JP2015064248A - Single molecule recognition method, device, and program - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、単分子識別方法、装置、及びプログラムに関する。 The present invention relates to a single molecule identification method, apparatus, and program.
従来、タンパク質を構成するアミノ酸、核酸を構成するヌクレオチド、糖鎖を構成する単糖など、生体分子、特に生体高分子を構成する単分子を識別することが行われている。単分子の識別には、例えば、光、電気等をプローブ信号とする単分子測定を用いた識別法が存在する。単分子測定を用いた識別法では、対象試料に対して、蛍光分子や電気活性を有するプローブ分子を修飾することで、特定の単分子の検出を可能としている。 Conventionally, biomolecules such as amino acids constituting proteins, nucleotides constituting nucleic acids, and monosaccharides constituting sugar chains have been identified, particularly single molecules constituting biopolymers. For identification of single molecules, for example, there is an identification method using single molecule measurement using light, electricity or the like as a probe signal. In the identification method using single molecule measurement, a specific single molecule can be detected by modifying the target sample with a fluorescent molecule or a probe molecule having electric activity.
しかし、上述のプローブ分子を修飾する単分子の検出方法では、化学試薬が必要であることや、修飾効率が問題となる。さらに、特定の化学種のみしか検出できず、多種多様な分子種が混在する生体試料を対象とした単分子の識別には適用することができない、という問題がある。 However, the above-described method for detecting a single molecule for modifying a probe molecule requires a chemical reagent and has a problem of modification efficiency. Furthermore, there is a problem that only specific chemical species can be detected, and it cannot be applied to single molecule identification for biological samples in which a wide variety of molecular species are mixed.
また、多種多様な単分子を識別するためには、高感度な測定シグナルを得ること、及び測定シグナルの標準化が必要である。 In addition, in order to distinguish a wide variety of single molecules, it is necessary to obtain a highly sensitive measurement signal and to standardize the measurement signal.
高感度な測定シグナルを得ることができる単分子の識別方法として、電極間距離を１ｎｍ以下に固定したナノギャップ電極を用いて、単分子を流れるトンネル電流を測定することにより、単分子識別を行う技術が提案されている（例えば、特許文献１〜５参照）。トンネル電流を用いた測定では、単分子の電子エネルギー状態を直接測定することができる。 As a single molecule identification method capable of obtaining a highly sensitive measurement signal, single molecule identification is performed by measuring a tunnel current flowing through a single molecule using a nanogap electrode in which the distance between electrodes is fixed to 1 nm or less. Techniques have been proposed (see, for example, Patent Documents 1 to 5). In the measurement using the tunnel current, the electron energy state of a single molecule can be directly measured.
また、測定シグナルの標準化に関連して、サンプルに混合する試薬に被検物質の測定に関与しない別の物質である内部標準物質を入れ、その内部標準物質を測定し、真のサンプルの採取量との誤差を補正することにより、正確な被検物質の定量値を得る電気化学的測定方法が提案されている（例えば、特許文献６及び７参照）。 In addition, in connection with standardization of measurement signals, the internal standard substance, which is another substance not involved in the measurement of the test substance, is put in the reagent mixed in the sample, the internal standard substance is measured, and the amount of true sample collected An electrochemical measurement method has been proposed in which an accurate quantitative value of a test substance is obtained by correcting the error (see, for example, Patent Documents 6 and 7).
トンネル電流測定のような、ギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別では、測定の仕方や状態に応じて、測定結果が左右されるため、測定シグナルを標準化することが必要である。そこで、トンネル電流測定による単分子識別に、特許文献６及び７のような標準化を適用し、試料分子自体を内部標準物質とした相対コンダクタンスを定義することで、間接的な標準化を行うことは可能である。 In single-molecule identification based on a minute current measurement using a gap electrode, such as tunneling current measurement, the measurement result depends on the measurement method and state, and thus it is necessary to standardize the measurement signal. Therefore, it is possible to perform standardization indirectly by applying standardization as in Patent Documents 6 and 7 to single molecule identification by tunneling current measurement and defining relative conductance with the sample molecule itself as an internal standard substance. It is.
しかし、内部標準物質を十分に測定するために、測定時間が長時間化するという問題がある。また、上述のような標準化は、未知分子を含む試料には適用することができないため、未知分子を含む試料を測定する場合には、分離及び精製等の手順が必要となる。このように、ギャップ電極デバイスを用いた微量電流測定に、従来の標準化方法を適用するには、限定的な試料や条件下でしか適用することができない、という問題がある。 However, there is a problem that the measurement time becomes longer in order to sufficiently measure the internal standard substance. In addition, since the standardization as described above cannot be applied to a sample containing an unknown molecule, procedures such as separation and purification are required when measuring a sample containing an unknown molecule. Thus, in order to apply the conventional standardization method to the trace current measurement using the gap electrode device, there is a problem that it can be applied only under limited samples and conditions.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、未知分子を含む試料に対しても、分離及び精製等の手順を必要とすることなく、ギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別を行うことができるように標準化した単分子識別方法、装置、及びプログラムを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and a sample containing unknown molecules can be simply measured by measuring a minute current using a gap electrode without requiring a procedure such as separation and purification. It is an object to provide a single molecule identification method, apparatus, and program that are standardized so that molecular identification can be performed.
上記目的を達成するために、本発明の単分子識別方法は、電極間を通過する際に電極間に流れる微量電流に応じたシグナルの大きさが既知で、かつ前記シグナルの大きさの変動が予め定めた変動範囲内となる標準物質が添加されると共に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子が含まれる試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が、前記電極間を通過した際に流れた微量電流に応じたシグナルを測定するステップと、測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別するステップと、を含む。 In order to achieve the above object, the single molecule identification method of the present invention has a known signal magnitude corresponding to a minute current flowing between the electrodes when passing between the electrodes, and the fluctuation of the magnitude of the signal is known. A standard substance that falls within a predetermined variation range is added, and each of the standard substance and the single molecule to be discriminated included in a sample containing at least one type of single molecule to be discriminated is connected between the electrodes. Measuring a signal according to a small amount of current that flows when the signal passes through, and a signal indicating the standard substance included in the plurality of measured signals as a reference, the other signals included in the plurality of signals are Identifying the type of single molecule to be shown.
これにより、ギャップ電極を用いた微量電流測定のように、測定の仕方や状態に応じて、測定結果が左右される場合でも、標準物質を示す安定したシグナルを得ることができるため、未知分子を含む試料に対しても、分離及び精製等の手順を必要とすることなく、ギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別を行うことができるように標準化することができる。 As a result, a stable signal indicating a standard substance can be obtained even when the measurement result depends on the measurement method and state, such as a minute current measurement using a gap electrode. It is also possible to standardize the contained sample so that single molecule identification can be performed by a minute current measurement using a gap electrode without requiring procedures such as separation and purification.
また、前記標準物質を、電気伝導性を有し、かつ前記識別対象の単分子と結合しない同一形状の物質とすることができる。これにより、識別対象の単分子を示すシグナルとの区別が容易な標準物質を示すシグナルを得ることができる。 In addition, the standard substance may be a substance having the same shape that has electrical conductivity and does not bind to the single molecule to be identified. Thereby, a signal indicating a standard substance that can be easily distinguished from a signal indicating a single molecule to be identified can be obtained.
また、前記標準物質を、前記電極間を通過する際の前記電極間に対する姿勢が同一となる物質とすることができる。これにより、測定毎の標準物質を示すシグナルの大きさが均一化される。 The standard substance may be a substance having the same posture with respect to the electrodes when passing between the electrodes. Thereby, the magnitude | size of the signal which shows the reference material for every measurement is equalize | homogenized.
また、前記標準物質の形状を、球形とすることができる。これにより、電極の構成にかかわらず、測定毎の標準物質を示すシグナルの大きさが均一化される。 Further, the shape of the standard substance can be a sphere. Thereby, the magnitude | size of the signal which shows the reference material for every measurement is equalized irrespective of the structure of an electrode.
また、前記標準物質を、金属ナノ粒子またはフラーレンとすることができる。 The standard substance may be metal nanoparticles or fullerene.
また、前記複数のシグナルに対する前記標準物質を示すシグナルの割合が予め定めた割合範囲となるように、前記試料に対する前記標準物質の濃度を最適化することができる。これにより、標準物質を示すシグナルを安定して検出することができると共に、標準物質を示すシグナルがノイズとなることを防止することができる。 Further, the concentration of the standard substance relative to the sample can be optimized so that the ratio of the signal indicating the standard substance to the plurality of signals falls within a predetermined ratio range. Thereby, it is possible to stably detect a signal indicating the standard substance and to prevent the signal indicating the standard substance from becoming noise.
また、前記識別するステップで、前記標準物質を示すシグナルに対する前記複数のシグナルの相対値、及び単分子の種類とシグナルの相対値との予め定めた関係に基づいて、前記他のシグナルが示す単分子の種類を識別することができる。 Further, in the identifying step, based on the relative value of the plurality of signals with respect to the signal indicating the standard substance and the predetermined relationship between the type of single molecule and the relative value of the signal, the single signal indicated by the other signal The type of molecule can be identified.
また、前記測定するステップで、異なる複数の電極間距離に対応した異なる複数の標準物質が添加された試料について、電極間距離が異なる複数の状態毎に、前記微量電流に応じたシグナルを測定し、前記識別するステップで、前記状態毎に、測定された複数のシグナルに含まれる該当の状態に対応した標準物質を示すシグナルと、前記他のシグナルとを比較し、各状態における比較結果に基づいて、前記他のシグナルが示す単分子の種類を識別することができる。これにより、より精度の高い識別を行うことができる。 Further, in the measuring step, for a sample to which a plurality of different standard substances corresponding to a plurality of different interelectrode distances are added, a signal corresponding to the minute current is measured for each of a plurality of states having different interelectrode distances. In the identifying step, for each state, a signal indicating a standard substance corresponding to the corresponding state included in a plurality of measured signals is compared with the other signals, and based on the comparison result in each state. Thus, the type of single molecule indicated by the other signal can be identified. Thereby, identification with higher accuracy can be performed.
また、本発明の単分子識別装置は、電極間を通過する際に電極間に流れる微量電流に応じたシグナルの大きさが既知で、かつ前記シグナルの大きさの変動が予め定めた変動範囲内となる標準物質が添加されると共に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子が含まれる試料が、前記電極間を通過する際に、微量電流が流れるように配置された電極対と、前記試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が、前記電極間を通過した際に流れた微量電流に応じたシグナルを測定する測定部と、前記測定部により測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別する識別部と、を含んで構成することができる。 Further, the single molecule identification device of the present invention has a known signal magnitude corresponding to a minute current flowing between the electrodes when passing between the electrodes, and the fluctuation of the magnitude of the signal is within a predetermined fluctuation range. And a sample containing at least one type of identification target single molecule and an electrode pair arranged so that a small amount of current flows when the sample passes between the electrodes, and the sample Each of the standard substance and the single molecule to be identified included in a measurement unit that measures a signal according to a minute current that flows when passing between the electrodes, and a plurality of signals measured by the measurement unit And an identification unit for identifying the type of a single molecule indicated by another signal included in the plurality of signals on the basis of a signal indicating the standard substance included in the reference signal.
また、本発明の単分子識別プログラムは、コンピュータを、電極間を通過する際に電極間に流れる微量電流に応じたシグナルの大きさが既知で、かつ前記シグナルの大きさの変動が予め定めた変動範囲内となる標準物質が添加されると共に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子が含まれる試料が、前記電極間を通過する際に、微量電流が流れるように配置された電極対の電極間を、前記試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が通過した際に流れた微量電流に応じたシグナルを測定するように測定部を制御する測定制御部、及び前記測定部により測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別する識別部として機能させるためのプログラムである。 In addition, the single molecule identification program of the present invention is a computer in which the magnitude of a signal according to a small amount of current flowing between electrodes when passing between the electrodes is known, and the fluctuation of the magnitude of the signal is predetermined. A reference material within a variation range is added, and at least one kind of identification target single molecule includes a pair of electrode pairs arranged so that a small amount of current flows when the sample passes between the electrodes. A measurement control unit that controls a measurement unit to measure a signal corresponding to a minute current that flows when each of the standard substance and the single molecule to be identified included in the sample passes between electrodes; and An identification unit for identifying a type of a single molecule indicated by another signal included in the plurality of signals based on a signal indicating the standard substance included in the plurality of signals measured by the measurement unit; Is a program for making the function Te.
本発明に係る単分子識別方法、装置、及びプログラムによれば、測定の仕方や状態に応じて、測定結果が左右されるギャップ電極を用いた微量電流測定においても、標準物質による安定したシグナルを得ることができるため、未知分子を含む試料に対しても、分離及び精製等の手順を必要とすることなく、ギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別を行うことができるように標準化することができる。 According to the single molecule identification method, apparatus, and program according to the present invention, a stable signal from a standard substance can be obtained even in a minute current measurement using a gap electrode whose measurement result depends on the measurement method and state. Since it can be obtained, it is standardized so that samples containing unknown molecules can be identified by single-current measurement by measuring a minute current using a gap electrode without requiring procedures such as separation and purification. be able to.
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。以下の実施の形態では、微量電流として、電極間を単分子が通過した際に流れるトンネル電流を測定する場合を例に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. In the following embodiment, a case where a tunnel current that flows when a single molecule passes between electrodes as a minute current is measured will be described as an example.
＜第１の実施の形態＞
図１に示すように、第１の実施の形態に係る単分子識別装置１０は、ナノギャップ電極対１２、測定用電源１８、電気泳動用電極対２０、電気泳動用電源２２、電流計２４、及び制御部２６を含んで構成されている。以下に、各構成について説明する。
<First Embodiment>
As shown in FIG. 1, the single molecule identification device 10 according to the first embodiment includes a nanogap electrode pair 12, a measurement power source 18, an electrophoresis electrode pair 20, an electrophoresis power source 22, an ammeter 24, And the control unit 26. Each configuration will be described below.
ナノギャップ電極対１２は、一部に絶縁膜１４を設けた対向する２つの電極が、試料５０に含まれる単分子５２及び標準物質５４（詳細は後述）が電極間を通過する際に、トンネル電流が流れるような距離を隔てて配置されている。ナノギャップ電極対１２の具体的な作製方法は特に限定されない。 The nano-gap electrode pair 12 is formed by a pair of two opposing electrodes each provided with an insulating film 14 when a single molecule 52 and a standard material 54 (details will be described later) contained in the sample 50 pass between the electrodes. They are arranged at a distance such that current flows. The specific manufacturing method of the nanogap electrode pair 12 is not particularly limited.
測定用電源１８は、ナノギャップ電極対１２に対して電圧を印加する。測定用電源１８によってナノギャップ電極対１２に印加する電圧の大きさは特に限定されず、例えば、０．２５Ｖ〜０．７５Ｖとすることができる。測定用電源１８の具体的な構成は特に限定されず、適宜、公知の電源装置を用いることが可能である。 The measurement power supply 18 applies a voltage to the nanogap electrode pair 12. The magnitude of the voltage applied to the nanogap electrode pair 12 by the measurement power supply 18 is not particularly limited, and can be, for example, 0.25V to 0.75V. The specific configuration of the measurement power supply 18 is not particularly limited, and a known power supply device can be used as appropriate.
電気泳動用電極対２０は、試料５０に含まれる単分子５２及び標準物質５４の移動方向（図１中のブロック矢印Ａ）に電界を形成するように配置される。電気泳動用電極対２０の電極間に電界が形成されると、単分子５２及び標準物質５４が電気泳動により、電界方向に移動する。すなわち、単分子５２及び標準物質５４がナノギャップ電極対１２の電極間を通過するように移動する。 Electrophoresis electrode pair 20 is arranged so as to form an electric field in the moving direction of single molecule 52 and standard substance 54 contained in sample 50 (block arrow A in FIG. 1). When an electric field is formed between the electrodes of the electrode pair 20 for electrophoresis, the single molecule 52 and the standard substance 54 move in the direction of the electric field by electrophoresis. That is, the single molecule 52 and the standard substance 54 move so as to pass between the electrodes of the nanogap electrode pair 12.
電気泳動用電源２２は、電気泳動用電極対２０に対して電圧を印加する。電気泳動用電源２２によって電気泳動用電極対２０に印加する電圧の大きさは特に限定されず、ナノギャップ電極対１２の電極間を単分子５２及び標準物質５４が通過する速さを制御することができる電圧を適宜設定することができる。電気泳動用電源２２の具体的な構成は特に限定されず、適宜、公知の電源装置を用いることが可能である。 The power supply 22 for electrophoresis applies a voltage to the electrode pair 20 for electrophoresis. The magnitude of the voltage applied to the electrophoresis electrode pair 20 by the electrophoresis power source 22 is not particularly limited, and the speed at which the single molecule 52 and the standard substance 54 pass between the electrodes of the nanogap electrode pair 12 is controlled. Can be set as appropriate. The specific configuration of the power supply 22 for electrophoresis is not particularly limited, and a known power supply device can be used as appropriate.
電流計２４は、測定用電源１８により電圧が印加されたナノギャップ電極対１２の電極間を単分子５２及び標準物質５４が通過した際に生じるトンネル電流を測定する。電流計２４の具体的な構成は特に限定されず、適宜、周知の電流測定装置を用いればよい。 The ammeter 24 measures a tunnel current generated when the single molecule 52 and the standard material 54 pass between the electrodes of the nanogap electrode pair 12 to which a voltage is applied by the measurement power supply 18. The specific configuration of the ammeter 24 is not particularly limited, and a known current measuring device may be used as appropriate.
制御部２６は、単分子識別装置１０の各構成を制御すると共に、測定されたトンネル電流に応じたシグナルに基づいて、単分子５２の種類を識別する。 The control unit 26 controls each component of the single molecule identification device 10 and identifies the type of the single molecule 52 based on a signal corresponding to the measured tunnel current.
制御部２６は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、及び後述する単分子識別プログラムが格納されたＲＯＭ（Read Only Memory）等を備えたコンピュータで構成することができる。このコンピュータで構成される制御部２６は、機能的には、図２に示すように、電気泳動制御部３０、測定制御部３２、及び識別部３４を含んだ構成で表すことができる。以下、各部について詳述する。 The control unit 26 can be configured by a computer including a CPU (Central Processing Unit), a RAM (Random Access Memory), and a ROM (Read Only Memory) in which a single molecule identification program described later is stored. The control unit 26 configured by this computer can be functionally represented by a configuration including an electrophoresis control unit 30, a measurement control unit 32, and an identification unit 34, as shown in FIG. Hereinafter, each part is explained in full detail.
電気泳動制御部３０は、単分子５２及び標準物質５４が、ナノギャップ電極対１２の電極間を通過するように、電気泳動用電源２２による電圧の印加を制御する。 The electrophoresis control unit 30 controls application of voltage by the electrophoresis power supply 22 so that the single molecule 52 and the standard substance 54 pass between the electrodes of the nanogap electrode pair 12.
測定制御部３２は、ナノギャップ電極対１２の電極間に流れるトンネル電流を測定するように電流計２４を制御する。トンネル電流の測定時間は限定されないが、例えば、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間とすることができる。また、測定制御部３２は、電流計２４で測定されたトンネル電流の電流値を取得し、取得した電流値からコンダクタンスを計算し、コンダクタンス−時間プロファイルを作成する。コンダクタンスは、トンネル電流を測定した際にナノギャップ電極対１２に印可されていた電圧Ｖで、トンネル電流の電流値を除することにより、計算することができる。コンダクタンスを用いることにより、ナノギャップ電極対１２間に印加する電圧値が測定毎に異なる場合でも、統一された基準のプロファイルを得ることができる。なお、測定毎にナノギャップ電極対１２間に印加する電圧値を一定とした場合には、トンネル電流の電流値とコンダクタンスとは、同等に扱うことができる。 The measurement control unit 32 controls the ammeter 24 so as to measure the tunnel current flowing between the electrodes of the nanogap electrode pair 12. The measurement time of the tunnel current is not limited, but may be, for example, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, 1 hour. Further, the measurement control unit 32 acquires the current value of the tunnel current measured by the ammeter 24, calculates conductance from the acquired current value, and creates a conductance-time profile. The conductance can be calculated by dividing the current value of the tunnel current by the voltage V applied to the nanogap electrode pair 12 when the tunnel current is measured. By using the conductance, a uniform reference profile can be obtained even when the voltage value applied between the nanogap electrode pair 12 differs for each measurement. In addition, when the voltage value applied between the nanogap electrode pair 12 is made constant for each measurement, the current value of the tunnel current and the conductance can be handled equally.
また、測定制御部３２は、電流計２４で測定されたトンネル電流を、電流増幅器を用いて一旦増幅してから取得するようにしてもよい。電流増幅器を用いることによって、微弱なトンネル電流の値を増幅することができるため、トンネル電流を高感度に測定することが可能となる。電流増幅器としては、例えば、市販の可変高速電流アンプ(Femto社製、カタログ番号：ＤＨＰＣＡ−１００）を用いることができる。 Alternatively, the measurement control unit 32 may acquire the tunnel current measured by the ammeter 24 after having been amplified using a current amplifier. By using a current amplifier, a weak tunnel current value can be amplified, so that the tunnel current can be measured with high sensitivity. As the current amplifier, for example, a commercially available variable high-speed current amplifier (manufactured by Femto, catalog number: DHPCA-100) can be used.
識別部３４は、測定制御部３２により作成されたコンダクタンス−時間プロファイルに表れる複数のシグナルに含まれる標準物質５４を示すシグナルを基準にして、他のシグナルが示す単分子の種類を識別する。 The discriminating unit 34 discriminates the type of single molecule indicated by other signals with reference to the signal indicating the standard substance 54 included in the plurality of signals appearing in the conductance-time profile created by the measurement control unit 32.
図３に、コンダクタンス−時間プロファイルの模式的な一例を示す。コンダクタンス−時間プロファイルに表れる複数のシグナルとは、図３に示すように、ピーク値を有する部分であり、ピーク毎に１つのシグナルに対応する。従って、図３の例では、Ａに示す部分には、１つのシグナルが存在し、Ｂに示す部分には、４つのシグナルが存在することを示している。 FIG. 3 shows a schematic example of a conductance-time profile. The plurality of signals appearing in the conductance-time profile is a portion having a peak value as shown in FIG. 3, and corresponds to one signal for each peak. Therefore, in the example of FIG. 3, it is shown that one signal exists in the portion indicated by A and four signals exist in the portion indicated by B.
また、図３の例で、Ａに示す部分のシグナルは、標準物質５４を示すシグナルであり、Ｂに示す部分のシグナル群に含まれる各シグナルは、単分子５２を示すシグナルである。この場合、標準物質５４を示すシグナルのコンダクタンス、及び標準物質５４を示すシグナルのコンダクタンスに対する識別対象の単分子５２の種類毎の相対コンダクタンスが既知であれば、各シグナルが示す単分子の種類を識別することができる。 In the example of FIG. 3, the signal of the portion indicated by A is a signal indicating the standard substance 54, and each signal included in the signal group of the portion indicated by B is a signal indicating the single molecule 52. In this case, if the conductance of the signal indicating the standard substance 54 and the relative conductance of each type of the single molecule 52 to be identified with respect to the conductance of the signal indicating the standard substance 54 are known, the type of the single molecule indicated by each signal is identified. can do.
具体的には、標準物質５４の固有コンダクタンスに対する識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを、相対コンダクタンステーブル３６に予め記憶しておく。図４に、相対コンダクタンステーブル３６の一例を示す。そして、識別部３４は、図５に示すように、得られたコンダクタンス−時間プロファイルに表れた標準物質５４を示すシグナル以外のシグナルのコンダクタンスと、相対コンダクタンステーブル３６に記憶された識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスとを比較し、相対コンダクタンスが一致する単分子の種類を、そのシグナルが示す単分子の種類として識別する。なお、相対コンダクタンスが一致するとは、完全に一致する場合に限らず、両者の差が所定の閾値以下となる場合も含む。 Specifically, the relative conductance of the single molecule 52 to be identified with respect to the intrinsic conductance of the standard substance 54 is stored in advance in the relative conductance table 36. FIG. 4 shows an example of the relative conductance table 36. Then, as shown in FIG. 5, the identification unit 34 conducts signals other than the signal indicating the standard substance 54 in the obtained conductance-time profile, and the identification target single molecule stored in the relative conductance table 36. The relative conductance of 52 is compared, and the type of the single molecule having the same relative conductance is identified as the type of the single molecule indicated by the signal. Note that the fact that the relative conductances match does not only mean that the relative conductances completely match, but also includes the case where the difference between the two becomes equal to or less than a predetermined threshold.
ここで、上記のように、相対コンダクタンス値を用いて、各シグナルが示す単分子５２の種類を識別するために、どのような標準物質５４を用いることが好ましいかについて説明する。 Here, as described above, what standard substance 54 is preferably used for identifying the type of the single molecule 52 indicated by each signal using the relative conductance value will be described.
トンネル電流等のギャップ電極を用いた微量電流測定では、電極と、電極間を通過する分子との距離が、測定される微量電流の大きさに影響を与える。従って、電極間を通過する際の電極間に対する姿勢が均一とならない分子の場合、測定毎にコンダクタンス（シグナルの大きさ）にばらつきが生じてしまう。例えば図６に示すように、複数回の測定により得られたコンダクタンスのヒストグラムを作成した際に、ヒストグラムの分散が大きい物質は、標準物質５４として用いることに適さない。そこで、標準物質５４として、測定毎のコンダクタンスの変動が少ない物質を用いる。例えば図７に示すように、複数回の測定により得られたコンダクタンスのヒストグラムの分散が小さい物質が、標準物質５４として用いることに適している。 In the measurement of a minute current using a gap electrode such as a tunnel current, the distance between the electrode and a molecule passing between the electrodes affects the magnitude of the measured minute current. Therefore, in the case of a molecule in which the posture with respect to the electrodes when passing between the electrodes is not uniform, the conductance (signal magnitude) varies for each measurement. For example, as shown in FIG. 6, when a histogram of conductance obtained by a plurality of measurements is created, a substance having a large variance in the histogram is not suitable for use as the standard substance 54. Therefore, a material having a small variation in conductance for each measurement is used as the standard material 54. For example, as shown in FIG. 7, a substance having a small variance in the conductance histogram obtained by a plurality of measurements is suitable for use as the standard substance 54.
このように、測定毎のコンダクタンスの変動を少なくするためには、電極間を通過する際の電極間に対する姿勢が同一となる物質を標準物質５４として用いる。例えば、電極間と物質の形状との関係で電極間を通過する際の姿勢が一意に定まる物質や、電気泳動等により、電極間を通過する際の姿勢が同一になるように制御できる物質などが挙げられる。また、物質の形状が球形であれば、電極との関係を考慮したり、電気泳動等の制御を行ったりすることなく、電極間を通過する際の姿勢が同一になる。 As described above, in order to reduce the variation in conductance for each measurement, a material having the same posture with respect to the electrodes when passing between the electrodes is used as the standard material 54. For example, a material that uniquely determines the posture when passing between electrodes due to the relationship between the electrodes and the shape of the material, a material that can be controlled so that the posture when passing between the electrodes is the same by electrophoresis, etc. Is mentioned. Moreover, if the shape of the substance is spherical, the posture when passing between the electrodes is the same without considering the relationship with the electrodes or performing control such as electrophoresis.
また、標準物質５４を示すシグナルは、基準として用いるため、識別対象の単分子５２を示すシグナルとは明確に区別可能なシグナルとなることが好ましい。このため、標準物質５４としては、電気伝導性を有し、識別対象の単分子と結合しない物質であることが好ましい。また、基準として安定したシグナルとするために、試料５０内に含まれる標準物質は同一形状であることが好ましい。さらに、図３に示すように、単分子５２を示すシグナルとの差が大きいことが望ましいため、識別対象の単分子５２と比較して、大きな固有コンダクタンスを有する物質が好ましい。 In addition, since the signal indicating the standard substance 54 is used as a reference, it is preferably a signal that can be clearly distinguished from the signal indicating the single molecule 52 to be identified. Therefore, the standard substance 54 is preferably a substance that has electrical conductivity and does not bind to a single molecule to be identified. In order to obtain a stable signal as a reference, it is preferable that the standard substances contained in the sample 50 have the same shape. Further, as shown in FIG. 3, since it is desirable that the difference from the signal indicating the single molecule 52 is large, a substance having a large intrinsic conductance is preferable as compared with the single molecule 52 to be identified.
上記の条件を考慮して、標準物質５４として、金属ナノ粒子またはフラーレンを用いることができる。金属ナノ粒子としては、例えば金ナノ粒子、銀ナノ粒子、銅ナノ粒子、アルミナノ粒子等が挙げられる。なお、識別対象の単分子５２の大きさが０．５〜２ｎｍ程度の場合には、標準物質５４としてフラーレンを用いることが適している。また、識別対象の単分子５２の大きさが２ｎｍ以上の場合には、標準物質５４として金ナノ粒子を用いることが適している。 In consideration of the above conditions, metal nanoparticles or fullerene can be used as the standard material 54. Examples of the metal nanoparticles include gold nanoparticles, silver nanoparticles, copper nanoparticles, and alumina nanoparticles. In addition, when the size of the identification target single molecule 52 is about 0.5 to 2 nm, it is suitable to use fullerene as the standard substance 54. Further, when the size of the single molecule 52 to be identified is 2 nm or more, it is suitable to use gold nanoparticles as the standard substance 54.
次に、第１の実施の形態に係る単分子識別装置１０を用いて行われる単分子識別方法について説明する。 Next, a single molecule identification method performed using the single molecule identification apparatus 10 according to the first embodiment will be described.
まず、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子５２を溶液に溶解させる。溶液は、特に限定されない。例えば、超純水を用いることができる。超純水は、例えば、ミリポア社のMilli-Q Integral 3 （装置名）（Milli-Q Integral 3/5/10/15 （カタログ番号））を用いることによって作製することができる。溶液中の単分子５２の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１〜１．０μＭである。 First, at least one or more types of identification target single molecules 52 are dissolved in a solution. The solution is not particularly limited. For example, ultrapure water can be used. Ultrapure water can be produced, for example, by using Milli-Q Integral 3 (device name) (Milli-Q Integral 3/5/10/15 (catalog number)) manufactured by Millipore. Although the density | concentration of the single molecule 52 in a solution is not specifically limited, For example, it is 0.01-1.0 micromol.
次に、単分子５２を溶解させた溶液に、上述したような標準物質５４を添加する。溶液中の標準物質５４の濃度は、コンダクタンス−時間プロファイルに表れる複数のシグナルに対する標準物質５４を示すシグナルの割合が、所定範囲となるように最適化する。図８に示すように、標準物質５４の濃度が低い場合には、コンダクタンス−時間プロファイルにおける標準物質５４を示すシグナル（図８中のＡ）が少なくなるため、標準物質５４を示すシグナルを安定して検出することができない。一方、標準物質５４の濃度が高い場合には、コンダクタンス−時間プロファイルにおける標準物質５４を示すシグナルが多くなり、そのシグナルがノイズとなる。そこで、識別の安定性とノイズの低減とのバランスを考慮した最適なシグナル数となるように、上記の所定範囲を定めておく。 Next, the standard substance 54 as described above is added to the solution in which the single molecule 52 is dissolved. The concentration of the standard substance 54 in the solution is optimized so that the ratio of the signal indicating the standard substance 54 to a plurality of signals appearing in the conductance-time profile falls within a predetermined range. As shown in FIG. 8, when the concentration of the standard substance 54 is low, the signal indicating the standard substance 54 (A in FIG. 8) in the conductance-time profile decreases, so that the signal indicating the standard substance 54 is stabilized. Cannot be detected. On the other hand, when the concentration of the standard substance 54 is high, a signal indicating the standard substance 54 in the conductance-time profile increases, and the signal becomes noise. Therefore, the predetermined range is determined so as to obtain an optimum number of signals in consideration of the balance between the stability of identification and the reduction of noise.
そして、試料５０中にナノギャップ電極対１２を配置し、測定用電源１８により、ナノギャップ電極対１２に電圧を印加すると共に、電気泳動用電源２２により、電気泳動用電極対２０に電圧を印加する。そして、制御部２６を構成するコンピュータのＣＰＵが、ＲＯＭに格納された単分子識別プログラムを読み出して実行することにより、単分子識別装置１０により、図９に示す単分子識別処理が行われる。 Then, the nanogap electrode pair 12 is disposed in the sample 50, and a voltage is applied to the nanogap electrode pair 12 by the measurement power supply 18, and a voltage is applied to the electrophoresis electrode pair 20 by the electrophoresis power supply 22. To do. Then, the single molecule identification process shown in FIG. 9 is performed by the single molecule identification device 10 by the CPU of the computer constituting the control unit 26 reading and executing the single molecule identification program stored in the ROM.
図９に示す単分子識別処理のステップＳ１０で、測定制御部３２が、電流計２４を制御し、ナノギャップ電極対１２の電極間を単分子５２及び標準物質５４が通過する際に生じたトンネル電流を、所定時間測定させる。 In step S10 of the single molecule identification process shown in FIG. 9, the measurement control unit 32 controls the ammeter 24, and the tunnel generated when the single molecule 52 and the standard substance 54 pass between the electrodes of the nanogap electrode pair 12. The current is measured for a predetermined time.
次に、ステップＳ１２で、測定制御部３２が、測定されたトンネル電流の電流値を取得し、測定点毎にコンダクタンスを計算し、例えば図３に示すようなコンダクタンス−時間プロファイルを作成する。次に、ステップＳ１４で、識別部３４が、相対コンダクタンステーブル３６から、識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを取得する。 Next, in step S12, the measurement control unit 32 acquires the current value of the measured tunnel current, calculates conductance for each measurement point, and creates a conductance-time profile as shown in FIG. 3, for example. Next, in step S <b> 14, the identification unit 34 acquires the relative conductance of the single molecule 52 to be identified from the relative conductance table 36.
次に、ステップＳ１６で、識別部が、上記ステップＳ１２で作成されたコンダクタンス−時間プロファイルと、上記ステップＳ１４で取得した相対コンダクタンスとを比較して、各シグナルが示す単分子の種類を識別する。次に、ステップＳ１８で、識別部３４が、識別結果を出力して、単分子識別処理を終了する。 Next, in step S16, the identification unit compares the conductance-time profile created in step S12 with the relative conductance obtained in step S14, and identifies the type of single molecule indicated by each signal. Next, in step S18, the identification unit 34 outputs the identification result and ends the single molecule identification process.
以上説明したように、第１の実施の形態に係る単分子識別装置及び方法によれば、標準物質として、ナノギャップ電極間に流れるトンネル電流から作成したコンダクタンス−時間プロファイルにおけるコンダクタンスの変動が小さい物質を用いる。そして、コンダクタンス−時間プロファイルにおける標準物質を示すシグナルのコンダクタンスを基準にして、他のシグナルが示す単分子の種類を識別する。これにより、未知分子を含む試料に対しても、分離及び精製等の手順を必要とすることなく、ギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別を行うことができるように標準化することができる。 As described above, according to the single molecule identification apparatus and method according to the first embodiment, as a standard substance, a substance having a small variation in conductance in a conductance-time profile created from a tunnel current flowing between nanogap electrodes. Is used. Then, based on the conductance of the signal indicating the standard substance in the conductance-time profile, the type of single molecule indicated by the other signal is identified. As a result, it is possible to standardize samples containing unknown molecules so that single molecules can be identified by measuring a minute current using a gap electrode without requiring procedures such as separation and purification. .
＜第２の実施の形態＞
次に、第２の実施の形態について説明する。なお、第１の実施の形態に係る単分子識別装置１０と同一の部分については、同一符号を付して詳細な説明を省略する。
<Second Embodiment>
Next, a second embodiment will be described. In addition, about the part same as the single molecule identification device 10 which concerns on 1st Embodiment, the same code | symbol is attached | subjected and detailed description is abbreviate | omitted.
図１０に示すように、第２の実施の形態に係る単分子識別装置２１０は、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、測定用電源１８、電気泳動用電極対２０、電気泳動用電源２２、電流計２４、及び制御部２２６を含んで構成されている。 As shown in FIG. 10, the single molecule identification device 210 according to the second embodiment includes nanogap electrode pairs 12A, 12B, and 12C, a measurement power supply 18, an electrophoresis electrode pair 20, an electrophoresis power supply 22, An ammeter 24 and a control unit 226 are included.
ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の構成は、第１の実施の形態におけるナノギャップ電極対１２と同様である。ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々は、各電極間の中心が同一軸上に並ぶように、絶縁膜１４を介して積層されている。すなわち、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間により、単分子５２及び標準物質５４が通過する一つの通路を形成している。ナノギャップ電極対１２Ａの電極間距離はｄ１、ナノギャップ電極対１２Ｂの電極間距離はｄ２、ナノギャップ電極対１２Ｃの電極間距離はｄ３で各々異なる。図１０の例では、ｄ１＞ｄ２＞ｄ３である。例えば、ｄ１＝１．０ｎｍ、ｄ２＝０．７ｎｍ、ｄ３＝０．５ｎｍとすることができる。 The configuration of each of the nanogap electrode pair 12A, 12B, and 12C is the same as that of the nanogap electrode pair 12 in the first embodiment. Each of the nanogap electrode pairs 12A, 12B, and 12C is laminated via the insulating film 14 so that the centers between the electrodes are aligned on the same axis. That is, a single passage through which the single molecule 52 and the standard substance 54 pass is formed between the electrodes of the nanogap electrode pair 12A, 12B, and 12C. The distance between the electrodes of the nanogap electrode pair 12A is d1, the distance between the electrodes of the nanogap electrode pair 12B is d2, and the distance between the electrodes of the nanogap electrode pair 12C is d3. In the example of FIG. 10, d1> d2> d3. For example, d1 = 1.0 nm, d2 = 0.7 nm, and d3 = 0.5 nm.
制御部２２６は、図１１に示すように、電気泳動制御部３０、測定制御部２３２、及び識別部２３４を備えた構成で表すことができる。 As shown in FIG. 11, the control unit 226 can be represented by a configuration including an electrophoresis control unit 30, a measurement control unit 232, and an identification unit 234.
測定制御部２３２は、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間で生じたトンネル電流を、各々測定するように電流計２４を制御する。また、測定制御部２３２は、電流計２４で測定された電極間距離毎のトンネル電流の電流値を取得してコンダクタンスを計算し、電極間距離毎のコンダクタンス−時間プロファイルを作成する。 The measurement control unit 232 controls the ammeter 24 so as to measure the tunnel currents generated between the electrodes of the nanogap electrode pairs 12A, 12B, and 12C. Further, the measurement control unit 232 acquires the current value of the tunnel current for each inter-electrode distance measured by the ammeter 24, calculates conductance, and creates a conductance-time profile for each inter-electrode distance.
識別部２３４は、電極間距離毎のコンダクタンス−時間プロファイルに表れる複数のシグナルに含まれる、その電極間距離に対応した標準物質５４を示すシグナルと、他のシグナルとを比較する。そして、識別部２３４は、電極間距離毎の比較結果に基づいて、他のシグナルが示す単分子の種類を識別する。 The identification unit 234 compares a signal indicating the standard substance 54 corresponding to the inter-electrode distance included in the plurality of signals appearing in the conductance-time profile for each inter-electrode distance with other signals. And the identification part 234 identifies the kind of single molecule which another signal shows based on the comparison result for every distance between electrodes.
ここで、図１２に、複数種類の単分子（図１２の例ではアミノ酸）について、電極間距離ｄ毎の相対コンダクタンスを示す。ここでの相対コンダクタンスとは、図１２内のアミノ酸のうち、コンダクタンスが最大のものを１としたときの各アミノ酸のコンダクタンスである。図１２の例では、電極間距離ｄは、ｄ１＝１．０ｎｍ、ｄ２＝０．７ｎｍ、及びｄ３＝０．４ｎｍである。図１２に示すように、電極間距離ｄが０．４ｎｍの場合には、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐの相対コンダクタンスが近似している。同様に、電極間距離ｄが０．７ｎｍの場合には、ＣｙｓとＰｒｏ、及びＴｙｒとＴｒｐの相対コンダクタンスが近似している。同様に、電極間距離ｄが１．０ｎｍの場合には、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、及びＰｈｅの相対コンダクタンスが近似している。このように、相対コンダクタンスが近似している場合には、単分子の種類を識別する際の識別精度が低下する恐れがある。 Here, FIG. 12 shows the relative conductance for each inter-electrode distance d for a plurality of types of single molecules (amino acids in the example of FIG. 12). Here, the relative conductance is the conductance of each amino acid when the conductance of amino acids in FIG. In the example of FIG. 12, the inter-electrode distance d is d1 = 1.0 nm, d2 = 0.7 nm, and d3 = 0.4 nm. As shown in FIG. 12, when the inter-electrode distance d is 0.4 nm, the relative conductances of His, Thr, Tyr, and Trp are approximated. Similarly, when the inter-electrode distance d is 0.7 nm, the relative conductances of Cys and Pro, and Tyr and Trp are approximated. Similarly, when the interelectrode distance d is 1.0 nm, the relative conductances of Cys, Pro, and Phe are approximated. Thus, when the relative conductance is approximate, the identification accuracy when identifying the type of a single molecule may be reduced.
そこで、電極間距離毎に識別可能な単分子を予め定めておく。また、電極間距離毎に、その電極間距離に対応した標準物質５４を選択しておく。そして、電極間距離に対応した標準物質５４の固有コンダクタンスに対する、その電極間距離で識別可能な識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを、相対コンダクタンステーブル２３６に予め記憶しておく。図１３に、相対コンダクタンステーブル２３６の一例を示す。 Therefore, a single molecule that can be identified for each inter-electrode distance is determined in advance. For each interelectrode distance, a standard material 54 corresponding to the interelectrode distance is selected. The relative conductance of the single molecule 52 to be identified that can be identified by the interelectrode distance with respect to the intrinsic conductance of the standard material 54 corresponding to the interelectrode distance is stored in advance in the relative conductance table 236. FIG. 13 shows an example of the relative conductance table 236.
図１４に、識別部２３４による識別処理を模式的に示す。識別部２３４は、図１４に示すように、得られた電極間距離毎のコンダクタンス−時間プロファイルに表れた、その電極間距離に対応した標準物質５４を示すシグナル以外のシグナルのコンダクタンスと、相対コンダクタンステーブル２３６に記憶された、その電極間距離で識別可能な識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスとを比較することにより、各シグナルが示す単分子の種類を識別する。識別部２３４は、その電極間距離のコンダクタンス−時間プロファイルからは識別することができなかったシグナル（図中「Ｘ」で示すシグナル）については、異なる電極間距離のコンダクタンス−時間プロファイルにおいて、単分子の種類を識別する。 FIG. 14 schematically shows identification processing by the identification unit 234. As shown in FIG. 14, the identification unit 234 displays the conductance of the signal other than the signal indicating the standard material 54 corresponding to the distance between the electrodes and the relative conductance, which appear in the obtained conductance-time profile for each distance between the electrodes. The type of single molecule indicated by each signal is identified by comparing the relative conductance of the single molecule 52 to be identified, which can be identified by the distance between the electrodes, stored in the table 236. For a signal that cannot be identified from the conductance-time profile of the distance between the electrodes (the signal indicated by “X” in the figure), the identification unit 234 uses a single molecule in the conductance-time profile of the distance between the electrodes. Identify the type.
次に、第２の実施の形態に係る単分子識別装置２１０を用いて行われる単分子識別方法について説明する。 Next, a single molecule identification method performed using the single molecule identification apparatus 210 according to the second embodiment will be described.
まず、第１の実施の形態と同様に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子５２を溶液に溶解させる。次に、単分子５２を溶解させた溶液に、上述したような標準物質５４を添加する。第２の実施の形態では、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間距離（ｄ１、ｄ２、ｄ３）に対応した標準物質５４をそれぞれ添加する。 First, as in the first embodiment, at least one type of identification target single molecule 52 is dissolved in a solution. Next, the standard substance 54 as described above is added to the solution in which the single molecule 52 is dissolved. In the second embodiment, the standard materials 54 corresponding to the interelectrode distances (d1, d2, d3) of the nanogap electrode pairs 12A, 12B, 12C are respectively added.
そして、試料５０中にナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃを配置し、測定用電源１８により、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々に電圧を印加すると共に、電気泳動用電源２２により、電気泳動用電極対２０に電圧を印加する。そして、制御部２２６を構成するコンピュータのＣＰＵが、ＲＯＭに格納された単分子識別プログラムを読み出して実行することにより、単分子識別装置２１０により、図１５に示す単分子識別処理が行われる。 Then, the nanogap electrode pair 12A, 12B, 12C is arranged in the sample 50, and a voltage is applied to each of the nanogap electrode pair 12A, 12B, 12C by the measurement power supply 18, and the electrophoresis power supply 22 A voltage is applied to the electrode pair 20 for electrophoresis. Then, the single molecule identification process shown in FIG. 15 is performed by the single molecule identification device 210 when the CPU of the computer constituting the control unit 226 reads and executes the single molecule identification program stored in the ROM.
図１５に示す単分子識別処理のステップＳ２０で、測定制御部２３２が、電流計２４を制御し、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間により形成された一つの通路を、単分子５２及び標準物質５４が通過する際に生じたトンネル電流を、所定時間測定させる。 In step S20 of the single molecule identification process shown in FIG. 15, the measurement control unit 232 controls the ammeter 24 so that one path formed between the electrodes of the nanogap electrode pairs 12A, 12B, and 12C is single. The tunnel current generated when the molecule 52 and the standard substance 54 pass is measured for a predetermined time.
次に、ステップＳ２２で、測定制御部２３２が、測定されたトンネル電流の電流値を取得し、測定点毎にコンダクタンスを計算し、例えば図３に示すようなコンダクタンス−時間プロファイルを、電極間距離毎に作成する。次に、ステップＳ２４で、識別部２３４が、変数ｉに１を設定する。 Next, in step S22, the measurement control unit 232 acquires the current value of the measured tunnel current, calculates the conductance for each measurement point, and calculates, for example, the conductance-time profile as shown in FIG. Create each. Next, in step S24, the identification unit 234 sets 1 to the variable i.
次に、ステップＳ２６で、識別部２３４が、相対コンダクタンステーブル２３６から、電極間距離ｄｉに対応した単分子５２の相対コンダクタンス、すなわち、電極間距離ｄｉで識別可能な識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを取得する。 Next, in step S26, the identification unit 234 determines from the relative conductance table 236 the relative conductance of the single molecule 52 corresponding to the interelectrode distance di, that is, the relative of the single molecule 52 to be identified that can be identified by the interelectrode distance di. Get conductance.
次に、ステップＳ２８で、識別部２３４が、上記ステップＳ２２で作成された電極間距離ｄｉのコンダクタンス−時間プロファイルと、上記ステップＳ２６で取得した相対コンダクタンスとを比較して、各シグナルが示す単分子の種類を識別する。 Next, in step S28, the identification unit 234 compares the conductance-time profile of the interelectrode distance di created in step S22 with the relative conductance acquired in step S26, and the single molecule indicated by each signal Identify the type.
次に、ステップＳ３０で、識別部２３４が、全ての電極間距離ｄｉについて処理を終了したか否かを判定する。未処理の電極間距離ｄｉが存在する場合には、ステップＳ３２へ移行して、ｉを１インクリメントして、ステップＳ２６へ戻る。全ての電極間距離ｄｉについて処理が終了した場合には、ステップＳ３４へ移行して、識別部２３４が、識別結果を出力して、単分子識別処理を終了する。 Next, in step S30, the identification unit 234 determines whether or not the processing has been completed for all the inter-electrode distances di. If there is an unprocessed inter-electrode distance di, the process proceeds to step S32, i is incremented by 1, and the process returns to step S26. When the process is completed for all the inter-electrode distances di, the process proceeds to step S34, the identification unit 234 outputs the identification result, and the single molecule identification process is terminated.
以上説明したように、第２の実施の形態に係る単分子識別装置及び方法によれば、複数の電極間距離のナノギャップ電極間で生じたトンネル電流から得られたコンダクタンスを用いることで、第１の実施の形態の効果に加え、より精度の高い識別を行うことができる。 As described above, according to the single molecule identification device and method according to the second embodiment, by using the conductance obtained from the tunnel current generated between nanogap electrodes having a plurality of interelectrode distances, In addition to the effects of the first embodiment, more accurate identification can be performed.
なお、第２の実施の形態では、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々を、各電極間の中心が同一軸上に並ぶように積層する構成について説明したが、これに限定されない。例えば、同一平面上に、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々を配置してもよい。この場合、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々に対応して電気泳動用電極を設けるなどして、単分子５２及び標準物質５４が、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間を順次通過するように制御すればよい。 In the second embodiment, the nanogap electrode pairs 12A, 12B, and 12C are described as being stacked so that the centers between the electrodes are aligned on the same axis. However, the present invention is not limited to this. For example, each of the nanogap electrode pairs 12A, 12B, and 12C may be disposed on the same plane. In this case, the single molecule 52 and the standard substance 54 are provided in the respective electrodes of the nanogap electrode pair 12A, 12B, and 12C by providing an electrophoresis electrode corresponding to each of the nanogap electrode pair 12A, 12B, and 12C. What is necessary is just to control so that it may pass through between sequentially.
また、第２の実施の形態では、電極間距離が異なる複数のナノギャップ電極対を設ける場合について説明したが、１つのナノギャップ電極対の電極間距離を変更する機構を設けた構成としてもよい。例えば、てこの原理を利用して、力点、支点、及び作用点の幾何学的配置を調整することで、電極間距離を変更する構成とすることができる。より具体的には、ピエゾ素子によりナノギャップ電極対の一部を押し上げることにより、作用点となる電極端部を移動させて、電極間距離を変更する構成とすることができる。この場合、ピエゾ素子の押し上げ距離と電極間距離との対応関係に基づいて、所望の電極間距離に設定することができる。 In the second embodiment, the case where a plurality of nanogap electrode pairs having different interelectrode distances is provided has been described. However, a mechanism for changing the interelectrode distance of one nanogap electrode pair may be provided. . For example, the distance between the electrodes can be changed by adjusting the geometrical arrangement of the force point, the fulcrum, and the action point using the principle of leverage. More specifically, by pushing up a part of the nanogap electrode pair with a piezo element, the electrode end portion serving as the action point can be moved to change the inter-electrode distance. In this case, the desired inter-electrode distance can be set based on the correspondence between the push-up distance of the piezo element and the inter-electrode distance.
また、上記各実施の形態では、トンネル電流を測定する場合について説明したが、本発明は、あらゆるギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別法の標準化として適用することができる。本発明の適用により、測定前の分離及び精製等の前処理が必要なくなり、高精度な単分子識別を、高選択的かつ広範囲にわたる実験条件で行うことができる。例えば、代表的なバイオ高分子核酸塩基鎖の測定に使用した場合、遺伝子シーケンサー及び遺伝子発現解析法の高精度化及び選択性向上が見込まれる。また、公衆衛生、安全、安心、環境分野で使われる高速、高感度、及び低コストなアレルゲン検査、疾病診断等へ応用することもできる。 In each of the above-described embodiments, the case where the tunnel current is measured has been described. However, the present invention can be applied as standardization of a single molecule identification method based on a minute current measurement using any gap electrode. Application of the present invention eliminates the need for pretreatment such as separation and purification prior to measurement, and enables highly accurate single molecule identification to be performed with high selectivity and over a wide range of experimental conditions. For example, when used for measurement of typical biopolymer nucleic acid base chains, higher accuracy and improved selectivity of gene sequencers and gene expression analysis methods are expected. It can also be applied to high-speed, high-sensitivity, low-cost allergen testing, disease diagnosis, etc. used in the fields of public health, safety, security, and environment.
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施の形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the configurations described above, and various modifications are possible within the scope of the claims, and the technical means disclosed in different embodiments are appropriately combined. The obtained embodiments are also included in the technical scope of the present invention.
また、本願明細書中において、プログラムが予めインストールされている実施の形態として説明したが、外部の記憶装置や記録媒体等に格納されたプログラムを随時読み込んで、またインターネットを介してダウンロードして実行するようにしてもよい。また、当該プログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納して提供することも可能である。 In the specification of the present application, the program has been described as an embodiment in which the program is installed in advance. However, the program stored in an external storage device or recording medium is read as needed, and is downloaded and executed via the Internet. You may make it do. In addition, the program can be provided by being stored in a computer-readable recording medium.
１０、２１０ 単分子識別装置
１２ ナノギャップ電極対
２４ 電流計
２６、２２６ 制御部
３２、２３２ 測定制御部
３４、２３４ 識別部
３６、２３６ 相対コンダクタンステーブル
５２ 単分子
５４ 標準物質
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10,210 Single molecule identification apparatus 12 Nano gap electrode pair 24 Ammeter 26,226 Control part 32,232 Measurement control part 34,234 Identification part 36,236 Relative conductance table 52 Single molecule 54 Standard substance
Claims (10)
測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別するステップと、
を含む単分子識別方法。 A standard substance in which the magnitude of the signal according to the minute current flowing between the electrodes when passing between the electrodes is known and the fluctuation of the signal is within a predetermined fluctuation range is added, and at least A step of measuring a signal corresponding to a minute current that flows when each of the standard substance and the single molecule to be discriminated included in a sample containing one or more types of single molecules to be discriminated passes between the electrodes; When,
Identifying the type of a single molecule indicated by another signal included in the plurality of signals based on a signal indicating the standard substance included in the plurality of signals measured; and
A single molecule identification method comprising:
前記識別するステップで、前記状態毎に、測定された複数のシグナルに含まれる該当の状態に対応した標準物質を示すシグナルと、前記他のシグナルとを比較し、各状態における比較結果に基づいて、前記他のシグナルが示す単分子の種類を識別する請求項１〜請求項７のいずれか１項記載の単分子識別方法。 In the measuring step, for a sample to which a plurality of different standard substances corresponding to different inter-electrode distances are added, a signal corresponding to the trace current is measured for each of a plurality of states having different inter-electrode distances,
In the identifying step, for each state, a signal indicating a standard substance corresponding to a corresponding state included in a plurality of measured signals is compared with the other signals, and based on a comparison result in each state. The single molecule identification method according to any one of claims 1 to 7, wherein a type of a single molecule indicated by the other signal is identified.
前記試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が、前記電極間を通過した際に流れた微量電流に応じたシグナルを測定する測定部と、
前記測定部により測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別する識別部と、
を含む単分子識別装置。 A standard substance in which the magnitude of the signal according to the minute current flowing between the electrodes when passing between the electrodes is known and the fluctuation of the signal is within a predetermined fluctuation range is added, and at least A sample containing one or more types of single molecules to be identified passes through the electrodes, and a pair of electrodes arranged so that a small amount of current flows;
Each of the standard substance contained in the sample and the single molecule to be identified measures a signal according to a minute current that flows when passing between the electrodes,
An identification unit for identifying a type of a single molecule indicated by another signal included in the plurality of signals with reference to a signal indicating the standard substance included in the plurality of signals measured by the measurement unit;
Single molecule identification device comprising:
電極間を通過する際に電極間に流れる微量電流に応じたシグナルの大きさが既知で、かつ前記シグナルの大きさの変動が予め定めた変動範囲内となる標準物質が添加されると共に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子が含まれる試料が、前記電極間を通過する際に、微量電流が流れるように配置された電極対の電極間を、前記試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が通過した際に流れた微量電流に応じたシグナルを測定するように測定部を制御する測定制御部、及び
前記測定部により測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別する識別部
として機能させるための単分子識別プログラム。 Computer
A standard substance in which the magnitude of the signal according to the minute current flowing between the electrodes when passing between the electrodes is known and the fluctuation of the signal is within a predetermined fluctuation range is added, and at least When a sample containing one or more types of single molecules to be identified passes between the electrodes, the standard substance contained in the sample and the reference material included in the sample are arranged between the electrodes of the electrode pair arranged so that a minute amount of current flows. A measurement control unit for controlling the measurement unit to measure a signal corresponding to a minute current that flows when each single molecule to be identified passes, and the standard included in the plurality of signals measured by the measurement unit A single molecule identification program for functioning as an identification unit for identifying the type of a single molecule indicated by another signal included in the plurality of signals based on a signal indicating a substance.
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