JP2015504434A - 抗fgfr2抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
抗体ベースの治療法は、固形腫瘍を含むさまざまながんの処置に極めて有効であることが判明しつつある。例えば、ハーセプチン(HERCEPTIN(登録商標))は乳がんの処置に使用されて成功を収めており、リツキサン(RITUXAN(登録商標))はB細胞関連がんタイプに有効である。奏効する抗体ベースの治療法の開発において中核を成すのは、腫瘍細胞上に優先的に発現することが見いだされた細胞表面タンパク質に対する抗体の単離である。
本発明は、FGFR2に対する特異的アフィニティを有し、対象に治療的利益を送達することができる、新規抗体の発見に基づいている。本発明の抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であることができ、本明細書にさらに詳しく説明する多くの状況において使用することができる。
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を有する。ただし、本発明が関係する技術分野の当業者は、本発明で使用される用語の多くについて、その一般的定義を、以下の参考文献に見出すことができ、それらの定義が当技術分野で一般に理解されている意味と合致している限り、以下の参考文献を参照し、使用することができる。そのような参考文献には、例えばSingletonら「Dictionary of Microbiology and Biology」(第2版、1994);「The Cambridge Dictionary of Science and Technology」(Walker編, 1988);Hale & Marham「The Harper Collins Dictionary of Biology」(1991);およびLackieら「The Dictionary of Cell & Molecular Biology」(第3版、1999);および「Cellular and Molecular Immunology」Abbas, LichtmanおよびPober編、第2版、W.B. Saunders Companyなどがあるが、これらに限るわけではない。当技術分野において一般に理解されている意味を持つ本明細書で使用する用語の定義が記載されている他の技術情報源は、当業者が利用できるものであればどれでも参照することができる。本発明に関して以下の用語をさらに定義する。他の用語も本明細書のどこかで定義する。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「一つの(a)」、「および(and)」ならびに「その(the)」は、文脈上そうでないことが明白である場合を除き、複数の指示物を包含する。したがって、例えば「(ある)遺伝子(a gene)」とは1つ以上の遺伝子への言及であり、当業者に知られているその均等物が包含される、などということになる。
本発明は、抗FGFR2抗体を提供することによって、FGFR2陽性がん細胞の成長および新生物疾患の進行を阻害するための方法に関する。FGFR2を過剰発現する細胞と変異型FGFR2を発現する細胞との両方において、FGFR2への結合後にFGFR2の表面発現を低減する、結合タンパク質、抗体、その抗原結合性抗体フラグメント、ならびに抗体およびフラグメントの変異体が提供される。FGFR2を過剰発現する細胞と変異型FGFR2を発現する細胞との両方において、例えば限定するわけではないが、FGFR2を過剰発現するSNU16(ATCC−CRL−5974)およびMFM223(ECACC−98050130)ならびに変異型FGFR2を発現するAN3−CA(DSMZ−ACC 267)およびMFE−296(ECACC−98031101)などにおいて、広範囲にわたるさまざまなFGFR2発現細胞株に結合する抗体、もしくはその抗原結合性抗体フラグメント、またはその変異体を提供することが、本発明のもう一つの実施形態である。
完全ヒトN−CoDeR抗体ファージディスプレイライブラリーを使って、全細胞パンニングとタンパク質パンニングの組み合わせにより、そしてまた特別な方法を開発することによって、本発明の高アフィニティFGFR2特異的ヒトモノクローナル抗体を単離した。これらの方法には、細胞表面上にディスプレイされたFGFR2に優先的に結合する抗体であって、かつ、マウスFGFR2および他の種のFGFR2に対して交差反応性であり、がんなどのFGFR2関連疾患に見いだされるFGFR2過剰発現およびFGFR2の一般的な変異に依存しない結合活性および機能的活性を有する抗体を同定することができるパンニング手法およびスクリーニングアッセイの開発が含まれる。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、ここに提供する具体的ペプチド配列に限定されない。むしろ本発明は、これらのポリペプチドの変異体も包含する。本開示ならびに従来から利用できる技術および参考文献を参照することで、当業者は、本明細書に開示する抗体の機能的変異体を調製し、試験し、利用することができると共に、FGFR2に結合する能力を有するこれらの変異体が本発明の範囲に包含されることを理解するであろう。
本明細書に記載する抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存しているポリペプチド変異体を作製することができる。個々のアミノ酸の性質を考えれば、当業者には、いくつかの合理的な置換がわかるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするDNA分子にも関係する。これらの配列には、配列番号3、4、13、14、23、24、33、34、43、44、53および54に示すDNA分子が含まれるが、これらに限るわけではない。
a.Tm=69.3+0.41(G+C)%
b.二重鎖DNAのTmは、ミスマッチ塩基対の数が1%増加するごとに1℃低下する。
c.(Tm)μ2−(Tm)μ1=18.5log10μ2/μ1
式中、μ1およびμ2は2つの溶液のイオン強度である。
本発明の範囲に包含されるさらにもう一種類のDNA変異体は、それらがコードする産物に言及することによって記述することができる。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重ゆえに、配列番号1、2、5〜12、15〜22、25〜32、35〜42、45〜52、55〜60に見いだされるものと同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の1つ以上を含む組換えDNAコンストラクトを提供する。本発明の組換えコンストラクトは、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと共に使用され、そこに本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするDNA分子が挿入される。
細菌での使用に役立つ発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的プロモーターと作動可能な読み枠で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が保証されるように、また所望であれば、宿主内での増幅がもたらされるように、1つ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換に適した原核宿主には、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ならびにシュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトミセス(Streptomyces)属、およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)属のさまざまな種が含まれる。
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)(CMVプロモーター/エンハンサーなど)、シミアンウイルス40(SV40)(SV40プロモーター/エンハンサーなど)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))およびポリオーマに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーなどが含まれる。ウイルス調節要素のさらなる説明およびその配列については、例えばStinskiによるU.S.5,168,062、BellらによるU.S.4,510,245、およびSchaffnerらによるU.S.4,968,615を参照されたい。組換え発現ベクターは複製起点および選択可能マーカーも含むことができる(例えばAxelらによるU.S.4,399,216、4,634,665およびU.S.5,179,017を参照されたい)。適切な選択可能マーカーには、そのベクターが導入されている宿主細胞にG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、neo遺伝子はG418に対する耐性を付与する。効率のよいクローニングのために、重鎖のN末端の最初の3アミノ酸[EVQ](配列番号67および配列番号69)を、代替的に[QVE]として、例えばヒトIgG1 M048−D01−hIgG1の重鎖の変異体(配列番号222)として、発現させることもできる。効率のよいクローニングのために、軽鎖のN末端をアミノ酸残基、例えばアラニンで伸長することができる。
治療法は、本発明によって想定される抗体またはその抗原結合性フラグメントの治療有効量を、処置を必要とする対象に投与することを伴う。「治療有効」量とは、ここでは、単回投与として、または複数回投与レジメンに従って、単独で、または他の薬剤との組み合わせで、対象の処置区域におけるFGFR2陽性細胞を枯渇させるのに十分な量であって、有害な状態の軽減につながるが、毒物学的には認容できるような、抗体または抗原結合性フラグメントの量と定義される。対象は、ヒトまたは非ヒト動物(例えばウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の下等霊長類)であることができる。
FGFR2抗体またはその抗原結合性フラグメントは、FGFR2発現腫瘍の存在を検出するために使用することができる。血清および組織生検標本を含むさまざまな生物学的試料におけるFGFR2含有細胞または脱落FGFR2の存在は、FGFR2抗体を使って検出することができる。また、FGFR2抗体は、99Tc(または他の同位体)コンジュゲート抗体を使った免疫シンチグラフィなどといった、さまざまなイメージング方法に使用することができる。例えば、111Inコンジュゲート抗PSMA抗体を使って最近記述されたものに似たイメージングプロトコールを使って、膵臓癌または卵巣癌を検出することができる(Sodeeら, Clin.Nuc.Med. 21: 759−766, 1997)。使用することができるもう一つの検出方法は、本発明の抗体を適切な同位体にコンジュゲートすることによる陽電子放出断層撮影である(Herzogら, J.Nucl.Med. 34:2222−2226, 1993参照)。
本発明の一実施形態は、FGFR2抗体またはその抗原結合性フラグメントを単独で含むか、安定化化合物などといった少なくとも1つの他の薬剤と組み合わせて含む医薬組成物であって、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水などといった(ただしこれらに限るわけではない)任意の滅菌生体適合性医薬担体に入れて投与することができる医薬組成物である。さらなる一実施形態は、FGFR2結合抗体またはその抗原結合性フラグメントと、がんなどのFGFR2関連疾患を処置するのに適したさらにもう一つの医薬活性化合物とを含む医薬組成物である。これらの分子はいずれも、患者に単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、医薬組成物として投与することができ、医薬組成物では、賦形剤または医薬上許容される担体と混合される。本発明の一実施形態では、医薬上許容される担体は医薬的に不活性である。
本発明はさらに、上述した本発明組成物の成分の1つ以上が充填された1つ以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。そのような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって指示された形式で、当局によるヒト投与用製品の製造、使用または販売の認可を反映した告知書を、添付することができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野においてよく知られている方法で、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成(dragee−making)、研和(levigating)、乳化、カプセル化、捕捉(entrapping)または凍結乾燥プロセスなどによって、製造することができる。
本発明における使用に適した医薬組成物には、その活性成分が、意図する目的、すなわちFGFR2発現を特徴とする特定の疾患状態の処置を達成するのに有効な量で含有されている組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲で十分に可能である。
A.FGFR2を過剰発現する細胞株SNU16(ATCC−CRL−5974)およびMFM223(ECACC−98050130)ならびに変異型FGFR2を発現する細胞株AN3−CA(DSMZ−ACC 267)およびMFE−296(ECACC−98031101)において、FGFR2への結合後にFGFR2の細胞表面発現を低減する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
a)該残基が群Pro2、Leu6およびGlu8から選択されるか、
b)該残基が群Arg1、Pro2、Phe4およびSer5から選択される、
クレームB〜Cのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
b)配列番号15〜17によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号18〜20によって表される可変軽鎖CDR配列、または
c)配列番号25〜27によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号28〜30によって表される可変軽鎖CDR配列、または
d)配列番号35〜37によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号38〜40によって表される可変軽鎖CDR配列、または
e)配列番号45〜47によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号48〜50によって表される可変軽鎖CDR配列、または
f)配列番号55〜57によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号58〜60によって表される可変軽鎖CDR配列、または
g)配列番号75〜77によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号78〜80によって表される可変軽鎖CDR配列、または
h)配列番号85〜87によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号88〜90によって表される可変軽鎖CDR配列、または
i)配列番号95〜97によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号98〜100によって表される可変軽鎖CDR配列、または
j)配列番号105〜107によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号108〜110によって表される可変軽鎖CDR配列、または
k)配列番号115〜117によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号118〜120によって表される可変軽鎖CDR配列、または
l)配列番号125〜127によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号128〜130によって表される可変軽鎖CDR配列、または
m)配列番号135〜137によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号138〜140によって表される可変軽鎖CDR配列、または
n)配列番号145〜147によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号148〜150によって表される可変軽鎖CDR配列、または
o)配列番号155〜157によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号158〜160によって表される可変軽鎖CDR配列、または
p)配列番号165〜167によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号168〜170によって表される可変軽鎖CDR配列、または
q)配列番号175〜177によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号178〜180によって表される可変軽鎖CDR配列、または
r)配列番号185〜187によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号188〜190によって表される可変軽鎖CDR配列、または
s)配列番号195〜197によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号198〜200によって表される可変軽鎖CDR配列、または
t)配列番号205〜207によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号208〜210によって表される可変軽鎖CDR配列、または
u)配列番号215〜217によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号218〜220によって表される可変軽鎖CDR配列
を含む、クレームA〜Gに記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
b)配列番号11によって表される可変重鎖配列および配列番号12によって表される可変軽鎖配列、または
c)配列番号21によって表される可変重鎖配列および配列番号22によって表される可変軽鎖配列、または
d)配列番号31によって表される可変重鎖配列および配列番号32によって表される可変軽鎖配列、または
e)配列番号41によって表される可変重鎖配列および配列番号42によって表される可変軽鎖配列、または
f)配列番号51によって表される可変重鎖配列および配列番号52によって表される可変軽鎖配列、または
g)配列番号73によって表される可変重鎖配列および配列番号74によって表される可変軽鎖配列、または
h)配列番号83によって表される可変重鎖配列および配列番号84によって表される可変軽鎖配列、または
i)配列番号93によって表される可変重鎖配列および配列番号94によって表される可変軽鎖配列、または
j)配列番号103によって表される可変重鎖配列および配列番号104によって表される可変軽鎖配列、または
k)配列番号113によって表される可変重鎖配列および配列番号114によって表される可変軽鎖配列、または
l)配列番号123によって表される可変重鎖配列および配列番号124によって表される可変軽鎖配列、または
m)配列番号133によって表される可変重鎖配列および配列番号134によって表される可変軽鎖配列、または
n)配列番号143によって表される可変重鎖配列および配列番号144によって表される可変軽鎖配列、または
o)配列番号153によって表される可変重鎖配列および配列番号154によって表される可変軽鎖配列、または
p)配列番号163によって表される可変重鎖配列および配列番号164によって表される可変軽鎖配列、または
q)配列番号173によって表される可変重鎖配列および配列番号174によって表される可変軽鎖配列、または
r)配列番号183によって表される可変重鎖配列および配列番号184によって表される可変軽鎖配列、または
s)配列番号193によって表される可変重鎖配列および配列番号194によって表される可変軽鎖配列、または
t)配列番号203によって表される可変重鎖配列および配列番号204によって表される可変軽鎖配列、または
u)配列番号213によって表される可変重鎖配列および配列番号214によって表される可変軽鎖配列
を含む、クレームA〜Hに記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
ファージ選択に使用したツール:
本発明のヒト抗体の単離に使用した組換えタンパク質はR&D Systemsから入手した。それらを表1に列挙する。使用した変異体は全て、Fc−融合タンパク質として無担体調製物中に存在した。hTRAIL−Fcを、Fc結合物質を避けるための枯渇剤とした。タンパク質を、製造者の指示に従い、約2倍モル過剰のビオチン−LC−NHS(Pierce;カタログ番号21347)を使ってビオチン化し、Zeba脱塩カラム(Pierce;カタログ番号89889)を使って脱塩した。
本発明のヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントの単離は、6つのCDR全てが多様化されているFabライブラリーであるBioInvent International AB(スウェーデン・ルンド)のナイーブ抗体ライブラリーn−CoDeR(Soederlingら, Nat. Biotech. 2000, 18:853−856に記載されている)を用いるファージディスプレイ技術によって行った。表2に要約するとおり、本発明の抗体の選択には3つの異なる戦略を使用した。
1×PBS:Sigmaから(D5652−50l)、
PBST:0.05%Tween20(Sigma、P7949)を補足した1×PBSバッファー、
ブロッキング緩衝液:3%BSA(Sigma A4503)を補足したPBST、
沈殿バッファー:2.5M NaCl中の20%PEG(Calbiochem、528877)、
FACSバッファー:3%FBS(GIBCO、10082)および0.01%NaN3(Sigma、71289)を補足したPBS。
ファージELISA:
異なる選択ラウンドから選択されたファージを、ファージELISAを使って、特異性について分析した。簡単に述べると、ファージ発現は、10μlの終夜培養物(100μg/mlアンピシリン(Sigma、A5354)および1%グルコースを補足したLB培地中)を、100μlの新鮮培地(100μg/mlアンピシリンおよび0.1%グルコース(Sigma、G8769)を補足したLB培地)に加え、96ウェルMTP中、250rpm、37℃で、OD600が0.5に達するまで振とうすることによって行った。次に、ヘルパーファージM13KO7(Invitrogen、420311)を加え、試料を振とうせずに37℃でさらに15分間インキュベートした。IPTG(最終濃度0.5mM;最終体積200μl)を加えた後、細胞を、200rpmで振とうしながら、30℃で終夜インキュベートした。
可溶性Fabフラグメント(sFab)を生成させるために、第3選択ラウンドと第4選択ラウンドからのファージミドDNAを単離し、gene III配列を除去するために、制限酵素EagI(Fermentas、FD0334)およびEcoRI(NEB、R0101L)により、供給者の指示に従って消化した。その結果生じたフラグメントを再ライゲートし、コンストラクトを、ケミカリーコンピテント大腸菌Top10に、標準的方法を使って形質転換した。単一クローンを拾って、LB培地(100μg/mlアンピシリン(Sigma、A5354)、1%グルコース)が入っている96ウェルプレートに移し、250rpmおよび37℃で振とうした。翌朝、10mlの前培養物を、OD600が0.5に到達するまで、150μlの新鮮LB培地(100μg/mlアンピシリン(Sigma、A5354)、0.1%グルコース)に移した。その後、IPTG(最終濃度0.5mM)の添加によってsFab生産を誘導し、200rpmで振とうしながら、インキュベーションを30℃で終夜続けた。翌朝、50μlのBELバッファー(24.7g/lホウ酸;18.7g/l NaCl;1.49g/l EDTA pH8.0;2.5mg/mlリゾチーム(Roche))を各ウェルに加え、その混合物を室温で1時間インキュベートした。次に、9%BSAを含む1/3体積のブロッキングバッファーを加え、室温でさらに30分間のインキュベーションステップの後、各ウェルの50μlを、ELISAにおけるターゲットへのsFabの結合について、検出をHRPにカップリングした抗hIgG(Fab特異的)(1:2500希釈;Sigma; A0293)で行った点以外は基本的にファージについて述べたようにして、分析した。
ユニークなスクリーニングヒットを、FGFRタンパク質の異なる変異体へのそれらの結合の初期分析(実施例3参照)のために、小規模に生産した。20〜50mlのLB培地(0.1mg/mlアンピシリンおよび0.1%グルコースを補足したもの)に、初期pBIFベクター(ただしgene III配列を欠くもの)中にクローニングされたユニークなFab配列を含有する各大腸菌Top10クローンの前培養物を接種した。0.5mM IPTG(最終濃度)の添加によってsFabの生産を誘導し、250rpmで振とうしながら30℃でインキュベーションを続けた。
ユニークなスクリーニングヒットを実施例2で述べたように小規模に生産し、表3に列挙した異なるFGFR変異体への結合に関して、ELISAで試験した。
マウス、ラットおよびヒトがん細胞株に対する抗FGFR2抗体の結合特徴を決定するために、一群の細胞株への結合をフローサイトメトリーによって試験した。付着細胞をPBS(CaおよびMgを含まないもの)で2回洗浄し、酵素非含有PBS系細胞解離バッファー(Invitrogen)によって剥離した。FACSバッファー(3%FCS(Biochrom)を含有するCa/Mg不含PBS(Biochrom))に、約105細胞/ウェルの密度で、細胞を懸濁した。細胞を遠心分離(250g、5分、4℃)し、上清を捨てた。FACSバッファー中の目的の抗体の希釈液(別段の表示がある場合を除き80μl中に5μg/ml)に細胞を再懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。次に、細胞を100μlの冷FACSバッファーで1回洗浄し、1:150希釈した80μlの二次抗体(PEヤギ抗ヒトIgG、Dianova #109−115−098、またはPEヤギ抗マウスIgG、Jackson Immuno Research #115−115−164)を加えた。氷上で1時間インキュベートした後、細胞を冷FACSバッファーで再び洗浄し、100μlのFACSバッファーに再懸濁し、FACS−Array(BD Biosciences)を使ってフローサイトメトリーで分析した。結果は、目的の抗体による検出の幾何平均(Geo Mean)から二次抗体のみによる検出で測定されるバックグラウンド蛍光を差し引いたものとして算出される。以下のシステムで値をスコア化する:
幾何平均−二次抗体のみの幾何平均>10:+、>100:++、>1000:+++、10000:++++、カッコ内はカテゴリー境界に近い。
抗体の交差反応性プロファイリングに使用した細胞株のリスト
見いだされた抗体の結合特徴を決定するために、Pepscanの独占技術であるCLIPS(Chemically Linked Peptides on Scaffolds)技術(Timmermanら, J. Mol. Recognit. 2007, 20:283−99)に基づく広範なエピトープマッピングを行った。合計8653個の異なるCLIPSで、ネイティブヒトFGFR2上の線状、コンフォメーショナルおよび不連続エピトープをカバーする15AA長および30AA長のペプチドを設計した。ペプチドをペプチドアレイ上に合成した。このペプチドアレイにおいて、ヒトIgG1フォーマットの本発明の抗体を、ELISAベースのアッセイで試験した。最も高いELISA値を与えたペプチドを分析することで、共有されている類似アミノ酸配列を同定した。
生データは、CCDカメラによって得られた光学値である。値は、標準的96ウェルプレートELISAリーダーと同様に、0〜3000mAUの範囲にあった。分析のために結合値を抽出した。ウェルが偽陽性値をもたらす気泡を含有する場合もあり、カードを手作業で検査して、気泡が引き起こした値をいずれも0とスコア化した。
本発明の抗体の結合特徴をさらに詳しく明確にするために、アラニンスキャニングを行った。実施例5で述べたように、15AA長および30AA長のペプチドを合成し、一定のペプチドについては、ヒトFGFR2配列の各アミノ酸をアラニン残基で置き換えた。抗体の結合を実施例5で述べたように分析した。アラニンへのアミノ酸残基の交換が結合シグナルの有意な低減をもたらすのであれば、その残基は結合にとって重要であるとみなした。
エピトープと特徴付けられたN末端ペプチドに対する結合アフィニティを明確にするために、Biacore表面プラズモン共鳴実験を行った。
短時間インキュベーション後のリン酸化FGFR2(P−FGFR2)の細胞レベルに対する抗FGFR2抗体の効果を決定するために、P−FGFR2 ELISAを行った。MFM223細胞を、96ウェルプレートに、成長培地(MEMアール(Biochrom;F0315)+10%FCS+2mMグルタミン)中、1ウェルあたり7000細胞の密度でプレーティングした。プレーティングの24時間後に細胞を抗体(10μ/ml)と共に15分間インキュベートし、次に、PBSによる2回の洗浄ステップと、100μlの***解バッファー(50mM Hepes pH7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、10mM Na4P2O7、100mM NaF、10%グリセリン、1.5% Triton X−100および新たに加えたComplete Protease Inhibitorカクテル(Roche No. 1873580001)、4M Na3VO4からなり、NaOHでpHを7.4に調節したもの)中で5分間振とうすることによる溶解とを行った。試料を急速冷凍し、分析まで−80℃で保存した。P−FGFR2レベルの測定は、R&D SystemsのP−FGFR2 ELISAキットを製造者の指示に従って使用することによって行った。450nMでODを測定し(Tecan Spectra, Rainbow)、バックグラウンド補正を行った。P−FGFR2のレベルを無処置対象レベルの%として算出した。抗体フォーマットの非特異的効果を制御するために、並行して、同じアイソタイプの非細胞結合性対照IgGと共に試料をインキュベートした。
長期間インキュベーション後のリン酸化FGFR2(P−FGFR2)の細胞レベルに対する抗FGFR2抗体の効果およびFGF7のFGFR2リン酸化誘発力に対する抗体処理の効果を決定するために、P−FGFR2 ELISAを行った。MFM223細胞を、96ウェルプレートに、成長培地(MEMアール(Biochrom;F0315)+10%FCS+2mMグルタミン)中、1ウェルあたり7000細胞の密度でプレーティングした。プレーティングの24時間後に、細胞を抗体(10μ/ml)と共に24時間インキュベートし、次に、FGF7(R&D Systems、25ng/ml)の存在下または非存在下で15分間のインキュベーションを行った。細胞をPBSで2回洗浄し、(50mM Hepes pH7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、10mM Na4P2O7、100mM NaF、10%グリセリン、1.5% Triton X−100、新たに添加したComplete Protease Inhibitorカクテル(Roche No. 1873580001)、4mM Na3VO4、NaOHでpHを7.4に調節したもの)からなる溶解バッファー中、室温で5分間振とうすることで、細胞を溶解した。試料を急速冷凍し、R&DのP−FGFR2 ELISAで、製造者の指示に従って分析を行うまで、−80℃で保存した。450nM(Tecan Spectra, Rainbow)で光学密度を測定し、バックグラウンド補正を行った。P−FGFR2のレベルを無処置対象レベルの%として算出した。抗体フォーマットの非特異的効果を制御するために、並行して、同じアイソタイプの非細胞結合性対照IgGと共に試料をインキュベートした。
抗FGFR2抗体で処理した後のFGFR2表面発現を分析するために、FGFR2過剰発現(MFM223、SNU16)またはFGFR2変異(AN3−CA、MFE−296)を伴う異なる細胞株において、FACS分析を行った。付着細胞をPBS(CaおよびMg不含)で2回洗浄し、酵素非含有PBS系細胞解離バッファー(Invitrogen)によって剥離した。80μlの成長培地(MFM223、MFE−296:MEMアール(Biochrom;F0315)+10%FCS+2mMグルタミン、SNU−16:RPMI 1640(Biochrom、FG1215)+10%FBS;AN3−CA:MEMアール(Biochrom;FG0325)+10%FCS+1mMピルビン酸ナトリウム+1×NEA:非必須アミノ酸Biochrom K0293)に、0.5×105細胞/ウェルの密度で、細胞を懸濁した。5倍濃度の抗体希釈液20μlを加え(最終濃度10μg/ml)、37℃で4.5時間インキュベートした。このインキュベーション時間の後、細胞を100μlのFACSバッファーで1回洗浄し、検出抗体(濃度5μg/ml、hIgGにはマウス抗FGFR2、mIgGにはヒト抗FGFR2)で4℃において45分間染色した後、100μlのFACSバッファーによる洗浄をもう一度行った。PE染色二次抗体(PEヤギ抗ヒトIgG、Dianova #109−115−098、またはPEヤギ抗マウスIgG、Jackson Immuno Research #115−115−164、1:150希釈)を80μlの体積で加え、4℃で45分間インキュベートし、FACSバッファーでもう一度洗浄した後、細胞を、フローサイトメトリーにより、FACS Array(BD Biosciences)を使って分析した。対照実験では、目的の抗体と対応する検出抗体とを並行してインキュベートすることにより、オーバーラップするエピトープに関する抗体競合を排除した。二次抗体のみで染色した後に測定される幾何平均を、抗FGFR2抗体で染色した後に検出されるピークの幾何平均から差し引いた。結果を、抗体の非存在下で4.5時間インキュベートした対照細胞の%として算出する。
抗FGFR2抗体によって誘発されるFGFR2表面ダウンレギュレーションが全FGFR2レベルの長期間減少につながるかどうかを分析するために、FGFR2の全タンパク質レベルをFGFR2 ELISAによって分析した。SNU16細胞を、96ウェルプレートに、成長培地(RPMI 1640(Biochrome、FG1215)+10%FBS)中、5000細胞/ウェルの密度でプレーティングした。2時間後に細胞を、表示のとおりさまざまな濃度の抗FGFR2抗体または対応するアイソタイプ対照IgGと共にインキュベートした。抗体と共にインキュベーションを開始してから96時間後に、細胞を室温において300gで5分間遠心分離し、PBS中で2回洗浄し、100μlの溶解バッファー(50mM Hepes pH7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、10mM Na4P2O7、100mM NaF、10%グリセリン、1.5% Triton X−100、新たに添加したComplete Protease Inhibitorカクテル(Roche No.1873580001)、4mM Na3VO4、NaOHでpHを7.4に調節したもの)を添加して室温で5分間振とうすることによって溶解した。試料を急速冷凍し、全FGFR2−ELISAキット(R&D Systems)を製造者の指示に従って使用することによる分析まで、−80℃で保存した。450nM(Tecan Spectra, Rainbow)で光学密度を測定すると共にバックグラウンド補正を行った。全FGFR2の絶対レベルを算出するために、単離FGFR2タンパク質を使った標準曲線を、製造者の推奨(R&D Systems)に従って適用した。結果を、抗体の非存在下で96時間インキュベートした対照細胞において測定されるFGFR2レベルの%として表す。
本発明の抗FGFR2抗体を、FGFR2抗原への結合後にインターナライズするその能力について分析した。
本発明の抗FGFR2抗体のインビボ効力を、例えば異種または同種異系皮下腫瘍モデルによって試験した。本発明の抗体の効力を試験するための先行技術の方法は当業者には知られている。そこで例えばターゲットFGFR2を発現する腫瘍細胞をマウスの皮下に接種した。その後、腫瘍担持マウスを、本発明のFGFR2ターゲティング抗体、非結合性アイソタイプ対照またはリン酸緩衝食塩水(PBS)のいずれかで処置した。抗体の適用は腹腔内または静脈内に週に2回行った。付加的抗腫瘍効力を調べるために、本発明のFGFR2 Abを、一般的な標準治療と併用し、単剤での効力と比較した。カリパスによる頻繁な腫瘍面積測定によって、腫瘍成長を監視した。数週間にわたる腫瘍成長と処置の後に、腫瘍を収穫し、本発明の抗FGFR2抗体で処置された動物の腫瘍重量または腫瘍サイズ(式:長さ×幅によって算出される腫瘍面積)を、PBSまたはアイソタイプ対照抗体で処置したものと比較した。本発明の抗FGFR2抗体で処置されたマウスは、有意に小さい腫瘍を示した。
観察された全FGFR2レベルのダウンレギュレーションと、それと同時に起こるP−FGFR2の低減とが、インビボの異種移植片腫瘍でも見られるかどうかを分析するために、抗FGFR2抗体による処置後のSNU−16腫瘍をウェスタンブロットによって分析した。抗FGFR2抗体(2mg/kg、i.p.、週2回)で処置したNOD/SCIDマウスにおける異種移植片実験(詳細については実施例13を参照されたい)の終了時に腫瘍を収集した。最後の抗体注射の24時間後に腫瘍を採取し、液体窒素中で瞬間凍結し、分析まで−80℃で貯蔵した。ウェスタンブロット分析に先だって、凍結腫瘍を直径約5mmの薄片に切断し、各薄片を、予冷した5mmスチール球(Qiagen)および500μlの溶解バッファー(50mM Hepes pH7.2、150mM NaCl、1mM MgCl2、10mM Na4P2O7、100mM NaF、10%グリセリン、1.5% Triton X−100、新たに添加したComplete Protease Inhibitorカクテル(Roche No. 1873580001)、4mM Na3VO4、NaOHでpHを7.4に調節したもの)と一緒に、2mlエッペンドルフチューブに入れた。試料を、Tissuelyzer(Qiagen)中、300Hzで3分間溶解した後、氷上で30分間インキュベートした。次に、試料を、微量遠心機(Eppendorf)中、4℃、13000rpmで10分間遠心分離し、一つの元腫瘍に由来する薄片からの上清を、再び一つにプールした。BCAプロテインアッセイキット(Novagen、H2Oに1:50希釈した溶解物)を使って、腫瘍溶解物中のタンパク質レベルを決定した。試料を5mg/mlの最終濃度に希釈し、50μlの試料を、7.7μlの(10×)サンプル還元(Sample Reducing)剤および19.2μl(4×)NuPAGEサンプルバッファー(Sample Buffer)(Invitrogen)と混合した。115μgのタンパク質に相当する試料を、Invitrogen製NuPage 4−12% SDS PAGEゲルに適用し、120Vで2時間45分にわたって、泳動した。ブロッティングは、iBlotシステム(Invitrogen)により、製造者の推奨に従って行った。メンブレンを、5%BLOT QuickBlocker/PBST(Invitrogen)中、室温で2時間ブロッキングした後、一次抗体と共に4℃で終夜インキュベートした。一次抗体は次のとおりであった:P−FGFR:#AF3285、R&D Systems、0.5μg/m;全FGFR2:M017−B02−hIgG1、4μg/ml、3%BLOT QuickBlocker/PBST中。翌日、メンブレンをPBST中で3回洗浄した後、二次抗体(ペルオキシダーゼコンジュゲートAffiniPureヤギ抗ウサギIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch #111−035−003)またはペルオキシダーゼコンジュゲートAffiniPureヤギ抗ヒトIgG+IgM(H+L)(Jackson ImmunoResearch #109−035−127、3%BLOT QuickBlocker/PBST中、1:10000)と共に、室温で2時間インキュベートした。次に、メンブレンをPBSTで10分間、4回洗浄し、ECL試薬と共にインキュベートした後のケモルミネセンスによって、シグナルを検出した。ローディング対照を検出するために、メンブレンをストリッピング溶液ストロング(Milipore−H2O中、1:10)中、室温で15分間振とうしてストリッピングした後、ブロッキングし、3%QuickBlocker/PBST中、1:1000の抗アクチン抗体#A2066(Sigma)で検出した。
抗FGFR2抗体は、当技術分野において知られているプロトコールを使って、細胞毒性小分子にコンジュゲートすることができる(例えばLiuら, Proc Natl. Acad. Sci. (1996), 93, 8618−8623)。A431細胞は、10%FBSを補足したDMEM中で、接着培養物として維持される。6〜7週齢のNOD SCIDまたは他の免疫不全マウスの右脇腹に、培地0.1ml中の1〜5×106細胞が、皮下接種されるであろう。腫瘍サイズが約25mm2に達したら、4、7または10日ごとに、1〜10mg/kgの用量で、3回、抗体薬物コンジュゲートが腹腔内投与されるであろう。対照マウスは、PBSまたは同じ担毒体とコンジュゲートされた無関係なモノクローナル抗体で処置され、腫瘍サイズはノギスを使って週に2回測定されるであろう。抗腫瘍効力は、抗FGFR2抗体薬物コンジュゲート処置の腫瘍サイズと対照処置の腫瘍サイズとを比較することによって、評価されるであろう。
表9に示すファージディスプレイによって見いだされた本発明の抗FGFR2抗体を、親和性成熟によってさらに最適化した。
a)ペプチド結合ELISA:ビオチン化リジンにC末端で連結されたエピトープのアミノ酸配列を含む合成ペプチドRPSFSLVEDTTLEPEG−Ttds−Lys(ビオチン)(配列番号63に由来するペプチド配列、JPT Peptide Technology GmbH(ドイツ・ベルリン)で合成された)、および
b)組換えタンパク質結合ELISA:組換えヒトFGFR2(ヒトFGFR2のDNA配列(NP_000132.3)Met1〜Glu377、C末端でポリヒスチジンタグと融合されたもの;#10824−H08H、Sino Biological Inc.、中国・北京)。
本発明の抗FGFR2抗体と当技術分野において記載されている抗FGFR2抗体との間の競合を分析するために、さまざまな抗体を競合ELISAフォーマットで評価した。
Claims (25)
- FGFR2を過剰発現する細胞株SNU16(ATCC−CRL−5974)およびMFM223(ECACC−98050130)ならびに変異型FGFR2を発現する細胞株AN3−CA(DSMZ−ACC 267)およびMFE−296(ECACC−98031101)において、FGFR2への結合後にFGFR2の細胞表面発現を低減する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
- 配列番号63によって表されるFGFR2の細胞外N末端エピトープ(1RPSFSLVEDTTLEPE15)に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
- 細胞外N末端エピトープ(配列番号63)への抗体の結合が、Arg1、Pro2、Phe4、Ser5、Leu6、およびGlu8からなる残基の群より選択される少なくとも1つのエピトープ残基によって媒介される、請求項2に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
- FGFR2のN末端エピトープ(1RPSFSLVEDTTLEPE15)中のアミノ酸残基の少なくとも1つをアラニンに変えることによって、そのELISAシグナルの50%以上を失い、
a.該残基が群Pro2、Leu6およびGlu8から選択されるか、
b.該残基が群Arg1、Pro2、Phe4およびSer5から選択される、
請求項2〜3のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - FGFR2への結合において、群「M048−D01」、「M047−D08」、「M017−B02」、「M021−H02」、「M054−A05」、「M054−D03」、「TPP−1397」、「TPP−1398」、「TPP−1399」、「TPP−1400」、「TPP−1401」、「TPP−1402」、「TPP−1403」、「TPP−1406」、「TPP−1407」、「TPP−1408」、「TPP−1409」、「TPP−1410」、「TPP−1411」、「TPP−1412」、および「TPP−1415」から選択される少なくとも1つの抗体と競合する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合性フラグメント。
- 抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列が、「M048−D01」、「M047−D08」、「M017−B02」、「M021−H02」、「M054−A05」、「M054−D03」、「TPP−1397」、「TPP−1398」、「TPP−1399」、「TPP−1400」、「TPP−1401」、「TPP−1402」、「TPP−1403」、「TPP−1406」、「TPP−1407」、「TPP−1408」、「TPP−1409」、「TPP−1410」、「TPP−1411」、「TPP−1412」、または「TPP−1415」の少なくとも1つのCDR配列に対して、少なくとも50%、55%、60%、70%、80%、90%、または95%同一であるか、「M048−D01」、「M047−D08」、「M017−B02」、「M021−H02」、「M054−A05」、「M054−D03」、「TPP−1397」、「TPP−1398」、「TPP−1399」、「TPP−1400」、「TPP−1401」、「TPP−1402」、「TPP−1403」、「TPP−1406」、「TPP−1407」、「TPP−1408」、「TPP−1409」、「TPP−1410」、「TPP−1411」、「TPP−1412」、または「TPP−1415」のVH配列またはVL配列に対して、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、92%または95%同一である、請求項5に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
- 表9および表10に記載の少なくとも1つのCDR配列または少なくとも1つの可変重鎖もしくは軽鎖配列を含む、請求項5〜6のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
- a.配列番号5〜7によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号8〜10によって表される可変軽鎖CDR配列、または
b.配列番号15〜17によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号18〜20によって表される可変軽鎖CDR配列、または
c.配列番号25〜27によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号28〜30によって表される可変軽鎖CDR配列、または
d.配列番号35〜37によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号38〜40によって表される可変軽鎖CDR配列、または
e.配列番号45〜47によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号48〜50によって表される可変軽鎖CDR配列、または
f.配列番号55〜57によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号58〜60によって表される可変軽鎖CDR配列、または
g.配列番号75〜77によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号78〜80によって表される可変軽鎖CDR配列、または
h.配列番号85〜87によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号88〜90によって表される可変軽鎖CDR配列、または
i.配列番号95〜97によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号98〜100によって表される可変軽鎖CDR配列、または
j.配列番号105〜107によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号108〜110によって表される可変軽鎖CDR配列、または
k.配列番号115〜117によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号118〜120によって表される可変軽鎖CDR配列、または
l.配列番号125〜127によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号128〜130によって表される可変軽鎖CDR配列、または
m.配列番号135〜137によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号138〜140によって表される可変軽鎖CDR配列、または
n.配列番号145〜147によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号148〜150によって表される可変軽鎖CDR配列、または
o.配列番号155〜157によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号158〜160によって表される可変軽鎖CDR配列、または
p.配列番号165〜167によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号168〜170によって表される可変軽鎖CDR配列、または
q.配列番号175〜177によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号178〜180によって表される可変軽鎖CDR配列、または
r.配列番号185〜187によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号188〜190によって表される可変軽鎖CDR配列、または
s.配列番号195〜197によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号198〜200によって表される可変軽鎖CDR配列、または
t.配列番号205〜207によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号208〜210によって表される可変軽鎖CDR配列、または
u.配列番号215〜217によって表される可変重鎖CDR配列および配列番号218〜220によって表される可変軽鎖CDR配列
を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。 - a.配列番号1によって表される可変重鎖配列および配列番号2によって表される可変軽鎖配列、または
b.配列番号11によって表される可変重鎖配列および配列番号12によって表される可変軽鎖配列、または
c.配列番号21によって表される可変重鎖配列および配列番号22によって表される可変軽鎖配列、または
d.配列番号31によって表される可変重鎖配列および配列番号32によって表される可変軽鎖配列、または
e.配列番号41によって表される可変重鎖配列および配列番号42によって表される可変軽鎖配列、または
f.配列番号51によって表される可変重鎖配列および配列番号52によって表される可変軽鎖配列、または
g.配列番号73によって表される可変重鎖配列および配列番号74によって表される可変軽鎖配列、または
h.配列番号83によって表される可変重鎖配列および配列番号84によって表される可変軽鎖配列、または
i.配列番号93によって表される可変重鎖配列および配列番号94によって表される可変軽鎖配列、または
j.配列番号103によって表される可変重鎖配列および配列番号104によって表される可変軽鎖配列、または
k.配列番号113によって表される可変重鎖配列および配列番号114によって表される可変軽鎖配列、または
l.配列番号123によって表される可変重鎖配列および配列番号124によって表される可変軽鎖配列、または
m.配列番号133によって表される可変重鎖配列および配列番号134によって表される可変軽鎖配列、または
n.配列番号143によって表される可変重鎖配列および配列番号144によって表される可変軽鎖配列、または
o.配列番号153によって表される可変重鎖配列および配列番号154によって表される可変軽鎖配列、または
p.配列番号163によって表される可変重鎖配列および配列番号164によって表される可変軽鎖配列、または
q.配列番号173によって表される可変重鎖配列および配列番号174によって表される可変軽鎖配列、または
r.配列番号183によって表される可変重鎖配列および配列番号184によって表される可変軽鎖配列、または
s.配列番号193によって表される可変重鎖配列および配列番号194によって表される可変軽鎖配列、または
t.配列番号203によって表される可変重鎖配列および配列番号204によって表される可変軽鎖配列、または
u.配列番号213によって表される可変重鎖配列および配列番号214によって表される可変軽鎖配列
を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。 - IgG抗体である、上記請求項のいずれか一項に記載の抗体。
- scFv、Fab、Fab’フラグメントまたはF(ab’)2フラグメントである、上記請求項のいずれか一項に記載の抗原結合性フラグメント。
- モノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントである、上記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
- ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体または抗原結合性フラグメントである、上記請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸配列。
- 請求項15に記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを発現し、かつ/または請求項15に記載の核酸または請求項16に記載のベクターを含む、単離された細胞。
- 原核細胞または真核細胞である、請求項17に記載の単離された細胞。
- 請求項18に記載の細胞を培養することおよび抗体または抗原結合性フラグメントを精製することを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを製造する方法。
- 医薬としての、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは請求項14に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 診断剤としての、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体または抗原抗原結合性フラグメント。
- がんを処置するための医薬としての、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは請求項14に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合性フラグメントまたは請求項14に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む、医薬組成物。
- 請求項23に記載の医薬組成物と1つ以上の治療活性化合物との組み合わせ。
- 望ましくないFGFR2の存在と関連する障害または状態を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に、有効量の、請求項23に記載の医薬組成物または請求項24に記載の組み合わせを投与することを含む方法。
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