JP2015500663A - ナイロン−7、ナイロン−7,7、およびポリエステルを生産するための生物変換方法 - Google Patents
ナイロン−7、ナイロン−7,7、およびポリエステルを生産するための生物変換方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015500663A JP2015500663A JP2014548982A JP2014548982A JP2015500663A JP 2015500663 A JP2015500663 A JP 2015500663A JP 2014548982 A JP2014548982 A JP 2014548982A JP 2014548982 A JP2014548982 A JP 2014548982A JP 2015500663 A JP2015500663 A JP 2015500663A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- coa
- catalyzes
- produced
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
- C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
- C08G69/08—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from amino-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
- C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
- C08G69/26—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from polyamines and polycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/001—Amines; Imines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
本出願は、2011年6月30日出願の米国特許仮出願第61/503,043号;すべて2011年12月21日出願の米国特許仮出願第61/578,265号、同第61/578,272号、および同第61/578,289号;ならびに2012年6月29日出願の国際出願PCT/US2012/44984の恩典を主張するものであり、これらはすべてその全体が、本明細書中に完全に明記されているかのごとくに参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の態様は、1つまたは複数の単離された酵素の存在下または1つまたは複数の酵素を発現する組換え宿主細胞の存在下で二官能性または三官能性C7アルカンを生合成生産するための方法に関する。二官能性または三官能性C7アルカンは、例えばナイロン-7、ナイロン-7,xおよび/またはナイロン-x,7の生産における中間体として有用である。
化学工業による持続可能な活動の推進は、エネルギー使用量を減少させること、原料を再利用すること、および物品の生産の間に生成される副産物を低減することに焦点が置かれている。しかし、化学工業は基本的な原材料として石油と天然ガスに強く依存する。主要な石油化学工程に関連した最適化の状態を考慮すると、エネルギー、排出物、およびコストを現在のレベルより低く抑えるためには原材料の使用および製造設計における大幅な変更が必要である。バイオテクノロジーは、植物由来の糖類のような再生可能な炭水化物、または脂肪酸のような他の再生可能な原材料からの工業化学中間体および最終産物の生産のための新たなアプローチを提供する。加えて、バイオテクノロジーはまた、バイオディーゼル生産からのグリセロールのような廃棄物もしくは価値の低い一連の物質を利用する方法、またはベンゼン、トルエンおよび多環式芳香族炭化水素(PAH)などの石油化学由来の原材料を、既存の化学工程よりも環境に対して有害でないバイオプロセスにおける有用な生成物に変換する方法も提供する。
一般に、本開示は、ナイロン-7、ナイロン-7,xおよびナイロン-x,7の生産、ならびにポリエステルの生産における中間体として有用な二官能性または三官能性C7アルカンを生合成的に生産するための方法および材料に関する。
本明細書で本発明の説明において使用される用語は、特定の態様を説明することだけを目的とし、本発明の限定を意図しない。本発明の態様の説明および付属の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「1つ」および「その」は、文脈上明らかに指示されない限り、複数形態も含むことが意図されている。また、本明細書で使用される場合、「および/または」は、関連する列挙項目の1つまたは複数のありとあらゆる組合せを指し、それらを包含する。特に定義されない限り、説明において使用される技術および学術用語を含むすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
様々な異なる原材料が二官能性または三官能性アルカンを生成するために使用できる。一部の態様では、組換え宿主細胞または細胞(例えば組換え宿主細胞)から調製された溶解物を、7-アミノヘプタン酸などの二官能性または三官能性C7アルカンを生成するために再生可能な原材料と接触させる。炭素源として使用し得る再生可能な原材料の例は、セルロース系原材料、植物由来の炭水化物および脂肪酸を含むが、それらに限定されるわけではない。一部の態様では、組換え宿主細胞を接触させる原材料は、グルコース、スクロース、キシロース、脂肪酸またはグリセロールである。
上述したように、本発明の態様は、1つまたは複数の単離された酵素の存在下、該酵素を発現する組換え宿主細胞の存在下、または該酵素を発現する細胞(例えば組換え細胞)の細胞溶解物(または部分精製された溶解物)の存在下で二官能性または三官能性C7アルカンを生成するための方法に関する。一部の態様では、二官能性または三官能性C7アルカンの生成はピメレートまたはピメロイルCoAまたはピメロイル-[acp]から始まり、共通の中間体、すなわちピメリン酸セミアルデヒドを介して進行する。具体的には、一部の態様では、本発明は、ピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸へのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素を使用することによって二官能性C7アルカン、7-アミノヘプタン酸を生成する方法に関する。図1参照。ω-トランスアミナーゼなどのセミアルデヒドアミノトランスフェラーゼを使用することができる。例示的なトランスアミナーゼは、EC 2.6.1、例えばEC 2.6.1.18、EC 2.6.1.19、EC2.6.1.1、EC 2.6.1.13、EC 2.6.1.48、およびEC 2.6.1.62に分類されるトランスアミナーゼを含むが、それらに限定されるわけではない。一部の態様では、アミノトランスフェラーゼは、ビブリオ・フルビアリス(V.fluvialis)、バチルス・ウェイヘンステファネンシス(B.weihenstephanensis)、緑膿菌(P.aeruginosa)、枯草菌(B.subtilis)、またはシュードモナス・シリンゲ(P.syringae)由来のEC 2.6.1.18に分類されるβ-アラニンアミノトランスフェラーゼである。その全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開公報第2011/031147号参照。
ピメレートおよび/またはピメロイルCoAは、以下を含む多数の異なる方法によって得ることができる:(i)α-ケト酸鎖伸長経路から生成されるα-ケトスベレート、(ii)ビオチン生合成経路I、(iii)ビオチン生合成経路II、(iv)3個のマロニルCoA分子の1個のピメロイルCoA分子への縮合、(v)ベンゾエート分解経路、(vi)シクロヘキサンカルボキシレート経路、(vi)D,L-ジアミノピメレート経路、および(vii)出発炭素源がクロトネートである生合成経路。図2参照。ピメレートおよび/またはピメロイルCoAまたはピメロイル-[acp]へのこれらの経路は以下でさらに詳細に説明する。
二官能性アルカンは、α-ケトグルタレートから当技術分野にて公知のα-ケトアジペート、α-ケトピメレートまたはα-ケトスベレートへの連続的な鎖伸長反応によって生成できる。例えば図3および国際公開公報第2010/068944号参照。次に、α-ケト二酸(Cn、n=5〜8)または対応する 2-アミノ二酸の脱カルボキシル化により、Cn-1、例えばC4〜7のα,ω-二官能性アルカンの前駆体が提供される。これらの連続的なα-ケト酸鎖伸長反応は、メタノカルドコッカス・ジャナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)、メタノコッカス・ボルタエ(Methanococcus voltae)およびメタノサルシナ・サーモフィラ(Methanosarcina thermophila)などのメタン生成細菌において明らかにされたように補酵素Bの生合成経路において起こる。
一部の態様では、ある種の生物は3個のマロニルCoA分子を1個のピメロイルCoA分子に縮合することができるので、マロニルCoAをピメロイルCoAの供給源として使用することができる。図4参照。また、参照により本明細書に組み入れられる、Lin,S.and Cronan,J.E.,Molecular Biosystems 7:1811-21(2011)も参照のこと。したがって、ピメロイルCoAがマロニルCoAから生成される組換え宿主を生産することができる。一部の態様では、宿主細胞はアクロモバクター属(Achromobacter)以外の生物である。一部の態様では、ピメロイルCoAは、その後、ピメリン酸または他の二官能性C7アルカンに変換し得る。
一態様では、組換え宿主細胞は、グリセロールおよび/または脂肪酸から誘導されるアセチルCoAから、ピメリン酸および/またはピメロイル-[acp]、またはピメロイル-CoAを生産する。例えば、どちらも参照により本明細書に組み入れられる、Lin,S.,Nature Chem.Biol.6:682-688(2010);およびCronan,J.E.and Lin,S.,Current Opinion in Chem.Biology 15:1-7(2011)を参照されたい。図5は、枯草菌におけるBioIによる長鎖脂肪酸-[acp]チオエステルの酸化的切断を通じたピメロイル-[acp]の形成を示しており、これは、ビオチン生合成II(グラム陽性菌)における前駆体であるピメリン酸またはピメロイル-CoAに変換される。図6は、ビオチン生合成I(グラム陰性菌)におけるピメロイル-[acp]またはそのメチルエステルの形成を示す。図6はまた、ピメロイル-[acp]メチルエステルのピメリン酸モノメチルエステルへの変換のための経路も示す。ピメリン酸モノメチルエステルは、その後、例えばEC 3.1.1のリパーゼの存在下でピメリン酸(ヘプタン-1,7-二酸)に変換される。図6はまた、エステラーゼ(EC 3.1.1、例えば EC 3.1.1.85の酵素、BioH)の存在下でのピメロイル-[acp]メチルエステルのピメロイル-[acp]への変換も示す。ピメロイル-[acp]は、その後、アシル-[acp]-チオエステラーゼ、例えばEC 3.1.2.14の酵素、例えばFatAまたはFatBの存在下でピメリン酸(ヘプタン-1,7-二酸)に変換される。一部の態様では、本発明は、図6に示す酵素の1つまたは全部を含むピメリン酸(ヘプタン-1,7-二酸)を生産することができる組換え宿主細胞を企図する。一部の態様では、組換え宿主細胞は、ピメロイルCoAがビオチン生合成にシャトル(shuttle)することができないように、6-カルボキシヘキサノイルCoA(ピメロイルCoA)を7-ケト-8-アミノペラルゴン酸(KAPA)に変換することができる酵素であり、天然のビオチン生合成経路を有する宿主生物においてBioF遺伝子によってコードされる、7-ケト-8-アミノペラルゴン酸シンテターゼの欠失を有する。
ピメリン酸および/またはピメロイルCoAは真核生物のビオチン生合成経路からも得ることができる。例えば、どちらも参照により本明細書に組み入れられる、Roje,S.,Phytochemistry 68:1904-1921(2007);およびCharles R.Hall,The Contribution of Horizontal Gene Transfer to the Evolution of Fungi(May 10,2007)(未公表博士論文、Duke University)(Duke University Librariesのファイル)参照。真核生物経路において、アセチルCoAは、EC 2.3.1.9に分類される酵素を使用してアセトアセチルCoAに生物変換され;アセトアセチルCoAは、E.C.1.1.1.157に分類される酵素を使用して(S)-3-ヒドロキシブタノイルCoAに生物変換され;(S)-3-ヒドロキシブタノイルCoAは、EC 4.2.1.17に分類される酵素を使用してクロトニルCoAに生物変換され;クロトニルCoA は、EC 4.1.1.70に分類される酵素を使用してグルタコニル-1-CoAに生物変換され;グルタコニル-1-CoAは、EC 1.3.99.7に分類される酵素を使用してグルタリルCoAに生物変換され;グルタリルCoAは、EC 2.3.1.43に分類される酵素を使用して3-ケトピメリル CoAに生物変換され;3-ケトピメリル CoAは、EC 1.1.1.4259に分類される酵素を使用して3-ヒドロキシピメリルCoAに生物変換され;3-ヒドロキシピメリルCoAは、EC 4.2.1.-に分類される酵素を使用して2,3-ジデヒドロピメロイルCoAに生物変換され;そして 2,3-ジデヒドロピメロイルCoAは、EC 1.3.1.62に分類される酵素を使用してピメロイルCoAに生物変換される。ピメロイルCoAは、その後ピメリン酸に変換される。
本明細書において企図されるピメロイルCoAおよび/またはピメリン酸の1つの付加的な供給源は、図7に示すベンゾエート分解経路である。例えば、すべてが参照により本明細書に組み入れられる、Bernsteinb,J.R.,et al.,Metabolic Eng'g 10:131-140(2008);Harwood,C.S.,et al.,FEMS Microbiology Reviews 22:439-458(1999);およびHarrison,F.H.and Harwood,C.S.,Microbiology 151:727-736(2005)参照。多数の変換が図7に例示されており、その中でベンゾエートはEC 6.2.1.25に分類される酵素を使用してベンゾイルCoAに変換され、最終的にピメロイルCoAに変換される。ベンゾイルCoAは、EC 1.3.99.15に分類される酵素を使用してシクロヘキサ-1,5-ジエンカルボニルCoAに変換される。一部の態様では、シクロヘキサ-1,5-ジエンカルボニルCoAは、EC 4.2.1.100 に分類される酵素を使用して6-ヒドロキシシクロへキス-1-エン-1-カルボキシルCoAに生物変換され;6-ヒドロキシシクロへキス-1-エン-1-カルボキシルCoAは、EC 1.1.1-に分類される酵素を使用して6-ケトオキシシクロへキス-1-エン-1-カルボキシルCoAに生物変換され;6-ケトオキシシクロへキス-1-エン-1-カルボキシルCoAは、EC 3.7.1.-に分類される酵素を使用して3-ヒドロキシピメリルCoAに生物変換され;3-ヒドロキシピメリルCoAは、EC 4.2.1.-に分類される酵素を使用して6-カルボキシルへキス-2-エノイルCoAに生物変換され;3-ヒドロキシピメリルCoAは、EC 1.3.1.62に分類される酵素を使用してピメロイルCoAに生物変換される。ピメロイルCoAは、次に、ピメリン酸(ヘプタン-1,7-二酸)に変換される。一部の態様では、EC 4.2.1.-に分類される酵素を使用してシクロヘキサ-1,5-ジエンカルボニルCoAはシクロヘキス-1-エン-1-カルボキシルCoAに生物変換され、シクロヘキス-1-エン-1-カルボキシルCoAは2-ヒドロキシシクロヘキサン-1-カルボキシルCoAに生物変換され;2-ヒドロキシシクロヘキサン-1-カルボキシルCoA は、E.C.1.1.1.-に分類される酵素を使用して2-ケトシクロヘキサン-1-カルボキシルCoAに生物変換され、そして2-ケトシクロヘキサンカルボキシルCoAは、EC 3.1.2.-_に分類される酵素(例えば、EC 3.1.2.-に分類される酵素、α-ケトシクロヘキサンカルボキシルCoAヒドロラーゼRp-badI)を使用してピメロイルCoAに生物変換される。
ピメレートのさらに別の供給源は、2,6-ジアミノピメレートとしても知られるD,L-ジアミノピメレートである。D,L-ジアミノピメレートはリジンの生成における中間体である。一部の態様では、内因性リジン経路は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの欠失を有する組換え宿主細胞を作製することにより、ピメレートを優先的に生産するように改変できる。例えば図10参照。D,L-ジアミノピメレートは、D,L-ジアミノピメレートの6-アミノ-2-ヘプテン二酸への還元的脱アミノ化を触媒する酵素によって不飽和モノアミノピメリン酸に生物変換することができる。D,L-ジアミノピメレートの還元的脱アミノ化を触媒する酵素の例は、EC 4.3.1、例えばEC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.9、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13、EC 4.3.1.14; EC 4.3.1.23、およびEC 4.3.1.24に分類されるアンモニアリアーゼを含む。一部の態様では、アンモニアリアーゼは、C.アマロナティカス(C.amalonaticus)、C.テタノモルフム(C.tetanomorphum)またはA.オリゼ由来のEC 4.3.1.2に分類されるメチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼである。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Botting,Biochemistry 27:2953-2955(1988);およびKato,Appl.Microbiol.Biotechnol.50:468-474(1998)参照。
ピメロイルCoAの供給源、および最終的にピメレートの供給源は、出発炭素源がクロトネートである生合成経路である。その生合成経路を図9に例示する。例えば、Mouttaki,H.,et al.,Applied Envtl.Microbiology 73:930-938(2001)参照。クロトネートはアセチルCoAに分解される。図9に示す生合成経路において生成されるアセチルCoAの3分の2がアセテートに変換されることが報告されている。一部の態様では、本発明は、図9に示すように多数の代謝段階においてアセチルCoAがアセテートではなくアセトアセチルCoAに変換され、その後グルタコニルCo Aに変換されるように、アセチルCoAをアセテートに変換する酵素(例えばリン酸アセチルトランスフェラーゼおよびアセテートキナーゼ)が欠失している組換え宿主細胞を提供する。グルタコニルCoAはその後グルタリルCoAに変換される。グルタリルCoAは、鎖伸長されて3-オキソピメリルCoAを形成する。還元、脱水および2度目の還元後、ピメリルCoAが得られる。
一部の態様では、ピメリン酸セミアルデヒドは、スフィンゴモナスおよびコリネバクテリウム属種からのテトラリン(ベンゾシクロヘキサン)分解経路を使用して生産される。7-オキソヘプタン酸は、スフィンゴモナス・マクロゴリタビド(Sphingomonas macrogolitabid)におけるテトラリン分解経路の中間体として生成される.Lopez-Sanchez,A.,et al.,Appl.Environ.Microbiol.76:110-118(2010)。テトラリンは、ピルビン酸およびピメリン酸セミアルデヒドを生じる両方の芳香環の開裂によって代謝される。有機溶媒であるテトラリンは、ナフタレンから誘導される複雑な出発物質である。ナフタレンは現在コールタールから生産されるが、ナフタレン合成のための生合成経路がシロアリ、真菌および一部の種類の植物において生じることは公知である。Chen,J.et al.,Nature 392:558-559(1998);Daisy,B.H.,et al.,Microbiology 148:3737-3741(2002);およびAzuma,H.,et al.,Phytochemistry 42:999-1004(1996)。ピメリン酸セミアルデヒドは、上記で論じたように7-アミノヘプタン酸または 7-ヒドロキシヘプタン酸に変換することができる。
本発明の一部の態様はまた、組換え宿主細胞を使用することを含む、2-オキソピメレートからヘキサメチレンジアミンを生成する方法も提供する。2-オキソピメレートは、メタン生成古細菌における補酵素B生合成経路の公知の中間体である。
本開示は、本明細書で述べる経路の1つにおいて化合物を生成するために使用される酵素の1つまたは複数(例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、またはさらにそれ以上)を組換え発現する組換え宿主細胞、および二官能性および三官能性C7アルカンを生成するためにそのような宿主細胞を使用する方法を特徴とする。例えば、宿主細胞は以下の1つまたは複数(上記のような)をコードする1つまたは複数(上記のような)の外因性核酸を含み得る:D,L-ジアミノピメレートまたはα-アミノピメレートの還元的脱アミノ化を触媒する酵素、2-ヘプテン二酸のピメリン酸へのエノエート還元を触媒する酵素、ピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへのカルボン酸還元を触媒する酵素、ピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸へのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素、7-アミノヘプタン酸のエナントラクタムへのアミド加水分解を触媒する酵素、7-アミノヘプタン酸の7-アミノヘプタナールへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素、1,7-ジアミノヘプタンを生成するための7-アミノヘプタナールへのアミノ基の転移を触媒する酵素、2-ヘプテン二酸CoAを生成するための2-ヘプテン二酸へのCoAの転移を触媒する酵素、2-ヘプテン二酸CoAのピメロイルCoAへのエノエート還元を触媒する酵素、ピメリン酸を生成するためのピメロイルCoAのチオエステル加水分解を触媒する酵素、ピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへのカルボン酸還元を触媒する酵素、α-ケトピメレートを生成するためのα-アミノピメレートからのアミノ基の転移を触媒する酵素、α-ケトピメレートのα-ヒドロキシピメレートへのカルボニル還元を触媒する酵素、α-ヒドロキシピメレートCoAを生成するためのα-ヒドロキシピメレートへのCoAの転移を触媒する酵素、α-ヒドロキシピメレートの2-ヘプテン二酸への還元を触媒する酵素、α-ケトピメレートのα-ケトスベレートへのα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素、α-アミノスベレートを生成するためのα-ケトスベレートへのアミノ基の転移を触媒する酵素、α-アミノスベレートの7-アミノヘプタン酸へのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素、ピメリン酸セミアルデヒドを生成するためのα-ケトスベレートのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素、ピメリン酸を生成するための6-アミノ-2-ヘプテン二酸のエノエート還元を触媒する酵素、またはピメロイル-[acp]のピメリン酸へのチオエステル加水分解を触媒する酵素。組換え宿主細胞は、上記に列挙した酵素の1つまたは複数をコードする1つまたは複数(上記のような)の核酸からなる任意のサブグループを含み得る。
本発明の方法において使用される生物触媒は、酵素が天然に存在する種の非修飾宿主細胞であり得る。典型的には、しかし、非天然の(すなわち組換えまたは遺伝子操作された)宿主細胞を生成するように宿主細胞を遺伝的に修飾する必要がある。
一部の態様では、全細胞生物触媒(すなわち宿主細胞)の染色体は修飾されている。この修飾は、染色体中の核酸の挿入、欠失または置換であり得る。細胞の染色体に修飾を行う方法は周知であり、例えばトランスポゾン突然変異誘発、Cre-Lox媒介性組換え、λRedおよびRecET媒介性組換えである。
一部の態様では、宿主細胞ゲノムのエピソーム組成物を修飾する。エピソームにより、任意の自律複製するエレメント、例えばプラスミド(線状または環状であり得る)、コスミド、酵母人工染色体(YAC)等が意味される。エピソームエレメントはしばしばそれらの宿主細胞に代謝負荷をかけ、したがって、エピソームの少なくとも1つのコピーが細胞***後に各々の娘細胞中に存在することを確実にする何らかの能動的分配機構が存在しない場合は、選択マーカーを含む必要がある。
細胞に導入される核酸は、多数のエレメントの1つまたは複数(例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、またはさらにそれ以上)を含み得る。典型的には、エレメントの1つは、二官能性または三官能性C7アルカンまたはそのような分子の前駆体を生産するために使用される酵素をコードする。一部の代替法では、核酸は、本発明の方法において機能する酵素ではないタンパク質をコードする。
一部の態様では、宿主細胞の単一株を使用して、本発明の方法において使用される複数(例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、またはさらにそれ以上)の酵素を発現させる。この場合、複数の酵素は同じ導入核酸によってコードされ得る。代替法では、酵素は別々の導入核酸フラグメント上にコードされ得る。酵素は、すべてが単一プロモーターから(例えば酵素をオペロンの形態で配置することによって)発現され得る。代替法では、酵素は複数の別々のプロモーターから発現され得る。一部の場合、複数の別々のプロモーターが同じ化学物質によって誘導され得る(例えば、複数の酵素の各々が酵素GALプロモーターから発現され得、したがって各遺伝子をガラクトースで誘導できることを意味する)。他の適切なプロモーターは当技術分野において公知である。代替法では、本発明の方法において使用される酵素をコードする遺伝子の各々は異なるプロモーターの制御下にある。したがって、異なる酵素を異なる誘導化合物の使用を通して個別に導入することができる。別の代替法では、いくつかの酵素は同じプロモーターの制御下にあり、およびまたいくつかの酵素は異なるプロモーターの制御下にある、中間的なアプローチが使用される。この代替法は、多数の酵素経路が宿主細胞において生成されており、経路の各成員をその他の経路成員と協調して制御するが、各々の経路を別々に制御することが望ましい場合に特に好都合であり得る。
細胞が非天然の条件下でタンパク質を発現するように遺伝子操作されている場合(例えば、ある種にネイティブであるタンパク質が天然のレベルより高いレベルで発現される場合、または代替法では、異なる種からのタンパク質が宿主細胞において発現される場合)、一部の場合には、そのタンパク質は活性形態では発現されない。その代わりに、誤って折りたたまれ、非機能性の「封入体」凝集物として蓄積され得る。この場合、タンパク質を発現するのに使用される細胞を、タンパク質の誤った折りたたみを防ぐことができるまたは凝集状態からタンパク質を再度折りたたむことができるシャペロンタンパク質をさらに発現するための遺伝子修飾に供し得る。そのようなシャペロンタンパク質を含むことは、細胞当たりの活性タンパク質の量を増大させ、それゆえ本発明の方法の全体的な効率を上昇させるので、好都合である。発現されるシャペロンは宿主細胞のシャペロンタンパク質であり得る。代替法では、シャペロンはタンパク質と同じ種/株に由来し得る。発現のための典型的なシャペロンタンパク質は、GroEL/GroESファミリーの成員、およびDnaJ/DnaK/GrpEファミリーの成員を含む。原型大腸菌のGroEL/GroESおよびDnaJ/DnaK/GrpEタンパク質のホモログが他の原核生物種において同定されており(例えば、参照)、真核生物ホモログも公知である(GroELおよびGroESは真核生物タンパク質Hsp60およびHsp10に対応し、DnaJ、DnaKおよびGrpEはそれぞれ真核生物タンパク質Hsp70、Hsp40およびHsp24に対応する)。これらのタンパク質は多数の種の酵母(例えばサッカロミセス・セレビシエ)において同定されている。本発明の方法において使用される酵素との共発現のための適切なシャペロンタンパク質の選択は、本明細書の教示に従って当業者に明らかである。
代謝遺伝子操作は、化合物を生産する細胞の能力を高めるために宿主細胞におけるパラメータを最適化する工程である。本発明の方法において使用される宿主細胞は、任意で、上記で論じた二官能性C7アルカンの生産量を最適化するように遺伝子操作されている。
本発明の一部の態様では、本発明の方法において細胞が変換を実施する時点で増殖中(すなわち***中)である宿主細胞を使用する。これらの態様では、所望の二官能性C7アルカンの生産を最適化する条件下で細胞を培養する。本明細書で述べる組換え宿主細胞のいずれかを、本発明の生合成生成物を生産するおよび/または分泌するように培養することができる。本明細書で使用される場合、培養という用語は発酵槽およびバイオリアクターと等価である。
一部の場合、増殖に使用される炭素源は、栄養ブロス、例えばルリア培地または酵母抽出物培地の形態で提供される。また別の場合には、宿主細胞の増殖に適した規定培地(すなわち各成分の濃度が既知である培地)を使用し得る。1つの代替法では、増殖培地はグルコースを炭素源として含む。別の代替法では、培地中で宿主細胞によって使用される炭素源は、グルコース、スクロース、キシロース、脂肪酸およびグリセロールである。
一部の態様では、本発明の方法において変換を触媒する酵素は2つ以上の株/種の細胞において存在し、それらの2つ以上の株/種の細胞は同時に使用される。本発明の方法における変換が実施されるときに複数の株/種が増殖している(すなわち細胞が共培養下にある)場合、選択される株/種は、ある株がその他の株を打ち負かしてしまわないように選択されねばならない。そのような関係は、共培養物に人工的共生を導入することによって得ることができる。すなわち使用される2つの株/種は、各々必須栄養素に栄養要求性であるが、異なる栄養素について栄養要求性である。さらに、その他の株は、培養物の増殖培地が2つの必須栄養素を含まない場合に両方の株が培養物中で共に生存できるように、その栄養素を過剰に生産するように遺伝子操作されるべきである。適切な栄養要求株の選択は、本明細書の教示に従って十分に当業者の理解の範囲内である。
本明細書で述べる培養条件は、ヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールまたはエナントラクタムの製造のためにスケールアップすることができ、連続的に増殖させることができる。例示的な増殖手順は、例えば流加発酵およびバッチ分離、流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離を含む。これらの工程のすべてが当技術分野において周知である。発酵手順は、商業的な量の二官能性および三官能性C7アルカンの生合成生産のために特に有用である。一般に、および非連続的な培養手順に関して、先に述べたヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールまたはエナントラクタムの連続的および/またはほぼ連続的な生産は、対数期の増殖を維持するおよび/またはほぼ維持するのに十分な養分および培地の存在下で、本明細書で述べるヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールまたはエナントラクタムを生産する組換え宿主細胞を培養する段階を含む。そのような条件下での連続培養は、例えば1日、2、3、4、5、6または7日またはそれ以上を含み得る。加えて、連続培養は、 1週間、2、3、4または5週間またはそれ以上および数か月までを含み得る。あるいは、組換え細胞は、特定の適用に適する場合は、数時間培養することができる。連続的および/またはほぼ連続的な培養条件は、これらの例示的な期間の間のすべての時間間隔を含み得ることが理解されるべきである。本発明の宿主細胞を培養する時間は、所望の目的のために十分な量の生成物を生産するのに十分な期間である。
流加発酵およびバッチ分離、流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離において利用できる。バッチ発酵および連続発酵手順の例は当技術分野において周知である。
本発明はまた、本発明による組換え宿主細胞ならびにヘプタン-1,7-二酸、7-オキソヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタン酸、7-ヒドロキシヘプタナール、7-アミノヘプタン酸、ヘプタメチレンジアミン、1,7-ヘプタンジオール、7-アミノヘプタナール、7-アミノヘプタノールおよびエナントラクタムを含む組成物も提供する。本発明はまた、本発明による組換え宿主細胞および原材料を含む組成物も提供する。一部の態様では、原材料は再生可能な原材料であり、例えば原材料は、グルコース、スクロース、キシロース、脂肪酸およびグリセロールからなる群より選択される。一部の態様では、原材料は多環芳香族炭化水素、例えばベンゼン、トルエンまたはシキメートである。
ここまで本発明を一般的に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらの実施例は説明として提供されるものであり、限定を意図されない。本明細書で開示される例示的な態様に、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正および変更を加え得ることが理解される。
3.1.1.1 MAL酵素遺伝子標的の選択
2,6-ジアミノピメリン酸の、ナイロン-7,7の生産において使用されるピメリン酸への変換、およびピメリン酸の7-アミノヘプタン酸への変換に関与する経路を同定した後、これらの経路からの遺伝子標的を選択した。特に、酵素標的を、その広い基質特異性、広範囲の宿主における存在、クローン化され、外因性に発現され得ること、および合理的設計によるタンパク質遺伝子操作のために利用可能な結晶構造に基づき、メチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼ(MAL;EC 4.3.1.2)を含むアンモニアリアーゼファミリー(EC 4.3.1)から選択した。シトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフムおよびアスペルギルス・オリゼ由来のMAL遺伝子を選択した。C.アマロナティカスによってコードされるMAL酵素(GeneBank AB005294;フラグメント1641-2882878596..879060NM_NM)とC.テタノモルフム(GeneBank S48141;フラグメント756-1997)によってコードされるMAL酵素は有意の相違を有する(57%の同一性)。アスペルギルス・オリゼのMAL遺伝子(GeneBank XM_001827609)は進化的に分岐しており(シトロバクター・アマロナティカスMAL と44%の同一性、クロストリジウム・テタノモルフムMALと39%の同一性)、異なる触媒特性および/または選択性を示し得る。2,6-ジアミノピメレートおよび2-アミノヘプタン二酸の還元的脱アミノ化のための潜在的な酵素である別の異例のアンモニアリアーゼは、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)(受託番号BAD69624)由来のD-グルコサミン酸アンモニアリアーゼ(EC 4.3.1.9)である。これは、α,β- 脱離反応を触媒する異例のアンモニアリアーゼである:
D-グルコサミネート→ 2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコネート+NH3
シトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフムおよびアスペルギルス・オリゼ由来の選択したMAL遺伝子標的を、inABLE技術を使用してIPTG誘導性pET21-aバックボーンにクローニングし、I4(シトロバクター・アマロナティカスMAL遺伝子を有するpET21-a)、I5(クロストリジウム・テタノモルフムMAL遺伝子を有するpET21-a)、およびI6(アスペルギルス・オリゼMAL遺伝子を有するpET21-a)を生成した。最初に、ソフトウェア解析を用いて遺伝子およびベクターDNAをトランケートされたパートに分割する。選択したMAL遺伝子およびpET21ベクター内の潜在的な制限酵素、例えばEarIの部位を同定し、突然変異を導入することによって分断した。コード配列内に位置するEarI制限部位を、コードされるタンパク質配列を改変するのを避けるために、例えばサイレント突然変異の組込みによって、分断した。生じたDNAはEarI部位を含まず、EarI(DNA 2.0を通して入手した)、長および短リンカーオリゴヌクレオチド(Sigma-Aldrichを通して入手した)ならびに長および短パートオリゴヌクレオチド(Sigma-Aldrichを通して入手した)によって隣接された対応するトランケートパートを設計するソフトウェア解析のための入力配列を使用した。パートおよびリンカーオリゴヌクレオチドの5'末端を、適切な反応条件(6μMオリゴ、1 PNK緩衝液、1mM ATP、10U T4キナーゼ、5mM DTT、5%(w/v)PEG8000)下に37℃で30分間、T4キナーゼの存在下でプライマーをインキュベートすることによってリン酸化し、次いで65℃で20分間酵素を不活性化した。
先に得られた大腸菌構築物を使用して、大腸菌におけるシトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフムおよびアスペルギルス・オリゼMAL遺伝子の発現を検討した。ベクター(各集合体から10ngのDNA)を使用してエレクトロコンピテントBL21(DE3)大腸菌細胞を形質転換し、形質転換試料をLB-Amp-寒天に塗布した。37℃で一晩インキュベートした後、形質転換体を得た。
シトロバクター・アマロナティカス、クロストリジウム・テタノモルフおよびアスペルギルス・オリゼに由来するメチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼの活性を、最初に、I4、I5およびI6株を用いてβ-メチルアスパルテートに対して検定した。本明細書で述べるその後の試験では、これらの株の活性を異なる基質、すなわち2-アミノピメレート、D,L-リジン、および最後に2,6-ジアミノピメリン酸に関して検定した。I17による2-アミノピメレートの陰性対照生物転換も実施した。
I4、I5およびI6リアーゼ株の5g/Lまたは20g/L全細胞当量で6種の生物転換体を調製した。酵素濃度は全細胞当量に基づいて計算し、これは、遠心分離後のペレット化した細胞質量(湿細胞重量)を、溶解の間に細胞を再懸濁するのに使用した緩衝液の容量で除したものである。生物転換を、10mM DL-スレオ-βメチルアスパルテートを用いて3ml容量で実施した。
2-アミノピメレートに対するI4およびI5酵素活性を調べるために、様々なレベルの酵素および基質濃度で(2変数、2レベル状況デザイン)8種の生物転換体を調製した。以下に示す様々な負荷を用いて3ml容量で生物転換を実施した。
3.1.1.4.1で述べた実験で使用したレベルに合致するように様々なレベルの細胞抽出物および基質を用いて4種の生物転換体を調製した。3mlの反応容量で以下に示すように生物転換を実施した。
2-アミノピメレートに対するリアーゼ活性を試験するために使用したのと同様の方法で8種の生物転換体を調製した。I4およびI5リアーゼ株を、様々な濃度の細胞出物およびDL-リジン基質を用いて以下のように試験した。
メソ-2,6-ジアミノピメリン酸に対するリアーゼ活性を試験するために6種の生物転換体を調製した。I4、I5および17株を5mM メソ-2,6-ジアミノピメリン酸を用いて試験し、様々な濃度の細胞出物を以下のように検査した。
3.1.2.1 エン酸レダクターゼ標的の選択
ピメリン酸の2つの不飽和中間体、すなわち2-アミノ-5,6-デヒドロピメリン酸および2-ヘプテン二酸の、それらの対応する飽和化合物、2-アミノヘプタン二酸およびピメリン酸への変換に関与する経路を同定した後、酵素標的を、エン酸レダクターゼファミリー(EC 1.3.1)、例えばEC 1.3.1.31、EC 1.3.1.8、EC 1.3.1.9、EC 1.3.1.10, EC 1.3.1.31、EC 1.3.1.38、EC 1.3.1.39、EC 1.3.1.44、またはEC 1.3.1.62におけるピメロイル-CoAデヒドロゲナーゼ、例えばPimC/PimDもしくはThnJ/ThnKから選択した。エン酸レダクターゼはEC 1.3、例えばEC 1.3.8.1またはEC 1.3.99.3、EC 1.3.99.B10もしくはシントロファス・アシディトロフィカス(Syntrophus aciditrophicus)2,3-ジデヒドロピメリル-CoAレダクターゼおよびそのホモログであってよい。α,β-不飽和カルボン酸に対するそれらの異なる基質特異性およびそれらの安定性に基づく(Stereocomplementary bioreduction of α,β-unsaturated dicarboxylic acids and dimethyl esters using enoate reductases - Enzyme- and substrate-based stereocontrol:Stueckler et al.Org.Lett.2007,9,5409-5411)。
選択した枯草菌およびトマト由来のYqjM、OPR1および OPR3遺伝子標的を、次に、3.1.1.2章で詳述したようにinABLE技術を用いてIPTG誘導性pET21-aバックボーンにクローニングし、I1(pET21-a中の枯草菌YqjM遺伝子)、I2(pET21-a中のトマトOPR1遺伝子)、およびI3(pET21-a中のトマトOPR3遺伝子)を作製した。
反応をサーモサイクラーにおいて実施し(95℃、0.5分;95℃、0.5分、55℃、1分、68℃、10分の35サイクル;68℃、1分、4℃保持)、その後DpnI(1μL)で処理して、メチル化親DNAを37℃で2時間消化した。消化反応物(3μL)を使用してTOP10エレクトロコンピテント大腸菌細胞を形質転換し、形質転換試料(100μL)をLB-Kan-寒天に塗布した。37℃で一晩インキュベートした後、Quikchange反応プレートで約100クローンを得たのに比して、陰性対照プレートでは皆無であった。10クローンをプレートから採取し、対応するプラスミドを精製して、EarI消化によって分析した。アガロースゲル上に300bpのバンドが存在しないことは、OPR3遺伝子内に位置するEarI部位が欠失していることを示した。EarI消化は、数個のクローンが残留EarI部位の除去に関して陽性であることを示した。DNA塩基配列決定によりクローンの配列を確認した。
最初に、クローン化したエン酸レダクターゼ遺伝子を、3.1.1.3章で上述したように1mM IPTGおよび37℃の誘導温度を用いて大腸菌で発現させた。簡単に述べると、各々培養物について誘導前および誘導後の様々な時点でOD600を測定した。誘導後24時間のインキュベーション後に残った残存培養物を50mLファルコンチューブに移し、5000rpmで10分間の遠心分離によって採取して、SDS-PAGEを用いて試料のタンパク質含量を分析した。予想されたサイズ(35kDa)の大きなタンパク質バンドが、IPTG誘導後に枯草菌YqjMエン酸レダクターゼの発現試験からの可溶性画分において明瞭に見えた。IPTG誘導後にトマトOPR1エン酸レダクターゼの発現物からの不溶性画分において大きなバンドが見え、I2から発現された予想上の42kDa OPR1タンパク質が大腸菌において不溶性であることを示唆した。予想されたサイズ(44kDa)のタンパク質バンドが、トマトOPR3 エン酸レダクターゼI3のIPTG誘導後に可溶性部分ならびに不溶性画分で明瞭に検出され、予想された 44kDaのトマトOPR3エン酸レダクターゼタンパク質が大腸菌において部分的可溶性形態として発現されることを示唆した。
C6基質(2-ヘキセン二酸および2,3-ジデヒドロアジポイル-CoA)およびC7基質(2-ヘプテン二酸および2,3-ジデヒドロピメロイル-CoA)の両方の、二重結合の還元を評価した。
3.1.3.1 標的酵素の選択
脂肪アシルCoAレダクターゼは、クチクラワックス形成のために植物および他の高等真核生物におけるワックスエステル合成に関与する。古細菌および細菌では、これらの酵素は長鎖アルカン生合成に関与するが、これらの生物におけるそれらの生理的機能はまだ必ずしも明らかではない。植物におけるワックスエステルの形成は、アシルCoAの伸長から始まって長鎖脂肪酸(LFCA)(または脂肪アシルCoA)を形成し、次にこれが脱カルボニル経路またはアシルCoA還元経路によって還元される(Cheesbrough and Kolattukudy,1984)。
*証拠のレベル-酵素活性は、酵素が異種もしくは同種のいずれかで精製されたこと、または活性が粗抽出物または他の細胞画分において測定されたことを意味する。
C.クルイベリの2つの菌株(DSM555およびDSM563)を、以下のものを含む改変DSM-52培地40mL中にて、エタノール(20mL/L培養物)およびスクシネート(5g/L)を加えたフラスコ内にて増殖させた:K2HPO4(0.31g/L)、KH2PO4(0.23g/L)、NH4Cl(0.25g/L)、MgSO4x7H2O(0.20g/L)、微量元素溶液SL-10(1mL)(10mL HCl(25%、pH7.7M)/L溶液;1.5g/L FeCl2x4H2O;70mg/L ZnCl2;100mg/L MnCl2x4H2O;6mg/L H3BO3;190mg/L CoCl2x6H2O;2mg/L CuCl2x2H2O;24mg/L NiCl2x6H2O;36mg/L Na2MoO4x2H2O)、亜セレン酸塩-タングステン酸塩溶液(1mL)(0.5g/L NaOH、3mg/L Na2SeO3x5H2O;4mg/L Na2WO4x2H2O)、酵母エキス(1g/L)、レザズリン90.5g/L)、NaHCO3(2.5g/L)、ビタミン7種の溶液(1mL)(100mg/LのビタミンB12;80mg/Lのp-アミノ安息香酸(aminoenzoic acid);20mg/LのD(+)-ビオチン;200mg/Lのニコチン酸;100mg/Lのパントテン酸カルシウム;300mg/Lの塩酸ピリドキシン;200mg/Lのチアミン-HClx2H2O)、システイン-HClxH2O(0.25g/L)、Na2Sx9H2O(0.25g/L)。培地は厳密に嫌気的に調製した。
3.1.4.1 カルボン酸レダクターゼ標的の選択、クローニングおよび発現
ピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへの還元のための酵素標的をカルボン酸レダクターゼファミリー(EC 1.2.99.-、例えばEC 1.2.99.6)から選択した。特に、ノカルジア属のカルボン酸レダクターゼは、芳香族基質に対して大きな基質特異性を示す単量体酵素であり、大腸菌において成功裏にクローン化され、発現された(Nocardia sp.Carboxylic acid reductase:Cloning,expression,and characterization of a new aldehyde oxidoreductase family:He et al.Appl.Environ.Microbiol.2004,70,1874-1881)。この酵素は、それゆえ、ピメリン酸のピメリン酸セミアルデヒドへの変換を観測する初期スクリーニングのための良好な候補物であった。
活性アッセイは、陽性対照としての安息香酸ナトリウム、およびピメリン酸ナトリウムに対するCAR活性の検出に基づいた。アッセイの条件は、Applied and Environmental Microbiology 2004, 70, p1874-1881から採用した。
上記のアッセイ物のそれぞれに関してNADPH消費を経時的に測定した分光光度アッセイの結果を、図13に提示している。NADPH消費のバックグラウンド速度(基質、および空ベクターを保有する生物触媒を用いた陰性対照実験、表2)に関して補正すると、アジピン酸およびピメリン酸の両方が、モデル基質である安息香酸塩よりも高率で還元型であることが明らかである。したがって、カルボン酸レダクターゼ酵素がNADPHを消費し、かつ安息香酸ナトリウム、アジピン酸およびピメリン酸に対する活性を有することが守備良く実証された。
CoASHまたはアシル-[アシル-キャリアータンパク質]チオエステルの加水分解または転移を触媒することができる酵素は、EC 3.2.1.-、例えばEC 3.1.2.2、EC 3.1.2.14EC 3.1.2.18;3.1.2.19、3.1.2.20 EC 3.1.2.21などからのチオエステルヒドロラーゼ、EC 6.2.1.-、例えばEC 6.2.1.3、EC 6.2.1.5;EC 6.2.1.14、EC 6.2.1.20;EC 6.2.1.23などからの酸-チオールリガーゼ、ならびにEC 2.8.3.-、例えばEC 2.8.3.12およびEC 2.8.3.13などからのCoAトランスフェラーゼ、または(or or)CoAのピメリン酸への可逆的転移を触媒するThnHの遺伝子産物を含む(Aroa Lopez-Sanchez, Belen Floriano, Eloisa Andujar, Maria Jose Hernaez, and Eduardo Santero, 2010. Tetralin-Induced and ThnR-Regulated Aldehyde Dehydrogenase and β-Oxidation Genes in Sphingomonas macrogolitabida Strain TFA. Appl. Environ Microbiol. 76: 110-118)。それらの3つのファミリーのうち、チオエステラーゼは、多数の特性づけられた酵素、ならびに鎖の長さ(C-3〜C-26)の点および官能基(ジカルボキシリル-CoA基質)の点から見たそれらの幅広い基質特異性のために、ピメロイル-CoAの加水分解のための最良の候補となる。
酸-チオールリガーゼは、付随するアデノシン三リン酸(ATP)の加水分解を伴って炭素-硫黄結合の形成を触媒する。CoAリガーゼは、可逆性に関して厳密にまたは体系的に試験されていない。結晶構造が得られておらず、そのため活性部位の構造は不明である。それゆえ、AMP、ピロリン酸またはマグネシウムイオンが可逆的反応のために必要であるかどうかは明らかでなく、これらの補因子の組合せの存在下および不在下でインビトロアッセイを実施すべきである。言うまでもなく、最終的な目標は全細胞において可逆的反応を得ることであり、これはより困難であり得る。経路における後の反応は、当然ながら、平衡をチオ開裂の方向に引き寄せる。それにもかかわらず、ATPの加水分解およびその後のピロリン酸の加水分解は正反応をエネルギー発生性にするので、これは逆転させるのが難しい反応であり得る。それゆえ、細胞を遺伝子操作することを試みる前に、インビトロで反応の可逆性に対する種々のATP:AMP比の影響を測定することが重要である。ATP:AMP比が決定的に重要である場合は、可逆的反応を進行させるのに十分なだけ細胞内ATP濃度を低下させるように細胞エネルギー充足率を操作することが必要であり得る。これは、次に、十分に低いATP濃度を達成するためにATPシンターゼ阻害剤または脱共役剤を使用する必要があり得るので、良好な生産性を得ることに関してさらなる困難を引き起こし得る。原則として、これらの問題はいずれも克服できないわけではないが、遺伝子操作された生物触媒の開発は複雑になり得る。アシルCoAの加水分解は、それゆえ、逆反応と比較して熱力学的に不利である酸-チオールリガーゼ触媒反応の間、ATPの生成を必要とする。
ピメリン酸CoAシンターゼ(6-カルボキシヘキサン酸CoAリガーゼ)は、無細胞抽出物を用いてバチルス・スファエリカスにおいて発見された。これはビオチン生合成経路に関与する。酵素活性は、7-ケト-8-アミノペラルゴン酸シンテターゼと合わせた反応およびサッカロミセス・セレビシエを使用した微生物学的アッセイによって間接的に決定された[1]。ピメリン酸CoAシンターゼ(bioW)をコードする遺伝子は、B.スファエリカスゲノムからのライブラリ担持配列を有する大腸菌突然変異体の相補性試験によって7-ケト-8-アミノペラルゴン酸シンテターゼ(bioF)と共に同定された[Gloeckler R,Ohsawa I,Speck D,Ledoux C,Bernard S,Zinsius M,Villeval D,Kisou T,Kamogawa K,Lemoine Y.(1990)Cloning and characterization of the Bacillus sphaericus genes controlling the bioconversion of pimelate into dethiobiotin.Gene.87:63-70]。BioWは大腸菌において過剰発現され、均一に精製された[Ploux O,Soularue P,Marquet A,Gloeckler R,Lemoine Y.(1992)Investigation of the first step of biotin biosynthesis in Bacillus sphaericus.Purification and characterization of the pimeloyl-CoA synthase,and uptake of pimelate.Biochem J.287:685-690]。この酵素は、ピメリン酸二ナトリウム、ATP、CoASHおよびMgCl2の存在下で活性であった。反応の生成物はピメロイルCoAおよびAMPであり、ADPは検出されなかった。この酵素はATP およびピメリン酸に対してのみ特異的であった。他のヌクレオチド(例えばGTP、AMP)および代替的な基質(コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、スベリン酸)は受け入れられなかった。
異化ピメロイルCoAリガーゼ、pauAは、シュードモナス・メンドシナ35におけるジカルボン酸(C6〜C10)の分解に関与する[Binieda A,Fuhrmann M,Lehner B,Rey-Berthod C,Frutiger-Hughes S,Hughes G,Shaw NM.(1999)Purification,characterization,DNA sequence and cloning of a pimeloyl-CoA synthetase from Pseudomonas mendocina 35.Biochem J.340:793-801]。この酵素はジカルボン酸を活性化し、ジカルボン酸はその後β酸化経路によって代謝される。酵素は均一に精製され、部分的アミノ酸配列が決定された。pauAはbioWより広い基質範囲を示し、ピメリン酸(100%相対活性)、アジピン酸(72%)およびアゼライン酸(18%)を受け入れた。この酵素は、ビオチン生合成経路に関与するbioWよりも1桁から2桁分活性であった。遺伝子pauAが同定され、リガーゼは大腸菌において成功裏に過剰発現された。シュードモナス・メンドシナ由来のリガーゼpauAをこのクラスからの一例として選択したが、それはその基質範囲および特異的活性が理由である(好ましい基質はピメリン酸である、Binieda et al., 1999. Purification, characterization, DNA sequence and cloning of a pimeloyol-CoA synthetase from Pseudomonas mendocina 35. Biochem. J. 340: 793-801)。
高度好熱性古細菌サーモコッカス・コダカラエンシス(SCSTk)由来のスクシニル-CoAシンテターゼは、TK1880(α-サブユニット)およびTK0943(β-サブユニット)によってコードされるヘテロマー酵素(α2β2)である。SCSは、スクシニル-CoAのスクシネートへの可逆的変換を触媒し、CoAはADP/GDPの基質レベルでのリン酸化を伴う。SCSTkは比較的特異的であり、少数の酸のみに対して意味のあるレベルの活性を示す。スクシネート、イソバレレートおよび3-メチルチオプロピオネートに対するSCSTkの活性レベルおよび速度論的パラメーターからは、Glu、LeuおよびMetの異化作用におけるこの酵素の関与が示唆される。しかし、ACSIITkが後者2つの基質に対しても高レベルの活性を示すことを考慮すれば、SCSTkの主要な生理的役割はスクシニル-CoAからのATPの生成にある可能性が最も高い。SCSTkは可逆的酵素であり、それはアジペートでネイティブ性基質の活性の59%を示しており(Shikata et al., 2007. J Biol Chem, 282:26963-26970)、それ故に適した候補であるように思われる。
酵素を79%の回収率で約34倍に精製した[Izumi Y,Morita H,Tani Y,Ogata K.(1974)The pimeloyl-CoA synthetase responsible for the first step in biotin biosynthesis by microorganisms.Agr.Biol.Chem.38,2257-2262]。反応は、ピメリン酸、ATP、CoASHおよびMgCl2を必要とした。この酵素はピメリン酸に対してのみ特異的であり、他のジカルボン酸は受け入れられなかった。興味深いことに、ATPをADPで置き換えることができ、ピロリン酸開裂が必須ではないことを示唆した。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列は不明である。しかし、巨大菌の3つの完全なゲノムが1974年から公表されている。それゆえ、bioWホモログに関するBLAST検索を実施した。残念ながら、これはいかなる適合も示さなかった。
ラベンダー細胞培養物におけるピメロイルCoAシンターゼ活性が記述されている[6]。[3H]-ピメリン酸はビオチン生合成における前駆体であることが認められたが、この酵素または遺伝子について入手可能なデータはない。
エンドウタンパク質抽出物の可溶性画分において活性が認められた[7]。酵素はATP/Mg2+およびCoASHを必要とした。リガーゼの分子量を、リシニバチルス・スファエリカス由来のリガーゼに対するポリクローナル抗体を使用してウェスタンブロット法によって決定した。酵素は、ピメリン酸ならびにアゼライン酸を受け入れたが、ノナン酸は受け入れなかった。GTPをATPの代わりに使用することができたが、ADPについては反応を認めなかった。可溶性ピメロイルCoAシンテターゼをコードする遺伝子は同定されなかった。
この酵素はペルオキシソームタンパク質画分に位置した[GerblingH,Axiotis S,Douce R.(1994)A new acyl-CoA synthetase,located in higher plant cytosol.J Plant Physiol.143:561-564.]。ピメリン酸はピメロイルCoAへと活性化され、その後β酸化経路によってアセチルCoAおよびマロニルCoAに分解された。この酵素の基質範囲は試験しなかった。この酵素は、同じ生物由来の可溶性アシルCoAシンテターゼよりも高いpH最適値を示した。
ジカルボン酸(C5〜C16)は、ラット肝臓からのミクロソームタンパク質画分由来のジカルボキシリルCoAシンテターゼによってそれらのCoAエステルに変換された[Vamecq J,de Hoffmann E,Van Hoof F.(1985)The microsomal dicarboxylyl-CoA synthetase.Biochem J.230:683-693.]。この酵素はATPを利用するが、GTPは利用しない。反応はその生成物によって阻害され、AMPはピロリン酸よりも阻害性である。酵素はC12基質に対して最も高い活性を示した。ジカルボキシリルCoAシンテターゼの一部のアッセイでは、CoA消費のプラトーの後にCoAが放出された。これは、反応が可逆的であり得ることを示唆するので、重要な所見である。しかし、タンパク質試料がCoAチオエステラーゼで汚染されていた可能性があるため、この示唆はいくぶん慎重に取り扱うべきである。この酵素は有望であり得るが、ラットゲノム配列のBLAST検索はいかなるbioWまたはpauAホモログも明らかにしなかった。遺伝子を同定するには代替的なアプローチ、例えば酵素の精製、N末端配列決定、プライマー設計およびPCR増幅が必要であろう。
硝酸ナトリウムおよびピメリン酸ナトリウムで増殖するように濃縮した活性汚泥由来の脱窒素菌の環境培養物において活性が認められた[Gallus C,Schinlc B.(1994)Anaerobic degradation of pimelate by newly isolated denitrifying bacteria.Microbiology.140:409-416.]。この酵素はATPおよび Mg2+の存在下で活性であった。反応の生成物はADPではなくAMPであった。この酵素は安息香酸を受け入れなかった。
アシダミノコッカス・フェルメンタンス由来のグルタコン酸補酵素A-トランスフェラーゼ(Gct)は、アセチル-CoAおよび遊離酸からの(R)-2-ヒドロキシグルタリル-CoAの形成を触媒する酵素である。Gctは、2種類のサブユニット(GctA、35725DaおよびGctB、29168Da)で構成されるヘテロ八量体(α4β4)として特性づけられている。両方のサブユニット:GctAおよびGctBが大腸菌で共発現され、グルタコン酸CoA-トランスフェラーゼ(EC 2.8.3.12)として機能的であることが示されている。Gctはまた、不飽和型および飽和型の基質ならびにヒドロキシル化基質(2-ヒドロキシグルタレート)に対しても活性があるが、C7補酵素誘導体に対しては検討されていない(Mack et al., 1994. Location of the two genes encoding glutaconate coenzyme A-transferase at the beginning of the hydroxyglutarate operon in Acidaminococcus fermentans.). Eur. J. Biochem, 226:41-51)。これは、アシダミノコッカス・フェルメンタンス(Acidaminococcus fermentans)(GctAB、EC 2.8.3.12)(Glutaconate CoA-transferase from Acidaminococcus fermentans:Buckel et al.Eur.J.Biochem.1981,118,315-321)由来の酵素、グルタコン酸CoAトランスフェラーゼの活性を、部位指定突然変異誘発によってCoAトランスフェラーゼからCoAエステラーゼに変更することが可能であったので(Mack M,Buckel W.(1997)Conversion of glutaconate CoA-transferase from Acidaminococcus fermentans into an acyl-CoA hydrolase by site-directed mutagenesis.FEBS Lett.405;209-212)、見込みのある標的であるようである。この酵素は大腸菌において成功裏に発現され、グルタコニルCoA、3-メチルグルタコニルCoA、ブチンジオイルCoA、2-ヒドロキシアジポイルCoA、オキサロクロトニルCoAおよびムコニルCoAの酵素生合成のために使用された(Parthasarthy A,Pierik A,Kahnt J,Zelder O,Buckel W.(2011)Substrate specificity of 2-hydroxyglutaryl-CoA dehydratase from Clostiridium symbiosum:Toward a bio-based production of adipic acid.Biochemistry.50:3540-35500)。GctABの結晶構造も公表された(Jacob U,Mack M,Clausen T,Huber R,Buckel W,Messerschmidt A.(1997)Glutaconate CoA-transferase from Acidaminococcus fermentans:the crystal structure reveals homology with other CoA-transferases.Structure.5:415-426)。このトランスフェラーゼは、いくつかの水素結合を介して末端カルボン酸陰イオンをセリン残基に結合し、これにより種々の鎖の長さに調整し得る。
3.1.5.3.1 適切な酵素の選択
チオエステラーゼは、CoAまたは[acp]チオエステルの加水分解を触媒する加水分解酵素である。
ACOT8はヒトPET1チオエステラーゼのホモログである。この酵素は大腸菌において Hisタグ融合タンパク質として過剰発現され、HisTrapカラムクロマトグラフィを用いて均一に精製された[Westin MA,Hunt MC,Alexson SE.(2005)The identification of a succinyl-CoA thioesterase suggests a novel pathway for succinate production in peroxisomes.J Biol Chem.280:38125-38132]。活性は、長鎖アシルCoAに関して5〜10μM超の基質濃度で阻害されたが、BSAの添加は阻害を防止された。チオエステラーゼの基質範囲を、飽和および不飽和直鎖アシルCoA(C2〜C20)を用いて試験した。最も高い活性はC10〜C18の胆汁酸(トリヒドロキシコプロスタノイルCoA、コロイルCoAおよびケノデオキシコロイルCoAならびに分枝鎖アシルCoA)に対してであった。試験した基質の大部分についてのKm値はかなり低く、ACOT8が非常に広い基質特異性を有し、それらの大部分を受け入れ得ることを強く示唆した。ACOT8はCoASHにより10〜15μMのIC50で強力に阻害された。ACOT8はジカルボキシリル-モノCoA誘導体に対する活性に関しても試験され、長鎖基質を優先的に加水分解した(C鎖の長さがC3からC12に増大すると共に活性が上昇した)[Hunt MC,Solaas K,Kase BF,Alexson SE.(2002)Characterization of an acyl-coA thioesterase that functions as a major regulator of peroxisomal lipid metabolism.J Biol Chem.277:1128-1138]。
ACOT3は大腸菌において発現され、均一に精製された[19]。この酵素はC8からC26までのモノカルボン酸エステルに対して活性を示し、より長鎖の基質(C16)に対して最も高い活性を示した。酵素は胆汁酸エステルを受け入れなかった。遊離CoASHによる阻害は存在しなかった。ジカルボン酸エステルは試験しなかった。
ACOT5は大腸菌において発現され、均一に精製された[Westin MA,Alexson SE,Hunt MC.(2004)Molecular cloning and characterization of two mouse peroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPARalpha)-regulated peroxisomal acyl-CoA thioesterases.J Biol Chem.279:21841-21848]。この酵素はC6からC20までのモノカルボン酸エステルに対して活性を示し、中鎖基質(C10)に対して最も高い活性を示した。酵素は胆汁酸エステルを受け入れなかった。遊離CoASHによる阻害は存在しなかった。ジカルボン酸エステルは試験しなかった。
ACOT4は大腸菌において発現され、均一に精製された[18]。この酵素は狭い基質範囲を示し、スクシニルCoAおよびグルタリルCoAを受け入れた。反応は、500μMまでの濃度ではCoASHによって阻害されなかった。
マウスAcot8(野生型mRNA配列 GeneBank NM_133240;mRNAフラグメント65-1027)およびインフルエンザ菌YciA(野生型遺伝子配列GeneBank L42023フラグメント 878596-879060、EC 3.1.2.20)由来のチオエステラーゼを、それらのジカルボキシリルCoA基質に対する特異性のゆえに、ピメロイルCoAのピメリン酸への変換についての例として選択した(The identification of a succinyl-CoA thioesterase suggests a novel pathway for succinate production in peroxisomes:Westin J.et al.Biol.Chem 2005,280,38125-38132;Divergence of function in the hot dog fold enzyme superfamily - the bacterial thioesterase YciA:Zhuang et al.Biochemistry 2008,47,2789-2796)。どちらの遺伝子もそれらのそれぞれの宿主ゲノムから同定され、大腸菌において成功裏にクローニングされ、発現された(Characterization of an acyl-CoA thioesterase that functions as a major regulator of peroxisomal lipid metabolism:Hunt et al.J.Biol.Chem.277,1128-1138;Divergence of function in the hot dog fold enzyme superfamily - the bacterial thioesterase YciA:Zhuang et al.Biochemistry 2008,47,2789-2796)。
補酵素Aナトリウム塩(150mg、195μmol)を、アセトン(22.5mL)と水(225μL)の混合物中に懸濁させた。この懸濁液を氷上で0℃まで冷却し、200mM炭酸水素ナトリウム溶液でpH 8に調整した。酸塩化物(586μmol、3当量)を、懸濁液に撹拌しながらゆっくりと添加し、その間、反応物のpHは、炭酸水素ナトリウム溶液のさらなる添加によって8に維持した。反応混合物を0℃でさらに1時間撹拌した。HPLC反応モニタリングによる判定で補酵素Aが消費されたところで、反応混合物を真空下で濃縮し、白色残留物を水(20mL)に再懸濁させ、5Mリン酸でpH 3に調整した上で、ジエチルエーテル(3×20mL)で抽出した。続いて、残った水層を、Phenomenexによって供給されているStrata X 33μmポリマー逆相1g/20mLカートリッジを用いる固相抽出(SPE)によって精製した。
生物変換を最終容積2mL中にて実施した。生物変換物は、1mM基質、200mM KClおよび50mM Hepesカリウム(pH 7.5)で構成した。陰性対照は、空ベクターを保有する細胞で構成した。生物触媒は、最終濃度がほぼ15g/L全細胞当量となるように無細胞抽出物として投入した。反応は、周囲温度(20℃)で、15mLファルコンチューブ内で撹拌しながら実施した。各生物変換物の試料採取を1時間後、4時間後および24時間後に行い、Phenomenex Luna C18 250 x 4.6mm、5ミクロンカラムによるHPLC(Agilent 1100)によって分析した。注入の前に、反応を停止させるために各試料を100℃で5分間加熱し、14000rpmで2分間遠心分離を行った上で、0.2ミクロンのシリンジフィルターを通して濾過した。濾過液を、ピメロイル-CoAの消失(Rt 12.39分)およびCoAの形成(Rt 7.98分間)に関して260nmでのHPLCによって分析したが、これらはいずれもこの波長で強く吸光するものの、ピメリン酸(pimlic acid)は260nmでのUVによっては検出されない。ピメリン酸の形成はLC-MSによって確認した。
トランスアミナーゼまたはアミノトランスフェラーゼは、アミノ酸とケト酸の間の反応を触媒する酵素である。この反応は、アミノ供与体からアミノ基を除去する段階、α-ケト酸を残す段階、およびそれを受容体α-ケト酸に転移してアミノ酸に変換する段階を含む。これらはアミノ酸の合成において重要な酵素であり、自然界全体に遍在する。これらの酵素の多くはピリドキサルリン酸(PLP)を補因子として含む。これらの酵素は、広範囲の基質を利用する、広範囲の細胞機能をカバーする大きくて多様性のあるファミリーに属する。
文献検索、BLAST検索およびタンパク質データベース検索によって同定された多数の候補物は、ピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸への変換のための適切な酵素である。
ストレプトミセス・グリセウス由来の4-アミノ酪酸トランスアミナーゼ
この酵素は1985年に初めて検討され、以下の反応を触媒することが認められた。
4-アミノブタノエート+2-オキソグルタレート→4-オキソブタノエート+グルタメート
この酵素は、6-アミノヘキサノエートおよび7-アミノヘプタノエートを含む比較的広い基質範囲を有し、2-オキソグルタレートをアミノ受容体として使用して、対応するセミアルデヒドを形成する(Yonaha,K.,K.Suzuki,and S.Toyama,4-Aminobutyrate:2-oxoglutarate aminotransferase of Streptomyces griseus:purification and properties.Eur J Biochem,1985.146(1):p.101-6)。これは非常に有望であるが、これらの反応の可逆性は試験されていない。それゆえ、グルタメートは7-オキヘプタノエートから7-アミノヘプタン酸を提供するので、これをアミノ供与体として使用して逆反応をインビトロで試験する。酵素をS.グリセウスIFO 3102(S.グリセウス亜種グリセウス)において精製し、各々約50kDaの2つの同一サブユニットからなる100kDaであることを認めた。補因子はピリドキサル5'-リン酸である。タンパク質はPubmedデータベースに寄託される(表1)。推定上の4-アミノトランスフェラーゼと注釈されている、これをコードする遺伝子(SGR_1829)は、IFO 3102に密接に関連する、S.グリセウスIFO 13350のゲノム配列中に存在する。明らかではないが、このタンパク質が、記述され、検討された酵素の近接ホモログである可能性は極めて高い(Yonaha,K.,K.Suzuki,and S.Toyama,4-Aminobutyrate:2-oxoglutarate aminotransferase of Streptomyces griseus:purification and properties.Eur J Biochem,1985.146(1):p.101-6)。入手可能な基質範囲データを考慮すると、このタンパク質は適切なアミノトランスフェラーゼ酵素として試験するための非常に良好な候補物である。
サーマス・サーモフィルス由来のアミノアジピン酸トランスアミナーゼ(Q72LL6)
これは、哺乳動物由来のα-アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ(AAAAT)に相同性を有する酵素であり、細菌サーマス・サーモフィルスHB27におけるリジン合成に関与すると考えられる[2,3]。動力学データが、2-オキソアジペート、2-オキソイソカプロエート、α-アミノアジペートおよびさらには芳香族アミノ酸などに基質に関して入手可能である[3]。タンパク質は大腸菌において発現され、精製されており、インビトロでは主として、各々約44kDaのサイズのサブユニットのホモ二量体として存在することが認められた(Miyazaki,T.,et al.,alpha-Aminoadipate aminotransferase from an extremely thermophilic bacterium,Thermus thermophilus.Microbiology,2004.150(Pt 7):p.2327-34)。広い基質特異性、その原核生物起源およびコード遺伝子が入手可能であることは、これが1に関して試験するための良好な候補物であり得ることを示唆する。これは非常によく検討された酵素であり、その結晶構造が入手可能であって(PDB ID:2ZP7)、基質特異性への機構的洞察を提供する(Ouchi,T.,et al.,Dual roles of a conserved pair,Arg23 and Ser20,in recognition of multiple substrates in alpha-aminoadipate aminotransferase from Thermus thermophilus.Biochem Biophys Res Commun,2009.388(1):p.21-7;Tomita,T.,et al.,Mechanism for multiple-substrates recognition of alpha-aminoadipate aminotransferase from Thermus thermophilus.Proteins,2009.75(2):p.348-59)。
この酵素は先に述べたサーマス・サーモフィルス由来の酵素に類似する。キヌレニン/アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼと注釈されているが、2つの異なるタンパク質がこれらの反応を実施することを示唆するいくつかの証拠がある(Mawal,M.R.and D.R.Deshmukh,Alpha-aminoadipate and kynurenine aminotransferase activities from rat kidney.Evidence for separate identity.J Biol Chem,1991.266(4):p.2573-5)。タンパク質はラットの腎臓から精製され、ヒト胚性腎線維芽細胞において発現されており、約100kDaのサイズであることが認められた。この酵素は2-オキソアジペートを基質として受け入れることができる。初期試験は(おそらく同じ酵素に関して)、見かけ上可逆性である反応においてDL-2-アミノピメリン酸をアミノ供与体とし、2-オキソグルタレートを受容体として使用できることを示している(Deshmukh,D.R.and S.M.Mungre,Purification and properties of 2-aminoadipate:2-oxoglutarate aminotransferase from bovine kidney.Biochem J,1989.261(3):p.761-8)。同じ論文は、ピメリン酸が活性の阻害剤であり得、ピメリン酸の存在下で活性が30%低下し得ることを示した。
EC 2.6.1.48からのジアミノアミノトランスフェラーゼ、例えば5-アミノ吉草酸トランスアミナーゼもまた、ピメリン酸セミアルデヒドからの7-アミノヘプタン酸の調製に適した触媒である。
2つの遺伝子を、どちらもピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸への変換およびα-ケトスベレートのα-アミノスベレートへの変換のために選択した:(1)IlvE-ωVf融合物(SEQ ID 1および 2)ならびに(2)IlvE-Ad最適化ω融合物(SEQ ID 3および4)。これらの遺伝子を、以前に大腸菌において高い発現レベルを示した、分枝鎖アミノトランスフェラーゼIlvEの5'末端と共にωアミノトランスフェラーゼの融合物を組み込んだプラスミドにおいて調製した(図23および図24参照)。IlvEフラグメントの導入はアミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現を有意に増大させることが実証された。IlvEフラグメントと分枝鎖アミノトランスフェラーゼ遺伝子を含む別の熱誘導性プラスミドも活性アッセイにおいて試験した(ING66)。
組換えVfアミノトランスフェラーゼを使用して7-アミノヘプタン酸への活性を検定した。3種の生物転換体を調製し、7-アミノヘプタン酸およびピルビン酸ナトリウムのL-アラニンへの変換に対する酵素負荷の影響を検討した。生物転換体におけるL-アラニンの検出は、7-アミノヘプタン酸に関する所望のアミノトランスフェラーゼ特異性の明確な証拠を提供する。7-アミノヘプタン酸のピメリン酸セミアルデヒドへのアミノトランスフェラーゼ変換を示す反応スキームを以下に提示する。
7-アミノヘプタン酸に対するビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)ω-アミノトランスフェラーゼ(アクセッション番号HQ418483.1(WT遺伝子配列:フラグメント325-1686))活性の観察された活性に基づき、逆方向での反応、すなわち、ピメリン酸セミアルデヒドの7-アミノヘプタン酸への変換を行った。ビブリオ・フルビアリスω-アミノ酸トランスアミナーゼ酵素、ならびにN-ter-His-Tag精製バチルス・ウェイヘンステファネンシスの両方を評価した。バチルス・ウェイヘンステファネンシスω-アミノ酸トランスアミナーゼ(アクセッション番号JA114119.1)を発現させて、標準的な手法を用いて精製した。反応はアジピン酸セミアルデヒドおよびピメリン酸セミアルデヒドの両方を用いて行い、生成物の形成(6-アミノカプロン酸および7-アミノヘプタン酸)をHPLC(Agilent 1200、GraceSmart RP C18カラム)によって確認した。
C6およびC7セミアルデヒドの合成は、公表された方法(Synthetic communications, 21 (8&9), 1075-1081 (1991)に基づき、以下の一般的な反応スキームに従って行った。
ε-カプロラクトン1a(50g、0.425mol、1当量)をメタノール(500mL)中に溶解させた。濃硫酸(1mL)を投入し、溶液を加熱して一晩還流させた。2aへの完全な変換をGC-MSによって判定した。反応物をRTまで冷却させて、水(700mL)を投入した。生成物をジエチルエーテル(3×200mL)中に抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた上で濃縮して、透明な無色の液体(40.7g)を得た。粗生成物を高真空下(沸点=120℃、7mbar)で蒸留して無色の油2a(32.9g)を得て、それを次の段階に直接用いた。
濃硫酸(1mL)、水(120mL)およびメタノールを氷上で15℃に冷却した。過硫酸カリウム(365.6g、1.34mol、3当量)を、撹拌しながらゆっくりと添加した。メタノール(150mL)中にあるシクロヘプタノン1b(50g、0.447mmol、1当量)を、45分間かけて滴下しながら添加した。反応物を一晩かけて撹拌しながら室温まで温まるようにした。2bへの完全な変換はGC-MSによって判定した。この時点で、2aに記載したワークアップ(work-up)生成物の追跡を行った。
クロロクロム酸ピリジニウム(PCC)(60g)およびシリカゲル(60g)を、1L RBフラスコに、ジクロロメタン(200mL)とともに投入した。この懸濁液を乾燥するまで濃縮して、微粉末を得た。ジクロロメタン(500mL)を、3Å分子ふるい(70g)とともに投入した。懸濁液を氷上で0℃に冷却した。
各エステルアルデヒド3a/b(1g、6.9mmol、1当量)を、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 8)(20mL)中に懸濁させた。固定化リパーゼ樹脂(100mg)を投入し、懸濁液を50℃に加熱して45分間撹拌した。この時点の後に、GC-MSにより、エステルアルデヒド出発材料3a/bが消費されたことが示された。懸濁液をRTに冷却して、リパーゼビーズを濾過し、その結果得られた濾過液を真空下で濃縮して、リン酸緩衝液中にある粗C6/C7セミアルデヒド4a/4bを得た。生成物を1H NMRによって特性決定した。
各エステルアルデヒド3a/b(1g、6.9mmol、1当量)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 8)(20mL)中に懸濁させた。固定化リパーゼ樹脂(100mg)を投入し、懸濁液を50℃に加熱して45分間撹拌した。この時点の後に、GC-MSにより、エステルアルデヒド出発材料3a/bが消費されたことが示された。懸濁液をRTに冷却して、リパーゼビーズを濾過し、その結果得られた濾過液を真空下で濃縮して、リン酸緩衝液中にある粗C6/C7セミアルデヒド4a/4bを得た。生成物を1H NMRによって特性決定した。
* 全細胞当量(WCE)という用語は、細胞溶解後の無細胞抽出物中に存在する生物触媒の量を推定するために用いられる用語である。これは、既知の重量の湿性全細胞を、規定の溶解用緩衝液容積中に再懸濁させることによって計算される。例えば、遠心沈降させた湿性全細胞ペレットの1gを10mLの溶解用緩衝液に再懸濁させる場合には、WCE濃度は100g/Lである。典型的には、本発明者らは生物触媒の懸濁液原液をこの様式で調製し、この原液を必要に応じて希釈して、各生物変換における所望の生物触媒濃度を得る。
C6およびC7セミアルデヒドの10mM原液を試験の前に調製した。これらの原液の調製には以下のプロトコルを用いた:10mMメチルエステルアルデヒドを50mMリン酸ナトリウム(pH 7)(50mL)中に懸濁させた。カンジダ・アンタークティカ(Candida antarctica)由来の固定化リパーゼアクリル樹脂(10mg)を投入した。懸濁液を50℃に加熱して、1時間撹拌した。TLC分析により、この時点の後での出発材料の完全な消費が示された。反応物をRTに冷却し、ビーズを濾過して、ほぼ10mMのセミアルデヒドを含む濾過液を各生物変換に直接用いた。
続いて、6種の生物変換を、最終容積5mL中にてそれぞれ実施した。各生物変換物は、5mMセミアルデヒド、100mM L-グルタミン酸一ナトリウム、および、無細胞抽出物として投入して最終濃度15g/L全細胞当量とした生物触媒で構成した。反応は、30℃で、15mLファルコンチューブ内で撹拌しながらpH 7にて実施した。各生物変換物を定期的に試料採取し、HPLCによって分析した。注入の前に、各試料を100℃に5分間加熱し、14000rpmで2分間遠心分離を行って、0.2ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過した。
V.f. ω-アミノ酸トランスアミナーゼが6-オキソヘキサン酸および7-オキソヘプタン酸に対する活性を有することが首尾良く実証された。対応する6-アミノヘキサン酸生成物および7-アミノヘプタン酸生成物の形成をHPLCによって測定した。生成物ピークの実体は、それらの各々の外部標準物質の保持時間と相関づけることによって判定した。
続いて、14種の生物変換を最終容積1mL中にて実施した。各生物変換物は、10mMセミアルデヒド、100mM L-グルタミン酸一ナトリウム、およびある範囲にわたる精製酵素アリコート容積(100、10および1μL)で構成した。これは、種々のタンパク質濃度でのトランスアミナーゼ活性を評価するために行った。各生物変換はpH 7で実施し、30℃(250rpm)の振盪インキュベーター内に置いた。試料採取を定期的に行い、HPLCによって分析した。注入の前に、各試料を100℃に5分間加熱し、14000rpmで2分間遠心分離を行って、0.2ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過した。
精製N-ter-His-Tag B.w ω-アミノ酸トランスアミナーゼは、6-オキソヘキサン酸および7-オキソヘプタン酸に対して弱い活性を有することが実証された。HPLCの結果は、100μLの精製酵素を投入した実験で所望のアミノ酸生成物が形成されたことを示している。
装置:Agilent 1200;カラム:GraceSmart RP C18 150 x 4.6mm、5ミクロン;カラム温度:40℃。流速:1mL/分;検出:UV 338nm;注入容積:14uL
移動相:系統A:5mMリン酸ナトリウム pH 7;系統B:アセトニトリル
勾配:
β-メルカプトエタノール(50μL)、o-フタルジアルデヒド(50mg)、400mMホウ酸カリウム緩衝液 pH10(4.5mL)およびメタノール(0.5mL)を含む5mL溶液を調製した。誘導体化は、HPLCのオートサンプラー中にて以下の注入プログラムを用いて行った:2μLの試料、6μLの誘導体化混合物、6μLのホウ酸カリウム緩衝液 pH10を注入器ループ内で混合し、注入前に4分間保持した。
10mM 6-アミノカプロン酸
10mM 7-アミノヘキサン酸
50mM L-グルタミン酸一ナトリウム
α-ケトスベレートのα-アミノスベレートへの変換を実証するために、大腸菌由来のIlvE L-AAAT(WT遺伝子:X02413.1(フラグメント301..1230);WTタンパク質:1104250A)をL-選択的アミノトランスフェラーゼとして選択し、バチルス・スファエリクス(Bacillus sphaericus)D-AAAT(WT遺伝子:U26732.1(フラグメント427..1278)WTタンパク質:P54693.1)をD-選択的αアミノ酸アミノトランスフェラーゼの一例として選択した。
参考文献:J. Org. Chem. 1986, 51, 2389-2391およびOrganic syntheses, Coll. Vol. 3, p510, 1955
無水エタノール(880mL)を含むRBフラスコを0℃に冷却した。塩化アセチル(124mL、1.71mol、7当量)を1時間かけて滴下しながら添加した。二酸(1)(0.245mol、1当量)を投入し、その結果得られた懸濁液が室温まで温まるようにした。薄層クロマトグラフィーによる判定で反応が完了したところで、水(300mL)を投入し、エタノールを蒸発によって除去した。残った水性溶液を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液でpH 7に中和した。生成物をメチルtertブチルエーテル(3×250mL)で抽出して、硫酸ナトリウム上で乾燥させた上で濾過し、真空下で濃縮して、粗ジエチルエステル(2)を70%の単離収率で無色の油として得た。次の段階の前に、ジエチルエステルを高真空蒸留によって精製した。
無水ジエチルエーテル(161mL)を含む、火力乾燥を行ったフラスコに対して、窒素雰囲気下にて、金属カリウムの塊(8g、206mmol、1当量)を投入した。無水エタノール(32mL、536mmol、2.6当量)を30分間かけて滴下しながら添加した。金属カリウムが完全に溶解したところで(30℃への穏やかな加熱が必要であった)、淡黄色の溶液が観察された。ジエチルオキサレート(27.5mL、206mmol、1当量)を、よく撹拌しながら急速に添加した。この時点で、ジエチルエーテル(50mL)中にあるジエチルエステル中間体(2)(206mmol、1当量)を10分間かけて添加した。添加中に橙色の懸濁液が形成され、それを氷上で0℃に冷却した。2時間後に固体を濾過し、ジエチルエーテル(5×50mL)を用いて濾過ケーキの洗浄を行った。濾過ケーキ(1回目の採取物)を収集し、濾過液を4℃で一晩貯蔵した。さらなる固体が一晩で沈降した(2回目の採取物)。これを濾過し、1回目の採取物と合わせて黄色の固体(33.7g)を得た。これを5M塩酸中に懸濁させて、ジエチルエーテル抽出(3×100mL)を実施した。一緒に合わせた有機物を鹹水(1×100mL)で洗浄して、硫酸マグネシウム上で乾燥させた上で濾過し、濃縮して、トリエチルオキサリル中間体(3)を粗製の黄色の油(24.5g)として得た。
粗トリエチルオキサリル中間体(3)(24.5g)を10M塩酸(100mL)中に溶解させて、室温で一晩撹拌し続けた。反応混合物を真空下で濃縮して、ゴム状の橙色の油を得た。これをアセトン(100mL)中に溶解させて、活性炭(4g)を投入した。懸濁液を室温で一晩撹拌し続けて、セライトパッドに通して濾過した。濾過ケーキをアセトン(5×10mL)で洗浄し、その結果得られた淡黄色の濾過液を濃縮して、淡橙色の油(20.5g)を得た。
IlvE(L-AAAT)
4種の生物変換を、最終容積5mL中にてそれぞれ実施した。各生物変換物は、10mM基質および50mM L-グルタミン酸一ナトリウムで構成した。生物触媒は、100g/Lの最終濃度が得られるように全細胞として投入した。反応は、30℃で、15mLファルコンチューブ内にて撹拌しながら実施した。各生物変換物を定期的に試料採取し、HPLCによって分析した。注入の前に、各試料を100℃に5分間加熱し、14000rpmで2分間遠心分離を行って、0.2ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過した。
9種の生物変換を、最終容積5mLにて実施した。各生物変換物は、10mM基質、50mM D-アラニン、および0.4mMピリドキサールリン酸で構成した。生物触媒を、21g/L全細胞当量の最終濃度が得られるように無細胞抽出物として投入した。反応は、振盪インキュベーターにおいて、30℃で、15mLファルコンチューブ内で実施した。各生物変換物を定期的に試料採取し、HPLCによって分析した。注入の前に、各試料を100℃に5分間加熱し、14000rpmで2分間遠心分離を行って、0.2ミクロンのシリンジフィルターに通して濾過した。
大腸菌IlvEを用いて、L-2-アミノスベリン酸およびL-2-アミノピメリン酸生成物が、それぞれ2-オキソスベレートおよび2-オキソピメレートから生成されることが首尾良く実証された。生物変換の結果は、外部標準物質のHPLC保持時間を、各生物変換において形成された、観察された生成物ピークと相関づけることによって判定した。
装置:Agilent 1100;カラム:Phenomenex Kinetex 150 x 4.6mm、5 micro GraceSmart 150 x 4.6mm、5ミクロン;カラム温度:40℃ 流速:1mL/分;検出:UV 338nm;注入容積:14uL
移動相:系統A:5mMリン酸ナトリウム pH 7;系統B:アセトニトリル
勾配:
β-メルカプトエタノール(50μL)、o-フタルジアルデヒド(50mg)、400mMホウ酸カリウム緩衝液 pH10(4.5mL)およびメタノール(0.5mL)を含む5mL溶液を調製した。誘導体化は、誘導体化は、HPLCのオートサンプラー中にて以下の注入プログラムを用いて行った:2μLの試料、6μLの誘導体化混合物、6μLのホウ酸カリウム緩衝液 pH10を注入器ループ内で混合し、注入前に4分間保持した。
Boc-L-システイン(128mg)、o-フタルジアルデヒド(50mg)、400mMホウ酸カリウム緩衝液 pH10(4.5mL)およびメタノール(0.5mL)を含む5mL溶液を調製した。誘導体化は、HPLCのオートサンプラー中にて以下の注入プログラムを用いて行った:2μLの試料、6μLの誘導体化混合物、6μLのホウ酸カリウム緩衝液 pH10を注入器ループ内で混合し、注入前に4分間保持した。
10mM D-グルタミン酸;10mM DL-2-アミノスベリン酸;10mM DL-2-アミノピメリン酸;10mM L-2-アミノスベリン酸;50mM D-アラニン;50mM L-MSG
適切な触媒を、α-アミノスベリン酸の脱カルボキシル化のための候補物としてα-アミノ酸デカルボキシラーゼから、特にアスパラギン酸4-デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.11)、 グルタミン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.15)、リジンデカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.18)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.20)およびジアミノ酪酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.86)から選択した。
誘導後24時間の試料からのあらかじめ凍結した細胞ペレットを、1.5mgのリゾチームを添加した、0.1mMトリス、1mg/mlペプスタチンAおよび200mM PMSFプロテアーゼ阻害剤からなるビーズ溶解緩衝液に再懸濁した(5のOD600で1mL の培養物からの細胞ペレットの溶解のために161μLの混合物を使用すべきである)。酸で洗った212〜300μmのガラスビーズ(溶解緩衝液1mL当たり0.4g)を各試料に添加した。全速力でボルテックスする30秒のバースト、次いで氷上で30秒のインキュベーションを合計10分間反復することによって溶解を実施した。
装置:Agilent 1100;カラム:GraceSmart RP C18 150 x 4.6mm、5ミクロン;カラム温度:40℃。流速:1mL/分。検出:UV 338nm。注入容積:14uL。
移動相:系統A:5mMリン酸ナトリウム pH 7;系統B:アセトニトリル
勾配:
β-メルカプトエタノール(50μL)、o-フタルジアルデヒド(50mg)、400mMホウ酸カリウム緩衝液 pH10(4.5mL)およびメタノール(0.5mL)を含む5mL溶液を調製した。誘導体化は、HPLCのオートサンプラー中にて以下の注入プログラムを用いて行った:2μLの試料、6μLの誘導体化混合物、6μLのホウ酸カリウム緩衝液(pH10)を注入器ループ内で混合し、注入前に4分間保持した。
10mM 6-アミノヘキサン酸
10mM 7-アミノヘプタン酸
10mM DL-2-アミノスベリン酸
10mM DL-2-アミノピメリン酸
3,1.8.1 適切な触媒の選択
デカルボキシラーゼのファミリーの中で、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、特にピルビン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.1)、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.7)および分枝鎖2-オキソ酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.72)は、α-ケトスベリン酸の脱カルボキシル化のための最良の候補物として浮上した。
補酵素B [(7-メルカプトヘプタノイル)スレオニンリン酸]の合成のための経路は、古細菌における他の代謝経路の分析ならびに2Hおよび13C標識前駆体の最終生成物への組込みの質量分析に基づき、White [White RH(1989)Biosynthesis of the 7-mercaptoheptanoic acid subunit of component B [(7-mercaptoheptanoyl)threonine phosphate] of methanogenic bacteria,Biochemistry,28:860-865]によって主張された。この経路は、 仮定上の2-ケト酸デカルボキシラーゼによって媒介される2-ケトスベリン酸の7-オキソヘプタン酸(ピメリン酸セミアルデヒド)への非酸化的脱カルボキシル化段階を含む。次の段階では、7-メルカプトヘプタン酸が形成される。この生成物だけが形成される(C5およびC6等価物は形成されない)ので、これは、経路の上流の酵素の少なくとも1つがC8基質だけを受け入れ、C6およびC7基質は受け入れないことを示す。
WhiteとGrahamによって行われた研究は、古細菌(Archaebacteria)(メタノカルドコッカス・ジャナスキイのような)が2-ケトスベリン酸の7-オキソヘプタン酸への非酸化的脱カルボキシル化に関与する酵素を有する可能性があることを示した。補酵素B経路に関わる他の酵素は、M.ジャナスキイ[Bult CJ,White O,Olsen GJ,Zhou L,Fleischmann RD,Sutton GG,Blake JA,FitzGerald LM,Clayton RA,Gocayne JD,Kerlavage AR,Dougherty BA,Tomb JF,Adams MD,Reich CI,Overbeek R,Kirkness EF,Weinstock KG,Merrick JM,Glodek A,Scott JL,Geoghagen NS,Venter JC.(1996)Complete genome sequence of the methanogenicarchaeon,Methanococcus jannaschii.Science.273:1058-1073]およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)ΔH[Smith DR,Doucette-Stamm LA,Deloughery C,Lee H,Dubois J,Aldredge T,Bashirzadeh R,Blakely D,Cook R,Gilbert K,Harrison D,Hoang L,Keagle P,Lumm W,Pothier B,Qiu D,Spadafora R,Vicaire R,Wang Y,Wierzbowski J,Gibson R,Jiwani N,Caruso A,Bush D,Reeve JN,(1997)Complete genome sequence of Methanobacterium thermoautotrophicum deltaH:functional analysis and comparative genomics.J Bacteriol.179:7135-7155] のゲノムの分析によって同定された。ゲノムを標的遺伝子クラスターの存在に関して分析し、既存の酵素に相同性を示すタンパク質についてBLAST検索した。我々は、2-ケトスベリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を同定するために同様のアプローチをとった。
遺伝子クラスターの分析
細菌ゲノムは、特定の経路において役割を果たす酵素をコードする遺伝子がオペロンおよび/または遺伝子クラスターに局在する、高レベルの組織化を示し得る。補酵素B経路の他の酵素が同定されており、一部の古細菌ゲノムの配列が公表されているので、2-ケトスベリン酸デカルボキシラーゼを同定することを試みた。以下の表はこの経路に関わる遺伝子および酵素を示す。
M.ジャナスキイおよびM.サーモオートトロフィカム由来の補酵素B生合成遺伝子は、M.サーモオートトロフィカムにおける(R)-ホモクエン酸シンターゼ(MTH1630)およびホモクエン酸シンターゼ/デヒドラターゼラージサブユニット(MTH1631)をコードする遺伝子を除き、遺伝子クラスターに存在するとは思われなかった。上記に列挙した遺伝子のいずれかを含む仮説上のオペロンの分析は、公知のデカルボキシラーゼに相同性を有するいかなるタンパク質の存在も示さなかった。それゆえ、M.ジャナスキイにおける関連代謝経路中の類似の脱カルボキシル化に関して検索を行った。
M.ジャナスキイにおける他の代謝経路の分析は、類似の脱カルボキシル化が補酵素M経路に存在することを示した[Graupner M,Xu H and White RH.(2000)Identification of the gene encoding sulfopyruvate decarboxylase,an enzyme involved in biosynthesis of coenzyme M.J Bacteriol.182:4862-4867]。
3-スルホピルベートのスルホアセトアルデヒドへの非酸化的脱カルボキシル化は、2つのサブユニット、comD(SEQ ID 19)およびcomE(SEQ ID 20)を含むスルホピルビン酸デカルボキシラーゼ(EC.4.1.1.79)によって触媒される。補酵素Bおよび補酵素Mはどちらもメタン生成に関与し、脱カルボキシル化の下流の反応が類似するので、デカルボキシラーゼが共に進化して、互いに高い相同性を示す可能性がある。
M.ジャナスキイゲノムの分析は、アセト乳酸シンターゼと注釈される2つのタンパク質(MJ0277およびMJ0663)の存在を示し、これらは、補酵素B生合成に関与するこれまで同定されていなかった2-ケトスベリン酸非酸化的デカルボキシラーゼである可能性がある。この第2のヴァージョンのアセト乳酸シンターゼ(MJ0663)を見たところ有すると思われるのは、メタン生成菌種のみであり、例えば、メタノカルドコッカス・フェルベンス(Methanocaldococcus fervens)(NC_013156.1)(座位YP_003128272);メタノトリス・イグネウス(Methanotorris igneus)Kol 5(NC_015562.1)(座位YP_004483786)およびメタノカルドコッカス・インフェルヌス(Methanocaldococcus infernus)ME(NC_014122.1)(座位YP_003615749)はすべて、MJ0663に関する陽性率が75%を上回るタンパク質を有する。メタン非生成菌種でMJ0663に対する陽性率が50%を上回るものはない。他の菌種は、MJ0277、メタノカルドコッカス・フェルベンス(座位YP_003127480);メタノトリスコッカス・イグネウスKol 5(座位YP_004484320)およびメタノカルドコッカス・インフェルヌスME(座位YP_003615992)に対する相同性を有する第2の遺伝子を有し、この遺伝子はアセト乳酸シンターゼと注釈されている。この遺伝子は、他のメタン非生成生物におけるアセト乳酸シンターゼとの相同性を有する。
3.1.10.1 酵素遺伝子標的の選択
α-ケトピメリン酸のα-ケトスベリン酸への変換は、以前にメタン生成古細菌、例えばメタノカルドコッカス・ジャナスキイ、メタノコッカス・バンニエリ(Methanocaldococcus vannielii)、メタノカルドコッカス・マリパルディス(Methanocaldococcus maripaludis)、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム、メタノサルシナ・サーモフィラ等における補酵素Bの生合成の一部であると報告された(White,Arch.Biochem.Biophys.270:691-697(1989))。ロイシンおよびリジン生合成に関与する酵素に相同な、α-ケトグルタル酸からスベリン酸への複数回の鎖伸長に関与する酵素をコードする遺伝子がメタノカルドコッカス・ジャナスキイから同定され、それらの対応するタンパク質が特性づけられた(α-keto acid chain elongation reactions involved in the biosynthesis of coenzyme B(7-mercaptoheptanoyl threonine phosphate)in Howell et al.,Biochemistry 37:10108-10117(1998);Drevland et al.,J.Bacteriol.189:4391-4400(2007);Howell et al.,J.Bacteriol.182:5013-5016(2000);Drevland et al.,J.Biol.Chem.283:28888-28896(2008);and Jeyakanthan et al.,Biochemistry 49:2687-2696(2010))。
次に、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム由来の選択した遺伝子標的を、3.1.1.2章で詳述したように、inABLE技術を用いてIPTG誘導性pET21-aバックボーンにクローニングし、I9(pET21-a 中のM.サーモオートトロフィカムAksA(1)-MTH1630遺伝子)、I10(pET21-a中の M.サーモオートトロフィカム AksA(2)-MTH1481遺伝子)、I11(pET21-a中の M.サーモオートトロフィカムAksD(1)-MTH1386遺伝子)、I12(pET21-a 中のM.サーモオートトロフィカムAksD(2)-MTH1631遺伝子)、I13(pET21-a 中のM.サーモオートトロフィカムAksE(l)-MTH0829遺伝子)、I14(pET21-a中のM.サーモオートトロフィカムAksE(2)-MTH1387遺伝子)、I15(pET21-a中のM.サーモオートトロフィカムAksF(1)-MTH0184遺伝子)、およびI16(pET21-a中のM.サーモオートトロフィカムAksF(2)-MTH1388遺伝子)を作製した。
大腸菌における外因性メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカムAksA(1)-MTH1630、AksA(2)-MTH1481、AksD(1)-MTH1386、AksD(2)-MTH1631、AksE(1)-MTH0829、AksE(2)-MTH1387、AksF(1)-MTH0184およびAksF(1)-MTH0184鎖伸長遺伝子の発現を3.1.1.3章で述べたように実施した。簡単に述べると、エレクトロコンピテントBL21(DE3)細胞を10ng DNAで形質転換し、形質転換試料をLB-Amp-寒天に塗布した。37℃で一晩インキュベートした後、形質転換体を得た。単一クローンを各集合体から採取し、5mlのLB-Amp培地に出発培養物として接種した。37℃および250rpmで一晩インキュベートした後、培養物のOD600を測定し、2mLの培養物(約8×107)を使用して100mLのLB-Ampに接種し、これを500mLのバッフル付き振とうフラスコにおいて37℃および250rpmでインキュベートした。
2,6ジアミノピメレート(2,6 DAP)およびα-アミノピメレート(AAP)から選択される化合物を、2,6 DAPの6-アミノ-2-ヘプテン二酸(6A2HA)への還元的脱アミノ化またはAAPの2-ヘプテン二酸(2 HDA)への還元的脱アミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含む、化合物を変換する方法であって、ここで6A2HAまたは2 HDAが生成される、方法。
[本発明1002]
化合物が2,6 DAPである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
6A2HAを、6A2HAのAAPへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAAPが生成される、本発明1002の方法。
[本発明1004]
AAPを、AAPの2 HDAへの還元的脱アミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDAが生成される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
2 HDAを、2 HDAのピメリン酸(PA)へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
PAを、PAのピメリン酸セミアルデヒド(PAS)へのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
PASを、PASの7-アミノヘプタン酸(7 AHA)へのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
7 AHAを、7 AHAのエナントラクタム(ENTL)へのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
7 AHAを、7 AHAの7-アミノヘプタナール(7 AHT)へのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHTが生成される、本発明1007の方法。
[本発明1010]
7 AHTを、1,7-ジアミノヘプタン(1,7 DAH)を生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1009の方法。
[本発明1011]
2 HDAを、2-ヘプテン二酸-補酵素A(2 HDA-CoA)を生成するための2 HDAへの補酵素A(CoA)の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、本発明1004の方法。
[本発明1012]
2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのピメロイルCoA(PCoA)へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、本発明1011の方法。
[本発明1013]
PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1015の方法。
[本発明1018]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
AAPを、α-ケトピメレート(AKP)を生成するためのAAPへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAKPが生成される、本発明1004の方法。
[本発明1020]
AKPを、AKPのα-ヒドロキシピメレート(AHP)へのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHPが生成される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
AHPを、α-ヒドロキシピメレート(AHP-CoA)を生成するためのAHPへのCoAの転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHP-CoAが生成される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
AHP-CoAを、AHP-CoAの2 HDA-CoAへの脱水を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、本発明1021の方法。
[本発明1023]
2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、本発明1022の方法。
[本発明1024]
PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1026の方法。
[本発明1028]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1026の方法。
[本発明1029]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
AHPを、AHPの2 HDAへの脱水を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDAが生成される、本発明1020の方法。
[本発明1031]
2 HDAを、2 HDAのピメリン酸(PA)へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、本発明1030の方法。
[本発明1032]
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1033の方法。
[本発明1036]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
2 HDAを、2 HDA-CoAを生成するための2 HDAへのCoAの転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、本発明1030の方法。
[本発明1038]
2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、本発明1038の方法。
[本発明1040]
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1041の方法。
[本発明1043]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1041の方法。
[本発明1044]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1043の方法。
[本発明1045]
AKPを、AKPのα-ケトスベレート(AKS)へのα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAKSが生成される、本発明1019の方法。
[本発明1046]
AKSを、α-アミノスベレート(AAS)を生成するためのAKSへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAASが生成される、本発明1045の方法。
[本発明1047]
AASを、AASの7 AHAへのα-アミノ酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1046の方法。
[本発明1048]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1047の方法。
[本発明1049]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1047の方法。
[本発明1050]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1049の方法。
[本発明1051]
AKSを、AKSのPASへのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1045の方法。
[本発明1052]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1051の方法。
[本発明1053]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1052の方法。
[本発明1054]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1052の方法。
[本発明1055]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1054の方法。
[本発明1056]
PCoAを、PCoAのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1023の方法。
[本発明1057]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1056の方法。
[本発明1058]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1057の方法。
[本発明1059]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1057の方法。
[本発明1060]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1059の方法。
[本発明1061]
PCoAを、PCoAのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1038の方法。
[本発明1062]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1061の方法。
[本発明1063]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1062の方法。
[本発明1065]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1064の方法。
[本発明1066]
6A2HAおよび2 HDAから選択される化合物を、6A2HAのAAPへのエノエート還元または2 HDAのPAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでAAPまたはPAが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1067]
PCoAおよびピメロイル-[acp](PACP)から選択される化合物を、PCoAまたはPACPのPAへのチオエステラ-ゼ加水分解を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPAが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1068]
PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、本発明1067の方法。
[本発明1069]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、本発明1068の方法。
[本発明1070]
7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、本発明1069の方法。
[本発明1071]
7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、本発明1069の方法。
[本発明1072]
7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、本発明1071の方法。
[本発明1073]
AKPを、AKPのAHPへのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素と接触させる段階を含み、ここでAHPが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1074]
AKPがα-ケトアジペートまたはα-ケトグルタレートの鎖伸長によって生成される、本発明1073の方法。
[本発明1075]
AHPをPAまたはPCoAに変換する段階をさらに含む、本発明1073の方法。
[本発明1076]
α-ケト酸鎖の伸長によってAKPをAKSに変換する段階を含む、化合物を変換する方法。
[本発明1077]
AKPがα-ケトアジペートまたはα-ケトグルタレートの鎖伸長によって生成される、本発明1076の方法。
[本発明1078]
PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここで7 AHAが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1079]
PASが、2,6 DAP、AKG、PCoAまたはPACPからの変換によって得られる、本発明1078の方法。
[本発明1080]
PCoAおよびPACPから選択される化合物を、該化合物のPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPASが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1081]
PASを、PASの7-ヒドロキシヘプタン酸(7 HHA)へのアルコール脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここで7 HHAが生成される、化合物を変換する方法。
[本発明1082]
前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、精製された酵素である、本発明1001〜1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、細胞溶解物または部分精製された細胞溶解物中に存在する、本発明1001〜1081のいずれかの方法。
[本発明1084]
前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、該酵素を組換え発現する細胞中に存在する、本発明1001〜1081のいずれかの方法。
[本発明1085]
酵素がアンモニアリアーゼを含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1086]
アンモニアリアーゼが、EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼである、本発明1085の方法。
[本発明1087]
EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼが、EC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.9、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13、EC 4.3.1.23、またはEC 4.3.1.24を含む、本発明1086の方法。
[本発明1088]
酵素がエン酸レダクターゼを含む、本発明1003、1005、1012、1023、1031、1038、および1066のいずれかの方法。
[本発明1089]
エン酸レダクターゼがEC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼを含む、本発明1088の方法。
[本発明1090]
エン酸レダクターゼが以下のものである、本発明1088の方法:
(a)EC 1.3.1におけるものであって、EC 1.3.1.8;EC 1.3.1.9;EC 1.3.1.10、EC 1.3.1.31;EC 1.3.1.38;EC 1.3.1.39;EC 1.3.1.44;もしくはEC 1.3.1.62におけるピメロイル-CoAデヒドロゲナーゼ、例えばPimC/PimDもしくはThnJ/ThnKなどを含む;または
(b)EC 1.3、例えばEC 1.3.8.1;EC 1.3.99.3;EC 1.3.99.B10;もしくはシントロファス・アシディトロフィカス(Syntrophus aciditrophicus)2,3-ジデヒドロピメリル-CoAレダクターゼおよびそれらのホモログにおけるものである。
[本発明1091]
酵素がカルボン酸レダクターゼまたはNAD依存性非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、本発明1006、1014、1025、1032、1040、および1068のいずれかの方法。
[本発明1092]
カルボン酸レダクターゼが、EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼ、またはNAD依存性非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばスフィンゴモナス(Shingomonas)属種もしくはカプリアビダス(Cupriavidus)属種におけるThnGなどを含む、本発明1091の方法。
[本発明1093]
EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99.6を含み、NAD依存性非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼがスフィンゴモナスにおけるThnGである、本発明1092の方法。
[本発明1094]
酵素がω-トランスアミナーゼを含む、本発明1007、1015、1026、1033、1052、1057、1062、1069および1078のいずれかの方法。
[本発明1095]
ωトランスアミナーゼがEC 2.6.1におけるトランスアミナーゼを含む、本発明1094の方法。
[本発明1096]
EC 2.6.1におけるω-トランスアミナーゼが、EC 2.6.1.18;EC 2.6.1.19;EC 2.6.1.11;EC 2.6.1.13;EC 2.6.1.39;EC 2.6.1.48;EC 2.6.1.62を含む、本発明1095の方法。
[本発明1097]
酵素がチオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼまたはCoAトランスフェラーゼを含む、本発明1013、1024、1039、1056、1061、および1067のいずれかの方法。
[本発明1098]
チオエステラーゼがEC 3.1.2におけるチオエステラーゼを含む、本発明1097の方法。
[本発明1099]
EC 3.1.2におけるチオエステラーゼが以下のものを含む、本発明1098の方法:
EC 3.1.2.18;EC 3.1.2.19;もしくはEC 3.1.2.20由来のCoA-チオエステルに対して作用するチオエステラーゼ;
YciA、tesBもしくはAcot13の遺伝子産物;または
EC 3.1.2.14およびEC 3.1.2.21由来の[acp]-チオエステルに対して作用するチオエステラーゼ。
[本発明1100]
酸-チオールリガーゼがEC 6.2.1における酸-チオールリガーゼを含む、本発明1097の方法。
[本発明1101]
EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼが、EC 6.2.1.3;EC 6.2.1.5;EC 6.2.1.14;またはEC 6.2.1.23由来のCoAエステルに対して作用するCoAシンテターゼ、ならびにEC 6.2.1.14(BioWなど)およびEC 6.2.1.20におけるアシル-[acp]-シンテターゼを含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
CoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼを含む、本発明1097の方法。
[本発明1103]
EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3.12;EC 2.8.3.13またはEC 2.8.3.14またはThnHの遺伝子産物を含む、本発明1102の方法。
[本発明1104]
酵素がアミノ酸アミノトランスフェラーゼまたは脱アミノ基デヒドロゲナーゼを含む、本発明1010、1018、1019、1029、1036、1044、1046、1050、1060、1065および1072のいずれかの方法。
[本発明1105]
アミノ酸アミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼを含む、本発明1104の方法。
[本発明1106]
EC 2.6.1におけるアミノ酸アミノトランスフェラーゼが、EC 2.6.1.21;EC 2.6.1.39;EC 2.6.1.42;またはEC 2.6.1.67を含む、本発明1105の方法。
[本発明1107]
1つまたは複数の酵素がカルボニルレダクターゼを含む、本発明1020または1073の方法。
[本発明1108]
カルボニルレダクターゼが、EC.1.1.1.184、EC 1.1.1.79、EC 1.1.1.B3;EC 1.1.1.B4;またはEC 1.1.99.2.もしくはEC 1.1.99.6由来の2-ヒドロキシグルタリルデヒドロゲナーゼ(dehydogenase)/αケトグルタル酸(ketogluterate)レダクターゼを含む、本発明1107の方法。
[本発明1109]
酵素がα-ケト酸デカルボキシラーゼまたはアセト乳酸シンターゼを含む、本発明1047または1051の方法。
[本発明1110]
酵素が、脂肪-アシル-CoAレダクターゼまたは脂肪-アシル-[acp]レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、本発明1056、1061または1080の方法。
[本発明1111]
脂肪-アシル-CoAレダクターゼ、脂肪-アシル-[acp]レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1におけるレダクターゼである、本発明1110の方法。
[本発明1112]
EC 1.2.1における脂肪-アシル-CoAレダクターゼ脂肪-アシル-[acp]レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1.3;EC 1.2.1.4;EC 1.2.1.20;EC 1.2.1.22;EC 1.2.1.50;EC 1.2.1.57;EC 1.2.1.63;またはEC 1.2.1.76を含む、本発明1111の方法。
[本発明1113]
酵素がアルデヒドデヒドロゲナーゼ、カルボン酸レダクターゼまたは非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、本発明1009、1015、1028、1035、1043、1049、1055、1059、1064および1071のいずれかの方法。
[本発明1114]
アルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1を含み、カルボン酸レダクターゼまたは非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼ、またはThnGなどの非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、本発明1113の方法。
[本発明1115]
EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63を含み、カルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99.6を含み、かつ、非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼがスフィンゴモナス属種またはカプリアビダス属種由来のThnGを含む、本発明1114の方法。
[本発明1116]
酵素がCoAトランスフェラーゼまたは酸-チオールリガーゼを含む、本発明1011、1021および1037のいずれかの方法。
[本発明1117]
CoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼを含み、酸チオールリガーゼがEC 6.2.1を含む、本発明1116の方法。
[本発明1118]
EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3.12;EC 2.8.3.13もしくはEC 2.8.3.14またはThnHの遺伝子産物を含み、EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼがEC 6.2.1.3;EC 6.2.1.5;EC 6.2.1.14;およびEC 6.2.1.23を含む、本発明1117の方法。
[本発明1119]
酵素が、EC 3.5.2、例えば3.5.2.11などにおけるアミドヒドロラーゼである、本発明1008、1016、1027、1034、1042、1048、1053、1058、1063および1070のいずれかの方法。
[本発明1120]
酵素がヒドロリアーゼを含む、本発明1022または1030の方法。
[本発明1121]
ヒドロリアーゼがEC 4.2.1におけるヒドロリアーゼを含む、本発明1120の方法。
[本発明1122]
EC 4.2.1におけるヒドロリアーゼが、EC 4.2.1.2;EC 4.2.1.59;4.2.1.61;4.1.2.17または4.1.2.18を含む、本発明1121の方法。
[本発明1123]
α-ケト酸鎖伸長が、AksA、AksD、AksEおよびAksFを含む酵素のセットのうち1つまたは複数によって触媒される、本発明1045、1074、1076および1077のいずれかの方法。
[本発明1124]
AksAがEC 2.3.3におけるAksA酵素を含む、本発明1123の方法。
[本発明1125]
EC 2.3.3におけるAksA酵素が、EC 2.3.3.13または2.3.3.14を含む、本発明1124の方法。
[本発明1126]
AksDおよびAks Eがいずれも、EC 4.2.1.114におけるAksD/E酵素を含む、本発明1123の方法。
[本発明1127]
AksDがEC 4.2.1.114における酵素を含み、Aks EがEC 4.2.1.36における酵素を含む、本発明1123の方法。
[本発明1128]
AksFがEC 1.1.1におけるAksF酵素を含む、本発明1123の方法。
[本発明1129]
EC 1.1.1.におけるAksF酵素がEC 1.1.1.87を含む、本発明1128の方法。
[本発明1130]
α-ケト酸鎖伸長酵素の1つまたは複数がメタン生成細菌に由来する、本発明1045、1074、1076および1077のいずれかの方法。
[本発明1131]
酵素がアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼを含む、本発明1081の方法。
[本発明1132]
アルコールデヒドロゲナーゼがEC. 1.1.1.1、EC 1.1.1.2またはEC 1.1.1.21を含む、本発明1131の方法。
[本発明1133]
アルコールデヒドロゲナーゼが、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)由来のadhA、ザイモモナス・モビリス由来のadhB、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のブタノールデヒドロゲナーゼ、サッカロミセス(Saccharomyces)ADHIV、およびS.セレビシエ(S.cerevisiae)由来のADH6から選択される、本発明1131の方法。
[本発明1134]
PCoAまたはPACPがアセチル-CoAまたはベンゾイル-CoAから誘導される、本発明1067または1080の方法。
[本発明1135]
アセチル-CoAが、セルロース系原材料、糖類、グリセロール、または脂肪酸を含む再生可能な原材料から誘導される、本発明1134の方法。
[本発明1136]
アセチル-CoAがSynGas、メタンまたはメタノールから誘導される、本発明1134の方法。
[本発明1137]
ベンゾイル-CoAが多環式芳香族炭化水素から誘導される、本発明1134の方法。
[本発明1138]
2,6 DAPが、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを欠くリジン産生生物によって生産される、本発明1001、1002および1079のいずれかの方法。
[本発明1139]
2,6 DAPが再生可能な原材料から誘導される、本発明1001、1002、1079および1138のいずれかの方法。
[本発明1140]
再生可能な原材料が糖類を含む、本発明1139の方法。
[本発明1141]
生体誘導(bioderived)ナイロン-7、ナイロン-7,xまたはナイロン-x,7。
[本発明1142]
PASまたはAASから誘導される7 AHAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン-7。
[本発明1143]
PAおよび1,7 DHAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン-7,7であって、PAがPCoA、PACP、または2 HDAから誘導され、1,7 DHAが7 AHAから誘導される、ナイロン-7,7。
[本発明1144]
(i)本発明1002〜1007;
(ii)本発明1002〜1004および1011〜1015;
(iii)本発明1002〜1004および1019〜1026;
(iv)本発明1002〜1004、1019〜1020および1030〜1033;
(v)本発明1002〜1004、1019〜1020、1030および1037〜1041;
(vi)本発明1002〜1004、1019および1045〜1047;
(vii)本発明1002〜1004、1019、1045および1051〜1052;
(viii)本発明1002〜1004、1019〜1023および1056〜1057;
(ix)本発明1002〜1004、1019〜1020、1030、1037〜1038および1061〜1062;
(x)本発明1067〜1069;
(xi)本発明1073〜1075;
(xii)本発明1076〜1077;
(xiii)本発明1078〜1079;または
(xiv)本発明1080、
の方法段階を含む方法によって作製される7 AHAを重合させる工程によって生産されるナイロン-7。
[本発明1145]
1,7 DHAが以下の方法段階:
(a)本発明1002〜1007および1009〜1010;
(b)本発明1002〜1004、1011〜1015および1017〜1018;
(c)本発明1002〜1004、1019〜1026および1028〜1029;
(d)本発明1002〜1004、1019〜1020、1030〜1033および1035〜1036;
(e)本発明1002〜1004、1019〜1020、1037〜1041および1043〜1044;
(f)本発明1002〜1004、1019、1045〜1047および1049〜1050;
(g)本発明1002〜1004、1019、1045、1051〜1052および1054〜1055;
(h)本発明1002〜1004、1019〜1023および1056〜1060;
(i)本発明1002〜1004、1019〜1020、1037〜1038および1061〜1065;
(j)本発明1067〜1069および1071〜1072;
(k)本発明1073〜1075;
(l)本発明1076〜1077;
(m)本発明1078〜1079;または
(n)本発明1080、
を含む方法によって作製され、かつ
PAが以下の方法段階:
(o)本発明1002〜1005;
(p)本発明1002〜1004および1011〜1013;
(q)本発明1002〜1004および1019〜1024;
(r)本発明1002〜1004、1019〜1020および1030〜1031;
(s)本発明1002〜1004、1019〜1020、1030および1037〜1039;
(t)本発明1067;または
(u)本発明1073〜1075、
を含む方法によって作製される、1,7 DHAおよびPAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン7,7。
[本発明1146]
宿主細胞の実質的に純粋な培養物であって、そのうちの実質的な数が、7 AHA;PA;1,7 DAH;ENTL;および7 HHAから選択される1つまたは複数のポリマー単量体の生合成に関与する1つまたは複数の酵素をコードする1つまたは複数の外因性核酸を含み、酵素が、アンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼまたはCoAシンテターゼ(synthtase)、CoAトランスフェラーゼ、アシル-[acp]チオエステラーゼ、アシル-[acp]シンテターゼ、アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、脱アミノ基デヒドロゲナーゼ、カルボニルレダクターゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、アセト乳酸シンターゼ、α-アミノ酸デカルボキシラーゼ、脂肪-アシル-CoAレダクターゼ、アシル-[acp]-レダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミドヒドロラーゼ、ヒドロリアーゼ、およびα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素からなる群より選択される、宿主細胞の実質的に純粋な培養物。
[本発明1147]
細胞が原核細胞である、本発明1146の培養物。
[本発明1148]
原核細胞が、大腸菌(Escherichia coli)種などの大腸菌属(Escherichia);クロストリジウム・ルジュングダーリイ(Clostridium ljungdahlii)、クロストリジウム・オートエタノゲヌム(Clostridium autoethanogenum)またはクロストリジウム・クルイベリ(Clostridium kluyveri)種などのクロストリジウム属(Clostridia);コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)種などのコリネバクテリウム属(Corynebacteria);カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)またはカプリアビダス・メタリデュランス(Cupriavidus metallidurans)種などのカプリアビダス属(Cupriavidus);シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)またはシュードモナス・オレオボランス(Pseudomonas oleavorans)種などのシュードモナス属(Pseudomonas);デルフチア・アシドボランス(Delftia acidovorans)種などのデルフチア属(Delftia);枯草菌(Bacillus subtillis)種などのバシラス属(Bacillus);デルブリュッキ菌(Lactobacillus delbrueckii)などのラクトバシラス属(Lactobacillus);ならびに、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)種などのラクトコッカス属(Lactococcus)からなる群より選択される、本発明1147の培養物。
[本発明1149]
細胞が真核細胞である、本発明1146の培養物。
[本発明1150]
真核細胞が、以下のものからなる群より選択される、本発明1149の培養物:クロコウジカビ(Aspergillus niger)種などのアスペルギルス属(Aspergillus);サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)種などのサッカロミセス属(Saccharomyces);C.トロピカリス(C. tropicalis)、C.アルビカンス(C. albicans)、C.クロアカエ(C. cloacae)、C.グイリエルモンディイ(C. guillermondii)、C.インターメディア(C. intermedia)、C.マルトサ(C. maltosa)、C.パラプシロシス(C. parapsilosis)またはC.ゼイレノイデス(C. zeylenoides)種などのカンジダ属(Candida);ピキア・パストリス(Pichia pastoris)種などのピキア属(Pichia);ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)種などのヤロウイア属(Yarrowia);イサタケンキア・オリエンタリス(Issathenkia orientalis)種などのイサタケンキア属(Issatchenkia);デバリオミセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)種などのデバリオミセス属(Debaryomyces);アークスラ・アデニニボランス(Arxula adenoinivorans)種などのアークスラ属(Arxula);クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)種などのクルイベロミセス属(Kluyveromyces);エクソフィアラ属(Exophiala);ケカビ属(Mucor);トリコデルマ属(Trichoderma);クラドスポリウム属(Cladosporium);ファネロケーテ属(Phanerochaete);クラドフィアロフォラ属(Cladophialophora);ペシロミセス属(Paecilomyces);スケドスポリウム属(Scedosporium);およびオフィオストマ属(Ophiostoma)。
[本発明1151]
アンモニアリアーゼがEC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1152]
EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼが、EC 4.3.1.1;EC 4.3.1.2;EC 4.3.1.3;EC 4.3.1.9;EC 4.3.1.12;EC 4.3.1.13;EC 4.1.3.14;EC 4.1.3.23またはEC 4.3.1.24を含む、本発明1151の培養物。
[本発明1153]
エン酸レダクターゼがEC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1154]
エン酸レダクターゼが以下のものである、本発明1153の培養物:
(a)EC 1.3.1におけるものであり、EC 1.3.1.8;EC 1.3.1.9;EC 1.3.1.10、EC 1.3.1.31;EC 1.3.1.38;EC 1.3.1.39;EC 1.3.1.44;もしくはEC 1.3.1.62におけるピメロイル-CoAデヒドロゲナーゼ、例えばPimC/PimDもしくはThnJ/ThnKなどを含む;または
(b)EC 1.3、例えばEC 1.3.8.1;EC 1.3.99.3;EC 1.3.99.B10におけるもの、もしくはシントロファス・アシディトロフィカス(Syntrophus aciditrophicus)2,3-ジデヒドロピメリル-CoAレダクターゼおよびそれらのホモログ。
[本発明1155]
カルボン酸レダクターゼが、EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼ、または非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1156]
EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99.6を含み、非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼが、スフィンゴモナスにおけるスフィンゴモナス(Spingomonas)およびカプリアビダス属種に由来するThnG、またはそれらのホモログを含む、本発明1155の培養物。
[本発明1157]
ω-トランスアミナーゼがEC 2.6.1におけるトランスアミナーゼを含む、本発明1156の培養物。
[本発明1158]
EC 2.6.1におけるω-トランスアミナーゼが、EC 2.6.1.18;EC 2.6.1.19;EC 2.6.1.1;EC 2.6.1.13;EC 2.6.1.39;EC 2.6.1.48;EC 2.6.1.48;またはEC 2.6.1.62を含む、本発明1157の培養物。
[本発明1159]
チオエステラーゼがEC 3.1.2におけるチオエステラーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1160]
EC 3.1.2におけるチオエステラーゼが、EC 3.1.2.18;EC 3.1.2.19;もしくはEC 3.1.2.20由来のCoA-チオエステルに対して作用するチオエステラーゼ;YciA、tesBもしくはAcot13の遺伝子産物;またはEC 3.1.2.14およびEC 3.1.2.21由来の[acp]-チオエステルに対して作用するチオエステラーゼを含む、本発明1159の培養物。
[本発明1161]
酸-チオールリガーゼがEC 6.2.1における酸-チオールリガーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1162]
EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼが、EC 6.2.1.3;EC 6.2.1.14;またはEC 6.2.1.23由来のCoAエステルに対して作用するCoAシンテターゼ、ならびにEC 6.2.1.14(BioWなど)およびEC 6.2.1.20におけるアシル-[acp]-シンテターゼを含む、本発明1161の培養物。
[本発明1163]
CoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼまたはThnHの遺伝子産物およびそれらのホモログを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1164]
EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3.12;EC 2.8.3.13;EC 2.8.3.14;またはThnHの遺伝子産物を含む、本発明1163の培養物。
[本発明1165]
アミノ酸アミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1166]
EC 2.6.1におけるアミノ酸アミノトランスフェラーゼが、EC 2.6.1.21;EC 2.6.1.39;EC 2.6.1.42;またはEC 2.6.1.67を含む、本発明1165の培養物。
[本発明1167]
カルボニルレダクターゼが、EC.1.1.1.184;EC 1.1.1.79;EC 1.1.1.B3;EC 1.1.1.B4、またはEC 1.1.99.2.もしくはEC 1.1.99.6由来の2-ヒドロキシグルタリルデヒドロゲナーゼ/αケトグルタル酸(ketogluterate)レダクターゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1168]
脂肪-アシル-CoAレダクターゼ、脂肪-アシル-[acp]レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1におけるレダクターゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1169]
EC 1.2.1における脂肪-アシル-CoAレダクターゼ、脂肪-アシル-[acp]レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1.3;EC 1.2.1.4;EC 1.2.1.20;EC 1.2.1.22;EC 1.2.1.50;EC 1.2.1.57;EC 1.2.1.63;またはEC 1.2.1.76.を含む、本発明1168の培養物。
[本発明1170]
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1171]
EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1.3;EC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63を含む、本発明1170の培養物。
[本発明1172]
ヒドロリアーゼが、EC 4.2.1におけるヒドロリアーゼを含む、本発明1146の培養物。
[本発明1173]
EC 4.2.1におけるヒドロリアーゼが、EC 4.2.1.2;EC 4.2.1.59;EC 4.2.1.61;EC 4.1.2.17またはE.C. 4.1.2.18を含む、本発明1172の培養物。
[本発明1174]
α-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素が、AksA、AksD、AksEおよびAksF酵素を含む酵素のセットから選択される1つまたは複数の酵素を含む、本発明1146の培養物。
[本発明1175]
AksAがEC 2.3.3におけるAksA酵素を含む、本発明1174の培養物。
[本発明1176]
EC 2.3.3におけるAksA酵素が、EC 2.3.3.13またはE.C. 2.3.3.14を含む、本発明1175の培養物。
[本発明1177]
AksDおよびAks Eがいずれも、EC 4.2.1.114におけるAksD/E酵素を含む、本発明1174の培養物。
[本発明1178]
EC 4.2.1におけるAksD酵素がEC 4.2.1.36を含む、本発明1177の培養物。
[本発明1179]
AksFがEC 1.1.1におけるAksF酵素を含む、本発明1174の培養物。
[本発明1180]
EC 1.1.1.におけるAksF酵素がEC 1.1.1.87を含む、本発明1179の培養物。
[本発明1181]
アルコールデヒドロゲナーゼがEC. 1.1.1.1またはEC 1.1.1.2またはEC 1.1.1.21を含む、本発明1146の培養物。
[本発明1182]
アルコールデヒドロゲナーゼが、ザイモモナス・モビリス由来のadhA、ザイモモナス・モビリス由来のadhB、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のブタノールデヒドロゲナーゼ、サッカロミセスADHIV、およびS.セレビシエ由来のADH6から選択される、本発明1146の培養物。
[本発明1183]
7 AHA;PA;1,7 DAH;ENTL;および7 HHAから選択される1つまたは複数のポリマー単量体の生合成に関与する1つまたは複数の外因性核酸をコードする1つまたは複数の外因性核酸を含む単離された細胞であって、酵素が、アンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼまたはCoAシンテターゼ(synthtase)、CoAトランスフェラーゼ、アシル-[acp]チオエステラーゼ、アシル-[acp]シンテターゼ、アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、脱アミノ基デヒドロゲナーゼ、カルボニルレダクターゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、アセト乳酸シンターゼ、α-アミノ酸デカルボキシラーゼ、脂肪-アシル-CoAレダクターゼ、アシル-[acp]-レダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミドヒドロラーゼ、ヒドロリアーゼおよびα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素からなる群より選択される、単離された細胞。
他の目的および利点は、本明細書に記載する以下の詳細な説明の検討から当業者には明らかになるであろう。
Claims (183)
- 2,6ジアミノピメレート(2,6 DAP)およびα-アミノピメレート(AAP)から選択される化合物を、2,6 DAPの6-アミノ-2-ヘプテン二酸(6A2HA)への還元的脱アミノ化またはAAPの2-ヘプテン二酸(2 HDA)への還元的脱アミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含む、化合物を変換する方法であって、ここで6A2HAまたは2 HDAが生成される、方法。
- 化合物が2,6 DAPである、請求項1記載の方法。
- 6A2HAを、6A2HAのAAPへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAAPが生成される、請求項2記載の方法。
- AAPを、AAPの2 HDAへの還元的脱アミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDAが生成される、請求項3記載の方法。
- 2 HDAを、2 HDAのピメリン酸(PA)へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、請求項4記載の方法。
- PAを、PAのピメリン酸セミアルデヒド(PAS)へのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項5記載の方法。
- PASを、PASの7-アミノヘプタン酸(7 AHA)へのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項6記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAのエナントラクタム(ENTL)へのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項7記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAの7-アミノヘプタナール(7 AHT)へのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHTが生成される、請求項7記載の方法。
- 7 AHTを、1,7-ジアミノヘプタン(1,7 DAH)を生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項9記載の方法。
- 2 HDAを、2-ヘプテン二酸-補酵素A(2 HDA-CoA)を生成するための2 HDAへの補酵素A(CoA)の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、請求項4記載の方法。
- 2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのピメロイルCoA(PCoA)へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、請求項11記載の方法。
- PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、請求項12記載の方法。
- PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項13記載の方法。
- PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項14記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項15記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項15記載の方法。
- 7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項17記載の方法。
- AAPを、α-ケトピメレート(AKP)を生成するためのAAPへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAKPが生成される、請求項4記載の方法。
- AKPを、AKPのα-ヒドロキシピメレート(AHP)へのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHPが生成される、請求項19記載の方法。
- AHPを、α-ヒドロキシピメレート(AHP-CoA)を生成するためのAHPへのCoAの転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAHP-CoAが生成される、請求項20記載の方法。
- AHP-CoAを、AHP-CoAの2 HDA-CoAへの脱水を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、請求項21記載の方法。
- 2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、請求項22記載の方法。
- PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、請求項23記載の方法。
- PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項24記載の方法。
- PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項25記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項26記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項26記載の方法。
- 7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項28記載の方法。
- AHPを、AHPの2 HDAへの脱水を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDAが生成される、請求項20記載の方法。
- 2 HDAを、2 HDAのピメリン酸(PA)へのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、請求項30記載の方法。
- PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項31記載の方法。
- PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項32記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項33記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項33記載の方法。
- 7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項35記載の方法。
- 2 HDAを、2 HDA-CoAを生成するための2 HDAへのCoAの転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで2 HDA-CoAが生成される、請求項30記載の方法。
- 2 HDA-CoAを、2 HDA-CoAのPCoAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPCoAが生成される、請求項37記載の方法。
- PCoAを、PCoAのPAへのチオエステル加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPAが生成される、請求項38記載の方法。
- PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項39記載の方法。
- PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項40記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項41記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項41記載の方法。
- 7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項43記載の方法。
- AKPを、AKPのα-ケトスベレート(AKS)へのα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAKSが生成される、請求項19記載の方法。
- AKSを、α-アミノスベレート(AAS)を生成するためのAKSへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでAASが生成される、請求項45記載の方法。
- AASを、AASの7 AHAへのα-アミノ酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項46記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項47記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項47記載の方法。
- 7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項49記載の方法。
- AKSを、AKSのPASへのα-ケト酸脱カルボキシル化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項45記載の方法。
- PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項51記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項52記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項52記載の方法。
- 7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項54記載の方法。
- PCoAを、PCoAのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項23記載の方法。
- PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項56記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項57記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項57記載の方法。
- 7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項59記載の方法。
- PCoAを、PCoAのPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項38記載の方法。
- PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項61記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項62記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項62記載の方法。
- 7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項64記載の方法。
- 6A2HAおよび2 HDAから選択される化合物を、6A2HAのAAPへのエノエート還元または2 HDAのPAへのエノエート還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでAAPまたはPAが生成される、化合物を変換する方法。
- PCoAおよびピメロイル-[acp](PACP)から選択される化合物を、PCoAまたはPACPのPAへのチオエステラ-ゼ加水分解を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPAが生成される、化合物を変換する方法。
- PAを、PAのPASへのカルボン酸還元を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでPASが生成される、請求項67記載の方法。
- PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHAが生成される、請求項68記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAのENTLへのアミド加水分解を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここでENTLが生成される、請求項69記載の方法。
- 7 AHAを、7 AHAの7 AHTへのアルデヒド脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで7 AHTが生成される、請求項69記載の方法。
- 7 AHTを、1,7 DAHを生成するための7 AHTへのアミノ基の転移を触媒する酵素と接触させる段階をさらに含み、ここで1,7 DAHが生成される、請求項71記載の方法。
- AKPを、AKPのAHPへのケトン還元を触媒する1つまたは複数の酵素と接触させる段階を含み、ここでAHPが生成される、化合物を変換する方法。
- AKPがα-ケトアジペートまたはα-ケトグルタレートの鎖伸長によって生成される、請求項73記載の方法。
- AHPをPAまたはPCoAに変換する段階をさらに含む、請求項73記載の方法。
- α-ケト酸鎖の伸長によってAKPをAKSに変換する段階を含む、化合物を変換する方法。
- AKPがα-ケトアジペートまたはα-ケトグルタレートの鎖伸長によって生成される、請求項76記載の方法。
- PASを、PASの7 AHAへのセミアルデヒドアミノ化を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここで7 AHAが生成される、化合物を変換する方法。
- PASが、2,6 DAP、AKG、PCoAまたはPACPからの変換によって得られる、請求項78記載の方法。
- PCoAおよびPACPから選択される化合物を、該化合物のPASへの還元を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここでPASが生成される、化合物を変換する方法。
- PASを、PASの7-ヒドロキシヘプタン酸(7 HHA)へのアルコール脱水素化を触媒する酵素と接触させる段階を含み、ここで7 HHAが生成される、化合物を変換する方法。
- 前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、精製された酵素である、請求項1〜81のいずれか一項記載の方法。
- 前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、細胞溶解物または部分精製された細胞溶解物中に存在する、請求項1〜81のいずれか一項記載の方法。
- 前記酵素、または前記1つまたは複数の酵素が、該酵素を組換え発現する細胞中に存在する、請求項1〜81のいずれか一項記載の方法。
- 酵素がアンモニアリアーゼを含む、請求項1または2記載の方法。
- アンモニアリアーゼが、EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼである、請求項85記載の方法。
- EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼが、EC 4.3.1.1、EC 4.3.1.2、EC 4.3.1.3、EC 4.3.1.9、EC 4.3.1.12、EC 4.3.1.13、EC 4.3.1.23、またはEC 4.3.1.24を含む、請求項86記載の方法。
- 酵素がエン酸レダクターゼを含む、請求項3、5、12、23、31、38、および66のいずれか一項記載の方法。
- エン酸レダクターゼがEC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼを含む、請求項88記載の方法。
- エン酸レダクターゼが以下のものである、請求項88記載の方法:
(a)EC 1.3.1におけるものであって、EC 1.3.1.8;EC 1.3.1.9;EC 1.3.1.10、EC 1.3.1.31;EC 1.3.1.38;EC 1.3.1.39;EC 1.3.1.44;もしくはEC 1.3.1.62におけるピメロイル-CoAデヒドロゲナーゼ、例えばPimC/PimDもしくはThnJ/ThnKなどを含む;または
(b)EC 1.3、例えばEC 1.3.8.1;EC 1.3.99.3;EC 1.3.99.B10;もしくはシントロファス・アシディトロフィカス(Syntrophus aciditrophicus)2,3-ジデヒドロピメリル-CoAレダクターゼおよびそれらのホモログにおけるものである。 - 酵素がカルボン酸レダクターゼまたはNAD依存性非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項6、14、25、32、40、および68のいずれか一項記載の方法。
- カルボン酸レダクターゼが、EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼ、またはNAD依存性非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばスフィンゴモナス(Shingomonas)属種もしくはカプリアビダス(Cupriavidus)属種におけるThnGなどを含む、請求項91記載の方法。
- EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99.6を含み、NAD依存性非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼがスフィンゴモナスにおけるThnGである、請求項92記載の方法。
- 酵素がω-トランスアミナーゼを含む、請求項7、15、26、33、52、57、62、69および78のいずれか一項記載の方法。
- ωトランスアミナーゼがEC 2.6.1におけるトランスアミナーゼを含む、請求項94記載の方法。
- EC 2.6.1におけるω-トランスアミナーゼが、EC 2.6.1.18;EC 2.6.1.19;EC 2.6.1.11;EC 2.6.1.13;EC 2.6.1.39;EC 2.6.1.48;EC 2.6.1.62を含む、請求項95記載の方法。
- 酵素がチオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼまたはCoAトランスフェラーゼを含む、請求項13、24、39、56、61、および67のいずれか一項記載の方法。
- チオエステラーゼがEC 3.1.2におけるチオエステラーゼを含む、請求項97記載の方法。
- EC 3.1.2におけるチオエステラーゼが以下のものを含む、請求項98記載の方法:
EC 3.1.2.18;EC 3.1.2.19;もしくはEC 3.1.2.20由来のCoA-チオエステルに対して作用するチオエステラーゼ;
YciA、tesBもしくはAcot13の遺伝子産物;または
EC 3.1.2.14およびEC 3.1.2.21由来の[acp]-チオエステルに対して作用するチオエステラーゼ。 - 酸-チオールリガーゼがEC 6.2.1における酸-チオールリガーゼを含む、請求項97記載の方法。
- EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼが、EC 6.2.1.3;EC 6.2.1.5;EC 6.2.1.14;またはEC 6.2.1.23由来のCoAエステルに対して作用するCoAシンテターゼ、ならびにEC 6.2.1.14(BioWなど)およびEC 6.2.1.20におけるアシル-[acp]-シンテターゼを含む、請求項100記載の方法。
- CoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼを含む、請求項97記載の方法。
- EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3.12;EC 2.8.3.13またはEC 2.8.3.14またはThnHの遺伝子産物を含む、請求項102記載の方法。
- 酵素がアミノ酸アミノトランスフェラーゼまたは脱アミノ基デヒドロゲナーゼを含む、請求項10、18、19、29、36、44、46、50、60、65および72のいずれか一項記載の方法。
- アミノ酸アミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼを含む、請求項104記載の方法。
- EC 2.6.1におけるアミノ酸アミノトランスフェラーゼが、EC 2.6.1.21;EC 2.6.1.39;EC 2.6.1.42;またはEC 2.6.1.67を含む、請求項105記載の方法。
- 1つまたは複数の酵素がカルボニルレダクターゼを含む、請求項20または73記載の方法。
- カルボニルレダクターゼが、EC.1.1.1.184、EC 1.1.1.79、EC 1.1.1.B3;EC 1.1.1.B4;またはEC 1.1.99.2.もしくはEC 1.1.99.6由来の2-ヒドロキシグルタリルデヒドロゲナーゼ(dehydogenase)/αケトグルタル酸(ketogluterate)レダクターゼを含む、請求項107記載の方法。
- 酵素がα-ケト酸デカルボキシラーゼまたはアセト乳酸シンターゼを含む、請求項47または51記載の方法。
- 酵素が、脂肪-アシル-CoAレダクターゼまたは脂肪-アシル-[acp]レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項56、61または80記載の方法。
- 脂肪-アシル-CoAレダクターゼ、脂肪-アシル-[acp]レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1におけるレダクターゼである、請求項110記載の方法。
- EC 1.2.1における脂肪-アシル-CoAレダクターゼ脂肪-アシル-[acp]レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1.3;EC 1.2.1.4;EC 1.2.1.20;EC 1.2.1.22;EC 1.2.1.50;EC 1.2.1.57;EC 1.2.1.63;またはEC 1.2.1.76を含む、請求項111記載の方法。
- 酵素がアルデヒドデヒドロゲナーゼ、カルボン酸レダクターゼまたは非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項9、15、28、35、43、49、55、59、64および71のいずれか一項記載の方法。
- アルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1を含み、カルボン酸レダクターゼまたは非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼ、またはThnGなどの非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項113記載の方法。
- EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1.3、EC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63を含み、カルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99.6を含み、かつ、非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼがスフィンゴモナス属種またはカプリアビダス属種由来のThnGを含む、請求項114記載の方法。
- 酵素がCoAトランスフェラーゼまたは酸-チオールリガーゼを含む、請求項11、21および37のいずれか一項記載の方法。
- CoAトランスフェラーゼがEC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼを含み、酸チオールリガーゼがEC 6.2.1を含む、請求項116記載の方法。
- EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3.12;EC 2.8.3.13もしくはEC 2.8.3.14またはThnHの遺伝子産物を含み、EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼがEC 6.2.1.3;EC 6.2.1.5;EC 6.2.1.14;およびEC 6.2.1.23を含む、請求項117記載の方法。
- 酵素が、EC 3.5.2、例えば3.5.2.11などにおけるアミドヒドロラーゼである、請求項8、16、27、34、42、48、53、58、63および70のいずれか一項記載の方法。
- 酵素がヒドロリアーゼを含む、請求項22または30記載の方法。
- ヒドロリアーゼがEC 4.2.1におけるヒドロリアーゼを含む、請求項120記載の方法。
- EC 4.2.1におけるヒドロリアーゼが、EC 4.2.1.2;EC 4.2.1.59;4.2.1.61;4.1.2.17または4.1.2.18を含む、請求項121記載の方法。
- α-ケト酸鎖伸長が、AksA、AksD、AksEおよびAksFを含む酵素のセットのうち1つまたは複数によって触媒される、請求項45、74、76および77のいずれか一項記載の方法。
- AksAがEC 2.3.3におけるAksA酵素を含む、請求項123記載の方法。
- EC 2.3.3におけるAksA酵素が、EC 2.3.3.13または2.3.3.14を含む、請求項124記載の方法。
- AksDおよびAks Eがいずれも、EC 4.2.1.114におけるAksD/E酵素を含む、請求項123記載の方法。
- AksDがEC 4.2.1.114における酵素を含み、Aks EがEC 4.2.1.36における酵素を含む、請求項123記載の方法。
- AksFがEC 1.1.1におけるAksF酵素を含む、請求項123記載の方法。
- EC 1.1.1.におけるAksF酵素がEC 1.1.1.87を含む、請求項128記載の方法。
- α-ケト酸鎖伸長酵素の1つまたは複数がメタン生成細菌に由来する、請求項45、74、76および77のいずれか一項記載の方法。
- 酵素がアルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドレダクターゼを含む、請求項81記載の方法。
- アルコールデヒドロゲナーゼがEC. 1.1.1.1、EC 1.1.1.2またはEC 1.1.1.21を含む、請求項131記載の方法。
- アルコールデヒドロゲナーゼが、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)由来のadhA、ザイモモナス・モビリス由来のadhB、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のブタノールデヒドロゲナーゼ、サッカロミセス(Saccharomyces)ADHIV、およびS.セレビシエ(S.cerevisiae)由来のADH6から選択される、請求項131記載の方法。
- PCoAまたはPACPがアセチル-CoAまたはベンゾイル-CoAから誘導される、請求項67または80記載の方法。
- アセチル-CoAが、セルロース系原材料、糖類、グリセロール、または脂肪酸を含む再生可能な原材料から誘導される、請求項134記載の方法。
- アセチル-CoAがSynGas、メタンまたはメタノールから誘導される、請求項134記載の方法。
- ベンゾイル-CoAが多環式芳香族炭化水素から誘導される、請求項134記載の方法。
- 2,6 DAPが、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを欠くリジン産生生物によって生産される、請求項1、2および79のいずれか一項記載の方法。
- 2,6 DAPが再生可能な原材料から誘導される、請求項1、2、79および138のいずれか一項記載の方法。
- 再生可能な原材料が糖類を含む、請求項139記載の方法。
- 生体誘導(bioderived)ナイロン-7、ナイロン-7,xまたはナイロン-x,7。
- PASまたはAASから誘導される7 AHAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン-7。
- PAおよび1,7 DHAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン-7,7であって、PAがPCoA、PACP、または2 HDAから誘導され、1,7 DHAが7 AHAから誘導される、ナイロン-7,7。
- (i)請求項2〜7;
(ii)請求項2〜4および11〜15;
(iii)請求項2〜4および19〜26;
(iv)請求項2〜4、19〜20および30〜33;
(v)請求項2〜4、19〜20、30および37〜41;
(vi)請求項2〜4、19および45〜47;
(vii)請求項2〜4、19、45および51〜52;
(viii)請求項2〜4、19〜23および56〜57;
(ix)請求項2〜4、19〜20、30、37〜38および61〜62;
(x)請求項67〜69;
(xi)請求項73〜75;
(xii)請求項76〜77;
(xiii)請求項78〜79;または
(xiv)請求項80、
の方法段階を含む方法によって作製される7 AHAを重合させる工程によって生産されるナイロン-7。 - 1,7 DHAが以下の方法段階:
(a)請求項2〜7および9〜10;
(b)請求項2〜4、11〜15および17〜18;
(c)請求項2〜4、19〜26および28〜29;
(d)請求項2〜4、19〜20、30〜33および35〜36;
(e)請求項2〜4、19〜20、37〜41および43〜44;
(f)請求項2〜4、19、45〜47および49〜50;
(g)請求項2〜4、19、45、51〜52および54〜55;
(h)請求項2〜4、19〜23および56〜60;
(i)請求項2〜4、19〜20、37〜38および61〜65;
(j)請求項67〜69および71〜72;
(k)請求項73〜75;
(l)請求項76〜77;
(m)請求項78〜79;または
(n)請求項80、
を含む方法によって作製され、かつ
PAが以下の方法段階:
(o)請求項2〜5;
(p)請求項2〜4および11〜13;
(q)請求項2〜4および19〜24;
(r)請求項2〜4、19〜20および30〜31;
(s)請求項2〜4、19〜20、30および37〜39;
(t)請求項67;または
(u)請求項73〜75、
を含む方法によって作製される、1,7 DHAおよびPAを重合させる段階を含む工程によって生産されるナイロン7,7。 - 宿主細胞の実質的に純粋な培養物であって、そのうちの実質的な数が、7 AHA;PA;1,7 DAH;ENTL;および7 HHAから選択される1つまたは複数のポリマー単量体の生合成に関与する1つまたは複数の酵素をコードする1つまたは複数の外因性核酸を含み、酵素が、アンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼまたはCoAシンテターゼ(synthtase)、CoAトランスフェラーゼ、アシル-[acp]チオエステラーゼ、アシル-[acp]シンテターゼ、アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、脱アミノ基デヒドロゲナーゼ、カルボニルレダクターゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、アセト乳酸シンターゼ、α-アミノ酸デカルボキシラーゼ、脂肪-アシル-CoAレダクターゼ、アシル-[acp]-レダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミドヒドロラーゼ、ヒドロリアーゼ、およびα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素からなる群より選択される、宿主細胞の実質的に純粋な培養物。
- 細胞が原核細胞である、請求項146記載の培養物。
- 原核細胞が、大腸菌(Escherichia coli)種などの大腸菌属(Escherichia);クロストリジウム・ルジュングダーリイ(Clostridium ljungdahlii)、クロストリジウム・オートエタノゲヌム(Clostridium autoethanogenum)またはクロストリジウム・クルイベリ(Clostridium kluyveri)種などのクロストリジウム属(Clostridia);コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)種などのコリネバクテリウム属(Corynebacteria);カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)またはカプリアビダス・メタリデュランス(Cupriavidus metallidurans)種などのカプリアビダス属(Cupriavidus);シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)またはシュードモナス・オレオボランス(Pseudomonas oleavorans)種などのシュードモナス属(Pseudomonas);デルフチア・アシドボランス(Delftia acidovorans)種などのデルフチア属(Delftia);枯草菌(Bacillus subtillis)種などのバシラス属(Bacillus);デルブリュッキ菌(Lactobacillus delbrueckii)などのラクトバシラス属(Lactobacillus);ならびに、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)種などのラクトコッカス属(Lactococcus)からなる群より選択される、請求項147記載の培養物。
- 細胞が真核細胞である、請求項146記載の培養物。
- 真核細胞が、以下のものからなる群より選択される、請求項149記載の培養物:クロコウジカビ(Aspergillus niger)種などのアスペルギルス属(Aspergillus);サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)種などのサッカロミセス属(Saccharomyces);C.トロピカリス(C. tropicalis)、C.アルビカンス(C. albicans)、C.クロアカエ(C. cloacae)、C.グイリエルモンディイ(C. guillermondii)、C.インターメディア(C. intermedia)、C.マルトサ(C. maltosa)、C.パラプシロシス(C. parapsilosis)またはC.ゼイレノイデス(C. zeylenoides)種などのカンジダ属(Candida);ピキア・パストリス(Pichia pastoris)種などのピキア属(Pichia);ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)種などのヤロウイア属(Yarrowia);イサタケンキア・オリエンタリス(Issathenkia orientalis)種などのイサタケンキア属(Issatchenkia);デバリオミセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)種などのデバリオミセス属(Debaryomyces);アークスラ・アデニニボランス(Arxula adenoinivorans)種などのアークスラ属(Arxula);クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)種などのクルイベロミセス属(Kluyveromyces);エクソフィアラ属(Exophiala);ケカビ属(Mucor);トリコデルマ属(Trichoderma);クラドスポリウム属(Cladosporium);ファネロケーテ属(Phanerochaete);クラドフィアロフォラ属(Cladophialophora);ペシロミセス属(Paecilomyces);スケドスポリウム属(Scedosporium);およびオフィオストマ属(Ophiostoma)。
- アンモニアリアーゼがEC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼを含む、請求項146記載の培養物。
- EC 4.3.1におけるアンモニアリアーゼが、EC 4.3.1.1;EC 4.3.1.2;EC 4.3.1.3;EC 4.3.1.9;EC 4.3.1.12;EC 4.3.1.13;EC 4.1.3.14;EC 4.1.3.23またはEC 4.3.1.24を含む、請求項151記載の培養物。
- エン酸レダクターゼがEC 1.3.1におけるエン酸レダクターゼを含む、請求項146記載の培養物。
- エン酸レダクターゼが以下のものである、請求項153記載の培養物:
(a)EC 1.3.1におけるものであり、EC 1.3.1.8;EC 1.3.1.9;EC 1.3.1.10、EC 1.3.1.31;EC 1.3.1.38;EC 1.3.1.39;EC 1.3.1.44;もしくはEC 1.3.1.62におけるピメロイル-CoAデヒドロゲナーゼ、例えばPimC/PimDもしくはThnJ/ThnKなどを含む;または
(b)EC 1.3、例えばEC 1.3.8.1;EC 1.3.99.3;EC 1.3.99.B10におけるもの、もしくはシントロファス・アシディトロフィカス(Syntrophus aciditrophicus)2,3-ジデヒドロピメリル-CoAレダクターゼおよびそれらのホモログ。 - カルボン酸レダクターゼが、EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼ、または非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項146記載の培養物。
- EC 1.2.99におけるカルボン酸レダクターゼがEC 1.2.99.6を含み、非アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼが、スフィンゴモナスにおけるスフィンゴモナス(Spingomonas)およびカプリアビダス属種に由来するThnG、またはそれらのホモログを含む、請求項155記載の培養物。
- ω-トランスアミナーゼがEC 2.6.1におけるトランスアミナーゼを含む、請求項156記載の培養物。
- EC 2.6.1におけるω-トランスアミナーゼが、EC 2.6.1.18;EC 2.6.1.19;EC 2.6.1.1;EC 2.6.1.13;EC 2.6.1.39;EC 2.6.1.48;EC 2.6.1.48;またはEC 2.6.1.62を含む、請求項157記載の培養物。
- チオエステラーゼがEC 3.1.2におけるチオエステラーゼを含む、請求項146記載の培養物。
- EC 3.1.2におけるチオエステラーゼが、EC 3.1.2.18;EC 3.1.2.19;もしくはEC 3.1.2.20由来のCoA-チオエステルに対して作用するチオエステラーゼ;YciA、tesBもしくはAcot13の遺伝子産物;またはEC 3.1.2.14およびEC 3.1.2.21由来の[acp]-チオエステルに対して作用するチオエステラーゼを含む、請求項159記載の培養物。
- 酸-チオールリガーゼがEC 6.2.1における酸-チオールリガーゼを含む、請求項146記載の培養物。
- EC 6.2.1における酸-チオールリガーゼが、EC 6.2.1.3;EC 6.2.1.14;またはEC 6.2.1.23由来のCoAエステルに対して作用するCoAシンテターゼ、ならびにEC 6.2.1.14(BioWなど)およびEC 6.2.1.20におけるアシル-[acp]-シンテターゼを含む、請求項161記載の培養物。
- CoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼまたはThnHの遺伝子産物およびそれらのホモログを含む、請求項146記載の培養物。
- EC 2.8.3におけるCoAトランスフェラーゼが、EC 2.8.3.12;EC 2.8.3.13;EC 2.8.3.14;またはThnHの遺伝子産物を含む、請求項163記載の培養物。
- アミノ酸アミノトランスフェラーゼがEC 2.6.1におけるアミノトランスフェラーゼを含む、請求項146記載の培養物。
- EC 2.6.1におけるアミノ酸アミノトランスフェラーゼが、EC 2.6.1.21;EC 2.6.1.39;EC 2.6.1.42;またはEC 2.6.1.67を含む、請求項165記載の培養物。
- カルボニルレダクターゼが、EC.1.1.1.184;EC 1.1.1.79;EC 1.1.1.B3;EC 1.1.1.B4、またはEC 1.1.99.2.もしくはEC 1.1.99.6由来の2-ヒドロキシグルタリルデヒドロゲナーゼ/αケトグルタル酸(ketogluterate)レダクターゼを含む、請求項146記載の培養物。
- 脂肪-アシル-CoAレダクターゼ、脂肪-アシル-[acp]レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1におけるレダクターゼを含む、請求項146記載の培養物。
- EC 1.2.1における脂肪-アシル-CoAレダクターゼ、脂肪-アシル-[acp]レダクターゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1.3;EC 1.2.1.4;EC 1.2.1.20;EC 1.2.1.22;EC 1.2.1.50;EC 1.2.1.57;EC 1.2.1.63;またはEC 1.2.1.76.を含む、請求項168記載の培養物。
- アルデヒドデヒドロゲナーゼが、EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む、請求項146記載の培養物。
- EC 1.2.1におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼがEC 1.2.1.3;EC 1.2.1.4またはEC 1.2.1.63を含む、請求項170記載の培養物。
- ヒドロリアーゼが、EC 4.2.1におけるヒドロリアーゼを含む、請求項146記載の培養物。
- EC 4.2.1におけるヒドロリアーゼが、EC 4.2.1.2;EC 4.2.1.59;EC 4.2.1.61;EC 4.1.2.17またはE.C. 4.1.2.18を含む、請求項172記載の培養物。
- α-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素が、AksA、AksD、AksEおよびAksF酵素を含む酵素のセットから選択される1つまたは複数の酵素を含む、請求項146記載の培養物。
- AksAがEC 2.3.3におけるAksA酵素を含む、請求項174記載の培養物。
- EC 2.3.3におけるAksA酵素が、EC 2.3.3.13またはE.C. 2.3.3.14を含む、請求項175記載の培養物。
- AksDおよびAks Eがいずれも、EC 4.2.1.114におけるAksD/E酵素を含む、請求項174記載の培養物。
- EC 4.2.1におけるAksD酵素がEC 4.2.1.36を含む、請求項177記載の培養物。
- AksFがEC 1.1.1におけるAksF酵素を含む、請求項174記載の培養物。
- EC 1.1.1.におけるAksF酵素がEC 1.1.1.87を含む、請求項179記載の培養物。
- アルコールデヒドロゲナーゼがEC. 1.1.1.1またはEC 1.1.1.2またはEC 1.1.1.21を含む、請求項146記載の培養物。
- アルコールデヒドロゲナーゼが、ザイモモナス・モビリス由来のadhA、ザイモモナス・モビリス由来のadhB、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のブタノールデヒドロゲナーゼ、サッカロミセスADHIV、およびS.セレビシエ由来のADH6から選択される、請求項146記載の培養物。
- 7 AHA;PA;1,7 DAH;ENTL;および7 HHAから選択される1つまたは複数のポリマー単量体の生合成に関与する1つまたは複数の外因性核酸をコードする1つまたは複数の外因性核酸を含む単離された細胞であって、酵素が、アンモニアリアーゼ、エン酸レダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、ω-トランスアミナーゼ、チオエステラーゼ、酸-チオールリガーゼまたはCoAシンテターゼ(synthtase)、CoAトランスフェラーゼ、アシル-[acp]チオエステラーゼ、アシル-[acp]シンテターゼ、アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、脱アミノ基デヒドロゲナーゼ、カルボニルレダクターゼ、α-ケト酸デカルボキシラーゼ、アセト乳酸シンターゼ、α-アミノ酸デカルボキシラーゼ、脂肪-アシル-CoAレダクターゼ、アシル-[acp]-レダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミドヒドロラーゼ、ヒドロリアーゼおよびα-ケト酸鎖伸長を触媒する酵素からなる群より選択される、単離された細胞。
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161578289P | 2011-12-21 | 2011-12-21 | |
US201161578272P | 2011-12-21 | 2011-12-21 | |
US201161578265P | 2011-12-21 | 2011-12-21 | |
US61/578,272 | 2011-12-21 | ||
US61/578,265 | 2011-12-21 | ||
US61/578,289 | 2011-12-21 | ||
USPCT/US2012/044984 | 2012-06-29 | ||
PCT/US2012/044984 WO2013003744A2 (en) | 2011-06-30 | 2012-06-29 | Bioconversion process for producing nylon-7, nylon-7,7 and polyesters |
PCT/US2012/071472 WO2013096898A2 (en) | 2011-12-21 | 2012-12-21 | Bioconversion process for producing nylon-7, nylon-7,7 and polyesters |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017034360A Division JP2017131229A (ja) | 2011-12-21 | 2017-02-27 | ナイロン−7、ナイロン−7,7、およびポリエステルを生産するための生物変換方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015500663A true JP2015500663A (ja) | 2015-01-08 |
JP2015500663A5 JP2015500663A5 (ja) | 2016-02-12 |
Family
ID=48669717
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014548982A Pending JP2015500663A (ja) | 2011-12-21 | 2012-12-21 | ナイロン−7、ナイロン−7,7、およびポリエステルを生産するための生物変換方法 |
JP2017034360A Pending JP2017131229A (ja) | 2011-12-21 | 2017-02-27 | ナイロン−7、ナイロン−7,7、およびポリエステルを生産するための生物変換方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017034360A Pending JP2017131229A (ja) | 2011-12-21 | 2017-02-27 | ナイロン−7、ナイロン−7,7、およびポリエステルを生産するための生物変換方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2794897A2 (ja) |
JP (2) | JP2015500663A (ja) |
CN (1) | CN104126012A (ja) |
BR (1) | BR112014015077A2 (ja) |
WO (1) | WO2013096898A2 (ja) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103732569B (zh) | 2011-06-17 | 2016-06-29 | 英威达技术有限责任公司 | 使用水解酶来增加废物流中的单体含量 |
WO2013003744A2 (en) * | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Invista Techonologies S.A R.L | Bioconversion process for producing nylon-7, nylon-7,7 and polyesters |
US9102958B2 (en) | 2011-12-16 | 2015-08-11 | Invista North America S.á.r.l. | Methods of producing 6-carbon chemicals via CoA-dependent carbon chain elongation associated with carbon storage |
US9102960B2 (en) | 2011-12-16 | 2015-08-11 | Invista North America S.á.r.l. | Methods of producing 6-carbon chemicals via CoA-dependent carbon chain elongation associated with carbon storage |
EP2931907A2 (en) | 2012-12-14 | 2015-10-21 | Invista Technologies S.A R.L. | METHODS OF PRODUCING 7-CARBON CHEMICALS VIA CoA-DEPENDENT CARBON CHAIN ELONGATION ASSOCIATED WITH CARBON STORAGE |
CN105026570A (zh) | 2012-12-31 | 2015-11-04 | 英威达技术有限责任公司 | 通过氧化裂解从长链脂肪酸生产7-碳化学物的方法 |
WO2014105788A2 (en) * | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Invista North America S.A.R.L. | Methods of producing 7-carbon chemicals via carbon chain elongation associated with cyclohexane carboxylate synthesis |
WO2014105794A2 (en) * | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Invista North America S.A.R.L. | Methods of producing 7-carbon chemicals via methyl-ester shielded carbon chain elongation |
EP2938730A2 (en) | 2012-12-31 | 2015-11-04 | Invista Technologies S.A R.L. | Methods of producing 6-carbon chemicals via methyl-ester shielded carbon chain elongation |
CN105026569A (zh) | 2012-12-31 | 2015-11-04 | 英威达技术有限责任公司 | 通过丙酮酸和琥珀酸半醛羟醛缩合生产7-碳化学物的方法 |
WO2014105796A2 (en) * | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Invista North America S.A.R.L. | Methods of producing 7-carbon chemicals via aromatic compounds |
CN105189764A (zh) | 2012-12-31 | 2015-12-23 | 英威达技术有限责任公司 | 通过与辅酶b合成相关的c1碳链延伸生产7-碳化学物的方法 |
WO2015176026A1 (en) | 2014-05-15 | 2015-11-19 | Invista North America S.á.r.l. | Methods of producing 6-carbon chemicals using 2,6-diaminopimelate as precursor to 2-aminopimelate |
US9957535B2 (en) | 2014-06-16 | 2018-05-01 | Invista North America S.A.R.L. | Methods, reagents and cells for biosynthesizing compounds |
EP3155112A1 (en) | 2014-06-16 | 2017-04-19 | Invista Technologies S.à.r.l. | Process for producing glutarate and glutaric acid methyl ester |
BR112016029394A2 (pt) | 2014-06-16 | 2017-10-17 | Invista Tech Sarl | métodos, reagentes e células para biossintetizar composto |
CN106795537A (zh) | 2014-06-16 | 2017-05-31 | 英威达技术有限责任公司 | 用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞 |
US20160145657A1 (en) * | 2014-11-26 | 2016-05-26 | Invista North America S.á.r.l. | Methods and Materials for Producing 7-Carbon Chemicals via a C9 Route |
CN108998430B (zh) * | 2018-06-29 | 2020-11-13 | 浙江工业大学 | 一种界面自组装羰基还原酶及在(r)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯合成中的应用 |
CN116790698B (zh) * | 2023-06-21 | 2024-06-18 | 南京大学 | 基于氧化脱羧酶的硫醛合成方法及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014525741A (ja) * | 2011-06-30 | 2014-10-02 | インビスタ テクノロジーズ エス.アー.エール.エル. | ナイロン−7、ナイロン−7,7、およびポリエステルを生産するための生物変換方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3719561A (en) * | 1966-08-26 | 1973-03-06 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for producing diaminopimelic acid |
FR2921364B1 (fr) * | 2007-09-20 | 2009-11-06 | Arkema France | Procede de coproduction de 7-oxoheptanoate de methyle et d'acide undecylenique a partir d'acide ricinoleique |
BRPI0909839A2 (pt) * | 2008-03-28 | 2017-06-13 | Univ California | produção de ácidos dicarboxílicos usando policetídeo sintases |
EP2366026A2 (en) * | 2008-12-12 | 2011-09-21 | Celexion, Llc | Biological synthesis of difunctional alkanes from alpha ketoacids |
CN102348805A (zh) * | 2009-03-11 | 2012-02-08 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 己二酸的制备 |
WO2011031147A1 (en) * | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Dsm Ip Assets B.V. | Preparation of a compound comprising an amine group from an alpha-keto acid |
CN102575270A (zh) * | 2009-09-11 | 2012-07-11 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | α-酮庚二酸的制备 |
WO2012031910A2 (en) * | 2010-09-10 | 2012-03-15 | Dsm Ip Assets B.V. | Method for preparing alpha-ketopimelic acid by c1-elongation |
-
2012
- 2012-12-21 CN CN201280070432.9A patent/CN104126012A/zh active Pending
- 2012-12-21 BR BR112014015077-0A patent/BR112014015077A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-12-21 JP JP2014548982A patent/JP2015500663A/ja active Pending
- 2012-12-21 WO PCT/US2012/071472 patent/WO2013096898A2/en active Application Filing
- 2012-12-21 EP EP12816586.7A patent/EP2794897A2/en active Pending
-
2017
- 2017-02-27 JP JP2017034360A patent/JP2017131229A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014525741A (ja) * | 2011-06-30 | 2014-10-02 | インビスタ テクノロジーズ エス.アー.エール.エル. | ナイロン−7、ナイロン−7,7、およびポリエステルを生産するための生物変換方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. Vol. 73, No. 3, JPN6016033235, 2007, pages pp. 930-938 * |
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. Vol. 76, No. 1, JPN6016033230, 2010, pages pp. 110-118 * |
BIOCHEM. J., vol. Vol. 287, JPN6016033232, 1992, pages pp. 685-690 * |
MICROBIOLOGY, vol. Vol. 151, JPN6016033234, 2005, pages pp. 727-736 * |
MOLECULAR BIOSYSTEMS, vol. Vol. 7, JPN6016033233, March 2011 (2011-03-01), pages pp. 1811-1821 * |
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. Vol. 266, No. 17, JPN6016033231, 1991, pages pp. 11044-11050 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2013096898A3 (en) | 2014-03-13 |
EP2794897A2 (en) | 2014-10-29 |
WO2013096898A2 (en) | 2013-06-27 |
BR112014015077A2 (pt) | 2020-10-27 |
JP2017131229A (ja) | 2017-08-03 |
CN104126012A (zh) | 2014-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10577634B2 (en) | Bioconversion process for producing nylon-7, nylon-7,7 and polyesters | |
JP2017131229A (ja) | ナイロン−7、ナイロン−7,7、およびポリエステルを生産するための生物変換方法 | |
US20230022583A1 (en) | Adipate (ester or thioester) synthesis | |
CN105189764A (zh) | 通过与辅酶b合成相关的c1碳链延伸生产7-碳化学物的方法 | |
CN106795536A (zh) | 用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞 | |
US20130288320A1 (en) | Methods and microorganisms for increasing the biological synthesis of difunctional alkanes | |
US10774349B2 (en) | Alpha omega bifunctional fatty acids | |
AU2017213461B2 (en) | Adipate (ester or thioester) synthesis | |
Adkins | Renewable production of 5-carbon polyamide monomers using engineered escherichia coli |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141006 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20150612 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151216 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20151216 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160831 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20161125 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170227 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20170605 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171005 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171006 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20171026 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20171124 |