JP2015500287A - 抗体−薬物のコンジュゲート、ならびに関連する化合物、組成物および方法 - Google Patents

抗体−薬物のコンジュゲート、ならびに関連する化合物、組成物および方法 Download PDF

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Abstract

抗体−サイトトキシン、抗体−薬物のコンジュゲート、ならびにそれらの製造に使用されるリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート、ツブリシンアナログおよび合成における中間体などの関連する化合物；組成物；および癌の治療方法を含む方法が開示される。

Description

本発明は、抗体−薬物のコンジュゲート（ＡＤＣ）、ならびにその製造に使用されるリンカー、ツブリシン（tubulysin）アナログ、およびその合成における中間体などの関連する化合物；組成物；および癌の治療方法を含む方法に関する。
癌は米国で二番目に一般的な死亡原因であり、外科的切除を除いて、未だに有効な治療選択肢はほとんどない。癌の薬物治療では、癌細胞表面に存在する抗原を標的とするモノクローナル抗体の使用が一般的となってきている。米国にて治療的使用のために承認されている抗癌抗体には、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、すなわち慢性リンパ性白血病の治療に用いられるヒト化抗ＣＤ５２抗体；ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、すなわち結腸直腸癌に用いられるヒト化抗ＶＥＧＦ抗体；セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、すなわち結腸直腸癌、頭頸部癌および扁平上皮癌に用いられるキメラ抗上皮細胞成長因子抗体；イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、すなわちメラノーマに用いられるヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体；オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標））、すなわち慢性リンパ性白血病に用いられるヒト抗ＣＤ２０抗体；パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、すなわち結腸直腸癌に用いられるヒト抗上皮細胞成長因子受容体抗体；リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、すなわち非ホジキンリンパ腫に用いられるキメラ抗ＣＤ２０抗体；トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、すなわち非ホジキンリンパ腫に用いられるネズミ抗ＣＤ２０抗体；およびトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）））、すなわち乳癌に用いられるヒト化抗ＨＥＲ２抗体が挙げられる。これらの抗体はその表示される癌の治療に有用であることが証明されているが、単一薬剤として治療的に有効であることはほとんどなく、通常、癌の標準的な化学療法と併用して使用される。
一例として、トラスツズマブ（trastuzumab）は、ヒト上皮成長因子受容体２タンパク質、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）の細胞外ドメインと高い親和性で選択的に結合し、それによってＨＥＲ２陽性癌細胞の成長を阻害する、組換えＤＮＡ誘導性ヒト化モノクロナール抗体である（Coussensら、Science 1985, 230, 1132-9；Salmonら、Science 1989, 244, 707-12）。ハーセプチン（HERCEPTIN）は、先行して広範な抗癌治療を受けているＨＥＲ２を過剰発現する乳癌の患者を治療するのに有用であるが、この個体群の患者の中にはハーセプチン治療に応答しないか、ほんのわずかしか応答しないものもいる。したがって、ハーセプチン治療に応答しないかほとんど応答しない、ＨＥＲ２過剰発現性腫瘍またはＨＥＲ２発現に付随する他の疾患を患っている患者にとっては、更なるＨＥＲ２関連の癌の治療法の開発について有意な臨床上の要求がある。
抗体−薬物のコンジュゲート（ＡＤＣ）は急成長を遂げている種類の標的療法であり、抗癌薬の選択性および細胞毒活性の両方を改善することに関して有望かつ新規な解決法を提示する。例えば、Trailら、「Monoclonal antibody drug immunoconjugates for targeted treatment of cancer」, Cancer Immunol. Immunother. 2003, 52, 328-337；およびChari、「Targeted Cancer Therapy： Conferring Specificity to Cytotoxic Drugs」, Acc. Chem. Res., 2008, 41（1）, 98-107を参照のこと。これらのＡＤＣは３種の成分：リンカー（２）を介してサイトトキシン（３）にコンジュゲートしたモノクローナル抗体（１）を有する。サイトトキシンは、リシン上の第一アミンと、またはシステイン上のスルフヒドリル基と選択的に反応するリンカーを介して、抗体上のリシンまたはシステイン側鎖のいずれかと結合する。コンジュゲートしうるリンカー／薬物の最大数は、抗体上に存在する反応性アミンまたはスルフヒドリル基の数に依存する。典型的な抗体は、可能性のあるコンジュゲーション部位として９０個までのリシンを含有するが；大抵のＡＤＣで、一の抗体当たりのサイトトキシンの最適数は、サイトトキシンの数が大きくなるにつれてＡＤＣが凝集するため、典型的には２〜４である。結果として、現在臨床的開発中の一般的なリシンに結合したＡＤＣは、抗体上の異なるアミノ基にコンジュゲートした、一の抗体当たり０〜１０個のサイトトキシンを含有する不均質な混合物である。ＡＤＣで成功する鍵となる因子として次のこと：モノクローナル抗体が、癌抗原特異的であり、非免疫原性であり、毒性が低く、そして癌細胞により吸収されること；サイトトキシンが高い効力を有し、リンカーとの結合に適していること；リンカーがシステイン（Ｓ）またはリシン（Ｎ）結合に対して特異的であってもよく、循環において安定しており、プロテアーゼ切断可能、および／またはｐＨ感受的であってもよく、およびサイトトキシンとの結合に適していること、が挙げられる。
ＵＳＡにて治療的使用が承認された抗癌ＡＤＣとして、ブレンツキシマブ・ベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））、すなわち未分化大細胞リンパ腫およびホジキンリンパ腫に使用されるモノメチルオーリスタチンＥにコンジュゲートしたキメラ抗ＣＤ３０抗体；およびゲンツズマブ・オゾガミチン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、すなわち急性骨髄性白血病に使用されるカリケアマイシンγにコンジュゲートしたヒト化抗ＣＤ３３抗体（この製品は効能不足のために２０１０年に取り消されている）が挙げられる。
数種のＡＤＣで新しい臨床的効果が実証されたが、現在開発中の大部分のＡＤＣの有用性は、製品コストが高くなる煩雑な合成方法により、細胞毒性薬の効力を制限することに伴う不十分な抗腫瘍活性により、およびリンカーの不安定性およびＡＤＣの不均質によって問題となる安全性によって、制限される可能性がある。例えば、Ducryら、「Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies」, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13; Chari、「Targeted Cancer Therapy: Conferring Specificity to Cytotoxic Drugs」, Acc. Chem. Res. 2008, 41, 98-107；およびSenter、「Recent advancements in the use of antibody drug conjugates for cancer therapy」, Biotechnol.: Pharma. Aspects, 2010, 11, 309-322を参照のこと。
一例として、トラスツズマブをメイタンシノイド薬であるメルタンシンにコンジュゲートさせ、ＡＤＣトラスツズマブ・エムタンシン（emtansine）（トラスツズマブ−ＤＭ１またはトラスツズマブ−ＭＣ−ＤＭ１、略してＴ−ＤＭ１とも称される）を形成する（（LoRussoら、「Trastuzumab Emtansine：A Unique Antibody-Drug Conjugate in Development for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Positive Cancer」, Clin. Cancer Res. 2011, 17, 6437-6447；Burrisら、「Trastuzumab emtansine：a novel antibody-drug conjugate for HER2-positive breast cancer」, Expert Opin. Biol. Ther. 2011, 11, 807-819）。現在、米国ではその適用症についてフェーズＩＩＩの試験下にある。メルタンシンは、マレイミドでメルタンシン側鎖の４−チオ吉草酸の末端に結合し、リンカーのカルボキシル基とトラスツズマブのリシン塩基性アミンの間でアミド結合を形成する、マレイミドカプロイル（ＭＣ）リンカーを通してトラスツズマブにコンジュゲートする。トラスツズマブは８８個のリシン（および３２個のシステイン）を有する。結果として、トラスツズマブのエムタンシンは極めて不均質であり、１つのトラスツズマブに付き０〜８個のメルタンシンを含有する（メルタンシン／トラスツズマブの平均割合が３．４である）数十の異なる分子を含有する。
抗体のシステインもまた、マレイミドまたは他のチオール特異的官能基を含有する、リンカーを通してサイトトキシンにコンジュゲートするのに使用され得る。典型的な抗体は、重鎖および軽鎖を一緒に共有結合し、抗体のインビボでの安定性に寄与する、４個、または時に５個の鎖間ジスルフィド結合（重鎖間で２個および重鎖と軽鎖の間で２個の結合）を含有する。これらの鎖間ジスルフィド結合は、ジチオスレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、または他の弱還元剤で選択的に還元され、コンジュゲーションのための８個の反応性スルフヒドリル基を得ることができる。システイン結合のＡＤＣは、コンジュゲーション部位となる可能性が小さいため、リシン結合のＡＤＣほども不均質ではないが；現行のシステインリンカーは１個の硫黄原子と結合するに過ぎないため、コンジュゲーションの間に鎖間ジスルフィド結合が部分的に喪失してより不安定となり易い。システイン結合のＡＤＣでは、１つの抗体に付きサイトトキシンの最適数も２〜４である。例えば、ＡＤＣＥＴＲＩＳは、システインを介してコンジュゲートされるモノメチルオーリスタチンＥ残基を１つの抗体に付き０〜８個含有する不均質な混合物である。
Hofle／Reichenbachのグループによって、マイコバクテリアの培養体より初めて単離されたツブリシン（Sasseら、J. Antibiot. 2000, 53, 879-885）は、チュブリン高分子化を阻害することで作用し、それによりアポトーシスを誘発する特に強力な細胞増殖阻害剤である（Khalilら、Chem. Biochem. 2006, 7, 678-683；およびKaurら、Biochem. J. 2006, 396, 235-242）。そのツブリシンの中で、ツブリシンＤが最も強力であり、エポチロン、ビンブラスチンおよびパクリタキセル（タキソール（登録商標））を含む、他の大部分のツブリシン修飾体よりも活性が１０〜１００倍大きい（Steinmetzら、Angew. Chem. 2004, 116, 4996-5000；Steinmetzら、Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4888-4892；およびHofleら、Pure App. Chem. 2003, 75, 167-178）。パクリタキセルおよびビンブラスチンは現在使用される種々の癌の治療薬であり、エポチロン誘導体は臨床試験で活性を評価している途中である。ツブリシンＤの合成誘導体は、阻害機構および重要な結合相互作用について必要不可欠な情報を提供し、標的とする抗体またはリガンドに対する孤立エンティティまたは化学弾頭のいずれかとして、抗癌剤として優れた特性を有しうる。
ツブリシンＤは、式：
Figure 2015500287
 で示されるように、４つの領域、すなわちＭｅｐ（Ｄ−Ｎ−メチルピペコリン酸）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｔｕｖ（ツブバリン）およびＴｕｐ（ツブフェニルアラニン）に分けることができる、複合テトラペプチドである。ツブリシンＤを含む、ツブリシンの強力な誘導体の多くはまた、天然物中ではほとんど観察されることがない、興味深いＯ−アセチルＮ，Ｏ−アセタール官能基を取り込んでいる。この反応性官能基は酸性および塩基性反応条件の両方で不安定であり、したがってツブリシンの機能にて重要な役割を果たしている可能性がある（Ileyら、Pharm. Res. 1997, 14, 1634-1639）。最近になって、Ｏ−アシルＮ，Ｏ−アセタール官能基を導入する、ツブリシンＤの全合成（多くのツブリシンファミリーの中で最初の合成を示す）が報告された（Peltierら、J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 16018-16019）。ツブリシンＵおよびＶを含む、他のツブリシンは、Domlingら、「Total Synthesis of Tubulysins U and V」, Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7235-7239で合成された。
米国特許出願公開番号ＵＳ２０１１／００２１５６８Ａ１（Ellmanら）は、化合物（４０）および（１０）（本明細書にて、各々、Ｔ１およびＴ２と称される）を含む、多くのツブリシンアナログの合成および活性を開示する。
Figure 2015500287
Schumacherらの「In Situ Maleimide Bridging of Disulfides and a New Approach to Protein PEGylation」, Bioconjugate Chem. 2011, 22, 132-136は、３，４−ビス（２−ヒドロキシエチルスルファニル）ピロール−２，５−ジオン［Schumacherらにより、「ジメルカプトエタノールマレイミド」と称される］および３，４−ビス（フェニルスルファニル）ピロール−２，５−ジオン［「ジチオフェノールマレイミド」］などの３，４−二置換マレイミドの合成、およびソマトスタチンのＰＥＧ化剤としてのそのＮ−ＰＥＧ化誘導体を開示し、そこでは置換マレイミドがシステイン−システインのジスルフィド結合が開裂して得られた２個の硫黄原子に結合する。
強力で均質なＡＤＣ、癌の治療に用いるための該ＡＤＣを含有する組成物およびその使用方法、ならびにその調製方法およびその調製における中間体を開発することが望ましい。
第一の態様にて、本発明は、式：
Figure 2015500287
 ［式中：
Ａは抗体であり、
ＰＤはピロール−２，５−ジオンまたはピロリジン−２，５−ジオンであり、
二重結合は、ピロール−２，５−ジオンまたはピロリジン−２，５−ジオンの３位および４位と、抗体におけるシステイン−システインのジスルフィド結合が開裂して得られた２個の硫黄原子との結合を示し、
Ｌは−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−であり、
ＣＴＸはアミド結合でＬに結合したサイトトキシンであり、
ｎは１〜４の整数であり、および
ｍは１〜１２の整数である］
で示される、抗体−サイトトキシン、抗体−薬物のコンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。ＰＤの、抗体におけるシステイン−システインのジスルフィド結合が開裂して得られた２個の硫黄原子との二座配位結合のため、これらのＡＤＣは均質であり、単座配位リンカーとのＡＤＣよりも安定性が大きい。従って、それらのＡＤＣはインビボでの半減期を延ばし、全身に放出されるサイトトキシンの量を減らし、単座配位リンカーとのＡＤＣよりも安全である。
第二の態様にて、本発明は、本発明の第一の態様のＡＤＣを含有する医薬組成物を提供し；第三の態様にて、本発明は本発明の第一の態様のＡＤＣまたは本発明の第二の態様の医薬組成物を投与することによって関連性のある抗体により標的とされる癌を治療する方法を提供する。
第四の態様にて、本発明は、式Ａ、式Ｂおよび式Ｃ：
Figure 2015500287
 ［式中、
Ｒはハロまたはヒドロキシルで所望により置換されてもよいＣ１−６アルキル；ハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで所望により置換されてもよいフェニル；ハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで所望により置換されてもよいナフチル；あるいはハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで所望により置換されてもよい２−ピリジルであり、
Ｌは−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−であり、
ＣＴＸはアミド結合でＬに結合したサイトトキシンであり、および
ｍは１〜１２の整数である］
で示されるリンカー−サイトトキシンのコンジュゲートを提供する。これらの二座配位リンカー−サイトトキシンのコンジュゲートは本発明の第一の態様の抗体−薬物のコンジュゲートを調製するのに有用である。
第五の態様にて、本発明は、式ＡＡ、式ＢＢおよび式ＣＣ：
Figure 2015500287
 ［式中、
Ｒはハロまたはヒドロキシルで所望により置換されてもよいＣ１−６アルキル；ハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで所望により置換されてもよいフェニル；ハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで所望により置換されてもよいナフチル；あるいはハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで所望により置換されてもよい２−ピリジルであり、
Ｌは−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−であり、
Ｚはカルボキシル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルまたはアミノであり、および
ｍは１〜１２の整数である］
で示されるリンカーを提供する。これらの二座配位リンカーは本発明の第四の態様のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲートを調製するのに有用である。
第六の態様にて、本発明は、式ＡＡＡ、式ＢＢＢおよび式ＣＣＣ：
Figure 2015500287
 ［式中、
Ｒ’はクロロ、ブロモ、ヨード、Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、または４−トルエンスルホニルオキシであり、
Ｌは−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−であり、
Ｚはカルボキシル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルまたはアミノであり、および
ｍは１〜１２の整数である］
で示されるリンカーを提供する。これらの二座配位リンカーもまた、本発明の第四の態様のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲートを調製するのに有用であり、本発明の第五の態様のリンカーを調製するのに有用である。
第七の態様にて、本発明は式Ｔ３およびＴ４：
Figure 2015500287
 で示されるツブリシンを提供する。これらの新規なツブリシンは、上記される既知のツブリシンＴ１およびＴ２のアナログであるが、末端のＮ−メチルピペリジンが非置換のピペリジンで置換されているため、これらの新規な化合物は、ピペリジンの窒素原子と、リンカーのカルボキシ基のカルボニルとの間でアミド結合を形成することにより、カルボニル基を含有するリンカーとのツブリシン−リンカーのコンジュゲートを形成しうる。
本発明の好ましい実施態様は、本明細書により特徴付けられ、ならびに出願された本願の請求項１〜４７の特性およびこれら化合物の対応する医薬組成物の特性、方法および使用により特徴付けられる。
定義
「抗体」（免疫グロブリンとしても知られる）は、細菌およびウイルスなどの異物を確認し、中和するのに免疫系で使用されるラージＹ型タンパク質である。抗体の「Ｙ」字の各先端は抗原の一部位に特異的な部位を有するため、抗体は異物標的（抗原と称される）の独特な部分を認識し、これらの２つの構造物は正確に結合しうる。抗体は４本のポリペプチド鎖、すなわちシステインジスルフィド結合により結合した２本の同じ重鎖および２本の同じ軽鎖からなる。「モノクローナル抗体」は、抗体分子が同一の免疫細胞（そのすべてが独特な親細胞である）により産生されるため、そのすべての分子が同一である単一特異性抗体である。典型的には、モノクローナル抗体は、まず、骨髄腫細胞を所望の抗原で免疫化されているマウスから由来の脾臓細胞（またはウサギから由来のＢ細胞）と融合させ、次にその得られたバイブリドーマをアフィニティ精製などの技法により精製することにより調製される。組換えモノクローナル抗体は、所望の特異性を有する抗体が得られるアミノ酸配列とわずかに異なるアミノ酸配列を有する抗体のライブラリーを構築するのにイムノグロブリン遺伝子セグメントをクローニングする、レパートリークローニング法またはファージ提示法／酵母提示法と称される技法を介して、マウス細胞よりもむしろウイルスまたは酵母細胞で調製される。得られた抗体は発酵操作で大規模に調製されてもよい。「キメラ」または「ヒト化」抗体は、オリジナル（通常はマウス）と、組換え工程、例えばモノクローナル抗体の結合部をコードするマウスＤＮＡを、ヒト抗体を産生するＤＮＡと融合させ、一部マウスで一部ヒトのモノクローナル抗体を産生する工程で使用されるヒトＤＮＡ配列の組み合わせを含有する抗体である。完全なヒト化抗体は、トランスジェニックマウス（ヒト抗体を産生するのに遺伝子操作されているマウス）またはファージ提示ライブラリーを用いて産生される。本発明にて特に興味のある抗体は、癌抗原に特異的であり、非免疫原性であり、毒性が低く、癌細胞によって容易に内在化される抗体である；適切な抗体として、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、ゲンツズマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、およびトラスツズマブが挙げられる。
「サイトトキシン」は、癌細胞内で放出されると、その細胞に対して毒性である分子である。本発明で特に興味のあるサイトトキシンが、ツブリシン（式Ｔ３およびＴ４のツブリシンなど）、アウリスタチン（モノメチルアウリスタチンＥおよびモノメチルアウリスタチンＦなど）、メイタンシノイド（メルタンシンなど）、カリケアマイシン（カリケアマイシンγなど）であり；特に式Ｔ３およびＴ４のツブリシンのように、塩基性アミンまたはカルボキシル基を有することによるなどの、アミド結合を介してリンカーに配位し得る、それらのサイトトキシンである。
「リンカー」は、２個の反応性末端、すなわち一つは抗体とコンジュゲートするための、もう一つはサイトトキシンとコンジュゲートするための末端を有する分子である。リンカーの抗体コンジュゲーション反応性末端は、典型的には、抗体表面にあるシステインチオールまたはリシンアミン基を介して抗体とコンジュゲートしうる部位であり、それは典型的には二重結合（マレイミドにあるような）などのチオール反応基、またはクロロ、ブロモまたはヨードなどの脱離基、またはＲ−スルファニル基、またはカルボキシル基などのアミン反応基であり；その一方で、リンカーのサイトトキシンコンジュゲーション反応性末端は、典型的には、サイトトキシン上の塩基性アミンまたはカルボキシル基とのアミド結合の形成を介してサイトトキシンとコンジュゲートしうる部位であり、それは典型的にはカルボキシルまたは塩基性アミン基である。「リンカー」なる語が、コンジュゲートされている形態のリンカーを示すのに用いられる場合、反応性末端の一方または両方は、リンカーおよび／またはサイトトキシンの間で結合が形成されるため、不在（チオール反応基の脱離基など）であってもよく、あるいは不完全（カルボン酸のカルボニル基だけであるなど）であってもよい。
「抗体−薬物のコンジュゲート」または「ＡＤＣ」は、リンカーを介して、１または複数（典型的には１〜４個）の各サイトトキシンにコンジュゲートしている抗体である。抗体は、典型的には、癌抗原に特異的なモノクローナル抗体である。
「ツブリシン」は、Sasseら、および背景技術に記載の他の著者らによるなどの、ツブリシンとして記載される天然物、およびまた米国特許出願公開番号ＵＳ２０１１／００２１５６８Ａ１に記載されるツブリシンアナログの両方を包含する。本発明にて特に興味のあるツブリシンは、式Ｔ３およびＴ４で示されるツブリシン、ならびに末端にあるＮ−メチルピペリジンが置換されていないピペリジンと置き換えられており、リンカーとのアミド結合の形成を可能とする、他のツブリシンである。
式Ｔ３およびＴ４のツブリシンの末端にあるピペリジン基の一部を形成するアミンなどの「塩基性アミン」は、アミドの一部を形成しない第一または第二アミンである。
「治療上の有効量」は、本発明の第一の態様のＡＤＣ、または本発明の第二の態様の組成物が、癌に罹患しているヒトに投与された場合に、癌を治療するのに十分な量であることを意味する。癌を「治療する」または癌の「治療」とは、次の事象：
（１）癌の増殖を制限／阻害すること、すなわちその進行を制限すること；
（２）癌の拡散を抑制／防止すること、すなわち転移を抑制／防止すること；
（３）癌を緩和すること、すなわち癌の退行を惹起すること；
（４）癌の再発を抑制／防止すること；および
（５）癌の症状を緩和すること
の１または複数を包含する。
治療に興味のある癌は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性腫瘍を包含するが、これらに限定されない。かかる癌のさらに具体的な例は、有棘細胞癌（例、扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃癌（gastric or stomach cancer）、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、口腔癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝臓癌、例えば、ＨＥＲ２陽性乳癌を含む乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（kidney or renal cancer）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、メラノーマ、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳腫瘍、頭頸部癌、および関連する転移を包含する。
略語／頭字語
ＡＤＣ：抗体−薬物のコンジュゲート；ＤＥＡ：ジエチルアミン；ＤＣＣ：１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＩＡＤ：アゾジカルボン酸ジイソプロピル；ＤＩＰＣ：１，３−ジイソプロピルカルボジイミド；ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水；ＤＴＰＡ：ジエチレントリアミンペンタ酢酸；ＤＴＴ：ジチオスレイトール；ＥＤＣ：エチル ３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート；ＨＯＢＴ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド；ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン；ＭＭＡＥ：モノメチルアウリスタチンＥ；ＭＭＡＦ：モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン；ＭＣ：マレイミドカプロイル、６−（２，５−ジオキソピロリル）ヘキサノイル；ＰＢＳ：ホスフェート緩衝生理食塩水；ＰＥＧ：ポリ（エチレングリコール）；ＴＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロボラート；ＴＣＥＰ：トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン；ＴＧＩ：腫瘍成長阻害
本発明のＡＤＣ
背景技術に示されるように、抗体上のシステインチオールと配位結合する従前のＡＤＣは単官能性リンカーを利用しており、その一例がＭＣリンカーである。システイン−システインのジスルフィド結合を還元して開裂し、コンジュゲーションのために遊離チオールとすることは、抗体の安定性を小さくし、還元チオールの反応によるＡＤＣの形成は、以下のスキームに示されるように、結合を再び形成しない。
Figure 2015500287
 しかしながら、本発明の二官能性ピロール−２，５−ジオン−およびピロリジン−２，５−ジオン−を基礎とするリンカーは、システイン−システインのジスルフィド結合が開裂して得られた２個の硫黄原子と反応する２個の反応性官能基（以下のスキーム中のＸ）を含有する。二官能性リンカーと２個のシステインの反応は、以下のスキーム（環に二重結合がない：式ＡＡおよびＡＡＡのコハク酸イミドリンカー；環に二重結合がある：式ＢＢおよびＢＢＢのマレイミドリンカー）：
Figure 2015500287
 に示されるように、２個のチオエーテル結合を介して結合した一のジスルフィドに付き１個のリンカーでの「ステープル型（stapled）」ジチオスクシンイミドまたはジチオマレイミド−抗体のコンジュゲートを付与する。
従来のシステインのコンジュゲーションについての方法とは異なり、該反応は２個のシステインの硫黄原子の間で共有結合の構造を再形成し、したがって抗体の全体としての安定性を損なうことはない。該方法はまた、すべての反応性システインが用いられるため、一の抗体に付き最適には４個の薬物のコンジュゲーションを可能とし、均質なＡＤＣを得る。全体としての結果は、システインの間で、相対的に不安定なジスルフィド結合が、安定した「ステープル型」結合で置き換えられた。一置換されたマレイミドリンカー（式：ＣＣおよびＣＣＣ）はまた、マレイミドの二重結合がシステインの硫黄原子の一つと、そしてＸ基がもう一つとコンジュゲートしうるため、抗体とのコンジュゲーションにて効果的な二官能性を示す。
本発明の化合物の調製
ＡＤＣ、リンカー−サイトトキシンのコンジュゲート、リンカーおよびツブリシンなどの本発明の化合物は、有機化合物および生物有機化学の一般的方法により調製される。例えば、Larock、「Comprehensive Organic Transformations」, Wiley-VCH, New York, N.Y., U.S.A.を参照のこと。適当な保護基ならびにその添加および除去の方法は、必要に応じて、Greeneら、「Protective Groups in Organic Synthesis」, 2nd ed., 1991, John Wiley and Sons, New York, NY, USに記載されている。参考文献はまた、明細書のいずれに記載されている文献にも言及し、例えばリンカーの合成について以前に言及されている、Schumacherらの文献、ツブリシンの調製に関する米国特許出願公開第２０１１／００２１５６８Ａ１等である。
ツブリシンの調製
ツブリシンＴ３およびＴ４は、Peltierらおよび米国出願公開第２０１１／００２１５６８Ａ１に記載の方法と同様の方法により、Ｄ−Ｎ−メチルピペコリン酸の代わりにＤ−ピペコリン酸を用い、適宜、保護および脱保護することで調製される。
リンカーの調製
比較物質のＭＣリンカーをその調製が当該分野にて公知である方法により調製した。
本発明のリンカーを、以下のSchumacherらの方法と同様の方法により調製する（反応スキーム中、Ｒ、ＬおよびＺは、上記の発明の第五および第六の態様の開示にて該記号に付与されるのと同じ意義を有する）：
Figure 2015500287
２，３−ジブロモマレイミド（１当量）および炭酸水素ナトリウムなどの塩基（約５ 当量）をメタノールに溶かし、２−ピリジンチオール（１当量よりわずかに多めの量）のメタノール中溶液を添加する。反応物を外界温度で１５分間攪拌する。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ（石油エーテル：酢酸エチル、９：１→７：３への勾配溶出）を用いるなどして精製し、３，４−ビス（２−ピリジルスルファニル）ピロール−２，５−ジオンを得る。
３，４−ビス（２−ピリジルスルファニル）ピロール−２，５−ジオンと側鎖とのカップリングを完全に乾燥した条件下で実施する。３，４−ビス（２−ピリジルスルファニル）ピロール−２，５−ジオン（１当量）およびトリフェニルホスフィン（１当量）のテトラヒドロフランとジクロロメタンの混合液中混合物に、ＤＩＡＤ（１当量）を−７８℃で滴下した。反応物を５分間攪拌し、側鎖（０.５当量）／ジクロロメタンを滴下する。５分間攪拌した後、ネオペンチルアルコール（１当量）／テトラヒドロフランおよびジクロロメタンを加え、さらに５分間攪拌し、ついで３，４−ビス（２−ピリジルスルファニル）ピロール−２，５−ジオン（１当量）を添加し、さらに５分間攪拌する。反応物を攪拌しながら２０時間外界温度にまで加温させ、次に溶媒を減圧下で除去する。残渣をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィ（メタノール：ジクロロメタン、勾配溶出０−１０％メタノール）による操作に付して精製し、リンカーを得る。側鎖は保護形態で使用されてもよく、ミツノブ反応の後に、適宜、脱保護されてもよい。
あるいは、適宜、所望により保護されてもよい側鎖を、上２段落に記載の合成とは反対で、ミツノブカップリング反応により、３，４−ジブロモマレイミドにカップリングし；得られた化合物を塩基の存在下でＲ−チオールと反応させてジスルフィド交換されるように活性化してもよい。
ピロール−２，５−ジオン部よりもむしろピロリジン−２，５−ジオン部を含有するリンカーについて、２，３−ジブロモコハク酸イミドで出発することで同様の方法を用いてもよいが；より一般的には、これらのリンカーは、該リンカーを置換されていないマレイミドで調製し、そのリンカーを臭素化し、側鎖とカップリングさせた後にジブロモスクシンイミド部を得、次に該リンカーを最終段階でＲ−チオールで「活性化させる」ことで調製される。
モノ置換のマレイミドリンカーは、通常は、塩基性条件下、ジブロモスクシンイミドリンカーを脱ヒドロブロモ化に供し、関連する方法に付すことで調製される。
リンカー−サイトトキシンのコンジュゲートの調製
リンカー−サイトトキシンのコンジュゲートは、Doroninaら、Bioconjugate Chem. 2006, 17, 114-124、および類似文書に記載の方法と類似する方法により調製され得る。リンカー（１当量）およびＨＡＴＵ（１当量）を無水ＤＭＦに溶かし、つづいてＤＩＰＥＡ（２当量）を添加する。得られた溶液をＤＭＦに溶かしたサイトトキシン（０．５当量）に加え、反応物を外界温度で３時間攪拌する。リンカー−サイトトキシンのコンジュゲートをＣ−１８カラムでの逆相ＨＰＬＣで精製する。
ＡＤＣの調製
抗体、典型的にはモノクローナル抗体を特異的癌標的（抗原）に対して産生させ、精製して特徴付ける。その抗体を含有する治療薬ＡＤＣを、システインコンジュゲーションの標準的方法、例えば、Hamblettら、「Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate」, Clin. Cancer Res. 2004, 10, 7063-7070；Doroninaら、「Development of potent and highly efficacious monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy」, Nat. Biotechnol., 2003, 21（7）, 778-784；およびFranciscoら、「cAC10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethylauristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity」, Blood, 2003, 102, 1458-1465の方法と類似する方法により調製する。一抗体に付き４つの薬物での抗体−薬物のコンジュゲートを、抗体を過剰量のＤＴＴまたはＴＣＥＰなどの還元剤で３７℃で３０分間部分還元に付すことで調製し、ついでＤＰＢＳ中１ｍＭ ＤＴＰＡでＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ−２５を介して溶出することで緩衝液を交換する。溶離液をさらにＤＰＢＳで希釈し、抗体のチオール濃度を５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）［エルマン試薬］を用いて測定する。過剰量の、例えば５倍量のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲートを４℃で１時間にわたって加え、そのコンジュゲーション反応物を、かなり過剰な、例えば２０倍量のシステインを添加してクエンチさせてもよい。得られたＡＤＣ混合物をＰＢＳで平衡にさせたＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５で精製し、未反応のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲートを取り除き、所望により脱塩してもよく、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。得られたＡＤＣを次に、例えば、０．２μｍのフィルターを介して滅菌濾過に供し、所望により貯蔵のために凍結乾燥に付してもよい。
本発明のＡＤＣの形成は、次の反応スキームにより説明され、ここで「Ｙ」字構造は抗体を意味し、一つのジスルフィド結合だけが示され、リンカー−サイトトキシンのコンジュゲートの詳細は、ＡＤＣの概念を示すにおいて簡素化のために省略されている：
Figure 2015500287
 典型的には、ｎは４であり、鎖間システインジスルフィド結合はすべてリンカー−薬物のコンジュゲートにより置き換えられている。Schumacherらは、そのソマトスタチンとのコンジュゲーションにて、還元剤をソマトスタチンとＰＥＧ化リンカーとの混合物に添加しており、そのことは抗体とリンカー−サイトトキシンのコンジュゲートでも可能であるかもしれず、合成方法として排除されるものではない。
アッセイ
本発明のＡＤＣを、抗体のアッセイについて通常使用されるいずれかの方法により所望の抗原との結合アフィニティ、および該抗原との特異性についてアッセイしてもよく；また、細胞培養に対する効能についてのアッセイ、異種移植アッセイ等などの、細胞***停止剤／細胞毒性剤のアッセイに通常使用されるいずれかの方法により、抗癌剤としての効能についてアッセイしてもよい。当業者は、技術および利用可能な文献を考慮して、適切なアッセイ技法を決定するのに困難はなく；これらのアッセイの結果から、抗癌剤としてヒトに試験するのに適する用量を決定するのに、およびそれらの試験の結果から、ヒトの癌を治療するのに適する使用用量を決定するのに困難はない。
処方および投与
本発明の第一の態様のＡＤＣは、典型的には、静脈内投与用液剤として、あるいは静脈内液剤を調製するのに復元される凍結乾燥濃縮物（例えば、生理食塩水、５％デキストロース、または類似等張溶液で復元される濃縮物）として処方されてもよい。典型的には、静脈内注射または注入により投与される。医薬処方、特に抗癌抗体の処方の分野の当業者は、技術および利用可能な文献を鑑みれば、適切な処方を開発するのに、困難はない。
実施例
リンカーの合成
実施例１
３，４−ビス（２−ピリジルスルファニル）ピロール−２，５−ジオン
Figure 2015500287
 の合成
３，４−ジブロモピロール−２，５−ジオン［２，３−ジブロモマレイミド］（１ｇ）を、ゴム栓およびバブラーを備えた１００ｍＬのきれいな丸底フラスコに加え、ＨＰＬＣ等級のメタノール（５０ｍＬ）に溶かした。２−ピリジンチオール（２当量）を２０ｍＬのシンチレーションバイアルに加え、メタノール（１０ｍＬ）に溶かした。窒素下、攪拌しながら、２−ピリジンチオール／メタノール溶液を３，４−ジブロモピロール−２，５ ジオンに、２０ｍＬのシリンジを介して１６ゲージの針で滴下し、その反応混合物をさらに３−４時間攪拌した。メタノールを蒸発させ、粗生成物を酢酸エチルに溶かし、約２ｇのシリカゲル上にロードした。シリカゲルロードの粗生成物を１２ｇのシリカゲルカートリッジを介してヘキサン：酢酸エチルの９：１〜０：１の勾配にて２５カラム容量で溶出した。生成物に富むフラクションを確認し、プールして凍結乾燥させた。最終生成物を酢酸エチルおよびジエチルエーテルから再結晶に供して黄色針状晶を得、それを濾過により集めた。
他の３，４−ジ（Ｒ−スルファニル）ピロール−２，５−ジオンについて、同様の合成をSchumacherらの方法を用いて行った（the Supplementary Materials、Ｓ１７−Ｓ１８頁を参照のこと）。（３，４−ジブロモ−２，５−ジオキソピロリル）−末端のリンカー［すなわち、側鎖がすでにピロール窒素に付加されている化合物］で出発する同様の合成を行い、対応する（２，５−ジオキソ−３，４−ジ（Ｒ−スルファニル）ピロリル）−末端のリンカーを得てもよく；および／または他のチオール（Schumacherらのベンゼンチオールおよび２−ヒドロキシエタンチオールなど）で出発し、対応するリンカーを得てもよく；および／または他のピロールジオンまたはピロリジンジオン（３，４−ジクロロピロール−２，５−ジオンまたは３，４−ジブロモピロリジン−２，５−ジオン、あるいはそれらに基づく化合物など）で出発し、対応する３，４−ジ（Ｒ−スルファニル）ピロール−２，５−ジオンまたは３，４−ジ（Ｒ−スルファニル）ピロリジン−２，５−ジオンあるいはそれらに基づくリンカーを得てもよい。
実施例２
３９−（３，４−ジブロモ−２，５−ジオキソピロリル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタン酸：
Figure 2015500287
 の合成
１００ｍＬの二口丸底フラスコをフレーム乾燥に付し、窒素下で冷却した。その冷却したフラスコに、２００ｍｇ（０.２９６ミリモル）の３９−ヒドロキシ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６ドデカオキサノナトリアコンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルを充填した。トリフェニルホスフィン（１０６ｍｇ）をバイアル中の無水テトラヒドロフラン（約５ｍＬ）に溶かし、該溶液を窒素下でカニューレを介して１００ｍＬのフラスコに加えた。その１００ｍＬのフラスコを氷水浴で１５分間冷却した。清澄溶液が観察されるまで、該冷却溶液に３，４−ジブロモピロール−２，５−ジオン（、５５ｍｇ、０.２１７ミリモル）を攪拌しながら添加した。ＤＩＡＤ（５８．３μＬ）を冷却反応混合液に加え、それを氷浴中でさらに１０分間攪拌した。反応混合液を攪拌し、約２０時間にわたって室温に到達させ、ついでロータリーエバポレーター上で乾燥するまで濃縮して黄色粘稠性油を得、それを約１ｇのシリカゲル上に吸収させ、リベラリス（Reveleris）順相クロマトグラフィーユニット上に乾燥ロードさせた。その油を１２ｇのシリカゲルのカートリッジにてメタノール：ジクロロメタンの１：０〜９：１の勾配にて２８カラム容量で溶出した。目的生成物を含有するフラクションをプールし、濃縮乾燥させた。精製した生成物を５０：５０のアセトニトリル：水に懸濁させ、一夜凍結乾燥させて清澄な明黄色粘稠性油を得た。ＬＣ−ＭＳ分析によれば、ｔｅｒｔ−ブチル−保護のカルボン酸生成物は後処理の間に部分的に脱保護された。生成物をすべて遊離酸に脱保護するのに、その凍結乾燥された材料をジクロロメタン中５％トリフルオロ酢酸で処理し、乾燥状態にまで濃縮し、アセトニトリル：水（５０：５０）中で一夜凍結乾燥させた。
同様の合成を３，４−ビス（２−ピリジルスルファニル）ピロール−２，５−ジオンで出発して行い、３９−（２，５−ジオキソ−３，４−ビス（２−ピリジルスルファニル）ピロリル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタン酸を得るか、あるいは他の３，４−ジ（Ｒ−スルファニル）ピロール−２，５−ジオンで出発し、対応するリンカーを得るか；および／または他のヒドロキシル末端側鎖で出発し、例えば６−ヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを用いて６−（３，４ ジブロモ−２，５−ジオキソピロリル）ヘキサン酸等を得る。２，３−ジブロモマレイミドよりもむしろマレイミドで出発する同様の合成に付して、６−（２，５−ジオキソピロリル）ヘキサン酸、ＭＣリンカーなどの従来の比較リンカーを得る。
実施例３
３９−（３，４−ジブロモ−２，５−ジオキソピロリジニル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタン酸［ｄＢｒＰＥＧリンカー］：
Figure 2015500287
 の合成
３９−（２，５−ジオキソピロリル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタン酸を、２，３−ジブロモマレイミドよりもむしろマレイミドで出発する以外、実施例２の３９−（３，４−ジブロモ−２，５−ジオキソピロリル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタン酸と同様の方法で調製した。酸を臭素／クロロホルム（０.５当量）で処理し、つづいて一夜還流させ、シリカゲル上のフラッシュ精製に付した後、３９−（３，４−ジブロモ−２，５−ジオキソピロリジニル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタン酸を得た。
同様の合成を、他のヒドロキシル末端側鎖を用いて、例えば６−ヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを用いて行い、６−（３，４−ジブロモ−２，５−ジオキソピロリジニル）ヘキサン酸等を得てもよい。この合成の生成物であるジブロム化リンカーを、さらなる工程にて、塩基で脱臭素化に付し、６−（３−ブロモ−２，５−ジオキソピロリル）ヘキサン酸などの（３−ブロモ−２，５−ジオキソピロリル）末端のリンカーを得てもよい。
リンカー−サイトトキシンのコンジュゲートの合成
実施例４
Ｔ４
Figure 2015500287
 の合成
Ｆｍｏｃ−Ｄ−２ピペリジンカルボン酸をイソロイシンとＥＤＣおよび炭酸水素ナトリウムの存在下でカップリングさせてＦｍｏｃ−Ｔ４を調製し、ついで得られたＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｉｐ−Ｉｌｅ−ＯＨをＮ−メチルバリン中間体１（Concortisより購入）に、ＨＯＢＴおよびＤＩＰＣ／ＤＭＦ（１当量）と混合し、つづいてＮＭＭ（２.５当量）を添加することでカップリングした。反応混合液を一夜攪拌し、シリカゲル上、ヘキサンおよび酢酸エチルの勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製した。溶媒を蒸発させてＦｍｏｃ−４を黄色油として得た。次に、塩化メチレン中２０％ＤＥＡで３０分間処理することで該Ｆｍｏｃ−Ｔ４を脱保護してＴ４を得、それをアセトニトリル／水で溶出するＣ１８逆相カラムでのプレパラティブＨＰＬＣに付して精製した。
実施例５
６−（２，５−ジオキソピロリル）ヘキサノイル−Ｔ４［ＭＣ−Ｔ４］および３９−（３，４−ジブロモ−２，５−ジオキソピロリジニル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタノイル−Ｔ４［ｄＢｒＰＥＧＴ４］
Figure 2015500287
 の合成
実施例２および３に記載されるＭＣまたはｄＢｒＰＥＧリンカーを、ＤＭＦ中ＤＩＰＥＡ（２当量）の存在下、ＴＢＴＵ（１当量）で活性化させ、Ｔ４と室温で72時間カップリングさせることで、Ｔ４をその各々のリンカーにカップリングさせた。プレパラティブＣ１８ＨＰＬＣ（アセトニトリル−水の勾配）で精製し、抗体とのコンジュゲーションに適するＭＣ−Ｔ４またはｄＢｒＰＥＧ−Ｔ４を得た。
他のリンカーを用いる類似合成に付し、対応するリンカー−Ｔ４コンジュゲートを得る。Ｔ３、ＭＭＡＦまたは他のサイトトキシン（塩基性アミンを含む）を用いる類似合成に付し、対応するリンカー−サイトトキシンのコンジュゲートを得る。アミン末端のリンカーおよびカルボキシル基を含むサイトトキシンを用い、該サイトトキシンを上記した実施例で活性化されるリンカーと同様の方法にてサイトカインを活性化する類似合成に付して、他のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲートを得る。
実施例６
３９−（２，５−ジオキソ−３，４−ビス（２−ピリジルスルファニル）ピロリル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタノイル−ＭＭＡＦ［ｄＰＳＰＥＧ−ＭＭＡＦ］：
Figure 2015500287
 の合成
３９−（２，５−ジオキソ−３，４−ビス（ピリジン−２−イルチオ）−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタン酸を、きれいなフレーム乾燥させた５０ｍＬの丸底フラスコに加え、カルボン酸をＤＭＦ（３ｍＬ）中ＤＣＣの存在下でＮＨＳを用いて活性化させた。ＭＭＡＦをＤＭＦ（約１ｍＬ）に予め溶かし、２２ゲージ針を介してそのＮＨＳ活性化酸に移した。ＤＩＰＥＡを該反応混合液に加え、一夜攪拌した。粗反応混合液を２１.２ｍｍ ｘ ５０ｍｍのAgilentのＰＲＥＰ−Ｃ１８カラムの逆相ＨＰＬＣ上、３５ｍＬ／分の流速で２０カラム容量（約３０分間の勾配時間）にて精製した。生成物に富むフラクションを確認し、プールし、凍結乾燥させて白色半固体としてｄＰＳＰＥＧ−ＭＭＡＦのコンジュゲートを得た。
他のリンカーを用いる類似合成に付し、対応するリンカー−ＭＭＡＦのコンジュゲートを得る。Ｔ３、Ｔ４または塩基性アミンを含む他のサイトトキシンを用いる類似合成に付し、ｄＰＳＰＥＧ−Ｔ４などの対応するリンカー−サイトカインのコンジュゲートを得る。アミン末端のリンカーおよびカルボキシル基を含むサイトトキシンを用い、上記の実施例で活性化されるリンカーと同様にしてサイトトキシンを活性化する類似合成に付し、他のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲートを得る。
抗体−薬物のコンジュゲートの合成
実施例７
トラスツズマブ−ｄＴＳＰＥＧ−ＭＭＡＦ ＡＤＣ
Figure 2015500287
 の合成
トラスツズマブ（１ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬのｐＨ７.４ ＰＢＳ（Gibco、ＭｇおよびＣａ不含）中溶液（１ｍＭ ＤＴＰＡを含む））を滅菌処理した１.７ｍＬのエッペンドルフ管にロードし、ついで２.７５当量のＴＣＥＰ塩酸塩（シグマアンプル０.５Ｍ濃度）を加え、該混合物を３７℃で１時間インキュベートし、トラスツズマブに付き平均して４個の遊離チオール対を得る（このことはエルマン比色アッセイにより確認され得る−Ellman、「Tissue sulfhydryl groups」, Arch. Biochem. Biophys, 1959, 82, 70-77あるいはこのアッセイに言及する後の文献を参照のこと）。還元された抗体溶液を氷浴中約０℃で１５分間冷却し；ついでジメチルスルホキシド中ｄＰＳＰＥＧ−ＭＭＡＦ（約４当量）溶液を加え、該混合物を３７℃で２時間（または４℃で２０時間）インキュベートする。得られたトラスツズマブ−ｄＴＳＰＥＧ−ＭＭＡＦ ＡＤＣをサイズ排除クロマトグラフィー（GE AKTAの純正クロマトグラフィーシステム）またはＰＤ１０脱塩カラムで精製する。
ｄＰＳＰＥＧ−Ｔ４などの他のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート、および／または１８−２Ａ（ネズミＩｇＧ２ａ抗体）などの他の抗体を用いる類似合成に付して対応するＡＤＣを得る。
アッセイ
本発明のＡＤＣの抗体の部分に対応する抗原を発現を発現する癌細胞株および抗原を欠く類似する癌細胞株などの、興味のある癌細胞株のその細胞毒性を測定することにより、そのＡＤＣのインビトロでの効能および選択性について試験する。本発明のＡＤＣを、癌研究の分野の当業者に周知の、マウス皮下癌異種移植実験およびマウス同所性癌異種移植実験などの動物実験にてインビボにて効能および安全性について試験する。
実施例８
トラスツズマブと比較したトラスツズマブＡＤＣの細胞毒性
トラスツズマブがＭＣリンカーを介して現在使用のサイトトキシンＭＭＡＦにコンジュゲートされている２種のＡＤＣ［トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦ］の細胞毒性を、ＨＥＲ２陽性およびＨＥＲ２陰性腫瘍細胞にて、トラスツズマブ単独での細胞毒性と比較した。ＨＥＲ２陰性腫瘍細胞では、両方のＡＤＣについて、およびトラスツズマブそれ自体についてのＩＣ５０は＞５００ｎＭであったが；ＨＥＲ２陽性細胞では、トラスツズマブそれ自体のＩＣ５０はなおも＞５００ｎＭである一方で、２種のトラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦのＡＤＣはＩＣ５０が０．００９ｎＭおよび０．０１８ｎＭであった。これらの結果はＡＤＣがその親抗体よりも効能にてかなり強力であることを示唆する。
実施例９
ＭＭＡＦと比較したＴ１およびＴ２の細胞毒性
ツブリシンＴ１およびＴ２の細胞毒性を、標準的細胞毒性アッセイにてＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋）細胞株を用いるＭＭＡＦの細胞毒性と比較した。これらの細胞にて、ＭＭＡＦはＩＣ５０が９３ｎＭであり、Ｔ１はＩＣ５０が１１ｎＭで、Ｔ２はＩＣ５０が＜０．１ｎＭであって、このことはこれらのツブリシンがＭＭＡＦよりもかなり強力であることを示す。これらの結果はＮ−コンジュゲート可能なＴ３およびＴ４が非−Ｎ−コンジュゲート可能なツブリシンＴ１およびＴ２と同様の効能を有し、ＭＭＡＦよりもかなり強力であることを示唆する。これらの結果および実施例８の結果は、ツブリシンＡＤＣがＭＭＡＦ ＡＤＣよりもかなり強力であり、効果的な抗癌剤であることを示唆する。
実施例１０
抗原発現細胞に対するＡＤＣの結合アフィニティ
抗体およびＡＤＣと抗原発現細胞との結合を細胞ＥＬＩＳＡを用いて測定する。標的を発現するように遺伝子導入された肉腫細胞（ＨＥＲ２についてＦ２７９、ＣＤ９８についてＦ２４４）を、その日に、３８４−ウェルプレートに１ウェルに付き５０００細胞で播種する。翌日、抗体を別個のプレートにて連続して希釈し、ついで培地が前もって吸引で除去されている、細胞プレートに移した。室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄バッファー（ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ウシ血清アルブミンを含む）で洗浄し、ついで培地中に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の第二抗体（２５μＬ）を加え、室温で３０分間インキュベートする。ついで、該プレートを洗浄し、１５μＬの化学発光基質（Pierceカタログ番号３７０６９）を加え；該プレートをプレートベースの発光読取り装置で読み取る。トラスツズマブおよびトラスツズマブＡＤＣ（トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦ、トラスツズマブ−ＭＣ−Ｔ４、トラスツズマブ−ｄＴＳＰＥＧ−ＭＭＡＦ、およびトラスツズマブ−ｄＴＳＰＥＧ−Ｔ４）はＦ２７７細胞について比較しうるアフィニティを示し；１８−２Ａおよび１８−２Ａ ＡＤＣ（１８−２Ａ−ＭＣ−ＭＭＡＦ、１８−２Ａ−ＭＣ−Ｔ４、１８−２Ａ−ｄＴＳＰＥＧ−ＭＭＡＦ、および１８−２Ａ−ｄＴＳＰＥＧ−Ｔ４）はＦ２４４細胞について比較しうるアフィニティを示し、これは薬物のペイロードのコンジュゲーションが抗原結合に影響を与えないことを示す。
実施例１１
抗原発現細胞に対するＡＤＣの効能
腫瘍細胞増殖の阻害についてのＡＤＣの効能を細胞増殖アッセイにて試験した。薬物処理を行う前日に、Ｒａｍｏｓ（Ｂ細胞リンパ腫）およびＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋ヒト乳癌）細胞株を、ウェル当たり、各々、３０００および５０００個の細胞で、９６ウェルプレートの半分の領域に播種した。ＡＤＣおよび対照をマスタープレートにて連続希釈に供し、次に細胞プレートに移し、それを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。ＡＴＰＬｉｔｅ１Ｓｔｅｐキット（Perkin Elmerカタログ番号５０−９０４−９８８３）を製造業者に記載されるように用い、ウェルのＡＴＰのレベルを測定することで細胞を計数した。１８−２Ａ ＡＤＣ（１８−２Ａ−ＭＣ−ＭＭＡＦ、１８−２Ａ−ＭＣ−Ｔ４、１８−２Ａ−ｄＴＳＰＥＧ−ＭＭＡＦ、および１８−２Ａ−ｄＴＳＰＥＧ−Ｔ４）はほとんど等効力であり、Ｒａｍｏｓ細胞にて親の１８−２Ａ抗体よりもかなり強力であったのに対して、トラスツズマブ ＡＤＣ（トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦ、トラスツズマブ−ＭＣ−Ｔ４、トラスツズマブ−ｄＴＳＰＥＧ−ＭＭＡＦ、およびトラスツズマブ−ｄＴＳＰＥＧ−Ｔ４）はほとんど等効力であり、ＢＴ４７４細胞にて親のトラスツズマブ抗体よりもかなり強力であった。
実施例１２
ネズミ異種移植実験におけるＡＤＣの有効性
Ｒａｍｏｓ細胞の異種移植実験
Ｒａｍｏｓ細胞株をＡＴＣＣより入手し、供給側のプロトコルに従って培養した。４−６週齢の雌の免疫不全マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｃ．Ｂ−１７スキッドマウス）に、ＰＢＳ（マグネシウムまたはカルシウム不含）およびＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences）の混合物（１：１の割合）中の１ｘ１０７個の生存細胞をその右側に皮下注射した。マウス当たりで注射した総容量は２００μＬであり、５０％はＭａｔｒｉｇｅｌであった。腫瘍が６５−２００ｍｍ３の大きさに達すると、マウスを無作為に選別した。ＡＤＣをＰＢＳ中で処方し、１ｍｇ／ｋｇの用量で側面尾静脈に、一回静脈内投与し、体重および腫瘍を週に２回測定した。腫瘍の体積をvan der Horstら、「Discovery of Fully Human Anti-MET Monoclonal Antibodies with Antitumor Activity against Colon Cancer Tumor Models In Vivo」, Neoplasia, 2009, 11, 355-364に記載されるように測定した。実験は実験点に付き一群８匹の動物で行われた。負の対照群は、ＨＢ１２１（ＩｇＧ２ａ陰性抗体）および遊離ＭＭＡＦまたはＴ４を、適宜、ＡＤＣで放出される濃度と等モルの濃度で投与され、その一方で正の対照群は１８−２Ａを投与された。本発明のリンカーとの１８−２Ａ ＡＤＣ（１８−２Ａ−ｄＴＳＰＥＧ−ＭＭＡＦおよび１８−２Ａ−ｄＴＳＰＥＧ−Ｔ４）は、コンパレーターのＡＤＣ（各々、１８−２Ａ−ＭＣ−ＭＭＡＦおよび１８−２Ａ−ＭＣ−Ｔ４）よりもわずかであるが、比較できるほどに大きなＴＧＩを、および親１８−２Ａ抗体よりも大きなＴＧＩを示し、その一方ですべてが対照と比べて有意なＴＧＩを示した。毒性は動物の体重測定で観察されなかった。
ＢＴ４７４細胞の異種移植実験
ＢＴ４７４細胞株をＡＴＣＣより入手し、供給側のプロトコルに従って培養した。４−６週齢の雌の免疫不全マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｃ．Ｂ−１７スキッドマウス）に、ＰＢＳ（マグネシウムまたはカルシウム不含）およびＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences）の混合物（１：１の割合）中の１ｘ１０７個の生存細胞をその右側に皮下注射する３日前に、β−エストラジオールペレットを移植した。マウス当たりで注射した総容量は２００μＬであり、５０％はＭａｔｒｉｇｅｌであった。腫瘍が１００−１５０ｍｍ３の大きさに達すると、マウスを無作為に選別した。ＡＤＣをＰＢＳ中で処方し、１ｍｇ／ｋｇの用量で側面尾静脈に、一回静脈内投与し、体重および腫瘍を週に２回測定した。腫瘍の体積を上記されるvan der Horstらに記載されるように測定した。実験は実験点に付き一群８匹の動物で行われた。負の対照群は、ＨＢ１２１および遊離ＭＭＡＦまたはＴ４を、適宜、ＡＤＣで放出される濃度と等モルの濃度で投与され、その一方で正の対照群はトラスツズマブを１ｍｇ／ｋｇで投与された。本発明のリンカーとのトラスツズマブ ＡＤＣ（トラスツズマブ−ｄＴＳＰＥＧ−ＭＭＡＦおよびトラスツズマブ−ｄＴＳＰＥＧ−Ｔ４）は、コンパレーターのＡＤＣ（各々、トラスツズマブ−ＭＣ−ＭＭＡＦおよびトラスツズマブ−ＭＣ−Ｔ４）と対比可能な大きさのＴＧＩを、および親トラスツズマブよりもわずかに大きなＴＧＩを示し、その一方ですべてが対照と比べて有意なＴＧＩを示した。毒性は動物の体重測定で観察されなかった。
同様の試験を他の癌（異なる抗原を発現する細胞の癌）およびＡＤＣ（ここで、抗体はその癌により発現される抗原に対応する）で行う。

Claims (47)

  1. 式：
    Figure 2015500287
     ［式中：
    Ａは抗体であり、
    ＰＤはピロール−２，５−ジオンまたはピロリジン−２，５−ジオンであり、
    二重結合は、ピロール−２，５−ジオンまたはピロリジン−２，５−ジオンの３位および４位と、抗体におけるシステイン−システインのジスルフィド結合が開裂して得られた２個の硫黄原子との結合を示し、
    Ｌは−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−であり、
    ＣＴＸはアミド結合でＬに結合したサイトトキシンであり、
    ｎは１〜４の整数であり、および
    ｍは１〜１２の整数である］
    で示される、抗体−薬物のコンジュゲート。
  2. Ａがモノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  3. Ａがヒトまたはヒト化抗体である、請求項１または２記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  4. Ａが癌抗原に特異的な抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  5. Ａがアレムツズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、またはトラスツズマブである、請求項１記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  6. Ａがトラスツズマブである、請求項１記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  7. ＣＴＸが、オーリスタチン、カリケアマイシン、メイタンシノイド、またはツブリシンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  8. ＣＴＸが、モノメチルオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＦ、カリケアマイシンγ、メルタンシン、ツブリシンＴ３、またはツブリシンＴ４である、請求項７記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  9. ＰＤがピロリジン−２，５−ジオンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  10. ＰＤがピロール−２，５−ジオンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  11. Ｌが−（ＣＨ２）ｍ−である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  12. Ｌが−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物のコンジュゲート。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体−薬物のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
  14. 癌を患っているヒトに、有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体−薬物のコンジュゲート、または請求項１３に記載の医薬組成物を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
  15. 式Ａ、ＢまたはＣ：
    Figure 2015500287
     ［式中、
    Ｒはハロまたはヒドロキシルで置換されてもよいＣ１−６アルキル；ハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで置換されてもよいフェニル；ハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで置換されてもよいナフチル；あるいはハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで置換されてもよい２−ピリジルであり、
    Ｌは−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−であり、
    ＣＴＸはアミド結合でＬに結合したサイトトキシンであり、および
    ｍは１〜１２の整数である］
    で示される、リンカー−サイトトキシンのコンジュゲート。
  16. 式Ａで示される、請求項１５記載のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート。
  17. 式Ｂで示される、請求項１５記載のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート。
  18. 式Ｃで示される、請求項１５記載のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート。
  19. Ｒがハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで置換されてもよい２−ピリジルである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート。
  20. Ｒが２−ピリジルである、請求項１９記載のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート。
  21. ＣＴＸが、オーリスタチン、カリケアマイシン、メイタンシノイド、またはツブリシンである、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート。
  22. ＣＴＸが、モノメチルオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＦ、カリケアマイシンγ、メルタンシン、ツブリシンＴ３、またはツブリシンＴ４である、請求項２１に記載のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート。
  23. Ｌが−（ＣＨ２）ｍ−である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート。
  24. Ｌが−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載のリンカー−サイトトキシンのコンジュゲート。
  25. 式ＡＡ、ＢＢまたは式ＣＣ：
    Figure 2015500287
     ［式中、
    Ｒはハロまたはヒドロキシルで置換されてもよいＣ１−６アルキル；ハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで置換されてもよいフェニル；ハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで置換されてもよいナフチル；あるいはハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、Ｃ１−３アルコキシカルボニル、またはＣ１−３アルキルで置換されてもよい２−ピリジルであり、
    Ｌは−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−であり、
    Ｚはカルボキシル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルまたはアミノであり、および
    ｍは１〜１２の整数である］
    で示される、リンカー。
  26. 式ＡＡで示される、請求項２５記載のリンカー。
  27. 式ＢＢで示される、請求項２５記載のリンカー。
  28. 式ＣＣで示される、請求項２５記載のリンカー。
  29. Ｒが２−ピリジルである、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のリンカー。
  30. Ｌが−（ＣＨ２）ｍ−である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のリンカー。
  31. Ｌが−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載のリンカー。
  32. Ｚがカルボキシルである、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載のリンカー。
  33. ＺがＣ１−６アルコキシカルボニルである、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載のリンカー。
  34. Ｚがアミノである、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載のリンカー。
  35. 式ＡＡＡ、ＢＢＢまたはＣＣＣ：
    Figure 2015500287
     ［式中、
    Ｒ’はクロロ、ブロモ、ヨード、Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、または４−トルエンスルホニルオキシであり、
    Ｌは−（ＣＨ２）ｍ−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−であり、
    Ｚはカルボキシル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルまたはアミノであり、および
    ｍは１〜１２の整数である］
    で示されるリンカー。
  36. 式ＡＡＡで示される、請求項３５記載のリンカー。
  37. 式ＢＢＢで示される、請求項３５記載のリンカー。
  38. 式ＣＣＣで示される、請求項３５記載のリンカー。
  39. Ｌが−（ＣＨ２）ｍ−である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のリンカー。
  40. Ｌが−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のリンカー。
  41. Ｚがカルボキシルである、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のリンカー。
  42. ＺがＣ１−６アルコキシカルボニルである、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のリンカー。
  43. Ｚがアミノである、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のリンカー。
  44. Ｒ’がクロロ、ブロモ、またはヨードである、請求項３５〜４３のいずれか一項に記載のリンカー。
  45. Ｒ’がブロモである、請求項４４記載のリンカー。
  46. 式Ｔ３：
    Figure 2015500287
     で示される、ツブリシン化合物。
  47. 式Ｔ４：
    Figure 2015500287
     で示される、ツブリシン化合物。
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