JP2015072462A - Super-resolution observation device and super-resolution observation method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、超解像観察装置及び超解像観察方法に関する。 The present invention relates to a super-resolution observation apparatus and a super-resolution observation method.
光学系の解像限界を超えた解像度で標本を観察する超解像光学顕微鏡の一種に、誘導放出過程を利用したＳＴＥＤ（ＳＴＥＤ：Stimulated Emission Depletion）顕微鏡がある。 One type of super-resolution optical microscope that observes a specimen at a resolution exceeding the resolution limit of the optical system is a STED (STIM: Stimulated Emission Depletion) microscope using a stimulated emission process.
ＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光の照射領域と誘導光（ＳＴＥＤ光）の照射領域とを標本上で部分的に重複させ、励起光の照射領域のうちＳＴＥＤ光の照射されていない領域で発生した蛍光のみを検出対象とすることで超解像を実現している。 The STED microscope partially overlaps the excitation light irradiation region and the guide light (STED light) irradiation region on the specimen, and only the fluorescence generated in the excitation light irradiation region that is not irradiated with the STED light. Super-resolution is realized by using as a detection target.
特に、特許文献１に記載のＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光の単体に起因して生じた蛍光をＳＴＥＤ光の単体に起因して生じた蛍光から分離して検出するために、励起光の強度を時間方向にかけて変調すると共に、標本で発生した蛍光のうち励起光と同じ周波数で変化する成分のみをロックイン検出している。これによって解像度を高く維持することができる。
In particular, the STED microscope described in
因みに、特許文献１に記載のＳＴＥＤ顕微鏡のように、励起光の単体に起因して生じた蛍光をＳＴＥＤ光の単体に起因して生じた蛍光から分離できる場合、ＳＴＥＤ光の光周波数に関する自由度が高まるという利点もある。例えば、ＳＴＥＤ光の光周波数を高めに設定することにより、誘導放出効率を維持しながらＳＴＥＤ光の照射強度を抑え、標本に含まれる細胞のダメージを軽減することもできる。
Incidentally, as in the STED microscope described in
本発明の目的は、ＳＴＥＤ顕微鏡の更なる性能向上にある。 An object of the present invention is to further improve the performance of the STED microscope.
本発明を例示する超解像観察装置は、物体に含まれる物質を多光子励起するための励起光を前記物体に向けて集光すると共に、励起中の前記物質を誘導放出するための誘導光を、前記励起光の集光領域と部分的に重複する領域に向けて集光する照明光学系と、前記物体へ向かう前記励起光の特性を時間方向にかけて変調する変調部と、前記励起光及び前記誘導光の集光領域に存在する前記物質が自然放出した蛍光のうち、前記変調の周波数のＮ倍周波数で時間変化する成分（但し、Ｎは１以上の整数）を検出する検出部とを備える。 The super-resolution observation apparatus exemplifying the present invention condenses excitation light for multiphoton excitation of a substance contained in an object toward the object, and stimulated light for stimulated emission of the substance being excited. Illuminating optical system that focuses light toward a region that partially overlaps the light collecting region of the excitation light, a modulation unit that modulates the characteristics of the excitation light toward the object in the time direction, and the excitation light and A detection unit for detecting a component (N is an integer of 1 or more) that changes with time at a frequency N times the modulation frequency among the fluorescence spontaneously emitted from the substance existing in the light condensing region. Prepare.
物体に含まれる物質を多光子励起するための励起光を前記物体に向けて集光すると共に、励起中の前記物質を誘導放出するための誘導光を、前記励起光の集光領域と部分的に重複する領域に向けて集光する照明手順と、
本発明を例示する超解像観察方法は、前記物体へ向かう前記励起光の特性を時間方向にかけて変調する変調手順と、前記励起光及び前記誘導光の集光領域に存在する前記物質が自然放出した蛍光のうち、前記変調の周波数のＮ倍周波数で時間変化する成分（但し、Ｎは１以上の整数）を検出する検出手順とを備える。
Condensing excitation light for multiphoton excitation of a substance contained in an object toward the object, and guiding light for stimulated emission of the substance being excited partially with the excitation light condensing region An illumination procedure for condensing light toward an overlapping area;
The super-resolution observation method exemplifying the present invention includes a modulation procedure for modulating the characteristics of the excitation light directed toward the object in a time direction, and the substance existing in a condensing region of the excitation light and the guide light is spontaneously emitted. And a detection procedure for detecting a component (N is an integer of 1 or more) that changes with time at a frequency N times the frequency of the modulation.
本発明を例示する超解像観察装置は、物体に含まれる物質を多光子励起するための励起光を前記物体に向けて集光すると共に、励起中の前記物質を誘導放出するための誘導光を、前記励起光の集光領域と部分的に重複する領域に向けて集光する照明光学系と、前記励起光及び前記誘導光の集光領域に存在する前記物質が自然放出した蛍光を検出する検出部とを備え、前記物体に照射される前記励起光は、パルス光であり、前記物体に照射される前記誘導光は、パルス光である。 The super-resolution observation apparatus exemplifying the present invention condenses excitation light for multiphoton excitation of a substance contained in an object toward the object, and stimulated light for stimulated emission of the substance being excited. Illuminating optical system for condensing light toward a region partially overlapping with the excitation light condensing region, and detecting fluorescence emitted spontaneously by the substance present in the condensing region of the excitation light and the guiding light The excitation light applied to the object is pulsed light, and the guide light applied to the object is pulsed light.
本発明によれば、ＳＴＥＤ顕微鏡の更なる性能向上が可能である。 According to the present invention, it is possible to further improve the performance of the STED microscope.
［第１実施形態］
以下、本発明の第１実施形態としてＳＴＥＤ顕微鏡を説明する。
[First Embodiment]
Hereinafter, a STED microscope will be described as a first embodiment of the present invention.
図１は、本実施形態におけるＳＴＥＤ顕微鏡の構成図である。図１に示すとおりＳＴＥＤ顕微鏡には、励起光源１１１と、ＳＴＥＤ光源１１２と、レンズ１２１、１２２と、ミラーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５と、強度変調器１３１と、変調器駆動回路１３２と、位相板１４と、ダイクロイックミラー１５１、１５２と、光スキャナ１７と、１／４波長板１８と、対物レンズ１９と、標本２０と、フィルタ２１と、レンズ２２と、光検出器２３と、光路長調整機構２９と、制御装置３０と、パーソナルコンピュータなどの演算装置４０とが配置される。
FIG. 1 is a configuration diagram of a STED microscope in the present embodiment. As shown in FIG. 1, the STED microscope includes an
このうち制御装置３０には、信号発生器（ＦＧ：Function Generator）２４、周波数混合器（ＭＩＸＥＲ）２５、バンドパスフィルタ（ＢＰＦ：Band-Pass Filter）２６、ロックインアンプ（ＬＩＡ：Lock-In Amplifier）２７などが配置され、光スキャナ１７には、可動式の主走査ミラー１７１、可動式の副走査ミラー１７２などが配置され、光路長調整機構２９には、可動のミラーＭ２、Ｍ３などが配置される。以上のＳＴＥＤ顕微鏡における観察対象は、標本２０である。
Among them, the
標本２０は、例えば培養液と共に培養容器に収容された生体細胞であり、この生体細胞の特定の部位は蛍光物質（蛍光色素）で予め染色されている。この蛍光物質の電子を１光子吸収過程により励起準位へ励起するための励起光の光周波数をωｅｘ’とおくと、この蛍光物質の電子を２光子吸収過程（３次非線形光学効果の一種）により励起準位へ励起するための励起光の光周波数ωｅｘは、ωｅｘ＝ωｅｘ’／２で表される。光周波数ωｅｘを波長に換算すると、８００ｎｍ〜１２００ｎｍの範囲内の何れかの値、例えば１０６０ｎｍである。また、励起中の電子を誘導放出過程により基底準位へ移行させるための誘導光（後述するＳＴＥＤ光）の光周波数をωＳＴとおくと、光周波数ωＳＴは、蛍光物質から発せられる蛍光の光周波数帯域内の何れかの値であればよい。光周波数ωＳＴを波長に換算すると、例えば６６０ｎｍである。なお、光周波数ωｅｘ’、ωＳＴ、ωｅｘにはωｅｘ’＞ωＳＴ＞ωｅｘの関係が成り立つ。
The
以下、ＳＴＥＤ顕微鏡の基本動作を説明する。 Hereinafter, the basic operation of the STED microscope will be described.
先ず、励起光源１１１から射出した光（励起光）は、レンズ１２１により平行光束となり、強度変調器１３１を介してダイクロイックミラー１５１へ向かい、ダイクロイックミラー１５１を透過する。
First, light (excitation light) emitted from the
一方、ＳＴＥＤ光源１１２から射出した光（ＳＴＥＤ光）は、レンズ１２２により平行光束となり、ミラーＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４を順に反射してから位相板１４を通過し、ミラーＭ５を反射する。ミラーＭ５を反射したＳＴＥＤ光は、ダイクロイックミラー１５１を反射し、ダイクロイックミラー１５１を透過した励起光と合波（光路が統合）される。
On the other hand, the light (STED light) emitted from the STED
合波された励起光及びＳＴＥＤ光は、ダイクロイックミラー１５２を透過した後、主走査ミラー１７１、副走査ミラー１７２を順に反射すると、１／４波長板１８を介して対物レンズ１９の瞳側へ入射する。瞳側から対物レンズ１９へ入射した励起光及びＳＴＥＤ光は、対物レンズ１９の先端から射出すると、標本２０において集光する。
The combined excitation light and STED light are transmitted through the
標本２０に向かう励起光及びＳＴＥＤ光の偏光状態は、１／４波長板１８の通過により、直線偏光から円偏光へと変換されているので、標本２０における励起光及びＳＴＥＤ光のＰＳＦ（点像分布関数）からは偏光依存性が排除されている。よって、標本２０に励起光及びＳＴＥＤ光が形成する光スポットの状態は、光軸の周りに等方的（光軸に関して回転対称）である。なお、光スポットの詳細は、後述する。
Since the polarization state of the excitation light and STED light toward the
標本２０の光スポットでは、蛍光が発生する。この蛍光は、先端側から対物レンズ１９へ入射すると、対物レンズ１９の瞳側から平行光束となって射出し、１／４波長板１８、副走査ミラー１７２、主走査ミラー１７１を順に介してダイクロイックミラー１５２へ入射する。
In the light spot of the
ダイクロイックミラー１５２へ入射した蛍光は、ダイクロイックミラー１５２を反射すると、フィルタ２１、レンズ２２を順に介して光検出器２３へ入射し、光検出器２３において電気信号に変換される。なお、フィルタ２１には、励起光と同じ波長の光をカットし、かつ、ＳＴＥＤ光と同じ波長の光をカットし、かつ、蛍光と同じ波長帯域の光の大部分を透過するような特性が付与されている。
When the fluorescence incident on the
光検出器２３は、フォトダイオードや光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier Tube）などで構成され、入射した蛍光の強度に応じて電気信号を生成し、その電気信号を制御装置３０のロックインアンプ２７へ与える。
The
ロックインアンプ２７は、与えられた電気信号から必要な信号成分をロックイン検出（同期検波）すると、その信号成分を演算装置４０へ与える。なお、ロックイン検出の詳細は、後述する。
When lock-in detection (synchronous detection) is performed on a necessary signal component from the applied electric signal, the lock-in
光スキャナ１７は、主走査ミラー１７１及び副走査ミラー１７２により光の進行方向を制御するガルバノメータスキャナなどの光スキャナである。制御装置３０から与えられる駆動信号に応じて光スキャナ１７が主走査ミラー１７１及び副走査ミラー１７２を適切なパターンで姿勢変化させると、対物レンズ１９の光軸と垂直な面方向にかけて光スポットが標本２０を二次元走査する。よって、二次元走査中にロックインアンプ２７が順次に検出した信号成分は、対物レンズ１９の焦点面における蛍光強度分布を表す。なお、光スキャナ１７１の配置先は、対物レンズ１９の瞳の近傍又は対物レンズ１９の瞳と共役な面の近傍である。
The
演算装置４０は、二次元走査中にロックインアンプ２７が検出した信号成分を適切に配列することで標本２０の蛍光画像を作成し、不図示のメモリへ格納すると共に、不図示の表示装置へ表示させる。
The
以下、ＳＴＥＤ顕微鏡の超解像原理を説明する。 Hereinafter, the super-resolution principle of the STED microscope will be described.
先ず、ＳＴＥＤ光の単独光路に配置された位相板１４には、位相遅延量分布が付与されている。周方向に亘る位相板１４の位相遅延量分布は、周位置が１８０°ずつズレた２つの位置の間の位相差が「π」となるような分布である。この場合、励起光の単体が標本２０に形成する光スポット（励起光スポット）の形状は円形であるのに対して、ＳＴＥＤ光の単体が標本２０に形成する光スポット（ＳＴＥＤ光スポット）の形状は、輪帯状（ドーナツ状）となる。励起光スポットの中心と、ＳＴＥＤ光スポットの中心とは、何れも対物レンズ１９の光軸上にある。
First, a phase delay amount distribution is given to the
ここで、円形の励起光スポット（図２の符号Ａｅｘ）の輪郭と、ドーナツ状のＳＴＥＤ光スポット（図２の符号ＡＳＴ）の内輪郭は、本来的には何れも対物レンズ１９の解像限界に相当するサイズとなるはずである。但し、ＳＴＥＤ顕微鏡では、ＳＴＥＤ光の強度を十分に高く設定することにより、ＳＴＥＤ光スポット（図２の符号ＡＳＴ）における誘導放出を飽和させ、ＳＴＥＤ光スポット（図２の符号ＡＳＴ）の内輪郭を励起光スポット（図２の符号Ａｅｘ）の輪郭よりも実質的に狭める。そのために、例えばＳＴＥＤ光の単独光路に挿入された不図示のＮＤフィルタの透過率が高めに設定される。
Here, both the contour of the circular excitation light spot (reference symbol A ex in FIG. 2) and the inner contour of the donut-shaped STED light spot (reference symbol A ST in FIG. 2) are essentially solutions of the
この場合、標本２０における励起光のＰＳＦ及びＳＴＥＤ光のＰＳＦは、例えば図２に示すとおりになる。図２では、光軸と垂直なｘ方向に亘るＰＳＦ（一次元ＰＳＦ）のみを描いたが、光軸と垂直な別の方向に亘るＰＳＦも同様である。図２に示すとおりＳＴＥＤ光スポットＡＳＴは、励起光スポットＡｅｘに対して部分的に重複し、励起光スポットＡｅｘのうちＳＴＥＤ光スポットＡＳＴのピーク（図２における外側の２つのピーク）は、励起光スポットＡｅｘの周縁部に位置する。
In this case, the PSF of the excitation light and the PSF of the STED light in the
したがって、ＳＴＥＤ顕微鏡では、先ず、標本２０に励起光が照射されると、励起光スポットＡｅｘに位置していた蛍光物質の電子が励起され（但し、励起確率は励起光スポットＡｅｘの中央部ほど高い。）、続いて、蛍光寿命の経過前に標本２０にＳＴＥＤ光が照射されると、励起光スポットＡｅｘの周縁部に近い励起中の電子は、光周波数ωＳＴの誘導放出光を発生させるのに対して、励起光スポットＡｅｘの中央部に近い励起中の電子は、誘導放出光を発生させることなく、蛍光寿命の経過後に自然放出光（蛍光）を発生させる。
Therefore, in the STED microscope, first, when the
したがって、ＳＴＥＤ顕微鏡では、励起光スポットＡｅｘの周縁部では誘導放出の分だけ蛍光の発生が抑制されるのに対して、励起光スポットＡｅｘの中央部では蛍光の発生が抑制されない。ＳＴＥＤ顕微鏡では、この蛍光を検出対象とすることで超解像効果を得る。 Therefore, in the STED microscope, the peripheral edge portion of the excitation light spot A ex whereas the occurrence of an amount corresponding fluorescence induced emission is suppressed, generation of fluorescence is not suppressed at the central portion of the excitation light spot A ex. In the STED microscope, a super-resolution effect is obtained by using this fluorescence as a detection target.
以下、本実施形態における励起光及びＳＴＥＤ光に必要な条件を説明する。 Hereinafter, conditions necessary for the excitation light and the STED light in this embodiment will be described.
先ず、本実施形態における励起光の光周波数は、蛍光物質の電子を２光子励起するための光周波数ωｅｘに設定される。また、励起光は、励起光スポットＡｅｘの中央部にて２光子励起確率が十分に高まるよう、パルス幅の狭いパルス光に設定される。そのために、励起光源１１１としては例えばフェムト秒パルスレーザ光源などのパルスレーザ光源が使用される。励起光源１１１のパルス幅ΔＴｅｘは、例えば数百ｆｓ（フェムト秒）に設定され、励起光源１１１の繰り返し周波数ｆｒｅｐは、例えば８０ＭＨｚに設定される。よって、横軸を時間、縦軸をパルス強度として、励起光源１１１から射出する励起光の波形を示したならば、例えば図３（ａ）に示すとおりとなる。
First, the optical frequency of the excitation light in this embodiment is set to the optical frequency omega ex for two-photon excitation of the electrons of the fluorescent material. Further, the excitation light is set to pulse light having a narrow pulse width so that the two-photon excitation probability is sufficiently increased in the central portion of the excitation light spot Aex . Therefore, as the
一方、ＳＴＥＤ光の光周波数は、励起中の電子を誘導放出するための光周波数ωＳＴに設定される。また、ＳＴＥＤ光は、誘導放出確率が適度に高まるよう、パルス幅の適度に狭いパルス光に設定される。そのために、ＳＴＥＤ光源１１２としてはピコ秒パルスレーザ光源などのパルスレーザ光源が使用される。ＳＴＥＤ光源１１２のパルス幅ΔＴＳＴは、例えば数ｐｓ（ピコ秒）〜数百ｐｓ（ピコ秒）に設定され、ＳＴＥＤ光源１１２の繰り返し周波数ｆｒｅｐは、励起光源１１１の繰り返し周波数と共通に設定される。よって、横軸を時間、縦軸をパルス強度として、ＳＴＥＤ光源１１２から射出するＳＴＥＤ光の波形を示したならば、例えば図３（ｂ）に示すとおりとなる。
On the other hand, the optical frequency of the STED light is set to an optical frequency ω ST for stimulated emission of electrons being excited. Further, the STED light is set to pulse light having a moderately narrow pulse width so that the stimulated emission probability is moderately increased. Therefore, a pulse laser light source such as a picosecond pulse laser light source is used as the STED
ここで、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、標本２０に励起光のパルスが到達するタイミングよりも、標本２０にＳＴＥＤ光のパルスが到達するタイミングの方が、若干遅延していることが望ましい。このため、標本２０に向かう励起光の光路長と、標本２０に向かうＳＴＥＤ光の光路長との関係は、予め調整されていると仮定する。図１の光路長調整機構２９は、この調整を行うために設けられた機構である。光路長調整機構２９は、ＳＴＥＤ光の単独光路に配置されたミラーＭ２、Ｍ３を適切な方向へ移動させるステージなどで構成される。標本２０の観察前、ＳＴＥＤ顕微鏡のオペレータは、光路長調整機構２９によりＳＴＥＤ光の光路長を調整し、標本２０に励起光のパルスが到達するタイミングから標本２０にＳＴＥＤ光のパルスが到達するタイミングまでの時間（ディレイ時間Δ）を調整する。
Here, in the STED microscope of this embodiment, it is desirable that the timing at which the pulse of the STED light reaches the
図３（ｃ）は、ディレイ時間Δを説明する図である。図３（ｃ）においてパルス幅の狭い方が励起光パルスを示しており、図３（ｃ）ではパルス幅の広い方がＳＴＥＤ光パルスを示している。図３（ｃ）に示すとおり標本２０に励起光パルスが到達するタイミングからＳＴＥＤ光パルスが到達するイミングまでのディレイ時間Δは、蛍光物質の蛍光寿命より短く、かつ、励起光パルスとＳＴＥＤ光パルスとが時間的に重複しない範囲内で最も短い時間に設定される。なお、ディレイ時間Δの調整方法の詳細は、後述する。
FIG. 3C illustrates the delay time Δ. In FIG. 3C, the narrower pulse width indicates the excitation light pulse, and in FIG. 3C, the wider pulse width indicates the STED light pulse. As shown in FIG. 3C, the delay time Δ from the timing at which the excitation light pulse arrives at the
以下、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡におけるロックイン検出の原理を説明する。 Hereinafter, the principle of lock-in detection in the STED microscope of this embodiment will be described.
図１に示した光検出器２３には、励起光の単体に起因して生じた「必要な蛍光」だけでなく、ＳＴＥＤ光の単体に起因して生じた「余分な蛍光」も混入している。この余分な蛍光を必要な蛍光から分離するために、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、励起光とＳＴＥＤ光とのうち励起光のみを、変調周波数ｆｍで時間方向にかけて強度変調する。よって、必要な蛍光は時間変化するのに対して、余分な蛍光は時間変化しない。このうち必要な蛍光の時間変化を、数式で説明する。
The
先ず、励起光の変調周波数をｆｍとおき、励起光の強度平均値をＩ０とおき、時間をｔとおくと、励起光強度の時間変化波形Ｉｅｘは、以下の式（１）で表される。 First, the modulation frequency of the excitation light f m Distant, an intensity average value of the excitation light I 0 Distant, placing the time t, the time change waveform I ex of the excitation light intensity, by the following equation (1) expressed.
また、比例係数をαとおくと、励起光の単体に起因して生じた必要な蛍光、すなわち、励起光による２光子吸収過程で発生する蛍光の強度ＩＴＰＦは、以下の式（２）で表される。 If the proportionality coefficient is α, the necessary fluorescence generated due to the single excitation light, that is, the intensity I TPF of the fluorescence generated in the two-photon absorption process by the excitation light is expressed by the following equation (2). expressed.
この式（２）の右辺を見ると、励起光の単体に起因して生じた必要な蛍光には、時間変化しないＤＣ成分（第１項）と、励起光の変調周波数ｆｍと同じ周波数で時間変化する成分（第２項）と、励起光の変調周波数ｆｍの２倍周波数で時間変化する成分（第３項）とが含まれていることがわかる。 Looking at the right side of the equation (2), the fluorescence necessary that occur due to single excitation light, time invariant DC component (first term), at the same frequency as the modulation frequency f m of the excitation light a time-varying component (second term), it can be seen that the time-varying component at twice the frequency of the modulation frequency f m of the excitation light and (third term) are included.
一方、数式では示さなかったが、ＳＴＥＤ光は変調されないので、ＳＴＥＤ光の単体に起因して生じた余分な蛍光には、ＤＣ成分しか含まれない。 On the other hand, although not shown in the equation, since the STED light is not modulated, the extra fluorescence generated due to the single STED light contains only the DC component.
したがって、２光子吸収過程を利用した本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、光検出器２３の生成する電気信号のうち、時間変化しないＤＣ成分には、必要な蛍光と余分な蛍光との双方が反映されるが、周波数ｆｍ又は２ｆｍで変化する成分には、必要な蛍光と余分な蛍光とのうち前者のみが反映される。
Therefore, in the STED microscope of this embodiment using the two-photon absorption process, both necessary fluorescence and extra fluorescence are reflected in the DC component that does not change with time in the electrical signal generated by the
そこで、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、光検出器２３の生成する電気信号から、周波数ｆｍで変化する成分と、周波数２ｆｍで変化する成分とを、ロックイン検出する。これによって、余分な蛍光を検出対象から外すことができる。
Therefore, in the STED microscope according to the present embodiment, from the electrical signal generated by the
以下、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡におけるロックイン検出の動作を説明する。 Hereinafter, the operation of lock-in detection in the STED microscope of the present embodiment will be described.
図１に示した信号発生器２４、変調器駆動回路１３２、強度変調器１３１、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、ロックインアンプ２７は、ロックイン検出のために搭載された要素である。
The
信号発生器２４は、励起光の変調周波数ｆｍと同じ周波数で時間変化するリファレンス信号を、変調器駆動回路１３２、周波数混合器２５、ロックインアンプ２７の各々へ与える。但し、信号発生器２４は、周波数混合器２５に対しては、周波数ｆｍで時間変化する２つのリファレンス信号を並行して与える。
The
変調周波数ｆｍは、繰り返し周波数ｆｒｅｐより低く、ｆｍ≦ｆｒｅｐ／２である。また、変調周波数ｆｍは、ノイズの１／ｆ特性と系の検出感度とを考慮して適切な値に設定されることが望ましく、例えば数ＭＨｚ程度に設定される。 The modulation frequency f m is lower than the repetition frequency f rep , and f m ≦ f rep / 2. The modulation frequency f m, it is set in consideration of the detection sensitivity of 1 / f characteristic and the system noise to a suitable value is set desirably, for example, about several MHz.
変調器駆動回路１３２は、リファレンス信号ｆｍと同じ周波数で時間変化する駆動信号を、励起光の単独光路へ配置された強度変調器１３１へ与える。
強度変調器１３１は、音響光学変調器（ＡＯＭ：Acousto-Optic Modulator）などの光強度変調器であり、与えられた駆動信号に応じて励起光の強度を時間方向にかけて変調周波数ｆｍで変調する。よって、強度変調器１３１から射出する励起光の強度は、例えば図４（ａ）に示すとおりに時間変化する。ここでは、図４（ａ）に点線で示すとおり励起光強度の変調波形を正弦波形と仮定する。 Intensity modulator 131, an acousto-optic modulator (AOM: Acousto-Optic Modulator) is a light intensity modulator, such as, for modulating the intensity of the excitation light in accordance with a drive signal applied at the modulation frequency f m and toward the time direction . Therefore, the intensity of the excitation light emitted from the intensity modulator 131 changes with time as shown in FIG. 4A, for example. Here, it is assumed that the modulation waveform of the excitation light intensity is a sine waveform as indicated by a dotted line in FIG.
図１に示す周波数混合器２５は、周波数ｆｍで時間変化する２つのリファレンス信号をミキシングすることにより、周波数２ｆｍで時間変化する電気信号と、周波数ゼロで時間変化する電気信号とを生成し、それら２つの電気信号をバンドパスフィルタ２６へ与える。
バンドパスフィルタ２６は、電気的バンドパスフィルタであって、周波数２ｆｍで時間変化する電気信号と、周波数ゼロで時間変化する電気信号とのうち、周波数２ｆｍで時間変化する電気信号のみを選択してロックインアンプ２７へ与える。
したがって、ロックインアンプ２７には、周波数２ｆｍで時間変化するリファレンス信号と、周波数ｆｍで時間変化するリファレンス信号とが並行して与えられる。以下、周波数ｆｍで時間変化するリファレンス信号を「第１リファレンス信号」と称し、周波数２ｆｍで時間変化するリファレンス信号を「第２リファレンス信号」と称す。
Therefore, the lock-in
ロックインアンプ２７は、光検出器２３の出力する電気信号から、第１リファレンス信号と同じ周波数（＝ｆｍ）で時間変化する成分（以下、「第１信号成分」と称す。）をロックイン検出して演算装置４０へ与えると共に、光検出器２３の出力する電気信号から、第２リファレンス信号と同じ周波数（＝２ｆｍ）で時間変化する成分（以下、「第２信号成分」と称す。）をロックイン検出して演算装置４０へ与える。
The lock-in
このうち、第１信号成分には、光検出器２３へ入射した蛍光のうち、励起光の変調周波数（＝ｆｍ）と同じ周波数で時間変化する成分（式（２）の第２項）が反映され、時間変化しない成分は反映されない。つまり、第１信号成分には、必要な蛍光が反映され、余分な蛍光は反映されない。
Among these, in the first signal component, a component (second term of the expression (2)) that changes with time at the same frequency as the modulation frequency (= f m ) of the excitation light in the fluorescence incident on the
また、第２信号成分には、光検出器２３へ入射した蛍光のうち、励起光の変調周波数（＝ｆｍ）の２倍周波数で時間変化する成分（式（２）の第３項）が反映され、時間変化しない成分は反映されない。つまり、第２信号成分には、必要な蛍光が反映され、余分な蛍光は反映されない。
The second signal component, of the fluorescence incident on the
そして、図１の演算装置４０は、ロックインアンプ２７から並行して与えられる第１信号成分と第２信号成分との和又は平均を信号成分として求め、その信号成分により標本２０の蛍光画像を作成する。このように、演算装置４０が第１信号成分と第２信号成分との和又は平均をとれば、蛍光画像のＳＮ比が高まる。
1 obtains the sum or average of the first signal component and the second signal component given in parallel from the lock-in
以下、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡の効果を説明する。 Hereinafter, the effect of the STED microscope of this embodiment will be described.
本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、蛍光物質の電子の励起に２光子吸収過程を利用するので、検出対象である蛍光の発光元を、光スポット中央の極めて狭い領域のみに制限することができる。 In the STED microscope of the present embodiment, since the two-photon absorption process is used for excitation of electrons of the fluorescent material, the emission source of the fluorescence to be detected can be limited to only a very narrow region at the center of the light spot.
したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、１光子吸収過程を利用する場合よりも、高い超解像効果を得ることができる。 Therefore, the STED microscope of the present embodiment can obtain a higher super-resolution effect than when using a one-photon absorption process.
また、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、２光子吸収過程を利用するので、検出対象である蛍光は、対物レンズ１９の焦点面近傍のみにおいて発生する。よって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、蛍光の発生元を光軸方向にかけても狭めることができる。
In addition, since the STED microscope of the present embodiment uses a two-photon absorption process, fluorescence that is a detection target is generated only in the vicinity of the focal plane of the
したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、標本２０の深部の蛍光画像を高コントラストで取得することができる。また、標本２０のうち対物レンズ１９の焦点面から外れた面の退色を避けることもできる。
Therefore, in the STED microscope of the present embodiment, a fluorescent image of the deep part of the
また、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光の変調周波数と同じ周波数で時間変化する第１信号成分と、励起光の変調周波数の２倍周波数で変化する第２信号成分との双方をロックイン検出するので、余分な蛍光の影響を受けずに、必要な蛍光を漏れなく検知することができる。 In addition, the STED microscope of the present embodiment locks in both the first signal component that changes with time at the same frequency as the modulation frequency of the excitation light and the second signal component that changes at twice the modulation frequency of the excitation light. Since detection is performed, the necessary fluorescence can be detected without omission without being affected by excessive fluorescence.
したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、蛍光画像を高画質に取得することができる。
［第１実施形態の補足］
なお、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、励起光強度の変調波形を図４に示すとおり正弦波形としたが、図５に示すとおり矩形波としてもよい。
Therefore, the STED microscope of this embodiment can acquire a fluorescent image with high image quality.
[Supplement to the first embodiment]
In the STED microscope of the first embodiment, the modulation waveform of the excitation light intensity is a sine waveform as shown in FIG. 4, but may be a rectangular wave as shown in FIG.
また、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、ＳＴＥＤ光をパルス光としたが、ＳＴＥＤ光を連続光としてもよい。その場合、例えば、ＳＴＥＤ光源１１２としてパルスレーザ光源の代わりに連続発振レーザ光源を使用すればよい。
In the STED microscope of the first embodiment, the STED light is pulsed light, but the STED light may be continuous light. In that case, for example, a continuous wave laser light source may be used as the STED
因みに、励起光をパルス光、ＳＴＥＤ光を連続光とし、かつ、励起光の強度を正弦波で変調した場合は、図６に示すとおりとなる。 Incidentally, when the excitation light is pulsed light, the STED light is continuous light, and the intensity of the excitation light is modulated with a sine wave, the result is as shown in FIG.
また、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、光路長調整機構２９の設け先をＳＴＥＤ光の単独光路としたが、励起光の単独光路であってもよいし、励起光の単独光路とＳＴＥＤ光の単独光路との双方であってもよい。
In the STED microscope of the first embodiment, the optical path
また、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡において、ＳＴＥＤ光をパルス光とした場合、ディレイ時間Δの調整が必要となるが、ＳＴＥＤ光を連続光とした場合は、ディレイ時間の調整は不要なので、光路長調整機構２９を省略することが可能である。
In the STED microscope of the first embodiment, when the STED light is pulsed light, it is necessary to adjust the delay time Δ. However, when the STED light is continuous light, it is not necessary to adjust the delay time. The
また、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、励起光の強度を時間方向に変調するための強度変調器１３１としてＡＯＭを使用した。以下、強度変調器１３１として使用されるＡＯＭを詳しく説明する。 In the STED microscope of the first embodiment, an AOM is used as the intensity modulator 131 for modulating the intensity of the excitation light in the time direction. Hereinafter, the AOM used as the intensity modulator 131 will be described in detail.
ＡＯＭは、超音波の媒質と、媒質を振動させる圧電素子とを備え、圧電素子は、印加電圧（駆動信号）に応じて媒質を振動させることにより、媒質内に超音波を発生させる。媒質内に超音波が発生すると、媒質内に格子状の屈折率分布が生じ、回折格子としての機能がＡＯＭへ付与される。例えば、超音波の周波数がＭＨｚオーダーに設定されると、ＡＯＭではブラック回折が支配的となり、ＡＯＭへ入射した励起光は、主に０次回折光及び１次回折光の２種類に分岐される。標本２０へ導光される励起光は、０次回折光及び１次回折光のうち、１次回折光のみである。ＡＯＭに与えられる駆動信号の振幅が時間方向にかけて変調周波数ｆｍで変調されると、１次回折光の強度が時間方向にかけて変調周波数ｆｍで変調される。このように、標本２０へ導光される励起光として１次回折光を選択すれば、０次回折光を選択した場合と比べて励起光の強度変調のコントラストを高くすることができる。
The AOM includes an ultrasonic medium and a piezoelectric element that vibrates the medium. The piezoelectric element vibrates the medium according to an applied voltage (drive signal), thereby generating an ultrasonic wave in the medium. When ultrasonic waves are generated in the medium, a grating-like refractive index distribution is generated in the medium, and a function as a diffraction grating is imparted to the AOM. For example, when the frequency of the ultrasonic wave is set to the order of MHz, black diffraction is dominant in the AOM, and the excitation light incident on the AOM is mainly branched into two types of zero-order diffracted light and first-order diffracted light. The excitation light guided to the
なお、ＡＯＭを通過する励起光には分散が発生し、励起光のパルス幅が広がる傾向にあるので、ＡＯＭを使用する場合は、この分散を補償するための逆の分散が、ＡＯＭへ入射する前の励起光に対して予め付与されることが望ましい。逆の分散を励起光に付与する光学素子としては、例えば、１対のプリズムやチャープミラーなどを使用することができる。 In addition, since the dispersion | distribution generate | occur | produces in the excitation light which passes AOM, and there exists a tendency for the pulse width of excitation light to spread, when using AOM, the reverse dispersion | distribution for compensating this dispersion | distribution injects into AOM. It is desirable to be given in advance to the previous excitation light. As an optical element that imparts reverse dispersion to the excitation light, for example, a pair of prisms or a chirped mirror can be used.
また、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、強度変調器１３１として例えばＡＯＭを使用したが、例えばＥＯＭ（ＥＯＭ：Electro-Optic Modulator）及び偏光子の組み合わせを使用したり、機械的なチョッパーを使用したりすることもできる。因みに、ＥＯＭと偏光子との組み合わせによると、光の偏光と位相との組み合わせが可変なので、所望の変調波形による光の強度変調が実現する。
［第２実施形態］
以下、第１実施形態におけるディレイ時間Δ（図３（ｃ）参照）の調整方法を、第２実施形態として説明する。
In the STED microscope of the first embodiment, for example, an AOM is used as the intensity modulator 131. However, for example, a combination of an EOM (EOM: Electro-Optic Modulator) and a polarizer or a mechanical chopper is used. You can also. Incidentally, according to the combination of the EOM and the polarizer, since the combination of the polarization and the phase of the light is variable, the light intensity modulation by the desired modulation waveform is realized.
[Second Embodiment]
Hereinafter, a method of adjusting the delay time Δ (see FIG. 3C) in the first embodiment will be described as a second embodiment.
前述したとおり励起光のパルス幅ΔＴｅｘはおよそ数百ｆｓに設定され、ＳＴＥＤ光のパルス幅ΔＴＳＴは数ｐｓ〜数百ｐｓに設定される。そして、両者のディレイ時間Δは、励起光パルスとＳＴＥＤ光パルスとが時間的に重複しない範囲内でなるべく短いことが望ましい。 As described above, the pulse width ΔT ex of the excitation light is set to about several hundred fs, and the pulse width ΔT ST of the STED light is set to several ps to several hundreds ps. The delay time Δ between the two is desirably as short as possible within a range where the excitation light pulse and the STED light pulse do not overlap in time.
なぜなら、励起光とＳＴＥＤ光とが標本２０へ同時に照射されている期間が存在しなければ、励起光とＳＴＥＤ光との同時照射による非線形相互作用の発生を回避することができるので、余分なノイズ光となる和周波光や４光波混合光の発生を回避することができるからである。また、励起光とＳＴＥＤ光とが標本２０へ同時に照射されている期間が存在しなければ、励起光とＳＴＥＤ光との同時照射による標本２０のダメージを回避することもできる。
This is because if there is no period in which the excitation light and the STED light are simultaneously irradiated onto the
そこで、本実施形態では、ディレイ時間Δの調整を以下の手順（１）〜（３）で行う。 Therefore, in the present embodiment, the delay time Δ is adjusted by the following procedures (1) to (3).
（１）標本２０の位置をシフトさせ、標本２０における蛍光物質の分布領域を対物レンズ１９の焦点面から外す。このとき、対物レンズ１９の焦点面には例えば標本２０のカバーガラスのみが存在する。
(1) The position of the
（２）フィルタ２１の代わりに校正用フィルタを配置する。校正用フィルタには、４光波混合光と同じ波長の光を透過し、かつ、励起光と同じ波長の光をカットし、かつ、ＳＴＥＤ光と同じ波長の光をカットするような特性が付与される。この状態で光検出器２３に入射できる光は、基本的に４光波混合光のみとなる。因みに、励起光の波長をλｅｘ＝１０６０ｎｍとおき、ＳＴＥＤ光の波長をλＳＴ＝６６０ｎｍとおくと、４光波混合光の波長λＦＷＭは、式（３）のとおり表される。
(2) A calibration filter is arranged instead of the
（３）光検出器２３の出力する電気信号の振幅を監視しながら、ＳＴＥＤ光の光路長が延長される方向へと光路長調整機構２９を移動させ、電気信号の振幅が最大となった後、さらに光路長調整機構２９を同じ方向に移動させ、電気信号のレベルがノイズレベルまで低下した時点で、光路長調整機構２９の移動を終了する。この時点で、ディレイ時間Δは最適値となる（以上、手順（３））。
［第２実施形態の補足］
なお、第２実施形態では、励起光パルスとＳＴＥＤ光パルスとの時間的重複を検知するために、４光波混合光の発生の有無を検知したが、和周波光の発生の有無を検知してもよい。その場合、校正用フィルタには、和周波光と同じ波長の光を透過し、かつ、励起光と同じ波長の光をカットし、かつ、ＳＴＥＤ光と同じ波長の光をカットするような特性が付与される。因みに、励起光の波長をλｅｘ＝１０６０ｎｍとおき、ＳＴＥＤ光の波長をλＳＴ＝６６０ｎｍとおくと、和周波光の波長λＳＨＧは、およそ４０７ｎｍとなる。
(3) After the optical path
[Supplement of the second embodiment]
In the second embodiment, in order to detect temporal overlap between the excitation light pulse and the STED light pulse, the presence / absence of the four-wave mixed light is detected, but the presence / absence of the sum frequency light is detected. Also good. In that case, the calibration filter has characteristics such as transmitting light having the same wavelength as the sum frequency light, cutting light having the same wavelength as the excitation light, and cutting light having the same wavelength as the STED light. Is granted. Incidentally, if the wavelength of the excitation light is set to λ ex = 1060 nm and the wavelength of the STED light is set to λ ST = 660 nm, the wavelength λ SHG of the sum frequency light is about 407 nm.
また、第２実施形態では、手順（１）〜（３）の一部又は全部をオペレータが手動で行ってもよいし、ＳＴＥＤ顕微鏡が自動で行ってもよい。 In the second embodiment, some or all of the procedures (1) to (3) may be performed manually by an operator, or a STED microscope may be performed automatically.
また、第２実施形態では、手順（１）、（２）の実行順序は、反対であってもよい。
［第３実施形態］
以下、第１実施形態の変形例として第３実施形態を説明する。
In the second embodiment, the execution order of the procedures (1) and (2) may be reversed.
[Third Embodiment]
Hereinafter, the third embodiment will be described as a modification of the first embodiment.
ここでは第１実施形態との相違点のみを説明する。第１実施形態では、励起光の特性のうち「強度」を変調対象としたが、本実施形態では、励起光のＰＳＦを変調対象とする。 Here, only differences from the first embodiment will be described. In the first embodiment, the “intensity” of the characteristics of the excitation light is the modulation target. In the present embodiment, the PSF of the excitation light is the modulation target.
図７は、本実施形態におけるＳＴＥＤ顕微鏡の構成図である。第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡（図１）との相違点は、強度変調器１３１の代わりに空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial Light Modulator）５０が備えられた点にある。 FIG. 7 is a configuration diagram of the STED microscope in the present embodiment. The difference from the STED microscope (FIG. 1) of the first embodiment is that a spatial light modulator (SLM) 50 is provided instead of the intensity modulator 131.
空間光変調器５０は、変調器駆動回路１３２から与えられる駆動信号に応じて、通過光束の位相遅延量分布を時間変化させる位相板であり、例えば液晶などで構成される。
The spatial
空間光変調器５０の配置先は、強度変調器１３１と同様に励起光の単独光路であるが、不図示のリレーレンズによって対物レンズ１９の瞳とほぼ共役に結ばれている必要がある。つまり、空間光変調器５０の配置先は、瞳共役面又はその近傍である。
The spatial
空間光変調器５０の位相遅延量分布は、図８（ａ）に示す第１状態と、図８（ｂ）に示す第２状態との間で切り換わる。この切り換え（スイッチング）の周波数は、第１実施形態の変調周波数ｆｍと同じである。
The phase delay amount distribution of the spatial
図８（ａ）に示す第１状態は、瞳共役面の全体に亘って位相遅延量が一様（位相遅延量がゼロ）な状態である。 The first state shown in FIG. 8A is a state in which the phase delay amount is uniform (the phase delay amount is zero) over the entire pupil conjugate plane.
図８（ｂ）に示す第２状態は、光軸を含む平面で瞳共役面を分割してなる一方の領域の位相遅延量と他方の領域の位相遅延量との差が「π」となった状態である。 In the second state shown in FIG. 8B, the difference between the phase delay amount of one region obtained by dividing the pupil conjugate plane on the plane including the optical axis and the phase delay amount of the other region is “π”. It is in the state.
空間光変調器５０の位相遅延量分布が第１状態（図８（ａ））であるときには、標本２０における励起光のＰＳＦは、図８（ａ’）に示すとおり、光軸上にピークを有した「通常のＰＳＦ」となる。
When the phase delay amount distribution of the spatial
空間光変調器５０の位相遅延量分布が第２状態（図８（ｂ））であるときには、標本２０における励起光のＰＳＦは、図８（ｂ’）に示すとおり、光軸に関して対称な２つの位置にピークを有した「ふた山形状のＰＳＦ」となる。
When the phase delay amount distribution of the spatial
一方、標本２０におけるＳＴＥＤ光のＰＳＦは、図８（ａ”）、（ｂ”）で示すとおり時間変化しない。
On the other hand, the PSF of the STED light in the
したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡において、励起光及びＳＴＥＤ光からなる光スポットの中央（光軸近傍）に着目すると、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡と同様、ＳＴＥＤ光の強度は時間変化しないのに対して励起光の強度のみが周波数ｆｍで時間変化することがわかる。 Therefore, in the STED microscope of the present embodiment, when attention is paid to the center of the light spot composed of the excitation light and the STED light (near the optical axis), the intensity of the STED light does not change with time as in the STED microscope of the first embodiment. only the intensity of the excitation light for it can be seen that changes at a frequency f m time.
したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡も第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡と同様の効果を得ることができる。
［第３実施形態の補足］
なお、第３実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、空間光変調器５０の位相遅延量分布を第１状態と第２状態との２状態の間で離散的に変化させた（すなわち励起光ＰＳＦの変調波形をパルス波形に設定した）が、空間光変調器５０の位相遅延量分布を第１状態と第２状態との間で連続的に変化させても（励起光ＰＳＦの変調波形を例えば正弦波形に設定しても）よい。
Therefore, the STED microscope of the present embodiment can obtain the same effects as the STED microscope of the first embodiment.
[Supplement of the third embodiment]
In the STED microscope of the third embodiment, the phase delay amount distribution of the spatial
また、第３実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、標本２０に向かう励起光のＰＳＦを変調対象としたが、標本２０に向かう励起光の他の特性（例えば、位相、偏光状態、波長など）を変調対象としてもよい。
Further, in the STED microscope of the third embodiment, the PSF of the excitation light traveling toward the
例えば、標本２０に向かう励起光の波長を時間方向にかけて変調すれば、標本２０に向かう励起光の強度を時間方向にかけて変調した場合と同様の効果が期待できる。
For example, if the wavelength of the excitation light toward the
また、例えば、標本２０に向かう励起光の偏光方位を時間方向にかけて変調すると共に、変調された励起光の光路のうち標本２０の上流側に検光子を配置したならば、標本２０に向かう励起光の強度を時間方向にかけて変調した場合と同様の効果が期待できる。
［第４実施形態］
以下、第１実施形態の変形例として第４実施形態を説明する。
Further, for example, if the polarization direction of the excitation light toward the
[Fourth Embodiment]
Hereinafter, the fourth embodiment will be described as a modification of the first embodiment.
ここでは第１実施形態との相違点のみを説明する。 Here, only differences from the first embodiment will be described.
図９は、本実施形態におけるＳＴＥＤ顕微鏡の構成図である。第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡（図１）との主な相違点は、強度変調器１３１、変調器駆動回路１３２、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６の代わりに、信号発生器を内蔵したコントローラ３１が備えられた点にある。ここでは、コントローラ３１を制御装置３０の一部とする。
FIG. 9 is a configuration diagram of the STED microscope in the present embodiment. The main difference from the STED microscope (FIG. 1) of the first embodiment is that, instead of the intensity modulator 131, the
コントローラ３１は、励起光源１１１の繰り返し周波数ｆｒｅｐｅｘと、ＳＴＥＤ光源１１２の繰り返し周波数ｆｒｅｐＳＴとを個別に制御し、繰り返し周波数ｆｒｅｐｅｘ、ｆｒｅｐＳＴの間に差異を設ける。繰り返し周波数ｆｒｅｐｅｘは、第１実施形態の変調周波数ｆｍの１／Ｍ倍（Ｍは２以上の整数）に設定され、繰り返し周波数ｆｒｅｐＳＴは、第１実施形態の変調周波数ｆｍと同じに設定される。ここでは、ｆｒｅｐｅｘ＝ｆｍ／２、ｆｒｅｐＳＴ＝ｆｍに設定されたと仮定する。
The controller 31 includes a repetition frequency f Repex
この場合、標本２０に照射される励起光強度の時間変化波形、標本２０に照射されるＳＴＥＤ光強度の時間変化波形は、図１０に示すとおりとなる。
In this case, the time change waveform of the excitation light intensity irradiated on the
ここで、図１０の上段に示すとおり、本実施形態における励起光の波形は、繰り返し周波数ｆｍ／２の単純なパルス波形であるが、このような励起光の波形は、「繰り返し周波数ｆｍのパルス光の強度を、周波数ｆｍ／２の矩形波で変調した場合」と同様の波形である。 Here, as shown in the upper part of FIG. 10, the waveform of the excitation light in the present embodiment is a simple pulse waveform with a repetition frequency f m / 2, but the waveform of such excitation light is “repetition frequency f m. The waveform is the same as that in the case where the intensity of the pulsed light is modulated with a rectangular wave having a frequency of f m / 2.
よって、図１０の上段及び下段に示すとおり、本実施形態における励起光及びＳＴＥＤ光の波形は、「励起光とＳＴＥＤ光との双方を繰り返し周波数ｆｍのパルス光とし、かつ、励起光のみの強度を、周波数ｆｍ／２の矩形波で変調した場合」と同様の波形である。 Therefore, as shown in the upper and lower part of FIG. 10, the waveform of the excitation light and the STED light in this embodiment, "a pulse light of both repetition frequency f m of the excitation light and the STED light and only the excitation light The waveform is the same as that in the case where the intensity is modulated with a rectangular wave having a frequency of f m / 2.
したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡でも第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡と同様の現象が標本２０で発生する。
Therefore, even in the STED microscope of this embodiment, the same phenomenon as that of the STED microscope of the first embodiment occurs in the
なお、本実施形態のコントローラ３１は、周波数ｆｍ／２で時間変化する第１リファレンス信号と、周波数ｆｍで時間変化する第２リファレンス信号とを、ロックインアンプ２７へ並行して与える。
The controller 31 of this embodiment includes a first reference signal that changes at a
また、本実施形態のロックインアンプ２７は、与えられた第１リファレンス信号及び第２リファレンス信号に応じて、第１実施形態のロックインアンプ２７と同様に第１信号成分及び第２信号成分をロックイン検出する。
Further, the lock-in
したがって、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、強度変調器１３１を使用しないにもかかわらず、第１実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡と同様の効果を得ることができる。 Therefore, the STED microscope according to the present embodiment can obtain the same effects as those of the STED microscope according to the first embodiment, although the intensity modulator 131 is not used.
しかも、本実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、強度変調器１３１を使用しない（ＡＯＭを使用しない）ので、ＡＯＭの通過により励起光に発生する分散の問題、ひいては励起光のパルス幅に発生する拡がりの問題を、回避することもできる。
［第５実施形態］
以下、第４実施形態における励起光源１１１及びＳＴＥＤ光源１１２の繰り返し周波数の制御方法を、第５実施形態として詳しく説明する。
In addition, since the STED microscope of the present embodiment does not use the intensity modulator 131 (no AOM is used), there is a problem of dispersion generated in the excitation light due to the passage of the AOM, and thus a problem of spread generated in the pulse width of the excitation light. Can also be avoided.
[Fifth Embodiment]
Hereinafter, a method for controlling the repetition frequency of the
先ず、励起光源１１１、ＳＴＥＤ光源１１２の各々のパルス発生原理が、連続発振レーザ光源による直接変調法である場合、繰り返し周波数ｆｒｅｐの制御は、連続発振レーザを駆動するための電気信号の周波数の制御により行うことができる。したがって、コントローラ３１は、電気信号の周波数を制御することで、繰り返し周波数ｆｒｅｐを制御することができる。
First, when the pulse generation principle of each of the
一方、励起光源１１１、ＳＴＥＤ光源１１２の各々のパルス発生原理が、レーザ共振器によるモード同期法である場合、繰り返し周波数ｆｒｅｐの制御は、レーザ共振器の共振器長Ｌの調整により行うことが可能である。したがって、コントローラ３１は、共振器長Ｌを制御することで、繰り返し周波数ｆｒｅｐを制御することができる。
On the other hand, when the pulse generation principle of each of the
因みに、光速をｃとおくと、繰り返し周波数ｆｒｅｐと、共振器長Ｌとは、以下の式（４）で表される。 Incidentally, if the speed of light is c, the repetition frequency f rep and the resonator length L are expressed by the following equation (4).
したがって、共振器長Ｌにより繰り返し周波数ｆｒｅｐを制御することができることは明らかである。 Therefore, it is obvious that the repetition frequency f rep can be controlled by the resonator length L.
なお、共振器長Ｌを制御可能とするためには、レーザ共振器の中に電気光学変調器（ＥＯＭ：Electro-Optic Modulator）を挿入しておけばよい。ＥＯＭは、例えばニオブ酸リチウム、あるいはＫＴＰ結晶等の基板に電圧印加用の電極を設けた素子であり、与えられた電圧に応じて結晶の屈折率を変化させる。結晶の厚みをｄとおき、結晶の屈折率をｎとおくと、結晶を透過する光の光路長はｎｄで表されるので、結晶の屈折率ｎを制御することで共振器長Ｌを制御することができる。よって、コントローラ３１は、ＥＯＭに与える電圧を制御することで、繰り返し周波数ｆｒｅｐを制御することができる。
［各実施形態の補足］
上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を、励起光の変調周波数の１倍周波数（＝ｆｍ）で時間変化する第１信号成分と、励起光の変調周波数の２倍周波数（＝２ｆｍ）で時間変化する第２信号成分との双方としたが、蛍光画像の画質向上よりも演算負荷軽減を重視するのであれば、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を、第１信号成分と第２信号成分との一方のみとしてもよい。
In order to control the resonator length L, an electro-optic modulator (EOM) may be inserted into the laser resonator. The EOM is an element in which a voltage application electrode is provided on a substrate such as lithium niobate or KTP crystal, and changes the refractive index of the crystal according to a given voltage. When the thickness of the crystal is set to d and the refractive index of the crystal is set to n, the optical path length of the light transmitted through the crystal is expressed by nd. Therefore, the resonator length L is controlled by controlling the refractive index n of the crystal. can do. Therefore, the controller 31 can control the repetition frequency f rep by controlling the voltage applied to the EOM.
[Supplement of each embodiment]
In the STED microscope of each embodiment described above, the target of lock-in detection by the lock-in
因みに、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を第１信号成分のみとする場合、ロックインアンプ２７に与えられるリファレンス信号は、周波数ｆｍで時間変化する第１リファレンス信号のみでよく、演算装置４０は、ロックインアンプ２７がロックイン検出した第１信号成分のみを蛍光画像の作成に使用すればよい。
Incidentally, when the target of lock-in detection by the lock-in
また、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を第２信号成分のみとする場合、ロックインアンプ２７へ与えられるリファレンス信号は、周波数２ｆｍで時間変化する第２リファレンス信号のみでよく、演算装置４０は、ロックインアンプ２７がロックイン検出した第２信号成分のみを蛍光画像の作成に使用すればよい。
Also, when the target of lock-in detection by the lock-in
また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡には、第１信号成分及び第２信号成分の双方をロックイン検出するモードと、第１信号成分のみをロックイン検出するモードと、第２信号成分のみをロックイン検出するモードとのうち、少なくとも２つのモードが搭載されてもよい。 Further, the STED microscope of each embodiment described above includes a mode for detecting lock-in for both the first signal component and the second signal component, a mode for detecting lock-in only for the first signal component, and only the second signal component. Among the modes for detecting lock-in, at least two modes may be mounted.
また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、２光子吸収過程を利用したが、３光子吸収過程を利用してもよい。３光子吸収過程を利用する場合、励起光の光周波数ωｅｘは、ωｅｘ＝ωｅｘ’／３に設定される。 In the STED microscope of each embodiment described above, a two-photon absorption process is used, but a three-photon absorption process may be used. When the three-photon absorption process is used, the optical frequency ω ex of the excitation light is set to ω ex = ω ex ′ / 3.
また、３光子吸収過程を利用する場合、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象は、励起光の変調周波数と同じ周波数（＝ｆｍ）で時間変化する第１信号成分と、励起光の変調周波数の２倍周波数（＝２ｆｍ）で変化する第２信号成分と、励起光の変調周波数の３倍周波数（＝３ｆｍ）で変化する第３信号成分とのうち、少なくとも１つとされる。
When the three-photon absorption process is used, the lock-in detection target by the lock-in
例えば、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を、第３信号成分のみとする場合、ロックインアンプ２７へ与えられるリファレンス信号は、周波数３ｆｍで時間変化する第３リファレンス信号のみでよく、演算装置４０は、ロックインアンプ２７がロックイン検出した第３信号成分のみを蛍光画像の作成に使用すればよい。
For example, the subject of the lock-in detection by the lock-in
また、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を第２信号成分及び第３信号成分の２つとする場合、ロックインアンプ２７へ与えられるリファレンス信号は、周波数２ｆｍで時間変化する第２リファレンス信号と、周波数３ｆｍで時間変化する第３リファレンス信号との２つとなり、演算装置４０は、ロックインアンプ２７がロックイン検出した第２信号成分及び第３信号成分の和又は平均をとることにより、蛍光画像の高画質化を図ればよい。
Also, if the subject of the lock-in detection by the lock-in
また、ロックインアンプ２７によるロックイン検出の対象を第１信号成分及び第２信号成分及び第３信号成分の３つとする場合、ロックインアンプ２７へ与えられるリファレンス信号は、周波数ｆｍで時間変化する第１リファレンス信号と、周波数２ｆｍで時間変化する第２リファレンス信号と、周波数３ｆｍで時間変化する第３リファレンス信号との３つとなり、演算装置４０は、ロックインアンプ２７がロックイン検出した第１信号成分及び第２信号成分及び第３信号成分の和又は平均をとることにより、蛍光画像の高画質化を図ればよい。
In the case of three and the target first signal component and a second signal component and a third signal component of the lock-in detection by the lock-in
また、３光子吸収過程を利用する場合、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡には、第１信号成分及び第２信号成分及び第３信号成分の３つをロックイン検出するモードと、第１信号成分及び第２信号成分のみをロックイン検出するモードと、第１信号成分及び第３信号成分のみをロックイン検出するモードと、第２信号成分及び第３信号成分のみをロックイン検出するモードと、第１信号成分のみをロックイン検出するモードと、第２信号成分のみをロックイン検出するモードと、第３信号成分のみをロックイン検出するモードとのうち、少なくとも２つのモードが搭載されてもよい。 When using the three-photon absorption process, the STED microscope of each embodiment described above includes a mode for detecting lock-in of the first signal component, the second signal component, and the third signal component, and the first signal. A mode for detecting lock-in only for the component and the second signal component, a mode for detecting lock-in only for the first signal component and the third signal component, and a mode for detecting lock-in only for the second signal component and the third signal component At least two modes are mounted: a mode for detecting lock-in only for the first signal component, a mode for detecting lock-in only for the second signal component, and a mode for detecting lock-in only for the third signal component. Also good.
要するに、Ｍ光子吸収過程を利用する場合（Ｍは２以上の整数）、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光の光周波数ωｅｘをωｅｘ＝ωｅｘ’／Ｍに設定し、第１信号成分〜第Ｍ信号成分のうち少なくとも１つをロックイン検出し、検出した１又は複数の信号成分で蛍光画像を作成すればよい。但し、ここでいう「第Ｍ信号成分」とは、周波数Ｍｆｍで変化する成分のことである。 In short, when using the M photon absorption process (M is an integer of 2 or more), the STED microscope of each embodiment described above sets the optical frequency ω ex of the excitation light to ω ex = ω ex ′ / M, What is necessary is just to perform lock-in detection of at least one of the 1st signal component to the Mth signal component, and create a fluorescent image with the detected one or more signal components. However, here referred to as "the M signal component" is a component that changes at a frequency Mf m.
また、Ｍ光子吸収過程を利用する場合（Ｍは２以上の整数）、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡には、ロックイン検出の対象の異なる少なくとも２つのモードが搭載されてもよい。但し、２つのモードの各々におけるロックイン検出の対象は、第１信号成分〜第Ｍ信号成分のうち１又は複数の信号成分である。 Further, when the M photon absorption process is used (M is an integer of 2 or more), the STED microscope of each embodiment described above may be equipped with at least two modes with different lock-in detection targets. However, the lock-in detection target in each of the two modes is one or a plurality of signal components among the first signal component to the M-th signal component.
また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、複数の信号成分を並行してロックイン検出するために、１台のロックインアンプ２７を使用したが、複数台のロックインアンプを使用してもよい。
In the STED microscope of each of the above-described embodiments, one lock-in
また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、励起光及びＳＴＥＤ光を生成するために２台のレーザ光源を使用したが、１台のレーザ光源と１台の光パラメトリック発振器との組み合わせ、或いは、１台のレーザ光源と２台の光パラメトリック発振器との組み合わせを使用してもよい。 In the STED microscope of each embodiment described above, two laser light sources are used to generate excitation light and STED light. However, a combination of one laser light source and one optical parametric oscillator, or A combination of one laser light source and two optical parametric oscillators may be used.
また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、標本２０を光スポットで走査する手法として、光スキャナ１７によるスキャン（光スキャン）を採用したが、不図示の標本ステージによるスキャン（ステージスキャン）を採用してもよい。ステージスキャンは、光軸と垂直なｘｙ方向に標本２０を移動させることによって行われる。因みに、光スキャンの方がステージスキャンよりもスキャンの高速化が容易である。
In the STED microscope of each embodiment described above, scanning by the optical scanner 17 (optical scanning) is adopted as a method of scanning the
また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡では、標本２０へ同時に形成される光スポットの個数を単数としたが、複数としてもよい。光スポットの個数を複数化すれば、標本２０をスキャンするのに要する時間を短縮することができる。
In the STED microscope of each embodiment described above, the number of light spots simultaneously formed on the
また、上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、標本２０の照明タイプとして落射型を採用したが、透過型を採用してもよいことは言うまでもない。
［各実施形態のまとめ］
上述した各実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、物体（標本２０）に含まれる物質（蛍光物質）を多光子励起するための励起光を物体（標本２０）に向けて集光すると共に、励起中の前記物質（蛍光物質）を誘導放出するための誘導光（ＳＴＥＤ光）を、励起光の集光領域（励起光スポットＡｅｘ）と部分的に重複する領域（ＳＴＥＤ光スポットＡＳＴ）に向けて集光する照明光学系（レンズ１２１、１２２、位相板１４、ダイクロイックミラー１５１、１／４波長板１８、対物レンズ１９）と、物体（標本２０）へ向かう励起光の特性を時間方向にかけて変調する変調部（強度変調器１３１、変調器駆動回路１３２、空間光変調器５０、コントローラ３１）と、励起光及び誘導光（ＳＴＥＤ光）の集光領域（光スポット）に存在する物質（標本２０）が自然放出した蛍光のうち、変調の周波数（ｆｍ）のＮ倍周波数（Ｎ×ｆｍ）で時間変化する成分（信号成分）を検出する検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）とを備える（但し、Ｎは１以上の整数）。
In the STED microscope of each embodiment described above, the epi-illumination type is adopted as the illumination type of the
[Summary of each embodiment]
The STED microscope of each embodiment described above condenses excitation light for multiphoton excitation of a substance (fluorescent material) contained in an object (specimen 20) toward the object (specimen 20), and the excitation is being performed. Stimulated light (STED light) for stimulated emission of a substance (fluorescent substance) is collected toward a region (STED light spot A ST ) that partially overlaps with the excitation light condensing region (excitation light spot A ex ). Modulation that modulates the characteristics of excitation light directed toward the object (specimen 20) and the illumination optical system (
また、多光子励起は、２光子励起であり、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、変調の周波数（ｆｍ）の１倍周波数（ｆｍ）で時間変化する第１成分（第１信号成分）と、変調の周波数の２倍周波数（２ｆｍ）で時間変化する第２成分（第２信号成分）とのうち、少なくとも１つを検出する。
Further, multiphoton excitation is two-photon excitation, and the detection unit (
また、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、変調の周波数（ｆｍ）の１倍周波数（ｆｍ）で時間変化する第１成分（第１信号成分）と、変調の周波数の２倍周波数（２ｆｍ）で時間変化する第２成分（第２信号成分）との各々を検出する。
Further, the detection unit (the
また、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、第１成分（第１信号成分）と第２成分（第２信号成分）との和又は平均を求める。
The detection unit (the
また、多光子励起は、３光子励起であり、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、変調の周波数の１倍周波数（ｆｍ）で時間変化する第１成分（第１信号成分）と、変調の周波数の２倍周波数（２ｆｍ）で時間変化する第２成分（第２信号成分）と、変調の周波数の３倍周波数（３ｆｍ）で時間変化する第３成分（第３信号成分）とのうち、少なくとも１つを検出する。
The multiphoton excitation is three-photon excitation, and the detection unit (the
また、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、変調の周波数の１倍周波数（ｆｍ）で時間変化する第１成分（第１信号成分）と、変調の周波数の２倍周波数（２ｆｍ）で時間変化する第２成分（第２信号成分）と、変調の周波数の３倍周波数（３ｆｍ）で時間変化する第３成分（第３信号成分）との各々を検出する。
In addition, the detectors (the
また、検出部（光検出器２３、ロックインアンプ２７、信号発生器２４、周波数混合器２５、バンドパスフィルタ２６、コントローラ３１）は、第１成分（第１信号成分）と第２成分（第２信号成分）と第３成分（第３信号成分）との和又は平均を求める。
The detection unit (the
また、励起光の前記特性は、励起光の強度である。或いは、前記変調部は、前記励起光のＰＳＦを変化させることにより、前記励起光の強度を変調する。 The characteristic of the excitation light is the intensity of the excitation light. Alternatively, the modulation unit modulates the intensity of the excitation light by changing the PSF of the excitation light.
また、物体（標本２０）に照射される励起光は、パルス光であり、物体（標本２０）に照射される誘導光（ＳＴＥＤ光）は、パルス光である。 Moreover, the excitation light irradiated to the object (specimen 20) is pulsed light, and the guide light (STED light) irradiated to the object (sample 20) is pulsed light.
また、物体（標本２０）に照射される励起光のパルスと誘導光（ＳＴＥＤ光）のパルスとの間には、互いのパルスが時間的に重複しないようディレイ時間（Δ）が設けられている。 In addition, a delay time (Δ) is provided between the excitation light pulse and the guide light (STED light) pulse irradiated on the object (specimen 20) so that the pulses do not overlap in time. .
また、ディレイ時間は、物質（蛍光物質）の蛍光寿命よりも短く設定される。 The delay time is set shorter than the fluorescence lifetime of the substance (fluorescent substance).
また、励起光の集光領域（励起光スポットＡｅｘ）の形状は、円形であり、誘導光の集光領域（ＳＴＥＤ光スポットＡＳＴ）の形状は、輪帯状であり、励起光の集光領域（励起光スポットＡｅｘ）の中心と誘導光（ＳＴＥＤ光）の集光領域（ＳＴＥＤ光スポットＡＳＴ）の中心とは一致する。 In addition, the shape of the excitation light condensing region (excitation light spot A ex ) is circular, and the shape of the condensing light condensing region (STED light spot A ST ) is annular, and the excitation light condensing is concentrated. The center of the region (excitation light spot A ex ) coincides with the center of the condensing region (STED light spot A ST ) of the guide light (STED light).
また、上述した実施形態のＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光及び誘導光（ＳＴＥＤ光）の集光領域（光スポット）で物体（標本２０）を走査する走査部（光スキャナ１７、標本ステージ）を更に備える。
［その他の補足］
上述した各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。
The STED microscope of the above-described embodiment further includes a scanning unit (
[Other supplements]
The requirements of each embodiment described above can be combined as appropriate. Some components may not be used. In addition, as long as it is permitted by law, the disclosure of all publications and US patents relating to the devices cited in the above embodiments and modifications are incorporated herein by reference.
１１１…励起光源、１１２…ＳＴＥＤ光源、１２１、１２２…レンズ、Ｍ１〜Ｍ５…ミラー、１３１…強度変調器、１３２…変調器駆動回路、１４…位相板、１５１、１５２…ダイクロイックミラー、１７…光スキャナ、１８…１／４波長板、１９…対物レンズ、２０…標本、２１…フィルタ、２２…レンズ、２３…光検出器、２９…光路長調整機構、３０…制御装置、４０…演算装置、５０…空間光変調器、３１…コントローラ
DESCRIPTION OF
Claims (16)
前記物体へ向かう前記励起光の特性を時間方向にかけて変調する変調部と、
前記励起光及び前記誘導光の集光領域に存在する前記物質が自然放出した蛍光のうち、前記変調の周波数のＮ倍周波数で時間変化する成分（但し、Ｎは１以上の整数）を検出する検出部と、
を備えることを特徴とする超解像観察装置。 Condensing excitation light for multiphoton excitation of a substance contained in an object toward the object, and guiding light for stimulated emission of the substance being excited partially with the excitation light condensing region An illumination optical system for condensing light toward an overlapping area,
A modulator that modulates the characteristics of the excitation light toward the object in the time direction;
Of the fluorescence spontaneously emitted by the substance existing in the light condensing region of the excitation light and the guide light, a component that changes with time at a frequency N times the modulation frequency (where N is an integer of 1 or more) is detected. A detection unit;
A super-resolution observation apparatus comprising:
前記多光子励起は、２光子励起であり、
前記検出部は、
前記変調の周波数の１倍周波数で時間変化する第１成分と、前記変調の周波数の２倍周波数で時間変化する第２成分とのうち、少なくとも１つを検出する
ことを特徴とする超解像観察装置。 The super-resolution observation apparatus according to claim 1,
The multiphoton excitation is two-photon excitation;
The detector is
Detecting at least one of a first component that changes in time at a frequency that is one time the frequency of the modulation and a second component that changes in time at a frequency that is twice the frequency of the modulation. Observation device.
前記検出部は、
前記変調の周波数の１倍周波数で時間変化する第１成分と、前記変調の周波数の２倍周波数で時間変化する第２成分との各々を検出する
ことを特徴とする超解像観察装置。 The super-resolution observation apparatus according to claim 2,
The detector is
A super-resolution observation apparatus that detects each of a first component that changes in time at a frequency that is one time the modulation frequency and a second component that changes in time at a frequency twice that of the modulation.
前記検出部は、
前記第１成分と前記第２成分との和又は平均を求める
ことを特徴とする超解像観察装置。 In the super-resolution observation apparatus according to claim 3,
The detector is
A super-resolution observation apparatus that calculates a sum or an average of the first component and the second component.
前記多光子励起は、３光子励起であり、
前記検出部は、
前記変調の周波数の１倍周波数で時間変化する第１成分と、前記変調の周波数の２倍周波数で時間変化する第２成分と、前記変調の周波数の３倍周波数で時間変化する第３成分とのうち、少なくとも１つを検出する
ことを特徴とする超解像観察装置。 The super-resolution observation apparatus according to claim 1,
The multiphoton excitation is three-photon excitation;
The detector is
A first component that changes in time at a frequency that is one time the frequency of the modulation, a second component that changes in time at a frequency that is twice the frequency of the modulation, and a third component that changes in time at a frequency that is three times the frequency of the modulation A super-resolution observation apparatus characterized by detecting at least one of them.
前記特性は、前記励起光の強度である
ことを特徴とする超解像観察装置。 In the super-resolution observation apparatus according to any one of claims 1 to 5,
The super-resolution observation apparatus, wherein the characteristic is the intensity of the excitation light.
前記変調部は、前記励起光のＰＳＦを変化させることにより、前記励起光の強度を変調する
ことを特徴とする超解像観察装置。 The super-resolution observation apparatus according to claim 6,
The modulation section modulates the intensity of the excitation light by changing the PSF of the excitation light.
前記物体に照射される前記励起光は、パルス光であり、
前記物体に照射される前記誘導光は、パルス光である
ことを特徴とする超解像観察装置。 In the super-resolution observation apparatus according to any one of claims 1 to 7,
The excitation light applied to the object is pulsed light,
The super-resolution observation apparatus, wherein the guide light irradiated on the object is pulsed light.
前記物体に照射される前記励起光のパルスと前記誘導光のパルスとの間には、互いのパルスが時間的に重複しないようディレイ時間が設けられている
ことを特徴とする超解像観察装置。 The super-resolution observation apparatus according to claim 8,
A super-resolution observation apparatus characterized in that a delay time is provided between the pulse of the excitation light and the pulse of the guide light irradiated to the object so that the pulses do not overlap in time. .
前記ディレイ時間は、前記物質の蛍光寿命よりも短く設定される
ことを特徴とする超解像観察装置。 The super-resolution observation apparatus according to claim 9,
The super-resolution observation apparatus, wherein the delay time is set shorter than the fluorescence lifetime of the substance.
前記励起光の集光領域の形状は、円形であり、
前記誘導光の集光領域の形状は、輪帯状であり、
前記励起光の集光領域の中心と前記誘導光の集光領域の中心とは一致する
ことを特徴とする超解像観察装置。 In the super-resolution observation apparatus according to any one of claims 1 to 10,
The shape of the excitation light condensing region is circular,
The shape of the condensing region of the guide light is an annular shape,
The super-resolution observation apparatus, wherein a center of the condensing region of the excitation light and a center of the condensing region of the guide light coincide.
前記励起光及び前記誘導光の集光領域で前記物体を走査する走査部を更に備える
ことを特徴とする超解像観察装置。 In the super-resolution observation apparatus according to any one of claims 1 to 11,
A super-resolution observation apparatus, further comprising: a scanning unit that scans the object in a condensing region of the excitation light and the guide light.
前記物体へ向かう前記励起光の特性を時間方向にかけて変調する変調手順と、
前記励起光及び前記誘導光の集光領域に存在する前記物質が自然放出した蛍光のうち、前記変調の周波数のＮ倍周波数で時間変化する成分（但し、Ｎは１以上の整数）を検出する検出手順と、
を備えることを特徴とする超解像観察方法。 Condensing excitation light for multiphoton excitation of a substance contained in an object toward the object, and guiding light for stimulated emission of the substance being excited partially with the excitation light condensing region An illumination procedure for condensing light toward an overlapping area;
A modulation procedure for modulating the characteristics of the excitation light toward the object in the time direction;
Of the fluorescence spontaneously emitted by the substance existing in the light condensing region of the excitation light and the guide light, a component that changes with time at a frequency N times the modulation frequency (where N is an integer of 1 or more) is detected. Detection procedure;
A super-resolution observation method comprising:
前記励起光及び前記誘導光の集光領域に存在する前記物質が自然放出した蛍光を検出する検出部とを備え、
前記物体に照射される前記励起光は、パルス光であり、前記物体に照射される前記誘導光は、パルス光である
ことを特徴とする超解像観察装置。 Condensing excitation light for multiphoton excitation of a substance contained in an object toward the object, and guiding light for stimulated emission of the substance being excited partially with the excitation light condensing region An illumination optical system for condensing light toward an overlapping area,
A detection unit that detects fluorescence spontaneously emitted by the substance present in the condensing region of the excitation light and the guide light; and
The super-resolution observation apparatus, wherein the excitation light irradiated on the object is pulsed light, and the guide light irradiated on the object is pulsed light.
前記励起光のパルスと前記誘導光のパルスとの間には、互いのパルスが時間的に重複しないようディレイ時間が設けられている
ことを特徴とする超解像観察装置。 The super-resolution observation apparatus according to claim 14,
A super-resolution observation apparatus characterized in that a delay time is provided between the excitation light pulse and the induced light pulse so that the pulses do not overlap in time.
前記ディレイ時間は、前記物質の蛍光寿命よりも短い
ことを特徴とする超解像観察装置。 The super-resolution observation apparatus according to claim 15,
The super-resolution observation apparatus, wherein the delay time is shorter than the fluorescence lifetime of the substance.
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