から化学的に引き剥がされ、抗原提示のために照射された同系の胸腺細胞に供給される。その後３Ｈチミジン挿入によってモニターされる増殖試験において、クローン化ＣＴＬラインの反応性が試験される。
ＷＯ第９７／３５０３５号にＳＰＨＥＲＥが記載されている。この方法はポリスチレンビーズ上で合成された組み合わせられたペプチドライブラリーを使用する。ここで、各ビードは、別々の部分のビーズから化学的に放出される特異的ペプチドの純粋な集団を含む。一緒にしたビードアレーからの放出ペプチドを、Ｔ細胞の活性を検出するための方法（例えば ｓｕｐ．３Ｈ‐チミジン挿入（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を測定）、５１Ｃｒ放出アッセイ（ＣＴＬｓのため））、またはＩＬ‐２産生（ＣＤ４＋Ｔ細胞のため）を用いてプールドアレーからの放出ペプチドをスクリーニングした。反復ペプチドプール／放出戦略を用いることによって、たった数日のうちに１０７より多いペプチドをスクリーニングすることができる。対応する陽性ビーズ（＞１００ｐｍｏｌｅｓ）上の残基ペプチドの分析は、上記エピトープ配列の速やか且つ控えめの確認を可能にする。
ＣＴＬへのアグリカンペプチド結合を確認するアッセイの簡単な概観を次に述べる。大ざっぱに言うと、ウェル１つあたり１０００個のビーズを含む１０個の９０ウェルプレートは、ビーズ１０６個を収容するであろう。１つのウェルあたり１００個のビーズを含む１０個の９６ウェルプレートはビーズ１０５個を収容する。スクリーンあたり必要なＣＴＬ細胞の数、および手作業による操作量の両方を最小にするために、溶出したペプチド類をさらにプールし、任意の所望の複雑性を有するウェルが得られる。例えば、可溶性ライブラリーを有する実験に基づくと、たった２×１０６個のＣＴＬ細胞で、９６ウェルプレートにおいて１０７個のペプチド（１００００ペプチド／ウェル）をスクリーニングすることができる。ビーズからあるパーセンテージのペプチドを引き剥がし、それらをガンマ照射し、それらをフォスターＡＰＣｓおよびクローン化ＣＴＬラインと共にインキュベートした後、３Ｈチミジンの取り込みによって確認した陽性ウェルをさらに試験した。あるいは上に指摘されたように、サイトカイン産生または細胞分解性５１Ｃｒ放出アッセイが用いられる（Coulieら, 1992. Int. J. Cancer 50:289-291）。各陽性ウェルからのビーズは分離され、各ビードからの付加的パーセンテージのペプチドを利用して、前のように個々にアッセイされる。陽性の個々のビーズはその後デコードされ、反応性アミノ酸配列が確認される。すべての陽性ビーズの分析により、被検ＣＴＬクローンを刺激する、保存的に置換されたエピトープ類の部分的プロフィールが判明する。この時点でそのペプチドは再合成され、再検査される。また、第二のライブラリー（複雑さは最小である）が、すべての保存的置換の表示で合成でき、特定のＣＴＬによって寛容された誘導体の完全なスペクトルが列挙される。複数のＣＴＬを同時にスクリーニングすることによって、対応するエピトープ類の検索が非常に容易になる。
ＣＤ８＋ＭＨＣクラスＩに制限されたＣＴＬエピトープ類の確認のために記載された方法は、ＣＤ４＋ＭＨＣクラスII制限ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ類の同定に使用できる。この場合、ＭＨＣクラスII対立遺伝子特異的ライブラリーは、ハプロタイプ特異的アンカー残基が適切な位置に現れるように合成される。ＭＨＣクラスIIアグレトピックモテイーフが、一般的対立遺伝子に確認されている（参照：例えば、Rammensee, 1995. Curr. Opin. Immunol. 7:85-96; Altuviaら, 1994. Mol. Immunol. 24:375-379; Reayら, 1994. J. Immunol. 152:3946-3957; Verreckら, 1994. Eur. J. Immunol. 24:375-379; Sinigaglia and Hammer, 1994. Curr. Opin. Immunol. 6:52-56; Rotzschke and Falk, 1994. Curr. Opin. Immunol. 6:45-51）。それらのペプチドの全長は概ね１２‐２０アミノ酸残基であり、前に記載された方法はライブラリーの複雑さを制限するために用いることができる。アグリカンＡＰＬは（例えばＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ（1989,supra）によって、またはＲｏｂｅｒｇｅ他（1995,suprs）によって記載されるように）溶液合成または固相合成を用いて合成できる。
特定の実施態様において、ＡＰＬは、次から選択される少なくとも１つの活性を有する。（ｉ）Ｔリンパ球の、アグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対する反応を中和する（ｉｉ）アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的Ｔリンパ球にアネルギーを誘起する（ｉｉｉ）アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的Ｔリンパ球にアポトーシスを誘起する（ｉｖ）アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的‐Ｔｈ２免疫反応の活性を刺激する（ｖ）炎症性サイトカイン産生の抑制を含む、アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的Ｔｈ２免疫反応の発生を抑制する（ｖｉ）アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的‐調節リンパ球（例えばＴ調節リンパ球（Ｔｒｅｇ））の活性を刺激する（ｖｉｉ）炎症性刺激による、アグリカンまたはシトルリン化アグリカン特異的抗原の活性化を防止または阻止する。
３．２．３．ＮＦ‐κＢインヒビター類
ＮＦ‐κＢインヒビターは、免疫細胞、特に抗原提示細胞中のＮＦ‐κＢのレベルまたは機能的活性を低下させる任意の分子または化合物を含む。ＮＦκＢインヒビターは種々の形をとることができる。その非制限的な例としては、小分子、核酸類、ペプチド類、ポリペプチド類、ペプチドミメテイックスなどが含まれる。
幾つかの実施態様において、ＮＦ‐κＢインヒビターはＮＦ‐κＢ経路の一メンバーのレベルおよび機能的活性を低下させる。そのメンバーは以下から好適に選択される：ＢＴＫ、ＬＹＮ、ＢＣＲ Ｉｇα、ＢＣＲ Ｉｇβ、Ｓｙｋ、Ｂｌｎｋ、ＰＬＣγ２、ＰＫＣβ、ＤＡＧ、ＣＡＲＭＡ１、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＰ３、ＡＫＴ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＣＯＴ、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫγ、ＮＩＫ、ＲｅｌＡ／ｐ６５、Ｐ１０５／ｐ５０、ｃ‐Ｒｅｌ、ＲｅｌＢ、ｐ５２、ＮＩＫ、Ｌｅｕ１３、ＣＤ８１、ＣＤ１９、ＣＤ２１とその補体と凝集カスケードにおけるそのリガンド類、ＴＲＡＦ６、ユビキチンリガーゼ、Ｔａｂ２、ＴＡＫ１、ＮＥＭＯ、ＮＯＤ２、ＲＩＰ２、Ｌｃｋ、ｆｙｎ、Ｚａｐ７０、ＬＡＴ、ＧＲＢ２、ＳＯＳ、ＣＤ３ ｚｅｔａ、Ｓｌｐ‐７６、ＧＡＤＳ、ＩＴＫ、ＰＬＣγ１、ＰＫＣθ、ＩＳＯＳ、ＣＤ２８、ＳＨＰ２、ＳＡＰ、ＳＬＡＭ、２Ｂ４）。同様の例証的実施例において、ＮＦ‐κＢインヒビターは、ＲｅｌＡ／ｐ６５、Ｐ１０５／ｐ５０、ｃ‐Ｒｅｌ、ＲｅｌＢ、ｐ５２のうちの任意の１種類以上のもののレベルまたは機能的活性を低下させる。好適には、これらの実施態様において、ＮＦ‐κＢインヒビターは上記メンバーの少なくと１つの機能または活性をブロックし、阻害し、あるいはそれらに拮抗する。その他の実施態様において、ＮＦ‐κＢインヒビターは、ＮＦ‐κＢ経路のメンバー（それはＳＨＰ１、ＳＨＩＰ、ＰＩＲ‐Ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＦｃｇＲIIＢ、ＩκＢ、Ｐ１００、ＣＴＬＡ４、ＰＤ‐１、Ｃｂ１、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ、Ｃｓｋから好適に選択される）のレベルまたは機能的活性を高める。これらの実施態様において、ＮＦ‐κＢインヒビターはそのメンバーの少なくとも１つの機能または活性を高め、刺激する。
ＮＦ‐κＢは文献に豊富に記載され、代表的実施例が下表に列挙される。
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特定の実施態様において、ＮＦ‐κＢインヒビターは、例えばＢＡＹ１１‐７０８２およびＢＡＹ１１‐７０８５（BioMol,Plymouth Meeting,PA）、クルクミンおよびクルクミン誘導体または同族体などのようなＩκＢ燐酸化のインヒビターである。多数のクルクミン誘導体および同族体が当業者には公知であり、本発明に使用できる（例えばＷＯ第２００７／０５１３１４号、ＵＳ第２００６／０２７６５３６号を参照）。そのような誘導体は可溶性または効能を高めたものであってもよい。クルクミン誘導体の例としては、ジメトキシクルクミン（Jeongら, 2009. J. Clin. Biochem. Nutr. 44:79-84）、３，５‐ビス（２‐フルオロベンジリデン）‐４‐ピペリドン（ＥＦ２４）（米国特許出願第２０１１００５９１５７号）、ビス（アリ‐ルメチリデン）アセトン（ＷＯ第２００７／０００９９８号）、デメトキシクルクミンおよびビスデメトキシクルクミン（ＷＯ第２００６／１１７０７７号）などがある。使用されるその他のクルクミン同族体としてはジヒドロクルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ジヒドロキシテトラヒドロクルクミン、ヤクチノンＡ、ヤクチノンＢなどがあり、さらにこれらの塩類、酸化体、還元体、グリコシド類、エステル類を含む（米国特許出願第２００３０１４７９号、米国特許第５８９１９２４号）。クルクミン同族体のその他の例は、非制限的に、（ａ）フェルラ酸（例えば４‐ヒドロキシ‐３‐メトキシ桂皮酸、３，４‐メチレンジオキシ桂皮酸）、３，４‐ジメトキシ桂皮酸）、（ｂ）芳香族ケトン類（例えば、４‐（４‐）ヒドロキシ‐３‐メトキシフェニル）‐３‐ブテン‐２‐オン、およびジンゲロン、４‐（３，４‐メチレンジオキシフェニル）‐２‐ブタノン、４‐（ｐ‐ヒドロキシフェニル）‐３‐ブテン‐２‐オン、４‐ヒドロキシバレロフェノン、４‐ヒドロキシベンジルラクトン、４‐ヒドロキシベンゾフェノン、１，５‐ビス（４‐ジメチルアミノフェニル）‐１，４‐ペンタジエン‐３‐オン）、（ｃ）芳香族ジケトン（例えば６‐ヒドロキシジベンゾイルメタン）（ｄ）カフェイン酸化合物（例えば３，４‐ジヒドロキシ桂皮酸、（ｅ）桂皮酸、（ｆ）芳香族カルボン酸（例えば３，４‐ジヒドロキシヒドロ桂皮酸、２‐ヒドロキシ桂皮酸、３‐ヒドロキシ桂皮酸、４‐ヒドロキシ桂皮酸）、（ｇ）芳香族ケトカルボン酸（例えば、４‐ヒドロキシフェニルピルビン酸）、（ｈ）芳香族アルコール類（例えば４‐ヒドロキシフェネチルアルコール）がある。本発明に使用できるこれらの同族体およびその他の代表的同族体は、さらにＷＯ第９５／１８６０６号およびＷＯ第０１／０４０１８８号に記載されている。その他の、二量体、デキストラン、およびデンドライマー結合体を含むクルクミン誘導体および同族体も使用できる（例えば米国特許出願第２０１００２４０９０５号、Shi, W.ら, 2007. Org. Lett. 9(26):5461-5464を参照）。
クルクミン、クルクミン誘導体または同族体は、プロドラッグのような結合物として提供することができる。クルクミン プロドラッグの例が知られており（参照：例えばLu, P.ら, 2005. J Huazhong Univ Sci Technolog Med. Sci. 25(6):668-670, 678、Kapoor, N.ら 2007. Cancer Lett. 248(2):245-250）、プロドラッグの製法が知られている（参照：例えばＷＯ第２００６／０７６７３４号、米国特許第５９５２２９４号、Balant, L. P.ら, 1990. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 15:143-153、Bundgaard, H.ら, 1991. Drugs of the Future 16:443-458）。米国特許出願公開第２００７／２７０４６４号も参照されたい。
このＮＦ‐κＢインヒビターは最小／無視し得る程度の副作用をもち、宿主に対して無毒であることが好ましい。好適には、ＮＦ‐κＢインヒビターは、ＮＦ‐κＢの代替経路を、あるいはＮＦ‐κＢの古典経路と代替経路を両方共ブロックする。
幾つかの実施態様において、ＮＦ‐κＢインヒビターは核酸の形を成すが、これは一般的に、ヌクレオチド配列を操作可能に結合することで、プロモータに対してインヒビターをコードすることにより得られる。その配列は構成的または誘導性であり、関心とする抗原提示細胞において操作可能であり、核酸構成物を形成する。核酸構成物の、抗原提示細胞またはそれらの前駆体への送達は、患者を直接、核酸構成物にさらすことによって、または最初に抗原提示細胞またはそれらの前駆体を核酸構成物で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質転換し、それから形質転換した抗原提示細胞またはその前駆体を患者に移植することによって、達成される。
抗原コーデイング核酸に関して３．２．１章で述べたように、核酸構成物を抗原提示細胞に導入し、変異体であるヌクレオチド配列を作り出すという考えは、ＮＦ‐κＢインヒビター ペプチド／ポリペプチドを発現できる核酸構成物に等しく適用される。
３．２．４．ｍＴＯＲインヒビター類
ｍＴＯＲ経路の阻害は、例えば、Delgoffe and Powell (2009. Immunology 127(4):459-465)およびFischerら(2009, Handb Exp Pharmacol. 188:215-232)に記載されているように、抗原提示細胞（例えば樹状細胞、Ｂ細胞など）の免疫寛容原性を刺激することが知られている。それに従い本発明は、ｍＴＯＲ経路のインヒビターを、全体的、部分的にアグリカンポリペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンポリペプチド）に対応する抗原から選択された抗原分子、またはその抗原を発現し得る核酸分子と共に使用して、被検体における関節損傷の治療および予防において、アグリカンポリペプチドに対する免疫反応を抑制すると考えた。
ここに用いられるｍＴＯＲインヒビター類は、免疫細胞、特に抗原提示細胞におけるｍＴＯＲのレベルまたは機能的活性を低下させる分子または化合物を含む。ｍＴＯＲインヒビターは、種々の形をとることができる。その非制限的な例としては小細胞、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似物などを含む。
幾つかの実施態様において、ｍＴＯＲインヒビターは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓによって作られるマクロライド系抗生物質であるラパマイシン、およびラパマイシン誘導体、例えば４０および／または１６および／または３２の位置が置換されたラパマイシン、あるいは例えば式（Ｉ）の化合物、から選択される。
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上記式中、Ｒ１はＣＨ３またはＣ３‐６アルキニルであり、
Ｒ２はＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、または−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３である。
Ｘが＝Ｏで、Ｒ１がＣＨ３である場合はＲ２はＨ以外である、という条件で、３‐ヒドロキシ‐２‐（ヒドロキシメチル）‐２‐メチル‐プロパノイルまたはテトラゾリル、例えばテトラゾール‐１‐イルであり、Ｘは＝Ｏ、（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。
式Ｉの化合物中のＲ２が−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨであるとき、式Ｉの化合物は生理学的に加水分解できるそのエーテル、例えば−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ１−８アルキルを含む。
式Ｉの化合物の代表的な例は、例えば４０‐Ｏ‐（２‐ヒドロキシ）エチル‐ラパマイシン（エベロリムスとしても知られる）、３２‐デオキソラパマイシン、１６‐Ｏ‐置換ラパマイシン、例えば１６‐ペント‐２‐イニロキシ‐３２‐デオキソラパマイシン、１６‐ペント‐２‐イニロキシ‐３２（ＳまたはＲ）‐ジヒドロ‐ラパマイシン、１６‐ペント‐２‐イニロキシ‐３２（ＳまたはＲ）‐ジヒドロ‐４０‐０‐（２‐ヒドロキシエチル）‐ラパマイシン、４０‐［３‐ヒドロキシ‐２‐（ヒドロキシ‐メチル）‐２‐メチルプロパノエート］‐ラパマイシン（ＣＣＩ７７９としても知られる）、４０‐エピ‐（テトラゾリル）‐ラパマイシン（ＡＢＴ５７８としても知られる）または４０‐Ｏ‐エトキシエチル‐ラパマイシン（バイオリムス９としても知られる）を含む。
ｍＴＯＲインヒビターは、いわゆるラパログ類（例えばＷＯ第９８０２４４１号、ＷＯ第０１１４３８７号およびＷＯ第０３６４３８３号（これらは引例によりそのままここに組み入れられる）に開示される）や、ＡＰ２３５７３（例えば４０‐Ｏ‐（ジメチルホスフィノイル）‐ラパマイシン）のような化合物、ＷＯ第２００５０４７２９５号の実施例１にてバイオリムスＡ９、ＴＡＦＡ‐９３の名称で開示されている化合物類を含む。その他のｍＴＯＲインヒビターは例えばＷＯ第２００４１０１５８３号，ＷＯ第９２０５１７９号、ＷＯ第９４０２１３６号、ＷＯ第９４０２３８５号、ＷＯ第９６１３２７３号に開示されており、それらは引例によりそのままここに組み入れられる。
幾つかの実施態様において、ｍＴＯＲインヒビターは式Ｉの化合物、ラパマイシンを含み、ラパログ、ＴＡＦＡ‐９３を含み、より好ましくは、ラパマイシン、式Ｉの化合物、またはラパログを含む。
特定の実施態様において、ｍＴＯＲインヒビターはＷＯ第９４０９０１０号の実施例８に開示される４０‐Ｏ‐（２‐ヒドロキシエチル）ラパマイシンである。
その他の実施態様において、ｍＴＯＲインヒビターは、ＷＯ第９６４１８０７号に開示されている３２‐デオキソラパマイシンまたは１６-ペントー２-イニロキシ‐３２（Ｓ）‐ジヒドロ‐ラパマイシン、または例えばＷＯ第９５１６６９１号に開示されているような化合物である。
例証的ｍＴＯＲインヒビターとしては以下を含む。ラパマイシン、４０‐Ｏ‐（２‐ヒドロキシエチル）‐ラパマイシン、３２‐デオキソラパマイシン、１６‐ペント‐２‐イニロキシ‐３２‐デオキソラパマイシン、１６‐ペント‐２‐イニロキシ‐３２（ＳまたはＲ）‐ジヒドロ‐ラパマイシン、１６‐ペント‐２‐イニロキシ‐３２（ＳまたはＲ）‐ジヒドロ‐４０‐Ｏ‐（２‐ヒドロキシエチル）‐ラパマイシン、４０‐［３‐ヒドロキシ‐２‐（ヒドロキシ‐メチル）‐２‐メチルプロパノエート］‐ラパマイシン（ＣＣ１７７９としても知られる）、４０‐エピ‐（テトラゾリル）‐ラパマイシン（ＡＢＴ５７８としても知られる）、ＡＰ２３５７３、バイオリムスＡ９、および／または、例えばＴＡＦＡ‐９３の名称で開示されている化合物類、例えば４０‐Ｏ‐（２‐ヒドロキシエチル）‐ラパマイシン、３２‐デオキソラパマイシン、ＣＣＩ７７９、ＡＢＴ５７８、ＡＰ２３５７３。
その他の実施態様において、ｍＴＯＲインヒビターは、非制限的に次式（II）および（III）の構造を有する化合物類を含む、ピラゾロピリミジン誘導体から選択される。
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式（II）または（III）の化合物類の幾つかの実施態様において、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、独立的に水素、ハロゲン、ＣＮ、−ＣＦ３，−ＯＨ，−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、置換／未置換アルキル、置換／未置換ヘテロアルキル、置換／未置換シクロアルキル、置換／未置換ヘテロシクロアルキル、置換／未置換アリール、または置換／未置換ヘテロアリールである。幾つかの実施態様において、Ｒ３またはＲ４の少なくとも１つは水素である。幾つかの実施態様において、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は独立的に水素、または置換／未置換のＣ１‐Ｃ１０アルキル(例えばＣ１‐Ｃ５アルキル、またはＣ１‐Ｃ３アルキル）である。Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４も独立的に水素または未置換のＣ１‐Ｃ１０アルキル(例えばＣ１‐Ｃ５アルキル、またはＣ１‐Ｃ３アルキル)である。
式（II）または式（III）の幾つかの実施態様において、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は独立的に水素、ハロゲン、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、Ｒ７を置換／未置換のアルキル、Ｒ７を置換／未置換のヘテロアルキル、Ｒ７を置換／未置換のシクロアルキル、Ｒ７を置換／未置換のヘテロシクロアルキル、Ｒ７を置換／未置換のアリール、またはＲ７を置換／未置換のヘテロアリールである。Ｒ７は独立的にオキソ、ハロゲン、−ＣＮ、ＣＦ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、Ｒ８を置換／未置換のアルキル、Ｒ８を置換／未置換のヘテロアルキル、Ｒ８を置換／未置換のシクロアルキル、Ｒ８を置換／未置換のヘテロシクロアルキル、Ｒ８を置換／未置換のアリール、またはＲ８を置換／未置換のヘテロアリールである。Ｒ８は独立的にハロゲン、オキソ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、未置換アルキル、未置換ヘテロアルキル、未置換シクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、未置換アリール、または未置換ヘテロアリールである。幾つかの実施態様において、Ｒ１は置換／未置換アルキル、または置換／未置換ヘテロシクロアルキルである(例えばモルフォリノ）。幾つかの実施態様において、Ｒ１は−Ｃ（Ｏ）Ｒ８Ａで置換され、ここでＲ８Ａは未置換アルキルである。
式IIの幾つかの実施態様において、Ｒ２は独立的に水素、ハロゲン、−ＣＮ、−ＣＦ３ＯＲ５、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、置換／未置換のアルキル、置換／未置換のヘテロアルキル、置換／未置換のシクロアルキル、置換／未置換のヘテロシクロアルキル、置換／未置換アリール、または置換／未置換のヘテロアリールである。幾つかの実施態様において、Ｒ２は独立的に水素、−ＯＲ５、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、または置換／未置換アルキルである。Ｒ５は独立的に水素、置換／未置換アルキル、置換／未置換ヘテロアルキル、置換／未置換シクロアルキル、置換／未置換ヘテロシクロアルキル、置換／未置換アリール、または置換／未置換ヘテロアリールである。幾つかの実施態様において、Ｒ５は、水素、または置換／未置換アルキル（例えば未置換Ｃ１−Ｃ５アルキル）である。
Ｒ２は独立的に、水素、ハロゲン、−ＯＲ５、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、Ｒ９を置換／未置換のアルキル、Ｒ９を置換／未置換のヘテロアルキル、Ｒ９を置換／未置換のシクロアルキル、Ｒ９を置換／未置換のヘテロシクロアルキル、Ｒ９を置換／未置換のアリール、またはＲ９を置換／未置換ヘテロアリールである。Ｒ９は独立的にハロゲン、オキソ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、Ｒ１０を置換／未置換のアルキル、Ｒ１０を置換／未置換のヘテロアルキル、Ｒ１０を置換／未置換のシクロアルキル、Ｒ１０を置換／未置換のヘテロシクロアルキル、Ｒ１０を置換／未置換のアリール、またはＲ１０を置換／未置換のヘテロアリールである。Ｒ１０は独立的にハロゲン、オキソ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、未置換アルキル、未置換ヘテロアルキル、未置換シクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、未置換アリール、または未置換ヘテロアリールである。その他の実施態様において、Ｒ２は−ＯＲ５である。幾つかの関連実施態様において、Ｒ５は水素または未置換Ｃ１−Ｃ５アルキル（例えば水素）である。
式（II）または（III）の幾つかの実施態様において、Ｒ５は独立的に水素、Ｒ１１を置換／未置換のアルキル、Ｒ１１を置換／未置換のヘテロアルキル、Ｒ１１を置換／未置換のシクロアルキル、Ｒ１１を置換／未置換のヘテロシクロアルキル、Ｒ１１を置換／未置換のアリール、またはＲ１１を置換／未置換のヘテロアリールである。Ｒ１１は独立的にハロゲン、オキソ、−ＣＮ、ＣＦ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、Ｒ１２を置換／未置換のアルキル、Ｒ１２を置換／未置換のヘテロアルキル、Ｒ１２を置換／未置換のシクロアルキル、Ｒ１２を置換／未置換のヘテロシクロアルキル、Ｒ１２を置換／未置換のアリール、またはＲ１２を置換／未置換のヘテロアリールである。Ｒ１２は独立的にハロゲン、オキソ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、未置換アルキル、未置換ヘテロアルキル、未置換シクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、未置換アリール、または未置換ヘテロアリールである。
式（III）の幾つかの実施態様において、Ｒ６は独立的に水素、ハロゲン、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＲ５、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、置換／未置換アルキル、置換／未置換ヘテロアルキル、置換／未置換シクロアルキル、置換／未置換ヘテロシクロアルキル、置換／未置換アリール、または置換／未置換ヘテロアリールである。Ｒ６も独立的に水素、−ＯＲ５、−ＣＮ、ハロゲン、または置換／未置換アルキル（例えば未置換Ｃ１−Ｃ５アルキル）である。Ｒ５は上で、式（Ｉ）の記述中に定義されている。幾つかの実施態様において、Ｒ６は独立的に水素、−ＯＲ５、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＯ２、またはＲ１３を置換／未置換のアルキル、Ｒ１３を置換／未置換のヘテロアルキル、Ｒ１３を置換／未置換のシクロアルキル、Ｒ１３を置換／未置換のヘテロシクロアルキル、Ｒ１３を置換／未置換のアリール、またはＲ１３を置換／未置換のヘテロアリールである。Ｒ１３は独立的にハロゲン、オキソ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、Ｒ１４を置換／未置換のアルキル、Ｒ１４を置換／未置換のヘテロアルキル、Ｒ１４を置換／未置換のシクロアルキル、Ｒ１４を置換／未置換のヘテロシクロアルキル、Ｒ１４を置換／未置換のアリール、またはＲ１４を置換／未置換のヘテロアリールである。Ｒ１４は独立的にハロゲン、オキソ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ２、−ＣＯＯＨ、未置換アルキル、未置換ヘテロアルキル、未置換シクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、未置換アリール、または未置換ヘテロアリールである。Ｒ６も、独立的に水素、−ＯＲ５、−ＣＮ、ハロゲン、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＮ、ＣＦ３ＮＯ２、ハロゲン、または未置換Ｃ１−Ｃ５アルキルである。幾つかの実施態様において、Ｒ６は水素である。
式（II）または（III）の幾つかの実施態様において、Ｒ３およびＲ４は水素である。式（II）の幾つかの実施態様において、ｎは１または２である。式（II）の幾つかの関連実施態様において、ｎは１である。その他の関連実施態様において、Ｒ２は−ＯＲ５で、ｎは１である。また別の関連実施態様においてＲ５は水素である。式（III）の幾つかの実施態様において、ｚは１ないし２の整数である。幾つかの実施態様において、ｚは１である。
幾つかの実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３および／またはＲ１４は、サイズが制限された置換基である。幾つかの実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３および／またはＲ１４は、Ｃ１−Ｃ１０、Ｃ１−Ｃ５アルキルまたはＣ１−Ｃ３アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルなどであり、これらはここに記載のように任意に置換されている。幾つかの実施態様においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３および／またはＲ１４は、２〜１０員の、２〜５員の、または２〜３員のヘテロアルキルで、ここに記載のように任意に置換されている。幾つかの実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３および／またはＲ１４は、Ｃ３−Ｃ１０、Ｃ３−Ｃ８、Ｃ３−Ｃ６またはＣ３−Ｃ５シクロアルキル、非制限的にシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどであり、これらはここに記載のように任意に置換されている。幾つかの実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３および／またはＲ１４は、３員の、４員の、５員の、６員の、７員の、８員の、９員の、または１０員のヘテロシクロアルキルであり、これらは非制限的にアジリジン、オキシラン、チイラン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジヒドロチオフェン、テトラヒドロチオフェン、ピペリジン、ジヒドロピラン、ジヒドロチオピラン、ジヒドロチオピラン、テトラヒドロチオピランを含み、これらはここに記載のように任意に置換されている。幾つかの実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３および／またはＲ１４は、Ｃ６〜Ｃ１０ アリールであり、これらは非制限的に、ここに記載されたように任意に置換されたフェニルまたはナフチルを含む。幾つかの実施態様において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３および／またはＲ１４はここに記載のように５〜１０員あるいは５〜６員のヘテロアリールで、これらはここに記載のように任意に置換されている。
その他の実施態様において、生物学的活性剤(例えば式（II）または（III）の化合物)は次の化合物類から選択される：
Figure 2015512371
３．２．５．Ｓｙｋインヒビター
代替的に、またはそれに加えて、抗原提示細胞(例えば樹状細胞、Ｂ細胞など）における免疫寛容原性は、Ｓｙｋ経路を阻止することによって刺激され得る。これらは例えばColonnaら(2010. J Immunol. 185(3):1532-43)、Matsubaraら(2006. Am J Respir Cell Mol Biol. 34(4):426-433)、Nakashimaら(2004. Eur J Pharmacol. 505(1-3):223-228)に記載される。こうして本発明もＳｙｋインヒビターを、全体的または部分的にアグリカンポリペプチド(例えばｃｉｔ‐アグリカン ポリペプチド)に対応する抗原、またはこの抗原を発現し得る核酸分子と組み合わせて使用し、アグリカンポリペプチドに対する免疫を抑制し、被検体の関節損傷を治療または阻止することを考えている。
ここに用いるように、Ｓｙｋ経路インヒビター類は、Ｓｙｋ経路を通るシグナルを減らし、または免疫細胞、特に抗原提示細胞のＳｙｋの機能的活性レベルを低下させるいかなる分子または化合物をも含む。Ｓｙｋインヒビターは、種々の形を取ることができ、その非制限的な例としては、小分子、核酸、ペプチド類、ポリペプチド類、ペプチド類似物、などである。
幾つかの実施態様において、Ｓｙｋインヒビターは、米国特許第６，４３２，９６３号に開示されており、これは引例によりそのままここに組み入れられる。例証的化合物は、例えばコラム３、ライン４５とコラム６、ライン２２の間に設定された定義によって包含され、特に、以下からなる群より選択される。２‐（２‐アミノエチルアミノ）‐４‐（３‐メチルアニリノ）ピリミジン‐５‐カルボキサミド、 ２‐（２‐アモミノエチルアミノ）‐４‐（３‐トリフルオロメチルアニリノ）ピリミジン‐５‐カルボキサミド‐ｅ、 ２‐（４‐アミノブチルアミノ）‐４‐（３‐トリフルオロメチルアニリノ）ピリミジン‐５‐カルボキサミド、 ２‐（２‐アミノエチルアミノ）‐４‐（３‐ブロモアニリノ）ピリミジン‐５‐カルボキサミド、 ２‐（２‐アミノエチルアミノ）‐４‐（３，５‐ジメチルアニリノ）ピリミジン‐５‐カルボキサミド、 ２‐（２‐アミノエチルアミノ）‐４‐（２‐ナフチルアミノ）ピリミジン‐５‐カルボキサミド、 ２‐（ｃｉｓ‐２‐アミノシクロヘキシルアミノ）‐４‐（３‐メチルアニリノ）ピリミジン‐５‐カルボキサミド‐ｅ、 ２‐（ｃｉｓ‐２‐アミノシクロヘキシルアミノ）‐４‐（３‐ブロモアニリノ）ピリミジン‐５‐カルボキサミド、２‐（ｃｉｓ‐２‐アミノシクロヘキシルアミノ）‐４‐（３，５‐ジクロロアニリノ）ピリミジン‐５-カルボキサミド、 および２‐（ｃｉｓ‐２‐アミノシクロヘキシルアミノ）‐４‐（３，４，５‐トリメトキシアニリノ）ピリミジン‐５‐カルボキサミド、 またはそれらの塩。このような化合物の合成法は、コラム６、ライン４３からコラム１３、ライン１７の間に記載される。
本発明に用いられるＳｙｋ インヒビターも、米国特許出願第２００４／００２９９０２号に開示されている化合物類を含み、これは引例によりここに組み入れられる。パラグラフ［０１０９］〜［０２１８］に提示された定義によって包含される化合物および特に、以下からなる群より選択される。Ｎ２，Ｎ４‐［（２，２‐ジメチル‐４Ｈ‐ベンゾ［１，４］オキサジン‐３‐オン）‐６‐イル］‐５‐フルオロ‐２，４‐ピリミ‐ジンジアミン、 Ｎ４‐（３，４‐ジクロロフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐（インダゾリン‐６‐イル）‐２，４‐ピリミジンジアミン， Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐（１‐メチル‐インダゾリン‐５‐イル）‐２，４‐ｐ‐イリミヂンジアミン、 Ｎ２，Ｎ４‐ビス（３‐ヒドロキシフェニル）‐５‐フルオロ２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ２，Ｎ４ビス（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（１，４‐ベンゾキサジン‐６‐イル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ２，Ｎ４‐ビス（３‐アミノフェニル）‐５‐フルオロ‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，４‐）エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）‐カルボニルメチル‐レネオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐５‐トリフルオロメチル‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチル‐レネオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐［（１Ｈ）‐インドール‐６‐イル］‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ２‐（３‐メチルアミノカルボニルメチレンオキシフェニル）‐Ｎ４‐［２‐Ｈ‐ピリド［３，２‐ｂ］‐１，４‐オキサジン‐３（４Ｈ）‐オン‐６‐イル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（２‐ヒドロキシエチル‐アミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ２，Ｎ４‐ビス（インドール‐６‐イル）‐５‐フルオロ‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ２‐［２‐（２‐ヒドロキシ‐１，１‐ジメチルエチルアミノ）カルボニルベンゾフラン‐５‐イル］‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ２‐［３‐（Ｎ２，３‐ ジヒドロキシプロピルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ２‐（３，５‐ジメトキシフェニル）‐Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（１，３‐オキサゾール‐５‐イル）フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）‐カルボニルメチル‐レネオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ２‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐Ｎ４‐［４‐（３‐フェニル‐１，２‐４‐オキサジアゾール‐５‐イル）メチル‐エネオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐（インダゾリン‐６‐イル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐Ｎ２‐（インダゾリン‐６‐イル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐（１‐メチル‐インダゾリン‐５‐イル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐Ｎ２‐（メチル‐インダゾリン‐５‐イル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、
Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［４‐（３‐フェニル‐１，２，４‐オキサジアゾール‐５‐イル）メチレノキシフェニル］２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，５‐ジメチル‐４‐ヒドロキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐［２‐（Ｎ‐モルフォリノ）エチレン‐エポキシ］フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，５‐ジメチル）‐４‐ヒドロキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐［２‐（Ｎ‐モルフォリノ）エチロキシ］フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３‐クロロ‐４‐ヒドロキシ‐５‐メチルフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐［２‐（Ｎ‐モルフォリノ）エチロキシ］フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ２‐（３‐ｔｅｒｔ‐ブチルカルボニルアミノフェニル）‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐５‐フルオロ‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３‐ｔｅｒｔ‐ブチルフェニル）‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐５‐フルオロ‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３‐ｔｅｒｔ‐ブチルフェニル）‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ２，３‐ジヒドロキシプロピルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐５‐フルオロ‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ２‐［３‐（Ｎ２，３‐ジヒドロキシプロピルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐イソプロピルフェニル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐［４‐（シアノメチレンオキシ）フェニル］‐５‐フルオローＮ２‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，５‐ジメチル‐４‐ヒドロキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐ピペラジノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，５‐ジメチル‐４‐ヒドロキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐［２‐（Ｎ‐ピペラジノ）エトキシ］‐フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン ビス塩化水素塩、 Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［４‐（２‐ヒドロキシエチロキシ）フェニル］‐２，‐４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（１，４‐ベンゾオキサジン‐３‐オン‐６‐イル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 （＋／−）‐５‐フルオロ‐Ｎ２-［（Ｎ‐メチルアセトアミド‐２）‐３‐フェノキシ］‐Ｎ４‐（２‐メチル‐１，４‐ベンゾキサジン‐６‐イル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ２‐（１，４‐ベンゾキサジン‐３‐オン‐６‐イル）‐５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３‐クロロ‐４‐トリフルオロメトキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシ‐４‐メチルフェニル）‐Ｎ２‐［３‐［（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシ］フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐Ｎ２‐［４‐メチル‐３‐［（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシ］フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシ‐４‐メチルフェニル）‐Ｎ２‐［３［（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシ］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３‐クロロ‐４‐メチルフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３‐クロロ‐４‐メトキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）‐カルボニルメチレンオキシ］フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐１（１Ｈ）‐インドール‐５‐イル］‐Ｎ２‐［３‐［（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシ］‐フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐Ｎ２‐［１‐（３‐ヒドロキシプロピル）インダゾリン‐６‐イル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［１‐（３‐ヒドロキシプロピル）インダゾリン‐５‐イル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐Ｎ２‐［１‐（３‐ヒドロキシプロピル）インダゾリン‐５‐イル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ２‐［１‐（３‐ヒドロキシプロピル）インダゾリン‐５‐イル］‐Ｎ４‐（４‐イソプロポキシフェニル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３，４‐エチレンジオキシフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［１‐［２（Ｎ‐メチルアミノカルボニル）エチル‐１］インダゾリン‐５‐イル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ４‐（４‐イソプロポキシフェニル）‐Ｎ２‐［１‐［２Ｎ‐メチルアミノカルボニル）エチル］‐インダゾリン‐５‐イル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐［（２，２‐ジメチル‐４Ｈ‐ベンゾ［１，４］オキサジン‐３‐オン）‐６‐イル］‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（メチル‐アミノカルボニルメチレンオキシ）フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐［（２，２‐ジメチル‐４Ｈ‐ベンゾ［１，４］オキサジン‐３‐オン）‐６‐イル］‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐（１‐メチルインダゾリン‐５‐イル）‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐［２，２‐ジフルオロ‐４Ｈ‐ベンゾ［１，４］オキサジン‐３‐オン）‐６‐イル］‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（メチルアミノカルボニルメチレンオキシ）フェニル］‐２，４‐ピリミジンヂアミン、 Ｎ４‐１（２，２‐ジメチル‐４Ｈ‐５‐ピリドール‐１，４］オキサジン‐３‐オン）‐６‐イル］‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（メチル‐アミノカルボニル‐メチレンオキシ）フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 ５‐フルオロ‐Ｎ２‐（３‐メチルアミノカルボニルメチレンオキシフェニル）‐Ｎ４‐［２Ｈ‐ピリド［３，２‐ｂ‐］‐１，４‐オキサジン‐３（４Ｈ）‐オン‐６‐イル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（４‐アミノ‐３，４‐ジヒドロ‐２Ｈ‐１‐ベンゾピラン‐６‐イル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３‐クロロ‐４‐ヒドロキシ‐５‐メチルフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐［２‐（Ｎ‐ピペラジノ）エトキシ］フェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 Ｎ４‐（３‐メチルカルボニルオキシムフェニル）‐５‐フルオロ‐Ｎ２‐［３‐（Ｎ‐メチルアミノ）カルボニルメチレンオキシフェニル］‐２，４‐ピリミジンジアミン、 またはそれらの塩。このような化合物類は、例えば米国特許出願第２００４／００２９９０２号のパラグラフ［０２１８］〜［０２６０］に記載されている方法によって合成でき、これは参照によりここに組み入れられる。
その他の実施態様において、Ｓｙｋインヒビターは米国特許出願第２０１０／０３１６６４９号に記載されている化合物類から選択され、これらは参照によってここに組み入れられる。このタイプの典型的化合物は下記の式ＩｚおよびＩｂによって表される。
式 Ｉｚによる化合物類を以下に示す：
Figure 2015512371
この式中、
Ｒ１はアリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロサイクリル、置換されたヘテロサイクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アシル、アシルアミノ、およびアシロキシから選択され、
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立的に、水素、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アシルアミノ、アシロキシ、−ＳＯアルキル、−ＳＯアリール、−ＳＯヘテロアリール、−ＳＯ２アルキル、−ＳＯ２アリール、−ＳＯ２ヘテロアリール、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アラルキル、およびヘテロアラルキルから選択され、およびここでＲ２ａまたはＲ２ｂが存在し、
Ｒ３は水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、アシル、アシルアミノ、アミノアシル、アシロキシ、オキシアシル、アミノ、置換されたアミノ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールから選択され、
Ｒ５は、水素、アルキル、および置換されたアルキルから選択され、
Ｒ６は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アシル、アシルアミノ、アシロキシ、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アラルキル、ヘテロアラルキル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロシクリル、および置換されたヘテロシクリルから選択され、
またはそれらの塩またはステレオ異性体。
式Ｉｂ による化合物類は、下に示される。
Figure 2015512371
ここで
Ｒ１は、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アシル、アシルアミノ、およびアシロキシから選択され、
Ｒ２aおよびＲ２ｂは、独立的に、水素、アルキル、置換されたアルキル、アシル、アシルアミノ、アシロキシ、−ＳＯアルキル、−ＳＯアリール、−ＳＯヘテロアリール、−ＳＯ２アルキル、−ＳＯ２アリール、−ＳＯ２ヘテロアリール、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アラルキル、およびヘテロアラルキルから選択され、およびここでＲ２ａまたはＲ２ｂが存在し、
Ｒ３は水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、アシル、アシルアミノ、アミノアシル、アシロキシ、オキシアシル、アミノ、置換されたアミノ、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、および置換されたヘテロアリールから選択され、
Ｒ４は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アミノ、または‐ＮＲ５Ｒ６から選択され、
Ｒ５は、水素、アルキル、および置換されたアルキルから選択され、
Ｒ６はアリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アシル、アシルアミノ、およびアシロキシから選択され、
またはそれらの塩またはステレオ異性体。
式Ｉｚによる化合物の例証的例は下記から選択される：３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐(２，４‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐１Ｈ‐ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン‐７‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； Ｎ‐（４‐（３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐７‐シアノ‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐フェニル）アセトアミド； Ｎ‐（４‐（３‐（３‐トリフルオロメチル）フェニルアミノ）‐７‐シアノ‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）フェニル）アセトアミド： ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（５‐メトキシ‐１Ｈ‐インドール‐３‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ‐］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（１Ｈ‐インドール‐５‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（１Ｈ‐インドール‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジクロロフェニルアミノ）‐２‐（２，４‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐１Ｈ‐ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン‐７‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（４‐フェノキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐ｅ‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐シアノフェニルアミノ）‐２‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； メチル３‐（７‐シアノ‐２‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１‐，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンゾエート； ３‐（２，４，４‐トリメチルペンタン‐２‐イルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ‐［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； Ｎ‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イル）‐２，２，‐２‐トリフルオロアセトアミド； メチル４‐（７‐シアノ‐２‐（２，４‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐１Ｈ‐ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン‐７‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１‐，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンゾエート； ３‐（３‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（２，４‐ジヒドロ‐２‐オキソー１Ｈ‐ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン‐７‐イル‐）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（２，４‐ジヒドロ‐２‐オキソ‐１Ｈ‐ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン‐７‐イル）‐６‐メチル‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐アミノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； Ｎ‐（７‐（シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イル）‐３‐フルオロ‐４‐（トルフルオロメチル）ベンザミド； Ｎ‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イル）ベンザミド； Ｎ‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イル）‐４‐フルオロベンザミド； Ｎ‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イル）‐３‐メトキシベンザミド； ３‐（３，４‐ジクロロフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐ブロモフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（６‐メトキシ‐１Ｈ‐インドール‐３‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐モルフォリノフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４，５‐トリメトキシフェニルアミノ）‐２‐（１Ｈ‐インドール‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐モルフォリノフェニルアミノ）‐２‐（１Ｈ‐インドール‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐(３，４‐ジメトキシフェニルアミノ)‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］‐ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐(３，４，５‐トリメトキシフェニルアミノ)‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］‐ピラゾール‐７‐カルボニトリル； Ｎ‐（３‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）フェニル）アセトアミド； Ｎ‐（３‐（７‐シアノ‐２‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）フェニル）アセトアミド； Ｎ‐（３‐（７‐シアノ‐２‐（３，４‐ジメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）‐フェニル）アセトアミド； Ｎ‐（３‐（７‐シアノ‐２‐（４‐（メチルチオ））フェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ‐）フェニル）アセトアミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐３‐（３‐アセトアミドフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）フェニル）アセトアミド； ３‐（３‐メトキシベンジルアミノ）‐２‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（２，４‐ジフルオロフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐）ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４‐ジフルオロフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（２，３‐ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン‐７‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； Ｎ‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イル）‐５‐フェニル‐１，３，４‐オキサジアゾール‐２‐カルボキサミド； ３‐（３，４‐ジメトキシフェネチルアミノ）‐２‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェネチルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； Ｎ‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イル）‐２‐（３‐，４‐ジメトキシフェニル）アセトアミド： ３‐（４‐モルフォリノフェニルアミノ）‐２‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（１Ｈ‐インドール‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐ブロモフェニルアミノ）‐２‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐メトキシベンジルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル： Ｎ‐（３‐（７‐シアノ‐２‐（１Ｈ‐インドール‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）フェニル）アセトアミド； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（４‐（メチルスルフォニル）フェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（２，３‐ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン‐６‐イルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（２，３‐ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン‐６‐イルアミノ）‐２‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソ‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（３‐フルオロ‐４‐メトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ２‐ブロモ‐Ｎ‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イル）アセトアミド；Ｎ‐（７‐シアノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］‐ピラゾール‐３‐イル）‐２‐フェノキシアセトアミド； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐ベンジル‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ２‐（３，４‐ジクロロフェニル）‐Ｎ‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イル）アセトアミド； ３‐（３，４，ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリフルオロフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（３‐クロロ‐４，５‐ジメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［‐１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（２，３‐ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン‐６‐イルアミノ）‐２‐（１Ｈ‐インドール‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ‐［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）フェニル）アセトアミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（６‐メトキシ‐１Ｈ‐インドール‐３‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ‐［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）フェニル）アセトアミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２（２，３‐）ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン‐７‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）フェニル）アセトアミド； ３‐（３，４‐ジフルオロフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ｔｅｒｔ‐ブチル４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）‐ベンジルカ
ルバメート； ３‐（４‐（アミノエチル）フェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； メチル３‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）‐ベンゾエート； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）フェニル）アセトアミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４‐ジメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）‐フェニル）アセトアミド； ３‐（２，３‐ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン‐６‐イルアミノ）‐２‐（３‐ヒドロキシ‐４，５‐ジメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； メチル４‐（７‐シアノ‐２‐（３‐ヒドロキシ‐４，５‐ジメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンゾエート； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）アセトアミド； ｔｅｒｔ‐ブチル‐４‐（（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾ‐１‐３‐イルアミノ）メチル）ピペリジン‐１‐カルボキシレート； ３‐（（ピペリジン‐４‐イル）メチルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐フルオロ‐４‐（４‐（ピロリジン‐１‐イル）ピペリジン‐１‐イル）フェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル： （Ｓ）‐メチル２‐（７‐シアノ‐２‐（３，４、５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）‐３‐フェニルプロパノエート； メチル３‐（２（３‐クロロ‐４，５‐ジメトキシフェニル）‐７‐シアノ‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンゾエート； メチル３‐（２‐（３‐クロロ‐４，５‐ジメトキシフェニル）‐７‐シアノ‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンゾエート； ３‐（３，４，５‐トリメトキシフェニルアミノ）‐２‐（４‐モルフォリノフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐ブロモフェニルアミノ）‐２‐（４‐モルフォリノフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ４‐（３‐（３，４，５‐トリメトキシフェニルアミノ）‐７‐シアノ‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐ベンザミド； ３‐アミノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐５‐（４‐メトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）ニコチンアミド； メチル３‐（２‐（４‐（（メトキシカルボニル）メトキシ）‐３‐メトキシフェニル）‐７‐シアノ‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンゾエート； ３‐（２，３‐ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン‐６‐イルアミノ）‐２‐（４‐（メトキシカルボニル）メトキシ）‐３‐メトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ２‐（５‐（７‐シアノ‐３‐（３‐（メトキシカルボニル）フェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐２‐メトキシフェノキシ）酢酸； ３‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１‐，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ６‐（４‐クロロフェニル）‐２‐（３，４‐ジメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐３，４‐ジメトキシベンザミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐３‐（４‐ヒドロキシフェニル）プロパンアミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐３‐（ピペリジン‐１‐イル）プロパンアミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐４‐シアノベンザミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐１‐メチルピペリジン‐４‐カルボキサミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐１Ｈ‐インドール‐３‐カルボキサミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イラミノ）ベンジル）‐１，６‐ジヒドロ‐６‐オキソピリジン‐３‐カルボキサミド； ３‐（（１‐ニコチノイルピペリジン‐４‐イル）メチルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ４‐（３‐（２，３‐ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン‐６‐イルアミノ）‐７‐シアノ‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）ベンザミド； ４‐（３‐（４‐ブロモフェニルアミノ）‐７‐シアノ‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）ベンザミド； メチル２‐（４‐（７‐シアノ‐３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐２‐メトキシフェノキシ）アセテート； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（３‐ヒドロキシ‐４，５‐ジメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ‐［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ２‐（４‐（２‐ヒドロキシエトキシ）‐３‐メトキシフェニル）‐３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐２（３、４‐ジメトキシフェニル）‐５Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ４‐（３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐７‐シアノ‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）ベンザミド）； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（４‐モルフォリノフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（３‐モルフォリノフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（３‐（シクロペンチルオキシ）‐４‐メトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（４‐（２‐ピロリジン‐イル）エトキシ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１‐，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ２‐（４‐（２‐メトキシエトキシ）‐３‐メトキシフェニル）‐３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソー２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐（トリフルオロメトキシ）フェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ‐［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐クロロ‐４‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１‐，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（３‐ヒドロキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； メチル２‐（４‐（７‐シアノ‐３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐フェノキシ）アセテート； Ｎ‐（３‐（７‐シアノ）‐３‐（３，４‐）ジメトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐フェニル）メタンスルホンアミド；Ｎ‐（３‐（７‐シアノ）‐３‐（３，４‐ジｍｒトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐フェニル）メタンスルホンアミド； ３‐（３‐（シクロペンチルオキシ）‐４‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ２‐（４‐（２‐ヒドロキシエトキシ）‐３‐メトキシフェニル）‐３‐（４‐）フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ４‐３‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐７‐シアノ‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）ベンザミド； ３‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３‐ヒドロキシ‐４，５‐ジメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３‐（シクロペンチルオキシ）‐４‐メトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐フルオロ‐３‐メチルフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐フルオロ‐４‐メチルフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ２‐（４‐（２‐メトキシエトキシ）‐３‐メトキシフェニル）‐３‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； メチル２‐（４‐（７‐シアノ‐３‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐２‐メトキシフェノキシ）アセテート； ２‐（４‐（２‐モルフォリノエトキシ）フェニル）‐３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ２‐（５‐（７‐シアノ‐３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐２‐メトキシフェノキシ）アセトアミド； ３‐（３‐イソプロポキシ‐４‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐）トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐フルオロ‐４‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐（シクロペンチルオキシ）‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐（２‐（ピロリジン‐１‐イル）エトキシ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐
（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐フルオロ‐３‐（トリフルオロメチル）フェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐（トリフルオロメトキシ）フェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾー［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐クロロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（４‐フルオロ‐３‐イソプロポキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐フルオロ‐４‐（ピロリジン‐１‐イル）フェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ２‐（４‐（７‐シアノ‐３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐２‐メトキシフェノキシ）アセトアミド； ３‐（３，４‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（４‐メトキシ‐３，５‐ジメチルフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，４‐ジヒドロ‐３‐オキソ‐２Ｈ‐ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン‐６‐イルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ２‐（５‐（７‐シアノ‐３‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐２‐メトキシフェノキシ）アセトアミド； ２‐（４‐（７‐シアノ‐３‐（４‐フルオロ‐３‐メトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐２‐メトキシフェノキシ）アセトアミド； ２‐（４‐（７‐シアノ‐３‐（３，４‐（ジメトキシフェニルアミノ）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐２‐イル）‐２‐メトキシフェノキシ）‐Ｎ‐シクロプロピルアセトアミド； ３‐（３‐クロロ‐４‐イソプロポキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，５‐ジメトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］‐ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３，５‐ジフルオロ‐４‐メトキシフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐エトキシ‐４‐フルオロフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； ３‐（３‐（シクロペンチルオキシ）‐４‐フルオロフェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル； Ｎ‐（３‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）ニコチンアミド； Ｎ‐（３‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）ピコリンアミド； Ｎ‐（３‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）イソニコチンアミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）ピコリンアミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）イソニコチンアミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐６‐シアノピリジン‐３‐カルボキサミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐２‐メチルピリジン‐３‐カルボキサミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐２‐メトキシピリジン‐３‐カルボキサミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐６‐メチルピリジン‐３‐カルボキサミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐４‐（トリフルオロメチル）ピリジン‐３‐カルボキサミド； Ｎ‐（４‐（７‐シアノ‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミダゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐３‐イルアミノ）ベンジル）‐６‐（トリフルオロメチル）ピリジン‐３‐カルボキサミド； および３‐（３‐フルオロ‐４‐（メチルチオ）フェニルアミノ）‐２‐（３，４，５‐トリメトキシフェニル）‐１Ｈ‐イミド‐アゾ［１，２‐ｂ］ピラゾール‐７‐カルボニトリル。
また別の実施態様において、Ｓｙｋインヒビターは、例えば米国特許出願第２０１１／０２４５２０５号に開示されているように、アミノピリジン化合物類から選択してもよく、これは引例としてここにそのまま組み入れられる。このタイプの非制限的インヒビター化合物は、式（ＩＶ）またはその薬学的に許容される塩によって表される。
Figure 2015512371
この式において、
Ｒ１は、以下の（ａ）〜（ｐ）より選択される。（ａ）水素 （ｂ）ハロゲン （ｃ）ＣＮ （ｄ）ＯＲａ、Ｃ３−６シクロアルキル、ハロゲンから独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたＣ１−６アルキル （ｅ）ＯＣ１−６アルキルで任意に置換されたＣ２−６アルケニル （ｆ）Ｃ２−６アルキニル （ｇ）Ｃ３−６シクロアルキル （ｈ）ＯＨ （ｉ）以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換された−Ｏ−Ｃ１−６アルキル：｛（ｉ）アリール（ｉｉ）Ｃ１−６アルキルから独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換された５員もしくは６員のヘテロアリール（ｉｉｉ）オキソ、ハロゲン、Ｃ１−６アルキルから独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換された４〜８員のヘテロシクリル（ｉｖ）−ＣＯ２Ｒａ（ｖ）−ＣＯＮＲｂＲｃ（ｖｉ）−ＮＲｂＲｃ（ｖｉｉ）−ＯＲａ｝ （ｊ）−Ａ−Ｘ（ここでＡは結合あるいはＯであり、Ｘは以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される：｛（ｉ）ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、−Ｃ１−６ハロアルキル、−Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、ＣＯＲａ、ＣＯ２Ｒａから独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換された４〜８員のヘテロシクリル（ｉｉ）Ｃ１−６アルキル、−ＯＲａ、−ＣＯ２Ｒａ、−ＮＲｂＲｃから独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたＣ３−６シクロアルキル（ｉｉｉ）ＯＲａで任意に置換されたベンジルで任意に置換されたヘテロアリール｝） （ｋ）Ｏ−ＣＨ２Ｃ．ｉｄｅｎｔ．Ｃ‐ピリミジニル （ｌ）−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｃ１−６アルキル （ｍ）−ＣＯＲａ （ｎ）−ＣＯ２Ｒａ （ｏ）−ＣＯＮＲｂＲｃ （ｐ）−ＮＲｂＲｃ。
Ｒ２は、以下の（ａ）〜（ｆ）より選択される：（ａ）Ｈ （ｂ）ハロゲン （ｃ）Ｃ１−６アルキル （ｄ）Ｏ−Ｃ１−６アルキル （ｅ）Ｃ１−６ハロアルキル （ｆ）Ｏ−Ｃ１−６ハロアルキル。もしくは、Ｒ１とＲ２の隣合う炭素原子は、合わせて（ＣＨ２）３‐４の構造を示す。
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、ＯＲａ、またはＣ１−４アリルである。
Ｒ４は、以下（ａ）〜（ｌ）より選択される。（ａ）Ｈ （ｂ）ハロゲン （ｃ）｛（ｉ）ハロゲン（ｉｉ）ＯＲａ（ｉｉｉ）ＯＣ（Ｏ）Ｒａ（ｉｖ）ＮＲｂＲｃ（ｖ）ＮＨＣ（Ｏ）Ｒａ（ｖｉ）ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲｂ｝から独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたＣ１−６アルキル （ｄ）Ｃ２−６アルケニル （ｅ）Ｃ２−６アルキニル （ｆ）Ｃ３−６シクロアルキル （ｇ）ＯＲａ （ｈ）ＮＯ２ （ｉ）ＮＲｂＲｃ （ｊ）ＮＨＣ（Ｏ）Ｒａ （ｋ）ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲｂ （ｌ）ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ。
Ｒ５は、以下の（ａ）〜（ｈ）より選択される。（ａ）Ｈ （ｂ）ハロゲン （ｃ）Ｃ１−８アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル（それぞれＲｙから独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換される） （ｄ）Ｃ３−１２炭素環あるいは炭素が連結した３〜１２員のヘテロシクリル（それぞれＲｚから独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換される） （ｅ）（一つ以上のＯＨ、ＣＮ、あるいはヘテロ環で任意に置換された）Ｃ１−３アルキルで任意に置換されたヘテロアリール （ｆ）−Ｃ（Ｏ）Ｒａ （ｇ）−Ｃ（Ｏ）２Ｒａ （ｈ）−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ。
Ｒ５（ｉ）は、ＨおよびＣ１−３アルキルから選択される。
Ｒａは、以下の（ａ）〜（ｇ）より選択される。（ａ）Ｈ （ｂ）以下の（ｉ）〜（ｘｉｖ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたＣ１−６アルキル：｛（ｉ）ハロゲン （ｉｉ）ＣＮ （ｉｉｉ）ＯＨ （ｉｖ）ＯＣ１−４アルキル （ｖ）オキソで任意に置換されたヘテロシクリル （ｖｉ）ＯＨで任意に置換されたＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル （ｖｉｉ）ＣＯ２Ｈ （ｖｉｉｉ）ＣＯ２Ｃ１−６アルキル （ｉｘ）ＣＯＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ） （ｘ）ＳＯ２Ｃ１−６アルキル （ｘｉ）−ＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ） （ｘｉｉ）ＮＲｂ（ｉ）Ｃ（Ｏ）ＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ） （ｘｉｉｉ）フェニル （ｘｉｖ）ＯＨで任意に置換されたヘテロアリール｝ （ｃ）Ｃ２−６アルケニル （ｄ）以下の（ｉ）〜（ｉｖ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたＣ３−６シクロアルキル：｛（ｉ）ＯＨ （ｉｉ）ＣＯ２Ｈ （ｉｉｉ）ＣＯ２Ｃ１−６アルキル （ｉｖ）ＣＯＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ）｝ （ｅ）以下の（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたフェニル：｛（ｉ）Ｃ２−６アルキニル （ｉｉ）ＣＮ （ｉｉｉ）ハロゲン （ｉｖ）ＯＨ （ｖｉ）ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−６アルキル （ｖｉｉ）ＣＯ２Ｈ （ｖｉｉｉ）ＣＯ２Ｃ１−６アルキル｝ （ｆ）｛Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキル、（ＣＨ２）１−８ＣＯ２Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＣＯ２Ｈで任意に置換されたフェニール｝から独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたヘテロアリール （ｇ）オキソで任意に置換されたヘテロシクリル。
ＲｂとＲｃは以下の（ａ）〜（ｇ）より独立的に選択される。（ａ）Ｈ （ｂ）以下の（ｉ）〜（ｘｖ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたＣ１−６アルキル：｛（ｉ）ＯＲａ （ｉｉ）ハロゲン （ｉｉｉ）オキソ、ＯＨ、（ＯＨで任意に置換された）Ｃ１−６アルキルで任意に置換されたヘテロシクリル （ｉｖ）［Ｃ１−４アルキル、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ）、ＣＯ２Ｒａ］から選択される１〜２個の基で任意に置換されたＣ３−６シクロアルキル （ｖ）ＯＨ、ＣＯ２Ｈで任意に置換されたＣ１−６で任意に置換されたヘテロアリール、もしくはヘテロアリールで任意に置換されたヘテロアリール （ｖｉ）ＳＯ２ＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ） （ｖｉｉ）ＳＯ２Ｃ１−４アルキル （ｖｉｉｉ）ＣＯＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ） （ｉｘ）ＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ） （ｘ）ＣＯ２Ｒａ （ｘｉ）［ハロゲン、ＯＲａ、（ハロゲン、オキソで任意に置換されたヘテロ環、ＯＲａで任意に置換された）Ｃ１−６アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＣＨ２ＯＨで任意に置換されたヘテロアリール］から独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたアリール （ｘｉｉ）ＳＯ３Ｈ （ｘｉｉｉ）ＮＲｂ（ｉ）ＣＯＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ） （ｘｉｖ）ＣＮ （ｘｖ）ＮＨＣ（Ｏ）Ｒａ｝ （ｃ）Ｆで任意に置換されたＣ３−６アルケニル （ｄ）以下の（ｉ）〜（ｖ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換され、ベンゼン環と任意に融合したＣ３−６シクロアルキル：｛（ｉ）Ｃ１−４アルキル （ｉｉ）ＯＲａ （ｉｉｉ）ＣＨ２ＯＨ （ｉｖ）ＣＯ２Ｒａ （ｖ）ＣＯＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ）｝ （ｅ）以下の（ｉ）〜（ｖ）より独立的に選択された１〜２個の基で任意に置換されたアリール：｛（ｉ）ＯＲａで任意に置換されたＣ１−６アルキル （ｉｉ）ＣＮ （ｉｉｉ）ＯＲａ （ｉｖ）ハロゲン （ｖ）ＯＣＯＣ１−４アルキル｝ （ｆ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたヘテロアリール：｛（ｉ）ＯＲａ （ｉｉ）ＣＯ２Ｒａ （ｉｉｉ）ＯＨで任意に置換されたＣ１−６アルキル｝ （ｇ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたヘテロシクリル：｛（ｉ）オキソ （ｉｉ）ＯＨ （ｉｉｉ）Ｃ１−６アルキル｝。
ＲｂとＲｃ、およびそれらが結合する窒素原子は、合わせて５、６、７員のヘテロ環を形成し、ヘテロ環にはさらに、Ｏ、Ｐ（Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎ、Ｎ−Ｒｘから選択されるヘテロ原子が０または１個含まれる。また、ヘテロ環は以下の（ａ）〜（ｊ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換される。（ａ）オキソ （ｂ）チオキソ （ｃ）以下の（ｉ）〜（ｖ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたＣ１−６アルキル：｛（ｉ）ＯＲａ （ｉｉ）ＣＯ２Ｒａ （ｉｉｉ）ＯＰ（Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）２ （ｉｖ）アリール （ｖ）ハロゲン｝ （ｄ）ＯＲａ （ｅ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ （ｆ）Ｃ（Ｏ）２Ｒａ （ｇ）ＣＯＮＲｂ（ｉ）Ｒｃ（ｉ） （ｈ）Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２ （ｉ）ＳＯ２Ｒａ （ｊ）ＣＮ。また、ＲｂとＲｃ、およびそられが結合する窒素原子は、合わせて以下の化合物を形成する。
Figure 2015512371
Ｒｂ（ｉ）とＲｃ（ｉ）は以下の（ａ）、（ｂ）より独立的に選択される。（ａ）Ｈ （ｂ）ＯＨ、ＣＯ２Ｈで任意に置換されたＣ１−６アルキル、またはＣＯ２Ｃ１−６アルキル。
Ｒｂ（ｉ）とＲｃ（ｉ）、およびそれらが結合する窒素原子は、合わせて５または６員のヘテロ環を形成し、ヘテロ環にはさらに、Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒｘから選択されるヘテロ原子が０または１個含まれる。また、オキソから独立的に選択される一つ以上の基で任意に置換される。
Ｒｕは、以下の（ａ）〜（ｅ）から選択される。（ａ）｛ハロゲン、ＯＨ、ＳＯ２Ｒａ、ＣＯＮＲｂＲｃ、ＮＲｂＲｃ、フェニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール｝から選択される１〜３個の基により任意で置換されるＣ１−６アルキル （ｂ）｛ＯＨ、ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＨ２｝で任意に置換されるＣ３−８シクロアルキル （ｃ）オキソで任意に置換されるヘテロ環 （ｄ）｛Ｃ２−６アルキニル、ＣＮ、ハロゲン、ＯＲａ｝で任意に置換されるアリール （ｅ）ＯＨで任意に置換されるヘテロアリール。
Ｒｘは、以下の（ａ）〜（ｊ）から選択される。（ａ）Ｈ （ｂ）ヘテロ環で任意に置換されるＣ１−６アルキル （ｃ）ＯＨまたはＯＣ１−４アルキルで任意に置換されるフェニル （ｄ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル （ｅ）−Ｃ（Ｏ）２−Ｃ１−６アルキル （ｆ）−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２ （ｇ）−Ｃ（Ｏ）２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）２ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２ （ｈ）ハロゲンで任意に置換された−ＳＯ２-Ｃ１−６アルキル、アルキルで任意に置換された−ＳＯ２ヘテロアリール （ｉ）−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−Ｃ１−６アルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２ （ｊ）−ＳＯ２ＮＨＣ（Ｏ）２−Ｃ１−６アルキル。
Ｒｙは、以下の（ａ）〜（ｚ）、および（ａａ）から選択される。（ａ）以下の（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたアリール：｛（ｉ）ハロゲン （ｉｉ）ＯＨまたはＣＯ２Ｒａで任意に置換されたＣ１−６アリル （ｉｉｉ）ＣＯ２Ｒaで任意に置換されたＣ２−６アルケニル （ｉｖ）ＣＯ２Ｒａで任意に置換されたフェニル （ｖ）ＣＯＲａ （ｖｉ）ＣＯ２Ｒａ （ｖｉｉ）ＣＯＮＲｂＲｃ （ｖｉｉｉ）ＯＲａ （ｉｘ）Ｓ（Ｏ）ｎＲａ （ｘ） ＳＯ２ＮＲｂＲｃ （ｘｉ）ＳＯ２ＮＨＣ（Ｏ）Ｒａ （ｘｉｉ）ＮＯ２ （ｘｉｉｉ）ＮＨＣ（Ｏ）Ｒａ｝ （ｂ）以下の（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたヘテロアリール：｛（ｉ）ハロゲン （ｉｉ）ＣＯ２Ｒａで任意に置換されたＣ１−６アルキル （ｉｉｉ）Ｃ３−６シクロアルキル （ｉｖ）ＣＯ２Ｒａで任意に置換されたアリール （ｖ）ＣＯＮＲｂＲｃ （ｖｉ）ＯＲａ （ｖｉｉ）ＳＯ２Ｒａ （ｖｉｉｉ）ＣＯ２Ｒａ （ｃ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）より独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたＣ３−８シクロアルキル：｛（ｉ）Ｃ１−６アルキル （ｉｉ）ＣＯ２Ｒａ （ｉｉｉ）ＮＲｂＲｃ｝ （ｄ）ＣＯ２Ｒａで任意に置換されたＣ６−８シクロアルケニル （ｅ）ハロゲン （ｆ）ＣＮ （ｇ）−Ｃ（Ｏ）Ｒａ （ｈ）−Ｃ（Ｏ）２Ｒａ （ｉ） Ｃ（Ｏ）ＣＯ２Ｒａ （ｊ）−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ （ｋ）−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ （ｌ）−ＯＲａ （ｍ）−ＯＣ（Ｏ）Ｒａ （ｎ）−ＮＲｂＲｃ （ｏ）−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｕ （ｐ）−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ （ｑ）−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２ （ｒ）−ＮＨＳＯ．ｓｕｂ．ｍＲａ （ｓ）−ＮＨＳＯ２ＮＲｂＲｃ （ｔ）ＳＯｎＲａ （ｕ）−ＳＯ２ＮＲｂＲｃ （ｖ）−ＳＯ２ＮＨＣ（Ｏ）Ｒａ （ｗ）−ＳＯ２ＮＨＣ（Ｏ）２Ｒａ （ｘ）ＳＯ３Ｈ （ｙ）−Ｐ（Ｏ）（ＯＲａ）２ （ｚ）ＣＯＮＨＯＨ （ａａ）オキソ、チオキソ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯ２Ｒａより独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたヘテロシクリル。
Ｒｚは、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される。（ａ）Ｒｙから選択される基 （ｂ）ハロゲン、ＮＲｂＲｃ、ＯＲａ、ＣＮ、（Ｃ１−６アルカン酸により任意に置換された）フェニル、ＣＯＮＲｂＲｃ、−ＣＯ２Ｒａより独立的に選択された一つ以上の基で任意に置換されたＣ１−６アルキル （ｃ）オキソ （ｄ）ＮＯＲａ。
上記において、ｍは１または２、ｎは０、１、または２である。
式ＩＶの代表的な化合物は、非制限的に以下を含む：
（１Ｒ，４Ｓ）‐４‐［５‐（３‐シクロプロピル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチルシクロヘキサンカルボン酸； （１Ｓ，４Ｒ）‐４‐［５‐（３‐シクロプロピル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチルシクロヘキサンカルボン酸； （１Ｓ，４Ｒ）‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチル‐４‐｛５‐［３‐メチル‐５‐（４‐メチル‐ピリミジン‐２‐イルアミノ）‐フェニル］‐１，３‐チアゾール‐２‐イル｝‐シクロヘキサンカルボン酸； （１Ｓ，４Ｒ）‐４‐［５‐（３‐｛［４‐（ジフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝‐５‐メチルフェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチルシクロヘキサンカルボン酸； ｔｒａｎｓ‐４‐ヒドロキシ‐４‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］シクロヘキサンカルボン酸； ｃｉｓ‐４‐ヒドロキシ‐４‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝‐フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］シクロヘキサンカルボン酸； ５‐ヒドロキシ‐５‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］アゼパン‐２‐オン； ｃｉｓ‐４‐［（ヒドロキシアセチル）アミノ］‐１‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］シクロヘキサンカルボキサミド； （１Ｓ，４Ｒ）‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチル‐４‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］‐Ｎ‐［３‐（２‐オキソピロリジン‐１‐イル）プロピル］シクロヘキサンカルボキサミド； （１Ｓ，４Ｒ）‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチル‐４‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝‐フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］シクロヘキサンカルボン酸； （１Ｒ，４８）‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチル‐４‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝‐フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］シクロヘキサンカルボン酸； （１Ｓ，４Ｓ）‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチル‐４‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝‐フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］シクロヘキサンカルボン酸； （１Ｒ，４Ｒ）‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチル‐４‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝‐フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］シクロヘキサンカルボン酸； （１ＲＡＳ）‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチル‐４‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］シクロヘキサンカルボキサミド； （１Ｓ，４Ｒ）‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチル‐４‐［５‐（３‐メチル‐５‐｛［４‐（トリフルオロメチル）ピリミジン‐２‐イル］アミノ｝フェニル）‐１，３‐チアゾール‐２‐イル］シクロヘキサンカルボキサミド； （１Ｓ，４Ｒ）‐４‐｛５‐［３‐（｛４‐［（１Ｒ）‐１‐フルオロエチル］ピリミジン‐２‐イル｝アミノ）‐５‐メチルフェニル］‐１，３‐チアゾール‐２‐イル｝‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチルシクロヘキサンカルボン酸； （１Ｓ，４Ｒ）４‐｛５‐［３‐（｛４‐［（１Ｓ）‐１‐フルオロエチル］ピリミジン‐２‐イル｝アミノ）‐５‐メチルフェニル］‐１，３‐チアゾール‐２‐イル｝‐４‐ヒドロキシ‐２，２‐ジメチルシクロヘキサンカルボン酸； あるいはそれらの薬学的に許容される塩。
３．２．６．免疫調節性粒子の実施例
幾つかの実施例において、３．２．１章で例に挙げて説明したアグリカン抗原の少なくとも一つは、上記で述べたインヒビターの一つ以上（例えば、３．２．３章で説明したＮＦ−κＢインヒビターの一つ以上、および／または３．２．４章で例に挙げて説明したｍＴＯＲインヒビターの一つ以上、および／または３．２．５章で例に挙げて説明したＳｙｋインヒビターの一つ以上）と、あるいは代替的に３．２．２章で例に挙げて説明したアグリカンＡＰＬ（ここではまとめて「生物活性物質」と呼ぶ）とともに粒子状を呈し、そのため、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ環境下において、抗原とインヒビターは抗原提示細胞まで容易に送達される。これらのインヒビターおよび抗原、あるいはＡＰＬは同一粒子内に存在／関連していてもよいし、異なる粒子内に存在／関連していてもよい。本発明の実施においては種々の粒子が使用されてよく、例えば非制限的に、リポソーム、ミセル、脂質粒子、セラミック／無機粒子を含み、これらの粒子は、典型的にはナノ粒子およびミクロ粒子から選択される。またこれらの粒子は、抗原提示細胞に取り込まれる（例えば食細胞活動、エンドサイトーシス）ように好適にサイズ化される。例証的実施例において、これらの粒子の大きさは約１００μｍ未満であり、さらに好適には５００ｎｍ以下としているが、約１０μｍ程度に大きくても約数ｎｍ程度に小さくてもよい。
リポソームは基本的に、水性コアの周りの殻となるリン脂質二重層からなる。利点としては、細胞外側の薄膜層を「模して」外側の層を親油性とすることで、種々の細胞に比較的容易に取り込まれることが挙げられる。ポリマービークルは、典型的には、生体適合性ポリマーからなるマイクロ／ナノ球体、およびマイクロ／ナノカプセルで構成され、生分解性（例えばポリ乳酸）であっても非生分解性（例えばエチレンビニルアセテート）であってもよい。ポリマー素子の幾つかの利点としては、放出および分解プロファイルが制御できることに加えて、作製が容易で負荷能力が高いこと、粒径の大きさがナノメーターからミクロンの幅があることが挙げられる。
幾つかの実施例において、粒子表面には抗原結合分子が存在し、非抗原提示細胞よりも抗原提示細胞（例えば樹状細胞）において高レベルで発現するマーカーと免疫相互作用を起こす。このタイプの例示的なマーカーとしては、ＭＧＬ、ＤＣＬ‐１、ＤＥＣ‐２０５、マクロファージマンノースＲ、ＤＣ‐ＳＩＧＮ、あるいは他のＤＣ、脊髄特有（レクチン）レセプタを含み、これらは例えば、Hawigerら(2001, J Exp Med 194:769)、 Katoら2003, J Biol Chem 278:34035)、 Benitoら(2004, J Am Chem Soc 126:10355)、 Schjetne,ら(2002, Int Immunol 14:1423) and van Vlietら 2006, Nat Immunol 7(11):1200-1208; Immunobiology 211:577-585)に開示されている。
本発明の免疫調節性粒子は、生物活性物質、界面活性剤、賦形剤、高分子材料を組み合わせて作製することができる。幾つかの実施例において、免疫調節性粒子は生分解性および生体適合性を有し、治療用あるいは診断用の薬剤を送達するため、制御された速度で生分解することが任意で可能である。免疫調節性粒子は種々の材料で作製され、有機材料および無機材料の両方が用いられる。脂肪酸などの、ポリマー／非ポリマー材料が用いられる。他の好適な材料としては、非制限的に、ゼラチン、ポリエチレングリコール、トレハルロース、デキストラン、キトサンが挙げられる。形成材料に基づいて、分解／放出時間が数秒から数ヶ月の免疫調節性粒子を設計／作製することができる。
３．２．６．１．ポリマー粒子
ポリマー粒子は、生体適合性および望ましい生分解性をもつポリマー、コポリマー、あるいはそれらの混合物から形成されてよい。またポリマーは以下の（ｉ）〜（ｉｖ）を含む様々な粒子特性が最適となるように形成されてよい：（ｉ）送達される生物活性物質と、生物活性物質を安定化させて送達時の活性を保持するポリマーの間における相互作用 （ｉｉ）ポリマー分解速度およびそれによる薬剤の放出プロファイル （ｉｉｉ）化学的に修飾されることによる表面の特徴および標的能力 （ｉｖ）粒子の空隙率。
粒子の形成には、ポリアンヒドライドなどの表面侵食ポリマーが用いられてよい。例えば、ポリ［（ｐ‐カルボキシフェノキシ）‐ヘキサンアンヒドライド］（ＰＣＰＨ）のようなポリアンヒドライドを用いてよい。生分解性を有するポリアンヒドライドが米国特許第４８５７３１１号に記載されている。
他の実施例として、ポリエステル（ポリ（ヒドロキシ酸）またはポリ（エステル）を含む）を基としたバルク侵食ポリマーを用いることができる。例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、またはそれらのコポリマーを用いて粒子を形成してよい。またポリエステルは、例えばアミノ酸のように、荷電可能または官能化可能な基を有してもよい。例証的実施例として、ＤＰＰＣのような界面活性剤を含んだポリ（Ｄ，Ｌ‐乳酸）、および／またはポリ（Ｄ，Ｌ‐乳酸‐グリコール酸コポリマー)（「ＰＬＧＡ」）を用いることで、制御された放出特性を有する粒子を形成することができる。
他のポリマーとしては以下を含む：ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン（例えばポリエチレン、ポリプロピレンなど）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニル化合物（例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステルなど）、アクリル酸およびメタクリル酸のポリマー、セルロースおよび他のポリサッカライド、ペプチドおよび蛋白質、またはそれらのコポリマーや混合物。またポリマーは、種々の制御された薬剤送達手段に対して、ｉｎ ｖｉｖｏ環境にて適切な安定性および生分解速度を有するように選択または修飾されてよい。
幾つかの実施例において、粒子は官能化されたポリエステルグラフトコポリマーより形成され、これらは以下に記載がある：Hrkachら1995, Macromolecules, 28:4736-4739 「Poly(L-Lactic acid-co-amino acid) Graft Copolymers: A Class of Functional Biodegradable Biomaterials」 , Hydrogels and Biodegradable Polymers for Bioapplications, ACS Symposium Series No. 627, Raphael M. Ottenbriteら Eds., American Chemical Society, Chapter 8, pp. 93-101, 1996）。
粒子の形成には、生分解性を有するポリマー以外の材料も用いられて良い。好適な材料としては、種々の非生分解性ポリマー、および種々の賦形剤を含む。また、粒子は生分解性ポリマーと賦形剤のみで形成されてもよい。
またポリマー粒子は、シングルおよびダブルエマルジョン溶媒蒸発、スプレードライ、溶媒抽出、溶媒蒸発、相分離、単純および複合コアセルベーション、界面重合、および同業者によって一般的に知られているその他の方法により作製されてよい。また、所望の粒径をもつ粒子を作製するための条件が整っている場合は、マイクロ球体／マイクロカプセルを作製する既知の技術を用いて、粒子を形成してもよい。
カプセル化された薬剤を送達するマイクロ球体を作製するために開発された方法が文献に記載されており、例えば、Doubrow, M., Ed., 「Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,」 CRC Press, Boca Raton, 1992に記載されている。他に、Mathiowitz and Langer (1987, J. Controlled Release 5:13-22)、Mathiowitzら(1987, Reactive Polymers 6:275-283)、Mathiowitzら(1988, J. Appl. Polymer Sci. 3:, 755-774)、米国特許第５２１３８１２号、米国特許第５４１７９８６号、米国特許第５３６０６１０号、米国特許第５３８４１３３号に記載されている。どの方法を選択するかは、ポリマーの種類、大きさ、外側の形態、所望の結晶度に基づいて決定されるが、これは例えば、Mathiowitzら(1990, Scanning Microscopy 4:329-340; 1992, J. Appl. Polymer Sci. 45:125-134)、および Benitaら(1984, J. Pharm. Sci. 73:1721-1724)に記載されている。
溶媒蒸発においては、例えば、Mathiowitzら (1990)、 Benita、および米国特許第４２７２３９８号（Jaffe）に記載があるように、該ポリマーはメチレンクロライドなどの揮発性有機溶媒に溶解する。何種類かの異なるポリマー濃度（０．０５〜２．０ｇ／ｍＬなど）が用いられる。生物活性物質は、可溶型であっても微粒子として散在していてもよいが、ポリマー溶液に投入され、その混合物は界面活性剤（例えばポリ（ビニルアルコール））を含む水溶液相に浮遊する。その水溶液相は、例えば、蒸留水にポリ（ビニルアルコール）を１％ｗ／ｖの濃度で含んでいてもよい。得られた乳濁液を、有機溶媒がほぼ蒸発するまでかき混ぜることで固体のマイクロ球体が得られ、それを水で洗浄した後、凍結乾燥機にて一晩乾燥させる。この方法により、異なるサイズ（１〜１０００μｍ）および異なる形態を有するマイクロ球体が得られる。
溶媒の除去は、第一に、ポリアンヒドライドなど不安定なポリマーの使用を意図したものである。この方法では、薬剤は揮発性有機溶媒（例えば塩化メチレン）中の選択したポリマーの水溶液中に分散／分解する。その混合物はシリコンオイルのようなオイルに懸濁させ、それをかき混ぜることで、乳濁液が得られる。溶媒は２４時間以内に油相中に広がり、滴状の乳濁液が硬化して固体のポリマーマイクロ球体となる。ホットメルト‐マイクロカプセル封入法（Mathiowitzら(1987, Reactive Polymers 6:275)に記載）とは異なり、本方法を用いることで、高い融点および幅広い分子量をもつポリマーからなるマイクロ球体を作製することができる。本手順では、１〜３００ミクロンの粒径を有するマイクロ球体が得られる。
幾つかの重合システムにおいて、シングル／ダブル‐エマルジョン法を用いて作製されるポリマー粒子は、液滴のサイズに依存してそのサイズが変わる。油中水型乳化剤の液滴が十分小さくなく、所望のサイズ幅を有する粒子を形成できない場合は、例えば乳化剤に音波処理や均一処理を施したり、界面活性剤を加えたりすることで、より小さな液滴を形成することができる。
上記いずれかの方法で作製した粒子が所望のサイズ幅に収まらない場合は、篩を用いたり、さらには熟練せる当業者に公知の比重による分離を行うことで、粒子をサイズ化することができる。
ポリマー粒子はスプレードライにより作製することもできる。スプレードライ法は、例えばＳｕｔｔｏｎおよびＪｏｈｎｓｏｎによりＷＯ第９６／０９８１４号に開示されており、ここでは９０％以上の粒子が平均１〜１０μｍのサイズを有し、水溶性で滑らかな球体マイクロ粒子材料の作製が開示されている。
３．２．６．２．リポソーム類
リポソームは以下に報告されているような標準的な方法によって製造できる：Kimら（1983, Biochim. Biophys. Acta 728:339-348）、Liuら（1992, Biochim. Biophys. Acta 1104:95-101）、Leeら（1992, Biochim. Biophys. Acta. 1103:185-197）、Breyら（米国特許出願公開第２００２００４１８６１号）、Hassら（米国特許出願公開第２００５０２３２９８４号）、Kisakら（米国特許出願公開第２００５０２６０２６０号）、Smyth-Templetonら（米国特許出願公開第２００６０２０４５６６号）。さらに、抗原送達のための脂質を基にした粒子形成について調査したCopelら(2005, Immunol. Cell Biol. 83:95-105)、ワクチンにおける粒子送達システム（蛋白質結合リポソームの作製方法も含む）を調査したBramwellら（2005, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 22(2):151-214; 2006, J Pharm Pharmacol. 58(6):717-728）を参照するとよい。様々なｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞培養や動物実験において、種々の脂質化合物を用いたリポソーム形成が試されてきた。これは例えば、Leeら(1992, Biochim. Biophys. Acta. 1103:185-197)、Liuら(1992, Biochim. Biophys. Acta. 1104:95-101)、Wangら(1989, Biochem. 28:9508-9510)に記載されている。
簡単には、選ばれた脂質（そして任意の有機可溶性の生物活性物質）を有機溶媒に溶解させ混合した後、真空に保たれたガラスチューブ内の底で乾燥させる。得られた脂質フィルムは、任意の水溶性生物活性物質を含む水性緩衝溶液を用いて再水和化され、ゆるやかに攪拌され、カプセル化される。水和化された脂質小胞は、押し出しによってさらに処理され、一連の凍結‐融解サイクルにかけられ、または脱水され、その後再水和され、生物活性物質のカプセル化を促進する。リポソームは遠心分離によって洗浄され、またはサイズ排除カラムにかけられ、捕捉されなかった生物活性物質をリポソーム組成物から除去し、４℃で保存することができる。リポソームの基礎的製法は、Thierryら(1992, Nuc. Acids Res. 20:5691-5698)に詳細に記載されている。
生物活性物質(類)のペイロードを運搬する粒子は、Pautotら(2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(19):10718-21)に記載されるような方法を用いて作ることができる。Pautotらの方法を用いて、ストレプトアビジン‐コーテド脂質（ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、および同様な脂質類）を用いてリポソームを作ることができる。Needhamら(2001, Advanced Drug Delivery Reviews 53(3):285-305)に記載された薬剤カプセル化技術を用いて１種類以上の活性作用物質をこれらの小胞に担わせることができる。
リポソームは種々の脂質のクロロホルム溶液を高真空にさらし、その後生成した脂質フィルム（ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ）をｐＨ４緩衝液で水和し、凍結および融解操作後、ポリカルボネーテド フィルターを通して押し出すことによって作ることができる。ＤＳＰＣまたはコレステロールを補充したＤＰＰＣを用いてカプセル化の効率を高める、または安定性を増加させることなどができる。経膜的ｐＨ勾配は、アルカリ化剤の添加によって小胞外培地のｐＨを７．５に調節することによって作り出すことができる。生物活性物質(例えば小分子、ＮＦ‐κＢインヒビター、ｍＴＯＲインヒビター、またはＳｙｋインヒビター；これらは例えば弱塩基性である）は、その後高温で、少量の生物活性物質の添加によって小胞溶液に捕捉され、リポソーム内の生物活性作用物質の蓄積を可能にする。
本発明の生物活性物質の運搬のために適したニオソームなどのその他の脂質ベースの粒子は、Copelandら(2005, Immunol. Cell Biol. 83:95-105)に記載されている。
３．２．６．３．セラミック粒子
本発明の生物活性物質を運搬するために、セラミック粒子を用いることもできる。これらの粒子は、一般的には、周知のゾル‐ゲル プロセスに似たプロセスを用いて作成され、通常は下記に記載されているような、単純で、室温の条件を必要とする：Brinkerら(「Sol-Gel Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing;」 Academic Press: San Diego, 1990, p-60)、Avnirら(1994, Chem. Mater. 6, 1605)。セラミック粒子は所望のサイズ、形、多孔度で作られ、極めて安定である。それらも、極端なｐＨおよび温度によって誘起される変性から、ドープされた分子（ポリペプチド、薬剤、など）を効果的に保護する（Jainら 1998. J. Am. Chem. Soc. 120:11092-11095）。さらに、それらの表面は、種々の修飾基により容易に機能的になる得る（Lalら 2000. Chem. Mater. 12:2632-2639、Badleyら 1990, Langmuir 6:792-801）。それにより、それらは種々のモノクローナル抗体およびその他のリガンド類に付着し、それらをｉｎ ｖｉｖｏ環境における所望の部位に標的化することができる。
種々のセラミック粒子は、活性剤含有ペイロードのｉｎ ｖｉｖｏ運搬のために説明されてきた。例えば、英国特許第１５９０５７４号は、生物学的活性成分をゾル‐ゲル マトリックスに挿入することを開示している。国際公開ＷＯ第９７／４５３６７号は，ゾル‐ゲル プロセスによって作られた調節可能に溶解できるシリカ キセロゲルを開示している。そこでは、生物学的活性物質が、予備焼結した粒子（１〜５００μｍ）またはディスクに浸み込ませることによって、挿入される。国際公開ＷＯ第００５０３４９号は、ゾル‐ゲル プロセスによって作られた調節可能な生物分解性シリカ線維（その線維の合成中に生物学的活性物質が挿入される）を開示している。米国特許出願公開第２００４０１８００９６号は、生物学的活性物質を捕らえるセラミック ナノ粒子について記載している。そのセラミックナノ粒子は、色素のミセル組成物の形成によって作られる。そのセラミック材料はそのミセル組成物に加えられ、そのセラミックナノ粒子はアルカリ性加水分解によって、沈殿する。米国特許出願公開第２００５０１２３６１１号は、粒子全体にほぼ均質に活性材料が分散したセラミック粒子の制御された放出を開示している。これらの粒子は、界面活性剤と無極性溶媒とを混合することによって逆ミセル溶液を作り；（ｂ）ゲル前駆体、触媒、濃縮剤、および可溶性活性物質を極性溶媒に溶解して、前駆体溶液を作り；（ｃ）逆ミセル溶液と前駆体溶液とを合一して乳濁液を作り；（ｄ）その乳濁液中の前駆体を濃縮することによって得られる。米国特許出願公開第２００６０２１０６３４号には、金属酸化物(例えば酸化チタアニウム、酸化ジルコニウム、酸化スカンジウム、酸化セリウム、および酸化イットリウム)を含むセラミック粒子上に生物活性物質を蒸発によって吸着させることが開示されている。Kortesuoら(2000, Int J Pharm. 200(2):223-229)では、トレミフェンシトレートおよびデキスメデトミジンＨＣｌのような薬剤の送達を制御するために、粒子サイズ範囲が狭い球状シリカゲル粒子を作ることを目的としたスプレー乾燥法を開示している。Wangら(2006, Int J Pharm. 308(1-2):160-167)には、生物活性物質の送達のために、多孔性ＣａＣＯ３ミクロ粒子による吸着と、ポリエレクトロライト多層フィルムによるカプセル化との組み合わせが記載されている。
３．２．６．４．バリスティック粒子
本発明の生物活性物質は、無針または「バリスティック」（微粒子銃）送達に使用するのに適した粒子に伴わせる、あるいは関連させてよい。バリスチック送達のための例証的な粒子は、例えばＷＯ第０２／１０１４１２号；ＷＯ第０２／１００３８０号；ＷＯ第０２／４３７７４号；ＷＯ第０２／１９９８９号；ＷＯ第０１／９３８２９号；ＷＯ第０１／８３５２８号；ＷＯ第００／６３３８５号；ＷＯ第００／２６３８５号；ＷＯ第００／１９９８２号；ＷＯ第９９／０１１６８号；ＷＯ第９８／１０７５０号；ＷＯ第９７／４８４８５号に記載されている。しかしながら、そのような粒子はバリスチック送達装置での使用に限られているわけではなく、他にも、免疫細胞に送達できる代替的な技術(例えば注入またはミクロ針送達など）によって粒子を投与することも可能である。
生物活性物質は当業者には公知の種々の技術を用いて運搬粒子にコーティング、または化学的に結合されてもよい。運搬粒子は、細胞内送達において一般的に使用される粒子サイズの範囲内で、適切な密度をもった材料から選択される。最適な運搬粒子サイズは、もちろん標的細胞の直径に依存する。典型的な粒子サイズは約０．０１〜２５０μｍ、約１０〜１５０μｍ、および約２０〜６０μｍである。粒子密度は約０．１〜２５ｇ／ｃｍ３、バルク密度は約０．５〜約３．０ｇ／ｃｍ３、あるいはそれ以上である。このタイプ粒子は非制限的に、金属粒子、たとえばタングステン、金、白金、イリジウムなどの運搬粒子を含む。タングステン粒子は、平均サイズが直径０．５〜２．０μｍのものが容易に入手できる。金粒子または微晶質の金（例えばEngelhsrd Corp.East Newark,N.J.から入手できる金粉末Ａ１５７０）も使用できる。金粒子はサイズが均一であり（Alpha Chemicalsから入手でき、粒子サイズ１−３μｍ、またはＤｅｇussa、South Plainfield,N.J.から入手でき、粒子サイズの範囲は０．９５μｍを含む）、また低毒性である。微晶質金は広い粒子サイズ分布（一般的には０．１−５μｍの範囲）を示す。微晶質金の不規則な表面領域は本発明の活性物質でコーティングするためには非常に効率的である。
金またはタングステンのような粒子上に生物活性分子(例えば蛋白質または核酸のような親水性分子)を吸着、カップリングまたは付着させるための多くの方法が知られている。例証的実施例において、このような方法は、あらかじめ決められた量の金またはタングステンを生物活性分子、ＣａＣｌ２およびスペルミジンと組み合わせる。その他の実施例では、エタノールを用いて、生物活性分子を金またはタングステン粒子上に沈殿させる(例えば以下を参照：Jumarら 2004, Phys Med. Biol. 49:3603-3612）。その生成した溶液を、コーティング処理中、適切に連続的に攪拌し、反応混合物を確実に均質にする。生物活性分子の付着後、その粒子を例えば適切な膜に移し、使用前に乾燥させ、サンプルモジュールまたはカセットの表面にコーティングするか、または特定の粒子を媒体とした運搬機器に使用するための運搬カセットに入れる。
処方された組成物は、例えば単純な蒸発（空気乾燥）、真空乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥、噴霧凍結乾燥、スプレーコーティング、沈殿、臨界超過液粒子形成、などといった標準的な技術を用いて粒子として適切に調製される。所望ならば、生成した粒子は、国際公開ＷＯ第９７／４８４８５号に記載される方法を用いて整えることができる。
３．２．６．５．界面活性剤
粒子に挿入できる界面活性剤は、ホスフォグリセリド類を含む。典型的なホスフォグリセリド類としては、ホスファチジルコリン類、例えば天然に存在する界面活性剤、Ｌ‐α‐ホスファチジルコリン ジパルミトイル（「ＤＰＰＣ」）を含む。界面活性剤は、例えば粒子‐粒子相互作用を減らすことによって、表面特性が有利に改善され、またそれにより、粒子の表面がより接着しにくくなる。肺に固有の界面活性剤の使用は、非生理学的界面活性剤の使用の必要性を回避するかも知れない。
粒子の表面に界面活性剤を与えると、静電気的相互作用のような相互作用、ファンデルワールス力および毛細管作用などにより粒子が凝集する傾向を減少させることができる。粒子表面における界面活性剤の存在は、表面のしわ(粗雑さ)の増加をもたらし、それによって密接な粒子‐粒子相互作用のために利用できる表面領域を減らすことによって、エアロゾル化が改善する。
当業者に公知の界面活性剤は、天然に生ずる任意の界面活性剤を含むことができる。その他の典型的表面活性剤には、ジホスファチジル グリセロール（ＤＰＰＧ）；ヘキサデカノール；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような脂肪アルコール；ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル；パルミチン酸またはオレイン酸のような表面活性脂肪酸；ソルビタン トリオレアート（Ｓｐａｎ８５）；グリココレート；サーファクチン；ポロキサマー；ソルビタン トリオレアートのようなソルビタン脂肪酸エステル；チオキサポル；リン脂質が含まれる。
これらの粒子は、インヒビターおよびアグリカン抗原の、抗原提示細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ送達のためのビヒクルとして使用できる。しかし、有用な実施態様において、例えば米国特許出願公開第２０１００１５１０００号に開示されているように、これら粒子は、生物活性化合物を抗原提示細胞へｉｎ ｖｉｖｏ送達するために用いられる。上記文献は引例によってここにそのまま組み入れられる。
３．２．７．Ｅｘ ｖｉｖｏ抗原提示細胞 実施態様
インヒビターおよびアグリカン抗原は、ｅｘ ｖｉｖｏ で種々の形の抗原提示細胞に送達され得、それらは可溶性または粒状である。抗原提示細胞およびその前駆体は、治療対象の被検体から得ることができる(すなわち自己抗原提示細胞またはその前駆体）。あるいは、抗原提示細胞またはその前駆体は、ＭＨＣが被検体とマッチした、またはマッチしないドナー（すなわち同種異型の抗原提示細胞）から得られるかまたは誘導される。これらの実施態様において、ドナーが被検体と組織適合性であるのが適切である。
上記の実施態様において、例えば３．２．３、３．２．４、または３．２．５章で述べたように、抗原提示細胞は１種類以上のインヒビターあるいはそのインヒビターを発現し得るポリヌクレオチドと、その抗原提示細胞のＮＦ‐κＢ活性および／またはｍＴＯＲ活性および／またはＳｙｋ活性を阻害、低下または減じるのに十分な時間および条件下で接触する。抗原提示細胞またはその前駆体との接触に使われる可溶性または粒状のインヒビターの量は、熟練せる当業者には公知の日常的方法によって実験的に決めることができる。幾つかの有用な実施態様において、抗原提示細胞はインヒビターの存在下で、約２、３、４、５、６、７、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間以上、または約９６、８４、７２、６０、４８、３６、２４、１２、８、７、６、５、４、３、または２時間未満、インキュベートされる。特定の実施態様において、抗原提示細胞はインヒビター(例えばａ ＮＦ‐κＢインヒビターまたはｍＴＯＲまたはＳｙｋインヒビター）と共に、約４８時間〜６０時間、３５℃−３８℃で、ＮＦ‐κＢ、ｍＴＯＲ、またはＳｙｋの活性を阻害、減少、損傷するのに十分な時間、インキュベートされる。同様の例証的実施例において、抗原提示細胞はリポポリサッカリド（ＬＰＳ）のような抗原提示細胞のアクチベータの存在下で、そして任意に付加的インヒビター類（例えばビタミンＤおよびデキサメサゾンのような付加的ＮＦκＢインヒビター類）の存在下でインキュベートしてもよい。
抗原提示細胞またはそれらの前駆体は例えば３．２．１章に記載したようにアグリカン抗原と、または例えば３．２．２．章に記載したようにアグリカンＡＰＬと、または例えば前記抗原またはＡＰＬを発現し得るポリヌクレオチドと、その抗原またはその操作された形のものがその抗原提示細胞によって現わされるのに十分な時間、および十分な条件下で接触させられる。好適には、上記インヒビターおよび／または上記抗原またはそれらを発現し得るポリヌクレオチドは、例えば３．２．６章に記載したように可溶性の形または粒状形である。抗原提示細胞またはそれらの前駆体と接触している可溶性または粒状の抗原、あるいはＡＰＬの量は、熟練せる当業者には公知の日常的方法によって実験的に決められる。幾つかの有用な実施態様において、抗原提示細胞はアグリカン抗原の存在下でインキュベートされ、その時間は、約２、３、４、５、６、７、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間以上、または約９６、８４、７２、６０、４８、３６、２４、１２、８、７、６、５、４、３、２時間未満、または約６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２分未満でもよい。細胞が任意に操作され、アグリカン抗原を示すために必要な、ポリペプチドまたはペプチド類の時間および量は、パルスチェイス プロトコルを用いて決められ、その際アグリカン抗原への暴露の後に洗浄期間が続き、そして読み出しシステム（例えばアグリカン抗原特異的エフェクターリンパ球反応の抑制または阻害を誘導することができる）にかけられる。細胞がアグリカン抗原またはその操作された形をそれら(細胞)の表面に発現するための最適時間および量が決まると、免疫寛容原性反応を誘起するための細胞およびアグリカン抗原を作成するプロトコルが使用できる。熟練せる当業者は、この点に関して、抗原提示細胞がその表面上に抗原を現わすために必要な時間の長さが、使用する抗原、または使用する抗原の形、その量、および使用する抗原提示細胞、並びに抗原の装填が行われる条件によって変化するかも知れないことを認識するであろう。これらのパラメータは熟練せる当業者によって、決められた手順を用いて決められる。
幾つかの実施態様において、抗原提示細胞は抗原またはＡＰＬと約１〜６時間３７℃でインキュベートされるが、増殖因子およびインヒビターとのインキュベーションの持続時間だけ抗原提示細胞を抗原にさらすことができる。通常、精製抗原およびペプチドでは、０．１〜１０μｇ／ｍＬが、抗原特異的抗原提示細胞の作成のために適している。例証的実施例においてペプチド抗原の提示は、さらに短いインキュベーション期間（例えば約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０分）を用いて、約１０〜２０μｇ／ｍＬの濃度で達せられる。
３．２．７．１．抗原提示細胞およびそれらの前駆体のソース
抗原提示細胞またはそれらの前駆体は、熟練せる当業者に公知の方法によって分離することができる。このような細胞のソースは、特定の免疫反応を調節するために必要な抗原提示細胞によって異なるであろう。このような関係において、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、およびその他の骨髄系列の細胞から選択される。
典型的には、抗原提示細胞の前駆体は、任意の組織から分離することができるが、最も簡単には、血液、脊髄血液または骨髄から分離することができる（Sorgら 2001. Exp Hematol 29:1289-1294; Zhengら 2000. J Hematother Stem Cell Res 9:453-464）。バイオプシ−または関節タップ後のリウマチ様滑膜組織／液のような疾病組織から適した前駆体を得ることもできる（(Thomasら 1994a, J Immunol 153:4016-4028; Thomasら 1994b, Arthritis Rheum 37(4)）。その他の実施例は、非制限的に肝臓、脾臓、心臓、腎臓、腸、および扁桃を含む（Luら 1994. J Exp Med 179:1823-1834; McIlroyら 2001. Blood 97:3470-3477; Vremecら 2000. J Immunol 159:565-573; HartとFabre 1981. J Exp Med 154(2):347-361; HartとMcKenzie 1988. J Exp Med 168(1):157-170; Pavliら 1990. Immunology 70(1):40-47）。
組織から直接分離された白血球は抗原提示細胞前駆体の主要ソースを与える。典型的には、これらの前駆体は種々の増殖因子の存在下または不在下で培養することによって、抗原提示細胞に分化することができるに過ぎない。本発明は実際は、抗原提示細胞は粗混合物から、または一部、または実質的に精製された前駆体標本からこのように分化する場合もある。白血球は、例えばＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅを用いる密度勾配遠心分離（これは好中球、および赤血球(末梢血単核細胞またはＰＢＭＣｓを排除する）によって、または赤血球の塩化アンモニウム分解によって(leukocytes またはwhite blood cells)、血液または骨髄から便利に精製される。抗原提示細胞の多くの前駆体が、非増殖性単球のような末梢血液に存在する。それらは特異的サイトカインの存在下で培養することによって、マクロファージおよび樹状細胞を含む特異的抗原提示細胞に分化することができる。
組織樹状細胞またはランゲルハンス細胞の前駆体のような組織−誘導性前駆体は、一般的には、組織（例えば表皮の基底膜）を細砕し、それをコラゲナーゼまたはディスパーゼで消化し、その後密度勾配分離にかけることによって、または細胞表面マーカーの発現に基づく前駆体の選択によって、得られる。例えば、ランゲルハンス細胞前駆体はＣＤ１分子並びにＨＬＡ‐ＤＲを発現し、これに基づいて精製することができる。
幾つかの実施態様において、抗原提示細胞前駆体はマクロファージの前駆体である。概して、これらの前駆体は、任意のソースの単球から得ることができ、培地およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ‐ＣＳＦ）の存在下で長時間インキュベートすることによって、マクロファージに分化することができる（Erickson-Millerら 1990. Int J Cell Cloning 8:346-356; MetcalfとBurgess 1982. J Cell Physiol 111:275-283）。
その他の実施態様において、抗原提示細胞前駆体は、ランゲルハンス細胞の前駆体である。通常、ランゲルハンス細胞は、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、ＩＬ‐４／ＴＮＦαおよびＴＧＦβの存在下で、ヒト単球またはＣＤＤ３４＋骨髄前駆体から生成する（Geissmannら 1998. J Exp Med 187:961-966; Stroblら 1997a. Blood 90:1425-1434; Stroblら 1997b. dv Exp Med Biol 417:161-165; Stroblら 1996. J Immunol 157:1499-1507）。
また別の実施態様において、抗原提示細胞前駆体は、樹状細胞の前駆体である。幾つかの潜在的な樹状細胞前駆体は、末梢血、脊髄血、または骨髄から得られる。これらは単球、ＣＤ３４＋幹細胞、顆粒球、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ前駆体、および委託された脊髄性先祖（以下に記載）を含む。
単球
単球は組織培養培地（例えばＲＰＭＩ）および血清（例えばヒトまたはウシ胎仔血清）の存在下で、または無血清培地中で、１〜２時間、プラスチックに付着させることによって精製できる（Antonら 1998. Scand J Immunol 47:116-121; Arakiら 2001. Br J Haematol 114:681-689; Mackensenら 2000. Int J Cancer 86:385-392; Nestleら 1998. Nat Med 4:328-332; Romaniら 1996. J Immunol Meth 196:137-151; Thurnerら 1999. J Immunol Methods 223:1-15）。単球も末梢血から洗い清められる（Garderet ら 2001. J Hematother Stem Cell Res 10:553-567）。単球は、抗ＣＤ１４抗体と共に、イムノマグネチック選択、フローサイトメトリー分類またはパンニングを含むイムノアフィニテイ技術によっても精製できる（Arakiら 2001、 supra; Battye and Shortman、 1991. Curr. Opin. Immunol. 3:238-241）。循環する単球の数（すなわち収量）は、ＧＭ‐ＣＳＦを含む種々のサイトカインのｉｎ ｖｉｖｏ使用によって高めることができる（Groopmanら 1987. N Engl J Med 317:593-598; Hillら 1995. J Leukoc Biol 58:634-642）。単球は、Ｇｍ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４の存在下で長時間のインキュベーションによって樹状細胞に分化し得る。（Romaniら 1994. J Exp Med 180、 83-93; Romaniら 1996、 supra）。ＧＭ‐ＣＳＦとＩＬ‐４の組み合わせ（各々の濃度が約２００〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは約５００〜１０００Ｕ／ｍＬ、さらにより好ましくは約８００Ｕ／ｍＬ（ＧＭ−ＣＳＦ）〜１０００Ｕ／ｍＬ（ＩＬ−４））は、未熟な樹状細胞、すなわち抗原を捕捉する食細胞性樹状細胞をかなり多量に産生する。単球の、抗原ー捕捉−食細胞性樹状細胞への分化を促進するその他のサイトカインは、例えばＩＬ−１３である。
ＣＤ３４ ＋ 幹細胞
樹状細胞は、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＴＮＦα±幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ‐ｋｉｔＬ）、またはＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４±ｆｌｔ３Ｌの存在下で、ＣＤ３４＋骨髄誘導性前駆体からも生成できる（Baiら 2002. Int J Oncol 20:247-53; Chenら 2001. Clin Immunol 98:280-292; Loudovarisら 2001. J Hematother Stem Cell Res 10:569-578)）。ＣＤ３４＋細胞は骨髄吸引から、または血液から引き出され、単球について言えば、例えばイムノマグネチック選択またはイムノカラムを用いて豊富にすることができる（Davisら 1994. J Immunol Meth 175:247-257）。血液中のＣＤ３４＋細胞の比率は、最も一般的には種々のサイトカイン（Ｇ‐ＣＳＦを含むが、ｆｌｔ３Ｌおよびプロゲニポイエチンも含む）のｉｎ ｖｉｖｏ使用によって高めることができる（Flemingら 2001. Exp Hematol 29:943-951; Pulendranら 2000. J Immunol 165:566-572; Robinsonら 2000. J Hematother Stem Cell Res 9:711-720）。
その他の骨髄性プロゲニター
ＤＣは、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４／ＴＮＦの存在下で、ＣＤ３４＋幹細胞と同様なやり方で、委託された早期骨髄性プロゲニターから生成することができる。このような骨髄性前駆体は、炎症時には多くの組織に浸潤する（リウマチ性関節炎の滑膜液を含む）（Santiago-Schwarzら 2001. J Immunol. 167:1758-1768）。循環する樹状細胞前駆体および単球を含む全身の骨髄性細胞の膨張がｆｌｔ‐３リガンド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）またはプロゲニポエチン（ｐｒｏ‐ＧＰ）を含む幾つかのサイトカインで達成できる（Flemingら 2001, supra; Pulendranら 2000, supra; Robinsonら 2000, supra）。このようなサイトカインを数日、ヒトまたはその他の哺乳類に投与すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ操作のための、非常に多量の前駆体を末梢血または骨髄から引き出すことができるであろう。樹状細胞も、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４およびＴＮＦαの存在下で末梢血好中球前駆体から生成することができる（Kellyら 2001. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 47, 43-54; Oehlerら 1998. J Exp Med. 187:1019-1028）。樹状細胞は同様な方法を用いて、急性骨髄性白血病細胞からも生成できることは注目すべきである（Oehlerら 2000. Ann Hematol. 79, 355-62）。
組織ＤＣ前駆体、およびＡＰＣ前駆体のその他のソース
ＤＣ生成のその他の方法は、例えば、ＩＬ‐３＋／‐ＧＭ‐ＣＳＦの存在下における胸腺前駆体、およびＧＭ‐ＣＳＦの存在下における肝臓ＤＣ前駆体およびコラーゲン基質による。形質転換された、または動かない樹状細胞系がｖ‐ｍｙｃのような癌遺伝子を用いて生成されるかも知れない。これは例えば（Pagliaら 1993, supra）によって、またはｍｙｂ（BanyerとHapel 1999, supra; Gondaら 1993, supra）によって記載されている。
循環するＤＣ前駆体
これらはヒトおよびマウスの末梢血液において記載されてきた。適切な樹状細胞前駆体を確認するために特定の細胞表面マーカーを利用することもできる。特に、ＣＤ１１ｃの発現、およびＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ５６およびＣＤ３の非発現および低発現によって、血液中に樹状細胞前駆体の種々の集団を確認することができる。（O'Dohertyら 1994. Immunology 82, 487-493; O'Dohertyら 1993. J Exp Med 178:1067-1078）。これらの細胞は表面マーカーＣＤ１３およびＣＤ３３によっても確認できる（Thomasら 1993b. J Immunol 151(12):6840-6852）。プラズマ細胞腫性樹状細胞前駆体として知られる、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ５６およびＣＤ３が欠けている第二のサブセットはＣＤ１１ｃを発現しないが、ＣＤ１２３（ＩＬ‐３Ｒ鎖）ＨＬＡ‐ＤＲを発現する（Farkasら 2001. Am J Pathol 159. 237-243; Grouardら 1997. J Exp Med 185:1101-1111; Rissoanら 1999. Science 283:1183-1186）。大部分の循環するＣＤ１１ｃ＋樹状細胞前駆体はＨＬＡ‐ＤＲ＋である、しかしながら若干の前駆体はＨＬＡ‐ＤＲ−であるかも知れない。ＭＨＣクラスII発現の欠落が、末梢血中樹状細胞前駆体で明らかに示されている（del Hoyoら, 2002. Nature 415:1043-1047）。
任意に、上に記載されたＣＤ３３＋ＣＤ１４‐/loまたはＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ‐Ｄｒ＋系統マーカー陰性樹状細胞前駆体は、培養培地で、または単球コンデイションの培地で、１８〜３６時間インキュベーションすることによって、より成熟した抗原提示細胞に分化することができる（Thomasら 1993b, supra; ThomasとLipsky, 1994. J Immunol 153:4016-4028; O'Dohertyら 1993, supra）。あるいは末梢血非Ｔ細胞または精製していないＰＢＭＣのインキュベーション後に成熟した末梢血樹状細胞が、低密度によって特徴づけられ、そこでメトリザミドおよびＮｙｃｏｄｅｎｚを含み、密度勾配で精製できる（FreudenthalとSteinman, 1990. Proc Natl Acad Sci U S A 87:7698-7702; VremecとShortman, 1997. J Immunol 159:565-573）。または非制限的にではあるがＣＭＲＦ‐４４ｍＡｂのような特異的モノクローナル抗体によって特徴づけられる（Fearnleyら 1999. Blood 93:728-736; Vuckovicら 1998. Exp Hematol 26:1255-1264）。プラズマ細胞種性樹状細胞は細胞表面マーカーに基づいて、末梢血から直接精製でき、その後ＩＬ‐３の存在下でインキュベートできる（Grouardら, 1997, supra; Rissoanら, 1999, supra）。あるいは、上記のようにプラズマ細胞種性ＤＣは、密度勾配から、またはインキュベートされた末梢血細胞のＣＭＲＦ‐４４選択から誘導できる。
概して、任意の前駆体から生成する樹状細胞では、単球誘導性サイトカイン、リポポリサッカリド、およびＣｐＧリピートを含むＤＮＡ、ＴＮＦα、ＩＬ‐６、ＩＦＮ‐α、ＩＬ‐１β、壊死細胞、再付着、細菌、膜構成成分、ＲＮＡまたはポリＩＣのような活性化因子の存在下でインキュベートすると、未熟樹状細胞は活性化される（Clark, 2002. J Leukoc Biol 71:388-400; Hackerら 2002. Immunology 105:245-251; KaishoとAkira, 2002. Biochim Biophys Acta 1589:1-13; Koskiら 2001. Crit Rev Immunol 21:179-189）。樹状細胞活性化のこのプロセスは、ＮＦ‐κＢインヒビターの存在下で阻害される（O'Sullivan and Thomas, 2002. J Immunol 168:5491-5498）。
３．２．８．ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原提示細胞 実施態様
その他の実施態様において、被検体にＮＦ‐κＢインヒビターおよび／またはｍＴＯＲインヒビター、および／またはＳｙｋインヒビター（時には、ひとまとめにして、「インヒビター（類）」と呼ぶこともある）を、アグリカンポリペプチド（そのシトルリン化型も含む）に全体的または一部分対応するアグリカン抗原と共に同時投与することによって、その被検体のアグリカン特異的免疫寛容原性抗原提示細胞の数は増加する。上記インヒビター（類）および／または上記抗原は核酸型（すなわち、この場合はそれらは核酸構成物から生成される）または非核酸型である。インヒビター（類）および抗原は可溶性または粒状型でよい（例えば抗原およびインヒビターが両方共可溶性型、または抗原またはインヒビターの一つが可溶性型で、他が粒状型でもよいし、または抗原とインヒビターが両方共粒状型でもよい）。特定の実施態様において、インヒビター（類）および抗原が粒状型で同時投与される。好ましくはインヒビター（類）および抗原が同じ粒子に含まれる。ひとたび投与されると、それら粒子は被検体の抗原提示細胞によって（例えば食作用またはエンドサイトーシスによって）取り込まれ、インヒビター（類）／抗原ペイロードは細胞内部に放出される。
３．２．９．Ｅｘ ｖｉｖｏ調節性リンパ球 実施態様
３．２．７章により得られ、またはｅｘ ｖｉｖｏ作成された、アグリカン特異的抗原提示細胞は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球を含むその他の免疫細胞の調節のために、そして特に免疫寛容またはアグリカン抗原（そのシトルリン化型も含む）に対するアネルギーをあらわすＴリンパ球およびＢリンパ球を生成するために有用である。アグリカン抗原に対する寛容／アネルギーをあらわすリンパ球、特にＴリンパ球を引出す効率は、その抗原に対する免疫反応を測定することによって知ることができ、非制限的に次のことを含む：例えば、アグリカン特異的サイトリテイックＴリンパ球（ＣＴＬ）の標的として例えばアグリカン特異的抗原提示細胞をｉｎ ｖｉｖｏ使用して、Ｔリンパ球サイトリテイック活性を測定する；アグリカン特異的Ｔリンパ球増殖およびサイトカイン反応を測定する；およびＴ調節性抑制的機能を測定する（参照：VollenweiderとGroseurth, 1992, J. Immunol. Meth. 149:133-135）；例えばＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを用いてその抗原に対するＢ細胞反応を測定する；サイトカインプロフィ‐ルについて応答指令信号を送る；またはアグリカン抗原に対する皮膚反応性のテストによって遅速タイプの過敏性（ＤＴＨ）反応を測定する（参照、例えばChangら (1993, Cancer Res. 53:1043-1050））。抗原に暴露した後の抗原提示細胞の表面上の抗原の存在を検出できる、当業者に公知のその他の方法も本発明によって考慮される。
免疫寛容／アネルギー誘起性抗原提示細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスII分子のどちらか、または両方の上にアグリカン抗原、またはその操作された形を十分にあらわす能力をもっている。よって、ＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球およびＣＴＬの両方を、本発明のａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣによって寛容／アネルギーにすることができる。その上、本発明のａｇｇ‐ｔｏｌ ＡＰＣ は多数のアグリカン抗原を多数のＭＨＣｓ上に担うことができ、Ｔリンパ球のポリクローナルまたはオリゴクローナル寛容／アネルギーを得る。
こうして本発明は、アグリカン特異的寛容／アネルギーまたは調節性ＢまたはＴリンパ球、特にＴリンパ球を与えることもできる。それは、アグリカン抗原の出現に対して抗原特異的に反応することに失敗し、またはそれは、そのアグリカン抗原に対する先立つ免疫反応またはその後のプライミングを活発に調節する。その調節は概して長命に、例えば少なくとも約３ヶ月、好適には何年間も維持される。
特定の実施態様において、アグリカン特異的調節Ｔリンパ球は、上記のアグリカン特異的抗原提示細胞を、Ｔリンパ球の集団（それは脾臓または扁桃／リンパ節のような任意の適切なソースから得ることができるが、末梢血から得るのがより好ましい）と接触させることによって生成される。そのＴリンパ球は粗プレパレーションとして、または部分的に精製され、または実質的に精製されたプレパレーションとして使用できる。それは好適には標準的技術、例えば「Immunochemical Techniques, Part G: Separation and Characterization of Lymphoid Cells」 (Meth. in Enzymol. 108, Edited by Di Sabatoら 1984, Academic Press)に記載されているような標準的技術をもちいて適切に得ることができる。これは羊赤血球でロゼットすること、ナイロンウールまたはプラスチック付着のカラムを通して、付着細胞を除去すること、適したモノクローナル抗体を用いて、免疫磁気的、またはフローサイトメトリー選択することを含む（Cavanagh ら 1998. Blood 92(5)inhibitor1598-1607; Thomasら 1993. J Immunol 150inhibitor821-834）。
例えば３．２．７章に記載されているように、Ｔリンパ球のプレパレーションは、アグリカン特異的抗原提示細胞と、適当な期間接触させて、Ｔリンパ球における調節機能をこれらの抗原提示細胞によってあらわされる抗原または抗原類の方へ誘導する。この期間は普通約１〜５日である。概して、この処理後に生成する調節性Ｔリンパ球の増殖は、培地中のＩＬ‐２濃度に依存して短命である。このように作られた調節性リンパ球は、一般にはＩＬ‐１０および／またはその他の調節性サイトカインを、抗原特異的に産生するであろう。
幾つかの実施態様において、アグリカン特異的抗原提示細胞前駆体は、Ｔリンパ球の異種起源集団（それは好適には、末梢血から得られる）、および少なくとも１種類のインヒビター（３．２．３、３．２．４および３．２．５章に記載されている）を、アグリカン抗原、またはそのアグリカン抗原を発現できるポリヌクレオチドと共に培養する。これらの細胞は以下の（１）〜（４）を満足するために十分な時間および条件の下で培養される：（１）前駆体が抗原提示細胞に分化する；（２）これらの抗原提示細胞中のＮＦ‐κＢおよび／またはｍＴＯＲおよび／またはＳｙｋのレベルおよび／または機能的活性が除去されるか、軽減される；（３）アグリカン抗原、またはその操作された形のものが抗原提示細胞によってあらわされる；（４）抗原提示細胞がＴリンパ球のサブ集団を誘起し、アグリカン抗原の方へ調節的機能をあらわす。その際サブ集団はアグリカン特異的Ｔ細胞反応の抑制によって特徴づけられる。これはＦｉｃｏｌｌ‐精製ＰＢＭＣ プラス アグリカン抗原 プラス インヒビター（例えばＮＦ‐κＢおよび／またはｍＴＯＲ．および／またはｍＴＯＲ および／またはＳｙｋインヒビター（類））を用いて起こり得る。なぜならばこのようなプレパレーションは抗原提示細胞前駆体（例えば樹状細胞前駆体）およびＴリンパ球の両方を含むからである。
好適には、このように作られたアグリカン‐特異的‐抗原提示細胞は１種類以上のタイプの抗原特異的調節リンパ球、特に調節Ｔリンパ球（ここでは「Ｔｒｅｇ」とも言う）を誘起する。幾つかの集団、またはＴｒｅｇのサブセットが記載されている（Shevach, 2006. Immunity 25:195-201; Leeら 2011, Adv Immunol. 112:25-71; Sakaguchi, 2011. Methods Mol Biol.707:3-17）。ここには例えば天然に生ずるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが含まれる。天然Ｔｒｅｇ（Ｔｒｅｇ）として知られるＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）は、胸腺において発達し、健康な人では生まれたときから存在する。ｎＴｒｅｇのＴ細胞レセプタ（ＴＣＲ）の特異性は主として自己‐反応性である。その上、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘ３＋Ｔｒｅｇの集団はｉｎ ｖｉｖｏにおいて種々の条件下で、例えば抗原提示およびサイトカイン刺激のある一定の条件下で末梢に誘起され得、そして寛容を誘起し得る（参照：Roncaroloら 2007. Nat Rev Immunol. 7: 585-598）。誘導できるＴｒｅｇのその他のサブセットが報告されており（それにはＴｈ３細胞およびＴｒｌ細胞、およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇが含まれる）、Ｔｈ３細胞はＴＧＦβおよび種々の量のＩＬ‐４およびＩＬ‐１０を生産する（Chenら 1994. Science 265(5176):1237-1240）。Trl細胞はＩＬ‐１０を生産する（Grouxら 1997. Nature 389(6652):737-742）。また、低レベルのＦｏｘｐ３を発現するＣＤ８＋Ｔｒｅｇも報告されている（参照：例えばSmithら 2008. Trends Immunol. 29(7):337-342; Guillonneauら 2010. Curr Opin Organ Transplant 15:751-756; Filaciら 2011. Autoimmunity 44(1):51-57; Picardaら 2011. Immunotherapy 3(4 Suppl): 35-37）。
Ｔｒｅｇを分離し、広げるための多数の方法が当業者には公知であり、例えば以下のものがある。Bruskoら (2008. Immunological Reviews 223:371-390), Gregoriら (2011. Methods Mol Biol.677:31-46), Gregoriら (2007. Methods Mol Biol. 380:83-105), Menoretら 2011. Methods Mol Biol. 677: 63-83), Wang, L. (2010. Methods Mol Biol. 595:403-412), Danielら (2011. Methods Mol Biol. 707:173-185)。
こうして本発明は、リンパ球を、少なくとも約３日間、好適には少なくとも約５日間、本発明のアグリカン特異的抗原提示細胞で刺激することによって多量の抗原特異的リンパ球を生成する手段を提供する。
アグリカン特異的寛容は、Ｂリンパ球（ここではＢ細胞とも言う）にアグリカン抗原をコードする核酸分子を発現させることによって達成することもできる。ここで、核酸分子の発現はＢリンパ球の表面上の抗原またはその操作された形のものの出現に通ずる。
特定の実施態様において、核酸分子はさらにアグリカン抗原に直接、または間接的に（例えば高原のＣ‐末端に隣接して）融合した免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）、または免疫グロブリンの断片（例えば、Ｆｖ、ＦＡｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’)２免疫グロブリン断片、免疫グロブリン重鎖、など）をコードする。このタイプの例証的実施例において、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）は、アグリカン抗原を免疫系に出現させるための担体として用いられる、ここでアグリカン抗原は、免疫グロブリン重鎖骨組のＮ末端に融合して、融合蛋白を形成する。その融合蛋白は、‘活性化’Ｂ細胞において、ヘマトポエチン細胞（例えば骨髄誘導性細胞）またはリンパ性細胞（例えばリポポリサッカリドで刺激されていたＢ細胞芽細胞を含むＢ細胞）を、融合蛋白を生産でき、それによって寛容原性ＡＰＣを生産する核酸分子で変換（形質導入）することができる。アグリカン抗原またはその操作型は、これらのＢ細胞上の、宿主に重要な組織適合性錯体（ＭＨＣ）によってあらわされ、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）融合蛋白の出現および長期ｉｎ ｖｉｖｏ発現のために、寛容に導く。好適には、これらのＢ細胞はＭＨＣクラスIIおよび同時刺激性の分子類（例えば、Ｂ７．１およびＢ７．２）を発現する。これは、ＣＴＬＡ‐４に結合することによってＣＤ２５を発現する調節Ｔ細胞を補充し、トリガーするのに役立つ。このタイプの免疫グロブリン融合は例えば米国特許出願公開第２００２／００４８５６２号に記載され、引例によってここにそのまま組み入れられる。
このタイプの例証的実施例において、例えばＳｃｏｔｔ らによって記載されているように、抗原特異的免疫寛容は、Ｂ細胞中のレトロウイルスによって運ばれる抗原‐Ｉｇ融合蛋白を用いて誘起される（Zambidisら 1996. Proc Natl Acad Sci U S A 93(10):5019-5024; Kangら 1999. Proc Natl Acad Sci U S A 96(15):8609-8614; Agarwalら 2000. Clin Invest 106(2):245-252; El-Amineら 2002. Int Immunol 14(7):761-766; Meloら 2002. J Immunol 168(9):4788-4795; Songら 2004. Gene Ther 11(20):1487-1496; Leiら 2005. Blood 105(12):4865-4870; Xuら 2006. Mol Ther 13(1):42-48; Satputeら 2007. Arthritis Rheum 56(5):1490-1496; Scott, 2010. Haemophilia 16(102):89-94）。
このＢ細胞仲介性遺伝子治療アプローチは、実験的自己免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）（Agarwalら 2000, supra），ＥＡＥ（ミエリン基礎蛋白（ＭＢＰ）のような、またはミエリン稀突起神経膠細胞 糖蛋白質（ＭＯＧ）によって誘起される）（Meloら 2002,supra），および非肥満（ＮＯＤ）糖尿病のマウスモデル（Meloら2002,supra;Songら,2004,supra）のような疾患に成功裡に使用されている。このアプローチは、血友病Ａにおける因子VIIIに対する寛容を誘起するのにも成功し、（骨髄（ＢＭ）移植と組み合わせて）ＥＡＥの治療（Xuら 2006,supra）にも成功している。Ｂ細胞仲介性遺伝子治療は、アジュバント誘起性関節炎（ＡＡ）モデルにも成功裡に用いられている（Sayputeら 2007,suprs）。
融合蛋白は、任意の適切な手段（その融合蛋白を生成し得る核酸分子を、それを必要とする被検体に投与することを含む）によって送達される。特定の実施態様において、その被検体には、核酸分子で変換（形質導入）される造血性またはリンパ性細胞が投与される。
幾つかの実施態様において、アグリカン抗原コーデイング核酸分子を発現するＢリンパ球は、調節性Ｂリンパ球（ここでは「Ｂｒｅｇ」細胞とも言われる）であり、非制限的にＣＤ１ｄｈｉｇｈＣＤ５＋Ｂ細胞サブセットを含み、それは例えばＴｅｄｄｅｒによって開示されたように、ＩＬ‐１０の分泌によってＴ細胞 仲介性炎症性および免疫性反応を調節する（米国特許出願公開２０１１／０１３５６６、これは引例によってここにそのまま組み入れられる）。
３．２．１０．ＭＨＣペプチド複合体の実施態様
本発明は、アグリカン特異的免疫寛容原性を引出すための主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）‐ペプチド複合体の使用も考慮する。これらの複合体は概してアグリカンペプチド（例えばｃｉｔ‐アグリカンペプチド）および抗原結合部位を有する分離した（例えば可溶性の）ＭＨＣ成分を含み、この場合抗原は抗原結合部位と関連している。ＭＨＣ‐ペプチド複合体は、効率的に抗原提示細胞の代わりとなり、自己反応性抗原特異的Ｔリンパ球およびその他の免疫系細胞における不反応性を生ずる。ＭＨＣ成分はクラスＩまたはクラスII分子のいずれかでよい。所望ならば、ＭＨＣ分子の経膜的および／または細胞内ドメインも含まれ得る。そのペプチド抗原とＭＨＣ蛋白の抗原結合部位との関係は、共有結合または非共有結合でよい。
ＭＨＣ分子は任意の適切なプロトコルを用いて精製できる。その例証的実施例は、パパイン処理、３Ｍ ＫＣｌ処理、または洗浄剤処理によって、細胞（例えばリンパ球）を可溶化することを含む。例証的プロトコルにおいて、リンパ球からのＭＨＣ（例えばクラスII)の洗浄剤抽出が行われ、その後にアフィニテイー精製が行われる。洗浄剤はその後透析または選択的結合ビーズ、例えばバイオビーズによって除去できる。あるいは、多数のＭＨＣクラスIおよびクラスII分子の各々のアミノ酸配列が知られており、それらの対応するコーデイング配列がクローン化され、こうしてＭＨＣ蛋白類の組換え産生が可能になる。
アグリカン抗原は概ねペプチド（例えば約８〜１５アミノ酸の長さ）であり、それは当業者には公知の標準的アルゴリズムを用いてＭＨＣ分子であることが予想される。あるいは、アグリカンアミノ酸配列のオーバーラッピング部分に対応するペプチド類（例えば約８〜１５アミノ酸の長さ）を用いることができる。そのペプチド（類）は非シトルリン化またはシトルリン化のどちらでもよい。
上記複合体の要素は当業者に公知の標準的手段によって結合させることができる。抗原ペプチド類は、ＭＨＣ蛋白のポケット部分と、この二成分を混合することによって、非共有結合できる。それらは、たとえばフォト アフィニテイ ラベリングによる標準的方法によって共有結合もできる（参照：Hallら 1985. Biochemistry 24:5702-5711）。
経膜的含有ＭＨＣ分子を含む複合体類は、脂質の単層または二層に挿入された後、便利に投与される。典型的にはリポソーム類がこの目的のために用いられるが、脂質膜のいかなる形、例えば平面脂質膜または細胞（例えば赤血球）の細胞膜なども用いられる。これら複合体もミセルに便利に挿入される。
リポソームは、例えば３．２．６．２章に記載したように、標準的方法によって作られる。しかし、もしも経膜的領域が欠失していれば、その複合体は、ペプチド含有薬として便利に使用されるやり方で投与できる。
ミセルは、当業者には一般的に用いられ、無極性領域を有する分子の溶解性を高める。そしてミセルは当業者には公知の方法によって、ＭＨＣ‐ペプチド複合体類を挿入するために有利に用いられるかも知れない（参照：例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)，これは引例によってここにそのまま組み入れられる）。概して、複合体含有ミセルは、標準的な界面活性剤または洗浄剤を用いて作成される。
ＭＨＣ‐ペプチド複合体の一般的製法は、例えば米国特許出願公開第２００３／００６８３６３号に記載されており、これは引例によってここにそのまま組み入れられる。
３．２．１１．リガンドエピトープ抗原提示系に基づくキメラ構成物
本発明は、アグリカン特異的免疫寛容原性を誘起するためのリガンド エピトープ抗原提示系（Ｌ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．）テクノロジーの使用も考慮している。このテクノロジーは、自己抗原を含む小さいペプチドを、免疫またはＴ細胞結合リガンド（Ｉ／ＴＣＢＬ）に付加し、それを免疫細胞に提示することによって、寛容原性に変換する（Cihakovaら, 2008. Int Immunopharmacol 8:624; Rosenthalら, 1998. Vaccine 17:535-542; Goelら, 2003. Vaccine 21:4410; Goelら, 2005. Front Biosci 966; Zimmermanら, 1996. Vac Res 5:91-102; Zimmermanら, 1996. Vac Res 5:103-13; Zimmermanら, 1985. DNA. Med Virol 15:215-22. Charoenvitら, 2004. Antimicrob Agents Chemother 48:2455; Charoenvitら, 2004. Vaccine 10:2368; および Zimmermanら, 2001. Vaccine 19(32):4750-4759）。Ｉ／ＴＣＢＬｓは概ねＴ細胞に結合することが知られている／予想されている免疫系から誘導される。その例としては、ＭＨＣクラスＩおよびIIの一部、β２‐ミクログロブリンのようなアクセサリー分子の一部、ＬＦＡ‐３の一部、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の部分、およびＩａ＋分子が挙げられる。特定の実施態様において、β２ミクログロブリン（Ｊ）がＩ／ＴＣＢＬとして用いられ、関心とする自己抗原に結合する。このタイプの融合構成物を用いて、コラーゲン誘起性関節炎モデルにおいて、例えばZimmermanら (2010, Int Immunopharmacol 10:412-421)が記載しているように、治療対象の動物の血清中のＩＬ‐１２ｐ７０およびＩＬ‐１０の増加、並びにＩＬ‐１７およびＴＮＦαの減少とともに、疾患の進行を止めるのに成功した。
Ｌ．Ｅ．Ａ．Ｐ．Ｓ．構成物を作る例証的方法は、例えば米国特許第５，６５２，３４２号、および米国特許出願第２０１１／００９８４４４号に開示されており、これらは引例によってここにそのまま組み込まれる。
３．３．細胞ベースの治療または予防
例えば３．２．７章に記載のアグリカン特異的抗原細胞、または例えば３．２．９章に記載のアグリカン特異的ＴまたはＢ調節性リンパ球または寛容原性Ｂリンパ球は、それらだけで、または組み合わせて患者に投与され、アグリカン抗原（そのシトルリン化型も含む）に対する免疫反応を抑制する。これらの細胞をベースとする組成物は冒された、または素因のある被検体（早期ＲＡの患者およびＲＡの発生リスクのある人を含む）における関節損傷を治療または予防するために有用であり、好適に、疾患が進行して慢性的および衰弱型のＲＡになる前に治療または予防する。本発明の細胞は、アグリカン抗原に抗原特異的寛容原性反応を生起する任意の手段（例えば注射）によって患者に導入することができる。それら細胞は、患者から（たとえば自己組織の細胞）または、患者とはＭＨＣがマッチした、またはマッチしない（すなわち同種異型の）人、または人々から誘導できる。一般的には自己細胞が、そのソース細胞を提供した患者に注射され戻される。注射部位は皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、静脈内、またはリンパ系内でよい。これら細胞は、すでに関節損傷に罹っている患者（早期ＲＡ患者およびＲＡ発生リスクのある人々を含む）または関節損傷の素因のある人々に、患者の臨床的改善を起こすか、関節損傷または関節損傷の症状を予防するのに十分な回数を投与することができる。治療または予防の必要がある患者に注射する細胞の数は、特にアグリカン抗原または抗原類および個人のサイズによって変動し得る。この細胞数は、例えば約１０３〜１０１１個、そして通常は約１０５〜１０７個である（細胞としては例えば、血液、ＰＭＢＣ、または精製樹状細胞、Ｔリンパ球、造血またはリンパ系細胞、Ｂリンパ球など）。１回または数回（２、３、４または５回）の細胞投与が行われ、細胞の数およびパターンは治療医によって選択される。細胞は薬学的に容認される担体、細胞にも人体にも無毒である担体を用いて投与される。このような担体は細胞が増殖する増殖培地であってもよいし、または燐酸塩緩衝塩水のような任意の適切な緩衝培地でもよい。細胞はそれ単独で、または望まれない免疫反応の治療または予防のために当業者に公知のその他の治療薬、たとえば非制限的に、グルココルチコイド、メソトレキセート、Ｄ‐ペニシラミン、ヒドロキシクロロキン、金塩、スルファサラチン、ＴＮＦαまたはＩＬ‐１インヒビター、および／またはその他の形の特定の免疫療法と組み合わせた補助的治療として投与できる。
３．４．薬学的組成物
本発明によると、例えば３．２．１章に記載されているようなアグリカン抗原類、例えば３．２．２章に記載されているようなアグリカンＡＰＬ、例えば ３．２．３章に記載されているようなＮＦ‐κＢ、例えば３．２．４章に記載されているようなｍＴＯＲ、例えば３．２．５章に記載されているようなＳｙｋインヒビター類、例えば３．２．６章に記載されているような免疫調節粒子、例えば３．２．７章に記載されているような抗原提示細胞、例えば３．２．９章に記載されているような調節性ＴまたはＢリンパ球または免疫寛容原性Ｂリンパ球、例えば３．２．１０章に記載されているようなＭＨＣ‐ペプチド複合体類、および、例えば３．２．１１章に記載されているようなキメラ構成物（ここではまとめて「免疫モジュレータとも言われる」）は、アグリカン抗原およびそのシトルリン化型に対する免疫反応を抑制するための組成物および方法において有用である。そして早期ＲＡ患者、およびＲＡ発生リスクのある人々を含む、冒された、または素因のある人々における関節損傷を治療または予防するために特に有用である。
本発明の免疫モジュレータ含有組成物は一般的には薬学的組成物の形であり、それは薬学的に容認される担体または希釈物を含むことができる。治療している特定の条件によって、免疫モジュレータが処方され、全身的、局所的または局部限定的に投与できる。処方および投与のための技術は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences,」 Mack Publishing Co., Easton, Pa., 最終版 に見出すことができる。適切な経路とは、例えば、経口、直腸、経粘膜、または腸内投与；または筋肉内、皮下、骨髄内注射を含む腸管外投与、並びに硬膜下腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口投与を含む。注射のためには、本発明の免疫モジュレータは水溶液で、より好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的塩緩衝液で処方される。経粘膜投与の場合、浸透すべきバリアに適した浸透物質がその処方に用いられる。このような浸透物質は一般に当業者には公知である。筋肉内および皮下注射は例えば免疫原性組成物、ワクチン類およびＤＮＡワクチンの投与に適している。
免疫モジュレータは、当業者に公知の薬学的に容認される担体の、経口投与に適した量を使用して容易に処方できる。このような担体は、治療を受ける患者が経口摂取するために、本発明の化合物を錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などのような投与型に処方することを可能にする。これらの担体は、砂糖、澱粉、セルロース、およびその誘導体、麦芽、ゲラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール類、アルギン酸、燐酸塩緩衝溶液、乳化剤、等張食塩水、およびパイロジェン除去水、から選択できる。
非経口投与のための薬剤処方は、水溶性の形態の活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物類の懸濁液が適した油状注射懸濁液として調製される。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ごま油、または合成脂肪酸エステル類、例えばエチルオレエートまたはトリグリセリド類など、またはリポソーム類を含む。水性注射用懸濁液は、その懸濁液の粘度を高める物質類、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランなどを含める。任意に、その懸濁液は安定剤またはその化合物の溶解性を高める適切な作用物質も含み、非常に濃い溶液の調製を可能にすることができる。
経口的使用のための薬学的調製物は、活性化合物を固体腑形剤と合一し、生成した混合物を任意にすりつぶし、所望ならば適した助剤を加えた後、顆粒混合物を操作して、錠剤または糖衣錠のコアを得る。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトール、を含む砂糖のようなフィラー；例えばトウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、ポテト澱粉、ゲラチン、トラガントゴム、メチル セルロース、ヒドロキシプロピルメチル‐セルロース、カルボキシメチルセルロース ナトリウム、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調合物である。もし所望ならば、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を加えることができる。このような組成物は、薬剤学のいずれかの方法によって調製することができるが、全ての方法は、１つ以上の必要な成分を構成する担体と共に、上記のような１種類以上の免疫モジュレータと関係する段階を含む。概して、本発明の薬剤組成物は、それ自体公知の方法で、例えば一般的混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作成、細粒化、乳化、カプセル化、エントラッピングまたは凍結乾燥プロセスなどの手段によって製造できる。
糖衣錠のコアは適切なコーティングによって作られる。この目的のために濃縮砂糖溶液が用いられる。それは任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル ゲル、ポリエチレングリコール、または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒、または溶媒混合物を含む。確認のため、または活性化合物の量の種々の組み合わせを特徴づけるために、色素材料または顔料をその錠剤または糖衣錠コーティングに加えてもよい。
経口的に使用できる医薬品は、ゼラチンから作られたプッシュ‐フィット カプセル、並びに、ゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールなど、から作られた柔らかい密封カプセルを含む。プッシュ‐フィットカプセルは、活性成分を、ラクトースのようなフィラー、澱粉のような結合剤、タルクまたはマグネシウム ステアレートのような潤滑剤および任意に安定剤と混合して含むことができる。ソフトカプセルでは、活性成分を脂肪油、液体パラフィンまたはポリエチレングリコール類のような適当な液体に溶解または懸濁させてもよく、さらに安定剤を加えてもよい。
本発明の薬剤の投与型は注射またはこの目的のために特に設計された放出制御装置の移植、または付加的にこのやりかたで働くように変更されたその他の形のインプラントを含む。本発明の免疫モジュレータの制御された放出は、それを例えばアクリル樹脂、ワックス、高次脂肪族アルコール、ポリラクテックおよびポリグリコール酸およびある種のセルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルメチル セルロースを含む疎水性ポリマー類でコーティングすることによって行われる。さらに、制御された放出は、その他のポリマーマトリックス、リポソーム類またはミクロスフェア類によって達成できる。
本発明の免疫モジュレータは、鼻または肺吸入エアロゾルまたはネブライザーのための溶液、または吸入のための微粒子粉末として単独で、またはラクトースのような不活性担体またはその他の薬学的に容認される腑形剤と共に呼吸器官に投与することもできる。本発明の幾つかの特定の実施態様において、処方物の粒子は直径５０μｍ未満が有利であり、好適には１０μｍ未満である。
幾つかの粒子の実施態様において、免疫モジュレータは、米国特許第５，７８３，５６７号（Ｐａｎｇａｅａ）に記載されているように、ＡＰＣによる活発な取り込みによって、食作用などにより、投与される。これらの細胞による食作用は、粒子サイズを一般的には約２０μｍ以下、より好ましくは約１１μｍ以下に維持することによって改善されるであろう。
特定の粒子の実施態様において、粒子型の免疫モジュレータは、もしも肝臓または脾臓を含む細網内皮細胞系（ＲＥＳ）の食細胞による取り込みが所望ならば、直接血流に（すなわち静脈または動脈内注射または注入によって）運搬される。あるいは皮下注射を目標にし、流れ出すリンパ節の食作用ＡＰＣによって取り込まれる。粒子は例えば衝撃的またはマイクロニードル運搬を用いて皮膚内に（すなわち樹状細胞およびランゲルハンス細胞のような皮膚のＡＰＣに）導入することもできる。例証的な粒子仲介性の送達技術は、担体粒子を標的細胞の方へ進めるために爆発性、電気、またはガス放出送達を含める。（例えば米国特許第４９４５０５０号、第５１２０６５７号、第５１４９６５５号、および第５６３０７９６号に記載されている）。マイクロニードル送達の非制限的例は、国際公開ＷＯ第２００５／０６９７３６号およびＷＯ第２００５／０７２６３０号および米国特許第６５０３２３１号および第５４５７０４１号に開示されている。
その他の特定の粒子実施態様において、粒子送達の経路は例えば経口で胃腸管に至る。あるいは、粒子は肺のような器官に導入することができる（例えば粉末化微粒子の吸入、またはその微粒子を含む霧状の、またはエアロゾル化した溶液の吸入による）。その際それら粒子は、肺胞のマクロファージによって取り込まれる。または経鼻的に、または頬内に投与してもよい。ひとたび食細胞ＡＰＣがその粒子を食作用によって取り込むと、ＮＦ‐κＢインヒビターおよび任意にアグリカン抗原は細胞の内部に放出される。
粒子送達のために適した経路は、例えば口、直腸、経膜、または腸内投与である。また、筋肉内、皮下、骨髄内注射を含む非経口投与、並びに鞘内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を含む非経口投与でもよい。注射では、粒子は水溶液、適切には生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液または生理的食塩緩衝液などで処方される。経粘膜投与では、浸透するべきバリアに適した浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は概ね当業者には公知である。
粒子の非経口投与のための薬剤処方は、水溶性型の粒子の水溶液を含む。それに加えて粒子の懸濁液も、適した油性注射用懸濁液として調製される。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、または合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエートまたはトリグリセリドなどを含める。水性注射用懸濁液はその懸濁液の粘度を高める物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含む。さらにその懸濁液は任意で、化合物の溶解度を高める安定剤または作用物質を含めて、非常に濃い溶液を製造できるようしてもよい。
インヒビター（例えばＮＦ‐κＢインヒビター）および抗原の粒子性送達のための例証的な方法は、米国特許出願公開第２０１００１５１０００号に記載されている。
本発明の免疫モジュレータ（例えばインヒビター（類）、抗原、ＡＰＣｓ、リンパ球、融合蛋白、粒子など）は、薬剤的に適合する対イオンとの塩として提供されてもよい。薬剤的に適合する塩は、非制限的に塩化水素酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、などを含む多くの酸で形成される。塩類は水性またはその他のプロトン性溶媒（それらは遊離塩基型に相当する）により良く溶解する傾向がある。
本発明に適した薬剤組成物は、免疫モジュレータが、それらの意図する目的を達するために十分な量含まれる組成物である。患者に投与される免疫モジュレータの量は、被検体における臨床的改善を得るために十分な、または関節損傷の発生リスクのある被検体（ＲＡ発生のリスクのある被検体も含む）において、関節損傷、または関節損傷の症状を予防するのに十分な量でなければならない。投与される免疫モジュレータ（類）の量または投与頻度は治療すべき被検体（その投与法、年齢、性別、体重および全身的健康状態）に依存する。これに関しては、投与する免疫モジュレータの正確な量は医者の判断による。関節損傷の治療または予防において投与される免疫モジュレータの有効量を決める際に、医者は、炎症、炎症性サイトカインレベル、リンパ球の増殖、細胞融解性Ｔリンパ球活性およびアグリカン特異的‐調節性Ｔリンパ球機能を評価する。いかなる場合においても、熟練せる当業者は、免疫モジュレータ（類）の適切な量を容易に決めることができる。
本発明の方法に用いられるいかなる免疫モジュレータも、治療的に有効な量は最初に細胞培養アッセイから推定できる。例えば、動物モデルにおいて、細胞培養で決められたＩＣ５０を含む循環濃度範囲に達するような量が処方できる（例えば、ＮＦ‐κＢ活性またはｍＴＯＲ活性またはＳｙｋ活性における最大で半分の減少、アグリカン特異的抗原‐提示細胞の最大増加など）。このような情報を利用して、ヒトにおける有用な量をより正確に決定することができる。
このような免疫モジュレータの毒性および治療効果は細胞培養または実験的動物における標準的薬学的操作法によって決めることができ、ＬＤ５０（集団の５０％が死に至る量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療効果を発揮する量）が決められる。毒性と治療効果との用量比は、治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０としてあらわされる。大きい治療指数を示す免疫モジュレータが好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用するための用量範囲を処方するために用いられる。このような免疫モジュレータの投与量は、毒性が小さいかまたは無毒で、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。投与量は、使用する投与型、および利用する投与経路によって、この範囲内で変化させることができる。正確な処方、投与経路、および投与量は、個々の医者によって、患者の状態から決められる。（参照：例えばFinglら, 1975, in 「The Pharmacological Basis of Therapeutics」, Ch. 1 p1）。
投与量および間隔を個々に調節して、免疫反応の抑制またはアグリカン抗原に対する免疫寛容原性を高めるのに十分な、免疫モジュレータの血漿中レベルをもたらすことができる。全身性投与のための本発明の非細胞性免疫モジュレータの通常の患者投与量は、０．０００１〜２０００ｍｇ／日、一般には０．０００１〜２５０ｍｇ／日、および典型的には０．００１〜１５０ｍｇ／日である。
本発明の組成物は、幾つかの要因（例えば、治療すべき状態（例えばＲＡを含む関節損傷）の厳しさ、病気の再発があるかどうか、などを含む幾つかの要因）によって、数時間、数日、数週間、数ヶ月にわたって投与されてよい。その投与は数時間、数日、数週間、数ヶ月にわたって一定（例えば一定の注入）であってもよい。あるいは、その投与は間欠的で、例えば免疫モジュレータが１日一回、数日間、１時間に一回数時間、または適切と思われるその他の任意のスケジュールで投与してもよい。特定の実施態様において、本発明の免疫モジュレータは、規則的に、例えば毎週、二週間ごと、一月ごと、年４回、半年に１回、または毎年、下記の経路の一つによって：皮内、筋肉内、または皮下、並びに皮膚経皮的または鼻運搬経路の一つによって、体重１キログラムあたり１〜１００、通常は１０〜５０マイクログラム／キログラムの量が投与される。
３．５ 抗原特異的免疫寛容原性の試験方法
エフェクターリンパ球（特にエフェクターＴリンパ球）誘導によるアグリカン抗原に対する寛容を示す効率を、その抗原に対する免疫反応をアッセイすることによって測定した。そのアッセイは、非制限的に、抗原特異的細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を標的として、例えばアグリカン特異的抗原提示細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、エフェクターＴリンパ球細胞溶解性活性をアッセイし；アグリカン特異的Ｔリンパ球増殖、アポトーシス、またはサイトカイン産生（参照：例えばVollenweiderとGroscurth, 1992. J. Immunol. Meth. 149:133-135）、エフェクターＴ細胞の抗原特異的抑制をアッセイし、その抗原に対するＢ細胞抗体反応を、例えばＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定し；サイトカイン プロフィールを調べ；または特異的抗原に対する皮膚の反応性のテストによって遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を測定する（参照：例えばChangら 1993, Cancer Res. 53, 1043-1050）。
幾つかの実施態様において、アグリカン特異的調節性Ｔリンパ球によって誘起される抗原特異的寛容／アネルギーは、その抗原特異的免疫エフェクター細胞（例えば抗原特異的エフェクターＴおよび／またはＢリンパ球）がその後のアグリカン抗原による再刺激に反応できないことを反映している。これらの抗原特異的調節性リンパ球は、ＩＬ‐１０またはＩＦＮ‐γのようなサイトカイン類を抗原特異的なやり方で産生することによって特徴づけられる。ＩＬ‐１０およびＩＦＮ‐γは、ヒトにおいて、ＣＤ25−ＣＤ１２７ｄｉｍＣＤ４＋に誘導された調節性Ｔ細胞によって産生される強力な免疫抑制特性を有するサイトカインである。こうして、幾つかの実施態様において、アネルギーＴリンパ球の存在は、細胞内染色のような、当業者には公知の標準的アッセイ（Haringerら, 2009. J Exp Med 206(5):1009-1017）を用いてサイトカイン産生をアッセイすることによって確認できる。あるいは、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３(それらはＣＤ１２７ｄｉｍである)を発現するＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の比率には変化があってもよい。（Fazekas de St Groth Bら, 2011. Methods Mol Biol 707:263-79）。
代替的に、またはそれに加えて、抗原特異的寛容／アネルギーは、治療患者に免疫モジュレータ／寛容原性組成物を投与後少なくとも約１ヶ月、投与前のベースラインに比較して、関節損傷の軽減または治癒、またはそのサインおよびまたは構造的損傷を含む関節損傷の進行のスローダウンを測定するＸ線テストを行うことによって間接的に決定できる。その際、投与される免疫モジュレータ／寛容原性組成物の量は、関節損傷の軽減または治癒、または関節損傷（そのサイン、症状および／または構造的損傷を含む）の進行のスローダウンに達するために有効な量であり、その被検体が関節損傷の治療に成功していることを示す量である。特定の実施態様において、免疫モジュレータ／寛容原性組成物の投与後のＸ線テストは、その免疫モジュレータ／寛容原性組成物の投与後、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約１０週、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約２４週、少なくとも約６ヶ月、または少なくとも約５２週に行われる。このタイプの例証的実施例において、そのテストは全体的に改変されたシャープスコアを測定するものである。
本発明の理解を容易にし、実際的効果に繋げるために、特に好ましい実施態様が次の非制限的実施例によってここに記載される。
〔実施例〕
〔実施例１〕
Ｔ細胞は増殖性は低いが、シトルリン化自己抗原性ペプチドに反応してサイトカイン類を産生する
シトルリン化または修飾されていないペプチド抗原類は、フィブリノーゲン、ビメンチン、コラーゲン、およびアグリカン蛋白質配列から合成され、これらの確認は、Ｐ４にシトルリンを位置づける分子モデルにおけるＲＡ‐関連ＤＲ分子に対する結合能力の予測、またはＨＬＡ‐ＤＲ４‐ＩＥ‐トランスジェニックマウスにおけるこれまでの研究（表５）による（Hidaら, 2004. J. Autoimmun. 23:141-150; Hillら, 2008. J. Exp. Med. 205:967-979; von Delwigら, 2010. Arthritis Rheum. 62:143-149）。
Figure 2015512371
全体として２１名のＳＥ＋ＲＡ患者および６名のＳＥ＋健康対照者を試験した。４名のＲＡ患者を除く全てがＡＣＰＡ＋であった（表６）。ＲＡ患者の４３％が非喫煙者であり、３８％が過去に喫煙経験があり、１９％が現在喫煙者である。１名の健康対照者は現在の喫煙者であり、２名にＲＡの家族歴がある。種々の濃度のシトルリン化された、または未修飾のペプチド抗原に対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖性反応を、ＳＥ＋ＲＡ患者およびＳＥ＋健康対照者から分析した。ペプチド抗原および破傷風毒素に対する増殖性反応をＳＩとしてあらわした。ＳＩ＞２は有意であると考えた。シトルリン化および未修飾ペプチドに対する平均増殖性ＳＩは概ねＲＡ患者および健康対照者では１と２の間であり、各症例において、破傷風毒素に対する反応より低かった（図１）。シトルリン化アグリカンペプチドに反応した増殖性ＳＩは、ＲＡ患者の天然アグリカンペプチドに対する反応よりも有意に高かった（図１）。破傷風毒素に対する増殖性反応は、ＲＡを健康対照者のＰＢＭＣと比較した際、有意に低かった。
最初の実験において、本発明者らは、ペプチド反応をウシ胎仔血清でなくヒト血清の存在下でアッセイした場合に、バックグラウンド サイトカイン分泌および増殖反応は一般的に低いことを確認した。また、Ｈｅｔｅｒｏ Ｂｌｏｃｋを加えて、ＥＬＩＺＡ反応においてＲＦが捕捉、または検出抗体と結合するのを阻止するためにリウマリ性因子（ＲＦ）タイターを＞１００Ｕ／ｍＬとした条件下において、１０％の健康なまたは自己または同種異型のＲＡドナー血清を加えた場合、サイトカイン産生には差がなかった（Toddら, 2011. Arthritis & Rheumatism 63:894-903）。ペプチド刺激がない場合、ＲＡ患者のＰＢＭＣは、ペプチドが存在しない場合のその他のサイトカイン類に比べて有意により高い濃度のＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐６を分泌した（図２Ａ）。正味サイトカイン分泌は、［ペプチドで刺激した際に分泌するサイトカイン］−［ペプチドの存在しない場合に分泌したサイトカイン］として評価した。ＩＬ‐６分泌は、測定したサイトカイン類の中では最も高く、３０μｇ／ｍＬシトルリン化アグリカンに反応して６０ｎｇ／ｍＬもの正味産生であった。天然エピトープの、共通エピトープＨＬＡ‐ＤＲ対立遺伝子への結合の欠如と一致して（Snirら, 2011, supra），ＲＡ患者は天然アグリカンペプチドよりもシトルリン化アグリカンペプチドに反応して、有意により多量のＩＬ‐６、ＴＮＦ、およびＩＬ１０を産生した（図２Ｂ、図３Ｂ）。ＩＬ‐１７および或る程度のＩＦＮ‐γが数種のシトルリン化ペプチドに反応して分泌したが、個々間でかなりの変動があり、その差のいずれも統計的に有意ではなかった（図３）。ＩＬ‐２およびＩＬ‐４反応は概ね低い。ＲＡ患者と健康対照者を比較した場合、ＲＡ患者はシトルリン化アグリカンに反応して、健康対照者に比べて有意に多いＩＬ‐１０およびＴＮＦを分泌した（ｐ＜０．０５）、そしてシトルリン化アグリカンに反応した場合（ｐ＝０．０６５）と，シトルリン化フィブリノーゲンに反応した場合（ｐ＝０．０８）とでＩＬ‐１７に同様な傾向があった。天然自己ペプチドの安定的ＨＬＡ‐ＤＲ結合に欠ける場合、本発明者らは、対応する天然ペプチド類に対する反応の平均、および２ＳＤ高い閾値よりも大きいシトルリン化ペプチド類に対するポジテイブな反応を確認した（シトルリン化ビメンチンの反応は、天然ビメンチンに対する反応が測定されていなかったため、評価することができなかった）。ＳＥ＋健康対照者と比較した場合，ＳＥ＋ＲＡ患者のシトルリン化ペプチド反応は、サイトカイン類のより広いアレイを生成した。注目すべきは、各シトルリン化ペプチドに対して陽性反応を有するＲＡ患者と健康対照者のパーセンテージをプロットした場合、調節性サイトカインＩＬ‐１０およびＩＦＮ‐γが、被検エピトープ類に対してＲＡ患者にのみ産生したことである（図４）。
〔実施例２〕
ＲＡ患者のＩＬ‐６反応は疾患期間の長さによって変化する。
個々のＲＡ患者およびＳＥ＋健康対照者のシトルリン化ペプチド反応パターンををより良く理解するために、この研究の各個人について、各ペプチドに対するＩＬ‐６用量反応曲線をプロットした。４／６健康対照者からのＰＢＭＣは、用量依存的に、シトルリン化アグリカンに対してＩＬ‐６を分泌し、３／６はシトルリン化フィブリノーゲンに反応してＩＬ‐６を分泌した。上記のように、陽性反応のための同じ閾値を用いると、１７名のＲＡ患者のＰＢＭＣ反応のうち、６名がどのエピトープにも反応せずにＩＬ‐６を分泌し、８名がシトルリン化アグリカンのみに、０名がシトルリン化フィブリノーゲンに、０名がシトルリン化コラーゲンII型のみに、そして３名が複数のシトルリン化エピトープ類に反応した。こうして、ＩＬ‐６反応は、ＲＡ患者および健康対照者の両方で最も高く、シトルリン化アグリカンに対して最も頻繁に認められた。これは試験した中で最も免疫原性的エピトープであることを示唆するものである。複数のエピトープ類に対するＩＬ‐６反応は、５年以上前にＲＡと診断された患者のなかで、より頻繁に起きた（図５Ｂ）。
〔実施例３〕
エフェクターメモリＣＤ４＋Ｔ細胞はシトルリン化ペプチドに反応してサイトカイン類を分泌する。
ＩＬ‐６は、ＲＡにおいては重要なサイトカインであり、これはＰＢＭＣをＴ細胞または抗原提示細胞どちらかによって刺激したときに産生する。シトルリン化ペプチドによって刺激されたＰＢＭＣの上澄液に分泌されたサイトカインの起原を確認するために、ＲＡ ＰＢＭＣをシトルリン化または天然ペプチドと共に５日間インキュベートした。その際、細胞表面マーカー類の分析と共に細胞内サイトカイン染色をする前に、最後の１８時間についてはＢｒｅｆｅｌｄｉｎ‐Ａを添加した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、シトルリン化アグリカンまたはフィブリノーゲンと共にインキュベートしたとき、培地のみにおけるインキュベーションに比べて、より多くの細胞内ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐６を産生する（図６Ａ、Ｂ）。フルオレッセンス‐マイナス‐ワン（ＦＭＯ）染色は、記載されているように、陽性染色のための閾値を決めるゲーテイング戦略を示す（Herzenbergら, 2006. Nat Immunol 7(7):681-685）（図６Ｃ）。細胞内サイトカイン染色はＣＤ４−ＣＤ２８−細胞によるこれらのアッセイには観察されず、その大部分は抗原提示細胞を示す（図６Ｄ）。分化／老化したＣＤ４５ＲＯ−メモリー細胞は、ＣＤ４５ＲＡを再発現し、また、ＣＤ２７およびＣＤ２８の喪失によって特徴づけられることが示されている（Wengら, 2009. Trends Immunol 30(7):306-312）。健康対照者において、ＣＤ２８−細胞は低い割合のＣＤ４＋Ｔ細胞のみを含み、サイトカイン分泌細胞は専らＣＤ４＋ＣＤ２８＋であった。ＣＤ２８−細胞は、すべてではないが若干のＲＡ患者において、ＣＤ４＋ＰＢＴ細胞のなかではより豊富であった。ＣＤ４＋ＣＤ２８−Ｔ細胞が存在する場合、シトルリン化ペプチドに反応して、ＩＬ‐６およびＩＦＮ‐γが、ＣＤ２８−およびＣＤ２８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の両方によって分泌される。本発明者らが以前、上澄液の分析において認めたように、これらの培養で高いバックグラウンド サイトカイン分泌が認められた（図２Ａおよび６Ａ）。ＩＦＮ‐γ＋ＣＤ４＋およびＩＬ‐６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＯ−細胞の両方を含んでいた（図６Ｅ）。ＣＸＣＲ５＋小胞性ヘルパーＴ細胞はシトルリン化ペプチドに反応してＩＬ‐６またはＩＦＮ‐γを発現しなかった。
実施例１‐３の検討
本発明者はここで、ＩＬ‐６、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐１０およびＴＮＦを含む炎症性および調節性サイトカイン類が、シトルリン化自己エピトープに反応したＳＥ＋ＲＡ患者のＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生することを示した。上記シトルリン化自己エピトープのなかではシトルリン化アグリカンが最も免疫原性であった。これらのサイトカイン反応は、ペプチド特異的Ｔ細胞増殖反応が弱いにもかかわらず観察された。ＳＥ＋健康対照者もシトルリン化アグリカンおよびシトルリン化フィブリノーゲンに反応してサイトカインを産生した。このようなＴ細胞反応は必ずしも原因としてＲＡに関係してるわけでなく、むしろそれらはＡＣＰＡが存在しない場合でもシトルリン化自己ペプチドに向かうＳＥ＋個人に存在する自己反応性を証明するものである。しかし、シトルリン化自己エピトープに対するサイトカインの反応は、ＲＡ患者では健康な対象者よりも多様であった。実際ＲＡ患者だけがこれらのエピトープに対し反応して調節性サイトカイン類ＩＬ‐１０およびＩＦＮ‐γを分泌した（Haringerら, 2009. J Exp Med 206(5):1009-1017）。ＰＢおよび滑液Ｔ細胞によるＩＦＮ‐γ産生は、十分記載されており（Steinerら, 1999. Rheumatology 38(3):202-213）、そしてＩＦＮ調節された遺伝子は、関節痛を有するＡＣＰＡ＋患者におけるＲＡ発生を予想することが証明された（van Baarsenら, 2010. Arthritis & Rheumatism 62(3):694-704）。細胞内染色によって、本発明者らは、ペプチド刺激の少なくとも５日後に試験した際、これらの培養液に、ＣＤ４−抗原提示細胞によってではなく、メモリＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ‐６およびＩＦＮ‐γ産生を証明した。これらのデータは、ＣＤ４＋Ｔ細胞はサイトカインを産生できるが、単球、Ｂ細胞、及び樹状細胞のようなＣＤ４−抗原提示細胞が培養中にこれらのサイトカイン（これらは上澄液に分泌される）を産生する可能性も排除しないことを示している。ＩＬ‐６反応は、シトルリン化ペプチドに反応して用量依存的に増加した。細胞内サイトカイン染色は、メモリＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型と一致した広いサイトカイン反応プロフィールを確認した。
ＲＡにおける自己ペプチドおよび破傷風毒素抗原に対して自己反応性Ｔ細胞によってあらわされる低い増殖反応には、種々のメカニズムが貢献し得る。例えば、多くの研究が、Ｔ細胞レセプタ‐ＣＤ３複合体によりＲＡ Ｔ細胞のシグナルが低くなるとしている（Emeryら, 1984. Clin. Exp. Immunol. 57:123-129; Seitzら, 1988. Rheumatol. Int. 8:189-196; Allenら, 1995. Eur. J. Immunol. 25:1547-1554; Thomasら, 1992. Arthritis Rheum. 35:1455-1465; Bergら, 2000. Arthritis Res. 2:75-84; Mauriceら, 1997. J. Immunol. 159:2973-2978; Bergら, 2000. Clin. Exp. Immunol. 120:174-182）。ＩＬ‐２は、調節性Ｔ細胞によって、および活性化エフェクターメモリＴ細胞によって発現される高活性ＣＤ２５レセプタに結合することによって、速やかに消費される可能性がある。これは組織培養におけるＴ細胞増殖のためにＩＬ‐２を使用できる可能性を制限し得る（Wolfら, 2001. Eur. J. Immunol. 31:1637-1645; Ishimaruら, 2006. Nat. Immunol. 7:763-772）。さらに、自己反応性Ｔ細胞は、ここに証明されたように、調節性細胞およびサイトカイン類の影響を受ける（Bergら, 2001. Ann. Rheum. Dis. 60:133-139; van Amelsfortら, 2004. Arthritis Rheum. 50:2775-2785）。他方、エフェクターメモリー細胞は高レベルの炎症性および調節性サイトカインを産生し、サイトカイン産生は、ヒトおよびマウスの両方で、高度に分化した自己反応性エフェクターメモリーＴ細胞により効率的につながる（Garcia de Tenaら, 2006. J. Clin. Immunol. 26:233-242; Nankiら, 2000. Arthritis Res. 2:415-423; Moritaら, 1998. Arthritis Rheum. 41:1669-1676）。
炎症性サイトカインＩＬ‐６はＢ細胞抗体産生を刺激し、ＲＡの病因に重要な役割を演ずる（Assierら, 2010. Joint Bone Spine 77:532-536）。ＲＡ患者において、細胞内ＩＬ‐６およびＩＦＮ‐γはＣＤ２８＋およびＣＤ２８−およびＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＯ−ＰＢ ＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生された。本研究において、ＲＡ Ｔ細胞は、シトルリン化ペプチドに応じて、増殖性が低いものの良好なサイトカイン反応が得られた。過去の文献においてもこれに一致して、健康ドナーからのＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｄｉｍＣＤ２７メモリーＴ細胞は、増殖は少ないものの、ミトゲンに反応して多量のＩＬ‐４およびＩＬ‐１０を産生し、また、粘液グロブリン産生のための有効なＢ細胞ヘルプを与えることが示されている（Tortorellaら, 1995. J. Immunol. 155:149-162）。対照的に、Ｉｎ ｖｉｖｏリンパ性組織で抗体産生を促進することが示されている典型的ＣＸＣＲ５＋小胞性ヘルパーＴ細胞（Chevalierら, 2011. J Immunol 186:5556-5568）は、シトルリン化ペプチド類に反応したサイトカインを発現しなかった。興味深いことに、ＣＤ２８−Ｔ細胞がＲＡ患者のＰＢに存在した場合、それらもシトルリン化ペプチドに反応してサイトカインを産生した。ＣＤ２８−Ｔ細胞は滑液環境において重要なエフェクターメモリ増幅反応をあらわし、調節性Ｔ細胞による抑制に、より強く抵抗することが示されている（Wengら, 2009. Trends Immunol. 30:306-312; Thewissenら, 2007. J. Immunol 179:6514-6523）。合わせて、ここに示したデータは、種々のシトルリン化自己ペプチド及びＢ細胞のためのポテンシャルと反応するエフェクターメモリＴ細胞が、末梢血の循環を助け、そしてＳＥ＋個々人の滑膜液中に存在する、という仮説を支持する。
ＲＡ患者におけるこれまでの研究は、単一のシトルリン化ペプチド特異性に対する ＰＢ ＣＤ４＋Ｔ細胞を分析した。ＲＡ患者ではシトルリン化アグリカン８４‐１０３に対する増殖性及びＩＬ‐１７ＣＤ４＋Ｔ細胞反応がみられたが、健康な対照者では示されなかった。これはこのシトルリン化アグリカンエピトープの免疫原性を証明するものである（Delwigら, 2010. Arthritis Rheum 62(1):143-149）。未修飾のアグリカンエピトープは、アグリカン／プロテオグリカンで免疫したＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅにおいて免疫ドミナントである（Buzasら, 2005. Cell Immunol 235(2):98-108）。このシトルリン化アグリカンペプチドは本研究においても最も免疫原性な（反応者の頻度が最も高く、ＩＬ‐６反応がもっとも高い）エピトープであった。しかしながら、Ｂｕｚaｓの研究は、早期ＲＡと、長期持続性のＲＡ患者とを比較しておらず、アグリカン以外のいかなる抗原に対する宿主免疫反応も研究していなかった。
本研究者らは、長期ＲＡ患者において、シトルリン化フィブリノーゲン‐α７９‐９１に反応して、確かなサイトカイン産生が発現することを発見した。これは、シトルリン化ヒトフィブリノーゲンで免疫したＨＬＡ‐ＤＲ４‐ＩＥトランスジェニックマウスにおける免疫ドミナント エピトープであることが示されている（Hillら, 2008. J. Exp. Med. 205:967-979）。シトルリン化ビメンチン６６‐７８エピトープで刺激すると、Ｓｎｉｒら（2011,supra）の報告と同様に、本研究では非常に弱いサイトカイン反応が生じた。Ｓｎｉｒらは、シトルリン化ビメンチン５９‐７８と共にインキュベートした場合、ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０４０１＋ＲＡ患者Ｔ細胞が多数のサイトカイン類を産生するが、６６‐７８とインキュベートした場合には産生しないことを発見した。Ｓｎｉｒらの研究において、シトルリン化ビメンチン５９‐７８に反応したＣＤ１５４＋ＣＤ４＋ＲＡ患者のＴ細胞の少部分によって、ＩＮＦ‐γおよびＴＮＦが細胞内に発現したが、天然ビメンチン５９‐７８を使用した場合には、発現しなかった。細胞内サイトカインのためのＴ細胞染色の割合は本研究のそれより遥かに低かった。本研究における発明者らは、抗原刺激後５日間、第二の再刺激をすることなく染色を行った。最初の５日間、ペプチドと共に培養した後、ペプチドによる再刺激によって、アネルギーが誘導された可能性がある。またはそれらのエフェクターメモリー表現型（Di Mitriら 2011. 「Reversible Senescence in Human CD4+CD45RA+CD27- Memory T Cells.」 J. Immunol）を仮定すると、ほとんどのＴ細胞は、長いｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後にＣＤ１５４を発現することができなかった可能性がある。この研究と同様に、Ｓｎｉｒら（2011,supra）は、Ｄｅｌｗｉｇら（2010,supra）とは違って、強い増殖性またはＩＬ‐１７Ａ反応を認めなかった。サイトカイン分泌における差は、本研究には健康な血清またはＨｅｔｅｒｏ Ｂｌｏｃｋプラス自己血清が含まれていることに関係する可能性がある（Toddら, 2011. Arthritis & Rheumatism 63:894-903）。最後に、８４‐８８の疎水性アミノ酸があることで、シトルリン化アグリカンペプチドは水性培地に比較的溶け難く、それも異なる研究所において抗原の純度、濃度及び細胞の取り込みに影響した可能性がある。
本発明者らはＳＥ＋ＲＡ患者（ＡＣＰＡ＋であるかどうかは問わない）におけるシトルリン化自己エピトープに対するＴ細胞サイトカイン反応を、ＡＣＰＡ−の健康対照者とともに観察した。ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０４０１＋健康対照者のＴ細胞もシトロリン化ビメンチン５９‐７８に反応してサイトカインを産生することが報告されている（Snirら,2011,supra）。ＤＲ４‐ＩＥトランスジェニックマウスをシトルリン化ヒトフィブリノーゲンで免疫後、シトルリン化エピトープに対する反応と並行して未修飾の天然エピトープ類を刺激した。ＨＬＡ‐ＤＲ結合およびおよび未修飾エピトープに対する反応のこれまでの、および現在の分析から、シトルリン化エピトープに対する反応は、ＳＥ＋ＲＡ ＰＢに最も特異的と思われる。一方、健康対照者におけるシトルリン化エピトープに対する反応の大きさ及び広がりは期待されなかった。天然ヒトフィブリノーゲンを注入したＤＲ４‐ＩＥトランスジェニックマウスにおいてシトルリン化フィブリノーゲンの方へのＴ細胞の自己反応性はなかった（Hillら,2008,supra）。しかしながら、ＳＥ＋ＲＡ患者およびおよびＨＬＡ‐ＤＲ４＋健康対照者両方においてＣＤ４＋Ｔ細胞はＴ細胞レセプタ切除サークル、全体的末端短縮、および低下した再現能力を有することが示された。それらがともに意味するところは、Ｔ細胞の、末梢レパートリーへの投入のＨＬＡ‐ＤＲ ＳＥ関連性減少、Ｔ細胞の末梢自己抗原の方向への増殖ドライブの増加、およびＴＣＲレパートリーの広がりの制限である（Fujiiら, 2009. Proc Natl Acad Sci U S A 106:4360-4365; Koetzら, 2000. Proc Natl Acad Sci U S A 97:9203-9208; Schonlandら, 2003. Proc Natl Acad Sci U S A 100:13471-13476）。ヒトにおける現在またはこれまでの研究は、共に、ＨＬＡ‐ＤＲ ＳＥ＋個々人におけるＰＢ Ｔ細胞が、ストレスまたは炎症性状況（関節外傷または喫煙を含む）に潜在的にさらされる、シトルリン化によって変化したものを含めた、自己抗原の方への自己反応性に傾いているかも知れない。（Klareskogら, 2006. Arthritis Rheum. 54:38-46; de Jongら, 2010. Ann. Rheum. Dis. 69:255-262）。さらに、Ｔ細胞自己反応性とは異なり、Ｂ細胞自己反応性の、シトルリン化エピトープの方への発展は、ＲＡへの進行において重要なチェックポイントであるようにみえる。例えば歯周炎患者において、例えばポルフィロモナス ジンジバリスによる感染は細菌性抗原との交差反応性、病原関連性分子パターン、別の抗原提示細胞の標的化、またはこれらの組み合わせとの交差反応性によって、このチェックポイントを通過する進行のための重要なトリガーとなり得ることが提起されている（Wegnerら, 2010. Immunol. Rev. 233:34-54）。リシン残基のホモシトルリンへのカルバミン化は、ＲＡ自己抗原およびシトルリン化された抗原の抗原性を高める、また一つの要因となり得る（Mydelら, 2010. J Immunol. 184:6882-6890）。
ここに示すデータは、長期疾病のＲＡ患者は、多数のシトルリン化エピトープに、より反応し易く、一方最近発病したＲＡの患者（これまで未治療だった者も含む）は、無抗原に、またはシトルリン化アグリカンのみに、より反応し易いことを示す。これらのデータも、疾患の進行につれてエピトープの広がりが起こることを示している。ここに開発されたアッセイ、すなわちＴ細胞サイトカイン産生を種々濃度のパネルのシトルリン化エピトープの存在につなげるこのアッセイは、最も免疫原性であるペプチドエピトープを確認するために有用な、そして特異的Ｔ細胞反応を対応するＡＣＰＡ「微細特異性」（Willemzeら, 2011. Arthritis Rheum. 63:1823-1832）と関連づけるために有用なバイオマーカーであることを示唆する。有利なことに、これらのアッセイは、テトラマー特異的Ｔ‐細胞の分析と関連して行うことができる。考えられる応用としては、ＲＡ前から診断にいたるまでのＰＢＭＣの連続サンプルの比較（Deaneら, 2010. Arthritis Rheum. 62:3161-3172）を含み、および抗原特異的または非特異的な免疫療法（例えばＡｂａｔａｃｅｐｔ（Yueら, 2010. Arthritis Rheum. 62:2941-2952））における臨床試験からのＰＢＭＣの分析を含む。最後に、特異的ペプチド反応性の分析が、患者の層別化、および個人的抗原特異的免疫療法のための適切なエピトープの確認のために有益であることを提起する。
〔材料および方法〕
〔患者〕
１９８７年のＲＡのための米国リウマチ学会議（ＡＣＲ）基準（Aletahaら, 2010, supra）に適合した２１名の患者および６名の非喫煙ＡＣＰＡ−ＳＥ＋健康対照者が含まれた。全員が末梢血（ＰＢ）を提供したが、若干の症例で、すべてのアッセイを行うためには用量が不足していた。患者の人口統計的詳細は、表６に概略を示す。ＨＬＡ‐ＤＲ遺伝子型決定はＱｕｅｅｎｓｌａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓで行われた。研究は、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ａｌｅｘａｎｄｒａ Ｈｏｓｐｉｔａｌのヒト研究倫理委員会によって承認され、各患者からインフォームド・コンセンスが得られた。
Figure 2015512371
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ペプチド反応のための採血時に測定したＣＲＰ。
Ｍ：メソトレキセート、Ｓ：スルファサラジン Ｈ：ヒドロキシクロロキノン、Ｌ：レフルノミド Ａ：アバタセプト、Ｃ：コーカサス人、Ａ：アジア人、Ｉ：太平洋諸島人
＊ＰＢ（末梢血）およびＳＦ（髄液）の両方が得られた。ＲＡ患者では平均年齢＝５０（範囲＝２２〜６５）、その８９％は女性であり、対照者では平均年齢＝３８（４０〜４５）、５０％が女性である。
〔ペプチドの作成〕
ビメンチン、コラーゲンII型、フィブリノーゲン、およびアグリカンに対応するシトルリン化またはアルギニン含有ＳＥ結合エピトープが、Ａｕｓｐｅｐ（ＮＳＷ、オーストラリア）によって合成された。すべてのペプチドは濾過され、滅菌水で３００μg／ｍＬに再構成され、７０℃で保存された。研究ストック用の最終希釈は培養液で行われた。
〔ＰＢ単核細胞の精製および抗原提示アッセイ〕
単核細胞（ＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ密度勾配を使用して分離され（Amersham Pharmacia Biotec、Uppsala、スウェーデン）、０．９％食塩水で洗浄し、その後ＲＰＭＩおよび健康な、または自家‐または同種異型のＲＡドナーからの１０％ヒト血清に再懸濁させた。破傷風トキソイドを４Ｌｆｉ／ｍＬの濃度で用いた（Chiron Vaccinese）。２×１０５ＰＢＭＣまたはＳＨＭＣを０、３および３０μｇ／ｍＬの各ペプチドと共に、１０％ヒト血清を最終容量２００μＬになるように含むＰＲＭＩの存在下で、丸底ウェル中で、５日間インキュベートした。Ｔ細胞増殖を１μＣｉ／ウエル〔３Ｈ〕チミジン（ICN Biochemicals）を付加し、最後の１８時間アッセイした。細胞をグラスファイバーマット上に採取し、液体シンチレーション分光光度計（Packard Topcount、Packard Insturument Co.）によって測定した。ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＦＮγ、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１７、およびＴＮＦを５日目の上澄液中で、ＢＤサイトメトリック ビード アレイ（ＣＢＡ）キット（BD Bioscience）によって測定した。最初の動的（kinetic）実験は、５日間のペプチド刺激が抗原特異的増殖およびサイトカイン反応を最適に誘起することを示した。そして、より長い培養がよりよい反応を与えないことを示した。ＲＡ血清をサイトカイン産生アッセイに用いた場合、１５０μgのヘテロブロック（Omega Biologicals）をＣＢＡ測定中に加えた（Toddら, 2011, supra）。サンプルをＢＤ ＦＡＣＳアレイ（登録商標）バイオアナライザー装置で読み込んだ。増殖反応のための刺激指数（ＳＩ）を、バックグラウンドを超える、ペプチドに対する反応の倍増（fold increase）として計算した。正味のサイトカイン分泌を各反応について次のように計算した:［ペプチド刺激での濃度］−［ペプチド刺激なしの濃度］。陽性反応閾値は、ＲＡ患者でも健康対照者でも、対応する天然ペプチドの方にサイトカイン反応より２ＳＤ高かった。
〔フローサイトメトリーおよび細胞内サイトカイン染色〕
ＳＥ＋患者および健康対照者からのＰＢＭＣを、３および３０μg／ｍＬ濃度のペプチドと共に、またはこれを加えずに、５日間インキュベートした。ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（Sigma Aldrich）を最初の１８時間加えた。細胞を、ＣＤ３‐ＦＩＴＣ、ＣＤ４‐ＡＰＣ／Ｃｙ７、ＣＤ２８‐ＦＩＴＣ、ＣＸＣＲ５‐ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Biolegend）について、染色し、その後透過し、細胞内ＩＬ‐６‐ＡＰＣおよびＩＦＮ‐γ‐ＡＰＣ（Biolegend）について染色した。データをＧａｌｌｉｏｓフローサイトメトリーで集め、Ｋａｌｕｚａソフトウエア（Beckman Coulter）を用いて分析した。
〔統計的分析〕
ｐｏｓｔ‐ｈｏｃ補正を伴うｏｎｅ‐ｗａｙ ｎｏｎ‐ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ＡＮＯＶＡによって多くの手段を比較した。不対Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙテストは、破傷風トキソイド増殖反応をＲＡ患者と健康対照者の間で比較し、シトルリン化 対 天然ペプチド に対する特異的サイトカイン反応を比較した。有意性は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、および＊＊Ｐ＜０．００１として示した。すべての誤差棒はＳＥＭをあらわす。
〔実施例４〕
ＮＦ‐κＢ、ｍＴＯＲまたはＳＹＫのインヒビターを有するＲＡ患者からのＡＰＣの阻害は、シトルリン化アグリカンペプチドに対して反応しておこるＴ細胞サイトカイン産生を誘起するそれらの能力を抑制する。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、疾病期間１８年、抗ＣＣＰおよびＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０４０１共通エピトープ陽性のＲＡ患者から抽出した。自己ＣＤ４＋Ｔ細胞は免疫磁気ビーズを用いて分離した。非Ｔ細胞フラクションは樹状細胞、単球およびＢ細胞を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）からなる。それをマイトマイシンＣで処理して増殖を止める。そのＡＰＣを３μＭ ＢＡＹ７０１１‐８２、２０μｇ／ｍＬクルクミン（両方共ＮＦ‐κＢを阻害する）、１０ｎｇ／ｍＬラパマイシン（ｍＴＯＲを阻害する）、または４０μＭピセアタノール（ｓｙｋを阻害する）なしに、またはそれらと共に、１時間プレインキュベートし、それから１００ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳと１時間インキュベートした。ＡＰＣを３回洗い、０μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、または３０μｇ／ｍＬアグリカンペプチド８４‐１０３ ｃｉｔ９３の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞と共に５日間インキュベートした。サイトカイン類を培地上澄液中で、サイトカイン ビード アレイによって分析した。データは、３または３０μg／ｍＬペプチドに反応した正味（［ペプチド ウエル］−［ペプチドなしのウエル］）ＩＬ‐６およびＴＮＦ産生を示す。
図７に示される結果は、ＡＰＣの、Ｂａｙ１１‐７０８２とのプレインキュベーションが一部抑制され、その他のインヒビター類はＡＰＣ提示ｃｉｔ‐ペプチドがＴ細胞ＩＬ‐６産生を誘起する能力を一部抑制し、その他のインヒビター類は前記能力を完全に抑制したことを示す。すべてのインヒビター類は、ＡＰＣ提示ｃｉｔ‐ペプチドの、Ｔ細胞ＴＮＦ産生を誘起する能力を完全に抑制した。
〔実施例５〕
ＲＡ患者におけるシトルリン化アグリカンＧ１エピトープに対するサイトカイン反応
実施例４に記載された、同じＲＡ患者からのＰＢＭＣを、天然またはシトルリン化型の３５１アミノ酸ヒトアグリカンＧ１エピトープ（マウスの優性および優性以下のエピトープ類を含む）と１μg／ｍＬで５日間インキュベートし、その後上澄液のＩＬ‐６を測定した。図８に示される正味ＩＬ‐６（［抗原］−［抗原なしのウエル］）の産生は、シトルリン化Ｇ１エピトープに対して、対応する非シトルリン化エピトープに比較して、有意に高いＩＬ‐６反応を示す。
〔実施例６〕
Ｃｉｔアグリカン特異的Ｔ細胞はリウマチ性患者の末梢血に存在する
２ＨＬＡ‐ＤＲＢ１＊０４０１＋ＡＣＰＡ＋ＲＡ患者からのＰＢＭＣを、ダサチニブの存在下で、ＣＬＩＰ、インフルエンザ ヘマグルチニン（ＨＡ）、アグリカン８９‐１０３ｃｉｔ９３、９５またはビメンチン５９‐７１ｃｉｔ６４、６９、７１、ＤＲＢ１＊０４０１‐テトラマーで染色した。プロットは、免疫磁気ビーズを用いて、生きている細胞、テトラマー＋細胞のために豊富にしたＣＤ４＋Ｔ細胞上にゲートした。豊富になったＰＢＭＣのテトラマー＋％を各プロットごとに図９に示す。これらの結果は、シトルリン化アグリカン特異的Ｔ細胞がリウマチ性関節炎患者の末梢血に存在することを明らかに示す。
〔実施例７〕
末梢血中のｃｉｔ‐アグリカン特異的Ｔ細胞の数および蛍光強度
６名のＲＡ患者、および３名の健康対照者からのＰＢＭＣを、蛍光計量ビーズを含んだ実施例６におけるように染色し、その後、血液１ｍＬあたりのテトラマー＋Ｔ細胞の数を計算した。テトラマー染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＨＬＡ‐ＤＲ分子によってあらわされる抗原に対するＴ細胞レセプタの親和性の指標である。Ｃｉｔ‐アグリカン特異的Ｔ細胞は、ＲＡ患者及びこの遺伝子型の健康対照者の中を循環する。図１０に示す結果は、ｃｉｔ‐アグリカン特異的Ｔ細胞の数が健康対照者の平均に比較して、比率においてＲＡ患者の方がより高いこと、および若干の患者ではこれらＡｇ特異的Ｔ細胞がｃｉｔ‐アグリカンに、より高い親和性を有することを示している。
ここに記載されるあらゆる患者、特許出願、および出版物の開示は、引例によってここにそのまま組み入れられる。
この中の任意の参照の記載は、このような参照が本出願に対する「先行技術」として使用できる許可として構成されるべきでない。
この明細書を通じての目的は、本発明をいかなる実施態様、または特徴の特定の集合に制限することなく、本発明の好ましい実施態様を記載することである。そこで、熟練せる当業者はこの開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施態様に種々の修正および変更がなされ得ることを認めるであろう。全てのそのような修正および変更は添付の請求の範囲内に含まれるものとする。

Claims (43)

  1. 被検体の関節損傷を治療または予防するための方法であって、被検体においてアグリカンポリペプチドに対する抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起することを含み、または上記からなり、あるいは実質的に上記からなり、それにより関節損傷を治療または予防する方法。
  2. アグリカンポリペプチドがシトルリン化アグリカンポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 被検体が早期ＲＡまたは初期ＲＡである、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 被検体が、抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起する前に、早期ＲＡまたは初期ＲＡを有することを確認することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 被検体が、共通エピトープ（ＳＥ）陽性である、請求項１ないし４のいずれかの項に記載の方法。
  6. 被検体が抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起する前に、ＳＥ陽性であることを確認することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
  7. 被検体が、アグリカンポリペプチドに対する免疫反応を有し、又は発生リスクを有する、請求項１ないし６のいずれかの項に記載の方法。
  8. 前記免疫反応がエフェクターＴリンパ球反応を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記免疫反応がインターロイキン６（ＩＬ‐６）、インターフェロン‐γ（ＩＦＮ‐γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびインターロイキン‐１０（ＩＬ‐１０）からなる群から選択される少なくとも一種類のサイトカインの産生を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記免疫反応が、ＩＬ‐６、ＩＦＮ‐γおよびＴＮＦからなる群から選択される少なくとも一種類のサイトカインの産生を含み、またはその産生からなり、あるいは実質的にその産生からなる炎症性Ｔリンパ球反応を含む、請求項７に記載の方法。
  11. 炎症性Ｔリンパ球反応が、ＩＬ‐６の産生を含み、またはその産生からなり、あるいは実質的にその産生からなる、請求項１０に記載の方法。
  12. 免疫反応の少なくとも一部はＣＤ４＋リンパ球によって生成する、請求項７に記載の方法。
  13. 請求項１ないし１２のいずれかの項に記載される方法であって、抗原特異的免疫寛容原性反応が：
    （１）被検体において、アグリカンポリペプチドの部分に対応するペプチドをあらわす免疫寛容原性抗原提示細胞（ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣ）の数を増やし、その際前記部分はアグリカンポリペプチドに対する炎症性または自己反応性Ｔリンパ球反応と関連し；
    （２）被検体において、アグリカンポリペプチドに対して反応する炎症性または自己反応性Ｔリンパ球にアネルギーまたはアポトーシスを誘起し；
    （３）被検体において、アグリカンポリペプチドに対する炎症性または自己反応性Ｔリンパ球反応を抑制あるいは減らす調節性または抑制性Ｔリンパ球の数を増加させる
    ことによって起こる前記方法。
  14. 被検体において、関節損傷を治療または予防するａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣの数を増やすことを含み、または増やすことからなり、あるいは実質的に増やすことからなる、請求項１３に記載の方法。
  15. ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣが、アグリカンポリペプチドに対する炎症性または自己反応性Ｔリンパ球を抑制あるいは減らす調節性またはサプレッサーＴリンパ球の産生を刺激する、請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項１４または１５に記載の方法であって、被検体の抗原提示細胞を（１）抗原提示細胞におけるＮＦ‐κＢ活性を阻止するのに十分な量のＮＦ‐κＢインヒビターおよび／または（２）抗原提示細胞におけるｍＴＯＲ活性を阻止するのに十分な量のｍＴＯＲインヒビター、および／または（３）抗原提示細胞におけるＳｙｋ活性を阻止するのに十分な量のＳｙｋインヒビターを、全体的または部分的にアグリカンポリペプチドに対応する抗原またはその抗原を発現し得る核酸分子から選択される抗原性分子の、抗原提示細胞がそれらの表面に前記抗原またはその操作された形のものをあらわすのに十分な量と、接触させることによって、ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣが産生する、前記方法。
  17. 前記抗原が、全長のアグリカンポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記抗原が、成熟したアグリカンポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記抗原が、Ｇ１ドメイン、Ｇ２ドメイン、またはＧ３ドメインから選択されるアグリカンポリペプチドのドメインに対応するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記抗原が、アグリカンポリペプチドのＴ細胞エピトープに対応するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記アミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：５〜３５のいずれかあるいはそのシトルリン化型から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記アミノ酸配列が、配列ＩＤ番号：３２〜３５のいずれかから選択される、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記抗原がＨＬＡ ＤＲ制限され、被検体がＨＬＡ ＤＲ対立遺伝子陽性である、請求項１６に記載の方法。
  24. 前記抗原が、シトルリン型アグリカンポリペプチドを含むアグリカンポリペプチドに全体的または部分的に対応する１つ以上のペプチドの形である、請求項１６に記載の方法。
  25. 前記抗原が、複数の隣接オーバーラッピングペプチドの形であり、その配列がアグリカンポリペプチドあるいはそのシトルリン化型の少なくとも一部にわたっている請求項１６に記載の方法。
  26. オーバーラッピングペプチドが配列ＩＤ番号：４９〜５３１から選択されるアミノ酸配列およびそのシトルリン化型を含み、またはそれらからなり、あるいは実質的にそれらからなる請求項１６に記載の方法。
  27. インヒビターがＮＦ‐κＢインヒビター（例えば表２、３Ａ、３Ｂ、または４に列挙されるインヒビターのいずれかから選択されるＮＦ‐κＢインヒビター）である、請求項１６に記載の方法。
  28. ＮＦ‐κＢインヒビターが、クルクミンまたはクルクミン誘導体である、請求項２７に記載の方法。
  29. インヒビターおよび抗原性分子が溶液型で同時投与される、請求項１６に記載の方法。
  30. インヒビターおよび抗原性分子が粒状型で同時投与される、請求項１６に記載の方法。
  31. インヒビターおよび抗原性分子が同じ粒子内に含まれて同時投与される、請求項３０に記載の方法。
  32. 粒子が重合体粒子である、請求項３０に記載の方法。
  33. 粒子がリポソームである、請求項３０に記載の方法。
  34. ａｇｇ‐ｔｏｌＡＰＣが、アグリカンポリペプチドに全体的にまたは一部対応する抗原をコードする核酸分子をＢリンパ球に発現させることによって産生し、その際、前記核酸分子の発現がＢリンパ球上における抗原またはその操作型の提示に通ずる、請求項１３に記載の方法。
  35. 前記核酸分子が、前記抗原に直接または間接的に融合した免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片をさらにコードする、請求項３４に記載の方法。
  36. アグリカンポリペプチドに対する炎症性または自己反応性Ｔリンパ球反応を抑制あるいは減少させる調節性またはサプレッサーＴリンパ球を被検体に投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
  37. 実質的に、アグリカンポリペプチドに全体的または部分的に対応する抗原からなるＭＨＣ‐ペプチド複合体及び抗原結合部位を有する分離したＭＨＣ成分を被検体に投与することを含み、その際、前記抗原は前記抗原結合部位と結合する請求項１に記載の方法。
  38. 免疫調節ペプチド及び免疫‐またはＴ細胞‐結合リガンド（Ｉ／ＴＣＢＬ）を含むキメラ構成物を被検体に投与することを含み、その際、免疫調節性ペプチドはアグリカンポリペプチドの一部分に対応するアミノ酸配列を含み、または前記アミノ酸配列からなり、あるいは実質的に前記アミノ酸配列からなり、その際免疫調節性ペプチドはアグリカンポリペプチドの一部分に対応するアミノ酸配列を含み、またはそのアミノ酸配列からなり、あるいは実質的にそのアミノ酸配列からなり、また免疫調節性ペプチドは炎症性または自己反応性Ｔリンパ球上の抗原レセプタに結合し、Ｉ／ＴＣＢＬはヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および細胞毒性Ｔ細胞からなる群から選択されるＴ細胞のクラスまたはサブクラスに結合し、Ｔ細胞活性を調節する、請求項１に記載の方法。
  39. Ｉ／ＴＣＢＬが，ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスII分子、β２‐ミクログロブリンのようなアクセサリ分子、リンパ球機能関連性分子‐３（ＬＦＡ‐３）、免疫グロブリン分子の重鎖のＦｃ領域、Ｉａ＋分子類、ＣＤ２に対する抗体、ＣＤ３に対する抗体、ＣＤ４に対する抗体、ＣＤ８に対する抗体、レクチンに対する抗体、リンホカインから選択される分子の少なくとも一部を含む請求項３８に記載の方法。
  40. アグリカンポリペプチドに対する抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起する作用物質または作用物質類の組み合わせを含み、または前記からなり、あるいは実質的に前記からなる組成物。
  41. 作用物質または作用物質類の組み合わせが、（１）ＮＦ‐κＢのインヒビター、およびアグリカンポリペプチドまたはその抗原を発現し得る核酸分子に全体的にまたは一部対応する抗原から選択される抗原性分子；（２）ｍＴＯＲインヒビターおよび、アグリカンポリペプチドに全体的または部分的に対応する抗原、またはその抗原を発現し得る核酸分子から選択される抗原性分子；（３）Ｓｙｋ経路のインヒビターおよびアグリカンポリペプチドに全体的または一部分対応する抗原とその抗原を発現し得る核酸分子から選択される抗原性分子；（４）アグリカンポリペプチドに全体的または一部分対応する抗原をコードしてＢリンパ球に導入する核酸分子；（５）実質的に、アグリカンポリペプチドに全体的にまたは一部分対応する抗原及び抗原結合部位を有する分離したＭＨＣ成分からなるＭＨＣ‐ペプチド複合体であって、前記抗原が前記抗原結合部位と結合する前記複合体；（６）ここに定義されたようなキメラ構成物；（７）アグリカン特異的免疫寛容原性抗原提示細胞；または（８）アグリカンポリペプチドの一部に対応するアミノ酸配列を含み、または前記アミノ酸配列からなり、あるいは実質的に前記アミノ酸配列からなるＡＰＬ；から選択される請求項４０に記載の組成物。
  42. 請求項４０または請求項４１に定義されるアグリカンポリペプチドに対する抗原特異的免疫寛容原性を誘起して関節損傷を治療または予防する作用物質または作用物質類の組み合わせ。
  43. 関節損傷の治療及び予防のための薬剤の製造において、請求項４０または請求項４１に定義されるようなアグリカンポリペプチドに対する抗原特異的免疫寛容原性反応を誘起する作用物質または作用物質類の組み合わせの使用。
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