JP2015173626A - Method of preparing dna library for next generation sequencer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、次世代ＤＮＡシークエンサーを用いたＤＮＡタイピングに供するＤＮＡライブラリーの調製方法に関する。 The present invention relates to a method for preparing a DNA library for DNA typing using a next-generation DNA sequencer.
現在、様々なタイプの次世代シークエンサーが市場に出回っており、ヒトゲノムの解析、遺伝子発現解析などの研究に使用されるに至っている。
「次世代シークエンサー（シーケンサー）：ＮＧＳと略記することもある」、「新型シークエンサー」あるいは「超高速シークエンサー」などの呼称は、従来のサンガー法（ジデオキシ法）に基づくマイクロキャピラリーシークエンサー（ＳＢＴ）との対比において用いられている。次世代シークエンサーと呼ばれるＤＮＡシークエンサーは、少量のＤＮＡサンプルに基づいて、高速で大量のＤＮＡ断片を自動的に解析するという点では一致するが、採用されているシークエンス手法は機種によって異なっている。
At present, various types of next-generation sequencers are on the market and have been used for research such as human genome analysis and gene expression analysis.
“Next-generation sequencer (sequencer): may be abbreviated as NGS”, “new sequencer” or “ultra-high-speed sequencer” is called “micro-capillary sequencer (SBT)” based on the conventional Sanger method (dideoxy method). Used in contrast. A DNA sequencer called a next-generation sequencer agrees in that it automatically analyzes a large amount of DNA fragments at a high speed based on a small amount of DNA sample, but the sequence method employed differs depending on the model.
現在汎用されている次世代シークエンサーで採用されているシークエンス手法の代表例は「逐次合成シークエンシング（sequencing by synthesis: ＳＢＳ）」であり、ＤＮＡ断片をテンプレートとして１塩基ずつ再合成するときの蛍光強度等を検出して塩基配列が決定される。
実際に行われる工程は、（１）サンプルからＤＮＡを抽出し、（２）抽出したＤＮＡを大量並列シークエンスに適するように断片化してＤＮＡライブラリーを作成し、（３）ライブラリーのＤＮＡ断片の次世代シークエンサーに供して塩基配列を解読することを含む。ここで、各ＤＮＡ断片の塩基配列の単位を「リード」と呼ぶことがある。次いで、（４）ゲノム配列が既知の生物種の場合は、データベース等を利用して前記リードをリファレンス配列にマッピングして比較するリシークエンス、ゲノム配列が不明な生物種の場合は、新たにアセンブルを行って配列決定するｄｅ ｎｏｖｏシークエンスが行われる。
A typical example of the sequencing method adopted in the next-generation next-generation sequencers currently used is “sequencing by synthesis (SBS)”, and the fluorescence intensity when re-synthesizing one base at a time using a DNA fragment as a template. Etc. are detected to determine the base sequence.
The actual steps are as follows: (1) DNA is extracted from the sample, (2) the extracted DNA is fragmented so as to be suitable for mass parallel sequencing, and a DNA library is created. (3) DNA fragments of the library are This includes decoding the nucleotide sequence using a next-generation sequencer. Here, the unit of the base sequence of each DNA fragment may be referred to as “read”. Next, (4) resequencing in which the read is mapped to a reference sequence using a database or the like in the case of a biological species whose genome sequence is known, and a new assembly is performed in the case of a biological species whose genome sequence is unknown. A de novo sequence that performs sequencing is performed.
次世代シークエンサーにおける大量並列シークエンスを精度良くかつ均一に行うためには、（２）で作成するＤＮＡライブラリーの調製におけるＤＮＡ断片のサイズ（長さ）及び濃度の調整が重要である。
例えば、イルミナ社の次世代シークエンサーであるＭｉｓｅｑ（商品名）には、その装置に特化したＮｅｘｔｅｒａサンプル調製キット（商品名）が市販されている。Ｎｅｘｔｅｒａサンプル調製キットを用いたライブラリー調製では、サンプルから抽出されたＤＮＡの断片化と末端のタグ化が同時に行われ、タグを介してビーズに結合したＤＮＡ断片をエマルジョンＰＣＲにより増幅した後、磁気ビーズ（ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ：商品名）を用いて反応夾雑物及び長すぎるＤＮＡ断片を除去することができる。
In order to perform mass parallel sequencing in the next-generation sequencer with high accuracy and uniformity, it is important to adjust the size (length) and concentration of DNA fragments in the preparation of the DNA library prepared in (2).
For example, Miseq (trade name), a next-generation sequencer of Illumina, is commercially available with a Nextera sample preparation kit (trade name) specialized for the apparatus. In library preparation using the Nextera sample preparation kit, the DNA extracted from the sample is fragmented and the ends are tagged at the same time. After the DNA fragments bound to the beads via the tags are amplified by emulsion PCR, Reaction contaminants and DNA fragments that are too long can be removed using beads (AMPure XP: trade name).
本発明者等は、極めて多型性に富み、医学的にも重要なヒトＨＬＡ遺伝子領域のゲノム塩基配列を、次世代シークエンサー（Ｍｉｓｅｑ）及びＮｅｘｔｅｒａサンプル調製キットを用いて完全に決定することに成功した（非特許文献１）。しかしながら、同じキットを使用しても、ＰＣＲ産物の量によって得られるライブラリーに含まれる断片のサイズが異なる、また、前記キットを使用し調製したＤＮＡ断片のサイズ分布範囲が広すぎる、という問題が生じていた。 The present inventors have succeeded in completely determining the genomic base sequence of the human HLA gene region, which is extremely polymorphic and medically important, using the next-generation sequencer (Miseq) and the Nextera sample preparation kit. (Non-Patent Document 1). However, even if the same kit is used, the size of the fragments contained in the library obtained depends on the amount of the PCR product, and the size distribution range of the DNA fragments prepared using the kit is too wide. It was happening.
前記特許文献１では、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等によって断片サイズ（長さ）に応じて展開させた後、そのアガロースゲルの所望のサイズ（５００ｂｐ〜２０００ｂｐ）に該当する部分を切り出すことによりサイズ（長さ）調節を施すことによりタイピングの精度／有効性を向上させることができた。しかしながら、かかる作業は非常に煩雑で時間を要するものであった。 In Patent Document 1, after PCR-amplified DNA is developed according to the fragment size (length) by agarose gel electrophoresis or the like, a portion corresponding to the desired size (500 bp to 2000 bp) of the agarose gel is cut out. Therefore, it was possible to improve the accuracy / effectiveness of typing by adjusting the size (length). However, such work is very complicated and time consuming.
さらに、一般にサンプル（ＤＮＡライブラリー）は多数の容器（例えば、９６ウェル、３８４ウェル）を備えたプレート上で調製されるが、従来の調製方法では、同様の操作をしても各ウェル毎にサンプルに含まれるＤＮＡ濃度（量）が相違することは避けられない。一方、次世代シークエンサーにおけるタイピングの精度を向上させるには、ＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ断片は均一な濃度であることが望ましい。そこで従来は、調製したライブラリーをバイオアナライザー等で検査して、濃度のばらつきを調節するという煩雑な操作が必要であった。 Furthermore, in general, a sample (DNA library) is prepared on a plate having a large number of containers (for example, 96 wells, 384 wells). However, in the conventional preparation method, even if the same operation is performed, each well is prepared. It is inevitable that the DNA concentration (amount) contained in the sample is different. On the other hand, in order to improve the typing accuracy in the next-generation sequencer, it is desirable that the DNA fragments contained in the DNA library have a uniform concentration. Therefore, conventionally, a complicated operation of inspecting the prepared library with a bioanalyzer or the like and adjusting the concentration variation is required.
よって本発明は、上記のような従来技術の欠点を克服し、簡便かつ短時間にＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ断片のサイズのみならず濃度を均一に調節することができ、もって次世代シークエンサーに供するのに適したＤＮＡライブラリーを調製することができる方法を提供することを課題とする。 Therefore, the present invention overcomes the disadvantages of the prior art as described above, and can easily and uniformly adjust not only the size of DNA fragments contained in a DNA library but also a next-generation sequencer. It is an object to provide a method capable of preparing a DNA library suitable for use.
前記の課題を解決するために本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の磁気ビーズを用いた精製において、ＰＣＲ反応液と混合する磁気ビーズの比率を調節することにより長すぎる断片及び短すぎる断片を両方とも除去し、ＤＮＡ断片の長さを選択すること、さらにはライブラリーに含まれるＤＮＡ濃度を均一化することができることを見出した。この一連の操作の組み合わせによりモル濃度が均一化されることをＤＮＡ断片の長さと濃度を測定するバイオアナライザーの結果およびＭｉＳｅｑから得られるシーケンスデータ量により確認することで、本発明を完成した。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted intensive research. As a result, in the purification of DNA fragments amplified by PCR using magnetic beads, the ratio of magnetic beads to be mixed with the PCR reaction solution can be adjusted for a long time. It has been found that both too short and too short fragments can be removed, the length of the DNA fragments can be selected, and the DNA concentration contained in the library can be made uniform. The present invention was completed by confirming that the molar concentration was made uniform by the combination of this series of operations based on the results of a bioanalyzer that measures the length and concentration of DNA fragments and the amount of sequence data obtained from MiSeq.
即ち本発明は、以下の工程を含むＤＮＡライブラリーの調製方法を提供する。
（１）試験すべきＤＮＡ断片を含むサンプルを、磁気ビーズ分散液と第１の所定比率で混合して、必要とする範囲の上限を超える長さのＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させ、静置した上清を回収する工程；
（２）前記（１）で回収した上清を、磁気ビーズ分散液と前記第１の所定比率より低い第２の所定比率で混合して、必要とする範囲の下限を超える長さのＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させ、静置した上清を廃棄し、残った磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する工程；及び
（３）前記（２）で回収したＤＮＡ断片を、前記（１）及び（２）で使用した磁気ビーズ分散液の希釈液と混合し、静置した上清を廃棄し、残った磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する工程。
That is, the present invention provides a method for preparing a DNA library comprising the following steps.
(1) A sample containing a DNA fragment to be tested is mixed with a magnetic bead dispersion at a first predetermined ratio, and a DNA fragment having a length exceeding the upper limit of the required range is bound to the magnetic bead and allowed to stand. Recovering the collected supernatant;
(2) A DNA fragment having a length exceeding the lower limit of the required range by mixing the supernatant recovered in (1) above with a magnetic bead dispersion at a second predetermined ratio lower than the first predetermined ratio. And (3) the step of recovering the DNA fragments bound to the magnetic beads; and (3) recovering the DNA fragments recovered in (2) above; A step of mixing the diluted magnetic bead dispersion liquid used in (2), discarding the left supernatant, and collecting the remaining DNA fragments bound to the magnetic beads.
本発明の方法では、疎水性相互作用を増大させた水性媒体に磁気ビーズを浮遊させた磁気ビーズ分散液を用いたサイズ選択及び濃度調整により簡便にＤＮＡ断片長分布の縮小及び濃度範囲の均一化が達成されるので、極めて短時間で多検体のＤＮＡライブラリーを調製することができる。得られたＤＮＡライブラリーは次世代シークエンサーでの多検体解析におけるデータ量の均一化を実現することから、高精度のタイピングに適したものとなる。 In the method of the present invention, DNA fragment length distribution is easily reduced and the concentration range is made uniform by size selection and concentration adjustment using a magnetic bead dispersion in which magnetic beads are suspended in an aqueous medium with increased hydrophobic interaction. Thus, a multi-sample DNA library can be prepared in a very short time. The obtained DNA library is suitable for high-accuracy typing because it achieves uniform data volume in multi-analyte analysis with a next-generation sequencer.
以下に、本発明のＤＮＡライブラリー調製方法を工程毎に詳細に説明する。
まず、本発明の調製方法の工程（１）では、次世代シークエンサーでタイピングすべきＤＮＡを含むサンプルから調製されるＤＮＡ断片（試験すべきＤＮＡ断片）を含むサンプルを用いる。
本発明において「試験すべきＤＮＡ断片」とは、被験体から取得したサンプルから抽出し、断片化し、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片である。このＤＮＡ断片を調製する方法は特に限定されず、エマルジョンＰＣＲ等の当該技術分野で既知の手法を用いて調製してよい。
Below, the DNA library preparation method of this invention is demonstrated in detail for every process.
First, in step (1) of the preparation method of the present invention, a sample containing a DNA fragment (DNA fragment to be tested) prepared from a sample containing DNA to be typed with a next-generation sequencer is used.
In the present invention, the “DNA fragment to be tested” is a DNA fragment extracted from a sample obtained from a subject, fragmented, and PCR amplified. The method for preparing this DNA fragment is not particularly limited, and may be prepared using a technique known in the art such as emulsion PCR.
工程（１）においては、試験すべきＤＮＡ断片を含むサンプルを、磁気ビーズ分散液と第１の所定比率で混合する。
本発明で用いられる「磁気ビーズ分散液」は、ＰＣＲ増幅反応を行った際に得られるような、ＤＮＡと、残存するｄＮＴＰや塩、プライマーやプライマーダイマーなどの夾雑物を含む反応混合物からＤＮＡを精製する際に使用されている磁気ビーズ分散液でよい。
In step (1), a sample containing a DNA fragment to be tested is mixed with a magnetic bead dispersion at a first predetermined ratio.
The “magnetic bead dispersion” used in the present invention is DNA obtained from a reaction mixture containing DNA and impurities such as residual dNTP, salt, primer and primer dimer, which are obtained when PCR amplification reaction is performed. The magnetic bead dispersion used in the purification may be used.
磁気ビーズ分散液に含まれる磁気ビーズは、特に限定されないが、ビーズの粒子表面にＤＮＡを可逆的に結合させることのできる常磁性微小粒子であり、約１．０μｍ程度の均一な粒子径を有する粒子が好ましい。例えば、可逆的固相法（Solid Phase Reversible Immobilization: SPRI）の原理を利用した磁気ビーズ（Agencourt（商標）SPRI（商標））等が好ましく用いられる。このＳＰＲＩ磁気ビーズは、ポリスチレン製のコアに、約４０％の鉄成分を含有するマグネタイト（磁鉄鉱）層を被覆し、更にカルボン酸修飾ポリマーで表面を被覆したコア−シェル構造を有する直径１．０μｍ±８％の磁気ビーズである。 The magnetic beads contained in the magnetic bead dispersion are not particularly limited, but are paramagnetic microparticles capable of reversibly binding DNA to the particle surfaces of the beads and have a uniform particle size of about 1.0 μm. Particles are preferred. For example, magnetic beads (Agencourt (trademark) SPRI (trademark)) using the principle of a reversible solid phase method (Solid Phase Reversible Immobilization: SPRI) are preferably used. This SPRI magnetic bead has a core-shell structure in which a polystyrene core is coated with a magnetite layer containing about 40% iron component, and the surface is further coated with a carboxylic acid-modified polymer. ± 8% magnetic beads.
本発明で最も好ましく使用されるのは、前記ＳＰＲＩ磁気ビーズを、好ましくは２０重量％のポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ８０００）及び２．５Ｍのアルカリ金属塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み疎水性相互作用を増大させた水性媒体中に分散させた磁気ビーズ分散液である。この磁気ビーズ分散液としては、「ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ」という商品名で市販されているものを使用することができる。なお、ポリエチレングリコール及びアルカリ金属塩の種類及び濃度は、本発明の効果を奏する範囲内で適宜調整可能である。
従来の「ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ」は、精製されるサンプル量（μＬ）に対して１．８倍量の磁気ビーズ分散液を用いることにより、サイズの大きいＤＮＡを除去する工程で用いられていた。本発明では、試験すべきＤＮＡ断片を含むサンプル量と混合する磁気ビーズ分散液との比率（容量比率）を変えることによりビーズに吸着されるＤＮＡサイズが変化することに着目し、従来の比率より大幅に低い第1の所定比率で混合することにより、ＤＮＡサイズの上限値を、次世代シークエンサーでのタイピングに適した「必要な範囲」の上限、例えば約１０００ｂｐとすることができた。
Most preferably used in the present invention, the SPRI magnetic beads preferably comprise 20% by weight polyethylene glycol (eg PEG 8000) and 2.5M alkali metal salt (eg sodium chloride) for hydrophobic interaction. It is a magnetic bead dispersion liquid dispersed in an aqueous medium with an increased amount. As this magnetic bead dispersion liquid, what is marketed with the brand name of "AMpure XP" can be used. In addition, the kind and density | concentration of polyethyleneglycol and an alkali metal salt can be suitably adjusted within the range with the effect of this invention.
The conventional “AMpure XP” has been used in the process of removing large DNA by using 1.8 times the amount of magnetic bead dispersion with respect to the amount of sample to be purified (μL). In the present invention, focusing on the fact that the size of the DNA adsorbed on the beads changes by changing the ratio (volume ratio) between the sample amount containing the DNA fragment to be tested and the magnetic bead dispersion to be mixed, By mixing at a significantly lower first predetermined ratio, the upper limit of the DNA size could be set to the upper limit of the “necessary range” suitable for typing in the next-generation sequencer, for example, about 1000 bp.
本発明の方法の工程（１）で採用される第１の所定比率は、０．３〜０．５、好ましくは０．３５〜０．４５、最も好ましくは約０．４である。
試験すべきＤＮＡ断片を含むサンプルに約０．４の比率で磁気ビーズ分散液を混合し、ピペッティングで十分に攪拌した後に静置すると、約１０００ｂｐを超えるサイズのＤＮＡ断片は磁気ビーズに結合し、上清中には約１０００ｂｐ以下のＤＮＡ断片が含まれることになる。
そこで、マグネットスタンド等を用いて磁気ビーズを分離し、上清を回収することにより約１０００ｂｐ以下のサイズのＤＮＡ断片を含むサンプルが得られる。
The first predetermined ratio employed in step (1) of the method of the present invention is 0.3 to 0.5, preferably 0.35 to 0.45, and most preferably about 0.4.
When a sample containing a DNA fragment to be tested is mixed with a magnetic bead dispersion at a ratio of about 0.4 and left to stand after sufficient stirring by pipetting, a DNA fragment of a size exceeding about 1000 bp binds to the magnetic bead. In the supernatant, a DNA fragment of about 1000 bp or less is contained.
Therefore, a sample containing a DNA fragment having a size of about 1000 bp or less can be obtained by separating the magnetic beads using a magnet stand or the like and collecting the supernatant.
次に、本発明の方法の工程（２）においては、前記（１）で回収した上清、即ち、約１０００ｂｐ以下のサイズのＤＮＡ断片を含むサンプルを、磁気ビーズ分散液と前記第１の所定比率より低い第２の所定比率で混合して、約５００ｂｐ以下のサイズのＤＮＡ断片を除去する。
前記工程（１）で述べたように、サンプルと磁気ビーズ分散液との配合比率を変えることにより、ビーズに吸着するＤＮＡのサイズが変化する。
この工程（２）においては、サンプルに対する磁気ビーズ分散液の配合比率を、工程（１）における第１の所定比率よりも高い第２の所定比率とすることによって、目的とするサイズの下限値に満たないサイズの短いＤＮＡ断片が除去される。
Next, in the step (2) of the method of the present invention, the supernatant collected in the above (1), that is, a sample containing a DNA fragment having a size of about 1000 bp or less is added to the magnetic bead dispersion and the first predetermined solution. Mixing at a second predetermined ratio lower than the ratio removes DNA fragments having a size of about 500 bp or less.
As described in the step (1), the size of DNA adsorbed on the beads is changed by changing the blending ratio of the sample and the magnetic bead dispersion.
In this step (2), by setting the blending ratio of the magnetic bead dispersion to the sample to a second predetermined ratio higher than the first predetermined ratio in step (1), the lower limit of the target size is obtained. Short DNA fragments of less than size are removed.
具体的な手法は工程（１）と同様であるが、工程（２）で採用する第２の所定比率は、０．４５〜０．６、好ましくは約０．５であり、上清を廃棄して磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する点で工程（１）とは異なる。
磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する方法は当該分野で通常用いられている方法でよく、例えば、溶出バッファを加えてＤＮＡ断片を磁気ビーズから溶出させ、溶出したＤＮＡ断片を回収することができる。このようにして、ＤＮＡ断片のサイズの下限値を次世代シークエンサーに適した「必要な範囲」の下限、例えば約５００ｂｐとすることができる。
このようにして調製されたサンプルは、好ましくは約５００ｂｐ〜約１０００ｂｐのサイズのＤＮＡ断片を含んでいる。
なお、本発明におけるＤＮＡ断片サイズの「必要な範囲」とは、そのライブラリーを供する次世代シークエンサーによっても変化するが、一般的には、「必要な範囲」の下限値は約２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、及び８００ｂｐから選択され、上限値は約１０００ｂｐ、１２００ｂｐ、１５００ｂｐ、２０００ｂｐから選択されるが、これらの値の近傍及び中間値から選択することもできる。
The specific method is the same as in step (1), but the second predetermined ratio adopted in step (2) is 0.45 to 0.6, preferably about 0.5, and the supernatant is discarded. Thus, the step (1) is different in that the DNA fragments bound to the magnetic beads are recovered.
The method for recovering the DNA fragments bound to the magnetic beads may be a method commonly used in the art. For example, an elution buffer can be added to elute the DNA fragments from the magnetic beads, and the eluted DNA fragments can be recovered. . In this way, the lower limit of the size of the DNA fragment can be set to the lower limit of the “necessary range” suitable for the next-generation sequencer, for example, about 500 bp.
The sample thus prepared preferably contains a DNA fragment having a size of about 500 bp to about 1000 bp.
The “required range” of the DNA fragment size in the present invention also varies depending on the next-generation sequencer that provides the library, but generally, the lower limit of the “required range” is about 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, and 800 bp are selected, and the upper limit value is selected from about 1000 bp, 1200 bp, 1500 bp, and 2000 bp, but it is also possible to select from the vicinity and intermediate values of these values.
次に、本発明の調製方法の工程（３）では、前記工程（１）及び（２）を通して約５００ｂｐ〜約１０００ｂｐの範囲にサイズ選択されたＤＮＡ断片を、希釈した磁気ビーズ分散液を用いて濃度調節する。
本発明で用いているＡＭｐｕｒｅ ＸＰ等の磁気ビーズは、ＤＮＡのサイズ選択に使用されていたが、その磁気ビーズ濃度を調節することによりサンプル中のＤＮＡ濃度を均一化できることは全く知られておらず予測もされていなかった。
Next, in the step (3) of the preparation method of the present invention, a DNA fragment whose size is selected in the range of about 500 bp to about 1000 bp through the steps (1) and (2) is diluted with a magnetic bead dispersion. Adjust the concentration.
The magnetic beads such as AMpure XP used in the present invention were used for DNA size selection, but it is not known at all that the DNA concentration in the sample can be made uniform by adjusting the magnetic bead concentration. It was not even predicted.
本発明者等は、磁気ビーズ分散液に含まれる磁気ビーズ量（濃度）によって、磁気ビーズに結合するＤＮＡ量が変化することを見出し、この相関関係を利用することにより、断片サイズに依らずＤＮＡ濃度を均一化（ノーマライゼーション）することに成功した。
具体的には、前記工程（１）及び（２）で使用した磁気ビーズ分散液を、その媒体となる２０％ＰＥＧを含む水溶液で希釈した分散液を用いる。希釈率は、１０倍から４０倍、好ましくは１５〜３０倍、より好ましくは約２０倍である。４０倍以上に希釈した場合は、磁気ビーズが極めて少量になるため回収が困難になり好ましくない。
The present inventors have found that the amount of DNA bound to magnetic beads varies depending on the amount (concentration) of magnetic beads contained in the magnetic bead dispersion, and by utilizing this correlation, DNA can be obtained regardless of the fragment size. We succeeded in making the concentration uniform (normalization).
Specifically, a dispersion obtained by diluting the magnetic bead dispersion used in the steps (1) and (2) with an aqueous solution containing 20% PEG as the medium is used. The dilution rate is 10 to 40 times, preferably 15 to 30 times, more preferably about 20 times. When diluted 40 times or more, the amount of magnetic beads becomes extremely small, which makes recovery difficult and is not preferable.
約２０倍に希釈した前記（１）及び（２）の所定濃度より低濃度で含む磁気ビーズ分散液と混合して静置し、マグネットスタンド等を用いて磁気ビーズを固定して上清を回収して廃棄する。残った磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収すれば、約５００〜１０００ｂｐのサイズを有するＤＮＡ断片を等濃度で含むサンプルを得ることができる。 Mix with the magnetic bead dispersion containing a concentration lower than the predetermined concentration of (1) and (2), diluted approximately 20 times, and let stand, and fix the magnetic beads using a magnet stand etc. and collect the supernatant. And discard. By recovering the DNA fragments bound to the remaining magnetic beads, a sample containing DNA fragments having a size of about 500 to 1000 bp at an equal concentration can be obtained.
上記の本発明の方法に従って調製されたＤＮＡライブラリーは、次世代シークエンサーを用いたタイピングに適した範囲のサイズのＤＮＡ断片を等濃度で含有しているため、次世代シークエンサーにおける塩基配列の読み取りの精度が向上し、より正確なタイピングが可能となる。
また、本発明のＤＮＡライブラリー調製方法は、磁気ビーズを用いた簡便な手法であり、従来の調製方法に比較して時間的及び人的コストを削減することができる。
The DNA library prepared according to the above-described method of the present invention contains DNA fragments in a range suitable for typing using the next-generation sequencer at an equal concentration. Accuracy is improved and more accurate typing is possible.
In addition, the DNA library preparation method of the present invention is a simple technique using magnetic beads, and can reduce time and human costs compared to conventional preparation methods.
以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with specific examples, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）磁気ビーズ分散液の調製
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（商標）１０００μＬを１２０００ｒｐｍで１分間遠心し、静置後、上清１０００μＬを廃棄して残りの磁気ビーズを回収した。
１００ｇのポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）及び７３ｇの塩化ナトリウムを含む５００ｍＬ水溶液を調製し、当該水溶液５００μＬに前記回収した磁気ビーズを分散させた。すなわち、２０％重量のＰＥＧおよび２．５Ｍの塩化ナトリウムの水溶液に磁気ビーズ濃度がＡＭｐｕｒｅ ＸＰの２倍の濃度にて再浮遊した磁気ビーズ分散液を調整した。
以下の例においては、ここで調製した磁気ビーズ分散液を使用した。
Example 1 Preparation of Magnetic Beads Dispersion Agencourt AMpure XP ™ 1000 μL was centrifuged at 12000 rpm for 1 minute, allowed to stand, 1000 μL of supernatant was discarded, and the remaining magnetic beads were recovered.
A 500 mL aqueous solution containing 100 g of polyethylene glycol (PEG 8000) and 73 g of sodium chloride was prepared, and the recovered magnetic beads were dispersed in 500 μL of the aqueous solution. That is, a magnetic bead dispersion was resuspended in an aqueous solution of 20% PEG and 2.5M sodium chloride at a magnetic bead concentration twice that of AMpure XP.
In the following examples, the magnetic bead dispersion prepared here was used.
（実施例２）磁気ビーズによるＤＮＡ断片のサイズ選択
被検体から取得したＨＬＡ遺伝子領域を含むＤＮＡサンプルを用いて、以下の条件で断片化及びＰＣＲ増幅を行ってＤＮＡ断片を含むライブラリーを調製した。
なお、以下の実験は９６ウェルプレート上で実施した。
１．ＰＣＲ増幅
組成：
ＤＮＡ（２０ｎｇ） ０．５μＬ
５×Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ０．８μＬ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｆ ５μＭ ０．４μＬ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｒ ５μＭ ０．４μＬ
ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ ＧＸＬ ０．４μＬ
Ｈ ２ Ｏ ５．５μＬ
合計 １０．０μＬ
プライマー配列：
Ｐｒｉｍｅｒ Ｆ：ＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＴＧＴＣＴＣ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｒ：ＡＧＡＧＴＴＴＡＡＴＴＧＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＡＣＡ
ＰＣＲ条件：
（１）９４℃ ２分間
（２）９８℃ １０秒間
（３）６８℃ ５分間
（２）及び（３）を３０サイクル繰り返し、その後は４℃で保存した。
(Example 2) Size selection of DNA fragments using magnetic beads Using a DNA sample containing an HLA gene region obtained from a specimen, a library containing DNA fragments was prepared by performing fragmentation and PCR amplification under the following conditions: .
The following experiment was performed on a 96-well plate.
1. PCR amplification Composition:
DNA (20 ng) 0.5 μL
5 × Buffer 2 μL
dNTP Mixture 0.8μL
Primer F 5 μM 0.4 μL
Primer R 5 μM 0.4 μL
PrimerSTAR GXL 0.4μL
H 2 O 5.5 μL
Total 10.0μL
Primer sequence:
Primer F: AGGTGAATGGCTCTGAAAATTGTTCTC
Primer R: AGAGTTTAATTGTAATGCTGTTTGACACA
PCR conditions:
(1) 94 ° C. for 2 minutes (2) 98 ° C. for 10 seconds (3) 68 ° C. for 5 minutes (2) and (3) were repeated 30 cycles, and then stored at 4 ° C.
２．タグ化
組成：
ＰＣＲ産物（１０ｎｇ） ４μＬ
ＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ
ＴＤＥ１ １μＬ
合計 １０μＬ
条件：
５５℃ ５分間
その後は１０℃で保存した。
2. Tagged composition:
PCR product (10 ng) 4 μL
TD Buffer 5μL
TDE1 1μL
Total 10μL
conditions:
It was stored at 10 ° C. for 5 minutes at 55 ° C.
３．タグ化ＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅
組成：
タグ化ＤＮＡ ２μＬ
Ｉｎｄｅｘ１ Ｐｒｉｍｅｒ １μＬ
Ｉｎｄｅｘ２ Ｐｒｉｍｅｒ １μＬ
２×ＫａｐａＨｉＦｉＨＳＲＭ ５μＬ
ＰＰＣ １μＬ
合計 １０μＬ
ＰＣＲ条件：
（１）７２℃ ３分間
（２）９８℃ ３０秒間
（３）９８℃ １０秒間
（４）６３℃ ２０秒間
（５）７２℃ ３分間
（３）〜（５）を８サイクル繰り返し、その後は１０℃で保存した。
3. PCR amplification of tagged DNA libraries Composition:
Tagged DNA 2μL
Index1 Primer 1μL
Index2 Primer 1μL
2 x KapaHiFiHSRM 5μL
PPC 1μL
Total 10μL
PCR conditions:
(1) 72 ° C. for 3 minutes (2) 98 ° C. for 30 seconds (3) 98 ° C. for 10 seconds (4) 63 ° C. for 20 seconds (5) 72 ° C. for 3 minutes Repeat (3) to (5) for 8 cycles, then 10 Stored at ° C.
４．ＤＮＡ断片のサイズ選択
上記３で得たタグ化ＤＮＡライブラリーの５μＬを水４５μＬと混合して５０μＬのサンプルとした。当該サンプルに実施例１で調製した磁気ビーズ分散液を各種比率（容積比）で加え、１０回のピペッティングの後に１分間静置し、マグネットスタンドを用いて磁気ビーズを固定し、上清を廃棄した後、磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を溶出させ、得られたＤＮＡ断片のサイズ（長さ）の分布をバイオアナライザーで測定した。その結果を図１に示す。
4). Size selection of DNA fragment 5 μL of the tagged DNA library obtained in 3 above was mixed with 45 μL of water to make a 50 μL sample. To this sample, the magnetic bead dispersion prepared in Example 1 was added at various ratios (volume ratios), allowed to stand for 1 minute after 10 pipettings, and the magnetic beads were fixed using a magnet stand. After discarding, the DNA fragments bound to the magnetic beads were eluted, and the size (length) distribution of the obtained DNA fragments was measured with a bioanalyzer. The result is shown in FIG.
図１には、ＤＮＡサンプル（容量）に加える磁気ビーズ分散液の比率と、磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片のサイズを示すバイオアナライザーのゲルイメージの結果（上段）及び磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片のおよそのサイズをまとめた表（下段）を示す。
磁気ビーズの比率を上昇させることにより磁気ビーズに結合するＤＮＡ断片のサイズ（長さ）が低下する傾向が顕著に確認された。
FIG. 1 shows the result of the bioanalyzer gel image showing the ratio of the magnetic bead dispersion added to the DNA sample (volume), the size of the DNA fragment bound to the magnetic bead (upper stage), and the DNA fragment bound to the magnetic bead. A table (bottom) summarizing the approximate sizes is shown.
A tendency to decrease the size (length) of the DNA fragment bound to the magnetic beads by increasing the ratio of the magnetic beads was remarkably confirmed.
（実施例３）本発明によるＤＮＡサイズ選択
本発明の方法の工程（１）及び（２）により、ＤＮＡ断片のサイズ選択を行った。
具体的には、実施例１と同様にして、ＤＮＡサンプルに対して０．４倍の比率の磁気ビーズ分散液を加え、約１０００ｂｐを超えるＤＮＡ断片が結合した磁気ビーズをマグネットスタンドで固定し、上清を回収した。
次いで、前記上清に対して０．５倍の比率で磁気ビーズ分散液を加え、約５００ｂｐ以上のＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させた。
(Example 3) DNA size selection according to the present invention Size selection of DNA fragments was performed by steps (1) and (2) of the method of the present invention.
Specifically, in the same manner as in Example 1, 0.4 times the magnetic bead dispersion was added to the DNA sample, and the magnetic beads bound with DNA fragments exceeding about 1000 bp were fixed with a magnet stand, The supernatant was collected.
Next, a magnetic bead dispersion was added at a ratio of 0.5 to the supernatant to bind a DNA fragment of about 500 bp or more to the magnetic beads.
図２は、実施例２において、ＤＮＡサンプルに対して（ａ）０．４倍及び（ｂ）０．５倍の比率で磁気ビーズ分散液を加えて処理したときに磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片、及び（ｃ）実施例３で最終的に磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片の具体的なサイズ分布を示す。
図２から明らかなように、本発明によるサイズ選択（工程（１）及び（２））を実施することにより、長すぎる断片及び短すぎる断片が有効に排除され、ほぼ目的とするサイズ範囲（図２の黒塗り部分）のＤＮＡ断片を含有するＤＮＡライブラリーを調製することができた。
FIG. 2 shows DNA fragments bound to magnetic beads when treated by adding a magnetic bead dispersion in a ratio of (a) 0.4 times and (b) 0.5 times to a DNA sample in Example 2. And (c) shows a specific size distribution of the DNA fragment finally bound to the magnetic beads in Example 3.
As is apparent from FIG. 2, by carrying out the size selection according to the present invention (steps (1) and (2)), fragments that are too long and fragments that are too short are effectively eliminated, and almost the intended size range (FIG. 2). A DNA library containing the DNA fragment of the black portion (2) was prepared.
（実施例４）磁気ビーズによる濃度調節（ノーマライゼーション）
実施例１〜３で使用した磁気ビーズ分散液を、２０重量％のＰＥＧを含む水溶液で希釈し、その希釈率と（希釈した）磁気ビーズ分散液１００μＬ当たりに結合するＤＮＡ量との関係を測定し、その結果を図３に示す。
磁気ビーズ分散液を希釈すれば単位容量当たり分散液に含まれる磁気ビーズの量が減少するため、結合するＤＮＡ量の減少することが確認された。
(Example 4) Concentration control by magnetic beads (normalization)
The magnetic bead dispersion used in Examples 1 to 3 was diluted with an aqueous solution containing 20% by weight of PEG, and the relationship between the dilution rate and the amount of DNA bound per 100 μL of (diluted) magnetic bead dispersion was measured. The results are shown in FIG.
It was confirmed that when the magnetic bead dispersion was diluted, the amount of magnetic beads contained in the dispersion per unit volume was decreased, so that the amount of DNA to be bound was decreased.
一方、磁気ビーズ分散液を希釈すると磁気ビーズに固定されるＤＮＡ量は減少するが、同様の操作を行った各ウェル間のＤＮＡ量を比較すると、希釈率を上げるに従って、ウェル間での固定化されるＤＮＡ量が均一化されることが判明した。
例えば、実施例３でサイズ選択したサンプルでは、ＤＮＡサイズに関しては所定範囲に調節されているものの、各ウェルのサンプルに含まれるＤＮＡ量は、図４（ａ）に示すように不均一であった。これに対して、本発明の工程（３）に従って、２０倍に希釈した磁気ビーズ分散液を加えて処理した場合、磁気ビーズに結合（固定化）されたＤＮＡ量は、高度に均一化された（図４（ｂ））。
On the other hand, when the magnetic bead dispersion is diluted, the amount of DNA immobilized on the magnetic beads decreases, but when comparing the amount of DNA between wells that had been subjected to the same operation, the immobilization between the wells increases as the dilution rate increases. It was found that the amount of DNA to be made uniform.
For example, in the sample whose size was selected in Example 3, the DNA size was adjusted to a predetermined range, but the amount of DNA contained in each well sample was uneven as shown in FIG. 4 (a). . On the other hand, when the 20-fold diluted magnetic bead dispersion was added and processed according to the step (3) of the present invention, the amount of DNA bound (immobilized) to the magnetic beads was highly uniformed. (FIG. 4B).
前記のように希釈した磁気ビーズ分散液を用いてノーマライゼーションを施した９６サンプルから得られたそれぞれのシーケンスデータ量を、サンプル毎にプロットしたのが図５である。
一方、前記特許文献１に記載されているように、アガロースゲルを切り出して調製した９６サンプルから得られたそれぞれのシーケンスデータ量を図６にプロットした。
図５及び図６から明らかなように、本発明の方法（工程（３））に従ってＤＮＡモル濃度調節（ノーマライゼーション）を実施することにより、９６サンプルそれぞれのデータ量を均一にすることができ、従来の煩雑な処理に比較しても極めて高い均一化が達成できた。
FIG. 5 is a diagram in which the respective sequence data amounts obtained from the 96 samples subjected to normalization using the magnetic bead dispersion diluted as described above are plotted for each sample.
On the other hand, as described in Patent Document 1, each sequence data amount obtained from 96 samples prepared by cutting out an agarose gel was plotted in FIG.
As is clear from FIGS. 5 and 6, by performing DNA molar concentration adjustment (normalization) according to the method of the present invention (step (3)), the data amount of each of 96 samples can be made uniform. Compared with this complicated process, extremely high uniformity was achieved.
Claims (2)
（２）前記（１）で回収した上清を、磁気ビーズ分散液と前記第１の所定比率より低い第２の所定比率で混合して、必要とする範囲の下限を超える長さのＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させ、静置した上清を廃棄し、残った磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する工程；及び
（３）前記（２）で回収したＤＮＡ断片を、前記（１）及び（２）で使用した磁気ビーズ分散液の希釈液と混合し、静置した上清を廃棄し、残った磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する工程
を含む、ＤＮＡライブラリーの調製方法。 (1) A sample containing a DNA fragment to be tested is mixed with a magnetic bead dispersion at a first predetermined ratio, and a DNA fragment having a length exceeding the upper limit of the required range is bound to the magnetic bead and allowed to stand. Recovering the collected supernatant;
(2) A DNA fragment having a length exceeding the lower limit of the required range by mixing the supernatant recovered in (1) above with a magnetic bead dispersion at a second predetermined ratio lower than the first predetermined ratio. And (3) the step of recovering the DNA fragments bound to the magnetic beads; and (3) recovering the DNA fragments recovered in (2) above; A method for preparing a DNA library, comprising a step of mixing the diluted magnetic bead dispersion liquid used in (2), discarding the left supernatant, and recovering the remaining DNA fragments bound to the magnetic beads.
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