JP2015108597A - Pep-ELISA MEASUREMENT PEPTIDE - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酵素の検出方法に使用する新規ペプチドに関する。より詳細には、酵素活性に影響を与えるペプチドと該ペプチドを使用した、酵素の免疫学的測定法の感度と再現性とを高めるためのペプチドに関する。 The present invention relates to a novel peptide used in an enzyme detection method. More specifically, the present invention relates to a peptide that affects enzyme activity and a peptide that uses the peptide to enhance the sensitivity and reproducibility of an immunoassay for the enzyme.
生体内では種々の生体分子が多様な機能を発揮しており、多くの酵素がこうした機能を発揮するための反応に関与している。例えば、癌関連ガラクトース転移酵素(galactosyltransferase associated with tumor: GAT)の血中濃度は、卵巣癌の発症と相関性があることが知られている。また、アスパラギン酸プロテアーゼであるカテプシンEは、TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）を切断し、癌細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献１）。このため、上記のＧＡＴやカテプシンEなどの疾患関連酵素の血中濃度が、上述した癌の早期発見のための指標ともなる。 In vivo, various biomolecules exert various functions, and many enzymes are involved in reactions for exerting such functions. For example, it is known that the blood concentration of galactosyltransferase associated with tumor (GAT) is correlated with the onset of ovarian cancer. In addition, it has been reported that cathepsin E, which is an aspartic protease, cleaves TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) and induces apoptosis of cancer cells (Non-patent Document 1). For this reason, the blood concentration of the above-mentioned disease-related enzymes such as GAT and cathepsin E is also an index for the early detection of cancer described above.
試料中の酵素量を測定するには、対象となる酵素活性を直接測定する方法の他、抗体を利用して検出する方法等が用いられている。
このような酵素活性の直接測定法は、酵素の基質と、酵素反応後の生成物の検出方法を選択することで、測定感度を向上させることができる。また、抗体を使用して酵素を検出する方法として、免疫学的測定法（Enzyme-linked immuno-sorbent assay、以下、「ELISA法」ということがある。）等が知られている。ELISA法では、特異性の高い抗体を利用するために、目的とする酵素量を高精度で測定することができる。
In order to measure the amount of enzyme in a sample, a method of directly detecting the target enzyme activity, a method of detecting using an antibody, and the like are used.
Such a direct measurement method of enzyme activity can improve measurement sensitivity by selecting an enzyme substrate and a method for detecting a product after the enzyme reaction. Further, as a method for detecting an enzyme using an antibody, an immunological assay (Enzyme-linked immuno-sorbent assay, hereinafter sometimes referred to as “ELISA method”) or the like is known. In the ELISA method, since a highly specific antibody is used, the target enzyme amount can be measured with high accuracy.
ELISAは、抗体を用いる免疫学的測定法のひとつであり、直接吸着法とサンドイッチ法の２種類がある。サンドイッチ法では、一次抗体と二次抗体という２種類の異なるエピトープを認識する抗体を使用する。まず、一次抗体で固層表面をブロックした後に、酵素（標的分子）を含む溶液を加えて一次抗体と結合させ、次いで、酵素標識抗体（酵素で標識した二次抗体）を添加する。すなわち、標的分子が固相抗体と酵素標識抗体にサンドイッチされた構造をとる。そして、抗原・抗体反応を行わせた後に、酵素基質と反応させて発色させ、吸光度を測定して検体中に存在する標的分子（抗原）の量を測定する。 ELISA is one of the immunological measurement methods using antibodies, and there are two types, a direct adsorption method and a sandwich method. In the sandwich method, an antibody that recognizes two different epitopes, a primary antibody and a secondary antibody, is used. First, after blocking the solid layer surface with a primary antibody, a solution containing an enzyme (target molecule) is added to bind to the primary antibody, and then an enzyme-labeled antibody (secondary antibody labeled with the enzyme) is added. That is, the target molecule has a structure sandwiched between a solid phase antibody and an enzyme-labeled antibody. Then, after the antigen / antibody reaction is carried out, the color is developed by reacting with the enzyme substrate, the absorbance is measured, and the amount of the target molecule (antigen) present in the specimen is measured.
上記のようなELISA法は、抗体を用いるために標的分子に対する特異性が非常に高く、検体中に存在する標的分子の量を、正確に測定できるという利点がある。
一方で抗体を使用するこの方法には、標的分子に対して高い特異性・親和性を有する抗体を作製することが必須である。こうした抗体の入手は、動物への抗原の投与に始まる抗体の産生と精製、特異性・親和性の確認等、時間と費用と手間が掛かるという問題もあった。さらに、抗原との親和性についても、通常、抗体の結合親和性は〜ｎＭ程度が限界であり、それ以上の結合親和性を有する抗体の作製は極めて困難であるという問題があった。
The ELISA method as described above has an advantage that the specificity to the target molecule is very high because an antibody is used, and the amount of the target molecule present in the sample can be accurately measured.
On the other hand, in this method using an antibody, it is essential to produce an antibody having high specificity and affinity for a target molecule. Obtaining such antibodies also has the problem that it takes time, money, and labor, such as production and purification of antibodies starting with administration of antigens to animals, confirmation of specificity and affinity, and the like. Furthermore, with regard to the affinity with an antigen, the binding affinity of an antibody is usually limited to about nM, and there is a problem that it is extremely difficult to produce an antibody having a higher binding affinity.
このため、本発明の発明者らは、抗原-抗体反応に利用されるエピトープに対応するペプチドを使用することに着目した。そして、in-vitro-virus法（IVV法、非特許文献３参照。）を利用して、このペプチドをより親和性の高いものに進化させることに成功し、ELISA法と比較して、より簡便かつ高感度に検出対象分子を測定できる方法を開発し、Pep-ELISA法と命名した（特開2011−115146号公報、以下「従来技術１」という。）。 For this reason, the inventors of the present invention have focused on the use of peptides corresponding to epitopes used for antigen-antibody reactions. Then, using the in-vitro-virus method (IVV method, see Non-Patent Document 3), we have succeeded in evolving this peptide to a higher affinity, which is simpler than the ELISA method. In addition, a method capable of measuring a molecule to be detected with high sensitivity was developed and named Pep-ELISA (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-115146, hereinafter referred to as “Prior Art 1”).
従来技術１では、抗体に比べて分子量が格段に小さなペプチド（以下、「パラトープペプチド」という。）を、抗体に代えて使用する。このため、抗体の精製に要する時間と手間とを大幅に省くことができる。また、ここで使用するパラトープペプチドは合成も可能であり、IVV法を用いることにより、標的分子に対する特異性・親和性の高いペプチドアプタマー（以下、「アプタマー」ということがある。）を選択して使用できるために、迅速かつ高感度に検出できるという点で、非常に優れた方法である。
しかし、固相上に上記パラトープペプチドを固定した際のパラトープペプチドの配向性が不均一になると、それによって検出感度及び再現性が低下するという問題があった。また、パラトープペプチドが小さいため、基板表面と標的分子とが直接反応してしまい、パラトープペプチドと標的分子との結合が阻害され、検出感度及び再現性が低下するという問題もあった。
このため、所望の標的分子を、より高い検出感度で再現性よく、安定して検出できるPep-ELISA法に対する強い社会的要請があった。
In the
However, when the orientation of the paratope peptide is not uniform when the paratope peptide is immobilized on a solid phase, there is a problem in that detection sensitivity and reproducibility are lowered. In addition, since the paratope peptide is small, the substrate surface and the target molecule react directly, and there is a problem that the binding between the paratope peptide and the target molecule is inhibited, and the detection sensitivity and reproducibility are lowered.
For this reason, there has been a strong social demand for a Pep-ELISA method that can stably detect a desired target molecule with higher detection sensitivity with good reproducibility.
本発明の発明者は、上記のような状況の下で鋭意研究を進め、本発明を完成したものである。すなわち、本発明は、基板上に固定化した際のエピトープペプチドの配向性を保ち、検出感度向上および安定した再現性を実現するためのエピトープペプチドを支持するペプチド（以下、「スタンドペプチド」という。）を提供することを目的とする。 The inventor of the present invention has completed the present invention by carrying out diligent research under the above circumstances. That is, in the present invention, a peptide (hereinafter referred to as “stand peptide”) that supports the epitope peptide for maintaining the orientation of the epitope peptide when immobilized on a substrate, and realizing improved detection sensitivity and stable reproducibility. ).
すなわち、本発明の第１の態様は、Pep-ELISA法において、測定対象となるペプチドアプタマーを基板上に固定するためのペプチドであって、配列表の配列番号１の配列を有する、スタンドペプチドである。
ここで、前記スタンドペプチドは、αへリックス構造を有することが好ましい。
That is, the first aspect of the present invention is a peptide for immobilizing a peptide aptamer to be measured on a substrate in the Pep-ELISA method, which has the sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. is there.
Here, the stand peptide preferably has an α-helix structure.
また、前記スタンドペプチドは、前記配列表の配列番号１のアミノ酸配列の５’末端側にHOOC−(EDC, Sulfo−NHS)−NH2−を含むものであるか、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の３’末端側に、−HS−EMCS−NH2を有する HOOC-(EDC：Sulfo-NHS)−NH２を含むものであることが好ましい。 The stand peptide contains HOOC- (EDC, Sulfo-NHS) -NH 2 -at the 5 ′ end side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing It is preferable that HOOC- (EDC: Sulfo-NHS) -NH 2 having —HS-EMCS-NH 2 is contained on the 3′-terminal side of.
本発明の第２の態様は、上述したいずれかのスタンドペプチドを、基板上にC末端又はN末端で固定するペプチド固定化工程と；前記固定されたスタンドペプチドにペプチドアプタマーを結合させるアプタマー結合工程と；前記結合されたペプチドアプタマーに標的分子を結合させる標的分子結合工程と；前記標的分子に対する標識抗体を前記標的分子にさらに結合させるサンドイッチ工程と；標的分子に対する抗体の結合によって生じる反応を、蛍光測定又は吸光度測定で検出する反応検出工程と；を備える、Pep-ELISA法である。
前記基板は、96ウェルマイクロプレート、樹脂性のマイクロビーズ、磁性粒子、マイクロアレイであることが好ましい。
A second aspect of the present invention is a peptide immobilization step of immobilizing any of the above-mentioned stand peptides on a substrate at the C-terminus or N-terminus; an aptamer binding step of binding a peptide aptamer to the immobilized stand peptide A target molecule binding step of binding a target molecule to the bound peptide aptamer; a sandwich step of further binding a labeled antibody to the target molecule to the target molecule; and a reaction caused by binding of the antibody to the target molecule A reaction detection step of detecting by measurement or absorbance measurement.
The substrate is preferably a 96-well microplate, resinous microbeads, magnetic particles, or a microarray.
ここで、前記標的分子は、酵素、受容体、抗体、転写因子、シグナル伝達因子、特定の配列に結合するペプチド、特定の配列に結合するタンパク質、核酸、脂質、糖及び低分子化合物からなる群から選ばれるいずれかの物質であることが好ましい。
前記酵素は、NM23-H1、カテプシンE、ジンジパイン、メチルグアニン・メチル転移酵素（MGMT）、スーパーオキシドディスムターゼ1（SOD1）からなる群から選ばれるいずれかのものであることが好ましい。
Here, the target molecule is an enzyme, a receptor, an antibody, a transcription factor, a signal transduction factor, a peptide that binds to a specific sequence, a protein that binds to a specific sequence, a nucleic acid, a lipid, a sugar, and a low molecular weight compound. It is preferably any material selected from
The enzyme is preferably any one selected from the group consisting of NM23-H1, cathepsin E, gingipain, methylguanine methyltransferase (MGMT), and superoxide dismutase 1 (SOD1).
また、前記受容体は、Gタンパク質共役型受容体、イオンチャネル型受容体、及びキナーゼ関連受容体からなる群から選ばれるいずれかの受容体であることが好ましい。
前記抗体は、IgG、IgA、IgM、IgD、及びIgEからなる群から選ばれるいずれかの免疫グロブリンであることが好ましい。
前記転写因子は、NF-κB(nuclear factor-kappa B：核因子κB)、HNF(hepatocyte nuclear factor：肝細胞核因子)及びKLF(Kruppel-like factor：クルッペル様転写因子)等からなる群から選ばれるいずれかの因子であることが好ましい。
前記シグナル伝達因子は、βカテニン、カスパーゼ及びサイトカイン（インターロイキン、TNF-α）等からなる群から選ばれるいずれかの因子であることが好ましい。
The receptor is preferably any receptor selected from the group consisting of a G protein-coupled receptor, an ion channel receptor, and a kinase-related receptor.
The antibody is preferably any immunoglobulin selected from the group consisting of IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE.
The transcription factor is selected from the group consisting of NF-κB (nuclear factor-kappa B), HNF (hepatocyte nuclear factor), KLF (Kruppel-like factor), and the like. Either factor is preferred.
The signal transduction factor is preferably any factor selected from the group consisting of β-catenin, caspase, cytokine (interleukin, TNF-α) and the like.
前記特定の配列に結合するペプチドは、NM23-H1結合ペプチド、カテプシンE結合ペプチド、MGMT結合ペプチド、及びSOD1結合ペプチドからなる群から選ばれるいずれかのペプチドであることが好ましい。
特定の配列に結合するタンパク質は、上述した酵素、抗体、転写因子、及びシグナル伝達因子からなる群から選ばれるタンパク質であることが好ましい。
前記核酸は、天然に存在する核酸又は人工合成した核酸であることが好ましい。
前記脂質は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸及びステロイド等からなる群から選ばれるいずれかの脂質であることが好ましい。
The peptide that binds to the specific sequence is preferably any peptide selected from the group consisting of NM23-H1-binding peptide, cathepsin E-binding peptide, MGMT-binding peptide, and SOD1-binding peptide.
The protein that binds to a specific sequence is preferably a protein selected from the group consisting of the aforementioned enzyme, antibody, transcription factor, and signal transduction factor.
The nucleic acid is preferably a naturally occurring nucleic acid or an artificially synthesized nucleic acid.
The lipid is preferably any lipid selected from the group consisting of phospholipids, glycolipids, fatty acids, steroids and the like.
前記糖は、ブドウ糖、ムチン、プロテオグリカン、グリコーゲン及びキチン等からなる群から選ばれるいずれかの糖であることが好ましい。
前記低分子化合物は、ビタミン、ステロイドホルモン及びATP等からなる群から選ばれるいずれかの低分子化合物であることが好ましい。
前記ペプチドアプタマーは、上述した、酵素、受容体、抗体、転写因子、シグナル伝達因子、特定の配列に結合するペプチド、特定の配列に結合するタンパク質、核酸、脂質、糖及び低分子化合物からなる群から選ばれるいずれかの物質と結合し得るものであることが好ましい。
The sugar is preferably any sugar selected from the group consisting of glucose, mucin, proteoglycan, glycogen, chitin and the like.
The low molecular compound is preferably any low molecular compound selected from the group consisting of vitamins, steroid hormones, ATP, and the like.
The peptide aptamer includes the above-described enzyme, receptor, antibody, transcription factor, signal transduction factor, peptide that binds to a specific sequence, protein that binds to a specific sequence, nucleic acid, lipid, sugar, and low molecular weight compound. It is preferable that it can be bonded to any substance selected from
また、本発明の第３の態様は、上述したいずれかのスタンドペプチドを、基板上にC末端又はN末端で固定するペプチド固定化工程と；前記固定されたスタンドペプチドにペプチドアプタマーを結合させるアプタマー結合工程と；前記結合されたペプチドアプタマーに標的分子を結合させる標的分子結合工程と；前記標的分子に対する標識抗体を前記標的分子にさらに結合させるサンドイッチ工程と；標的分子に対する抗体の結合によって生じる反応を、蛍光測定又は吸光度測定で検出する反応検出工程と；を備える、Pep−ELISA法である。
ここで、前記ペプチドアプタマー及び標的分子は上述した通りである。
また、上記サンドイッチ工程で使用する抗体は、前記標的分子と結合し得るものであることが好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、GFP、フィコシアニン、フルオレセイン、ローダミンその他の蛍光色素からなる群から選ばれるいずれかの標識で標識されているものであることが好ましい。
The third aspect of the present invention is a peptide immobilization step of immobilizing any of the above-mentioned stand peptides on a substrate at the C-terminus or N-terminus; an aptamer for binding a peptide aptamer to the immobilized stand peptide A target molecule binding step for binding a target molecule to the bound peptide aptamer; a sandwich step for further binding a labeled antibody to the target molecule to the target molecule; and a reaction caused by binding of the antibody to the target molecule. A Pep-ELISA method comprising: a reaction detection step of detecting by fluorescence measurement or absorbance measurement.
Here, the peptide aptamer and the target molecule are as described above.
The antibody used in the sandwich step is preferably one that can bind to the target molecule, and any one selected from the group consisting of horseradish peroxidase (HRP), GFP, phycocyanin, fluorescein, rhodamine and other fluorescent dyes. It is preferable that it is labeled with any of these labels.
本発明によれば、基板上に固定化した際に、配向性を保つことができるスタンドペプチドが提供される。また、上記スタンドペプチドを使用することによって、検出感度が高く、再現性の良いPep-ELISA法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, when it fix | immobilizes on a board | substrate, the stand peptide which can maintain orientation is provided. Further, by using the above stand peptide, it is possible to provide a Pep-ELISA method with high detection sensitivity and good reproducibility.
以下に、本発明をより具体的に説明する。上述した通り、本発明は、Pep-ELISA法において、測定対象となるペプチドアプタマーを基板上に固定するためのペプチドであって、配列表の配列番号１の配列を有する、スタンドペプチドである。
配列表の配列番号１
SEGEWQQQQHQWAHQE
Hereinafter, the present invention will be described more specifically. As described above, the present invention is a peptide for immobilizing a peptide aptamer to be measured on a substrate in the Pep-ELISA method, and has the sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
SEGEWQQQQHQWAHQE
本発明のスタンドペプチドは、固相結合部位と、支持部位と、標的結合部位とを備える、全体として親水性のペプチドである。疎水性のペプチドでは、固相への固定化の際に固相（基板）表面と反応し、このスタンドペプチドの標的結合部位（ペプチド）の配向性が揃わなくなるからである。ここで、標的結合部位は、このスタンドペプチドの固相に結合されていない末端（以下、「フリー末端」という）と、そこに結合されたペプチドアプタマーとによって構成される。 The stand peptide of the present invention is a hydrophilic peptide as a whole comprising a solid phase binding site, a support site, and a target binding site. This is because the hydrophobic peptide reacts with the surface of the solid phase (substrate) at the time of immobilization to the solid phase, and the orientation of the target binding site (peptide) of this stand peptide is not uniform. Here, the target binding site is composed of a terminal (hereinafter referred to as “free terminal”) that is not bound to the solid phase of the stand peptide, and a peptide aptamer bound thereto.
このスタンドペプチドは、固相結合部位で固相（基板）と結合し、上記のように、標的結合部位で標的タンパク質と結合する。支持部位は、上記固相結合部位と標的結合部位との間に挟まれており、このスタンドペプチドが溶液中で安定して固相面から立ちあがること、及び標的分子と結合したときにもその標的分子を支持する役割を有する。
このため、本発明のスタンドペプチドの支持部位は、安定な構造を有する領域であるαヘリックス構造となっている。αヘリックス構造は、ヘモグロビンその他の様々なタンパク質で頻繁に見られる二次構造であり、(i)右巻きのらせん状構造である、(ii)らせんが一巻きする中にアミノ酸残基が3.6個含まれる、（iii）らせんのピッチは0.54nmである、という特徴を有する、安定な構造である。このため、標的結合部位の配向性を揃え、標的結合部位に標的分子が結合したときにも安定して標的分子を支えることができる。
This stand peptide binds to the solid phase (substrate) at the solid phase binding site and binds to the target protein at the target binding site as described above. The support site is sandwiched between the solid-phase binding site and the target binding site, and the stand peptide stably stands up from the solid-phase surface in the solution, and the target peptide also binds to the target molecule. It has a role to support molecules.
Therefore, the support site of the stand peptide of the present invention has an α-helix structure that is a region having a stable structure. The α-helix structure is a secondary structure frequently found in hemoglobin and various other proteins, (i) a right-handed helical structure, (ii) 3.6 amino acid residues in one turn of the helix. Included is (iii) a stable structure with the feature that the pitch of the helix is 0.54 nm. For this reason, the orientation of the target binding site is aligned, and the target molecule can be stably supported even when the target molecule is bound to the target binding site.
本発明のスタンドペプチドは、以上のようなαへリックス構造を有する支持部を有するため、基板上に固定化した際のペプチド配向性を保ち、検出感度向上および安定した再現性を実現することができる。
また、前記スタンドペプチドは、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の５’末端側にHOOC−(EDC, Sulfo−NHS))−NH2−を含むことが、測定対象となるペプチドアプタマーとの結合性が高いことから好ましい。さらにまた、配列表の配列番号１のアミノ酸配列の３’末端側に、−HS−EMCS−NH2を有する- HOOC-(EDC, Sulfo-NHS)−NH２を含むことが、固相との安定した結合を形成する上で好ましい。
Since the stand peptide of the present invention has the support part having the α-helix structure as described above, it can maintain the peptide orientation when immobilized on the substrate, and realize improved detection sensitivity and stable reproducibility. it can.
In addition, the stand peptide contains HOOC- (EDC, Sulfo-NHS))-NH 2 -on the 5 ′ end side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It is preferable because of its high properties. Furthermore, the 3 'end of the amino acid sequence of SEQ ID No. 1, has a -HS-EMCS-NH 2 - HOOC- (EDC, Sulfo-NHS) to contain -NH 2, the solid phase It is preferable for forming a stable bond.
上記スタンドペプチドは、例えば、ミオグロビンA鎖（A1〜A16、図３参照）中の疎水性アミノ酸をGlnに置換し、この配列を使用して作製することができる。ここで、本発明のスタンドペプチドは、N末端、C末端のいずれかの末端を基板上に固定するようにすることができる。
例えば、図４（Ａ）に示すアミノ酸配列を有するペプチドをN末端側フリータイプのスタンドペプチドとして作製することができる。このスタンドペプチドは、ペプチドアプタマーのカルボキシル基と結合する。また、図４（Ｂ）に示すアミノ酸配列を有するペプチドをC末端側フリータイプのスタンドペプチドとして作製することができる。
The stand peptide can be prepared, for example, by substituting Gln for a hydrophobic amino acid in the myoglobin A chain (A1 to A16, see FIG. 3) and using this sequence. Here, in the stand peptide of the present invention, either the N-terminus or the C-terminus can be fixed on the substrate.
For example, a peptide having the amino acid sequence shown in FIG. 4 (A) can be prepared as an N-terminal free type stand peptide. This stand peptide binds to the carboxyl group of the peptide aptamer. Moreover, the peptide which has an amino acid sequence shown to FIG. 4 (B) can be produced as a C-terminal side free type stand peptide.
ここで、前記標的分子としては、酵素、受容体、抗体、転写因子、シグナル伝達因子、特定の配列に結合するペプチド、特定の配列に結合するタンパク質、核酸、脂質、糖及び低分子化合物からなる群から選ばれるいずれかの物質であることが、分子量の点で扱いやすいことから好ましい。
酵素は、特定の生化学反応の触媒作用を持つタンパク質である。例えば、NM23-H1、カテプシンE、ジンジパイン、メチルグアニン・メチル転移酵素（MGMT）、スーパーオキシドディスムターゼ1（SOD1）等を使用することが、反応の検出が容易であることから好ましい。これらの中でも、カテプシンE、NM23-H1等を標的分子として好適に使用することができる。
Here, the target molecule includes an enzyme, a receptor, an antibody, a transcription factor, a signal transduction factor, a peptide that binds to a specific sequence, a protein that binds to a specific sequence, a nucleic acid, a lipid, a sugar, and a low molecular weight compound. Any substance selected from the group is preferable because it is easy to handle in terms of molecular weight.
Enzymes are proteins that catalyze specific biochemical reactions. For example, it is preferable to use NM23-H1, cathepsin E, gingipaine, methylguanine / methyltransferase (MGMT), superoxide dismutase 1 (SOD1) and the like because the reaction can be easily detected. Among these, cathepsin E, NM23-H1, and the like can be suitably used as target molecules.
受容体は、細胞膜上に存在し、ホルモンや神経伝達物質等と結合して、細胞の内側に向けて新しい情報を送り込むタンパク質である。抗体は、抗原に対して産生され、抗原と特異的に反応するタンパク質をいう。例えば、Gタンパク質共役型受容体、アセチルコリン受容体、チロシンキナーゼ受容体及びステロイドホルモン受容体等を挙げることができる。
転写因子は、遺伝子の転写を制御する2000種以上の因子の総称であり、通常、遺伝子の転写領域の５’側上流に結合して転写を制御する因子をいう。ステロイドホルモンレセプターも転写因子に含まれる。例えば、NF-κB(nuclear factor-kappa B)、HNF(hepatocyte nuclear factor)及びKLF(Kruppel-like factor)等を挙げることができる。
A receptor is a protein that exists on the cell membrane and binds to hormones, neurotransmitters, etc., and sends new information to the inside of the cell. An antibody refers to a protein that is produced against an antigen and reacts specifically with the antigen. Examples include G protein-coupled receptors, acetylcholine receptors, tyrosine kinase receptors, steroid hormone receptors, and the like.
A transcription factor is a general term for 2,000 or more factors that control gene transcription, and usually refers to a factor that regulates transcription by binding to the 5 ′ upstream side of a gene transcription region. Steroid hormone receptors are also included in transcription factors. Examples thereof include NF-κB (nuclear factor-kappa B), HNF (hepatocyte nuclear factor), and KLF (Kruppel-like factor).
シグナル伝達因子は、細胞内の種々のシグナル伝達に関与する因子の総称である。例えば、βカテニン、カスパーゼ及び各種サイトカイン（インターロイキン、TNF-α）等を挙げることができる。
前記特定の配列に結合するペプチドは、NM23-H1結合ペプチド、カテプシンE結合ペプチド、MGMT結合ペプチド、及びSOD1結合ペプチドからなる群から選ばれるいずれかのペプチドであることが好ましい。
A signal transduction factor is a general term for factors involved in various signal transduction in cells. For example, β-catenin, caspase, various cytokines (interleukin, TNF-α) and the like can be mentioned.
The peptide that binds to the specific sequence is preferably any peptide selected from the group consisting of NM23-H1-binding peptide, cathepsin E-binding peptide, MGMT-binding peptide, and SOD1-binding peptide.
特定の配列に結合するタンパク質は、上述した酵素、抗体、転写因子、及びシグナル伝達因子からなる群から選ばれるタンパク質であることが好ましい。
前記核酸は、天然に存在する核酸又は人工合成した核酸であり、イノシン酸その他のヌクレオチド構造を有する化合物を含む核酸も包含する。
前記脂質は、水に不溶で有機溶媒に可溶であり、加水分解によって脂肪酸を遊離する、生物体によって利用される物質である。例えば、リン脂質、糖脂質、脂肪酸及びステロイド等を挙げることができる。
The protein that binds to a specific sequence is preferably a protein selected from the group consisting of the aforementioned enzyme, antibody, transcription factor, and signal transduction factor.
The nucleic acid is a naturally occurring nucleic acid or an artificially synthesized nucleic acid, and includes a nucleic acid containing a compound having an inosinic acid or other nucleotide structure.
The lipid is a substance used by an organism that is insoluble in water and soluble in an organic solvent, and liberates fatty acids by hydrolysis. For example, phospholipid, glycolipid, fatty acid, steroid and the like can be mentioned.
前記糖は、広義には、ムチン、プロテオグリカン、グリコーゲン、キチン等を含む炭水化物の総称であり、狭義には、ブドウ糖、果物、ショ糖、乳糖及び麦芽糖その他の単糖類、二糖類をいう。
前記低分子化合物は、分子量が約1,000Da以下の分子をいい、ビタミン、ステロイドホルモン、ATP等を挙げることができる。
前記ペプチドアプタマーは、上述した、酵素、受容体、抗体、転写因子、シグナル伝達因子、特定の配列に結合するペプチド、特定の配列に結合するタンパク質、核酸、脂質、糖及び低分子化合物からなる群から選ばれるいずれかの物質と結合し得るものである。
The sugar is a general term for carbohydrates including mucin, proteoglycan, glycogen, chitin and the like in a broad sense, and in a narrow sense, it refers to glucose, fruit, sucrose, lactose, maltose and other monosaccharides and disaccharides.
The low molecular weight compound refers to a molecule having a molecular weight of about 1,000 Da or less, and includes vitamins, steroid hormones, ATP, and the like.
The peptide aptamer includes the above-described enzyme, receptor, antibody, transcription factor, signal transduction factor, peptide that binds to a specific sequence, protein that binds to a specific sequence, nucleic acid, lipid, sugar, and low molecular weight compound. It can bind to any substance selected from.
ここで、カテプシンEは主要な細胞内アスパラギン酸プロテアーゼの一つであり、動物の胃、胸腺、又は脾臓等に限局的に分布する非リソソーム性酵素である。カテプシンEは、生理活性ペプチドの生成、外来抗原のプロセシング、癌浸潤や転移等が起こるときに生じる、生理的及び病理的なタンパク質分解に関与していることが知られている。
また、NM23-H1は、1988年に癌転移抑制遺伝子として初めて同定された遺伝子であり、NM23-H1の発現の低下と乳癌やメラノーマ等の癌転移との間に相関関係があることが知られている。
Here, cathepsin E is one of the major intracellular aspartic proteases, and is a non-lysosomal enzyme localized in the stomach, thymus, spleen, etc. of animals. Cathepsin E is known to be involved in physiological and pathological proteolysis that occurs when bioactive peptide production, foreign antigen processing, cancer invasion, metastasis, and the like occur.
NM23-H1 was first identified as a cancer metastasis suppressor gene in 1988, and it is known that there is a correlation between decreased expression of NM23-H1 and cancer metastasis such as breast cancer and melanoma. ing.
ジンジパインは、歯周病の病原菌であるPorphyromonas gingivalis（ジンジバリス菌）が産生する、主要なシステインプロテアーゼであり、トリプシン様活性を示す。一次構造上、他のプロテアーゼとの相同性を示さないため、独自のグループとして分類されている。切断部位の特異性からArg-Xを切断するArg-gingipain（Rgp）とLys-Xを切断するLys-gingipain（Kgp）とに分類される。
MGMT（メチルグアニン・メチル転移酵素）は、DNAの脱メチル化酵素であり、グアニンからのメチル基の除去を通じて、DNA鎖に生じた損傷を直接消去する作用を持つ。
Gingipain is a major cysteine protease produced by Porphyromonas gingivalis, a pathogen of periodontal disease, and exhibits trypsin-like activity. Since it does not show homology with other proteases due to its primary structure, it is classified as a unique group. Based on the specificity of the cleavage site, it is classified into Arg-gingipain (Rgp) that cleaves Arg-X and Lys-gingipain (Kgp) that cleaves Lys-X.
MGMT (methylguanine methyltransferase) is a DNA demethylase, and has the effect of directly erasing damage caused to DNA strands by removing methyl groups from guanine.
SOD1は、スーパーオキシドディスムターゼ（Superoxide dismutase, SOD）の１つである。SODは、スーパーオキシドアニオン（・O2 −）を酸素と過酸化水素とに不均化する酸化還元酵素である。活性中心に銅(II)イオンと亜鉛(II)イオン(Cu, ZnSOD)、またはマンガン(III)イオン(MnSOD)や鉄(III)イオン(FeSOD)のように二価または三価の金属イオンを持った酵素で、細胞質（Cu, ZnSOD) やミトコンドリア（MnSOD)に多く局在している。SOD1は亜鉛を含む、2つのサブユニットからなる二量体である。 SOD1 is one of superoxide dismutase (SOD). SOD is an oxidoreductase that disproportionates superoxide anion (• O 2 − ) into oxygen and hydrogen peroxide. Copper (II) ion and zinc (II) ion (Cu, ZnSOD), or divalent or trivalent metal ion such as manganese (III) ion (MnSOD) or iron (III) ion (FeSOD) at the active center It is an enzyme that has a lot of localization in cytoplasm (Cu, ZnSOD) and mitochondria (MnSOD). SOD1 is a dimer composed of two subunits containing zinc.
本発明では、上述した構造を有するスタンドペプチドを固相に固定し、上記のような標的分子の配向性が揃うように、上記スタンドペプチドの標的結合部位に結合させる。上記のように、本発明のスタンドペプチドは固相から立ちあがっており、安定なαヘリックス構造を含むために標的分子を効率よく捕捉することができる。
本発明のスタンドペプチドを使用した場合と使用しない場合に、標的結合ペプチドがどのような状態で存在しているかを模式的に、それぞれ、図１及び２に示す。図１に示すように、本発明のスタンドペプチドを使用しない場合には、標的結合用ペプチドは、基板（固相）から立ちあがっているものもあるが、倒れ込んで基板に密着した状態になっているものもある。倒れこんでいる場合には、標的分子とうまく結合することができない。標的結合用ペプチドを基板に直接結合させず、ポリエチレングリコール（PEG）を介して結合させた場合にも、同様のことが起こる。
In the present invention, the stand peptide having the above-described structure is immobilized on a solid phase and bound to the target binding site of the stand peptide so that the orientation of the target molecule as described above is aligned. As described above, the stand peptide of the present invention rises from the solid phase and can capture the target molecule efficiently because it contains a stable α-helix structure.
FIG. 1 and FIG. 2 schematically show how the target binding peptide exists when the stand peptide of the present invention is used and when it is not used. As shown in FIG. 1, when the stand peptide of the present invention is not used, the target binding peptide may rise from the substrate (solid phase), but it falls down and is in close contact with the substrate. There are also things. If it falls down, it cannot bind well to the target molecule. The same thing occurs when the target binding peptide is not directly bonded to the substrate but is bonded via polyethylene glycol (PEG).
これに対し、図２に示すように、本発明のスタンドペプチドは、上述のように親水性であり、かつ安定なαヘリックス構造を支持部として有しているため、基板に倒れ込むことなく立ちあがっている。これによって、標的結合ペプチドの配向性が揃い、効率よく標的分子を捕捉することができる。さらに、スタンドペプチドの高さがほぼ一定となるために、検出感度を向上させることもできる。 On the other hand, as shown in FIG. 2, the stand peptide of the present invention is hydrophilic and has a stable α-helix structure as a support as described above, so that it stands up without falling into the substrate. Yes. Thereby, the orientation of the target binding peptide is uniform, and the target molecule can be efficiently captured. Furthermore, since the height of the stand peptide is substantially constant, detection sensitivity can be improved.
以上のような構造とするために、本願発明では、ミオグロビンA鎖(A1〜A16)中の疎水性アミノ酸をグルタミン（Gln）に置換した配列を使用する。ミオグロビンA鎖のA1〜A16の配列を使用したのは、上記の置換を行うことにより、親水性のαヘリックス構造を有するペプチドとすることができるからである。ここで、ミオグロビンA鎖(A1〜A16)の配列（配列表の配列番号１）は下記の通りである。 In order to obtain the structure as described above, the present invention uses a sequence in which a hydrophobic amino acid in the myoglobin A chain (A1 to A16) is substituted with glutamine (Gln). The reason why the sequences A1 to A16 of the myoglobin A chain are used is that a peptide having a hydrophilic α-helix structure can be obtained by performing the above substitution. Here, the sequence of myoglobin A chain (A1 to A16) (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) is as follows.
配列表の配列番号１
配列(N→C)：SEGEWQQQQHQWAHQE
Sequence (N → C): SEGEWQQQQHQWAHQE
このペプチドのアミノ酸配列を使用して、後述するインビトロ選択法により、下記の配列を有する、N末端フリータイプのαスタンドペプチド（配列表の配列番号２）及びC末端フリータイプのαスタンドペプチド（配列表の配列番号３）を得ることができる。 Using the amino acid sequence of this peptide, an N-terminal free type α-stand peptide (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) and a C-terminal free type α-stand peptide (arranged by the following in vitro selection method) Sequence listing SEQ ID NO: 3) can be obtained.
配列表の配列番号２
GGGSEGEWQQQQHQWAHQE
GGGSEGEWQQQQHQWAHQE
配列表の配列番号３
SEGEWQQQQHQWAHQEGGGC
SEGEWQQQQHQWAHQEGGGC
インビトロ選択法は、以下のようにして行う。
mRNAとリンカーとの連結は、公知の手法を用いて、直接的又は間接的に、化学的又は物理的に行うことができる。例えば、mRNAの３’末端にリンカーの末端と相補的な配列を設けておくと、両者をハイブリダイゼーションによって連結することができる。
本発明において、「ライゲーション」又は「ライゲーション反応」は、酵素により促進される反応をいい、具体的には、T4 RNAリガーゼ又はTS2126耐熱性ファージ由来DNAリガーゼを好適に利用することができ、T4 RNAリガーゼを利用することが、連結効率の理由からさらに好ましい。
The in vitro selection method is performed as follows.
The linkage between mRNA and linker can be performed directly or indirectly, chemically or physically, using a known method. For example, if a sequence complementary to the end of the linker is provided at the 3 ′ end of mRNA, both can be linked by hybridization.
In the present invention, “ligation” or “ligation reaction” refers to a reaction promoted by an enzyme. Specifically, T4 RNA ligase or TS2126 thermostable phage-derived DNA ligase can be suitably used. It is more preferable to use ligase for reasons of ligation efficiency.
ライゲーション反応前のアニーリングは、60〜100℃にて2〜60分間、ヒートブロック、アルミブロック、ウォーターバスその他の加温用器具にて温めた後、室温で2〜60分間放置して液温を穏やかに低下させ、さらに−5〜10℃に冷却して行うことが好ましい。例えば、90℃で５分間アルミブロック上にて温め、次に70℃で５分間アルミブロック上にて温め、最後に室温で10分間放置した後、氷上に置くようにすることが好ましい。
ライゲーション反応液の組成は、0.1〜2.5U/μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ；0.4〜5U/μＬのT4 RNAリガーゼ；10〜250mMのTris-塩酸（pH7.0〜8.0）；2.0〜50mMの塩化マグネシウム；2.0〜50ｍMのジチオスレイトール（DTT）；0.2〜5.0のmMのATPを含むものであることが好ましい。反応効率の点から、0.5U/μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ；2.0U/μLのT4 RNAリガーゼ;50mMのTris-塩酸（pH7.5）；10mMの塩化マグネシウム；10mMのDTT；1.0mMのATPを含有するものであることが好ましい。この反応液には、必要に応じて、SUPERase・InTM RNase inhibitor（Ambion社）などのRNA分解酵素阻害剤を添加してもよい。
For annealing before the ligation reaction, heat at 60 to 100 ° C for 2 to 60 minutes, warm with a heat block, aluminum block, water bath or other heating equipment, then leave it at room temperature for 2 to 60 minutes to increase the liquid temperature. It is preferable that the temperature is lowered gently and further cooled to −5 to 10 ° C. For example, it is preferable to warm on an aluminum block at 90 ° C. for 5 minutes, then warm on the aluminum block at 70 ° C. for 5 minutes, and finally leave at room temperature for 10 minutes before placing on ice.
The composition of the ligation reaction solution was 0.1-2.5 U / μL T4 polynucleotide kinase; 0.4-5 U / μL T4 RNA ligase; 10-250 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.0-8.0); 2.0-50 mM magnesium chloride Preferably 2.0-50 mM dithiothreitol (DTT); 0.2-5.0 mM ATP. In terms of reaction efficiency, 0.5 U / μL T4 polynucleotide kinase; 2.0 U / μL T4 RNA ligase; 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.5); 10 mM magnesium chloride; 10 mM DTT; 1.0 mM ATP It is preferable to contain. If necessary, an RNA-degrading enzyme inhibitor such as SUPERase • In ™ RNase inhibitor (Ambion) may be added to this reaction solution.
ライゲーション反応を行う反応系の体積は、4.0〜100μLであることが好ましい。反応効率の点から20〜40μLとすることが好ましく、20μLとすると最も反応効率が高い。
この反応系中でのRNAとリンカーとの量比は、5.0〜100pmolのリンカーに対し、mRNAの量を、5.0〜100 pmolとすることが好ましい。
アニーリング反応は、T4ポリヌクレオチドキナーゼ及びT4 RNAリガーゼを除いたライゲーション反応液中で行うことができる。そして、アニーリングの終わった反応液中に、これらの酵素を必要量投入することで、ライゲーション反応を開始させることができる。
ライゲーション反応は、10〜40℃で１分間〜数時間行うのが好ましい。作業効率及び反応効率の面から、20〜30℃で5〜180分間とすることが好ましく、25℃で15分間とすることが最も好ましい。
The volume of the reaction system for performing the ligation reaction is preferably 4.0 to 100 μL. The reaction efficiency is preferably 20 to 40 μL, and the reaction efficiency is highest when 20 μL.
The amount ratio of RNA to linker in this reaction system is preferably 5.0 to 100 pmol with respect to 5.0 to 100 pmol of linker.
The annealing reaction can be performed in a ligation reaction solution excluding T4 polynucleotide kinase and T4 RNA ligase. Then, the ligation reaction can be started by introducing a necessary amount of these enzymes into the reaction solution after the annealing.
The ligation reaction is preferably performed at 10 to 40 ° C. for 1 minute to several hours. From the viewpoint of working efficiency and reaction efficiency, it is preferably 5 to 180 minutes at 20 to 30 ° C., and most preferably 15 minutes at 25 ° C.
次に、連結体Ａ（mRNAとリンカーとの連結体）を無細胞翻訳系と接触させることによって、タンパク質の合成を行う。ここで、タンパク質を合成するための無細胞翻訳系は、動物由来細胞、植物由来細胞、菌類及び細菌類からなる群から選択することができる。具体的には大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などを使用することができる（Lamfrom H., Grunberg-Manago M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 27, 1 (1967)）。
生物種により翻訳に利用されるコドンの種類が異なるので、対象となる遺伝子や遺伝子の由来に合わせて無細胞翻訳系を選択することが好ましい。
Next, protein synthesis is carried out by bringing the conjugate A (conjugate of mRNA and linker) into contact with a cell-free translation system. Here, the cell-free translation system for synthesizing the protein can be selected from the group consisting of animal-derived cells, plant-derived cells, fungi and bacteria. Specifically, Escherichia coli, rabbit reticulocyte, wheat germ extract and the like can be used (Lamfrom H., Grunberg-Manago M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 27, 1 (1967)).
Since the type of codon used for translation differs depending on the biological species, it is preferable to select a cell-free translation system in accordance with the target gene and the origin of the gene.
本発明の実施形態においては、前記無細胞翻訳系として、ウサギの血液から得られた網状赤血球細胞のライセートを利用することが好ましい。前記ライセートは、マイクロコッカルヌクレアーゼによって細胞由来のmRNAを分解し、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）を加えてカルシウムをキレートし、前記ヌクレアーゼを不活化処理したもの（以下、「マイクロコッカルヌクレアーゼ処理済」という。）とすることが、より好ましい。 In the embodiment of the present invention, it is preferable to use a reticulocyte lysate obtained from rabbit blood as the cell-free translation system. The lysate is obtained by degrading cell-derived mRNA with micro-coccal nuclease, adding glycol ether diamine tetraacetic acid (EGTA) to chelate calcium, and inactivating the nuclease (hereinafter referred to as “micro-coccal nuclease treatment”). It is more preferable to say “finished”).
翻訳反応液の組成は、3.4〜85μLのウサギ網状赤血球ライセート（マイクロコッカルヌクレアーゼ処理済）と0.24〜10 pmolの上記連結体を含む反応バッファー（最終濃度：16〜400mMの酢酸カリウム；0.１〜2.5mMの酢酸マグネシウム；0.2〜50mMのクレアチンリン酸；各0.00〜0.25mMのアミノ酸を含む）を10〜100μL用いるのが好ましい。反応効率の点から、17μLのウサギ網状赤血球ライセート（同上）と1.2〜2.0pmolの上記連結体とを含む反応バッファー（最終濃度：80 mMの酢酸カリウム；0.5mMの酢酸マグネシウム；10mMのクレアチンリン酸；各0.05mMのアミノ酸（メチオニン及びロイシンは各々0.025mM）を25μL用いるのが、さらに好ましい。
また必要に応じて、この反応液に、SUPERase・InTM RNase inhibitor（Ambion社）などのRNA分解酵素阻害剤を添加してもよい。
The composition of the translation reaction solution was 3.4 to 85 μL of rabbit reticulocyte lysate (micrococcal nuclease-treated) and 0.24 to 10 pmol of the above-mentioned ligation buffer (final concentration: 16 to 400 mM potassium acetate; 0.1 It is preferred to use 10-100 μL of ~ 2.5 mM magnesium acetate; 0.2-50 mM creatine phosphate; each containing 0.00-0.25 mM amino acid. From the viewpoint of reaction efficiency, a reaction buffer (final concentration: 80 mM potassium acetate; 0.5 mM magnesium acetate; 10 mM creatine phosphate) containing 17 μL of rabbit reticulocyte lysate (same as above) and 1.2 to 2.0 pmol of the above conjugate. More preferably, 25 μL of each 0.05 mM amino acid (methionine and leucine 0.025 mM each) is used.
If necessary, an RNase inhibitor such as SUPERase / In ™ RNase inhibitor (Ambion) may be added to the reaction solution.
翻訳反応は20〜40℃で10〜90分間行うことが好ましく、生成効率と作業効率の点から、30℃で20分間行うことが特に好ましい。
翻訳反応後、連結体Ａと翻訳産物（タンパク質）との連結（連結体Ｂの形成）を、高塩濃度条件下にて促進することができる。連結体Ｂの形成促進は、終濃度0.3〜1.6Ｍの塩化カリウム及び終濃度40〜170mMの塩化マグネシウム存在下で行うのが好ましい。生成効率の点から、25μLの上記反応液に7〜10μLの３Ｍの塩化カリウム、及び３μLの１Ｍの塩化マグネシウム（終濃度：0.60〜0.79mMの塩化カリウム；79〜86mMの塩化マグネシウム）を添加することが、さらに好ましい。
連結体Ｂの形成促進は、形成効率と作業効率の点から、37℃で90〜120分間反応させることが好ましい。
The translation reaction is preferably performed at 20 to 40 ° C. for 10 to 90 minutes, and particularly preferably performed at 30 ° C. for 20 minutes from the viewpoint of production efficiency and work efficiency.
After the translation reaction, ligation between the ligation A and the translation product (protein) (formation of the ligation B) can be promoted under high salt concentration conditions. It is preferable to promote the formation of Conjugate B in the presence of potassium chloride having a final concentration of 0.3 to 1.6 M and magnesium chloride having a final concentration of 40 to 170 mM. From the viewpoint of production efficiency, 7 to 10 μL of 3M potassium chloride and 3 μL of 1M magnesium chloride (final concentration: 0.60 to 0.79 mM potassium chloride; 79 to 86 mM magnesium chloride) are added to 25 μL of the above reaction solution. More preferably.
The formation promotion of the linked body B is preferably performed at 37 ° C. for 90 to 120 minutes from the viewpoint of formation efficiency and work efficiency.
引き続き、連結体Ａを翻訳系に投入してタンパク質またはポリペプチド鎖を液相合成する際に、そのＣ末端（タンパク質連結部位）に、前記mRNAと翻訳されたタンパク質とが個々の分子ごとに連結される。mRNAにピューロマイシンを有するリンカーを結合させた結合体と翻訳系とを接触させると、そのmRNAがピューロマイシンを介して翻訳されたタンパク質と結合した連結体が生成する。 Subsequently, when the conjugate A is introduced into the translation system to synthesize a protein or polypeptide chain in a liquid phase, the mRNA and the translated protein are linked to each molecule at the C-terminus (protein linking site). Is done. When a conjugate in which a linker having puromycin is bound to mRNA is brought into contact with a translation system, a conjugate in which the mRNA is bound to a protein translated via puromycin is generated.
翻訳されたタンパク質はさらに、Ｎ末端側のペプチドの除去、糖鎖や脂質などの非アミノ酸成分の付加、アミノ酸の翻訳後修飾、又は立体構造や配列構造に基づく前記mRNAに対する親和性結合や、タンパク質の酵素活性によるmRNAの化学修飾その他の翻訳後修飾がなされてもよい。
こうした翻訳後修飾は、前記mRNAにコードされた遺伝子情報に基づいて行われてもよく、前記遺伝子ではなく外的要因に基づいて行われてもよい。例えば、フォールディング等を行うようにすることができる。
The translated protein further includes removal of the N-terminal peptide, addition of non-amino acid components such as sugar chains and lipids, post-translational modification of amino acids, or affinity binding to the mRNA based on the three-dimensional structure or sequence structure, Chemical modification of mRNA and other post-translational modifications may be made by the enzymatic activity of.
Such post-translational modification may be performed based on gene information encoded by the mRNA, or may be performed based on an external factor instead of the gene. For example, folding or the like can be performed.
上記連結体Ａ又は連結体Ｂは、あらかじめリンカーに標識化合物を結合させておくことによって、容易に検出することができる。そのような標識化合物としては、蛍光性化合物、抗原のエピトープ、放射性同位体等を挙げることができる。放射性同位体としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体を使用することが好ましい。
放射性同位体の利用が困難な場合には、蛍光性化合物を利用することが好ましい。蛍光性化合物としては、フリーの官能基（例えば、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、又はアミノ基など）を持ち、標識された塩基としてリンカーに連結可能な種々の蛍光色素を用いることが好ましい。このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコビリタンパク質、希土類金属キレート、ダンシルクロライド又はテトラメチルローダミンイソチオシアネート等を挙げることができる。また、各種GFP等も使用することができる。
The above-mentioned linking body A or linking body B can be easily detected by binding a labeling compound to a linker in advance. Examples of such labeling compounds include fluorescent compounds, antigenic epitopes, and radioisotopes. As the radioisotope, it is preferable to use a radioisotope such as 3 H, 14 C, 32 P, 125 I or 131 I.
When it is difficult to use a radioisotope, it is preferable to use a fluorescent compound. Fluorescent compounds have various functional groups that have free functional groups (for example, a carboxyl group that can be converted into an active ester, a hydroxyl group that can be converted into a phosphoramidide, or an amino group) and can be linked to a linker as a labeled base. It is preferable to use a dye. Examples of such fluorescent dyes include fluorescein isothiocyanate (FITC), phycobiliprotein, rare earth metal chelate, dansyl chloride or tetramethylrhodamine isothiocyanate. Various GFPs can also be used.
このαスタンドペプチドを所望のペプチドアプタマーと結合させる場合の模式図を図５および図６に示す。上記配列表の配列番号１のアミノ酸配列の５’末端側に−(EDC, Sulfo−NHS)−を含むようにすると、標的分子のカルボキシル基と結合して、標的分子を捕捉することができる。ここで、−(EDC, Sulfo−NHS)−は、図５に示す手法で上記配列表の配列番号１のアミノ酸配列の５’末端側に結合させる。
または、前記配列表の配列番号１のアミノ酸配列の３’末端側に、−HS−EMCS−を含むようにすると、標的分子のアミノ基と結合して標的分子を捕捉することができる。ここで、(−HS)−EMCS−は、図６に示す手法で上記配列表の配列番号１のアミノ酸配列の３’末端側に結合させる。
ここで、ペプチドアプタマーとは、進化分子工学によって創出された、標的分子と特異的に強く結合する能力を持ったRNA、DNA及びペプチド分子をいう。Szostakら(1990)による、環境適応（ラテン語でaptus）したオリゴマーを表す用語である。
FIG. 5 and FIG. 6 show schematic diagrams when this α-stand peptide is bound to a desired peptide aptamer. When-(EDC, Sulfo-NHS)-is included on the 5 ′ end side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the target molecule can be captured by binding to the carboxyl group of the target molecule. Here,-(EDC, Sulfo-NHS)-is bound to the 5 'end side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing by the method shown in FIG.
Alternatively, when -HS-EMCS- is included on the 3 ′ end side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the target molecule can be captured by binding to the amino group of the target molecule. Here, (-HS) -EMCS- is bound to the 3 'end side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing by the method shown in FIG.
Here, the peptide aptamer refers to RNA, DNA, and peptide molecules that have been created by evolutionary molecular engineering and have the ability to specifically and specifically bind to target molecules. Szostak et al. (1990) is a term for an oligomer adapted to the environment (latus aptus).
本発明の第２の実施態様は、上述したスタンドペプチドを、(a)基板上にC末端又はN末端で固定するペプチド固定化工程と、(b)前記固定化されたペプチドと標的分子とを反応させ、スタンドペプチドに標的分子を結合させる標的分子結合工程と、(c)標的分子の結合によって生じる反応を、蛍光測定又は吸光度測定で検出する反応検出工程と、を備える、Pep−ELISA法である。 In a second embodiment of the present invention, the above-mentioned stand peptide is (a) a peptide immobilization step of immobilizing on the substrate at the C-terminus or N-terminus, and (b) the immobilized peptide and the target molecule. A Pep-ELISA method comprising: a target molecule binding step of reacting and binding a target molecule to a stand peptide; and (c) a reaction detection step of detecting a reaction caused by the binding of the target molecule by fluorescence measurement or absorbance measurement. is there.
ここで、上記(a)の固定化工程では、以下のようにして基板上に、本発明のスタンドペプチドを固定化する。例えば、Peptide Coating Kit (TaKaRa)を使用することができる。この場合には、ペプチドアプタマーと連結した上記スタンドペプチドを、上記キットに添付された反応用バッファーを用いて、所定の濃度となるよう調整し、固定化プレートに所定の量、例えば、25〜100μL/ウェルとなるように分注する。
次いで、このキットに添付されたカップリング試薬を、蒸留水で所定の濃度、例えば、0.5〜2 mg/mLの濃度となるよう溶解し、速やかに、反応プレート（96ウェルマイクロプレート）の各ウェルに5〜20μLずつ添加し、プレートシェーカー等を用いて、所定の時間、よく混合する。混合後、所定の温度で所定の時間、例えば、室温で２時間、反応させる。
Here, in the immobilization step (a), the stand peptide of the present invention is immobilized on the substrate as follows. For example, Peptide Coating Kit (TaKaRa) can be used. In this case, the stand peptide linked to the peptide aptamer is adjusted to a predetermined concentration using the reaction buffer attached to the kit, and a predetermined amount, for example, 25 to 100 μL is immobilized on the immobilized plate. Dispense to make wells.
Next, the coupling reagent attached to this kit is dissolved in distilled water to a predetermined concentration, for example, 0.5 to 2 mg / mL, and immediately, each well of the reaction plate (96-well microplate) Add 5 to 20 μL each and mix well for a predetermined time using a plate shaker or the like. After mixing, the reaction is performed at a predetermined temperature for a predetermined time, for example, at room temperature for 2 hours.
次いで、反応プレート中の液を捨て、例えば、200μLの蒸留水を各ウェルに添加し、洗浄する。この洗浄操作は、所望の回数、例えば、３回繰り返す。洗浄後、非特異的な吸着を防止するために、各ウェルに、キットに添付されているブロッキング液を所定の量、例えば、200μLずつ添加し、所定の温度で所定の時間、例えば、室温で１時間反応させる。
反応プレート中の液を捨て、例えば、200μLの蒸留水で、各ウェルを洗浄する。この洗浄操作は所望の回数、例えば、3回繰り返す。
Next, the liquid in the reaction plate is discarded, and, for example, 200 μL of distilled water is added to each well and washed. This washing operation is repeated a desired number of times, for example, three times. After washing, in order to prevent non-specific adsorption, a predetermined amount, for example, 200 μL of blocking solution attached to the kit is added to each well, and the predetermined temperature is maintained at a predetermined temperature, for example, room temperature. Let react for 1 hour.
Discard the solution in the reaction plate and wash each well with, for example, 200 μL of distilled water. This washing operation is repeated a desired number of times, for example, three times.
得られたスタンドペプチドは、標的分子と結合するペプチドと図５および図６のようにして連結する。ここで使用する標的分子と結合するペプチド（以下、「標的結合ペプチド」ということがある。）は、標的分子を異種の動物の体内に注入した際に形成される抗体のエピトープ又はその一部と同じ配列のペプチドをいう。こうした標的結合ペプチドを得るための標的分子として好適使用できるものは、上述した通りである。 The obtained stand peptide is linked to the peptide that binds to the target molecule as shown in FIGS. As used herein, a peptide that binds to a target molecule (hereinafter sometimes referred to as “target binding peptide”) is an antibody epitope formed when the target molecule is injected into the body of a different animal or a part thereof. Refers to peptides of the same sequence. What can be suitably used as a target molecule for obtaining such a target-binding peptide is as described above.
これらの酵素に結合するペプチドは、上述したインビトロ選択法によって、選択することができる。例えば、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、このペプチドを用いて、例えば、以下の条件で、ELISAを行うことができる。
1. ペプチドコーティングキットに、上述した方法に従って、本発明のスタンドペプチドを固定する。
2. 標的分子（例えばNM23-H1）を各ウェルに100 ngずつ加え、室温で１時間半、振蘯する。
3. 200μLのリン酸緩衝生理食塩水（pH8.0、以下「PBS」ということがある。）でウェルを洗浄する（３回繰り返す）。
4. 一次抗体（NM23-H1 Antibody (C-20)、Santa Cruz Biotech社製）および二次抗体（Anti-GST-HRP、GE Healthcare Life Sciences社製）を、それぞれ500倍に希釈して各ウェルに加え、室温で１時間半、振蘯する。
5. 200μLのPBSでウェルを洗浄する（３回繰り返す）。
6. HRP基質（SureBlue、Kirkegaard & Perry Laboratories社製）を、100μLずつ、各ウェルに加え、室温で20分間、振蘯する。
7. 反応停止液（TMB Stop Solution 、Kirkegaard & Perry Laboratories社製）を100μLを、各ウェルに加えて撹拌した、その後、蛍光マイクロプレートリーダー（FluPoro、TaKaRa社）を用いて蛍光測定を行う（測定波長450nm）。
Peptides that bind to these enzymes can be selected by the in vitro selection methods described above. For example, a peptide having a desired amino acid sequence is synthesized, and ELISA can be performed using this peptide, for example, under the following conditions.
1. The stand peptide of the present invention is immobilized on a peptide coating kit according to the method described above.
2. Add 100 ng of target molecule (eg NM23-H1) to each well and shake for 1 hour and half at room temperature.
3. Wash the wells with 200 μL of phosphate buffered saline (pH 8.0, hereinafter sometimes referred to as “PBS”) (repeat three times).
4. Dilute the primary antibody (NM23-H1 Antibody (C-20), Santa Cruz Biotech) and secondary antibody (Anti-GST-HRP, GE Healthcare Life Sciences) 500 times to each well. And shake at room temperature for 1 1/2 hours.
5. Wash wells with 200 μL PBS (
6. Add 100 μL of HRP substrate (SureBlue, Kirkegaard & Perry Laboratories) to each well and shake for 20 minutes at room temperature.
7. Add 100 μL of reaction stop solution (TMB Stop Solution, Kirkegaard & Perry Laboratories) to each well and stir, then perform fluorescence measurement using a fluorescence microplate reader (FluPoro, TaKaRa) (measurement) Wavelength 450nm).
以下に、実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例に何等限定されるものではない。
（実施例１）αスタンドペプチドの合成
（１）使用したペプチド配列
αスタンドペプチド作成用の配列として、ミオグロビンＡ鎖の中のA1〜A16のアミノ酸配列をベースとして使用した。この配列を配列表の配列番号X2に示す。
上記のアミノ酸配列（A1〜A16）の中の疎水性アミノ酸をグルタミン(Q)に置換し、SEGEWQQQQHQWAHQE（配列番号１）の配列を使用した。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The present invention is not limited to the following examples.
Example 1 Synthesis of α-Stand Peptide (1) Peptide Sequence Used As the sequence for preparing α-stand peptide, the amino acid sequence of A1 to A16 in myoglobin A chain was used as a base. This sequence is shown in SEQ ID NO: X2 in the sequence listing.
The hydrophobic amino acid in the above amino acid sequence (A1 to A16) was substituted with glutamine (Q), and the sequence of SEGEWQQQQHQWAHQE (SEQ ID NO: 1) was used.
（２）αスタンドペプチドの作製
αスタンドペプチドを基板上に固定化する際に、N末端、C末端のいずれでも固定化できるように、N末端フリー型、C末端フリー型の双方を、以下のようにして作製した。
スペーサー配列を含めた配列（N末側、C末側連結に対応した２種類のペプチド配列：下記配列番号１及び２）を設計し、ペプチド合成会社（オペロン株式会社）に作製を依頼した。純度95％以上のペプチドが得られた。
N末側フリータイプ用αスタンドペプチドが下記の配列（配列番号２）、C末側フリータイプ用αスタンドペプチドが下記の配列（配列番号３）である。
(2) Preparation of α-stand peptide When α-stand peptide is immobilized on a substrate, both N-terminal free type and C-terminal free type are prepared as follows so that both N-terminal and C-terminal peptides can be immobilized. In this way, it was produced.
Sequences including a spacer sequence (two types of peptide sequences corresponding to N-terminal and C-terminal linkages: SEQ ID NOs: 1 and 2 below) were designed, and a peptide synthesis company (Operon Co., Ltd.) was commissioned. Peptides with a purity of 95% or more were obtained.
The α-stand peptide for N-terminal free type has the following sequence (SEQ ID NO: 2), and the α-stand peptide for C-terminal free type has the following sequence (SEQ ID NO: 3).
配列(N→C)：GGGSEGEWQQQQHQWAHQE （配列番号２）
配列(N→C)：SEGEWQQQQHQWAHQEGGGC （配列番号３）
なお、C末端側フリータイプ用αスタンドの配列は、連結反応をうまく行うことができるように、スペーサーGGGの配列の後ろに、さらにCysを付加した配列とした。
Sequence (N → C): GGGSEGEWQQQQHQWAHQE (SEQ ID NO: 2)
Sequence (N → C): SEGEWQQQQHQWAHQEGGGC (SEQ ID NO: 3)
The α-stand sequence for the C-terminal free type was a sequence in which Cys was further added after the spacer GGG sequence so that the ligation reaction could be performed successfully.
（３）αスタンドペプチドの精製
以上のようにして作製したαスタンドペプチドを、以下のようにしてカテプシンE結合ペプチド（p109）と結合させ、HPLCを用いて精製した。
EDC及びNHS（いずれもThermo Scientific社製）を室温に戻した。
活性化バッファー（0.1M MES, 0.5M NaCl, pH 6.0）でαスタンドペプチドを、1mg/mLに調製した。カップリングバッファー（リン酸緩衝生理食塩水(PBS), 100mM リン酸ナトリウム、150mM NaCl; pH 7.2）で、カテプシンE結合ペプチドをカップリングバッファー中で1mg/mLに調製した。
0.4mgのEDC（約2mM）及び0.6mgのNHS（約5mM）を、上記のように調製した1mLのαスタンドペプチド溶液に加え、室温で15分間反応させた。ここに、1.4μLの2-メルカプトエタノール（終濃度20mM）を加え、EDCをクエンチした。
(3) Purification of α-Stand Peptide The α-stand peptide produced as described above was bound to cathepsin E-binding peptide (p109) as follows and purified using HPLC.
EDC and NHS (both manufactured by Thermo Scientific) were returned to room temperature.
The α stand peptide was prepared at 1 mg / mL with an activation buffer (0.1 M MES, 0.5 M NaCl, pH 6.0). Cathepsin E-binding peptide was prepared at 1 mg / mL in coupling buffer with coupling buffer (phosphate buffered saline (PBS), 100 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl; pH 7.2).
0.4 mg EDC (about 2 mM) and 0.6 mg NHS (about 5 mM) were added to 1 mL of α-stand peptide solution prepared as described above, and allowed to react at room temperature for 15 minutes. To this, 1.4 μL of 2-mercaptoethanol (
カップリングバッファー（PBS）で平衡化しておいた脱塩カラムにかけて、架橋反応を停止させた。
カテプシンE結合ペプチドをαスタンドペプチドと等モル比となるように、活性化バッファー中に加え、２時間室温にて反応させた。ヒドロキシルアミン終濃度10mMとなるように加えて、反応を停止させた。次いで、過剰な停止試薬を脱塩カラムで除去した。
HPLC条件を以下に示す。
The cross-linking reaction was stopped by applying to a desalting column equilibrated with coupling buffer (PBS).
Cathepsin E-binding peptide was added to the activation buffer so as to have an equimolar ratio with the α-stand peptide, and allowed to react at room temperature for 2 hours. The reaction was stopped by adding a final hydroxylamine concentration of 10 mM. Excess stop reagent was then removed with a desalting column.
The HPLC conditions are shown below.
カラム：Symmetry 300 C18 columns (5um, 250 mm ｘ 4.6 mm), Waters社
移動相A：1M 酢酸トリエチルアミン (TEAA)
移動相B：100% アセトニトリル
移動相比：開始時(A:B = 100:0) → 30分経過時(A:B = 10:90)となるように勾配を設定。
温度：30°Ｃ
測定装置：LC-VPシリーズ、島津製作所
流速：1ml/min
検出器：UV検出器 (260nm, 280nm)、蛍光検出器（励起波長494nm、蛍光波長519nm）
フラクションサイズ：1ml（１分毎に分取）
Column: Symmetry 300 C18 columns (5um, 250mm x 4.6mm), Waters Mobile phase A: 1M Triethylamine acetate (TEAA)
Mobile phase B: 100% acetonitrile Mobile phase ratio: Start (A: B = 100: 0) → Set the gradient so that 30 minutes have passed (A: B = 10:90).
Temperature: 30 ° C
Measuring device: LC-VP series, Shimadzu Corporation Flow rate: 1ml / min
Detector: UV detector (260nm, 280nm), fluorescence detector (excitation wavelength 494nm, fluorescence wavelength 519nm)
Fraction size: 1ml (sorted every minute)
HPLCで分離した結果は図７の通りであった。図中、原料（αスタンド）は、αスタンドペプチドを表わす。また、原料（p109）はカテプシンE結合ペプチドを表わす。p109とαスタンドペプチドとの結合は、UV（260nm及び280nm）吸収による吸光度、及び蛍光（励起波長494nm、測定波長519nm）の両方で確認した。
蛍光吸収では３つのピーク（ピーク１〜３）が見られたため、それぞれのピークに対応する画分を集めて、カテプシンE結合ペプチドとαスタンドペプチドとの結合を確認した。
UVで確認したαスタンドペプチドのピークに近いピーク１では、カテプシンE結合ペプチドに複数のαスタンドペプチドが結合しており、p109のピークに近い方が１：１で結合していると考えられたため、ピーク３を以下の実験で使用した。
The result of separation by HPLC is shown in FIG. In the figure, the raw material (α stand) represents an α stand peptide. The raw material (p109) represents a cathepsin E-binding peptide. The binding between p109 and α-stand peptide was confirmed both by absorbance due to UV (260 nm and 280 nm) absorption and fluorescence (excitation wavelength 494 nm, measurement wavelength 519 nm).
Since three peaks (
In
（４）αスタンドペプチドの固相への固定
αスタンドペプチドは、以下のようにして、固相に固定した。ここで、固相である反応プレートとして、96ウェルマイクロタイタープレート（TaKaRa社製）を使用した。
上記のようにして合成したαスタンドペプチドを、Peptide Coating Kit (TaKaRa社製)を使用して固定した。まず、ペプチドアプタマーと連結した上記スタンドペプチドを、上記キットに添付された反応用バッファーを用いて、必要な濃度となるよう調整し、固定化プレートに50μL/ウェルとなるように分注した。本実施例では、スタンドペプチドの濃度を25μｇ/mLとなるように調製した。
(4) Immobilization of α-Stand Peptide on Solid Phase α-stand peptide was immobilized on the solid phase as follows. Here, a 96-well microtiter plate (TaKaRa) was used as a reaction plate as a solid phase.
The α stand peptide synthesized as described above was immobilized using Peptide Coating Kit (TaKaRa). First, the stand peptide linked to the peptide aptamer was adjusted to the required concentration using the reaction buffer attached to the kit, and dispensed to the immobilized plate at 50 μL / well. In this example, the concentration of the stand peptide was adjusted to 25 μg / mL.
次いで、このキットに添付されたカップリング試薬を、蒸留水で1mg/mlの濃度となるよう溶解し、速やかに、上記反応プレートの各ウェルに10μLずつ添加し、プレートシェーカーを用いてよく混合した。混合後、室温で２時間反応させた。
次いで、反応プレート中の液を捨て、200μLの蒸留水で、各ウェルを洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。洗浄後、非特異的な吸着を防止するために、各ウェルに、キットに添付されているブロッキング液を200μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。反応プレート中の液を捨て、200μLの蒸留水で、各ウェルを洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した。
以上のようにして、本発明のスタンドペプチドを固定した96ウェルマイクロタイタープレートを作成した。
Next, the coupling reagent attached to this kit was dissolved in distilled water to a concentration of 1 mg / ml, and 10 μL was quickly added to each well of the reaction plate and mixed well using a plate shaker. . After mixing, the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
Next, the liquid in the reaction plate was discarded, and each well was washed with 200 μL of distilled water. This washing operation was repeated three times. After washing, in order to prevent non-specific adsorption, 200 μL of blocking solution attached to the kit was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour. The solution in the reaction plate was discarded, and each well was washed with 200 μL of distilled water. This washing operation was repeated three times.
As described above, a 96-well microtiter plate on which the stand peptide of the present invention was immobilized was prepared.
（５）マウス及び健常人（女性）血清を用いた時のα−スタンドpep-ELISA
（５−１）材料
マウス血清として、正常マウス（8週齢、雌、図10（Ａ）中、WT（野生型）と示す）及びカテプシンE遺伝子をノックアウトしたマウス（8週齢、雌、図10（Ｂ）中、KO（ノックアウト）と示す）を各３匹使用した。注射器を用いて心臓から採血し、得られた血液を1000ｘｇ、10分間、4℃にて遠心し、血清を得た。
健常人血清として、30歳の女性から注射器を用いて前腕部静脈から採血し、得られた血液を1,000 ｘｇ、10分間、4℃にて遠心し、血清を得た。
それぞれの血清は、試験開始まで氷中に置いた。
（５−２）カテプシンE及びその基質の調製
カテプシンEは、ラットの脾臓から単離した。ラットを断頭後、脾臓を取り出してミンスし、ワーリングブレンダーを用いて、トップスピードで1分間、氷冷した蒸留水中にてホモジナイズした。得られたホモジネートに約10mLの水を加えて混合し、さらに水で5倍に希釈した。1000 x gで10分間遠心し、ペレットを等量の0.02Mのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）に再溶解し、再度1000 x gで10分間遠心した。２回の遠心で得られた上清を合わせて、「脾臓抽出物」とした。
(5) α-stand pep-ELISA when using mouse and healthy human (female) serum
(5-1) Material As mouse serum, normal mice (8 weeks old, female, shown as WT (wild type) in FIG. 10 (A)) and mice knocked out cathepsin E gene (8 weeks old, female, figure) 10 (B), indicated as KO (knockout)), 3 each were used. Blood was collected from the heart using a syringe, and the obtained blood was centrifuged at 1000 × g for 10 minutes at 4 ° C. to obtain serum.
As healthy human serum, blood was collected from a forearm vein from a 30-year-old woman using a syringe, and the obtained blood was centrifuged at 1,000 × g for 10 minutes at 4 ° C. to obtain serum.
Each serum was placed on ice until the start of the test.
(5-2) Preparation of cathepsin E and its substrate Cathepsin E was isolated from rat spleen. After decapitation of the rat, the spleen was removed and minced, and homogenized in ice-cooled distilled water for 1 minute at the top speed using a Waring blender. About 10 mL of water was added to the obtained homogenate and mixed, and further diluted 5-fold with water. After centrifuging at 1000 xg for 10 minutes, the pellet was redissolved in an equal volume of 0.02 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) and centrifuged again at 1000 xg for 10 minutes. The supernatants obtained by the two centrifugations were combined to obtain a “spleen extract”.
この脾臓抽出物を、17,000 x gで30分間遠心し、0℃にて、撹拌しながら固体の硫酸アンモニウムを添加して65％飽和とした。30分後、17,000 x gで20分間遠心して沈殿を集め、水に対して12時間透析した。17,000 x gで20分間遠心して不溶物を除去した。
1Mの酢酸を加えて、不溶物を除去した透析後の上清をpH 3.5にし、ついで、5Mの塩化ナトリウムを含む1/5量の0.5 M酢酸ナトリウムバッファー（pH 3.5）を加えた。得られた沈殿を、17,000 x gで20分間遠心して除去した。ペレットを1Mの塩化ナトリウムを含む0.1Mの酢酸ナトリウムバッファー（pH 3.5）に再溶解し、105,000 x gで30分間遠心し、上清を合わせた。この上清（酵素溶液）は、上記脾臓抽出物の65％の活性を含んでいた。比活性は、脾臓抽出物の6倍となった。
The spleen extract was centrifuged at 17,000 × g for 30 minutes, and solid ammonium sulfate was added to it at 65 ° C. with stirring at 0 ° C. After 30 minutes, the precipitate was collected by centrifugation at 17,000 xg for 20 minutes and dialyzed against water for 12 hours. Insoluble matter was removed by centrifugation at 17,000 xg for 20 minutes.
1 M acetic acid was added to the supernatant after dialysis from which insolubles had been removed to pH 3.5, and then 1/5 volume of 0.5 M sodium acetate buffer (pH 3.5) containing 5 M sodium chloride was added. The resulting precipitate was removed by centrifugation at 17,000 xg for 20 minutes. The pellet was redissolved in 0.1 M sodium acetate buffer (pH 3.5) containing 1 M sodium chloride, centrifuged at 105,000 × g for 30 minutes, and the supernatants were combined. This supernatant (enzyme solution) contained 65% of the activity of the spleen extract. The specific activity was 6 times that of the spleen extract.
1Mの塩化ナトリウムを含む0.1 Mの酢酸ナトリウムバッファー（pH 3.5）で平衡化したペプスタチン−セファロース4B（3.2 ｘ6.0 cm）でアフィニティークロマトグラフィーを行った。上記のようにして得られた酵素溶液を上記カラムにアプライした。
上記カラムを、280nmでの吸光がベースラインになるまでスターティングバッファーで洗浄した（Fig. 1）。その後、0.1 Mの塩化ナトリウムを含有する0.1Mのトリス塩酸バッファー（pH 8.6）で溶出した。画分の活性のピーク番号である203〜225を集めた。プールした酵素画分を限外濾過によって濃縮し、0.02 Mのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）に対して透析した。酵素の終了は約95％であり、比活性は、上記脾臓抽出物から310倍上昇し、約4,300単位であった。
Affinity chromatography was performed with pepstatin-Sepharose 4B (3.2 × 6.0 cm) equilibrated with 0.1 M sodium acetate buffer (pH 3.5) containing 1 M sodium chloride. The enzyme solution obtained as described above was applied to the column.
The column was washed with starting buffer until the absorbance at 280 nm reached baseline (Fig. 1). Thereafter, elution was performed with 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.6) containing 0.1 M sodium chloride. Fractions activity peak numbers 203-225 were collected. The pooled enzyme fractions were concentrated by ultrafiltration and dialyzed against 0.02 M sodium phosphate buffer (pH 7.0). The completion of the enzyme was about 95%, and the specific activity increased about 310 times from the spleen extract to about 4,300 units.
上記のように調製した酵素を、1Mの塩化ナトリウムを含む0.02 Mのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）で平衡化した、コンカナバリン-A−セファロース4Bカラム（2.5ｘ5.0cmの）にアプライした。このカラムを同じバッファーで洗浄し、その後、上記酵素を、0.2Mのメチル-D-α-グルコシドを含む上記バッファーで溶出した。このアフィニティークロマトグラフィーにより、比活性は1.5倍に上昇し、収量は約80％となった。 The enzyme prepared as described above was applied to a Concanavalin-A-Sepharose 4B column (2.5 x 5.0 cm) equilibrated with 0.02 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 M sodium chloride. The column was washed with the same buffer, after which the enzyme was eluted with the buffer containing 0.2M methyl-D-α-glucoside. This affinity chromatography increased the specific activity by a factor of 1.5 and yielded approximately 80%.
以上のようにして得られた酵素画分を濃縮し、0.02 Mのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）に対して透析し、2.5ｘ90 cmのセファデックスG-100 カラム（0.02 Mのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）で平衡化した）にアプライした。上記カラムから、溶出速度を9mL/時間、1つの画分を3 mLとして、同バッファーで溶出させて集めた。ウシヘモグロビンをpH 3.1で加水分解する、２つの酸性プロテイナーゼの活性が見られた。最初のピークは、分子量90,000、総活性の35〜40％を含み、比活性は約２倍であった。２番目のピークは、分子量44,000に相当する位置に溶出され、総活性の約60％を含んでいた。この活性のピークは、幾つかの物理化学的活性から、カテプシンDと推定した。 The enzyme fraction obtained as described above is concentrated, dialyzed against 0.02 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), and then 2.5 x 90 cm Sephadex G-100 column (0.02 M sodium phosphate buffer). (Equilibrated with pH 7.0)). The column was collected by eluting with the same buffer at an elution rate of 9 mL / hour and a fraction of 3 mL. Two acid proteinase activities were found to hydrolyze bovine hemoglobin at pH 3.1. The first peak contained a molecular weight of 90,000, 35-40% of the total activity, and the specific activity was about twice. The second peak eluted at a position corresponding to a molecular weight of 44,000 and contained about 60% of the total activity. This peak of activity was estimated as cathepsin D from several physicochemical activities.
セファデックスG-100からの高分子量（90,000）を有するプールした産物を濃縮し、0.05 Mのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）に対して透析した。同じ試料を、0.005 Mのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）で平衡化した、1.6ｘ12cmのDEAE-セファセルカラムにアプライした。このカラムを同じバッファーで洗浄し、バッファー中の塩化ナトリウムで、段階的に溶出した。この酵素を、0.3 Mの塩化ナトリウムで溶出させ、画分を集めて0.005 Mのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）に対して透析した。酵素の収量は、約80％で、比活性は３倍に上昇した。 The pooled product with high molecular weight (90,000) from Sephadex G-100 was concentrated and dialyzed against 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 7.0). The same sample was applied to a 1.6 × 12 cm DEAE-Sephacel column equilibrated with 0.005 M sodium phosphate buffer (pH 7.0). The column was washed with the same buffer and eluted stepwise with sodium chloride in buffer. The enzyme was eluted with 0.3 M sodium chloride and fractions were collected and dialyzed against 0.005 M sodium phosphate buffer (pH 7.0). The enzyme yield was about 80% and the specific activity increased threefold.
酵素溶液をLKB8101カラム上で等電点分画に供した。pH 4〜7のグラジエントを、カラムを横切るように導入した。pHの勾配を確認しながら、pH 4.1と4.4との間の位置となる画分を集めて濃縮し、0.1 Mのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）に対して透析した。酸性プロテイナーゼの比活性は、59,000単位でアプライした活性の収量は約80％であった。等電点分画後の試料を、精製した酵素調製物として使用した。 The enzyme solution was subjected to isoelectric focusing on an LKB8101 column. A gradient of pH 4-7 was introduced across the column. While confirming the pH gradient, fractions located between pH 4.1 and 4.4 were collected, concentrated and dialyzed against 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0). The specific activity of the acid proteinase was approximately 80% in yield of activity applied at 59,000 units. The sample after isoelectric focusing was used as a purified enzyme preparation.
次いで、蛍光基質（Cathepsin D/E の消光性蛍光基質(3200-v)、ペプチド研究所社製造）を準備した。この蛍光性基質を100％ DMSOに溶解して10mMとしたストック溶液を調製した。ストック溶液を、使用直前に反応バッファー（組成：50 mM の酢酸ナトリウム、100 mM NaCl、pH 4.5）で100倍に希釈した。 Next, a fluorescent substrate (Cathepsin D / E quenching fluorescent substrate (3200-v), manufactured by Peptide Laboratories) was prepared. A stock solution was prepared by dissolving this fluorescent substrate in 100% DMSO to 10 mM. The stock solution was diluted 100 times with a reaction buffer (composition: 50 mM sodium acetate, 100 mM NaCl, pH 4.5) immediately before use.
（５−３）pep-ELISA
上記（５−２）で調製したカテプシンE及び蛍光基質溶液を使用して、マウス血清及びヒト血清を用いてpep-ELISAを行った。
上記（４）で作成したαスタンドペプチド固定化マイクロタイタープレート３枚に、上記（５−２）で調製した蛍光基質溶液を50μLずつ加え、さらに、野生型マウス血清又はノックアウトマウス血清を、7.5μL、15μL及び20μLの量で添加した（ｎ＝3）。40℃で10分間インキュベートし、OD402の値を測定した（測定装置：パーキンエルマーライフサイエンスジャパン社製、製品名ARVOsx）。
ヒト血清の場合には、αスタンドペプチド固定化マイクロタイタープレートに、血清5μL〜40μLまで、５μL刻みで添加量を増やした点を除いてマウス血清を使用した場合と同様にして、測定を行った。結果を図10（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
(5-3) pep-ELISA
Pep-ELISA was performed using mouse serum and human serum using the cathepsin E and fluorescent substrate solution prepared in (5-2) above.
50 μL of the fluorescent substrate solution prepared in (5-2) above was added to three α-stand peptide-immobilized microtiter plates prepared in (4) above, and 7.5 μL of wild type mouse serum or knockout mouse serum was added. , 15 μL and 20 μL (n = 3). After incubation at 40 ° C. for 10 minutes, the value of OD 402 was measured (measuring device: manufactured by Perkin Elmer Life Science Japan, product name ARVOsx).
In the case of human serum, measurement was performed in the same manner as when using mouse serum except that the amount of addition was increased in 5 μL increments from 5 μL to 40 μL of serum on an α stand peptide-immobilized microtiter plate. . The results are shown in FIGS. 10 (A) and (B).
以上の測定結果から、αスタンドペプチドを用いたpep-ELISA系の特異性および感度は、αスタンドペプチドを使用しない場合のアッセイ系と、ほぼ同程度であることが示された。また、このアッセイ系は、少なくとも、ヒト健常女性の血清15~35μLの範囲で直線性が認められた。マウスの血清では、7.5〜15μLの範囲で、WTとKOとの差異が明確に測定された。
目視検査により、αスタンドペプチドを使用した場合の方が、使用しなかった場合よりもバラつきが少ないことが観察された。
From the above measurement results, it was shown that the specificity and sensitivity of the pep-ELISA system using the α-stand peptide is almost the same as that of the assay system when the α-stand peptide is not used. In addition, this assay system showed linearity at least in the range of 15 to 35 μL of serum from healthy human women. In the mouse serum, the difference between WT and KO was clearly measured in the range of 7.5-15 μL.
By visual inspection, it was observed that there was less variation when the α stand peptide was used than when it was not used.
（実施例２）カテプシンEの活性化の検討
カテプシンEの活性化を、以下の配列（配列番号４）を有するペプチドを化学合成し、これを用いて検討した。
IEGRGCPCIDFMVEVQVEVAEALLTALSLSPGS
(Example 2) Examination of the activation of cathepsin E The activation of cathepsin E was examined by chemically synthesizing a peptide having the following sequence (SEQ ID NO: 4).
IEGRGCPCIDFMVEVQVEVAEALLTALSLSPGS
次に、このペプチドのカテプシンEに対する性質を以下のようにして調べた。
上記ペプチドのカテプシンEとの解離定数(Kd)を、Biocore2000 (GEヘルスケア、英国)を用いてSPR法で測定した。カテプシンEをCM5 Biocoreセンサーチップ(GEヘルスケア、英国)上に、常法に従って、アミンカップリング法により固定した。
150μg/mLのカテプシンEを含む少量の酢酸バッファー（50mMの酢酸ナトリウム、100mMのNaCl、pH 4.5）を、サンプルレーンのフローセルに注入した。対照レーンもカテプシンEを含まない試料で同様に準備した。異なる4つの濃度（10、20、30、及び40 nM）の上記ペプチドを各レーンに注入し、流速20μL/分とし、カテプシンEと上記ペプチドとの間の相互作用を測定した。
Next, the property with respect to cathepsin E of this peptide was investigated as follows.
The dissociation constant (Kd) of the above peptide with cathepsin E was measured by the SPR method using Biocore 2000 (GE Healthcare, UK). Cathepsin E was immobilized on a CM5 Biocore sensor chip (GE Healthcare, UK) by an amine coupling method according to a conventional method.
A small amount of acetate buffer (50 mM sodium acetate, 100 mM NaCl, pH 4.5) containing 150 μg / mL cathepsin E was injected into the flow cell in the sample lane. A control lane was similarly prepared with a sample containing no cathepsin E. Four different concentrations (10, 20, 30, and 40 nM) of the peptide were injected into each lane, the flow rate was 20 μL / min, and the interaction between cathepsin E and the peptide was measured.
この実験では、ランニングバッファーとして、50mMのトリス塩酸、100mMのNaClを含む中性バッファー（pH 7.4）を使用し、ペプチドの除去用に50mMのNaOHを使用した。
得られたセンサーグラム曲線を１：１のラングミュア結合モデルにフィットさせ、BIA評価ソフトウェア（GEヘルスケア、英国）を用いてKd値を求めた。
上記ペプチドのKdは2nMであり、カテプシンEに対する高い親和性を持つことが示された。
In this experiment, a neutral buffer (pH 7.4) containing 50 mM Tris-HCl and 100 mM NaCl was used as a running buffer, and 50 mM NaOH was used for peptide removal.
The resulting sensorgram curve was fitted to a 1: 1 Langmuir binding model and the Kd value was determined using BIA evaluation software (GE Healthcare, UK).
The peptide had a Kd of 2 nM, indicating high affinity for cathepsin E.
セレクションバッファー（50mMのトリス塩酸、100mMのNaCl、pH 7.4）中で、25℃にて10分間、20nMのカテプシンEを20nMの上記ペプチドとインキュベートした。
引き続き、上記のようにして調製した５μMの蛍光性基質を加え、これらの混合物を、酵素反応のために37℃にて１時間インキュベートした。励起波長を340nm、検出波長を440nmとして、Infinite 200 (TECAN、日本)を用いて蛍光性産物をモニターした。
カテプシンEの活性化パーセントは、下記の式によって求めた。結果を図９に示す。
20 nM cathepsin E was incubated with 20 nM of the peptide in selection buffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.4) at 25 ° C. for 10 minutes.
Subsequently, 5 μM fluorescent substrate prepared as described above was added and these mixtures were incubated for 1 hour at 37 ° C. for enzymatic reaction. The fluorescent product was monitored using an Infinite 200 (TECAN, Japan) with an excitation wavelength of 340 nm and a detection wavelength of 440 nm.
The percent activation of cathepsin E was determined by the following formula. The results are shown in FIG.
A = 100 ｘ(Sf - Bf)/(Cf - Bf) [活性化%] (1) A = 100 x (Sf-Bf) / (Cf-Bf) [Activation%] (1)
図９に示すように、カテプシンEを含まない場合を100としたときに、上記ペプチドは高いカテプシンE活性の増強作用（178％）を示した。
以上より、このペプチドがカテプシンEを活性化することが示された。
As shown in FIG. 9, when the case where cathepsin E was not included was taken as 100, the peptide showed a high cathepsin E activity enhancing effect (178%).
From the above, it was shown that this peptide activates cathepsin E.
（実施例３）NM23-H1の使用
（１）スタンドペプチドとNm23-H1結合ペプチドとの結合
実施例１と同様に、Peptide Coating Kit (TaKaRa)を用いて、NM23-H1を結合させるスタンドペプチド（以下、「NM23−スタンドペプチド」という）を２種類作製し（スタンド-NM23ASAC#1及び#2）を、スタンドペプチドの濃度を、0.1 pmol/50μL、1 pmol/50μL、10 pmol/50μLの３通りとして調製し、それぞれ0、0.1、1、及び10 pmol/ウェルの濃度で反応プレートに固定した。ここで使用したNM23-スタンドペプチドの配列は、以下の通りであった。
(Example 3) Use of NM23-H1 (1) Binding of stand peptide and Nm23-H1 binding peptide In the same manner as in Example 1, using Peptide Coating Kit (TaKaRa), a stand peptide for binding NM23-H1 ( 2 types of “NM23-stand peptide” (stand-
配列番号５
RRLTPSSPGGGSEGEWQQQQHQWAHQE (M.W. = 3102)
次いで、NM23H-1を100 ng/wellとなるように各ウェルに加え、室温にて1.5時間、振蘯した。次いで、200μLのPBS（pH8.0）を各ウェルに添加して洗浄した。この操作を３回繰り返した。
SEQ ID NO: 5
RRLTPSSPGGGSEGEWQQQQHQWAHQE (MW = 3102)
Next, NM23H-1 was added to each well at 100 ng / well and shaken at room temperature for 1.5 hours. Next, 200 μL of PBS (pH 8.0) was added to each well and washed. This operation was repeated three times.
（２）ELISA
引き続き、抗NM23(C-20、HRP標識付き)、及び抗-GST-HRPを、それぞれ1: 500の希釈率で各ウェルに加え、室温にて、1.5時間振蘯した。次いで、200μLのPBSを各ウェルに添加して洗浄した。この操作を３回繰り返した。
この後、100μLのSureBlue/TMBキット（フナコシ）を各ウェルに添加し、室温で20分間反応させた。TMB基質用反応停止液（フナコシ）を100μLずつ各ウェルに加えて撹拌し、反応を停止させた。その後、450 nmで吸光度を測定した。
測定結果を下記表１及び図11に示す。
(2) ELISA
Subsequently, anti-NM23 (C-20, with HRP labeling) and anti-GST-HRP were added to each well at a dilution ratio of 1: 500, respectively, and shaken at room temperature for 1.5 hours. Then 200 μL of PBS was added to each well and washed. This operation was repeated three times.
Thereafter, 100 μL of SureBlue / TMB kit (Funakoshi) was added to each well and allowed to react at room temperature for 20 minutes. 100 μL of TMB substrate reaction stop solution (Funakoshi) was added to each well and stirred to stop the reaction. Thereafter, the absorbance was measured at 450 nm.
The measurement results are shown in Table 1 below and FIG.
上記表１及び図11より、スタンドなしの場合には、ウェルに固定化したNM23のELISAの測定結果は、いずれの濃度においてもほぼ同じであった。また、これは、抗体を変えても同様の結果であった。
これに対し、スタンドペプチドを使用した場合には、使用した抗体によって若干の相違は見られたが、固定した濃度に依存的に吸光度が上昇していた。
以上より、本発明のスタンドペプチドを使用することによって、効率よく標的分子であるNM23を捕捉することができ、また、検出感度も向上していることが示された。
From Table 1 and FIG. 11, in the case of no stand, the measurement results of ELISA of NM23 immobilized on the well were almost the same at any concentration. Moreover, this was the same result even if the antibody was changed.
In contrast, when the stand peptide was used, the absorbance increased depending on the fixed concentration, although a slight difference was observed depending on the antibody used.
From the above, it was shown that by using the stand peptide of the present invention, NM23, which is a target molecule, can be efficiently captured, and the detection sensitivity is improved.
本発明は、医薬、診断薬、試薬等の分野において有用である。 The present invention is useful in the fields of pharmaceuticals, diagnostic agents, reagents and the like.
配列番号１：αスタンドペプチド作成用のアミノ酸配列
配列番号２：N末端フリータイプ用のαスタンド
配列番号３：C末端フリータイプ用のαスタンド
配列番号４：カテプシンE活性化用ペプチド
配列番号５：NM23スタンドペプチド
SEQ ID NO: 1: amino acid sequence for preparing α stand peptide SEQ ID NO: 2: α stand for N-terminal free type SEQ ID NO: 3: α stand for C-terminal free type SEQ ID NO: 4: peptide for cathepsin E activation SEQ ID NO: 5 NM23 stand peptide
Claims (11)
配列表の配列番号１
SEGEWQQQQHQWAHQE In the Pep-ELISA method, a stand peptide that is a peptide for immobilizing a peptide aptamer to be measured on a substrate and has the sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
Sequence number 1 of a sequence table
SEGEWQQQQHQWAHQE
前記固定されたスタンドペプチドにペプチドアプタマーを結合させるアプタマー結合工程と；
前記結合されたペプチドアプタマーと標的分子とを結合させる標的分子結合工程と；
前記標的分子と反応する標識物質を添加する標識物質添加工程と；
前記標的分子と前記標識物質の結合とによって生じる反応を、蛍光測定又は吸光度測定で検出する反応検出工程と；
を備える、Pep-ELISA法。 A peptide immobilization step of immobilizing the stand peptide according to any one of claims 1 to 3 on a substrate at a C-terminus or an N-terminus;
An aptamer binding step of binding a peptide aptamer to the immobilized stand peptide;
A target molecule binding step of binding the bound peptide aptamer and a target molecule;
A labeling substance addition step of adding a labeling substance that reacts with the target molecule;
A reaction detection step of detecting a reaction caused by the binding of the target molecule and the labeling substance by fluorescence measurement or absorbance measurement;
Pep-ELISA method.
前記固定されたスタンドペプチドにペプチドアプタマーを結合させるアプタマー結合工程と；
前記結合されたペプチドアプタマーに標的分子を結合させる標的分子結合工程と；
前記標的分子に対する標識抗体を前記標的分子にさらに結合させるサンドイッチ工程と；
標的分子に対する抗体の結合によって生じる反応を、蛍光測定又は吸光度測定で検出する反応検出工程と；
を備える、Pep-ELISA法。 A peptide immobilization step of immobilizing the stand peptide according to any one of claims 1 to 3 on a substrate at a C-terminus or an N-terminus;
An aptamer binding step of binding a peptide aptamer to the immobilized stand peptide;
A target molecule binding step of binding a target molecule to the bound peptide aptamer;
A sandwich step of further binding a labeled antibody against the target molecule to the target molecule;
A reaction detection step of detecting a reaction caused by the binding of the antibody to the target molecule by fluorescence measurement or absorbance measurement;
Pep-ELISA method.
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