JP2015199693A - Liver regenerative capacity improver for non-alcoholic fatty liver disease and/or non-alcoholic steatohepatitis - Google Patents
Liver regenerative capacity improver for non-alcoholic fatty liver disease and/or non-alcoholic steatohepatitis Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝炎における肝再生能の低下を改善する肝再生能改善剤に関する。 The present invention relates to an agent for improving liver regeneration ability, which improves a decrease in liver regeneration ability in nonalcoholic fatty liver disease and / or nonalcoholic steatohepatitis.
非アルコール性脂肪性肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease：NAFLD）とは、脂肪性肝疾患の原因がアルコール性ではない類型である。具体的には、アルコール量として２０ｇ/日以下のアルコール摂取量で、ウイルス性肝炎や自己免疫性肝炎など原因を有さず、肝への脂肪沈着を認める疾患を非アルコール性脂肪性肝疾患としている。非アルコール性脂肪性肝疾患は、単純性脂肪肝の病態から、非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis：NASH）に進行する。非アルコール性脂肪肝炎は、炎症、肝細胞壊死、風船様変化、又は線維化を伴う病態であり、非アルコール性脂肪性肝疾患の重症型と考えられている。 Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a type in which the cause of fatty liver disease is not alcoholic. Specifically, a non-alcoholic fatty liver disease is a disease in which the amount of alcohol consumed is 20 g / day or less, has no cause such as viral hepatitis or autoimmune hepatitis, and fat deposition in the liver is recognized. Yes. Nonalcoholic steatohepatitis progresses from simple fatty liver pathology to nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Nonalcoholic steatohepatitis is a pathological condition accompanied by inflammation, hepatocyte necrosis, balloon-like changes, or fibrosis, and is considered a severe form of nonalcoholic fatty liver disease.
非特許文献１には、脂肪性肝疾患では肝切除後の肝再生が阻害されることが開示されている。すなわち、一般に、肝臓には一部切除されても元の大きさに再生する機能（肝再生能）があるが、非アルコール性脂肪肝炎の肝臓はこの肝再生能が著しくて低下していることが指摘されている。 Non-Patent Document 1 discloses that liver regeneration after hepatectomy is inhibited in fatty liver disease. That is, in general, the liver has a function of regenerating to the original size even if partly excised (liver regeneration ability), but the liver regeneration ability of nonalcoholic steatohepatitis is significantly reduced. Has been pointed out.
一方、非特許文献２には、肥満が小胞体ストレスを引き起こし、小胞体ストレスによりインスリン受容体シグナル伝達が抑制されることが示されている。また、非特許文献３には、4-フェニル酪酸（PBA）やタウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）を使用して小胞体ストレス応答を阻害することで、虚血性再灌流下の部分切除において、脂肪肝及び非脂肪肝ともに肝再生を改善したことが開示されている。小胞体ストレス応答とは、折り畳み不全のタンパク質（unfolded proteins）が蓄積する状態（小胞体ストレス）に起因して、これを回避するための防御システム（翻訳抑制、小胞体分子シャペロン翻訳誘導、異常タンパク質分解、アポトーシス誘導）を活性化させる機構である。
On the other hand, Non-Patent
上述したように、PBAやTUDCAにより小胞体ストレスを阻害することで肝再生が改善することが非特許文献３に記載されるものの、NAFLDやNASHにおける肝再生障害と小胞体ストレスとの関連について詳細は未知であった。そこで、本発明は、NAFLDやNASHにおける肝再生障害を改善できる肝再生能改善剤を提供することを目的とする。
As described above, although
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、小胞体ストレス応答のうち、RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ（PERK）を小胞体ストレスセンサーとする経路を阻害することで、NAFLDやNASHにおける肝再生障害を改善できることを見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies by the present inventors in order to achieve the above-mentioned object, by inhibiting the pathway that uses RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) as an endoplasmic reticulum stress sensor in the endoplasmic reticulum stress response. The present inventors have found that hepatic regeneration disorder in NAFLD and NASH can be improved, and the present invention has been completed.
本発明は以下を包含する。
（１）小胞体ストレス応答の経路のうち、RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ（PERK）を小胞体ストレスセンサーとする経路を阻害する、肝再生能改善剤。
（２）RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼのリン酸化を阻害する又は脱リン酸化する、真核生物翻訳開始因子２のαサブユニット（eIF2α）のリン酸化を阻害する又は脱リン酸化する、若しくは転写因子ATF4による転写促進活性を阻害する、ことを特徴とする（１）記載の肝再生能改善剤。
（３）真核生物翻訳開始因子２のαサブユニット（eIF2α）を脱リン酸化することを特徴とする（１）記載の肝再生能改善剤。
（４）増殖停止/DNA損傷誘導性タンパク質34（growth arrest and DNA damage-inducible protein 34：GADD34）をコードする遺伝子を発現可能に含むベクターであることを特徴とする（１）記載の肝再生能改善剤。
（５）上記ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターであることを特徴とする（４）記載の肝再生能改善剤。
（６）非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝における肝再生能を改善することを特徴とする（１）乃至（５）いずれか記載の肝再生能改善剤。
The present invention includes the following.
(1) A liver regenerative ability improver that inhibits an RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) as an endoplasmic reticulum stress sensor among endoplasmic reticulum stress response pathways.
(2) inhibiting or dephosphorylating phosphorylation of RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase, inhibiting phosphorylation of α subunit (eIF2α) of eukaryotic
(3) The liver regeneration ability improving agent according to (1), wherein the α subunit (eIF2α) of eukaryotic
(4) The liver regeneration ability according to (1), characterized in that it is a vector that can express a gene encoding growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34). Improver.
(5) The liver regeneration ability improving agent according to (4), wherein the vector is an adeno-associated virus vector.
(6) The liver regeneration ability improving agent according to any one of (1) to (5), wherein the liver regeneration ability in nonalcoholic fatty liver disease and / or nonalcoholic fatty liver is improved.
本発明によれば、非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝において低下する肝再生能を改善することができる。すなわち、本発明に係る肝再生能改善剤を利用することで、非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝における肝再生能が改善するため、当該疾患に対して例えば部分的肝切除術を行った後の予後を良好にすることができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the liver regeneration ability which reduces in nonalcoholic fatty liver disease and / or nonalcoholic fatty liver can be improved. That is, since the liver regeneration ability in nonalcoholic fatty liver disease and / or nonalcoholic fatty liver is improved by using the liver regeneration ability improving agent according to the present invention, for example, a partial response to the disease is provided. Prognosis after hepatectomy can be improved.
以下、本発明に係る肝再生能改善剤について詳細に説明する。
本発明に係る肝再生能改善剤は、小胞体ストレス応答の経路のうち、RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ（PERK）を小胞体ストレスセンサーとする経路を阻害するものである。
Hereinafter, the liver regeneration ability improving agent according to the present invention will be described in detail.
The liver regenerating ability improving agent according to the present invention inhibits a pathway using an RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) as an endoplasmic reticulum stress sensor among the endoplasmic reticulum stress response pathways.
ここで、小胞体ストレス応答とは、細胞に対して小胞体ストレスが負荷されると、小胞体ストレスを緩和・回避するための機構が活性化することをいう。小胞体ストレスを緩和・回避するための機構とは、特に限定されないが、新たな翻訳抑制、小胞体分子シャペロン翻訳誘導、異常タンパク質分解及びアポトーシス誘導を挙げることができる。 Here, the endoplasmic reticulum stress response means that when endoplasmic reticulum stress is applied to a cell, a mechanism for relieving and avoiding the endoplasmic reticulum stress is activated. The mechanism for alleviating and avoiding endoplasmic reticulum stress is not particularly limited, and examples thereof include new translational inhibition, endoplasmic reticulum molecular chaperone translation induction, abnormal proteolysis, and apoptosis induction.
小胞体ストレス応答には、図１に示すように、３種類の独立した小胞体ストレスセンサーが含まれる。これら小胞体ストレスセンサーが小胞体ストレスをセンシングすることで、小胞体ストレス応答が開始することとなる。３種類の小胞体ストレスセンサーとは、RNA依存性プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ（PKR-like ER kinase: PERK）、イノシトール要求性酵素１（inositol-requiring enzyme 1: IRE1）、及び活性型転写因子６（activating transcription factor 6: ATF6）である。本発明では、これら３種類の小胞体ストレスセンサーのうちPERKからの小胞体ストレス応答経路を抑制することで、非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝における肝再生能を改善する。 The endoplasmic reticulum stress response includes three independent endoplasmic reticulum stress sensors, as shown in FIG. The endoplasmic reticulum stress response starts when these endoplasmic reticulum stress sensors sense endoplasmic reticulum stress. The three types of endoplasmic reticulum stress sensors are RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase (PERK), inositol-requiring enzyme 1: IRE1, and active transcription factor 6 (Activating transcription factor 6: ATF6). In the present invention, by suppressing the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK among these three types of endoplasmic reticulum stress sensors, liver regeneration ability in nonalcoholic fatty liver disease and / or nonalcoholic fatty liver is improved. To do.
PERKからの小胞体ストレス応答経路とは、先ず、小胞体ストレスの負荷により、1回膜貫通型タンパクであるPERKの活性化から始まる。PERKの活性化とは、GRP78/BiPとヘテロダイマーを形成した非活性化状態から、GRP78/BiPが解離し、PERKがオリゴマーを形成して自己リン酸化することと同義である。PERKからの小胞体ストレス応答経路では、次に、活性化したPERKが翻訳開始因子の一つであるeIF2α(eukaryotic initiation factor 2α)をリン酸化する。すなわち、eIF2αのリン酸化によって、eIF2αを含む翻訳開始複合体が形成されず、当該複合体によるmRNAの翻訳が抑制される。また、PERKからの小胞体ストレス応答経路では、PERKの活性化及びeIF2αのリン酸化とともに、活性型転写因子４（activating transcription factor 4: ATF4）の翻訳量が増加する。ATF4をコードするmRNAは、5’側非翻訳領域には複数の短いORF（open reading frame）があり、その下流にATF4のコーディング領域があるという構造を有している。小胞体ストレスのない状態では、リボソームが複数の短いORFを翻訳した後にmRNAから離れ、ATF4のコーディング領域の翻訳が起こらない。小胞体ストレスが負荷された状態では、複数の短いORFの翻訳は起こらず、ATF4のコーディング領域の翻訳が起こる。転写因子であるATF4は、アポトーシスに関わる転写因子であるCHOP（C/EBP-homologous protein）、アスパラギン酸合成酵素遺伝子（ASNS）、転写リプレッサーであるATF3（activating transcription factor 3）遺伝子等の転写を促進することが知られている。 The endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK begins with the activation of PERK, which is a single transmembrane protein, under the load of endoplasmic reticulum stress. Activation of PERK is synonymous with GRP78 / BiP dissociating from an inactivated state in which heterodimer is formed with GRP78 / BiP, and PERK forms an oligomer to self-phosphorylate. In the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK, activated PERK then phosphorylates eIF2α (eukaryotic initiation factor 2α), which is one of translation initiation factors. That is, phosphorylation of eIF2α does not form a translation initiation complex containing eIF2α, and mRNA translation by the complex is suppressed. In the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK, the translation amount of activating transcription factor 4: ATF4 increases with activation of PERK and phosphorylation of eIF2α. The mRNA encoding ATF4 has a structure in which there are a plurality of short ORFs (open reading frames) in the 5'-side untranslated region and an ATF4 coding region downstream thereof. In the absence of endoplasmic reticulum stress, the ribosome translates multiple short ORFs, then leaves the mRNA and does not translate the coding region of ATF4. When endoplasmic reticulum stress is applied, translation of multiple short ORFs does not occur, but translation of the coding region of ATF4 occurs. ATF4, a transcription factor, transcribes transcription of COP (C / EBP-homologous protein), aspartate synthase gene (ASNS), transcription repressor ATF3 (activating transcription factor 3) gene, which is involved in apoptosis. It is known to promote.
以上のように、PERKからの小胞体ストレス応答経路とは、PERKの活性化から、eIF2αが関与する翻訳抑制及びATF4による各種遺伝子の転写促進を含む意味である。したがって、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害するとは、PERKの活性化を阻害すること、eIF2αのリン酸化を阻害すること、リン酸化したeIF2αの脱リン酸化を促進すること、ATF4の転写促進活性を阻害することを意味する。特に、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害するには、これらPERK活性化の阻害、eIF2αのリン酸化の阻害、リン酸化したeIF2αの脱リン酸化の促進及びATF4の転写促進活性の阻害から選ばれる少なくとも１以上の事象を引き起こすことを意味する。 As described above, the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK is meant to include translational repression involving eIF2α and transcriptional promotion of various genes by ATF4 from activation of PERK. Therefore, inhibiting the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK means inhibiting PERK activation, inhibiting eIF2α phosphorylation, promoting dephosphorylation of phosphorylated eIF2α, and promoting transcription of ATF4 Means inhibiting activity. In particular, to inhibit the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK, select from inhibition of PERK activation, inhibition of phosphorylation of eIF2α, promotion of dephosphorylation of phosphorylated eIF2α, and inhibition of transcription promotion activity of ATF4 Cause at least one or more events to occur.
よって、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害するには、PERK、eIF2α、eIF2αにより翻訳される遺伝子群、ATF4及びATF4により転写制御される遺伝子群をターゲットとすることができる。 Therefore, in order to inhibit the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK, a gene group translated by PERK, eIF2α, eIF2α, and a gene group transcriptionally controlled by ATF4 and ATF4 can be targeted.
<PERKをターゲットとする場合>
より具体的に、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害する際にPERKをターゲットとするとは、PERKとGRP78/BiPとの解離を阻害すること、PERKのオリゴマー形成を阻害すること、PERKの自己リン酸化を阻害することのいずれでも良い。また、siRNA法やアンチセンスオリゴヌクレチド法といった従来公知の手法により、PERKをコードする遺伝子をノックダウンすることで、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害してもよい。
<When targeting PERK>
More specifically, targeting PERK when inhibiting the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK includes inhibiting dissociation of PERK and GRP78 / BiP, inhibiting PERK oligomerization, and PERK self Any of inhibiting phosphorylation may be sufficient. Alternatively, the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK may be inhibited by knocking down a gene encoding PERK by a conventionally known method such as siRNA method or antisense oligonucleotide method.
なお、PERKとGRP78/BiPとの解離を阻害するには、特に限定されないが、例えばGRP78/BiPを始めとした化学シャペロンを含むシャペロンの細胞内発現レベルの増加といった手法を適用することができる。 In addition, although it does not specifically limit in order to inhibit dissociation of PERK and GRP78 / BiP, For example, methods, such as an increase in the intracellular expression level of chaperones including chemical chaperones including GRP78 / BiP, can be applied.
<eIF2αをターゲットとする場合>
PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害する際にeIF2αをターゲットとするとは、オリゴマーを形成して自己リン酸化したPERKによるeIF2αのリン酸化を阻害すること、リン酸化eIF2αの脱リン酸化を促進することのいずれであっても良い。
<When targeting eIF2α>
Targeting eIF2α in inhibiting the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK is to inhibit phosphorylation of phosphorylated eIF2α by inhibiting the phosphorylation of eIF2α by PERK that has been oligomerized and autophosphorylated Any of these may be used.
PERKによるeIF2αのリン酸化を阻害するには、例えば、PERKの活性阻害作用を有する低分子化合物や抗体を投与するといった手法を適用することができる。また、リン酸化eIF2αの脱リン酸化を促進するには、特に限定されないが、例えば、リン酸化eIF2αを基質とする脱リン酸化酵素をコードする遺伝子を導入する、当該脱リン酸化酵素の活性を亢進する作用を有する分子を投与するといった手法を適用することができる。 In order to inhibit the phosphorylation of eIF2α by PERK, for example, a technique of administering a low molecular compound or an antibody having an activity of inhibiting PERK activity can be applied. In addition, although there is no particular limitation on promoting dephosphorylation of phosphorylated eIF2α, for example, by introducing a gene encoding a dephosphorylation enzyme using phosphorylated eIF2α as a substrate, the activity of the dephosphorylation enzyme is enhanced. It is possible to apply a technique such as administering a molecule having an action to act.
リン酸化eIF2αを基質とする脱リン酸化酵素をコードする遺伝子としては、例えば、GADD34（growth-arrest DNA damage gene 34）遺伝子を挙げることができる。GADD34はプロテインフォスファターゼ１と複合体を形成し、リン酸化eIF2αを脱リン酸化する。なお、GADD34遺伝子は、PERKからの小胞体ストレス応答経路が活性化したときに転写促進される遺伝子であって、eIF2αのリン酸化による翻訳反応停止を正常化するようにフィードバック制御するものである。 Examples of a gene encoding a dephosphorylation enzyme using phosphorylated eIF2α as a substrate include a GADD34 (growth-arrest DNA damage gene 34) gene. GADD34 forms a complex with protein phosphatase 1 and dephosphorylates phosphorylated eIF2α. The GADD34 gene is a gene whose transcription is promoted when the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK is activated, and is feedback-controlled so as to normalize the termination of translation reaction due to phosphorylation of eIF2α.
<ATF4をターゲットとする場合>
PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害する際にATF4をターゲットとするとは、ATF4のmRNAのうち5’側非翻訳領域に存在する複数の短いORFの転写を促進し、下流に存在するATF4のコーディング領域の転写を抑制すること、翻訳されたATF4による転写促進作用を阻害することのいずれであっても良い。
<When targeting ATF4>
Targeting ATF4 when inhibiting the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK is to promote transcription of multiple short ORFs present in the 5'-untranslated region of the ATF4 mRNA, and downstream of ATF4 Either the transcription of the coding region may be suppressed, or the transcription promoting action by the translated ATF4 may be inhibited.
ATF4のmRNAのうち5’側非翻訳領域に存在する複数の短いORFの転写を促進し、下流に存在するATF4のコーディング領域の転写を抑制するには、特に限定されないが、例えば、siRNA法やアンチセンスオリゴヌクレチド法といった従来公知の手法を適用することができる。翻訳されたATF4による転写促進作用を阻害するには、例えば、ATF4を特異的に阻害する低分子化合物や抗体を投与するといった手法を適用することができる。 The ATF4 mRNA is not particularly limited to promote transcription of a plurality of short ORFs present in the 5 ′ untranslated region and to suppress transcription of the downstream ATF4 coding region, for example, siRNA method or A conventionally known method such as an antisense oligonucleotide method can be applied. In order to inhibit the transcription promoting action by the translated ATF4, for example, a technique of administering a low molecular weight compound or an antibody that specifically inhibits ATF4 can be applied.
<GADD34遺伝子の遺伝子導入>
より具体的な一例として、GADD34遺伝子を導入することでリン酸化eIF2αの脱リン酸化を促進する方法について詳述する。ここで、ヒト由来GADD34遺伝子のコーディング領域の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。なお、マウス由来GADD34遺伝子のコーディング領域の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。また、ヒト及びマウス以外の哺乳類動物のGADD34遺伝子に関して、コーディング領域の塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBankデータベース等の遺伝子関連情報を格納した公知のデータベースより入手することができる。
<GADD34 gene transfer>
As a more specific example, a method for promoting dephosphorylation of phosphorylated eIF2α by introducing the GADD34 gene will be described in detail. Here, the base sequence and amino acid sequence of the coding region of the human-derived GADD34 gene are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. The base sequence and amino acid sequence of the coding region of the mouse-derived GADD34 gene are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively. Further, regarding the GADD34 gene of mammals other than humans and mice, the base sequence and amino acid sequence of the coding region are known and can be obtained from a known database storing gene-related information such as the GenBank database.
本発明に係る肝再生能改善剤は、ヒトを含む哺乳類動物の医薬として適用することができる。本発明に係る肝再生能改善剤を使用する哺乳類動物に応じて、適宜、GADD34遺伝子を選択することが好ましい。 The liver regeneration ability improving agent according to the present invention can be applied as a pharmaceutical for mammals including humans. It is preferable to appropriately select the GADD34 gene according to the mammal using the liver regeneration ability improving agent according to the present invention.
例えば、ヒトの治療を行なうためには、ヒト由来GADD34遺伝子を用いることが望ましい。すなわち、この場合、配列番号１及び２にて特定されるGADD34遺伝子を用いることが望ましい。ただし、ヒトの治療目的であっても、使用するGADD34遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子に限定されず、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、リン酸化eIF2αを脱リン酸化する活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。ここで複数個とは、２〜７０個のアミノ酸とすることができ、２〜６０個のアミノ酸とすることが好ましく、２〜５０個のアミノ酸とすることがより好ましく、２〜４０個のアミノ酸とすることが更に好ましく、２〜３０個のアミノ酸とすることが更に好ましく、２〜２０個のアミノ酸とすることが更に好ましく、２〜１０個のアミノ酸とすることが更に好ましく、２〜５個のアミノ酸とすることが更に好ましい。 For example, it is desirable to use a human-derived GADD34 gene in order to treat humans. That is, in this case, it is desirable to use the GADD34 gene specified by SEQ ID NOS: 1 and 2. However, even for human therapeutic purposes, the GADD34 gene used is not limited to the gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and for example, one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 May encode a protein having an amino acid sequence substituted, deleted and / or added and having an activity of dephosphorylating phosphorylated eIF2α. The term “plurality” as used herein refers to 2 to 70 amino acids, preferably 2 to 60 amino acids, more preferably 2 to 50 amino acids, and 2 to 40 amino acids. More preferably, it is 2-30 amino acids, more preferably 2-20 amino acids, still more preferably 2-10 amino acids, 2-5 More preferably, the amino acid is
また、ヒトの治療目的であっても、使用するGADD34遺伝子としては、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子に限定されず、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、より好ましくは９０％以上の配列同一性、更に好ましくは９５％以上の配列同一性、或いは更に好ましくは９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、リン酸化eIF2αを脱リン酸化する活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。ここで配列同一性の値は、配列番号２のアミノ酸配列（６７４個）とのペアワイズアライメントを行い、完全に一致するアミノ酸残基の割合として算出することができる。 In addition, even for human therapeutic purposes, the GADD34 gene used is not limited to the gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, for example, 70% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Amino acids having sequence identity, preferably 80% or more sequence identity, more preferably 90% or more sequence identity, more preferably 95% or more sequence identity, or more preferably 97% or more sequence identity It may encode a protein having a sequence and having an activity of dephosphorylating phosphorylated eIF2α. Here, the value of sequence identity can be calculated as the ratio of amino acid residues that are completely matched by performing pairwise alignment with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (674).
さらに、ヒトの治療目的であっても、使用するGADD34遺伝子としては、配列番号１に示す塩基配列をコーディング領域と有する遺伝子に限定されず、配列番号１に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、リン酸化eIF2αを脱リン酸化する活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。ストリンジェントな条件とは、例えば、通常、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であるが、これらの条件に特に制限されるものではない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。ハイブリダイゼーションは、例えばMolecular Cloning: A laboratory Manual, 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,などに記載されている方法に準じて行うことができる。 Furthermore, even for human therapeutic purposes, the GADD34 gene to be used is not limited to a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a coding region, but is a string against the complementary strand of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It may consist of a polynucleotide that hybridizes under a gentle condition and encodes a protein having an activity of dephosphorylating phosphorylated eIF2α. The stringent conditions are, for example, usually 42 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS, preferably 50 ° C., 2 × SSC, 0.1% SDS, and more preferably The conditions are 65 ° C., 0.1 × SSC, and 0.1% SDS, but are not particularly limited to these conditions. Factors affecting the stringency of hybridization include a plurality of factors such as temperature and salt concentration, and those skilled in the art can realize optimum stringency by appropriately selecting these factors. Hybridization can be performed according to the method described in, for example, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
なお、配列番号２と異なるアミノ酸配列を有するタンパク質や、配列番号１に示す塩基配列以外の塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が、リン酸化eIF2αを脱リン酸化する活性を有するかについては、例えば、Mol. Cell Biol. 2003 Feb;23(4):1292-1303.に記載された方法に従って検討することができる。 Whether a protein having an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2 or a protein encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence other than the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 has an activity to dephosphorylate phosphorylated eIF2α. For example, it can be examined according to the method described in Mol. Cell Biol. 2003 Feb; 23 (4): 1292-1303.
本発明に係る肝再生能改善剤は、上述したGADD34遺伝子をベクターに組み入れ、当該ベクターを用いて肝臓において発現させることができるように調製することができる。ベクターとしては、特に限定されず、ヒトに使用することができる各種ベクターを用いることができる。ベクターとしては、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターのいずれを用いてもよい。これらのうち、ウイルスベクターを用いることが好ましい。ウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどが利用可能であるが、これらのうち、AAVベクターが好ましい。AAVベクターは安全性が高く、比較的長期の遺伝子発現を期待できることから特に好ましく用いられる。アデノ随伴ウイルスとしては、1型AAVウイルス（AAV1）、2型AAVウイルス（AAV2）、3型AAVウイルス（AAV3）、4型AAVウイルス（AAV4）、又は5型AAVウイルス（AAV5）などが知られているが、AAVベクターの製造にはいずれを用いることも可能である。例えば、AAV3の塩基配列はGene Bankに登録されており（NC_001729）、文献にも記載されている（Virology, 221, pp.208-217, 1996）。総説として、神経進歩, 45, pp.92-103, 2001又は実験医学, 20, pp.1296-1300, 2002などを参照することができる。これらの刊行物の開示及びこれらの刊行物に引用された文献の開示のすべてを参照により本発明の開示に含める。
The liver regeneration ability improving agent according to the present invention can be prepared so that the GADD34 gene described above can be incorporated into a vector and expressed in the liver using the vector. The vector is not particularly limited, and various vectors that can be used for humans can be used. As the vector, either a viral vector or a non-viral vector may be used. Of these, it is preferable to use a viral vector. As a viral vector, an adeno-associated virus (AAV) vector, a lentiviral vector, a herpes virus vector, and the like can be used. Of these, an AAV vector is preferable. AAV vectors are particularly preferably used because they are highly safe and can expect relatively long-term gene expression. Known adeno-associated viruses include type 1 AAV virus (AAV1),
本発明に係る肝再生能改善剤は特に限定されないが、AAVベクターを用いる場合には、以下の方法に従って組換えベクターを調製することができる。以下、本発明の好ましい態様としてAAVベクターを用いる場合について具体的に説明するが、本発明の範囲はAAVベクターを用いる場合に限定されることはない。上述したGADD34遺伝子をサイトロメガロウイルス(CMV)プロモーター領域とSV40のpolyA領域の間に挿入して3型AAV（AAV3）ウイルスゲノムの両端に存在するinverted terminal repeat (ITR)配列とともにプラスミドに組み込むことによりベクタープラスミドを調製する。上記のベクタープラスミド、パッケージングプラスミド（AAVの非構造蛋白質であるRepとカプシド蛋白であるVPを発現するためのプラスミド）、及びヘルパープラスミド（アデノウイルス由来の塩基配列でE2A、E4、及びVA領域を含む）の３種類のプラスミドをヒト腎由来のHEK293細胞にトランスフェクトすることにより、GADD34遺伝子を含むAAVベクターを調製することができる。
The liver regeneration ability improving agent according to the present invention is not particularly limited, but when an AAV vector is used, a recombinant vector can be prepared according to the following method. Hereinafter, the case where an AAV vector is used as a preferred embodiment of the present invention will be specifically described. However, the scope of the present invention is not limited to the case where an AAV vector is used. Insert the above GADD34 gene between the cytomegalovirus (CMV) promoter region and the SV40 polyA region and incorporate it into the plasmid together with the inverted terminal repeat (ITR) sequences present at both ends of the
<非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝>
本発明に係る肝再生能改善剤は、非アルコール性脂肪性肝疾患及び/又は非アルコール性脂肪性肝における肝切除後の肝臓再生不良（肝再生能の阻害）を改善する効果を有している。
<Non-alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic fatty liver>
The liver regeneration ability improving agent according to the present invention has an effect of improving non-alcoholic fatty liver disease and / or poor liver regeneration (inhibition of liver regeneration ability) after hepatectomy in non-alcoholic fatty liver. Yes.
ここで、非アルコール性脂肪性肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD）とは、肝細胞に脂肪(中性脂肪)が沈着して肝障害を引き起こす脂肪性肝疾患のうち、飲酒歴はないがアルコール性肝障害に類似した脂肪性肝障害がみられる病態を意味する。なお、脂肪肝とは、肝臓に脂肪が過剰に蓄積した状態であり、肝臓内の肝細胞の３０％以上に脂肪空胞が認められる状態と定義することができる。また、飲酒歴がないとは、例えば１日あたりアルコール摂取量がエタノール換算で20g以下の場合を意味する。 Here, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a fatty liver disease that causes liver damage by depositing fat (neutral fat) in hepatocytes. It means a condition in which fatty liver disorder similar to alcoholic liver disorder is observed. Fatty liver is a state in which fat is excessively accumulated in the liver, and can be defined as a state in which fatty vacuoles are observed in 30% or more of the hepatocytes in the liver. Moreover, having no history of drinking means, for example, a case where the alcohol intake per day is 20 g or less in terms of ethanol.
ここで、非アルコール性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis: NASH）とは、NAFLDにおける脂肪沈着とともに炎症や線維化がおこる脂肪性肝炎に進行した病態を意味する。すなわち、NAFLDは肝細胞に脂肪が沈着するのみの単純性脂肪肝と、NASHとに大別される。 Here, nonalcoholic steatohepatitis (NASH) means a disease state that has progressed to steatohepatitis in which inflammation and fibrosis occur along with fat deposition in NAFLD. That is, NAFLD is roughly classified into simple fatty liver in which fat is deposited in hepatocytes and NASH.
本発明に係る肝再生能改善剤は、NAFLD及び/又はNASHと診断された患者、特にNASHと診断された患者であって、肝臓の部分切除を予定する患者或いは肝臓の部分切除術を行った患者に対して投与される。本発明に係る肝再生能改善剤の投与量は、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害する際のターゲット（PERK、eIF2α、eIF2αにより翻訳される遺伝子群、ATF4及びATF4により転写制御される遺伝子群）により異なり、また、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、NASH進行度によって異なる。一例として、上述したGADD34遺伝子をクローニングしたアデノ随伴ウイルスベクターを肝再生能改善剤として使用する場合、例えば、肝臓組織重量で約1×105〜約1×1010PFU/gとなるように、好ましくは約1×106〜約1×109PFU/gとなるように、より好ましくは約1×107〜約1×108PFU/gとなるように投与する。 The liver regenerative ability improving agent according to the present invention is a patient diagnosed with NAFLD and / or NASH, particularly a patient diagnosed with NASH, who is scheduled to undergo partial resection of the liver, or has undergone partial resection of the liver It is administered to patients. The dosage of the liver regenerating ability improving agent according to the present invention is determined by the target for inhibiting the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK (PERK, eIF2α, genes translated by eIF2α, genes transcriptionally controlled by ATF4 and ATF4 It depends on the age of the patient, sex, symptoms, route of administration, frequency of administration, and NASH progression. As an example, when using the above-mentioned adeno-associated virus vector in which the GADD34 gene is cloned as a liver regeneration ability improving agent, for example, so that the liver tissue weight is about 1 × 10 5 to about 1 × 10 10 PFU / g, Preferably, the dose is about 1 × 10 6 to about 1 × 10 9 PFU / g, more preferably about 1 × 10 7 to about 1 × 10 8 PFU / g.
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
〔実施例１〕
本実施例では、マウス由来GADD34遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルスベクター（以下、pAAV-Flag-Gadd34 Expression vector）を作製し、肥満糖尿病モデルであるレプチン受容体欠損肥満マウス（db/dbマウス）に当該アデノ随伴ウイルスベクターを投与して、肝再生能の改善効果について検証した。また、db/dbマウスとの比較のため、痩せたマウス（Leanマウス）としてC57BLKsJ db/+mを使用した。
[Example 1]
In this example, an adeno-associated virus vector (hereinafter referred to as pAAV-Flag-Gadd34 Expression vector) that expresses a mouse-derived GADD34 gene was prepared, and this was applied to a leptin receptor-deficient obese mouse (db / db mouse) that is an obese diabetes model. Adeno-associated virus vector was administered to verify the effect of improving liver regeneration ability. For comparison with db / db mice, C57BLKsJ db / + m was used as a lean mouse (Lean mouse).
本実施例で作製したpAAV-Flag-Gadd34 Expression vectorは、Cell Biolabs社の商品名AAVヘルパーフリー発現システムを使用して作製した。特に、GADD34遺伝子（配列番号３及び４）については、以下の一対のプライマー： 5’-CAGGAATTCGCCCCGAGCCCAAGACCCCAG-3’(Forward：配列番号５)及び5’-ATGCTCGAGTTAGCCCCGCCTCCCTCCCAAGTAC-3’(Reverse：配列番号６)を使用してマウスゲノムを鋳型として増幅した。得られたGADD34遺伝子をpcDNA3.1-Flag VectorのEcoRI、XhoIサイトに挿入した。Flag-Gadd34をBamHI及びXhoI にて切り出し、当該キットに含まれるpAAV-MCS Expression VectorのBamHI, XhoIサイトに挿入することでpAAV-Flag-Gadd34 Expression vectorを作製した。なお、当該キットには、pAAV-DJ Vector、pHelper Vector及びpAAV-GFP Control Vectorが含まれている。 The pAAV-Flag-Gadd34 Expression vector prepared in this Example was prepared using a product name AAV helper free expression system manufactured by Cell Biolabs. In particular, for the GADD34 gene (SEQ ID NO: 3 and 4), the following pair of primers: 5′-CAGGAATTCGCCCCGAGCCCAAGACCCCAG-3 ′ (Forward: SEQ ID NO: 5) and 5′-ATGCTCGAGTTAGCCCCGCCTCCCTCCCAAGTAC-3 ′ (Reverse: SEQ ID NO: 6) Used to amplify the mouse genome as a template. The obtained GADD34 gene was inserted into EcoRI and XhoI sites of pcDNA3.1-Flag Vector. Flag-Gadd34 was excised with BamHI and XhoI, and inserted into the BamHI and XhoI sites of the pAAV-MCS Expression Vector included in the kit to prepare a pAAV-Flag-Gadd34 Expression vector. The kit contains pAAV-DJ Vector, pHelper Vector, and pAAV-GFP Control Vector.
そして、pAAV-Flag-Gadd34 Expression vector (又はpAAV-GFP Control Vector)、pAAV-DJ及びpHelperを、FuGENE6トランスフェクション試薬(Promega社製)を用いてAgilent Technologies社の293AAV細胞にコトランスフェクションした。48〜72時間後、細胞を回収し、凍結融解することによりrAAV-Flag-Gadd34 (又はrAAV-GFP) を得た。なお、本例ではViraBindアデノ随伴ウイルス精製キット(Cell Biolabs, Inc.) にて精製した。 Then, pAAV-Flag-Gadd34 Expression vector (or pAAV-GFP Control Vector), pAAV-DJ and pHelper were cotransfected into Agilent Technologies 293AAV cells using FuGENE6 transfection reagent (Promega). After 48 to 72 hours, the cells were collected and freeze-thawed to obtain rAAV-Flag-Gadd34 (or rAAV-GFP). In this example, purification was performed using a ViraBind adeno-associated virus purification kit (Cell Biolabs, Inc.).
一方、肥満糖尿病モデルであるdb/dbマウス(♂)は、日本エスエルシー株式会社より入手した。7週齢のdb/dbマウス(♂)にrAAV-Flag-Gadd34又はrAAV-GFPを2x107 PFU/gで尾静脈注射した。rAAV投与2週間後に70%肝切除を行なった。肝切除前、及び肝切除48時間後まで12時間ごとに採血し、肝切除48時間後に肝臓を採取した。 On the other hand, db / db mouse (♂), an obese diabetes model, was obtained from Japan SLC. Seven-week-old db / db mice (し た) were injected with rAAV-Flag-Gadd34 or rAAV-GFP at 2 × 10 7 PFU / g via the tail vein. Two weeks after rAAV administration, 70% hepatectomy was performed. Blood was collected before hepatectomy and every 12 hours until 48 hours after hepatectomy, and the liver was collected 48 hours after hepatectomy.
本実施例では、採取した血液に含まれるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT又はGPT）&アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST又はGOT）を測定した。ALT及びASTの測定にはトランスアミナーゼCII-テストワコー (Wako社製) を使用した。 In this example, alanine aminotransferase (ALT or GPT) & aspartate aminotransferase (AST or GOT) contained in the collected blood was measured. For the measurement of ALT and AST, transaminase CII-Test Wako (manufactured by Wako) was used.
肝組織は、protease inhibitor cocktail (Sigma社製) 含有CelLytic MT Cell Lysis Reagent (Sigma社製) で融解した。蛋白量測定後、蛋白量50μgを含む細胞融解液を、SDS-PAGEにて分離後し、ウエスタンブロッティングを行なった。抗Gadd34抗体、抗CHOP抗体 (以上、Santa Cruz Biotechnology社製)、リン酸化Ser51-eIF2α抗体、抗eIF2α抗体、抗Cleaved caspase3抗体、抗caspase3抗体(以上、Cell Signaling Technology社製)、抗GFP抗体（MLB社製）を購入して実験に供した。2次抗体としてRabbit TrueBlot (eBioscience社製) を用いた。 Liver tissue was thawed with CelLytic MT Cell Lysis Reagent (Sigma) containing protease inhibitor cocktail (Sigma). After measuring the amount of protein, a cell lysate containing 50 μg of protein was separated by SDS-PAGE and subjected to Western blotting. Anti-Gadd34 antibody, anti-CHOP antibody (above, Santa Cruz Biotechnology), phosphorylated Ser51-eIF2α antibody, anti-eIF2α antibody, anti-cleaved caspase3 antibody, anti-caspase3 antibody (above, Cell Signaling Technology), anti-GFP antibody ( MLB) was purchased and used for the experiment. Rabbit TrueBlot (manufactured by eBioscience) was used as a secondary antibody.
RNA抽出には、SV Total RNA Isolation System (Promega社製) を用い、cDNA合成には、PrimeScript RT reagent Kit(Takara社製)を用いた。定量的PCRは、CFX384 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories社製)を使用し、SYBR Premix ExTaq2 Kit (Takara社製) により行い、36B4を対照遺伝子として解析した。 For RNA extraction, SV Total RNA Isolation System (Promega) was used, and for cDNA synthesis, PrimeScript RT reagent Kit (Takara) was used. Quantitative PCR was performed using SYBR Premix ExTaq2 Kit (Takara) using CFX384 Real-Time System (Bio-Rad Laboratories), and 36B4 was analyzed as a control gene.
なお、本実施例では、n=4で行なった。データは、means±SEで示した。統計解析は、Student's t-testを用いて行った。また、p < 0.05である場合に有意差があるとした。 In this example, n = 4. Data are expressed as means ± SE. Statistical analysis was performed using Student's t-test. In addition, there was a significant difference when p <0.05.
先ず、db/dbマウスとLeanマウスについて、肝切除後の肝臓体重比を測定した結果を図２に示す。図２に示すように、Leanマウスでは肝切除後48時間で、肝臓体重比が1.6倍に増加したのに対し、db/dbマウスでは変化が見られなかった。また、血漿ALTについては、図３に示すように、db/dbマウスで有意に高い値を示していた。これらの結果から、db/dbマウスでは、肝切除後、肝再生脳が阻害されていることが確認された。なお、この結果は、詳細な結果を示さないが、高脂肪食を与えることで作製した脂肪肝を有する軽度肥満モデルにおいても同様な障害が観察されている。 First, the results of measuring the liver weight ratio after hepatectomy for db / db mice and Lean mice are shown in FIG. As shown in FIG. 2, in the Lean mouse, the liver-body weight ratio increased 1.6-fold 48 hours after hepatectomy, whereas no change was seen in the db / db mouse. Moreover, as shown in FIG. 3, plasma ALT showed a significantly high value in the db / db mouse. From these results, it was confirmed that in the db / db mice, the liver regeneration brain was inhibited after hepatectomy. Although this result does not show a detailed result, a similar disorder has been observed in a mild obesity model having fatty liver prepared by giving a high fat diet.
一方、db/dbマウスにrAAV-Flag-Gadd34を感染させ、肝切除後肝再生障害を評価した結果を図４及び５に示した。図４は、rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウス及びコントロールのrAAV-GFPを感染させたdb/dbマウスについて肝臓体重比を測定した結果を示している。また、図５は、rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウス及びコントロールのrAAV-GFPを感染させたdb/dbマウスについて血漿ALTを測定した結果を示している。 On the other hand, r / AV mice were infected with rAAV-Flag-Gadd34 and the results of evaluation of liver regeneration disorder after hepatectomy are shown in FIGS. FIG. 4 shows the results of measurement of liver weight ratios for db / db mice infected with rAAV-Flag-Gadd34 and db / db mice infected with control rAAV-GFP. FIG. 5 shows the results of measuring plasma ALT for db / db mice infected with rAAV-Flag-Gadd34 and db / db mice infected with control rAAV-GFP.
また、rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウス及びコントロールのrAAV-GFPを感染させたdb/dbマウスについて、抗GFP抗体、抗Gadd34抗体、抗リン酸化Ser51-eIF2α抗体及び抗eIF2α抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を図６に示した。図６に示すように、rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウスでは、Gadd34が過剰発現しており、eIF2αのリン酸化が減衰していることが分かる。 In addition, for db / db mice infected with rAAV-Flag-Gadd34 and control db / db mice infected with rAAV-GFP, anti-GFP antibody, anti-Gadd34 antibody, anti-phosphorylated Ser51-eIF2α antibody and anti-eIF2α antibody The result of Western blotting using was shown in FIG. As shown in FIG. 6, it can be seen that in the db / db mouse infected with rAAV-Flag-Gadd34, Gadd34 is overexpressed and phosphorylation of eIF2α is attenuated.
また、図４及び５に示すように、rAAV-Flag-Gadd34を感染させたdb/dbマウスでは、肝臓/体重比が有意に増加し、血漿ALT値が有意に抑制されていることが明らかとなった。この結果から、Gadd34遺伝子を過剰発現して、PERKからの小胞体ストレス応答経路を阻害することによって、肥満モデルにおける肝切除後の肝再生障害を改善できることが示された。 In addition, as shown in FIGS. 4 and 5, it is clear that in the db / db mice infected with rAAV-Flag-Gadd34, the liver / body weight ratio is significantly increased and the plasma ALT level is significantly suppressed. became. From these results, it was shown that the liver regeneration disorder after hepatectomy in the obesity model can be improved by overexpressing the Gadd34 gene and inhibiting the endoplasmic reticulum stress response pathway from PERK.
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| WO2017130756A1 (en) * | 2016-01-25 | 2017-08-03 | 学校法人 慶應義塾 | Therapeutic drug against intervertebral disk degeneration, targeting endoplasmic reticulum stress |
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