JP2015194360A - Molecular transport element and biomolecule measuring method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、リポソーム内部の物質と選択的に分子相互作用を行う分子をリポソーム内に輸送する分子輸送素子およびその作製方法に関する。 The present invention relates to a molecular transport element for transporting a molecule that selectively interacts with a substance inside a liposome into the liposome and a method for producing the same.
リポソームは、脂質二分子膜(LBL)により形成される球状構造の分子複合体である。リポソームを基本構造とする生体関連の分子複合体(以下、リポソーム類と称する)には、細胞のほか、細胞から放出されるエキソソーム、およびエンベロープを有するウイルスなどがあげられる。通常、これらの生体関連の分子複合体においては、脂質二分子膜に内包される空間に、種々の分子およびこの複合体が包含されている。包含されている分子およびこの複合体は、各生体分子複合体が機能するため、もしくは、自己複製するために必要なものとなっている。例えば、細胞においては、遺伝情報を含有する核などが存在している。また、エキソソームやウイルスには、RNAなどが存在する。 A liposome is a molecular complex having a spherical structure formed by a lipid bilayer (LBL). Examples of biological complex (hereinafter referred to as “liposomes”) having liposome as a basic structure include cells, exosomes released from cells, viruses having envelopes, and the like. Usually, in these biologically relevant molecular complexes, various molecules and this complex are included in the space enclosed in the lipid bilayer membrane. The contained molecule and this complex are necessary for the function of each biomolecular complex or for self-replication. For example, nuclei containing genetic information exist in cells. In addition, RNA and the like exist in exosomes and viruses.
リポソーム類に内包される空間に存在する物質の種類や濃度、およびこれらの時間的変化を追跡することは、生体関連の分子複合体の活動状態を把握するために、非常に有用である。例えば、ヒトのエキソソーム中に存在するマイクロRNA(miRNA)は、遺伝情報は含んでいないが、体内の代謝や疾病に関連して濃度が増減する特定配列を有するmiRNAの存在が報告されている。このため、この特定配列を有するmiRNAを検出することで、これまで早期診断が困難であった疾病の発見や正確な診断を行うことが可能となると考えられている(非特許文献1参照)。 Tracking the type and concentration of substances present in the space encapsulated in liposomes and their temporal changes is very useful for understanding the activity state of biologically related molecular complexes. For example, microRNA (miRNA) present in human exosomes does not contain genetic information, but the presence of miRNA having a specific sequence whose concentration increases or decreases in relation to metabolism and disease in the body has been reported. For this reason, it is thought that the detection of the miRNA which has this specific arrangement | sequence, and the discovery of the disease which had been difficult to diagnose early, and an accurate diagnosis can be performed now (refer nonpatent literature 1).
従来、リポソーム類の内部空間に存在する物質の種類の特定や濃度の特定では、対象となるリポソーム類を、薬剤などを用いて破壊し、内部の物質を抽出・生成していた。例えば、miRNAなどの核酸分子は、抽出・精製した状態の試料を用い、同じ配列をもつ塩基を複製することが容易であり、この複製により濃度を上昇させて測定感度を向上させる分析方法が一般的である。これらの技術においては、高性能な抽出・精製装置を用いて目的の物質だけを取り出して分析することが可能であり、また目的の物質の複製を合成して物質の濃度を上昇させることができる。このため、最終段階の物質の同定や定量の工程においては、妨害物質の影響をほとんど受けることなく、信頼性の高い結果が得られることが特徴である(非特許文献2参照)。 Conventionally, in order to specify the type and concentration of a substance present in the internal space of liposomes, the target liposomes are destroyed using a drug or the like, and the internal substance is extracted and generated. For example, for nucleic acid molecules such as miRNA, it is easy to replicate bases having the same sequence using extracted and purified samples, and an analytical method that increases the concentration by this replication to improve measurement sensitivity is common. Is. In these technologies, it is possible to extract and analyze only the target substance using a high-performance extraction / purification device, and it is possible to increase the concentration of the substance by synthesizing a copy of the target substance. . For this reason, in the process of identification and quantification of substances at the final stage, it is characterized in that highly reliable results can be obtained with little influence from interfering substances (see Non-Patent Document 2).
ところで、リポソーム類の内部空間に存在する物質は、RNAに代表されるように、外部環境下では分解酵素との接触によって容易に壊れてしまう脆弱なものが多い。このため、上述した内部の物質を抽出・精製したのちに分析を行う方法においては、最終段階の物質の同定や定量の工程の前に、変性や分解が起こらないことが非常に重要となる。例えば、抽出・精製条件の設定には、非常に注意を要する。このように、上述したリポソーム類に内包される空間に存在する物質の分析では、操作が煩雑で多くの時間を必要とし、加えて、高度な熟練を必要とし、容易に実施できないという問題があった。 By the way, as represented by RNA, substances existing in the internal space of liposomes are often fragile that are easily broken by contact with a degrading enzyme in an external environment. For this reason, in the method of performing analysis after extracting and purifying the internal substance described above, it is very important that denaturation and decomposition do not occur before the final substance identification and quantification process. For example, very careful attention is required for setting extraction / purification conditions. As described above, the analysis of the substance existing in the space enclosed by the liposomes described above has a problem that the operation is complicated and requires a lot of time, and in addition, a high level of skill is required and cannot be easily performed. It was.
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、リポソーム類に内包される空間に存在する物質の分析を、より容易に実施できるようにすることを目的とする。 The present invention has been made to solve the above-described problems, and an object of the present invention is to make it easier to analyze a substance present in a space enclosed in liposomes.
本発明に係る生体分子測定方法は、炭素材料の小片からなる基部と、検出対象となる生体分子と特異的に結合して一端が基部に固定された生体分子検出用分子と、生体分子検出用分子の他端に結合した蛍光色素分子とを備える分子輸送素子を用意する第1ステップと、生体分子を内包するリポソームが含まれている溶液中に分子輸送素子を加える第2ステップと、分子輸送素子を加えた溶液中で分子輸送素子の蛍光色素分子による蛍光を検出する第3ステップとを備える。基部は、グラフェン,グラフェン誘導体,およびカーボンナノチューブのいずれかから構成する。 The biomolecule measuring method according to the present invention includes a base portion made of a small piece of carbon material, a biomolecule detection molecule that specifically binds to a biomolecule to be detected and has one end fixed to the base, and a biomolecule detection A first step of preparing a molecular transport element comprising a fluorescent dye molecule bonded to the other end of the molecule; a second step of adding the molecular transport element to a solution containing liposomes encapsulating biomolecules; And a third step of detecting fluorescence by the fluorescent dye molecules of the molecular transport element in the solution to which the element is added. The base is made of any of graphene, graphene derivatives, and carbon nanotubes.
上記生体分子測定方法において、第3ステップで検出する蛍光は、第2ステップで、リポソームに侵入した分子輸送素子の部分に固定されている生体分子検出用分子と、リポソームが内包する生体分子との結合により、蛍光色素分子が基部より離間したことにより発光した蛍光である。 In the biomolecule measuring method, the fluorescence detected in the third step is a combination of a biomolecule detection molecule fixed to a part of the molecular transport element that has entered the liposome and a biomolecule encapsulated in the liposome in the second step. Fluorescence emitted when the fluorescent dye molecules are separated from the base by binding.
上記生体分子測定方法において、生体分子検出用分子の一端に結合した接着分子を備え、生体分子検出用分子は、接着分子により基部に固定されているようにしてもよい。 In the biomolecule measuring method, an adhesive molecule bonded to one end of the biomolecule detection molecule may be provided, and the biomolecule detection molecule may be fixed to the base by the adhesive molecule.
また、本発明に係る分子輸送素子は、炭素材料の小片からなる基部と、検出対象となる生体分子と特異的に結合して一端が基部に固定された生体分子検出用分子と、生体分子検出用分子の他端に結合した蛍光色素分子とを備え、基部は、グラフェン,グラフェン誘導体,およびカーボンナノチューブのいずれかから構成されている。 In addition, the molecular transport element according to the present invention includes a base made of a small piece of carbon material, a biomolecule detection molecule that is specifically bound to a biomolecule to be detected and fixed at one end, and a biomolecule detection And a fluorescent dye molecule bonded to the other end of the molecule for use, and the base is composed of any one of graphene, a graphene derivative, and a carbon nanotube.
上記分子輸送素子において、生体分子検出用分子の一端に結合した接着分子を備え、生体分子検出用分子は、接着分子により基部に固定されているようにしてもよい。 The molecular transport element may include an adhesion molecule bonded to one end of the biomolecule detection molecule, and the biomolecule detection molecule may be fixed to the base by the adhesion molecule.
以上説明したことにより、本発明によれば、リポソーム類に内包される空間に存在する物質の分析が、より容易に実施できるようになるという優れた効果が得られる。 As described above, according to the present invention, it is possible to obtain an excellent effect that the analysis of the substance existing in the space included in the liposomes can be performed more easily.
以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図1は、本発明の実施の形態における生体分子測定方法を説明するフローチャートである。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a flowchart for explaining a biomolecule measuring method according to an embodiment of the present invention.
まず、ステップS101で、分子輸送素子を作製(用意)する。分子輸送素子は、炭素材料の小片からなる基部と、検出対象となる生体分子と特異的に結合して一端が基部に固定された生体分子検出用分子と、生体分子検出用分子の他端に結合した蛍光色素分子とを備える。また、基部は、グラフェン,グラフェン誘導体,およびカーボンナノチューブのいずれかから構成する。なお、生体分子は、RNA,DNAなどの生体関連の分子および分子複合体を含む。 First, in step S101, a molecular transport element is prepared (prepared). The molecular transport element includes a base made of a small piece of carbon material, a biomolecule detection molecule that is specifically bound to a biomolecule to be detected and fixed at one end to the base, and the other end of the biomolecule detection molecule. And a bound fluorescent dye molecule. Further, the base portion is composed of any one of graphene, a graphene derivative, and a carbon nanotube. Biomolecules include biological molecules such as RNA and DNA and molecular complexes.
例えば、基板は、大きさが約0.1μmから100μm四方の酸化グラフェンの小片であればよい。また、蛍光色素分子は、6−carboxyfluorescein(FAM)を用いることができる。また、生体分子検出用分子の一端に接着分子を結合させ、基部に固定するようにしてもよい。例えば、ピレン酪酸,ピレンブタジエン酸などが接着分子として用いることができる。 For example, the substrate may be a small piece of graphene oxide having a size of about 0.1 μm to 100 μm square. As the fluorescent dye molecule, 6-carbofluorescein (FAM) can be used. Alternatively, an adhesive molecule may be bonded to one end of the biomolecule detection molecule and fixed to the base. For example, pyrene butyric acid or pyrene butadiene acid can be used as the adhesion molecule.
次に、ステップS102で、生体分子を内包するリポソーム(リポソーム類)が含まれている溶液中に分子輸送素子を加える。例えば、複数の分子輸送素子が分散している溶液を、対象とするリポソームが分散している検体溶液に混合すればよい。この後、ステップS103で、分子輸送素子を加えた溶液中で分子輸送素子の蛍光色素分子による蛍光を検出する。例えば、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いた観察により、蛍光像を確認すればよい。 Next, in step S102, a molecular transport element is added to a solution containing liposomes (liposomes) encapsulating biomolecules. For example, a solution in which a plurality of molecular transport elements are dispersed may be mixed with a sample solution in which target liposomes are dispersed. Thereafter, in step S103, the fluorescence of the molecular transport element by the fluorescent dye molecule is detected in the solution to which the molecular transport element has been added. For example, the fluorescence image may be confirmed by observation using a confocal laser fluorescence microscope.
図2に示すように、リポソーム(リポソーム類)101は、脂質二分子膜102から構成され、また、RNAなどの生体分子103を内包する。このように構成されたリポソーム101の脂質二分子膜102を、リポソーム101を破壊することなく、分子輸送素子201が貫通して侵入する。分子輸送素子201は、少なくとも一部が、リポソーム101に侵入可能な大きさとされていればよい。 As shown in FIG. 2, a liposome (liposomes) 101 is composed of a lipid bilayer membrane 102 and encapsulates a biomolecule 103 such as RNA. The molecular transport element 201 penetrates and enters the lipid bilayer membrane 102 of the liposome 101 thus configured without destroying the liposome 101. It is sufficient that at least a part of the molecular transport element 201 has a size capable of entering the liposome 101.
上述したステップS103で検出する蛍光は、ステップS102で、リポソーム101に侵入した分子輸送素子201の部分に固定されている生体分子検出用分子と、リポソーム101が内包する生体分子103との結合により、蛍光色素分子が基部より離間したことにより発光した蛍光である。 The fluorescence detected in step S103 described above is linked to the biomolecule detection molecule fixed to the portion of the molecular transport element 201 that has entered the liposome 101 in step S102 and the biomolecule 103 included in the liposome 101. This is fluorescence emitted when the fluorescent dye molecules are separated from the base.
上述した発光について図3を用いて説明する。分子輸送素子201は、図3に示すように、例えば、酸化グラフェンの小片からなる基部202と、基部202に一端が固定された生体分子検出用分子203と、生体分子検出用分子203の他端に結合した蛍光色素分子204とを備える。生体分子検出用分子203は、基部202に引き寄せられるため、図3の(a)に示すように、蛍光色素分子204も基板202に近づいた状態となる。この状態では、炭素材料である酸化グラフェンが励起エネルギー吸収物質であるため、クエンチングにより消光状態となる。 The above-described light emission will be described with reference to FIG. As shown in FIG. 3, the molecular transport element 201 includes, for example, a base 202 made of a small piece of graphene oxide, a biomolecule detection molecule 203 having one end fixed to the base 202, and the other end of the biomolecule detection molecule 203. And a fluorescent dye molecule 204 bonded to the. Since the biomolecule detection molecules 203 are attracted to the base portion 202, the fluorescent dye molecules 204 are also brought closer to the substrate 202 as shown in FIG. In this state, graphene oxide, which is a carbon material, is an excitation energy absorbing substance, and thus is quenched by quenching.
上述した状態に対し、生体分子検出用分子203の近傍に、生体分子検出用分子203と特異的に結合する生体分子211が存在すると、図3の(b)に示すように、生体分子検出用分子203は生体分子211と結合して複合体を形成する。このとき、生体分子検出用分子203の一端は、基部202に固定されており、生体分子検出用分子203は、基部202より離脱することはない。しかし、生体分子211との複合体を形成することにより、生体分子検出用分子203の他端は、ここに結合している蛍光色素分子204とともに、基部202より離間していく。このように、距離が遠くなるのに従って基部202による消光効率が著しく低下し、蛍光色素分子204の励起発光(蛍光)が観測されるようになる。 In the state described above, when there is a biomolecule 211 that specifically binds to the biomolecule detection molecule 203 in the vicinity of the biomolecule detection molecule 203, as shown in FIG. The molecule 203 is combined with the biomolecule 211 to form a complex. At this time, one end of the biomolecule detection molecule 203 is fixed to the base 202, and the biomolecule detection molecule 203 is not detached from the base 202. However, by forming a complex with the biomolecule 211, the other end of the biomolecule detection molecule 203 is separated from the base portion 202 together with the fluorescent dye molecule 204 bonded thereto. Thus, as the distance increases, the quenching efficiency by the base portion 202 is remarkably lowered, and the excitation light emission (fluorescence) of the fluorescent dye molecule 204 is observed.
上述したように、リポソームを構成する脂質二分子膜を貫通し、一部分もしくは全体がリポソームの内部に侵入し、また、侵入にともなってリポソームを破壊しない分子輸送素子を用いるようにしたところに本発明の特徴がある。分子輸送素子は、リポソーム内部の物質(生体物質)と選択的に分子相互作用を行う生体分子検出用分子を備える。 As described above, the present invention uses a molecular transport element that penetrates the lipid bilayer membrane constituting the liposome, partially or entirely penetrates into the interior of the liposome, and does not break the liposome as it enters. There are features. The molecular transport element includes a biomolecule detecting molecule that selectively interacts with a substance (biological substance) inside the liposome.
リポソームを構成する脂質二分子膜を貫通することができる分子輸送素子は、原子1〜数個程度の厚さからなるシート状の炭素材料からなる基部より構成すればよい。このようなシート状の物質として、例えばグラフェンおよびその誘導体を用いることができる。ここで、グラフェン誘導体とは、グラフェン骨格の一部を化学的に変化させたものであり、酸化グラフェン、酸化グラフェン還元体、ボロンまたは窒素で炭素を置換したグラフェン、五員環を含むグラフェンなどがある。また、上述した基部として、原子数個程度の径からなる棒状のカーボンナノチューブを用いるようにしてもよい。 The molecular transport element capable of penetrating the lipid bilayer membrane constituting the liposome may be composed of a base made of a sheet-like carbon material having a thickness of about 1 to several atoms. As such a sheet-like substance, for example, graphene and its derivatives can be used. Here, the graphene derivative is obtained by chemically changing a part of the graphene skeleton. Graphene oxide, graphene oxide reductant, graphene substituted with carbon by boron or nitrogen, graphene containing a five-membered ring, and the like is there. Further, a rod-like carbon nanotube having a diameter of about several atoms may be used as the above-described base.
分子輸送素子(基部)の大きさは、例えば、数μm程度と、対象とするリポソームと同程度、または、リポソームより小さければよい。また、基部が、炭素材料から構成されていれば、はじかれるなどのことがなく、リポソームに侵入することができる。 The size of the molecular transport element (base) may be, for example, about several μm, about the same as the target liposome, or smaller than the liposome. In addition, if the base is made of a carbon material, it can enter the liposome without being repelled.
これらの炭素材料からなる基部は、表面にDNAなどの小分子を搭載可能であることが知られている。アプタマー機能を有するDNAや、miRNAと相補的配列を有するDNAなどの生体分子検出用分子を用いれば、リポソーム内部の生体分子と選択的に分子相互作用を行うことが可能となる(非特許文献3参照)。基部の薄いまたは鋭利な端面形状を利用して脂質二分子膜を貫通させてもよいし、基部表面にDNAなどの小分子を搭載していることを利用し、リポソーム表面に付着している機能分子との相互作用によって脂質二分子膜を貫通させてもよい。 It is known that bases made of these carbon materials can be loaded with small molecules such as DNA on the surface. By using biomolecule detection molecules such as DNA having an aptamer function or DNA having a complementary sequence to miRNA, it becomes possible to selectively interact with biomolecules inside the liposome (Non-patent Document 3). reference). A function that adheres to the liposome surface by utilizing the fact that small molecules such as DNA are mounted on the base surface, which may penetrate the lipid bilayer membrane using a thin or sharp end face shape of the base The lipid bilayer may be penetrated by interaction with the molecule.
以下、実施例を用いてより詳細に説明する。 Hereinafter, it demonstrates in detail using an Example.
[実施例1]
以下では、分子輸送素子を構成する基部を、炭素原子1個程度の厚さからなる酸化グラフェンから構成し、リポソーム内部の物質と選択的に分子相互作用を行う生体分子を、100塩基以下程度のDNA鎖から構成した場合について説明する。
[Example 1]
In the following, the base constituting the molecular transport element is composed of graphene oxide having a thickness of about one carbon atom, and a biomolecule that selectively interacts with a substance inside the liposome is about 100 bases or less. The case where it consists of DNA strands will be described.
はじめに、分子輸送素子の作製について説明する。酸化グラフェンは、例えばグラファイトを化学的に酸化することで形成したものである。例えば非特許文献4に示される合成法により得られる。この酸化グラフェンを、純水に加えて撹拌することで、酸化グラフェンが分散した分散溶液を得る(第1製造工程)。この分散溶液中には、大きさが約1μmから100μm四方の様々な酸化グラフェンの小片が混在している。この分散溶液中の物質は、原子間力顕微鏡観察およびラマン分光分析から、単層の酸化グラフェンの小片(膜片)が主要成分であることが確認されている。 First, production of a molecular transport element will be described. Graphene oxide is formed, for example, by chemically oxidizing graphite. For example, it can be obtained by the synthesis method shown in Non-Patent Document 4. The graphene oxide is added to pure water and stirred to obtain a dispersion solution in which the graphene oxide is dispersed (first manufacturing step). In this dispersion, various pieces of graphene oxide having a size of about 1 μm to 100 μm square are mixed. From the atomic force microscope observation and the Raman spectroscopic analysis, it has been confirmed that the substance in the dispersion solution is mainly composed of a single layer of graphene oxide pieces (film pieces).
次に、遠心分離法により、上述した分散溶液から酸化グラフェンを沈殿させて分離する(第2製造工程)。 Next, graphene oxide is precipitated and separated from the above-described dispersion solution by a centrifugal separation method (second manufacturing step).
次に、酸化グラフェンの沈殿物に、DNA鎖を化学修飾(酸化グラフェンに固定)するための接着分子(リンカー)となる、ピレン酪酸スクシンイミドエステルの5mMジメチルホルムアミド溶液を混合し、ふたたび酸化グラフェンを分散溶液として、室温で撹拌しながら1時間反応させる(第3製造工程)。 Next, the graphene oxide precipitate is mixed with a 5 mM dimethylformamide solution of pyrenebutyric acid succinimide ester that serves as an adhesion molecule (linker) for chemically modifying the DNA strand (fixed to the graphene oxide), and the graphene oxide is dispersed again. The solution is allowed to react for 1 hour with stirring at room temperature (third production step).
次に、遠心分離法により、ピレン酪酸スクシンイミドエステルが吸着した酸化グラフェンを沈殿させ、上澄みを取り除いて未反応のピレン酪酸スクシンイミドエステルを除去する(第4製造工程)。 Next, the graphene oxide adsorbed with pyrenebutyric acid succinimide ester is precipitated by centrifugal separation, and the supernatant is removed to remove unreacted pyrenebutyric acid succinimide ester (fourth manufacturing step).
また、別途、蛍光色素分子を結合させた生体分子検出用分子を用意する。3’末端に蛍光色素分子(FAM)を、5’末端にアミノ基を導入したDNA鎖を合成し、100μM水溶液としておく(第5製造工程)。 Separately, a biomolecule detection molecule to which a fluorescent dye molecule is bound is prepared. A DNA strand in which a fluorescent dye molecule (FAM) is introduced at the 3 'end and an amino group is introduced at the 5' end is synthesized to prepare a 100 µM aqueous solution (fifth manufacturing step).
次に、第5製造工程で作成したDNA鎖の水溶液と、ピレン酪酸が吸着した酸化グラフェンの沈殿物とを混合し、ふたたび酸化グラフェンを分散溶液として、室温で撹拌しながら1時間反応させ、ピレン酪酸とDNA鎖の間にペプチド結合を形成させ、共有結合により固定する(第6製造工程)。これにより、酸化グラフェンの小片(基部)の表面に、ピレン酪酸をリンカーとしてDNA鎖(生体分子検出用分子)の一端が固定される。DNA鎖の他端には、蛍光色素分子が結合している。 Next, the aqueous solution of the DNA strand prepared in the fifth production step and the precipitate of graphene oxide adsorbed with pyrenebutyric acid are mixed, and again reacted with graphene oxide as a dispersion solution for 1 hour with stirring at room temperature. A peptide bond is formed between butyric acid and the DNA strand, and is fixed by a covalent bond (sixth manufacturing step). Thereby, one end of a DNA chain (molecule for biomolecule detection) is fixed to the surface of the small piece (base part) of graphene oxide using pyrene butyric acid as a linker. A fluorescent dye molecule is bound to the other end of the DNA strand.
次に、反応後の酸化グラフェンを沈殿させ、上澄みを取り除いて未反応のDNA鎖を除去する(第7製造工程)。これに水を加えて再び分散溶液とし、分子輸送素子の水分散溶液を得る(第8製造工程)。 Next, the graphene oxide after the reaction is precipitated, the supernatant is removed, and the unreacted DNA strand is removed (seventh manufacturing step). Water is added to this to obtain a dispersion solution again to obtain an aqueous dispersion solution of the molecular transport element (eighth manufacturing process).
なお、分子輸送素子の大きさを約1μm以下程度とするためには、第8製造工程の後、超音波処理により粉砕すればよい(第9製造工程)。超音波を照射する処理時間により、分子輸送素子を100nm程度まで細かくすることが可能である。第1製造工程の直後に、酸化グラフェンを超音波処理により粉砕して微細化すると、遠心分離法によって沈殿させることが困難になるため、第2製造工程より後の工程を進めることが困難となる。従って、より微細な分子輸送素子を得るためには、上述したように、第8製造工程の後で微細化するとよい。 In order to reduce the size of the molecular transport element to about 1 μm or less, it may be pulverized by ultrasonic treatment after the eighth manufacturing process (the ninth manufacturing process). It is possible to make the molecular transport element as fine as about 100 nm depending on the treatment time of irradiation with ultrasonic waves. Immediately after the first manufacturing step, if graphene oxide is pulverized and refined by ultrasonic treatment, it becomes difficult to precipitate by centrifugal separation, so that it is difficult to proceed with the steps after the second manufacturing step. . Therefore, in order to obtain a finer molecular transport element, as described above, it is preferable to refine after the eighth manufacturing process.
以上の工程によって作製した分子輸送素子の動作確認は、以下のように行った。まず、検体として、上述したDNAと相補鎖を形成する配列を有するRNAを内包するリポソームを用意した。このリポソームは、直径10μm以下であり、分散溶液として用意する。この分散溶液を対象試料とし、ここに、上述した分子輸送素子の分散溶液を混合し、作用させればよい。 The operation of the molecular transport device manufactured by the above steps was confirmed as follows. First, as a specimen, a liposome encapsulating RNA having a sequence that forms a complementary strand with the above-described DNA was prepared. The liposome has a diameter of 10 μm or less and is prepared as a dispersion solution. This dispersion solution is used as a target sample, and the above-described dispersion solution of the molecular transport element may be mixed and acted thereon.
比較対象試料として、上述のDNAと相補鎖を形成しない、塩基数が同程度の別配列のRNAを内包した、直径10μm以下程度のリポソームの分散溶液を用意した。この、比較対象試料に対しても、上記分子輸送素子を含む分散溶液を混合して作用させた。 As a sample to be compared, a liposome dispersion solution having a diameter of about 10 μm or less and encapsulating another sequence of RNA having the same number of bases that does not form a complementary strand with the above-described DNA was prepared. The dispersion solution containing the molecular transport element was also mixed and acted on the comparative sample.
上述したようなRNAを内包したリポソームは、例えば既報の方法により、得ることができる(非特許文献5参照)。またリポソームを形成する脂質分子の一部をローダミンなどの蛍光分子でラベル化しておけば、蛍光イメージ観察によりリポソームの位置および大きさを確認することができる。 Liposomes encapsulating RNA as described above can be obtained, for example, by a previously reported method (see Non-Patent Document 5). In addition, if a part of lipid molecules forming the liposome is labeled with a fluorescent molecule such as rhodamine, the position and size of the liposome can be confirmed by observation of a fluorescent image.
上述した試料および比較対象試料と、分子輸送素子を分散した溶液との混合は、高分子材料などの樹脂から構成した流路を有するチップを用いて行えばよい。高分子材料としては、PDMS(poly dimethylsiloxane)を基本骨格に有する材料を用いることができる。PDMSは、合成が簡単であるほか、ガラスやシリコン上の酸化膜に対して良好な密着が得られるという理由から好ましい。 Mixing of the above-described sample and the sample to be compared with the solution in which the molecular transport element is dispersed may be performed using a chip having a flow path made of a resin such as a polymer material. As the polymer material, a material having PDMS (poly dimethylsiloxane) as a basic skeleton can be used. PDMS is preferable because it is easy to synthesize and provides good adhesion to an oxide film on glass or silicon.
このような高分子材料製の流路は、シート状の高分子の片側表面に、所望とする数の流路形成用溝を形成し、ここに、ガラスやシリコン基板の主表面を貼り付ければよい。基板により閉鎖された溝で、流路が形成できる。流路形成用溝の一端および他端に貫通する孔部を高分子のシートに設ければ、基板に貼り付けて流路を形成した後で、導入口および排出口として用いることができる。なお、高分子のシートを貫通する流路形成用溝を形成した場合、シートの一方の面をガラスやシリコン基板の主表面に貼り付けると、上部が開放した溝状の流路となる。この場合、上述したような導入口および排出口を設ける必要はない。 Such a flow path made of a polymer material is formed by forming a desired number of flow path forming grooves on one side surface of a sheet-like polymer, and attaching a main surface of glass or a silicon substrate thereto. Good. A channel can be formed by a groove closed by a substrate. If a hole penetrating one end and the other end of the channel forming groove is provided in the polymer sheet, it can be used as an inlet and an outlet after being attached to a substrate to form a channel. When a flow path forming groove penetrating the polymer sheet is formed, when one surface of the sheet is attached to the main surface of the glass or silicon substrate, a groove-shaped flow path having an open top is formed. In this case, it is not necessary to provide the introduction port and the discharge port as described above.
ここでは、3本の流路形成用溝を形成したPDMSシートを、ガラス基板に貼り付け、3本の流路を備える流路チップを用いた。この流路チップの第1流路には、分子輸送素子を分散した溶液に試料溶液を混合した溶液を導入する。また、流路チップの第2流路には、分子輸送素子を分散した溶液に比較対象試料を混合した溶液を導入する。また、流路チップの第3流路には、分子輸送素子を分散した溶液に水を混合した溶液を導入する。 Here, a PDMS sheet in which three flow path forming grooves were formed was attached to a glass substrate, and a flow path chip having three flow paths was used. A solution obtained by mixing a sample solution with a solution in which molecular transport elements are dispersed is introduced into the first channel of the channel chip. In addition, a solution obtained by mixing a sample to be compared with a solution in which molecular transport elements are dispersed is introduced into the second channel of the channel chip. In addition, a solution obtained by mixing water with a solution in which molecular transport elements are dispersed is introduced into the third channel of the channel chip.
上述した3本の流路の蛍光イメージを、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて、同時に観察した。まずローダミンの赤色蛍光により、直径10μm以下程度のリポソームが、第1流路および第2流路に導入されていることを確認した。次に、FAMの緑色蛍光は、第2流路および第3流路においては、強度が非常に微弱であった。 The above-described fluorescence images of the three channels were simultaneously observed using a confocal laser fluorescence microscope. First, it was confirmed by the red fluorescence of rhodamine that liposomes having a diameter of about 10 μm or less were introduced into the first channel and the second channel. Next, the intensity of the FAM green fluorescence was very weak in the second and third channels.
これらに対し、第1流路においては、リポソームの膜内部において、FAMの蛍光強度の増加が観測された。これは、分子輸送素子がリポソーム膜を貫通もしくは内部に侵入し、搭載されているDNAがリポソーム内部のRNAと分子選択的に相補鎖を形成したことによりDNAの立体構造が変化し、3末端に導入したFAMが、酸化グラフェンへのエネルギー移動を起こさない程度に遠い距離に移動して発光したことで説明できる。 In contrast, in the first channel, an increase in the fluorescence intensity of FAM was observed inside the liposome membrane. This is because the three-dimensional structure of the DNA changes due to the molecular transport element penetrating through the liposome membrane or penetrating into the interior, and the mounted DNA forms a complementary molecule-selective strand with the RNA inside the liposome. This can be explained by the fact that the introduced FAM moved to a distance far enough not to cause energy transfer to graphene oxide and emitted light.
上述したことにより、本発明による分子輸送素子が、リポソームを構成する脂質膜を貫通して内部に侵入することが示された。この分子輸送素子を用いて、リポソーム内部の物質(生体物質)と選択的に分子相互作用を行う分子(生体分子検出用分子)を輸送することにより、標的とする物質の変性や分解が起こりにくい最適条件に保たれているリポソーム類の内部空間の環境下において、直接物質の検出や化学反応を起こすことが可能となる。このように、本発明によれば、リポソーム類を破壊することなどの複雑な処理をする必要が無く、リポソーム類に内包される空間に存在する物質の分析が、より容易に実施できるようになる。 From the above, it was shown that the molecular transport element according to the present invention penetrates into the inside of the lipid membrane constituting the liposome. By using this molecular transport element to transport molecules (biomolecule detection molecules) that selectively interact with the substance inside the liposome (biological material), the target substance is unlikely to denature or decompose. In the environment of the internal space of liposomes kept at the optimum conditions, it becomes possible to directly detect substances and cause chemical reactions. As described above, according to the present invention, it is not necessary to perform complicated processing such as destroying liposomes, and analysis of substances existing in the space enclosed by liposomes can be performed more easily. .
リポソーム内部に内包されるRNAとしては、例えば疾病特異的に発現上昇するmiRNAなどを対象とすることができる。例えば、がん特異的に発現上昇するmiRNAが、非特許文献1の図表5に示されている。これを対象とすることで、本発明により、疾病マーカの検出が可能となる。 As RNA encapsulated in the liposome, for example, miRNA whose expression is increased in a disease-specific manner can be targeted. For example, miRNA whose expression is specifically increased in cancer is shown in Chart 5 of Non-Patent Document 1. By targeting this, the disease marker can be detected according to the present invention.
なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、蛍光色素分子や接着分子が結合している生体分子検出用分子の端部に、更に、核酸やペプチドが配列した分子が結合していてもよい。 The present invention is not limited to the embodiment described above, and many modifications and combinations can be implemented by those having ordinary knowledge in the art within the technical idea of the present invention. It is obvious. For example, a molecule in which a nucleic acid or a peptide is arranged may be further bonded to an end of a biomolecule detection molecule to which a fluorescent dye molecule or an adhesion molecule is bonded.
また、接着分子としては、ピレン酪酸やピレンブタジエン酸などピレンが骨格に含まれているもや、ベンゼンおよび多環芳香族分子(ナフタレン,アントラセン,テトラセン,ペンタセン,フェナントレン,ピレン,ペリレン,コロネン)などを用いることができる。また、接着分子を生体分子検出用分子と結合させる官能基(分子)は、ブタジエン酸や、「−COOH」および「−(CH2)nCOOH」がある。なお、nは、好ましくは2〜10の範囲がよい。 Adhesion molecules include pyrene such as pyrenebutyric acid and pyrenebutadiene acid in the skeleton, benzene and polycyclic aromatic molecules (naphthalene, anthracene, tetracene, pentacene, phenanthrene, pyrene, perylene, coronene), etc. Can be used. The functional group (molecule) that binds the adhesion molecule to the biomolecule detection molecule includes butadiene acid, “—COOH”, and “— (CH 2 ) n COOH”. Note that n is preferably in the range of 2 to 10.
101…リポソーム、102…脂質二分子膜、103…生体分子、201…分子輸送素子、202…基部、203…生体分子検出用分子、204…蛍光色素分子、211…生体分子。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 101 ... Liposome, 102 ... Lipid bilayer membrane, 103 ... Biomolecule, 201 ... Molecular transport element, 202 ... Base, 203 ... Molecule for biomolecule detection, 204 ... Fluorescent dye molecule, 211 ... Biomolecule
Claims (5)
検出対象となる生体分子と特異的に結合して一端が前記基部に固定された生体分子検出用分子と、
前記生体分子検出用分子の他端に結合した蛍光色素分子と
を備える分子輸送素子を用意する第1ステップと、
生体分子を内包するリポソームが含まれている溶液中に前記分子輸送素子を加える第2ステップと、
前記分子輸送素子を加えた前記溶液中で前記分子輸送素子の前記蛍光色素分子による蛍光を検出する第3ステップと
を備え、
前記基部は、グラフェン,グラフェン誘導体,およびカーボンナノチューブのいずれかから構成することを特徴とする生体分子測定方法。 A base made of small pieces of carbon material;
A biomolecule detection molecule that specifically binds to a biomolecule to be detected and has one end fixed to the base;
A first step of preparing a molecular transport element comprising: a fluorescent dye molecule bonded to the other end of the biomolecule detection molecule;
A second step of adding the molecular transport element to a solution containing liposomes encapsulating biomolecules;
A third step of detecting fluorescence by the fluorescent dye molecules of the molecular transport element in the solution to which the molecular transport element has been added, and
The base part is composed of any one of graphene, a graphene derivative, and a carbon nanotube.
前記第3ステップで検出する蛍光は、
前記第2ステップで、前記リポソームに侵入した前記分子輸送素子の部分に固定されている前記生体分子検出用分子と、前記リポソームが内包する前記生体分子との結合により、前記蛍光色素分子が前記基部より離間したことにより発光した蛍光である
ことを特徴とする生体分子測定方法。 The biomolecule measuring method according to claim 1,
The fluorescence detected in the third step is
In the second step, the fluorescent dye molecule is bonded to the base by binding of the biomolecule detection molecule fixed to the part of the molecular transport element that has entered the liposome and the biomolecule included in the liposome. A method for measuring biomolecules, characterized in that the fluorescence is emitted by being further separated.
前記生体分子検出用分子の一端に結合した接着分子を備え、
前記生体分子検出用分子は、前記接着分子により前記基部に固定されている
ことを特徴とする生体分子測定方法。 The biomolecule measuring method according to claim 1 or 2,
Comprising an adhesion molecule bonded to one end of the biomolecule detection molecule;
The biomolecule detection method, wherein the biomolecule detection molecule is fixed to the base by the adhesive molecule.
検出対象となる生体分子と特異的に結合して一端が前記基部に固定された生体分子検出用分子と、
前記生体分子検出用分子の他端に結合した蛍光色素分子と
を備え、
前記基部は、グラフェン,グラフェン誘導体,およびカーボンナノチューブのいずれかから構成されていることを特徴とする分子輸送素子。 A base made of small pieces of carbon material;
A biomolecule detection molecule that specifically binds to a biomolecule to be detected and has one end fixed to the base;
A fluorescent dye molecule bonded to the other end of the biomolecule detection molecule,
The molecular transport element, wherein the base is made of any one of graphene, a graphene derivative, and a carbon nanotube.
前記生体分子検出用分子の一端に結合した接着分子を備え、
前記生体分子検出用分子は、前記接着分子により前記基部に固定されている
ことを特徴とする分子輸送素子。 The molecular transport device according to claim 4, wherein
Comprising an adhesion molecule bonded to one end of the biomolecule detection molecule;
The molecule transport element, wherein the biomolecule detection molecule is fixed to the base by the adhesive molecule.
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