JP2015159766A - Test method for cushing's syndrome, biomarker for test, and therapeutic agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、クッシング症候群の検査方法、クッシング症候群の検査のためのバイオマーカー、さらに当該バイオマーカーに着目したクッシング症候群の治療剤並びに治療剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a testing method for Cushing's syndrome, a biomarker for testing Cushing's syndrome, a therapeutic agent for Cushing's syndrome focusing on the biomarker, and a screening method for the therapeutic agent.
クッシング症候群では過剰なコルチゾールの分泌により、高血圧、II型糖尿病、中心性肥満、骨粗しょう症やうつ病などの症状を呈するが、その原因となる分子病態はこれまで不明であった。副腎におけるコルチゾールの生合成は、脳下垂体前葉から分泌される副腎皮質刺激ホルモン（以下「ACTH」ともいう。）によって調節される。ACTHが分泌され副腎皮質細胞のメラノコルチン-2受容体に結合すると、サイクリックAMP（cAMP）の産生が増加し、cAMP依存性プロテインキナーゼ（以下、「PKA」ともいう。）が活性化される。活性化したPKAによりステロイド生合成に関わる酵素の発現が誘導され、コルチゾールが産生される。下垂体腺腫や異所からの異常なACTH分泌は、クッシング症候群の主要な原因となる（ACTH依存性クッシング症候群）。また、副腎皮質腫瘍が、ACTHによる制御から逸脱してコルチゾールを自律的かつ過剰に産生する場合もあり、クッシング症候群のもう1つの主要な原因となる（ACTH非依存性クッシング症候群）。 In Cushing's syndrome, excessive cortisol secretion causes symptoms such as hypertension, type II diabetes, central obesity, osteoporosis and depression, but the molecular pathology that causes it has not been known. Cortisol biosynthesis in the adrenal gland is regulated by adrenocorticotropic hormone (hereinafter also referred to as “ACTH”) secreted from the anterior pituitary gland. When ACTH is secreted and bound to the melanocortin-2 receptor of adrenocortical cells, cyclic AMP (cAMP) production increases and cAMP-dependent protein kinase (hereinafter also referred to as “PKA”) is activated. The activated PKA induces the expression of enzymes involved in steroid biosynthesis and produces cortisol. Abnormal ACTH secretion from pituitary adenomas and ectopic sites is a major cause of Cushing's syndrome (ACTH-dependent Cushing's syndrome). Adrenal cortex tumors may also deviate from control by ACTH and produce cortisol autonomously and excessively, which is another major cause of Cushing's syndrome (ACTH-independent Cushing's syndrome).
ACTH非依存性クッシング症候群の病態生理は広く研究されているものの、コルチゾールの自律的な産生の原因となる分子病態は不明であった。本症候群で呈する症状の多くは、一般の集団においても高頻度に見られるため、時に診断が難しく、長期間にわたって適切な治療がなされないケースがあることが問題とされている。また、クッシング症候群の他にも副腎腫瘍が原因となり高血圧を呈する疾患（原発性アルドステロン症・褐色細胞腫）が存在し、これらを正確に鑑別する必要がある。これらのことから、ACTH非依存性クッシング症候群において特徴的に認められる分子病態を解明することが、臨床的な側面からも非常に重要であると考えられる。 Although the pathophysiology of ACTH-independent Cushing syndrome has been extensively studied, the molecular pathology responsible for the autonomous production of cortisol remains unclear. Many of the symptoms present in this syndrome are frequently seen even in the general population, so it is sometimes difficult to diagnose and there are cases where appropriate treatment is not performed over a long period of time. In addition to Cushing's syndrome, there are diseases (primary aldosteronism and pheochromocytoma) that cause hypertension due to adrenal tumors, and it is necessary to accurately distinguish them. From these facts, it is considered to be very important from the clinical aspect to elucidate the molecular pathology that is characteristically observed in ACTH-independent Cushing syndrome.
PRKAR1A遺伝子はPKAの「調節サブユニット」をコードする遺伝子であり、PRKACA遺伝子は、PKAの「触媒サブユニット」をコードする遺伝子である。PKAは、通常時はPRKACAに調節サブユニットであるPRKAR1Aが結合し不活性の状態となっている。ACTHの刺激により細胞内のcAMPの濃度が上昇すると、PKAの触媒サブユニットが調節サブユニットから解離して酵素活性を発揮し、コルチゾールの産生を促すことが知られている。 The PRKAR1A gene is a gene encoding a “regulatory subunit” of PKA, and the PRKACA gene is a gene encoding a “catalytic subunit” of PKA. Normally, PKA is inactive when PRKAR1A, a regulatory subunit, binds to PRKACA. It is known that when the intracellular cAMP concentration is increased by ACTH stimulation, the catalytic subunit of PKA dissociates from the regulatory subunit and exerts enzyme activity to promote the production of cortisol.
両側副腎過形成とクッシング症候群を呈する疾患として、カーニー複合と呼ばれる稀な遺伝性疾患がある。この疾患では、PKAの調節サブユニットをコードするPRKAR1A遺伝子に先天性の変異があることが知られている。この変異により、調節サブユニットのタンパク発現量が減少するため、PKAの活性が高レベルとなることが明らかとされている（非特許文献１）。カーニー複合は非常に稀な疾患であるため、ACTH非依存性クッシング症候群のうちPRKAR1A遺伝子の変異によって説明される症例はごく一部にすぎない。クッシング症候群の原因となる分子病態を解明し、より効果的な検査方法や治療方法の開発が望まれている。 A rare hereditary disease called Kearney complex is a disease presenting with bilateral adrenal hyperplasia and Cushing's syndrome. In this disease, it is known that there is a congenital mutation in the PRKAR1A gene encoding the regulatory subunit of PKA. It has been clarified that this mutation results in a high level of PKA activity because the protein expression level of the regulatory subunit decreases (Non-patent Document 1). Since Kearney complex is a very rare disease, only a few cases of ACTH-independent Cushing syndrome are explained by mutations in the PRKAR1A gene. It is desired to elucidate the molecular pathology causing Cushing's syndrome and to develop more effective testing and treatment methods.
本発明は、クッシング症候群の原因となる分子病態を解明し、効果的な検査方法を提供することを課題とする。またクッシング症候群の検査のためのバイオマーカーを提供し、さらに当該バイオマーカーに着目したクッシング症候群の治療剤並びに治療剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to elucidate the molecular pathology causing Cushing's syndrome and provide an effective test method. It is another object of the present invention to provide a biomarker for testing Cushing's syndrome, and to provide a therapeutic agent for Cushing's syndrome and a screening method for the therapeutic agent focusing on the biomarker.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、クッシング症候群において、PKAの触媒サブユニットをコードする遺伝子であるPRKACA遺伝子に変異を有する場合があることを見出し、本発明を完成した。これまでに、他の疾患においてもPRKACA遺伝子の変異の報告はなされていない。他の内分泌疾患において、背景技術の欄で言及したPRKAR1A遺伝子のほか、GNAS遺伝子やPDE8B遺伝子、PDE11A遺伝子など、PKAの活性に影響を与える遺伝子の変異は知られているが、PKAの触媒サブユニット自体の変異は知られていない。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the PRKACA gene, which is a gene encoding the catalytic subunit of PKA, may have a mutation in Cushing's syndrome. Was completed. So far, no PRKACA gene mutation has been reported in other diseases. In other endocrine diseases, there are known mutations in genes that affect PKA activity such as the GNAS gene, PDE8B gene, and PDE11A gene in addition to the PRKAR1A gene mentioned in the background section, but the catalytic subunit of PKA The mutation itself is not known.
即ち本発明は、以下よりなる。
１．サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニットであるPRKACAの変異型を検出することを特徴とする、クッシング症候群の検査方法。
２．変異型PRKACAが、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼの調節サブユニットであるPRKAR1Aとの相互作用を阻害する変異型PRKACAである、前項１に記載のクッシング症候群の検査方法。
３．変異型PRKACAが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第206番目のアミノ酸がロイシン（L）からアルギニン（R）に変異したL206R変異型PRKACAである、前項１に記載のクッシング症候群の検査方法。
４．採取した検体から、PRKACAの変異型をコードする遺伝子を検出することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載のクッシング症候群の検査方法。
５．採取した検体から、PRKACAの変異型を検出することを特徴とする、前項１〜３のいずれか１に記載のクッシング症候群の検査方法。
６．L206R変異型PRKACAからなる、クッシング症候群検査用バイオマーカー。
７．変異型PRKACAを阻害しうる物質を有効成分として含む、クッシング症候群治療剤。
８．変異型PRKACAが、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼの調節サブユニットであるPRKAR1Aとの相互作用を阻害する変異型PRKACAである、前項７に記載のクッシング症候群治療剤。
９．変異型PRKACAが、L206R変異型PRKACAである、前項７に記載のクッシング症候群治療剤。
１０．PRKACAの作用を制御しうる物質をスクリーニングすることを特徴とする、クッシング症候群治療剤のスクリーニング方法。
１１．PRKACAの作用を制御しうる物質のスクリーニングが、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニットであるPRKACAと調節サブユニットであるPRKAR1Aとの相互作用を調節しうる物質であることを特徴とする、前項１０に記載のクッシング症候群治療剤のスクリーニング方法。
That is, this invention consists of the following.
1. A test method for Cushing's syndrome, which comprises detecting a mutant form of PRKACA, which is a catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase.
2. 2. The test method for Cushing's syndrome according to item 1 above, wherein the mutant PRKACA is a mutant PRKACA that inhibits the interaction with PRKAR1A, which is a regulatory subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase.
3. 2. The test method for Cushing's syndrome according to item 1 above, wherein the mutant PRKACA is L206R mutant PRKACA in which the 206th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated from leucine (L) to arginine (R).
4). 4. The test method for Cushing's syndrome according to any one of items 1 to 3, wherein a gene encoding a PRKACA mutant is detected from the collected specimen.
5. 4. The method for examining Cushing's syndrome according to any one of items 1 to 3, wherein a mutant form of PRKACA is detected from the collected specimen.
6). A biomarker for testing Cushing's syndrome consisting of L206R mutant PRKACA.
7). A therapeutic agent for Cushing's syndrome comprising a substance capable of inhibiting mutant PRKACA as an active ingredient.
8). 8. The therapeutic agent for Cushing's syndrome according to item 7 above, wherein the mutant PRKACA is a mutant PRKACA that inhibits interaction with PRKAR1A, which is a regulatory subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase.
9. 8. The therapeutic agent for Cushing's syndrome according to item 7 above, wherein the mutant PRKACA is an L206R mutant PRKACA.
10. A screening method for a therapeutic agent for Cushing's syndrome, which comprises screening a substance capable of controlling the action of PRKACA.
11. The screening of a substance capable of controlling the action of PRKACA is a substance capable of regulating the interaction between PRKACA, which is a catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase, and PRKAR1A, which is a regulatory subunit. 11. A screening method for a therapeutic agent for Cushing's syndrome according to item 10 above.
さらに本発明は、以下も含まれる。
１２．変異型PRKACAを標的とすることを特徴とする、クッシング症候群の治療方法。
Further, the present invention includes the following.
12 A method for treating Cushing's syndrome, characterized by targeting mutant PRKACA.
本発明の検査方法により、クッシング症候群の検査を効果的に行うことができる。特に従来診断が困難であった、ACTH非依存性クッシング症候群の検査を有効に行うことができる。さらには変異型PRKACAを、クッシング症候群検査のためのバイオマーカーとすることができる。そして、変異型PRKACAを標的とする、クッシング症候群治療薬の開発に貢献しうる。 By the inspection method of the present invention, Cushing's syndrome can be effectively tested. In particular, it is possible to effectively test ACTH-independent Cushing syndrome, which has been difficult to diagnose in the past. Furthermore, mutant PRKACA can be used as a biomarker for Cushing's syndrome test. And it can contribute to the development of Cushing's syndrome therapeutic drug targeting mutant PRKACA.
副腎からのコルチゾール分泌が慢性的に分泌過剰になり、特徴的な症候を呈する状態をクッシング症候群という。この場合ACTH分泌が過剰となり二次的にコルチゾール分泌が増加する場合をACTH依存性クッシング症候群といい、副腎から自律的にコルチゾールが過剰産生される場合をACTH非依存性クッシング症候群又は副腎性クッシング症候群という。本明細書における「クッシング症候群」は、ACTH非依存性クッシング症候群、ACTH依存性クッシング症候群のいずれであっても良いが、特に好ましくはACTH非依存性クッシング症候群をいう。 Cushing syndrome is a condition in which cortisol secretion from the adrenal gland is chronically oversecreted and exhibits characteristic symptoms. In this case, when ACTH secretion is excessive and cortisol secretion increases secondarily, it is called ACTH-dependent Cushing syndrome, and when cortisol is overproduced autonomously from the adrenal gland, ACTH-independent Cushing syndrome or adrenal Cushing syndrome That's it. The “Cushing syndrome” in the present specification may be either ACTH-independent Cushing syndrome or ACTH-dependent Cushing syndrome, but particularly preferably refers to ACTH-independent Cushing syndrome.
本発明のクッシング症候群の検査方法は、cAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）の触媒サブユニットであるPRKACAの変異型を検出することを特徴とする。本発明者らは、クッシング症候群のうち副腎腺腫を伴う症例を対象として、全エクソンシークエンスによる網羅的な遺伝子変異解析を行い、PRKACA遺伝子の変異がクッシング症候群と密接に関連していることを見出した。そして、PRKACAの変異により触媒サブユニット（PRKACA）と調節サブユニット（PRKAR1A）が結合しなくなり、cAMPの濃度に依存せず、触媒サブユニットによるPKA酵素活性が高いレベルを維持していることが考えられ、コルチゾールの産生を促すことでクッシング症候群に至っているものと考えられた。 The test method for Cushing's syndrome of the present invention is characterized by detecting a mutant form of PRKACA, which is a catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase (PKA). The present inventors conducted a comprehensive gene mutation analysis by all exon sequences for cases with adrenal adenoma among Cushing syndromes, and found that PRKACA gene mutations are closely related to Cushing syndromes. . The PRKACA mutation causes the catalytic subunit (PRKACA) and the regulatory subunit (PRKAR1A) to become unbound, and the PKA enzyme activity by the catalytic subunit is maintained at a high level regardless of the cAMP concentration. It was thought that Cushing's syndrome was caused by promoting the production of cortisol.
本発明のクッシング症候群の検査方法において「PRKACAの変異型を検出する」とは、PRKACAの変異によってPKA酵素活性が高いレベルを維持しているような型のPRKACAを検出することをいう。例えば、PRKACAの変異によって触媒サブユニット（PRKACA）と調節サブユニット（PRKAR1A）が結合しない立体構造であって、触媒作用を有する変異型PRKACAが挙げられる。変異型PRKACAがPRKAR1Aと結合しないことで、触媒サブユニットであるPRKACAはPRKAR1Aと恒常的に解離しており、PKA酵素活性を発揮される状態となる。その結果コルチゾールの産生を促すと考えられる。そのような性質を有する変異型であればPRKACAのいずれの部位が変異していてもよく、特に限定されないが、例えばGenBank Accession No.NP_002721（cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha isoform 1 [Homo sapiens]）（配列番号１）に示すアミノ酸配列で特定されるPRKACAに関し、第206番目のアミノ酸がロイシン（L）からアルギニン（R）に変異したもの（以下、「L206R変異型PRKACA」という。）が挙げられる。 In the test method for Cushing's syndrome of the present invention, “detecting a PRKACA mutant type” means detecting a type of PRKACA that maintains a high level of PKA enzyme activity due to PRKACA mutation. For example, a mutant PRKACA having a catalytic structure that has a three-dimensional structure in which the catalytic subunit (PRKACA) and the regulatory subunit (PRKAR1A) do not bind due to PRKACA mutation can be mentioned. Since mutant PRKACA does not bind to PRKAR1A, PRKACA, which is a catalytic subunit, is permanently dissociated from PRKAR1A, and PKA enzyme activity is exerted. As a result, it is thought to promote the production of cortisol. Any site of PRKACA may be mutated as long as it is a mutant having such properties. For example, GenBank Accession No. NP_002721 (cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha isoform 1 [Homo sapiens] ) Regarding PRKACA specified by the amino acid sequence shown in (SEQ ID NO: 1), the amino acid at position 206 is mutated from leucine (L) to arginine (R) (hereinafter referred to as “L206R mutant PRKACA”). It is done.
PRKACAの変異型を検出する方法は、「変異型PRKACA」の発現や「変異型PRKACA」そのものを検出しうる方法であればよく、特に限定されない。例えば遺伝子レベルの検出であってもよいし、タンパク質レベルの検出であってもよい。 The method for detecting a mutant form of PRKACA is not particularly limited as long as it is a method capable of detecting the expression of “mutant PRKACA” and “mutant PRKACA” itself. For example, it may be gene level detection or protein level detection.
遺伝子レベルでの変異型PRKACAの検出は、自体公知の方法を応用して実施することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「PCR」と略称する）により、所望の位置の塩基を含むPRKACA遺伝子の部分配列を増幅し、得られた増幅産物の塩基配列をシークエンス法、例えばダイレクトシークエンシング法により配列決定する方法を用いることができる。配列決定法としてはシークエンス法以外に、ハイブリダイゼーション法及び制限酵素断片長多型（RFLP）解析法等が利用できる。 Detection of mutant PRKACA at the gene level can be carried out by applying a method known per se. For example, a partial sequence of the PRKACA gene containing a base at a desired position is amplified by polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as “PCR”), and the base sequence of the obtained amplification product is sequenced, for example, direct sequencing The sequencing method can be used. As a sequencing method, in addition to the sequencing method, a hybridization method, a restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) analysis method, and the like can be used.
例えば、L206R変異型PRKACA遺伝子を検出するために、以下の配列番号２〜４に示すプライマーを使用して、PCRにより被検試料中のDNAについてL206R変異に関連する部分配列を増幅し、検出することができる。プライマーは以下に限定されず、適宜必要な配列を構築することができる。
PRKACA_L206（Forward primer）：GGGAGGCTCCTACTTTGCTC （配列番号２）
PRKACA_L206（Reverse primer）：CAGCAGGGCTACATTCAGGT （配列番号３）
PRKACA_L206_FFPE（Forward primer）：GGGAGGCTCCTACTTTGCTC（配列番号２）
PRKACA_L206_FFPE（Reverse primer）：GGTGACAGACTTCGGTTTCG（配列番号４）
For example, in order to detect the L206R mutant PRKACA gene, the primers shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 below are used to amplify and detect a partial sequence related to the L206R mutation with respect to DNA in the test sample by PCR. be able to. The primer is not limited to the following, and a necessary sequence can be appropriately constructed.
PRKACA_L206 (Forward primer): GGGAGGCTCCTACTTTGCTC (SEQ ID NO: 2)
PRKACA_L206 (Reverse primer): CAGCAGGGCTACATTCAGGT (SEQ ID NO: 3)
PRKACA_L206_FFPE (Forward primer): GGGAGGCTCCTACTTTGCTC (SEQ ID NO: 2)
PRKACA_L206_FFPE (Reverse primer): GGTGACAGACTTCGGTTTCG (SEQ ID NO: 4)
タンパク質レベルで変異型PRKACAを検出する方法についても特に限定されず、自体公知の方法を応用して実施することができる。PRKACAタンパク質内の変異は、変異の位置、例えばPRKACAタンパク質の第206番目のアミノ酸についてロイシン（L）からアルギニン（R）等のアミノ酸を確認することで検出することができる。例えば、変異の部位を検出可能な抗体を用いた免疫学的手法により検出することもできる。タンパク質活性の機能的検出に基づく方法によることもできる。また、タンパク質の変異に基づく立体構造の違いを解析することによっても検出することができる。 The method for detecting mutant PRKACA at the protein level is not particularly limited, and can be carried out by applying a method known per se. A mutation in the PRKACA protein can be detected by confirming an amino acid such as leucine (L) to arginine (R) at the mutation position, for example, the 206th amino acid of the PRKACA protein. For example, it can also be detected by an immunological technique using an antibody capable of detecting the mutation site. It can also be by a method based on the functional detection of protein activity. It can also be detected by analyzing the difference in three-dimensional structure based on protein mutation.
タンパク質活性の機能的検出方法としては、被検試料中のPRKACAについて、PRKAR1Aとともに作用させてPKAの活性を確認することで実施することができる。 As a functional detection method for protein activity, PRKACA in a test sample can be used together with PRKAR1A to confirm PKA activity.
本発明は、本発明の検査方法を実施するための検査用試薬や検査用キットも含まれる。検査用試薬としては、例えば配列番号２〜４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを検査用プライマー試薬とすることができる。また、検査用キットとしては、配列番号２〜４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドによるプライマーセットや必要な緩衝液等を含む検査用キットが挙げられる。 The present invention also includes a test reagent and a test kit for carrying out the test method of the present invention. As a test reagent, for example, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NOs: 2 to 4 can be used as a test primer reagent. Moreover, as a test kit, the test kit containing the primer set by the oligonucleotide which consists of a base sequence shown by sequence number 2-4, a required buffer solution, etc. is mentioned.
遺伝子レベルで検出するための被検試料は、ヒト由来の血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、又は他の体液、あるいは組織などの検体から調製した核酸試料を用いることができる。核酸試料の調製は、自体公知の調製法により実施できる。本発明に係る遺伝子変異の検出には、核酸試料として、ゲノムDNA、cDNA又はRNAのいずれも使用可能である。タンパク質レベルで検出するための被検試料も、ヒト由来の血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、又は他の体液、あるいは組織などの検体から調製した試料を使用することができ、試料の調製は自体公知の方法により実施できる。 As a test sample for detection at the gene level, a nucleic acid sample prepared from a specimen such as human-derived blood, spinal fluid, bronchoalveolar lavage fluid, sputum, other body fluid, or tissue can be used. The nucleic acid sample can be prepared by a known method. For detection of the gene mutation according to the present invention, any of genomic DNA, cDNA or RNA can be used as a nucleic acid sample. Samples prepared from specimens such as human-derived blood, cerebrospinal fluid, bronchoalveolar lavage fluid, sputum, other body fluids, or tissues can also be used as test samples for detection at the protein level. The preparation can be carried out by a method known per se.
本発明は、クッシング症候群検査用バイオマーカーも包含される。クッシング症候群検査用バイオマーカーとしては、変異型PRKACAが挙げられ、特にL206R変異型PRKACAが挙げられる。バイオマーカーとしては、変異の部分を含むのであれば、PRKACAをコードする遺伝子の部分オリゴヌクレオチドやPRKACAタンパク質の部分ポリペプチドであってもよい。これら遺伝子、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド等を検出することによって、クッシング症候群の検査を実施することができる。クッシング症候群の診断のためには、遺伝子レベルでの検査方法やタンパク質レベルでの検査方法を組み合わせて行ってもよい。 The present invention also includes a biomarker for testing Cushing's syndrome. Examples of biomarkers for testing Cushing's syndrome include mutant PRKACA, and particularly L206R mutant PRKACA. The biomarker may be a partial oligonucleotide of a gene encoding PRKACA or a partial polypeptide of PRKACA protein as long as it includes a mutation portion. By detecting these genes, oligonucleotides, proteins, polypeptides, etc., Cushing's syndrome can be tested. For diagnosis of Cushing's syndrome, a test method at the gene level or a test method at the protein level may be combined.
本発明は、「クッシング症候群治療剤」も包含される。具体的には本発明における変異型PRKACAの分子標的薬をクッシング症候群治療剤として使用することができる。本発明は、変異型PRKACAを分子標的とする治療方法にも及ぶ。 The present invention also encompasses a “Cushing syndrome therapeutic agent”. Specifically, the mutant PRKACA molecular target drug in the present invention can be used as a therapeutic agent for Cushing's syndrome. The present invention also extends to therapeutic methods that target mutant PRKACA as a molecular target.
本発明は、「クッシング症候群治療剤のスクリーニング方法」、具体的には変異型PRKACAを標的とするクッシング症候群治療剤のスクリーニング方法が包含される。例えば、「正常PRKACA」と「変異型PRKACA」が生体に混在する場合に、変異型PRKACAのみを検出し、阻害しうる候補化合物をスクリーニングする方法により、クッシング症候群治療剤となり得る物質を選別することができる。候補化合物は、低分子化合物、核酸物質、タンパク質等いずれの物質であってもよい。 The present invention includes a “screening method for Cushing's syndrome therapeutic agent”, specifically, a screening method for Cushing's syndrome therapeutic agent targeting mutant PRKACA. For example, when "normal PRKACA" and "mutant PRKACA" coexist in a living body, a substance that can be a Cushing syndrome therapeutic agent is selected by a method that detects only the mutant PRKACA and screens candidate compounds that can be inhibited. Can do. The candidate compound may be any substance such as a low molecular weight compound, a nucleic acid substance, or a protein.
本発明について理解を深めるために、以下に本発明を実施例に示してより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。 In order to deepen the understanding of the present invention, the present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, it is needless to say that the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）遺伝子変異解析１
本実施例では、クッシング症候群のうち副腎腺腫を伴う症例を対象として、全エクソンシークエンスによる網羅的な遺伝子変異解析を行なった。ACTH非依存性クッシング症候群と診断され、インフォームドコンセントが得られた65名の患者について、東京大学の倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って、本発明のための全エクソンシークエンスによる網羅的な遺伝子変異解析を行った。ゲノムDNAは、副腎皮質腫瘍及び正常な副腎皮質、末梢血の検体から抽出して得た。その結果、PRKACA遺伝子の変異がクッシング症候群と密接に関連していることを見出した。
(Example 1) Gene mutation analysis 1
In this example, an exhaustive gene mutation analysis was performed for all cases of Cushing's syndrome with adrenal adenomas using all exon sequences. Comprehensive gene mutations in all exon sequences for the present invention in 65 patients diagnosed with ACTH-independent Cushing syndrome and obtained informed consent, according to a protocol approved by the University of Tokyo Ethics Committee Analysis was performed. Genomic DNA was obtained by extraction from adrenal cortex tumors, normal adrenal cortex, and peripheral blood samples. As a result, we found that the PRKACA gene mutation is closely related to Cushing's syndrome.
まず、8名の患者の腫瘍DNAならびに正常DNAについて、全エキソンシークエンス解析を行った。ゲノム領域のうち、タンパク質をコードする全エクソン領域（Exome）を、ヒト全エクソンキャプチャキットであるSureSelect Human All Exon V4 （アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて濃縮し、HiSeq2000（Illumina 社）を用いて塩基配列を決定した。腫瘍DNAの配列と正常DNAの配列を比較することにより、体細胞変異を確認した。これらのシークエンスデータは、The European Genome-phenome Archive (EGA)において、Accession No. EGAS00001000661で寄託されている。8名のうち4名でcAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）のCサブユニットをコードする遺伝子に体細胞性変異を認めた。遺伝子の変異は617番目の塩基であるチミン（T）のグアニン（G）への置換が認められた。当該変異は、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第206番目のアミノ酸がロイシン（L）からアルギニン（R）への置換（L206R変異型PRKACA）に該当する。また、他の内分泌疾患にて変異の知られているGNAS遺伝子の変異を1例に認めた。 First, a total exon sequence analysis was performed on tumor DNA and normal DNA of 8 patients. In the genomic region, all exon regions encoding proteins (Exome) are concentrated using SureSelect Human All Exon V4 (Agilent Technology Co., Ltd.), a human all exon capture kit, and using HiSeq2000 (Illumina). The base sequence was determined. Somatic mutation was confirmed by comparing the sequence of tumor DNA with that of normal DNA. These sequence data are deposited under Accession No. EGAS00001000661 in The European Genome-phenome Archive (EGA). Four out of eight individuals had somatic mutations in the gene encoding the C subunit of cAMP-dependent protein kinase (PKA). In the gene mutation, substitution of guanine (G) for thymine (T), the 617th base, was observed. This mutation corresponds to substitution of leucine (L) to arginine (R) at the 206th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (L206R mutant PRKACA). A GNAS gene mutation known to be mutated in other endocrine diseases was observed in one case.
上記結果に基づき、追加した57例について同様にPRKACA遺伝子の変異をサンガ―シークエンス法にて確認したところ、L206R変異型PRKACAは、57例中30例で確認された。同じ57名について、GNAS遺伝子の変異も確認したところ、10名にR201C（6名）及びR201H（4名）の変異を認めた。PRKACA遺伝子の変異をもつ症例とGNAS遺伝子の変異を持つ症例は重複していなかった（図１Ａ）。合計65名中34名（52.3％）にPRKACAの変異を認め、11名（16.9％）にGNASの変異を認めた（図１、２）。以下、PRKACAの変異について、検討した結果を示す。以下「変異型PRKACA」は「L206R変異型PRKACA」を意味する。 Based on the above results, the PRKACA gene mutation was confirmed in the same manner in the 57 additional cases by the Sanger sequencing method. As a result, L206R mutant PRKACA was confirmed in 30 of 57 cases. As for the same 57 people, when the mutation of the GNAS gene was also confirmed, the mutation of R201C (6 persons) and R201H (4 persons) was recognized in 10 persons. The cases with the PRKACA gene mutation and the GNAS gene mutation did not overlap (FIG. 1A). A total of 34 (65.3%) of 65 patients had PRKACA mutations, and 11 (16.9%) had GNAS mutations (Figs. 1 and 2). The results of studies on PRKACA mutations are shown below. Hereinafter, “mutant PRKACA” means “L206R mutant PRKACA”.
（実施例２）変異型PRKACAと臨床的特徴（コルチゾール）
本実施例では、変異型PRKACAについて臨床的意義を確認した。L206R変異型PRKACA保有患者について、1 mgデキサメタゾン抑制試験（DST）によるコルチゾール値を測定し、臨床的特徴を確認した。野生型PRKACA保有患者と比べて、変異型PRKACA保有患者はコルチゾール値が有意に高かった（図３）。
なお、デキサメサゾン抑制試験とは、クッシング症候群が疑われる場合に行われる検査方法として公知であり、糖質コルチコイドのアゴニストであるデキサメサゾンを投与して副腎皮質刺激ホルモンの分泌を抑制したのちに血中糖質コルチコイドを測定する方法である。
(Example 2) Mutant PRKACA and clinical characteristics (cortisol)
In this example, the clinical significance of mutant PRKACA was confirmed. In patients with L206R mutant PRKACA, cortisol levels were measured by 1 mg dexamethasone suppression test (DST) to confirm clinical features. Compared with patients with wild type PRKACA, patients with mutant PRKACA had significantly higher cortisol levels (FIG. 3).
The dexamethasone suppression test is known as a test method performed when Cushing's syndrome is suspected, and after administration of dexamethasone, an agonist of glucocorticoid, suppresses the secretion of corticotropin and blood sugar This is a method for measuring corticoids.
（実施例３）変異型PRKACAの機能解析１
PRKACAに調節サブユニットPRKAR1Aが結合することによりPKAは不活性の状態となる。PRKAR1AはPKAの調節サブユニットであり、PRKACAはPKAの触媒サブユニットである。本実施例では、L206R変異型PRKACAの、PRKAR1Aとの相互作用に対する機能解析を行った。
(Example 3) Functional analysis 1 of mutant PRKACA
Binding of the regulatory subunit PRKAR1A to PRKACA results in an inactive state of PKA. PRKAR1A is the regulatory subunit of PKA, and PRKACA is the catalytic subunit of PKA. In this example, functional analysis of the interaction of L206R mutant PRKACA with PRKAR1A was performed.
HEK293T細胞に野生型又は変異型のPRKACA（触媒サブユニット）の遺伝子（いずれもHA配列を付加）を各々導入し発現させ、培養細胞からタンパクを回収した。抗HA抗体を用いて、外因性に発現させた、PRKACAタンパク質（触媒サブユニット）に対して免疫沈降操作を行った後、抗PRKAR1A（調節サブユニット）抗体を用いてウェスタンブロットにより解析した。 Wild-type or mutant PRKACA (catalytic subunit) genes (both with HA sequences) were introduced and expressed in HEK293T cells, and proteins were collected from cultured cells. An immunoprecipitation operation was performed on PRKACA protein (catalytic subunit) exogenously expressed using anti-HA antibody, and then analyzed by Western blot using anti-PRKAR1A (regulatory subunit) antibody.
野生型の触媒サブユニットを発現させた細胞では調節サブユニットも共に沈降したのに対し、変異型の触媒サブユニットを発現させた細胞では、調節サブユニットの共沈降は見られなかった（図４Ａ）。これにより、変異型PRKACAでは調節サブユニットPRKAR1Aと結合しないことが確認された。精製タンパクを用いた解析においても、変異型PRKACAは調節サブユニットPRKAR1Aと結合しないことが確認された（図４Ｂ）。 In the cells expressing the wild-type catalytic subunit, the regulatory subunits were also precipitated, whereas in the cells expressing the mutant catalytic subunit, no co-precipitation of the regulatory subunits was observed (FIG. 4A). ). This confirmed that mutant PRKACA did not bind to regulatory subunit PRKAR1A. In the analysis using the purified protein, it was also confirmed that the mutant PRKACA did not bind to the regulatory subunit PRKAR1A (FIG. 4B).
（実施例４）変異型PRKACAの機能解析２
本実施例では、変異型触媒サブユニットのPKA活性に及ぼす影響を確認した。触媒サブユニットと調節サブユニットが結合しないことにより、cAMP非存在下においても触媒サブユニットが遊離し酵素活性を示すことが予想された。野生型PRKACA又は変異型PRKACAを発現させたHEK293T細胞の溶解液におけるPKA活性を測定した。PKA活性は、基礎値又はフォルスコリン刺激下における値を測定した。フォルスコリンはアデニル酸シクラーゼを活性化することにより、細胞内のcAMP濃度を上昇させる作用を有する。PKA活性は、PKAキナーゼ活性キット（ENZO）を用いてELISA法にて測定した。
(Example 4) Functional analysis 2 of mutant PRKACA
In this example, the effect of the mutant catalytic subunit on PKA activity was confirmed. Since the catalytic subunit and the regulatory subunit do not bind, it is expected that the catalytic subunit is released and exhibits enzyme activity even in the absence of cAMP. The PKA activity in the lysate of HEK293T cells expressing wild type PRKACA or mutant PRKACA was measured. The PKA activity was measured based on basal value or forskolin stimulation. Forskolin has the effect of increasing intracellular cAMP concentration by activating adenylate cyclase. PKA activity was measured by ELISA using a PKA kinase activity kit (ENZO).
野生型PRKACAを発現させた細胞においては、PKA活性の基礎値は低値であったが、フォルスコリンの刺激により活性上昇を認めた。一方、変異型PRKACAの場合はフォルスコリンの刺激がない場合でも、高いPKA活性を示した（図５）。 In cells in which wild-type PRKACA was expressed, the basic value of PKA activity was low, but increased activity was observed upon stimulation with forskolin. On the other hand, mutant PRKACA showed high PKA activity even in the absence of forskolin stimulation (FIG. 5).
以上の各実施例の結果より、クッシング症候群において変異型PRKACAが高頻度に認められることが確認された。これにより、変異型PRKACAを検出することで、クッシング症候群の診断を行うことができると考えられた。さらに、変異型PRKACAがPKA調節サブユニットであるPRKAR1Aとは結合しないことが確認されたこと、それに伴い細胞質においてPKA活性がcAMP濃度に関わらず恒常的に高くなり、その結果としてクッシング症候群を示すと考えられた。これにより、変異型PRKACAを標的とすることで、クッシング症候群の治療方法に応用できると考えられた。 From the results of the above Examples, it was confirmed that mutant PRKACA was frequently observed in Cushing's syndrome. Thus, it was considered that Cushing's syndrome can be diagnosed by detecting mutant PRKACA. Furthermore, it was confirmed that mutant PRKACA did not bind to PKA regulatory subunit PRKAR1A, and as a result, PKA activity was constantly increased in the cytoplasm regardless of cAMP concentration, resulting in Cushing syndrome. it was thought. Thus, it was considered that by targeting mutant PRKACA, it can be applied to a method for treating Cushing's syndrome.
以上詳述したように、本発明の変異型PRKACAを検出することによりクッシング症候群の検査を行うことができ、さらには変異型PRKACAを、クッシング症候群検査のためのバイオマーカーとすることができる。そして、変異型PRKACAを標的とする、クッシング症候群治療薬の開発に貢献しうる。 As described in detail above, Cushing's syndrome can be tested by detecting the mutant PRKACA of the present invention, and the mutant PRKACA can be used as a biomarker for testing Cushing's syndrome. And it can contribute to the development of Cushing's syndrome therapeutic drug targeting mutant PRKACA.
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