JP2015503924A - 遺伝子導入のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本明細書で開示されるのは、筋肉特異的な及び筋肉非特異的なプロモータからのＧＮＥをコードするＡＡＶに基づくウイルスベクター、及び変化したＧＮＥ機能に関連するミオパチーを治療することにおけるその使用である。【選択図】図１

Description

ＧＮＥをコードするＡＡＶに基づくウイルスベクター及び変化したＧＮＥ機能に関連するミオパチーを治療することにおけるその使用が提供される。

遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）（Askanas and En gel, 1998）、大腿四頭筋温存ミオパチー（Argov and Yarom, 1984）、及び縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ、野中病）（Nonaka et al., 1981）として様々に知られる劣性の成人発症性ミオパチーである、ＧＮＥミオパチーは、シアル酸の生合成経路における鍵となる酵素であるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼをコードする遺伝子（ＧＮＥ）における突然変異が原因となって生じる。状態は世界中の分布を有し、ほとんどの患者は複合ヘテロ接合体であり、ＧＮＥ遺伝子のエピメラーゼドメイン又はキナーゼドメイン又は各ドメインの１つでの突然変異を保有する。

ＧＮＥにおける突然変異が筋疾患をもたらす過程は理解されていない。ＧＮＥ^−／−の背景で生成され、酵素のエピメラーゼドメインに存在するＤ１７６ＶのＧＮＥミスセンス変異である日本人患者での頻繁な変異を過剰に発現するトランスジェニックマウスモデルは、ＧＮＥミオパチーについて関連するモデルであることが分かっている（Malicdan et al, 2007; Malicdan et al, 2009）。

ＵＳ２００９／０２９８１１２は、それを必要とする対象を特定することと、対象に化合物、又はその薬学上許容可能な塩、エステル、アミド、グリコール、ペプチジル又はプロドラッグを投与することを含む、対象にてＧＮＥミオパチーを治療する方法を議論しているが、その際、化合物は、グルコースとシアル酸を含めた間での生化学経路に沿って野生型個体にて生合成される化合物である。その中で議論されているのはまた、ＧＮＥアイソフォーム１の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターと、これらのベクターを含む組換え細胞と、細胞を含む組換え動物である。加えて、ＧＮＥミオパチーに対して治療効果を有する化合物を特定する方法が記載されている。

最近、リポソーム介して送達されるＧＮＥ遺伝子の注入による遺伝子療法治療が単一のＧＮＥミオパチー患者について報告されている（Nemunaitis et al, 2011）。ｗｔＧＮＥのｍＲＮＡが患者の大腿四頭筋で発現されたことが示されているが、これは、注入後７２時間のみでアッセイされたにすぎず、注入前の患者の状態の重症度のために、その有効性を正しく評価することはできなかった。

本明細書で開示されるのは、筋肉特異的なプロモータ及び筋肉非特異的なプロモータからのＧＮＥをコードするＡＡＶに基づくウイルスベクター、及び変化したＧＮＥ機能に関連するミオパチーを治療することにおけるその使用である。ＡＡＶに基づくベクターの使用は当該技術で既知ではあるが、変化したＧＮＥ機能に関連するミオパチーを治療することにおけるその使用は本発明者らに知る限り、従来考慮されてこなかった。本開示はその種のミオパチーを治療することにおけるそのようなベクターの相当な有効性を実証する。

ＡＡＶ／ＧＮＥによって形質導入された細胞におけるＧＦＰの発現を示す図である。２×１０^５個の細胞当たり１×１０^５のＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰウイルスベクターによって形質導入した後、様々な時点でＧＦＰを発現するマウスＣ２Ｃ１２細胞（上のグラフ）及びヒトＧＮＥミオパチーの筋肉細胞（下のグラフ）の比率。 ＡＡＶ／ｈＧＮＥによって形質導入された細胞におけるヒトＧＮＥのｍＲＮＡの発現を示す図である。上の図：ＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰウイルスベクターによってマウスＣ２Ｃ１２細胞に形質導入し、マウスＧＮＥに対してヒトＧＮＥに特異的なプライマーによるＲＴ／ＰＣＲによってｈＧＮＥのｍＲＮＡの発現を解析するために形質導入の８日後、ＧＦＰの発現について細胞を選別した。下の図：ＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（２×１０^５個の細胞当たり１×１０^５のウイルスベクター）によって形質導入した８日後、Ｍ７１２Ｔ変異を持つＧＮＥミオパチー患者に由来する筋肉培養細胞にてＡＲＭＳ法を用いたＲＴ／ＰＣＲによってヒト野生型ＧＮＥｍＲＮＡの発現を解析した。対照として、野生型（Ｗｔ）又は変異した（Ｍｕｔ）ｃＤＮＡのみを検出するプライマーセットによって正常細胞又はＧＮＥミオパチー細胞を解析した。Ｍは分子量標準を示す。 ＡＡＶベクターを注射したマウスの体重及び握力を示す図である。マウス当たり８．５×１０^１１ｖｇのＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｈＧＮＥ）又はＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｌｌｕｃ）、マウス当たり２．４×１０^１２ｖｇのＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｈｌｕｃ）又はＰＢＳのいずれかをマウスに静脈注射した。注射後、様々な時点で体重（上のグラフ）及び握力（下のグラフ）をモニターした。 ＡＡＶ／ルシフェラーゼで形質導入したマウスにおけるルシフェラーゼ活性を示す図である。４Ａ：マウス当たり８．５×１０^１１ｖｇの（Ｌｌｕｃ）又はマウス当たり２．４×１０^１２ｖｇの（Ｈｌｕｃ）にてＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの注射後の様々な時間でＩＶＩＣＳ動態システム（マサチューセッツ州、ホプキントンのＣａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて得られた代表的な生体内生物発光画像。発光はグレイスケール画像にて斑点として現れる。４Ｂ：平均放射輝度（ｐ／秒／ｃｍ^２／ｓｒ）として表されるルシフェラーゼ活性の定量。 ＡＡＶベクターを注射したマウスの筋肉におけるｈＧＮＥｍＲＮＡの発現を示す図である。マウス当たり８．５×１０^１１ｖｇのＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｈＧＮＥ）又はＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｌｌｕｃ）、マウス当たり２．４×１０^１２ｖｇのＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｈｌｕｃ）又はＰＢＳのいずれかによって形質導入した後、様々な時点のマウスの様々な筋肉にてリアルタイムＰＣＲによってｈＧＮＥｍＲＮＡの定量的発現を解析した。各試料についての相対的な定量的発現（ＲＱ）又は発現倍率は、標準化したｈＧＮＥとｍＧＮＥ（ｈＧＮＥ／ｍＧＮＥ）の値の間での比率として定義し、対照のマウス組織（適宜、ＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰを高用量若しくは低用量で注射したマウスの組織、又はＰＢＳを注射したマウスの組織）で検出されたＲＱ＝１として設定した最高値と比べる。 ＡＡＶベクターを注射したマウスの組織におけるｈＧＮＥｍＲＮＡの発現を示す図である。マウス当たり８．５×１０^１１ｖｇのＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｈＧＮＥ）又はＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｌｌｕｃ）、マウス当たり２．４×１０^１２ｖｇのＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｈｌｕｃ）又はＰＢＳのいずれかによって形質導入した後、様々な時点のマウスの様々な組織にてリアルタイムＰＣＲによってｈＧＮＥｍＲＮＡの定量的発現を解析した。相対的な定量的発現（ＲＱ）又は発現倍率は、図５で記載したように定義した。 ＡＡＶ由来のベクターの作出に使用したプラスミドを示す図である。７Ａ：ＡＡＶ８ウイルスベクターを作出するために、ｐＨｅｌｐｅｒと、ｐＡＡＶ８と、ｐＣＭＶ−ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ又はｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドのいずれかによってＨＥＫ２９３細胞に三重形質移入した。ｐＣＭＶ−ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位にてｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰからのルシフェラーゼ遺伝子をｈＧＮＥｃＤＮＡにより置き換えることによって生成した。７Ｂ：ｐＣＭＶ−ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰの拡大図である。 ＡＡＶ／ｈＧＮＥを注射した後の種々のマウス組織におけるＡＡＶ８／ｈＧＮＥのコピー数を示す図である。ＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰウイルスベクターの注射後、様々な時点でのウイルスのコピー数についてリアルタイム定量ＰＣＲによって種々の組織及び組織を解析した。それぞれ１００ｎｇ及び１０ｎｇの２つの組織ＤＮＡ測定を行い、プラスミドで得た検量線に対して平均を算出した。細胞当たりのｖｇの算出については、１ｎｇの組織を１５０のゲノムコピーと同等であると見なした。 ＡＡＶ８ベクターによって形質導入した４５日後のマウス組織の組織学を示す図である。種々のＡＡＶ８ベクターを注射した４５日後、マウスのパラフィン組織切片及び筋肉の凍結切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。肝臓切片（×４０）及び腎臓切片（×１０）を除いて写真はすべて×２０の倍率で撮影した。 ＡＡＶベクターによって形質導入した１７８日後のマウス組織の組織学を示す図である。種々のＡＡＶ８ベクターを注射した４５日後、マウスのパラフィン組織切片（５μ）及び筋肉の凍結切片（８μ）をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。肝臓切片（×４０）及び腎臓切片（×１０）を除いて写真はすべて×２０の倍率で撮影した。 ＡＡＶ８ベクターによって形質導入した４５日後及び１７８日後の追加のマウス組織の組織学を示す図である。上記図１０の記載を参照のこと。 ＡＡＶを注射したマウスの血清におけるＩＰ−１０のレベルを示す図である。マウス当たり８．５×１０^１１ｖｇのＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｈＧＮＥ）又はＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｌｌｕｃ）、マウス当たり２．４×１０^１２ｖｇのＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（Ｈｌｕｃ）又はＰＢＳを注射したマウスの種々の時点での血清にてＥＬＩＳＡによってＩＰ−１０のレベル（ｐｇ／ｍｌ）を測定した。測定は４３日目までは各群４匹のマウス、及び９２日目までは３匹のマウスで行った。 筋肉特異的なプロモータの制御下でｈＧＮＥを発現するＡＡＶに基づいたベクターであるＡＡＶ−ＭＣＫ−ＧＮＥの模式図を示す。 ＡＡＶ／ｈＧＮＥを注射したマウスの種々の組織におけるヒトＧＮＥｍＲＮＡの発現を示す図である。１×１０^１２のウイルスベクターゲノムをマウスの尾静脈に注射した。各カラムは１匹のマウスを表す。ｙ軸の尺度は、同一組織におけるＰＢＳを注射したマウスで測定された発現（ＲＱ＝１）に対するｈＧＮＥ（特異的なＴａｑｍａｎプローブ）ｍＲＮＡの発現倍率−相対ＲＱを表す。値はすべて関連する内在性マウス組織のＧＮＥ発現に対して正規化した。「ＭＣＫ／ＧＮＥ」及び「ＣＭＶ／ＧＮＥ」は、それぞれＭＣＫプロモータ又はＣＭＶプロモータによって駆動される野生型ヒトＧＮＥを含有するＡＡＶ８ウイルスベクターを示す。

本明細書で記載されるのは、プロモータに機能的に連結されたＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン２エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）をコードするヌクレオチド配列を含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に基づくウイルスベクターである。特定の実施形態では、ＡＡＶに基づくベクターは、ＡＡＶパッケージングシグナルを含む。さらに具体的な実施形態では、ＡＡＶに基づくベクターは、ＡＡＶパッケージングシグナルを含み、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含有せず、他の実施形態では、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の断片が存在するのであれば、前記断片は小さすぎて機能的ではない。他の実施形態では、ＡＡＶに基づくベクターはＡＡＶパッケージングシグナル並びにｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の双方を含む。

ＧＮＥ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋＩＤ番号１００２０を有する。代表的な配列には、すべて２０１２年１２月２５日にアクセスされたＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１１２８２２７、ＮＭ＿００１１９０３８３、ＮＭ＿００１１９０３８４、ＮＭ＿００１１９０３８８、ＮＭ＿００５４７６、ＡＹ５３１１２７、ＡＹ５３１１２８、ＡＹ５３１１２６、ＡＫ３１２５３９、及びＥＵ０９３０８４（それぞれ、配列番号１２〜２１）が挙げられる。特定の実施形態では、遺伝子は、そのそれぞれが別々の実施形態を表す、ＧＮＥの転写変異体１、２、３、４及び５から選択される。

特定の実施形態では、ベクターによって発現されるＧＮＥはヒトＧＮＥである。さらに具体的な実施形態では、遺伝子は、そのそれぞれが別々の実施形態を表す、ＧＮＥの転写変異体１、２、３、４及び５から選択される。技量のある熟練者は、ヒトの筋肉組織で機能的である種々のＧＮＥタンパク質、たとえば、ヒトＧＮＥの変異体、非ヒトＧＮＥタンパク質及びその変異体、及びＧＮＥのそのような形態をコードする遺伝子も使用することができることを本開示の観点から十分に理解するであろう。代謝的に機能的なＧＮＥタンパク質をコードする遺伝子が一般的に好ましい。特定の実施形態では、完全に機能的なＧＮＥが使用される。この文脈での「完全に機能的なＧＮＥ」はシアル酸の生合成にて野生型のヒトＧＮＥと少なくとも同等である活性を示すＧＮＥ遺伝子を指す。ＧＮＥの触媒活性をアッセイする方法は当該技術で既知であり、とりわけ、Ｋｅｐｐｌｅｒら、１９９９に記載されている。

ＡＡＶに基づくベクターは、とりわけ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｂ．Ｖ．（ＮＬ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（カナダ、オンタリオ州、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）、ＮａｎｏＣｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（米国ノースカロライナ州、チャペルヒル）、及びＶｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（中国、北京）によって製造される。ＡＡＶの部分配列及び完全配列並びにＡＡＶに基づくベクターの作出及び使用は、すべて２０１２年１２月２５日にアクセスされたＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＨＣ００００６８（配列番号２２）、ＨＣ００００５７、ＨＣ００００６１、ＨＣ００００４４（配列番号２３）、ＨＣ００００４１、ＨＣ００００３９、ＨＣ００００５９、ＨＣ００００４６、ＨＣ００００４２、ＨＣ００００４０、ＨＣ００００３８、Ｙ１８０６５（配列番号：２４）、ＮＣ＿００６２６１（配列番号：２５）、及びすべて参照によって組み入れられる米国特許公開２０１１／０１３６２２７、同２０１２／０２５３０１８、同２０１２／０２３２１３３、同２０１２／０２２０６４８、同２０１２／０１６４１０６、同２０１２／００２８３５７、同２０１１／０２３６３５３、同２０１０／０２６０８００、同２０１０／０２２７４０７、同２０１０／０３１０６０１、同２０１０／０２７８７９１、及び米国特許第８、３１８、６８７号、同第８、２９８、８１８号、同第８、２７３、３４４号、同第７、４５６、０１５号、同第７、０９４、６０４号及び同第６、６７０、１７６、並びに参照によって組み入れられるＧａｄａｌｌａらに記載されている。ＡＡＶの一般的な安全性及び有効性は、ＡＡＶの基本骨格を用いた臨床試験（すべて参照によって組み入れられるＣａｒｔｅｒ，２００５；Ｍａｇｕｉｒｅら、２００８；Ｐａｒｋら、２００８；Ｎａｔｈｗａｎｉら、２０１１；及びＨｕら、２０１０）を含めて文書で十分に立証されている。

特定の実施形態では、ＡＡＶに基づくベクターは組換えベクターである。代わりに又はさらに、ベクターはＡＡＶウイルス又はベクターにＧＮＥ遺伝子を導入することによって創られたベクターである。

特定の実施形態では、ＡＡＶ様のベクターは、そのそれぞれが別々の実施形態を表すＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１から選択される。たとえば、ＡＡＶベクターはＡＡＶ８ベクターのカプシド配列を含有し得る。ＡＡＶ８が、本明細書で利用される一方で、技量のある熟練者は、記載される組成物及び方法の文脈で生体内でのＧＮＥの発現に種々のＡＡＶベクターが好適であることを本開示の観点で十分に理解するであろう。複数のＡＡＶ血清型の可用性は多数の当該組織に対する効率的なターゲッティングを可能にする（それぞれ参考によって本明細書に組み入れられるＧａｏら、２００２ ＭｃＣａｒｔｙ、２００８；米国特許公開２００８／０７５７３７、２００８／００５０３４３、２００７／００３６７６０、２００５／００１４２６２、２００４／００５２７６４、２００３／０２２８２８２、２００３／００１３１８９、２００３／００３２６１３、及び２００２／００１９０５０）。代わりに又はさらに、ベクターは自己相補性（ｓｃ）のベクターであり、それは、たとえば、米国特許公開２００７／０１１０７２４及び２００４／００２９１０６及び米国特許第７，４６５，５８３号及び同第７，１８６，６９９号（すべて参照によって組み入れられる）に記載されている。追加のベクターは米国特許公開２０１１／０３０１２２６に記載されており、それは参照によって組み入れられる。

他の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、たとえば、（ｉ）ｓｃＡＡＶ.ＧＮＥ、たとえば、ｈＧＮＥと、（ｉｉ）ｒｅｐ及びｃａｐの転写物をコードするｒｅｐ−ｃａｐＡＡＶヘルパープラスミドと（ｉｉｉ）アデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６及びＶＡ Ｉ／ＩＩ ＲＮＡの遺伝子を発現するアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡｄヘルパー）用いた三重形質移入法によって作出することができる。

さらに他の実施形態では、記載されるＡＡＶベクターのゲノムを作出するのに使用されるプラスミドは、ＡＡＶ血清型（たとえば、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１から選択される）から取られるカプシドシグナル配列と、異なる血清型（たとえば、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１から選択される）に由来するパッケージング配列を含有し、その例は、ＡＡＶ８ベクターのカプシド配列とＡＡＶ２ベクターのシグナル配列を含有するＡＡＶ２／８ベクターである。ＡＡＶベクターに存在するシグナル配列は本明細書で記載される目的にとって生体内での有効性に有意な影響を及ぼすとは考えられない。

用語「プロモータに機能的に連結される」は本明細書で使用されるとき、ＧＮＥ遺伝子がプロモータの制御下で発現されることを指す。言い換えれば、プロモータがＧＮＥ遺伝子の発現を指示する。種々の実施形態では、本明細書で記載されるベクターはＧＮＥのオープンリーディングフレームのための内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有してもよいし、又は含有しなくてもよい。

ＧＮＥをコードするヌクレオチド配列は、非限定の実施形態では、天然に存在するｃＤＮＡ配列又は修飾されたｃＤＮＡ配列のようなｃＤＮＡであることができる。当業者は他の好適な種類のヌクレオチド配列も利用することができることを本開示の観点から認識するであろう。

ＧＮＥをコードするヌクレオチド配列を発現させるのに使用されるプロモータは、特定の実施形態では、筋肉特異的なプロモータである。他の実施形態では、それは筋肉非特異的なプロモータである。この文脈における「筋肉特異的なプロモータ」は、ベクターに含まれるその周辺の配列の文脈で、上皮細胞のような参照細胞よりも筋肉細胞にて少なくとも５倍高い発現を提供するプロモータを指す。代わりの実施形態では、筋肉細胞における発現は参照細胞よりも少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍又は少なくとも２０倍高い。

筋肉特異的なプロモータの非限定例は筋肉クレアチンキナーゼ（ＣＫＭ）のプロモータである。好適な筋肉クレアチンキナーゼのプロモータの非限定例は、ヒトの筋肉クレアチンキナーゼのプロモータ及びマウスの切り詰めた筋肉クレアチンキナーゼ（ｔＭＣＫ）プロモータである（Ｗａｎｇら、ＡＡＶベクターのための小型の筋肉特異的なプロモータの構築及び解析。Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８、Ｎｏｖ；１５（２２）：１４８９−９９）（代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１８８００２；配列番号２６）。ヒトの筋肉クレアチンキナーゼは、遺伝子ＩＤ番号１１５８（２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００００１９．９）を有する。筋肉特異的なプロモータの他の例には、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）のプロモータ、たとえば、ＭＬＣ２（遺伝子ＩＤ番号４６３３；２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿００７５５４．１）；ミオシン重鎖（ＭＨＣ）のプロモータ、たとえば、α−ＭＨＣ（遺伝子ＩＤ番号４６２４；２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿０２３４４４．１）；デスミンのプロモータ（遺伝子ＩＤ番号１６７４；２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿００８０４３．１）；心臓トロポニンＣのプロモータ（遺伝子ＩＤ番号７１３４；２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号．ＮＧ＿００８９６３．１）；トロポニンＩのプロモータ（遺伝子ＩＤ番号７１３５、７１３６、及び７１３７；２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿０１６６４９．１、ＮＧ＿０１１６２１．１、及びＮＧ＿００７８６６．２）；ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーのプロモータ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１、７６１（１９９１）；遺伝子ＩＤ番号４６５４；２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２４７８）；アクチンαのプロモータ（遺伝子ＩＤ番号５８、５９、及び７０；２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿００６６７２．１、ＮＧ＿０１１５４１．１、及びＮＧ＿００７５５３．１）；アクチンβのプロモータ（遺伝子ＩＤ番号６０；２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿００７９９２．１）；アクチンγのプロモータ（遺伝子ＩＤ番号７１及び７２；２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿０１１４３３．１及びＮＭ＿００１１９９８９３）；Ｐｉｔｘ３の眼球形態のイントロン１の中に存在する筋肉特異的なプロモータ（遺伝子ＩＤ番号５３０９）（Ｃｏｕｌｏｎら；筋肉特異的なプロモータは、２０１２年１２月２６日にアクセスされた代表的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＧ＿００８１４７の残基１１２１９−１１５２７に相当する；これらの残基は添付の配列ＩＤ表にて配列番号２７として提供される）；並びに参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開に記載されたプロモータが挙げられる。

特定の実施形態では、記載されるウイルスベクターはその免疫原性を低下させるように設計された修飾によって修飾され得る。そのような修飾の非限定例には、表面に露出したチロシン残基の数を減らす変異である。免疫原性の応答を回避するようにＡＡＶの能力を改善することは、必要に応じてウイルスベクターの有効な再利用を確保し得ることが、本開示の観点で当業者によって十分に理解されるであろう。最近の有望な研究はウイルスのカプシド構造を調節してさらに特異的な細胞を標的とする形質導入を得ること（Markusic et al., 2010）、又は免疫抑制によってウイルスのカプシド構造を調節すること（Mcintosh et ah, 2011）に関する。変異したＧＮＥタンパク質が正常レベルで患者にて発現される（Krause et ah, 2007）ので、正常な導入遺伝子ＧＮＥそれ自体に対する免疫応答への懸念はＧＮＥミオパチーのこの特定の症例では、はるかに少ないことが留意されるべきである。たった１つのヌクレオチドの変化を伴うタンパク質に対する生物の強力な免疫応答はほとんどありそうもないも十分に理解されるであろう。

提供されるのはまた、本明細書で記載されるようなウイルスベクターを含む宿主細胞である。

さらに、本明細書で記載されるようなウイルスベクターを含む医薬組成物が提供される。

本明細書で提供されるのはまた、本明細書で記載されるようなウイルスベクターを含む医薬組成物を投与する工程を含む、欠損したＧＮＥ機能に関連するミオパチーに罹っている対象を治療する方法である。本明細書で提供されるとき、記載される医薬組成物の単回投与が持続する発現、すなわち、ＧＮＥの少なくとも６ヵ月間の安定な発現を付与する。ウイルスベクターは本明細書で記載される特質のいずれかを有してもよく、そのそれぞれが別々実施形態を表す。

欠損したＧＮＥ機能に関連するミオパチーを治療するための薬物の調製における本明細書で記載されるようなウイルスベクターの使用も本明細書で提供される。ウイルスベクターは本明細書で記載される特質のいずれかを有してもよく、そのそれぞれが別々実施形態を表す。

特定の実施形態では、本明細書で記載される医薬組成物、又はその方法で使用されるものは欠損したＧＮＥ機能に関連するミオパチーを治療するのに適応される。そのようなミオパチーの具体例には、遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）、大腿四頭筋温存ミオパチー、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）及び野中病が挙げられる。ウイルスベクターは本明細書で記載される特質のいずれかを有してもよく、そのそれぞれが別々実施形態を表す。

一部の実施形態はすでに罹患したミオパチーを治療することに関する。本明細書で記載される医薬組成物は驚くべきことにすでに罹患したミオパチーを治療することにて有意な有効性を有することが発見された。この文脈で「すでに罹患したミオパチー」は症候性のミオパチーを指す。代わりに、その用語は症候性のミオパチーを呈する対象を指し得る。

一部の実施形態では、記載される医薬組成物は全身性投与に適応される。全身性投与の非限定の一例は静脈内注射である。別の実施形態は動脈内投与である。本明細書で調べられる組成物は全身性に投与した場合でさえ、筋肉組織にてＧＮＥの発現を指示することが示された。

他の実施形態では、局所領域の投与が使用される。さらに具体的な実施形態では、局所領域の投与は、冒された筋肉における静脈内投与及び冒された筋肉の近傍における動脈内投与から選択される。その上さらに具体的な実施形態では、静脈内投与及び動脈内投与は、治療される四肢の静脈循環の制約と併せて、冒された四肢、たとえば、腕、脚、指、又は足指の近傍での血管にて行われる。四肢の静脈循環を制約する方法には、静脈を圧迫することが可能である止血帯及び他の用具と同様に医療従事者又は患者による物理的圧迫が挙げられる。

他の実施形態では、医薬組成物は免疫抑制療法と一緒に投与するのに適応される。この点で、「免疫抑制療法と一緒に」は、一部の実施形態では、ベクターに対する免疫応答を鈍らせるような方法で投与することを指す。従って、ベクターに対する免疫応答をベクターの投与の通常３〜１４日以内、たとえば、ベクターの投与後３〜１４日まで、又は代わりにベクターの投与前３〜１４日までに開始するという時間枠の間で免疫抑制が達成されるという条件で、免疫抑制療法はベクターと正確に同時に投与される必要はない。

本発明で提供されるのはまた、ＡＡＶ−ＧＮＥウイルスベクターを作出する方法であって、方法は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質を発現する宿主細胞に、アデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ領域を含む第１のプラスミドと、ＡＡＶの逆方向末端反復によって境界を付けられたＧＮＥ遺伝子を含む第２のプラスミドと、ＡＡＶの逆方向末端反復を含まずにＡＡＶのｒｅｐ遺伝子及びカプシド遺伝子を含む第３のプラスミドを導入することと、プラスミドに含有される遺伝子の発現を可能にする条件下でそのような細胞をインキュベートすることを含む。

たとえば、ベクターの亜型、ＧＮＥ遺伝子、プロモータ等のような単一の特徴についての代替が「実施形態」として本明細書で説明される場合はどんな場合も、そのような代替は自由に組み合わせられて本明細書で提供される製剤全体の別個の実施形態を形成することが理解されるべきである。

そこからさらなる実施形態及び利点を引き出すことができる以下の実施例及び図面によって本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を説明するものであって、その範囲を限定するものではない。
実施例
材料及び実験方法
ＧＮＥのクローニング及びウイルスの作出

ヒトＧＮＥ遺伝子を運ぶＡＡＶ８ウイルスベクター（ＡＡＶ８−ｈＧＮＥ）を作出するために、以前記載されたＮ末端３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１０ ＧＮＥベクター(Amsili et al., 2008)からＰＣＲによってＧＮＥのｃＤＮＡを生成し、その後、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にてルシフェラーゼ遺伝子を置き換えることによってｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ｅＧＦＰベクター（ｐＺａｃ２．１−ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ、ペンシルベニア大学のＰｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって供給された）にサブクローニングした（図７）。ＨＥＫ２９３細胞への三重形質移入によって試験管内試験のための小規模のウイルス調製物を作製した（Matsushita et al, 1998）。使用した３種のプラスミド（図７）は、新しく生成したｐＣＭＶ−ＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ（配列番号２８；ＧＮＥｃＤＮＡはヌクレオチド１２６４−３４７５に及ぶ）又は新たなｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ、ペンシルベニア大学のＰｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって提供されたｐＲｅｐＣａｐＡＡＶ２／８プラスミド（ＡＡＶ２／８はプラスミドがＡＡＶ２配列から取られたパッケージングシグナル配列及びＡＡＶ８に由来するカプシド配列を有することを示す）、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＨｅｌｐｅｒプラスミドであった。７２時間後、凍結融解の繰り返し、その後の遠心によってウイルスを回収した。作製したウイルスベクターの力価は、形質導入の７２時間後、ＧＦＰを発現しているＨＥＫ２９３細胞の比率によって評価した。マウスの静脈注射に使用される大規模精製のｐＣＭＶ−ＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰを作製し、ペンシルベニア大学のＰｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ施設にてウイルスゲノム（ｖｇ）の測定によって力価判定した。
細胞培養

１０％ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びグルタミン（イスラエル、Ｂｅｉｔ ＨａｅｍｅｋのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で補完したＤＭＥＭにてＨＥＫ２９３細胞及びＣ２Ｃ１２細胞を維持した。ＧＮＥミオパチーに由来する筋肉細胞はＬｏｃｈｍｕｌｌｅｒら、１９９９によって記載されたように培養した。

６穴プレートに細胞を播き、形質導入し、様々な時点で解析のために回収した。ＧＦＰの発現はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）ＢＤ）によって解析した。
動物の処置及び染色

５〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に２５０μｌのＰＢＳ中８．５×１０^１１ｖｇ又は２．４×１０^１２ｖｇのウイルスベクター又はＰＢＳを注射した。一般的な挙動について及び体重及び電子握力強度計を用いた握力についてマウスをモニターした。

マウスを様々な時点で屠殺し、組織学及びＲＮＡ解析について組織検体を直ちに処理した（さらなる処理まで液体窒素にて瞬間凍結及び保存した）。凍結切片の組織学的解析のために液体窒素で冷却したイソペンタンにおける瞬間凍結によって様々な筋肉を処理し、−８０℃で保存した。

常法によるヘマトキシリン及びエオシンで組織切片を染色した。
ＧＮＥのｍＲＮＡの発現及びコピー数の決定

製造元のプロトコールに従ってＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（米国、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ）によって様々な時点で細胞及び組織から全ＲＮＡを抽出した。非ＲＮＡ試料分画を含有するＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ試料はさらなるＤＮＡ処理のために−８０℃で保存した。ＲＮＡ試料のＤＮａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）処理の後、製造元のプロトコールに従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってランダムヘキサマープライマー（ドイツ、Ｒｏｃｈｅ）を用いてＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡ産物をＰＣＲによって増幅した。内在性のマウスＧＮＥを検出しないヒトＧＮＥ特異的なプライマーを用いて、Ｃ２Ｃ１２マウス細胞におけるヒトＧＮＥｃＤＮＡ導入遺伝子の発現を検出した。ＧＦＰ陽性及びＧＦＰ陰性のＣ２Ｃ１２集団を別々に解析した。使用したプライマーは、
順方向：１１３１Ｆ−５´−ＧＧＡＡＡＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＡＧＧ−３´（配列番号１）
逆方向：１６０３Ｒ−５´−ＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＧＴＣ−３´（配列番号２）であった。

４７０ｂｐの産物が得られた。
ＧＮＥにおけるＭ７１２Ｔ変異を運ぶＧＮＥミオパチー細胞におけるヒトＧＮＥｃＤＮＡ導入遺伝子の発現を検出するために、野生型ｃＤＮＡと変異したｃＤＮＡを差別化することができるＡＲＭＳ（増幅不応性変異解析；［Little, 1995]）法を用いた。使用したプライマーは
双方の配列に共通するので双方の検出に使用することができるＡＲＭＳＦ−５´−ＴＧＧＡＡＧＧＣＡＴＧＴＣＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＧＧ−３´（配列番号３）
野生型配列のみを検出することができるｗｔ−Ｒ−５´−ＧＴＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡ−３´（配列番号４）及び
変異したＭ７１２Ｔの配列のみを検出することができるＭｕｔ−Ｒ５´ＧＴＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＴＧＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＣＡＧ３´（配列番号５）であった。

増幅した産物は長さ３３５ｂｐだった。
マウス組織におけるヒトＧＮＥｃＤＮＡ導入遺伝子の発現を検出するために、ヒトＧＮＥｃＤＮＡ（ヒトＧＮＥエクソン７〜８）の検出のために特に設計されたプライマー及びプローブを含有するＴａｑＭａｎ（登録商標）セットと共に定量的リアルタイムＰＣＲを用いた。
ｈＦ−５´ＴＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＡ３´（配列番号６）；
ｈＲ５´ＡＣＡＣＡＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＴＴＡＡＡＴ３´（配列番号７）；及び
ｈＧＮＥｐｒｏｂｅ−６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ（商標））−ＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧ−ブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ（登録商標））（配列番号８）

全く同じ領域（マウスＧＮＥのエクソン７〜８）にて内在性のＧＮＥｃＤＮＡのマウスでの検出のために特に設計されたプライマー及びプローブを含有するＴａｑＭａｎ（登録商標）セットによってマウスの内在性ＧＮＥの発現を同時に測定した。
ｎｉＦ−５´ＴＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡＣＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧ３´（配列番号９）；
ｎｉＲ−５´ＡＣＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＴＡＡＡＣ３´（配列番号１０）；及び
ｍＧＮＥプローブ：ＦＡＭ−ＴＧＧＣＡＡＴＡＧＴＴＡＧＣＡＴＧＡＡＧ−ＢＱ（配列番号１１）

ＡＢＩプリズム７５００リアルタイムＰＣＲシステム（英国、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて解析を行った。

各試料におけるｈＧＮＥの発現の相対的な定量（ＲＱ）は対照マウス組織で検出された最高値（ＲＱ＝１、適宜、ＡＡＶ８／ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰを高用量若しくは低用量で注射したマウスの組織、又はＰＢＳを注射したマウスの組織）に対するものだった。測定はすべて２つ組で行い、マウスのＨＰＲＴの発現（Ｍｍ００４４６９６８＿ｍｌ、英国、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して標準化した。

導入遺伝子がｈＧＮＥのｃＤＮＡなので、同じＴａｑＭａｎ（登録商標）ヒトＧＮＥ特異的プローブセットを用いて、ＡＢＩプリズム７５００リアルタイムＰＣＲシステム（英国、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって導入遺伝子のコピー数を測定した。Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ調製によってＤＮＡを抽出した。様々な組織のＤＮＡの２つ組試料を同時に解析し、ｐＣＭＶ−ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドの測定された量の検量線と比較した。
ルシフェラーゼ活性

ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰを運ぶウイルスベクターを注射したマウスにてルシフェラーゼ活性を生体内で解析した。画像解析の５分前に、０．５ｍｌのストック溶液にて１６５ｍｇ／体重ｋｇの甲虫ルシフェリンを動物の腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。ＩＶＩＳ動態システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にて画像解析を行った。
ＩＰ−１０の測定

製造元の指示書に従って、マウスＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０／ＣＲＧ−２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）免疫アッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってマウスのインターフェロンγ誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）を定量的に測定するためにマウスの血清を解析した。
ｈＧＮＥのｍＲＮＡの発現及び生体分布の測定

形質導入の４５、９４又は１７８日後、各群のマウスを屠殺し、炎症及び組織損傷について組織学（Ｈ＆Ｅ）によって、及びウイルスのコピー数及びヒトＧＮＥのｍＲＮＡの発現についてリアルタイムＰＣＲによってその組織を解析した。
結果
実施例１：筋肉細胞へのＡＡＶ／ｈＧＮＥの遺伝子導入
Ｃ２Ｃ１２細胞への遺伝子導入

ＡＡＶパッケージングシグナル及びＧＦＰを含有するベクターにヒトＧＮＥのｃＤＮＡをサブクローニングし（図７Ａ）、ＨＥＫ２９３細胞の三重形質移入によってＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰウイルスベクターの調製物を作製した。筋肉細胞に形質導入するＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰウイルスベクターの能力を評価するために、Ｃ２Ｃ１２マウス筋肉細胞株にウイルスベクター（１×１０^６感染性粒子／ｍｌ）で形質導入し、発現について解析した。形質導入の２日後及び３日後、ＧＦＰはそれぞれ細胞の１２％及び３０％検出された（図１Ａ）。形質導入された細胞をＧＦＰの発現について選別し、特定のヒトＧＮＥｍＲＮＡの存在について解析した。実際、ＧＦＰ陰性分画はそうでなかったが、ＧＦＰ陽性細胞はヒトＧＮＥのｍＲＮＡを発現していた（図２Ａ）。
ヒト一次筋肉細胞への形質導入

その後、Ｍ７１２Ｔ変異についてホモ接合体のＧＮＥミオパチー患者の生検に由来するヒトの一次培養筋肉細胞にウイルスベクター（１０^５感染性粒子／ｍｌ）で形質導入し、形質導入の３２日後（筋肉細胞が自然に老化する時点）までＧＦＰの発現及び正常なヒトＧＮＥｍＲＮＡの存在について解析した。ＧＦＰは当初、細胞の非常に低い比率で検出されたが、形質導入の８日後、発現は増加し、細胞のほぼ２２％に達した（図１Ｂ）。変異した内在性のＧＮＥと外来性の野生型ＧＮＥを区別することができるＡＲＭＳ法を用いて正常なヒト外来性のＧＮＥｍＲＮＡもこれらの細胞にて特異的に検出された。形質導入されなかったＧＮＥミオパチー細胞は変異したＧＮＥｍＲＮＡのみを発現したが、形質導入した細胞は野生型ｈＧＮＥｍＲＮＡを発現した（図２Ｂ）。

これらの知見は、ヒトの野生型ＧＮＥｃＤＮＡを運ぶＡＡＶ８ウイルスベクターは、培養でのマウス筋肉細胞及びヒトＧＮＥミオパチー筋肉細胞に形質導入し、これらの細胞にて導入遺伝子を発現することができることを明らかにしている。その潜在的な低シアル化状態及びＡＡＶウイルスベクターの一部の種類がシアル化受容体を介して細胞に感染するという知見を考えると、これらの細胞が上手く形質導入され得ることは明らかではなかった。
実施例２：ＡＡＶ／ｈＧＮＥを用いてマウスにてＧＮＥを上手く発現させることができる

ＡＡＶ８／ｈＧＮＥをマウスの筋肉内又は静脈内に注射し、その後３５日まで経過観察した生体内予備実験の結果は、ヒトのＧＮＥｍＲＮＡが全期間、局所的に又は全身性に発現されることを示した。有害な病理効果又は毒性は検出されなかった。

これらの結果は長期実験の設計を促した。５〜６週齢のマウスの尾静脈にＡＡＶ８−ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（８．５×ｌ０^１１ｖｇ／マウス）、ＡＡＶ８−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（８．５×ｌ０^１１ｖｇ／マウス）、高用量（２．５×１０^１２ｖｇ／マウス）でのＡＡＶ８−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ又はＰＢＳ（ｎ＝４）のいずれかを注射した。

マウスを６ヵ月間モニターし、その体重、挙動及び握力を様々な時点で調べた。経過観察の全期間の間、４群のマウス間にはこれらのパラメータの統計的に有意な差は検出されなかった（図３）。
ルシフェラーゼ活性

ＡＡＶ８−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを注射したマウスにて注射の８５、１４１及び１７６日後にルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼの画像解析は、観察の全期間の間、持続したルシフェラーゼ活性を示し（図４）、高いウイルス用量（２．５×１０^１２ｖｇ／マウスでのＡＡＶ８−ルシフェラーゼウイルスベクター）で注射したマウスで強かった。

これらの知見はＡＡＶが介在する遺伝子導入は生体内で有効であることを明らかにしている。
実施例３：ＡＡＶ／ｈＧＮＥベクターは筋肉組織でのＧＮＥの長期発現を可能にする

注射の４５、９４及び１７８日後、各群のマウスを屠殺し、リアルタイムＰＣＲによってウイルスコピー数について、ＡＡＶ８／ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを注射したマウスの肝臓、腎臓、心臓、脳、前肢及び大腿四頭筋を分析し（図８）、炎症及び組織の損傷について組織学（Ｈ＆Ｅ）によって組織を分析した。ウイルスの生体分布は、肝臓で最も高く（細胞当たり１０〜１００ウイルスコピーの間）、腎臓及び心臓で低く（細胞当たり１０ウイルスコピー未満）、脳（細胞当たり１ウイルスコピー未満）及び骨格筋（前肢及び大腿四頭筋における細胞当たり約０．１コピー）で最も低かった。これらの値は、最少限の時間に関連する変異を伴って、特に筋肉組織では相対的に安定していた。従って、ＡＡＶ８／ｈＧＮＥウイルスコピー数は筋肉組織では安定である。

定量的リアルタイムＰＣＲは、ヒトのＧＮＥｍＲＮＡが注射の６ヵ月後、骨格筋（図５）及び他の調べた組織すべて（図６）において依然として発現されていることを示した。特に、骨格筋（大腿四頭筋、前脛骨筋及び前肢）は、同じ組織で測定されたｍＧＮＥの値よりも１０〜数百倍高いｈＧＮＥを発現した。肝臓及び心臓は同じ効果を示した。それに対して、他の調べた組織はすべて（腎臓、脾臓、脳、肺及び卵巣）はるかに低い程度に注射した遺伝子を発現した。実験の終了時、発現のわずかな低下が見られ得たが（注射の１７８日後）、発現は実験全体を通してよく持続した。予想通り、この期間、４つの実験群の間でマウスＧＮＥｍＲＮＡの発現に有意な変化はなかった。

従って、ＡＡＶ８−ＧＮＥは生体内での長期のＧＮＥ発現を介在するのに十分な効率性を持って生体内でマウスの細胞に形質導入することができた。さらに、ウイルスベクターは静脈内に注射されたが、ＧＮＥは筋肉細胞にて発現された。
実施例４：組織病理学的解析はＡＡＶ／ｈＧＮＥを注射したマウスにて病理学的な変化を示さない

組織学（Ｈ＆Ｅ）は、実験期間中、３つの選択された時点のいずれにても肝臓、腎臓、心臓及び様々な筋肉を含む解析された組織のいずれにおいても病理学的な変化を検出しなかった。さらに、炎症の兆候は組織切片では検出されなかった（図９〜１０）。肺、脳、脾臓及びメスにおける卵巣のような他の組織も調べたが、同様の正常な結果が見られた（図１１）。
実施例５：ＡＡＶ／ｈＧＮＥは免疫的には上手く認容される

様々な時点（注射後１３〜９２日）ですべてのマウスから血清を採取し、炎症性マーカーＩＰ−１０（インターフェロンγ誘導性タンパク質）の発現（Liu et ah, 2011）についてＥＬＩＳＡによって解析した。図１２に見られるように、ＰＢＳを注射したマウスに比べてウイルスベクターを注射したマウスすべてについて類似して１３日目ころＩＰ−１０の軽い増加を検出することができた。炎症性応答のこの指標は、２０日目に最大まで増加し、その後低下してベースラインレベル近くのままだった。２．５×１０^１２ｖｇのＡＡＶ２／８−ルシフェラーゼウイルスベクターの高い用量で注射したマウスでさらに強い応答が認められた。従って、この一過性の応答は、クローニングされた導入遺伝子とは無関係に、明らかにウイルスカプシドによって誘発される。

８．５×１０^１１ｖｇ／マウス及び２．５×１０^１２ｖｇ／マウスの全身性の注射は投与後６ヵ月の期間にわたってマウスにとって毒性ではなかった。分析された臓器において、組織学的に有害効果は認められず、体重、運動力及び挙動によって評価されるように、マウスはすべて完全に健康であると思われた。
結論：実施例１〜５

従って、ＡＡＶ８／ｈＧＮＥはＧＮＥの生体内での発現に介在するのに十分な効率性を持ってマウスに形質導入することができた。さらに、ウイルスベクターは静脈内に注射されたが、ＧＮＥは筋肉細胞にて発現された。さらに、発現は少なくとも６ヵ月持続した。信頼できる特異的な抗ＧＮＥ抗体の欠如のためにＧＮＥは直接アッセイされず、ｍＲＮＡでのＧＮＥの発現が明らかにされた。これらの形質導入マウスではＧＮＥタンパク質も効率的に翻訳される可能性が高い。

炎症性マーカーの一過性の軽い上昇が認められたが、どんな異常も見られなかった。従って、野生型のヒトＧＮＥの多重全身性のｍＲＮＡ過剰発現は正常なマウスでは有害ではなく、同様にＧＮＥミオパチーでも安全であることが予想される。これらの知見は、ＡＡＶが介在する治療法モデルを構成し、ＧＮＥミオパチーにおける安全で効率的な筋肉の治療法へのＡＡＶ８に基づくベクターの使用を支持する。
実施例６：動物疾患モデルにおけるＡＡＶ／ｈＧＮＥベクターの試験

ＧＮＥミオパチーに関連する動物モデルは、ＧＮＥ^−／−の背景で生成され、酵素のエピメラーゼドメインに存在するＤ１７６ＶのＧＮＥミスセンス変異を過剰発現するトランスジェニックマウスモデル（「ＤＭＲＶ／ｈｌＢＭマウスモデル」；Ｍａｌｉｃｄａｎら、２００７及びＭａｌｉｃｄａｎら２００９を参照）である。前の実施例で記載されたようなヒトのｗｔＧＮＥ又はルシフェラーゼを運ぶＡＡＶ８に基づくベクターを成熟した症候性のＤＭＲＶ／ｈｌＢＭマウスに静脈注射した。冒されていない同腹仔も対照として注射した。注射の１０週後、骨格筋、肝臓、腎臓、心臓及び脾臓における顕著な数の細胞でｅＧＦＰの発現が見られた。マウスのプローブに対してヒトに特異的なプローブによるｍＲＮＡの測定は、ウイルス由来のヒトＧＮＥの発現の増加を示した。さらに重要なことに、４７週齢でＡＡＶ２／８−ｗｔｈＧＮＥを注射したＤＭＲＶ／ｈｌＢＭマウスは、ＡＡＶ８−ルシフェラーゼを注射したマウスと比べて、生存、運動能力、筋肉サイズ及び収縮特性にて有意な改善を示した。これらの結果はＧＮＥミオパチーのためのＡＡＶが介在する遺伝子療法の有効性を示す。
実施例７：筋肉特異的なプロモータからｈＧＮＥを発現するＡＡＶに基づくベクター

筋肉特異的なプロモータによってｈＧＮＥを発現するＡＡＶ８ベクターである ＡＡＶ−ＭＣＫ−ｈＧＮＥ（図１３；配列番号２９；ＧＮＥのｃＤＮＡはｎｔ９６４〜３１３３に及ぶ）を以下のように構築した。

米国オハイオ州、コロンブスの国立子供病院研究所のＭｅｎｄｅｌｌ博士によって提供されたプラスミドからＭＣＫ断片を増幅し、ＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ断片を置き換えることによって以前のベクターで使用された骨格にクローニングした。その後、ｈＧＮＥのｃＤＮＡをそれにクローニングして最終的なベクターを生成した。

以前のｐＣＭＶ−ＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰから出発して、ＣＭＶプロモータをＭＣＫプロモータで置き換え、ＩＲＥＳ配列及びＧＦＰマーカーを切り取った。

ベクターでＨＥＫ２９３細胞及びＣ２Ｃ１２細胞に形質移入し、ベクターがこれらの細胞におけるｍＲＮＡでのＧＮＥを発現させることを見つけた。その後、常法によるＨＥＫ２９３細胞の三重形質移入によって小規模なウイルスを生成した（Matsushita et ah, 1998）。７２時間後、凍結／融解の繰り返し、その後の遠心によってウイルスを回収した。使用した３種のプラスミドは、新しく生成したｐＭＣＫ−ｈＧＮＥプラスミド、ペンシルベニア大学のＰｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって提供されたｐＲｅｐＣａｐＡＡＶ２／８プラスミド及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＨｅｌｐｅｒプラスミドであった。マウスの静脈注射に使用される大規模精製したｐＭＣＫ−ｈＧＮＥ及びｐＣＭＶ−ｈＧＮＥ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰウイルスベクターを作製し、ウイルスゲノム（ｖｇ）測定によって力価判定した。
実施例８：筋肉特異的なｈＧＮＥを発現するＡＡＶに基づくベクターの発現試験

ＡＡＶ８のカプシドにおけるｐＭＣＫ-ＧＮＥベクターの大規模製造を、オハイオ州コロンブスの国立子供病院研究所の遺伝子療法のためのセンターでのＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにて実施した。上述のＣＭＶベクターと並行して１×１０^１２ｖｇのこのウイルスベクターを正常マウスに注射し、注射の４５日後、ヒトＧＮＥのｍＲＮＡの発現を前脛骨筋（ＴＡ）の筋肉、肝臓及び腎臓にてモニターした。実験は前の実施例で記載されたように実施した。

ｈＧＮＥ発現の定量はＰＢＳ／対照を注射されたマウスの相当する組織で検出された値に対して相対的である。測定はすべて２つ組で実施し、内在性のマウスＧＮＥの発現に対して標準化した。

双方の構築物は解析された組織で上手く発現した。ＭＣＫプロモータに基づくベクター構築物はＣＭＶプロモータ構築物と同様に発現を指示した（図１４）。ベクターが指示する筋肉特異的な発現は、ミオパチーの治療においてＣＭＶのような筋肉非特異的なベクターよりも優れていると予想される。
実施例９：筋肉特異的なｈＧＮＥを発現するＡＡＶに基づくベクターの動物モデル試験

ＧＮＥミオパチーのモデル動物にベクターを投与する。一部の実験では、ベクターの投与は、動物の生涯の様々な時点、たとえば、ＧＮＥミオパチーの症状の予想される発症の前及び後に実施して、ベクターがＧＮＥミオパチーの症状の出現を妨げるかどうか及び／又は動物の症状を救済するかどうかを解明する。動物を経過観察し、一般的な挙動及び臨床的な症状、筋肉弱化の出現又は消失について冒された治療されない同腹仔と比較し、その後、種々の組織におけるヒトＧＮＥの発現についての解析のために及び様々な組織の組織学的な観察のために動物を屠殺する。種々の実験では、筋肉クレアチンキナーゼ（ＣＫＭ）プロモータに基づくベクター、又はミオシン軽鎖（ＭＬＣ）プロモータ、たとえば、ＭＬＣ２、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモータ、たとえば、αＭＨＣ、デスミンプロモータ、心臓トロポニンプロモータ、トロポニンＩプロモータ、ＭｙｏＤ遺伝子ファミリープロモータ、アクチンプロモータ若しくはｐｉｔｘ３の眼球形態のイントロン１の中に存在する筋肉特異的なプロモータに由来するプロモータを用いるベクターが利用される。
実施例１０：ヒトのミオパチーを治療することにおける筋肉特異的なｈＧＮＥを発現するＡＡＶに基づくベクターの有効性

ＧＮＥミオパチーに罹っているヒトにウイルスベクターを投与する。一部の実験では、ベクターの投与は疾患の進行の様々な時点で実施する。対象を経過観察して治療法の認容性を判定し、たとえば、四肢及び／又は他の臓器における骨格筋の強度を測定することによって臨床症状及び疾患の進行について一般的に調べる。種々の実験では、たとえば、上文で記載されたように様々な筋肉特異的なプロモータに基づくベクターを利用する。

一部の実験では、ヒトにおけるウイルスベクターの送達は、たとえば、静脈内注射によって全身性である。他の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓への粒子の播種を阻止し、標的の四肢筋肉におけるその播種が好まれる短時間での止血帯を用いた四肢への局所領域注射（静脈内又は動脈内のいずれか）によって送達される。これは、筋肉特異的なプロモータによって付与される特異性を高めることが期待される。

本明細書で記載される方法及び組成物の正確な詳細が記載される本発明の精神から逸脱することなく変更され、又は改変され得ることは明らかであろう。我々は、その同等物すべてを含めて、以下の特許請求の範囲の範囲及び精神の範囲内に入るそのような改変及び変更すべてを請求する。

特許請求の範囲では、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等のようなその変形は、列記された成分は含まれることを示すが、一般に他の成分の排除は示さない。

Claims (23)

1. アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に基づくウイルスベクターであって、筋肉特異的なプロモータに機能的に連結されるＵＤＰ−Ｎアセチルグルコサミン２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶウイルスベクター。
2. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１から選択される請求項１のＡＡＶウイルスベクター。
3. 前記ＧＮＥがヒトＧＮＥである請求項１のＡＡＶウイルスベクター。
4. 前記ＧＮＥが完全に機能的なＧＮＥである請求項１のＡＡＶウイルスベクター。
5. 前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである請求項１のＡＡＶウイルスベクター。
6. 前記筋肉特異的なプロモータが、筋肉クレアチンキナーゼ（ＣＫＭ）のプロモータ、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）のプロモータ、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）のプロモータ、デスミンのプロモータ、心臓トロポニンのプロモータ、トロポニンＩのプロモータ、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーのプロモータ、アクチンのプロモータ、及びｐｉｔｘ３の眼球形態のイントロン１の中に存在するプロモータから成る群から選択される請求項１のＡＡＶウイルスベクター。
7. 前記ウイルスベクターが低下した免疫原性を示す請求項１のＡＡＶウイルスベクター。
8. 請求項１〜８のいずれか１項のＡＡＶウイルスベクターを含む宿主細胞。
9. 請求項１〜８のいずれか１項のＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物。
10. 欠損したＧＮＥ機能と関連するミオパチーを治療するための請求項９の医薬組成物。
11. 前記ミオパチーが、遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）、大腿四頭筋温存ミオパチー、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）、及び野中病から成る群から選択される請求項１０の医薬組成物。
12. 前記ミオパチーがすでに罹患したミオパチーである請求項１１の医薬組成物。
13. 前記医薬組成物の単回投与が、前記ミオパチーを有する対象にて前記ＧＮＥの持続的な発現を付与する請求項１０〜１２のいずれか１項の医薬組成物。
14. 前記医薬組成物が全身性投与に適応される請求項９〜１３のいずれか１項の医薬組成物。
15. 前記医薬組成物が、治療される四肢の静脈循環の制約と併せて、四肢における局所領域投与に適応される請求項９〜１３のいずれか１項の医薬組成物。
16. 前記医薬組成物が、免疫抑制療法と共に投与に適応される請求項９〜１５のいずれか１項の医薬組成物。
17. それを必要とする対象にて欠損したＧＮＥ機能に関連するミオパチーを治療する方法であって、請求項１のＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物を投与し、それによって欠損したＧＮＥ機能に関連するミオパチーを治療する工程を含む方法。
18. 前記ミオパチーが、遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）、大腿四頭筋温存ミオパチー、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）、及び野中病から成る群から選択される請求項１７の方法。
19. 前記ミオパチーがすでに罹患したミオパチーである請求項１８の方法。
20. 前記医薬組成物の単回投与が、前記ミオパチーを有する対象にて前記ＧＮＥの持続的な発現を付与する請求項１７の方法。
21. 前記医薬組成物が全身性に注射される請求項１７の方法。
22. 前記医薬組成物が、治療される四肢の静脈循環の制約と併せて、四肢に局所領域的に投与される請求項１７の方法。
23. 前記医薬組成物が、免疫抑制療法と共に投与される請求項１７の方法。

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