JP2015140322A - 関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、HLA-G[α1-3]ダイマーを有効成分とする、関節リウマチまたは関節リウマチに起因して生じる疾患(関節リウマチ関連疾患)の予防または治療剤に関する。ここでHLA-G[α1-3]としては下記(a)または(b)に記載するタンパク質を好適に用いることができる:
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【選択図】なし
Description
エキソン1:シグナル配列、エキソン2:α1細胞外ドメイン、エキソン3:α2細胞外ドメイン、エキソン4:α3細胞外ドメイン、エキソン5:膜貫通領域、エキソン6:細胞質ドメインI、エキソン7:細胞質ドメインII(非翻訳)、及びエキソン8:細胞質ドメインIII(非翻訳)。
(I-1)HLA-Gのα1ドメインとHLA-Gのα3ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の二量体(以下、「HLA-G[α1-3]ダイマー」ともいう。)を有効成分とする、関節リウマチまたは関節リウマチに起因して生じる疾患(以下、「関節リウマチ関連疾患」ともいう)の予防または治療剤。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
上記二量体が、上記(a)同士若しくは(b)同士のホモ二量体または(a)と(b)とのヘテロ二量体であり、白血球Ig様受容体B2(LILRB2)との結合活性を有するものである、(I-1)に記載する予防または治療剤。
(II-1)(I-1)に記載するHLA-G[α1-3]ダイマーを有効成分とする組成物を、関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、有効量投与する工程を有する、関節リウマチ若しくはその関連疾患の予防または治療方法。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
上記ダイマーが、上記(a)同士若しくは(b)同士のホモ二量体または(a)と(b)とのヘテロ二量体であり、且つ白血球Ig様受容体B2(LILRB2)との結合活性を有するものである、(II-1)に記載する予防または治療方法。
(III-1)関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療の為に使用される、(I-1)乃至(I-3)のいずれかに記載するHLA-G[α1-3]ダイマー、または当該HLA-G[α1-3]ダイマーを関節リウマチまたはその関連疾患の予防または治療に有効な割合で含有する医薬組成物。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
上記ダイマーが上記(a)同士若しくは(b)同士のホモ二量体または(a)と(b)とのヘテロ二量体であり、且つ白血球Ig様受容体B2(LILRB2)との結合活性を有するものである、(III-1)に記載するHLA-G[α1-3]ダイマーまたは医薬組成物。
(IV-1)関節リウマチまたはその関連疾患の予防若しくは治療剤を製造する為のHLA-G[α1-3]ダイマーの使用。なお、当該予防または治療剤には、当該予防または治療剤が「抗関節リウマチ作用」を発揮する有効量配合される。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質
上記ダイマーが上記(a)同士若しくは(b)同士のホモ二量体または(a)と(b)とのヘテロ二量体であり、且つ白血球Ig様受容体B2(LILRB2)との結合活性を有するタンパク質である、(IV-1)に記載する使用。
(1-1)HLA-G[α1-3]
HLA-Gは、非古典的MHCI分子の1つであり、以下に示すように古典的MHCIとは異なる幾つかの独特な特性を有している:
(i)少数の組織:絨毛外栄養膜、胸腺上皮細胞、及び一部の腫瘍に非常に限定された発現(J. LeMaoult, et al.,(2003) Tissue Antigens, 62, 273-84.)
(ii)限定的な多型性
(iii)遅い輸送
(iv)比較的限定的なペプチド提示。
HLA-G[α1-3]ダイマーは、前述するHLA-G[α1-3]同士が、ジスルフィド結合するか、またはジスルフィド結合によらないで非共有結合的に結合することにより、二量体化したものである。
本発明の予防または治療剤(以下、これを総称して「本発明の製剤」という。当該製剤は、本発明が対象とする組成物(医薬組成物)の一態様である。)において有効成分となるHLA-G[α1-3]ダイマーは、必要に応じて各種塩や水和物等の状態で用いられてもよい。また、保存安定性(特に活性維持)を考慮して適当な化学的修飾がなされた状態で用いられてもよい。またHLA-G[α1-3]ダイマーは、結晶化状態で用いられてもよいし、溶解状態で用いられてもよい。
本発明の製剤は、関節リウマチの症状緩和若しくは軽減、または関節リウマチに起因して生じる疾患(関節リウマチ関連疾患)の予防に用いられる。
1.朝のこわばり(1時間以上持続する)
2.多関節炎(少なくとも3領域以上の関節の腫れ)
3.手の関節の腫れ
4.対称性の関節の腫れ
5.リウマトイド結節
6.リウマトイド因子(リウマチ因子)陽性
7.レントゲン検査で典型的な関節所見。
本発明の製剤を非経口投与(例えば注射投与)する場合、その有効な投与量は、例えば、関節リウマチの症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態等に応じて異なり、限定はされないが、例えば、有効成分であるHLA-G[α1-3]ダイマーの割合に換算して、体重60kgの成人に対して1回あたり20mg以上、好ましくは20mg〜200mg程度を投与することができる。
(1)α1-3連結体を大腸菌で封入体として発現
pGMT7ベクターを制限酵素NdeIおよびHindIIIで切断した後、HLA-G分子のα1ドメインとα3ドメインとの連結体(α1-3連結体)をコードする遺伝子(配列番号2)、並びにその改変体(配列番号6)を、T4DNAリガーゼを用いて挿入し、それぞれHLA-G[α1-3]-pGMT7、改変型HLA-G[α1-3]-pGMT7を構築した。
IPTGを添加して発現誘導した菌体懸濁液を遠心分離機にかけ菌体を集め、Resuspension buffer(50mMトリスpH8.0,100mM塩化ナトリウム)を加え、懸濁し、超音波破砕で菌体を破砕した後、遠心分離して封入体を得た。この封入体をTriton wash buffer(0.5%TritonX-100、50mMトリスpH8.0,100mM塩化ナトリウム)及びResuspension buffer(50mMトリスpH8.0、100mM塩化ナトリウム)で十分洗浄した後に、6.0M Guanidine solution(6.0Mグアニジン、50mMメスpH6.5,10mM MEDTA)で可溶化した。この時点で、HLA-G[α1-3]溶液を紫外吸光法により測定したところ、A280値が約70であり、HLA-G[α1-3]の発現量はおよそ100mg/Lであると考えられる。Refolding buffer(0.1M トリスpH8.0, 0.4M L-アルギニン、5mM EDTA、3.7mM シスタミン、6.4mMシステアミン)を用いて一般的な希釈法で4℃、72時間撹件しながら巻き戻した。そして、これを濃縮した後、下記条件のゲルろ過クロマトグラフィーに供して精製した。
<ゲルろ過クロマトグラフィー条件>
カラム:HiLoad 26/60、Superdex 75(60cm、id 26mm)
移動相:20mM Tris-HCl、100mM NaCl buffer(pH8)
流速:2.5ml/min
Reaction buffer(50mM D-biotin、l00mM ATP、15μM BirA)にLILRB2のN末側2ドメイン(D1D2)を溶解し、C末端をビオチン化した。ゲルろ過クロマトグラフィー(Superdex 75)によりreaction bufferからビオチン化LILRB2を分離し精製した。
ヒト免疫抑制性レセプター(leukocyte immunoglobulin-like receptor B)であるLILRBのマウスホモログであるPIRB(pried-immunoglobulin-like receptor B)に対するHLA-G[α1-3]ダイマーの結合性を、表面プラズモン共鳴(Surface plasmon resonance)を用いて評価した。
PIRBの細胞外ドメインをHEL293T細胞にトランスフェクションし、これを1%FCS-DMEMで72時間培養した。PIRBの細胞外ドメインのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号7及び8に示す。なお、PIR-Bの全長のアミノ酸配列はNCBIのNM_011095において公表されており、PIR-B細胞外ドメインはこのうちドメイン1〜6にあたる部分である。
BIAcore(登録商標)3000(GE healthcare社のBIAcore)を使用し、HLA-G[α1-3]ダイマーと上記で調製したPIRB細胞外ドメインとの結合性を表面プラズモン共鳴実験により評価した。まず、研究用センサーチップ上に、ストレプトアビジンを共有結合で固定化し、そのストレプトアビジンを介して、ビオチン化PIRB細胞外ドメインとネガティブコントロールであるBSAを固定化した。次に、ランニングバッファーであるHBS-EP(10mMへペスpH7.5, 150mM塩化ナトリウム、3.4mM EDTA、0.005% Surfactant P20)に溶解したHLA-G[α1-3]ダイマーを5μL/分で流した。各濃度での結合応答は、サンプルフローセルにおける応答から対照フローセルにおいて測定された応答を減算することによって計算した。結合定数(Kd)は、ORIGIN7(Microcal Software)によって、スキャッチャード分析又は標準ラングミュア結合等温線の非線形カーブフィッティングによって得た。
(1)II型コラーゲン誘導型関節リウマチモデルマウス(collagen induced arthritis:CIA)の作成
(1-1) ウシII型コラーゲン含有エマルジョンの調製
ウシII型コラーゲンに0.02M Tris-HCl及び0.15M NaCl を含有するbuffer(pH8.0)を加え、4℃、遮光条件下で一晩かけて溶解した。これに初回感作(一次感作)の際には等量のComplete Freund’s Adjuvantを加えて、ホモジナイザーを用いて5分以上混合し、ウシII型コラーゲン含有エマルジョンを調製した。なお、当該エマルジョン50μl/(1匹あたりの投与量)中には100μgのウシII型コラーゲンが含まれている。他方、追加感作(二次感作)の際には等量のIncomplete Freund’s Adjuvantを加えて、ホモジナイザーを用いて5分以上混合し、ウシII型コラーゲン含有エマルジョンを調製した。なお、これらのエマルジョン50μl/(1匹あたりの投与量)中には200μgのウシII型コラーゲンが含まれている。
(i)初回感作(一次感作)
マウス(DBA/1JNCrlj、オス6週齢、チャールスリバー社から入手)50匹を、ジエチルエーテルで麻酔した後、マウス固定器に入れ、マウスの尾先端部より約3cmの部分の裏側の皮内に、上記で調製したウシII型コラーゲン含有エマルジョン50μlを注入(皮内投与)した。
上記初回感作から2週間後、再度上記のマウス50匹を、ジエチルエーテルで麻酔した後、マウス固定器に入れ、マウスの尾根部の皮内にウシII型コラーゲン含有エマルジョン50μlを注入した。
追加感作から1週間後に、上記マウスを各群23匹になるように2群(HLA-G[α1-3]ダイマー投与群、コントロール群)に分け、一方の群には調製例1で調製したHLA-G[α1-3]ダイマー含有溶液(0.51mg/ml PBS)、他方の群にはコントロールとしてPBS溶液(pH7.4)を、50μlずつ、26G針をつけた1ml容量のシリンジを用いて、左の後肢ウラに皮内投与し、週6日間、合計3週間に渡り観察し、RAスコアに従って採点した。
Claims (3)
- HLA-Gのα1ドメインとHLA-Gのα3ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質の二量体を有効成分とする、関節リウマチまたは関節リウマチに起因して生じる疾患の予防または治療剤。
- HLA-Gのα1ドメインとHLA-Gのα3ドメインとが連結したアミノ酸配列を有するタンパク質が、下記(a)または(b)に記載するアミノ酸配列からなるタンパク質であって:
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
上記二量体が、上記(a)同士若しくは(b)同士のホモ二量体または(a)と(b)とのヘテロ二量体であり、白血球Ig樣受容体B2との結合活性を有するものである、請求項1に記載する予防または治療剤。 - 関節リウマチ若しくはその関連疾患に罹患しているか、または当該疾患を発症し得る患者に、少なくとも3週間に1回の割合で局所投与される製剤形態を有するものである、請求項1または2に記載する予防または治療剤。
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