JP2015036624A - Kit and method for detecting and quantifying detection object - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、検出対象を検出又は定量するためのキット、及び方法に関する。 The present invention relates to a kit and a method for detecting or quantifying a detection target.
従来から、被検体中の検出対象を検出する方法として、ラテックス凝集法が利用されてきた。ラテックス凝集法とは、生体試料等の流体中における抗原を検出する場合、抗原に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させたラテックスと、流体とを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原を検出又は定量する方法である（例えば、特許文献１参照）。 Conventionally, a latex agglutination method has been used as a method for detecting a detection target in a specimen. The latex agglutination method is a method for detecting the antigen in a fluid such as a biological sample by mixing a latex carrying an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the antigen with the fluid to determine the degree of latex aggregation. This is a method for detecting or quantifying an antigen by measuring (for example, see Patent Document 1).
このラテックス凝集法によれば、検体として添加された抗原が複数のラテックス結合抗体を架橋させ、ラテックスの凝集を促す。このように手順が単純であるから、簡便且つ迅速に抗原を検出できる。しかし、抗原が微量の場合、その架橋が起こりにくいため、ラテックスが十分に凝集しない。このため、微量の抗原を検出することが困難であった。 According to this latex agglutination method, an antigen added as a specimen crosslinks a plurality of latex-bound antibodies to promote latex agglutination. Since the procedure is simple as described above, the antigen can be detected easily and rapidly. However, when the antigen is in a trace amount, the crosslinking is difficult to occur, so that the latex does not sufficiently aggregate. For this reason, it was difficult to detect a trace amount of antigen.
そこで、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法といった酵素基質反応を利用する方法も広く利用されている。これらの方法では、例えば、抗原に特異的に結合する一次抗体を抗原に結合させ、この一次抗体に酵素を有する二次抗体を結合させる。ここで、酵素の基質を添加し、酵素が触媒する反応の程度を測定することで、抗原を検出又は定量する。 Therefore, methods utilizing enzyme substrate reactions such as ELISA and CLEIA are also widely used. In these methods, for example, a primary antibody that specifically binds to an antigen is bound to the antigen, and a secondary antibody having an enzyme is bound to the primary antibody. Here, the antigen is detected or quantified by adding the enzyme substrate and measuring the degree of reaction catalyzed by the enzyme.
しかし、酵素基質反応を利用する方法では、二次抗体や発光試薬等の特殊な試薬が多数必須であり、作業コストが高い。また、発光試薬の退色（ブリーチング現象）を抑制する必要から、測定工程を極めて短時間に終了せざるを得ないため、測定精度が不充分になることが懸念される。一方、この方法は、試料及び各試薬をインキュベーションする工程、系を洗浄する工程、発光を測定する工程等の多段階からなっており、操作が煩雑である。しかも、各段階に要する時間が極めて長く、大規模処理には適さない。 However, in the method using the enzyme substrate reaction, a large number of special reagents such as secondary antibodies and luminescent reagents are essential, and the operation cost is high. Moreover, since it is necessary to suppress discoloration (bleaching phenomenon) of the luminescent reagent, the measurement process must be completed in a very short time, and there is a concern that the measurement accuracy may be insufficient. On the other hand, this method consists of multiple steps such as a step of incubating the sample and each reagent, a step of washing the system, and a step of measuring luminescence, and the operation is complicated. Moreover, the time required for each stage is extremely long, and is not suitable for large-scale processing.
そこで、本発明者らは、刺激応答性ポリマーを含有する物質と検出対象に対する抗体とが結合した第１の結合物、並びに有電荷又は親水性の物質と検出対象に対する別の抗体とが結合した第２の結合物を用いた、検出対象の検出及び定量技術を開発した（特許文献２及び３参照）。この技術は、上記２種類の結合物と検体とを混合した混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下においた後、濁度測定等によって刺激応答性ポリマーの凝集の程度が低下したと判定された場合には、検体中に検出対象が存在すると判別するものである。 Therefore, the present inventors have bound a first binding substance in which a substance containing a stimulus-responsive polymer and an antibody against the detection target are bound, and a charged or hydrophilic substance bound to another antibody against the detection target. The detection and quantification technique of the detection object using the 2nd conjugate | bonded_body was developed (refer patent document 2 and 3). In this technique, it was determined that the degree of aggregation of the stimuli-responsive polymer was reduced by measuring the turbidity after placing the mixture of the above-mentioned two kinds of conjugates and the specimen under conditions where the stimuli-responsive polymer aggregated. If it is detected, it is determined that the detection target exists in the sample.
この技術によれば、刺激応答性ポリマーを含有する物質、抗体、及び有電荷又は親水性の物質のみを用いて達成され、特殊な試薬を特に使用することなく行われるので、安価且つ簡便である。また、凝集阻害の程度を測定するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速に行うことができる。 According to this technique, it is achieved using only a substance containing a stimulus-responsive polymer, an antibody, and a charged or hydrophilic substance, and is performed without using any special reagent, so that it is inexpensive and simple. . Moreover, since it is only a measure of the degree of aggregation inhibition and is not a system that utilizes a reaction catalyzed by an enzyme, it can be carried out rapidly.
ところで、特許文献２及び３に記載される技術には、検出及び定量の感度を更に向上する余地があり得る。 By the way, the techniques described in Patent Documents 2 and 3 may have room for further improving the sensitivity of detection and quantification.
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、安価、簡便且つ高感度に検出対象を検出及び定量することができるキット及び方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a kit and a method capable of detecting and quantifying a detection target at low cost, simply and with high sensitivity.
本発明者らは、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子が、検出対象が存在しなかった際、刺激応答性物質に巻き込まれて凝集することを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下のものを提供する。 The present inventors have found that solid particles that present a hydrophobic portion on the surface and can be suspended in water are entangled and aggregated in a stimulus-responsive substance when there is no target to be detected. It came to complete. Specifically, the present invention provides the following.
（１） 検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、を備えるキット。
(1) A kit for detecting and / or quantifying a detection target,
A first bound substance in which a first substance containing a stimulus-responsive substance and a first affinity substance for the detection target are bound, and a solid particle capable of presenting a hydrophobic portion on the surface and suspending in water And a kit comprising:
（２） 親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物を更に備える（１）記載のキット。 (2) The kit according to (1), further comprising a second bound substance in which a second substance having a hydrophilic or charged portion and a second affinity substance for the detection target are bound.
（３） 第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有する（１）又は（２）記載のキット。 (3) The kit according to (1) or (2), wherein the first substance contains a particulate magnetic substance.
（４） 検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する条件下におき、前記刺激応答性物質の分散又はそれと相関する事象の有無を判定する工程を含む方法。
(4) A method for detecting a detection target in a sample,
A first bound substance in which a first substance containing a stimulus-responsive substance and a first affinity substance for the detection target are bound, and a solid particle capable of presenting a hydrophobic portion on the surface and suspending in water And the specimen, and the mixture is subjected to a condition in which the stimulus-responsive substance aggregates, and the presence or absence of an event correlated with the dispersion of the stimulus-responsive substance is determined.
（５） 検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度又はそれと相関するパラメータを測定し、前記検出対象の量と濁度又は前記パラメータとの前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
(5) A method for quantifying a detection target in a sample,
A first bound substance in which a first substance containing a stimulus-responsive substance and a first affinity substance for the detection target are bound, and a solid particle capable of presenting a hydrophobic portion on the surface and suspending in water And the specimen, and put the mixture under a predetermined condition in which the stimulus-responsive substance aggregates,
Measure the turbidity of the mixture or a parameter correlated therewith, and calculate the amount of the detection target in the sample based on a correlation equation under the predetermined condition between the amount of the detection target and the turbidity or the parameter Including methods.
（６） 親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物を更に混合し、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる（４）又は（５）記載の方法。
(6) A second binding substance in which a second substance having a hydrophilic or charged portion and a second affinity substance for the detection target are further mixed, and
The method according to (4) or (5), wherein the first affinity substance and the second affinity substance can simultaneously bind to the detection target at different sites of the detection target.
（７） 第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、前記条件においた後の前記混合物に磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む（４）から（６）いずれか記載の方法。
(7) The first substance contains a particulate magnetic substance,
The method according to any one of (4) to (6), wherein the method further includes separating the agglomerated magnetic substance by applying a magnetic force to the mixture after being subjected to the conditions.
本発明によれば、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子が、検出対象が存在しない場合には、刺激応答性物質に巻き込まれて凝集し、水中から除去される一方、検出対象が存在する場合には、刺激応答性物質の凝集が阻害されるため、水中に分散し続ける。これにより、検出対象の存否間での濁度の差が広がるため、高感度に検出対象を検出及び定量することができる。 According to the present invention, solid particles that present a hydrophobic portion on the surface and can be suspended in water are aggregated by being entrapped and stimulated by a stimulus-responsive substance when there is no detection target. On the other hand, when the detection target is present, the aggregation of the stimulus-responsive substance is inhibited, so that it continues to be dispersed in water. Thereby, since the difference in turbidity between the presence or absence of a detection target spreads, a detection target can be detected and quantified with high sensitivity.
しかも、以上の手順は、いずれも特殊な試薬を特に使用することなく行うことができ、また酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、安価、簡便、迅速に検出対象の検出又は定量を行うことができる。 In addition, any of the above procedures can be performed without using any special reagent, and since it is not a system that utilizes a reaction catalyzed by an enzyme, detection or quantification of a detection target is inexpensive, simple, and rapid. It can be performed.
以下、本発明の一実施形態について、図面を参照しながら説明する。 Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings.
＜キット＞
本発明のキットは、検出対象を検出又は定量するためのキットであって、第１の結合物と、第２の結合物とを含有する。各構成について、以下詳細に説明する。
<Kit>
The kit of the present invention is a kit for detecting or quantifying a detection target, and contains a first bound substance and a second bound substance. Each configuration will be described in detail below.
〔第１の結合物〕
第１の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と、検出対象に対する第１の親和性物質とが結合したものである。
[First combined product]
The first binding substance is a combination of the first substance containing the stimulus-responsive polymer and the first affinity substance for the detection target.
（第１の物質）
本発明で用いられる第１の物質は刺激応答性物質を含有する物質であり、この刺激応答性物質は、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できる物質である。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加（ｐＨの変化）、電場変化等が挙げられる。
(First substance)
The first substance used in the present invention is a substance containing a stimulus-responsive substance, and this stimulus-responsive substance causes a structural change in response to an external stimulus and can adjust aggregation and dispersion. . Examples of the stimulus include, but are not limited to, temperature change, light irradiation, acid or base addition (pH change), electric field change, and the like.
本発明では、刺激応答性物質は、温度変化によって凝集及び分散可能な温度応答性ポリマーであることが好ましい。なお、温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度（以下、ＵＣＳＴとも称する）を有するポリマーが挙げられる。 In the present invention, the stimulus-responsive substance is preferably a temperature-responsive polymer that can be aggregated and dispersed by temperature change. Examples of the temperature-responsive polymer include a polymer having a lower critical solution temperature (hereinafter also referred to as LCST) and a polymer having an upper critical solution temperature (hereinafter also referred to as UCST).
本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。 As the polymer having the lower critical solution temperature used in the present invention, Nn-propylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-ethylacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-acryloylpyrrolidine, N-acryloylpiperidine, N -N substitution such as acryloylmorpholine, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-ethylmethacrylamide, N, N-dimethylmethacrylamide, N-methacryloylpyrrolidine, N-methacryloylpiperidine, N-methacryloylmorpholine Polymer consisting of (meth) acrylamide derivative; hydroxypropyl cellulose, polyvinyl alcohol partially acetylated product, polyvinyl methyl ether, (polyoxyethylene-polyoxypropy N) block copolymers, polyoxyethylene alkylamine derivatives such as polyoxyethylene laurylamine; polyoxyethylene sorbitan ester derivatives such as polyoxyethylene sorbitan laurate; (polyoxyethylene nonylphenyl ether) acrylate, (polyoxyethylene octylphenyl) (Polyoxyethylene alkylphenyl ether) (meth) acrylates such as ether) methacrylate; and (polyoxyethylene alkyl ether) (meth) acrylate such as (polyoxyethylene lauryl ether) acrylate and (polyoxyethylene oleyl ether) methacrylate And other polyoxyethylene (meth) acrylic acid ester derivatives. Furthermore, copolymers comprising these polymers and at least two of these monomers can also be used. A copolymer of N-isopropylacrylamide and Nt-butylacrylamide can also be used. When a polymer containing a (meth) acrylamide derivative is used, another copolymerizable monomer may be copolymerized with the polymer within a range having a lower critical solution temperature. In the present invention, among others, Nn-propylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-ethylacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-acryloylpyrrolidine, N-acryloylpiperidine, N-acryloylmorpholine, Nn- From at least one monomer selected from the group consisting of propylmethacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-ethylmethacrylamide, N, N-dimethylmethacrylamide, N-methacryloylpyrrolidine, N-methacryloylpiperidine, N-methacryloylmorpholine Or a copolymer of N-isopropylacrylamide and Nt-butylacrylamide can be preferably used.
本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。 As the polymer having the upper critical solution temperature used in the present invention, a polymer comprising at least one monomer selected from the group consisting of acryloylglycinamide, acryloylnipecotamide, acryloyl asparagine amide, acryloyl glutamine amide and the like can be used. Moreover, the copolymer which consists of these at least 2 types of monomers may be sufficient. These polymers include other copolymerizable monomers such as acrylamide, acetylacrylamide, biotinol acrylate, N-biotinyl-N′-methacryloyl trimethylene amide, acryloyl sarcosine amide, methacryl sarcosine amide, acryloylmethyl uracil, etc. May be copolymerized within the range having the upper critical solution temperature.
また、本発明では、刺激応答性物質として、ｐＨ変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性ポリマーが利用できる。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における第１の結合物、第２の結合物、及び検体の変性等による検出・定量精度の低下を抑制できる点で、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。 In the present invention, as the stimulus-responsive substance, a pH-responsive polymer that can be aggregated and dispersed by pH change can be used. The pH at which the pH-responsive polymer undergoes a structural change is not particularly limited, but it can suppress a decrease in detection and quantification accuracy due to denaturation of the first bound substance, the second bound substance, and the specimen when stimulating. , PH 4 to 10 is preferable, and pH 5 to 9 is more preferable.
このようなｐＨ応答性ポリマーとしては、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが例示できる。より具体的には、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。 Examples of such pH-responsive polymers include polymers containing groups such as carboxyl, phosphoric acid, sulfonyl, and amino as functional groups. More specifically, (meth) acrylic acid, maleic acid, styrene sulfonic acid, 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid, phosphorylethyl (meth) acrylate, aminoethyl methacrylate, aminopropyl (meth) acrylamide, dimethylamino A monomer having a dissociating group such as propyl (meth) acrylamide may be polymerized, and the monomer having such a dissociating group and other vinyl monomers such as methyl (meta ) (Meth) acrylates such as acrylate, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, vinyl esters such as vinyl acetate and vinyl propionate, vinyl compounds such as styrene, vinyl chloride, N-vinylpyrrolidone, (Meth) acrylic And a de and the like or it may be copolymerized.
（微粒子状の磁性物質）
ここで用いる微粒子状の磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。この多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５−８２５３８公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。このような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質（磁性微粒子）は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満であることが好ましい。
(Particulate magnetic material)
The particulate magnetic material used here may be composed of polyhydric alcohol and magnetite. The polyhydric alcohol is not particularly limited as long as it is an alcohol structure having at least two hydroxyl groups in the structural unit and capable of binding to iron ions, and examples thereof include dextran, polyvinyl alcohol, mannitol, sorbitol, and cyclodextrin. It is done. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-82538 discloses a method for producing a particulate magnetic material using dextran. Moreover, the compound which has an epoxy like a glycidyl methacrylate polymer and forms a polyhydric alcohol structure after ring-opening can also be used. The fine particle magnetic material (magnetic fine particles) prepared using such a polyhydric alcohol preferably has an average particle size of 0.9 nm or more and less than 1000 nm so as to have good dispersibility. The average particle size is preferably 2.9 nm or more and less than 200 nm, in particular, in order to increase the detection sensitivity of the target detection target.
（第１の親和性物質）
第１の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
(First affinity substance)
The first affinity substance may be, for example, a monoclonal antibody that recognizes different antigenic determinants to be detected. The antibody used herein may be any type of immunoglobulin molecule, and may be an immunoglobulin molecule fragment having an antigen binding site such as Fab. The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
［第１の結合物の作製］
第１の結合物は、第１の物質と第１の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第１の物質側（例えば刺激応答性物質部分）及び第１の親和性物質（例えば、第１の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第１の物質及び第１の親和性物質を結合させる。
[Preparation of first bonded product]
The first binding substance is prepared by binding the first substance and the first affinity substance. This binding method is not particularly limited. For example, substances having affinity for each other on both the first substance side (for example, stimulus-responsive substance part) and the first affinity substance (for example, first antibody) side. (For example, avidin and biotin, glutathione and glutathione S-transferase) are bound, and the first substance and the first affinity substance are bound via these substances.
具体的には、刺激応答性物質へのビオチンの結合は、国際公開ＷＯ０１／００９１４１に記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行うことができる。また、第１の親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従って行うことができる。次に、ビオチン結合刺激応答性物質及びアビジン結合第１の親和性物質を混合すると、アビジンとビオチンとの結合を介して、第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーが結合する。 Specifically, as described in International Publication WO01 / 009141, biotin is bound to a stimulus-responsive substance by adding biotin or the like to a polymerizable functional group such as methacryl or acryl to form an addition polymerizable monomer. It can be carried out by copolymerizing with other monomers. The binding of avidin or the like to the first affinity substance can be performed according to a conventional method. Next, when the biotin-binding stimulus-responsive substance and the avidin-bonded first affinity substance are mixed, the first affinity substance and the stimulus-responsive polymer are bound via the bond between avidin and biotin.
別法として、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知の方法に従って抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ）をポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に第１の抗体を結合させることにより、刺激応答性物質と、検出対象の抗原に対する第１の抗体との第１の結合物が作製される。 Alternatively, a monomer having a functional group such as carboxyl, amino or epoxy is copolymerized with another monomer during the production of the polymer, and through this functional group, an antibody affinity substance (for example, according to methods well known in the art) A method of binding melon gel, protein A, protein G) to a polymer can be used. By binding the first antibody to the antibody affinity substance thus obtained, a first binding product of the stimulus-responsive substance and the first antibody against the antigen to be detected is produced.
あるいは、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を有するモノマーを他のモノマーと共重合させ、これらの官能基に検出対象の抗原に対する第１の抗体を常法に従って直接結合させてもよい。 Alternatively, a monomer having a functional group such as carboxyl, amino, or epoxy may be copolymerized with another monomer during the production of the polymer, and the first antibody against the antigen to be detected may be directly bonded to these functional groups according to a conventional method. Good.
あるいは、微粒子状の磁性物質に第１の親和性物質及び刺激応答性物質を結合させてもよい。 Alternatively, the first affinity substance and the stimulus-responsive substance may be bound to the particulate magnetic substance.
第１の物質を刺激応答性ポリマーが凝集する条件においた後、遠心分離によって分離することで、第１の結合物を精製してもよい。第１の結合物の精製は、刺激応答性ポリマーに微粒子状の磁性物質を結合させ、更に第１の親和性物質を結合させた後、刺激応答性ポリマーが凝集する条件におき、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。 The first conjugate may be purified by placing the first substance under conditions where the stimulus-responsive polymer aggregates and then separating by centrifugation. For purification of the first bound substance, a magnetic substance in the form of fine particles is bound to the stimulus-responsive polymer, and after the first affinity substance is further bound, the magnetic force is applied under the condition that the stimulus-responsive polymer aggregates. Then, the magnetic material may be recovered by a method.
微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。 The fine magnetic substance can be bonded to the stimulus-responsive polymer via a reactive functional group, or a polymerizable unsaturated bond is introduced into the active hydrogen or polyhydric alcohol on the polyhydric alcohol in the magnetic substance. The graft polymerization may be carried out by a method known in the art such as graft polymerization (for example, ADV.Polym.Sci., Vol.4, p111, 1965, J. Polymer Sci., Part-A, 3, p1031). 1965).
〔固体粒子〕
本発明で用いられる固体粒子は、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能なものである。懸濁可能なことで、濁度等の本発明で測定されるパラメータに影響を与える（測定光を吸光又は散乱させる）ことができる。水中で表面に疎水性部分が提示されることで、凝集の間に凝集体に巻き込まれることができ、また後述の凝集体の磁石への吸着の間にも巻き込まれることができる。なお、懸濁可能性は、固体粒子の比重、粒子径等を適宜調節することで付与することができる。
[Solid particles]
The solid particles used in the present invention are capable of presenting and suspending hydrophobic portions on the surface in water. Being suspendable can affect parameters measured by the present invention such as turbidity (absorb or scatter measurement light). By presenting the hydrophobic portion on the surface in water, it can be caught in the aggregate during aggregation, and can also be caught during the adsorption of the aggregate to the magnet described later. The suspendability can be imparted by appropriately adjusting the specific gravity, particle diameter and the like of the solid particles.
これに対し、ミセル等は、水中に懸濁可能ではある一方、表面に親水性部分のみが提示されており、結果的に凝集体に巻き込まれにくい。これは、刺激応答性物質の凝集が、近傍に配置された親水性又は有電荷の部分を避け、疎水性部分が集まるように刺激応答性物質が構造変化するためによるため、疎水性部分を表面に提示しない固体粒子が、刺激応答性物質が有する疎水性部分に近接しにくく、結果的に凝集体に巻き込まれにくいと推測される。 On the other hand, micelles and the like can be suspended in water, but only a hydrophilic portion is presented on the surface, and as a result, it is difficult to be caught in an aggregate. This is because the aggregation of the stimuli-responsive substance is due to the structural change of the stimuli-responsive substance so that the hydrophobic part is gathered while avoiding the hydrophilic or charged parts arranged in the vicinity. It is presumed that solid particles that are not presented in (1) are unlikely to be close to the hydrophobic portion of the stimulus-responsive substance, and as a result are not easily caught in the aggregate.
このような固体粒子の構成成分としては、カーボンブラック、疎水性有機微粒子（アマイドワックス、ポリエチレン、ポリプロピレン、変性ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルエステル、架橋シリコーン樹脂又はフッ素樹脂からなる微粒子等）、親水性微粒子を疎水化した微粒子（親水性微粒子を親油性化合物又は疎水性微粒子で表面改質をした微粒子）等、疎水性シリカ等が挙げられる。 The constituents of such solid particles include carbon black, hydrophobic organic fine particles (amide wax, polyethylene, polypropylene, modified polyethylene, polystyrene, polymethacrylic acid methyl ester, cross-linked silicone resin or fluororesin fine particles), hydrophilic Hydrophobic fine particles (hydrophilic fine particles or fine particles obtained by surface modification with lipophilic compounds or hydrophobic fine particles), hydrophobic silica, and the like.
なお、従来のラテックス凝集法などで用いられてきたラテックス粒子は、表面に検出対象に対する抗体を有しており、この抗体を介して検出対象に多数のラテックス粒子が結合し、凝集する作用が利用されている。これに対し、本発明で用いられる固体粒子は、検出対象に結合させるためではなく、凝集体への巻き込みのために用いられる。このため、本発明の固体粒子は、検出対象に選択的に結合するものではなく、具体的には検出対象に対する親和性物質（抗体）が結合されていない。また、本発明の固体粒子は、それ自身の磁性により磁石に吸着させるために用いるものではないため、非磁性成分で構成されてよく、常磁性を有する必要がない（ただし反磁性は有しないことが好ましい）。また、本発明の固体粒子は、検出対象に元来含まれ得る夾雑物（タンパク質、天然繊維等の天然成分）とは区別される。 The latex particles used in conventional latex agglutination methods have antibodies against the detection target on the surface, and the action of aggregating and binding a large number of latex particles to the detection target via this antibody is utilized. Has been. On the other hand, the solid particles used in the present invention are used not for binding to the detection target but for involving the aggregate. For this reason, the solid particles of the present invention do not selectively bind to the detection target, and specifically, an affinity substance (antibody) for the detection target is not bound. Further, since the solid particles of the present invention are not used for adsorbing to a magnet by their own magnetism, they may be composed of nonmagnetic components and do not need to have paramagnetism (but do not have diamagnetism). Is preferred). In addition, the solid particles of the present invention are distinguished from impurities (natural components such as proteins and natural fibers) that can be originally included in the detection target.
本発明の固体粒子の粒径は、大きすぎると、懸濁性を下げる傾向を有する一方、小さすぎると、濁度等のパラメータに与える影響（つまり検出及び定量の感度）を下げる傾向を有する。この観点で固体粒子の平均粒子径は適宜選択されてよく、例えば、０．１０〜０１．０μｍであってよく、０．３〜０．７μｍであってよい。 When the particle size of the solid particles of the present invention is too large, the suspension tends to lower the suspendability, while when too small, the influence on parameters such as turbidity (that is, sensitivity of detection and quantification) tends to decrease. From this viewpoint, the average particle diameter of the solid particles may be appropriately selected, and may be, for example, 0.10 to 01.0 μm, or 0.3 to 0.7 μm.
〔第２の結合物〕
本発明の方法では、第１の結合物に加えて、親水性又は有電荷の部分を有する第２の物質と、検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物を用いることが好ましい。これにより、検出感度を向上することができる。なお、第２の結合物を用いなくても、検出対象が有する親水性又は有電荷の部分が刺激応答性物質に接近するため、刺激応答性物質の凝集阻害効果をある程度得ることはできる。
[Second combined product]
In the method of the present invention, in addition to the first bound substance, a second bound substance in which a second substance having a hydrophilic or charged portion and a second affinity substance for the detection target are bound is used. It is preferable. Thereby, detection sensitivity can be improved. Even if the second binding substance is not used, the hydrophilic or charged portion of the detection target approaches the stimulus-responsive substance, and therefore, the aggregation-inhibiting effect of the stimulus-responsive substance can be obtained to some extent.
（第２の物質）
第２の物質は、例えば電荷を有する高分子化合物であり、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボキシルを含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン（カルボキシル）やポリカチオン（アミノ）の官能基数は、２５個以上が好ましい。また、カルボキシル基を持つラテックス粒子等も挙げられる。
(Second substance)
The second substance is, for example, a polymer compound having a charge, and is preferably a polyanion or a polycation. The polyanion means a substance having a plurality of anion groups, and the polycation means a substance having a plurality of cation groups. Examples of polyanions include nucleic acids such as DNA and RNA. These nucleic acids have the properties of polyanions due to the presence of a plurality of phosphodiester groups along the nucleic acid urn. The polyanion includes a polymer containing a large number of carboxyl-containing polypeptides (polypeptides consisting of amino acids such as glutamic acid and aspartic acid), polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polysulfonic acid, and acrylic acid or methacrylic acid as a polymerization component. Also included are polysaccharides such as carboxymethylcellulose, hyaluronic acid, and heparin. On the other hand, examples of the polycation include polylysine, polyarginine, polyornithine, polyalkylamine, polyethyleneimine, and polypropylethyleneimine. The number of functional groups of the polyanion (carboxyl) or polycation (amino) is preferably 25 or more. In addition, latex particles having a carboxyl group are also exemplified.
また、第２の物質は、例えば水溶性の高分子化合物であり、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等のエーテル結合を含有する高分子、ポリビニルアルコール等のアルコール性水酸基を含有する高分子、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性多糖類、中性アミノ酸を含むポリペプチド等が挙げられる。 The second substance is, for example, a water-soluble polymer compound, a polymer containing an ether bond such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyethylene oxide, or polypropylene oxide, or a high polymer containing an alcoholic hydroxyl group such as polyvinyl alcohol. Examples include molecules, water-soluble polysaccharides such as dextran, cyclodextrin, agarose and hydroxypropylcellulose, polypeptides containing neutral amino acids, and the like.
これらの物質は、高分子鎖の中又は末端に、第２の親和性物質を結合させるための官能基等を有していてもよい。また、第２の物質は、一種単独で利用しても、複数を混合して利用してもよい。 These substances may have a functional group or the like for binding the second affinity substance in the polymer chain or at the terminal. Further, the second substance may be used alone or in combination.
（第２の親和性物質）
第２の親和性物質は、第１の親和性物質とは異なる部位において、第１の親和性物質と同じ検出対象に結合できるものである。第１の親和性物質及び第２の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。
(Second affinity substance)
The second affinity substance is capable of binding to the same detection target as the first affinity substance at a site different from the first affinity substance. The first affinity substance and the second affinity substance may be, for example, monoclonal antibodies that recognize different antigenic determinants to be detected.
［作製方法］
第２の結合物は、第２の物質と第２の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第２の物質側及び第２の親和性物質（例えば、第２の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第２の物質及び第２の親和性物質を間接的に結合させる。
[Production method]
The second binding substance is created by directly or indirectly binding the second substance and the second affinity substance. Although not particularly limited, for example, substances that are compatible with each other (for example, avidin and biotin, glutathione, and glutathione S-transferase) on both the second substance side and the second affinity substance (eg, second antibody) side. And the second substance and the second affinity substance are indirectly bound via these substances.
第２の物質と第２の親和性物質とを直接的に結合させる場合、官能基を介して結合させてもよく、例えば、官能基を用いる場合、ゴッシュらの方法（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、 １、 ７１−７６、１９９０）のマレイミド−チオールカップリングに従って結合できる。具体的には、以下の２つの方法が挙げられる。 When the second substance and the second affinity substance are directly bonded, they may be bonded via a functional group. For example, when a functional group is used, the method of Gosh et al .: Bioconjugate Chem., 1, 71-76, 1990). Specifically, there are the following two methods.
第１の方法では、まず、核酸の５’末端にメルカプト基（別名、スルフヒドリル基）を導入する一方、抗体に６−マレイミドヘキサノイックアシッドスクシンイミドエステル（例えば、「ＥＭＣＳ（商品名）」（（株）同仁化学研究所製））を反応させてマレイミド基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。 In the first method, a mercapto group (also called a sulfhydryl group) is first introduced into the 5 ′ end of a nucleic acid, while a 6-maleimidohexanoic acid succinimide ester (for example, “EMCS (trade name)” (( The maleimide group is introduced by reacting Dojindo Laboratories Co., Ltd.)). Next, these two substances are bonded through a mercapto group and a maleimide group.
第２の方法では、まず、第１の方法と同様にして核酸の５’末端にメルカプト基を導入し、このメルカプト基に更にホモ二官能性試薬であるＮ，Ｎ−１，２−フェニレンジマレイミドと反応させることによって核酸の５’末端にマレイミド基を導入する一方、抗体にメルカプト基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。 In the second method, first, a mercapto group is introduced into the 5 ′ end of the nucleic acid in the same manner as in the first method, and N, N-1,2-phenylenedioxide, which is a homobifunctional reagent, is further introduced into this mercapto group. By reacting with maleimide, a maleimide group is introduced at the 5 ′ end of the nucleic acid, while a mercapto group is introduced into the antibody. Next, these two substances are bonded through a mercapto group and a maleimide group.
この他に、核酸をタンパク質に導入する方法としては、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１５巻５２７５頁（１９８７年）及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１６巻３６７１頁（１９８８年）に記載された方法が知られている。これらの技術は核酸と抗体の結合に応用できる。 In addition, as a method for introducing a nucleic acid into a protein, for example, the methods described in Nucleic Acids Research Vol. 15 5275 (1987) and Nucleic Acids Research Vol. 16 3671 (1988) are known. Yes. These techniques can be applied to the binding of nucleic acids and antibodies.
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１６巻３６７１頁（１９８８年）によると、まず、オリゴヌクレオチドを、シスタミン、カルボジイミド及び１−メチルイミダゾールと反応させることによって、オリゴヌクレオチドの５’末端の水酸基にメルカプト基を導入する。メルカプト基を導入したオリゴヌクレオチドを精製した後、ジチオトレイトールを用いて還元し、この後に２、２’−ジピリジルジスルフィドを加えることによってオリゴヌクレオチドの５’末端にジスルフィド結合を介してピリジル基を導入する。一方、タンパク質に対しては、イミノチアレンを反応させてメルカプト基を導入しておく。これらピリジルジスルフィドを導入したオリゴヌクレオチドとメルカプト基を導入したタンパク質を混合し、ピリジル基とメルカプト基を特異的に反応させてタンパク質とオリゴヌクレオチドを結合させる。 According to Nucleic Acids Research 16: 3671 (1988), a mercapto group is first introduced into the 5'-terminal hydroxyl group of an oligonucleotide by reacting the oligonucleotide with cystamine, carbodiimide and 1-methylimidazole. After purifying the oligonucleotide with a mercapto group introduced, it is reduced with dithiothreitol, followed by the addition of 2,2'-dipyridyl disulfide to introduce a pyridyl group via a disulfide bond at the 5 'end of the oligonucleotide. To do. On the other hand, for a protein, a mercapto group is introduced by reacting iminothalylene. The oligonucleotide into which the pyridyl disulfide is introduced and the protein into which the mercapto group is introduced are mixed, and the protein and the oligonucleotide are bound by specifically reacting the pyridyl group and the mercapto group.
Ｎｕｌｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ 第１５巻５２７５頁（１９８７年）によると、まず、オリゴヌクレオチドの３’末端にアミノ基を導入しておき、ホモ二官能性試薬であるジチオ−ビス−プロピオニックアシッド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（略称：ジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ）を反応させる。反応後、ジチオトレイトールを添加することによりジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ分子中のジスルフィド結合を還元して、オリゴヌクレオチドの３’末端にメルカプト基を導入する。タンパク質の処理については、特開平５−４８１００号公報に示すようなヘテロ二官能性架橋剤が用いられる。まず、タンパク質中の官能基（例えば、アミノ基）と反応しうる第１の反応性基（スクシンイミド）、及びメルカプト基と反応しうる第２の反応性基（例えば、マレイミド等）を有するヘテロ二官能性架橋剤と、タンパク質を反応させることにより、タンパク質に第２の反応性基を導入し、予め活性化されたタンパク試薬とする。このようにして得られたタンパク試薬をチオール化ポリヌクレオチドのメルカプト基へ共有結合させる。 According to Nucleic Acids Research Vol. 15, page 5275 (1987), first, an amino group was introduced into the 3 ′ end of the oligonucleotide, and a dithio-bis-propionic acid-N-, which is a homobifunctional reagent. Hydroxysuccinimide ester (abbreviation: dithio-bis-propionyl-NHS) is reacted. After the reaction, dithiothreitol is added to reduce the disulfide bond in the dithio-bis-propionyl-NHS molecule and introduce a mercapto group at the 3 'end of the oligonucleotide. For protein treatment, a heterobifunctional cross-linking agent as shown in JP-A-5-48100 is used. First, a heterobicycle having a first reactive group (succinimide) that can react with a functional group (for example, an amino group) in a protein and a second reactive group (for example, maleimide) that can react with a mercapto group. By reacting the protein with a functional cross-linking agent, a second reactive group is introduced into the protein to obtain a protein reagent activated in advance. The protein reagent thus obtained is covalently bound to the mercapto group of the thiolated polynucleotide.
核酸以外のポリアニオンやポリカチオンを使用する場合にも、これらの末端等にメルカプト基を導入することで、上記と同様の操作で第２の結合物を作製できる。 Even when a polyanion or polycation other than a nucleic acid is used, a second bound product can be produced by the same operation as described above by introducing a mercapto group at the terminal or the like.
＜検出方法＞
以上の結合物（少なくとも第１の結合物を含む）、固体粒子、及び検体の混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におくと、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが検出対象の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する。一方、検出対象が存在しない場合には、刺激応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。
<Detection method>
When the mixture of the above conjugate (including at least the first conjugate), the solid particles, and the specimen is subjected to a condition in which the stimulus responsive polymer aggregates, the stimulus responsive polymer is obtained when the detection target exists. Aggregation is inhibited by the charged portion or hydrophilic portion to be detected and dispersed. On the other hand, when there is no detection target, the stimulus-responsive polymer aggregates without being inhibited from aggregation.
第１の結合物、第２の結合物、固体粒子、及び検体は、すべてを同時に混合してもよく、１種ずつを別々に混合してもよい。また、第２の結合物の使用が必須でないことは前述のとおりである。 The first binding substance, the second binding substance, the solid particles, and the specimen may be mixed all at the same time, or may be mixed separately one by one. In addition, as described above, it is not essential to use the second combined product.
固体粒子の使用量は、過小であると、検出及び定量感度の向上が不十分になり得る一方、過大であると、分散する固体粒子により増加する濁度等が、測定機器（例えば分光光度計）の検出上限を超え、検出対象の定量性が失われるおそれがある。固体粒子の使用量は、このような観点で適宜設定されてよい。 If the amount of solid particles used is too small, improvement in detection and quantification sensitivity may be insufficient. On the other hand, if the amount used is too large, turbidity and the like increased due to dispersed solid particles may be measured by a measuring instrument (eg, a spectrophotometer ) Exceeds the detection limit, and the quantitative property of the detection target may be lost. The amount of solid particles used may be set as appropriate from this viewpoint.
この現象を、図１〜図２を参照しながら説明する。 This phenomenon will be described with reference to FIGS.
図１に示されるように、第１の結合物１０は刺激応答性ポリマー１１を含有し、この刺激応答性ポリマー１１はアビジン１５及びビオチン１７を介して検出対象５０に対する第１の抗体１３に結合されている。また、第１の結合物１０は微粒子状の磁性物質１９を含み、この磁性物質１９の表面に第１の物質としての刺激応答性ポリマー１１が結合されている。一方、第２の結合物２０では、検出対象５０に対する第２の抗体２３と、第２の物質２１とが結合されている。そして、第１の抗体１３及び第２の抗体２３は、検出対象５０の異なる部位に結合できることから、同じ検出対象５０に結合できる。第２の結合物２０は検出対象５０と刺激応答性ポリマー１１とを介して磁性物質１９に接近でき、このとき第２の物質２１が磁性物質１９の近傍に位置することになる。この段階で、固体粒子３０は、水中に懸濁されて分散しており、検出対象５０に少なくとも選択的には結合していない。
As shown in FIG. 1, the
図２に示されるように、第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物を所定条件下におくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が第２の結合物２０中の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する（図２（Ａ））。一方、検出対象５０が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（（図２（Ｂ））。このとき、固体粒子３０は、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が分散するため、水中に分散し続ける（図２（Ａ））一方、検出対象５０が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１の凝集体に巻き込まれ、分散する固体粒子３０が減る（（図２（Ｂ））。なお、本実施形態では、第２の結合物２０の電荷部分又は親水性部分が磁性物質１９の近傍に位置する構成としたが、これに限られず、検出対象の電荷部分又は親水性部分が磁性物質１９の近傍に位置する構成であってもよい。
As shown in FIG. 2, when the mixture of the first binding
刺激応答性ポリマー１１を凝集させるためには、例えば温度応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器を温度応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せばよい。温度応答性ポリマーには、上限臨界溶液温度（以下「ＵＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーと、下限臨界溶液温度（以下「ＬＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーの２種類がある。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を３７℃以上の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を５℃未満の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。
In order to agglomerate the stimulus-
また、ＬＣＳＴは、温度応答性ポリマーの周囲の塩濃度の増加に伴って低下することが知られている。このため、ある温度で温度応答性ポリマーが分散している溶液に、所定濃度の塩（例えば、ＮａＣｌ）を添加することにより、一定温度下で温度応答性ポリマーを凝集させることも可能である。 LCST is known to decrease with increasing salt concentration around the temperature-responsive polymer. For this reason, it is also possible to agglomerate the temperature-responsive polymer at a constant temperature by adding a salt (for example, NaCl) having a predetermined concentration to a solution in which the temperature-responsive polymer is dispersed at a certain temperature.
本発明で用いられる塩としては、硫酸リチウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム等の硫酸塩；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化バリウム、等のハロゲン化物；硝酸マグネシウム、硝酸カルシウム等の硝酸塩；チオシアン化カリウム等のチオシアン酸塩；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸塩；ホウ酸塩；リン酸塩等が挙げられる。これらの塩は、単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、酢酸ナトリウム等のモノカルボン酸のナトリウム塩、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、イミノ二酢酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、又は、酒石酸ナトリウム等のジカルボン酸のナトリウム塩、クエン酸二ナトリウム等のトリカルボン酸のナトリウム塩、エチレンジアミン４酢酸二ナトリウム等のテトラカルボン酸のナトリウム塩等の有機酸塩等が挙げられ、これらのカリウム塩等の有機酸塩等も利用できる。これらの塩は、単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 Examples of the salt used in the present invention include lithium sulfate, sodium sulfate, potassium sulfate, magnesium sulfate, ammonium sulfate and the like; halides such as sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, barium chloride; magnesium nitrate, Nitrates such as calcium nitrate; thiocyanates such as potassium thiocyanate; carbonates such as sodium carbonate and potassium carbonate; borate salts; phosphates and the like. These salts can be used alone or in combination of two or more. In addition, sodium salt of monocarboxylic acid such as sodium acetate, sodium aspartate, sodium glutamate, sodium iminodiacetate, sodium maleate, sodium malonate, sodium oxalate, disodium succinate, or dicarboxylic acid such as sodium tartrate Organic salts such as sodium salt of tricarboxylic acid such as disodium citrate, sodium salt of tetracarboxylic acid such as disodium ethylenediaminetetraacetate, etc. Available. These salts can be used alone or in combination of two or more.
温度応答性ポリマーを凝集させるためには、例えば、所望の塩濃度となるように塩の水溶液を添加すればよい。温度応答性ポリマーを凝集させるための塩の必要添加量は、塩の種類、水溶液の温度、温度応答性ポリマーの種類、温度応答性ポリマーの濃度によって異なるが、水溶液中終濃度で概ね５０ｍＭ〜５Ｍ、好ましくは１００〜１０００ｍＭの範囲である。 In order to agglomerate the temperature-responsive polymer, for example, an aqueous salt solution may be added so as to obtain a desired salt concentration. The necessary amount of salt to aggregate the temperature-responsive polymer varies depending on the type of salt, the temperature of the aqueous solution, the type of the temperature-responsive polymer, and the concentration of the temperature-responsive polymer, but the final concentration in the aqueous solution is generally 50 mM to 5 M. The range is preferably 100 to 1000 mM.
また、ｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器に酸溶液又はアルカリ溶液を加えればよい。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲の外にある分散混合液の入った容器に、酸溶液又はアルカリ溶液を加え、容器内をｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲に変更すればよい。例えば、ｐＨ５以下で凝集、ｐＨ５超で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ５超で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが５以下になるように酸溶液を加えればよい。また、ｐＨ１０以上で凝集、ｐＨ１０未満で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ１０未満で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが１０以上になるようにアルカリ溶液を加えればよい。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。具体的には、多数のカルボキシルを含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ヘパリン等の多糖類、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミン及びポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。
Moreover, what is necessary is just to add an acid solution or an alkaline solution to the container containing a liquid mixture, when using a pH-responsive polymer. Specifically, an acid solution or an alkali solution is added to a container containing a dispersion mixture outside the pH range where the pH-responsive polymer causes a structural change, and the pH-responsive polymer causes a structural change inside the container. Change to the range. For example, when a pH-responsive polymer that aggregates at pH 5 or lower and disperses at pH 5 or higher is used, an acid solution may be added to a container containing a mixed solution that is dispersed at pH 5 or higher so that the pH is 5 or lower. . In addition, when a pH-responsive polymer that aggregates at
また、光応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器にポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。凝集させるための好ましい光は、光応答性ポリマーに含まれる光応答性官能基の種類及び構造により異なるが、一般に波長１９０〜８００ｎｍの紫外光又は可視光が好適に使用できる。このとき、強度は０．１〜１０００ｍＷ／ｃｍ２が好ましい。なお、光応答性ポリマーは、測定精度を向上できる点で、濁度の測定に用いられる光が照射された際、分散を生じにくいもの、換言すれば凝集するものであることが好ましい。光応答性ポリマーとして、濁度の測定に用いられる光が照射された際に分散を生じるものを用いる場合、照射時間を短縮することで測定精度を向上できる。具体的には、アゾベンゼン、スピロベンゾピラン及びスピロベンゾチオピラン等の光応答性の官能基を含有するポリマー等が挙げられる。 In addition, when a photoresponsive polymer is used, light having a wavelength capable of aggregating the polymer may be irradiated to a container containing the mixed solution. The preferred light for aggregation varies depending on the type and structure of the photoresponsive functional group contained in the photoresponsive polymer, but generally ultraviolet light or visible light having a wavelength of 190 to 800 nm can be suitably used. At this time, the strength is preferably 0.1 to 1000 mW / cm 2 . In addition, it is preferable that a photoresponsive polymer is a thing which is hard to produce dispersion | distribution in other words, when it is irradiated with the light used for a turbidity measurement in the point which can improve a measurement precision. When using a photoresponsive polymer that generates dispersion when irradiated with light used for turbidity measurement, the measurement accuracy can be improved by shortening the irradiation time. Specific examples include polymers containing photoresponsive functional groups such as azobenzene, spirobenzopyran, and spirobenzothiopyran.
かかる条件下に第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物をおくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が第２の結合物２０中の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する（図２（Ａ））。一方、検出対象５０が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（（図２（Ｂ））。このとき、刺激応答性ポリマー１１の凝集体に固体粒子３０が巻き込まれ、分散する固体粒子３０が減ることは、前述のとおりである。
When the mixture of the first binding
なお、温度応答性ポリマーの凝集は、第１の結合物及び第２の結合物と検出対象との結合後に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮できる点で後者が好ましい。 The aggregation of the temperature-responsive polymer may be performed after the first bound substance and the second bound substance are bound to the detection target, or may be performed in parallel, but the processing time can be shortened. And the latter is preferred.
ここで、下限臨界溶液温度は、次のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。 Here, the lower critical solution temperature is determined as follows. First, a sample is put into a cell of an absorptiometer and the sample is heated at a rate of 1 ° C./min. During this time, the change in transmittance at 550 nm is recorded. Here, when the transmittance when the polymer is transparently dissolved is 100% and when the transmittance when the polymer is completely aggregated is 0%, the temperature at which the transmittance is 50% is obtained as LCST.
また、上限臨界溶液温度は、次のように決定する。１℃／分の速度で試料を冷却し、下限臨界溶液温度の場合と同様に５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＵＣＳＴとして求める。 The upper critical solution temperature is determined as follows. The sample is cooled at a rate of 1 ° C./min and the change in transmittance at 550 nm is recorded as in the case of the lower critical solution temperature. Here, when the transmittance when the polymer is transparently dissolved is 100% and the transmittance when the polymer is completely aggregated is 0%, the temperature at which the transmittance is 50% is obtained as UCST.
（判定）
分散の有無の判定は、例えば目視又は濁度測定で行うことができる。濁度は光散乱装置での光透過率から算出でき、濁度が低ければ刺激応答性ポリマーの凝集が阻害されており、検出物質の存在が示唆される。ここで、使用する光の波長は、磁性物質の粒径等に応じ所望の検出感度が得られるよう適宜設定されてよい。光の波長は、従来汎用の装置を利用できる点で、可視光の範囲内（例えば、５５０ｎｍ）であることが好ましい。
(Judgment)
Determination of the presence or absence of dispersion can be performed, for example, by visual observation or turbidity measurement. The turbidity can be calculated from the light transmittance of the light scattering device. If the turbidity is low, aggregation of the stimulus-responsive polymer is inhibited, which indicates the presence of the detection substance. Here, the wavelength of the light to be used may be appropriately set so as to obtain a desired detection sensitivity according to the particle size of the magnetic substance. The wavelength of light is preferably within the range of visible light (for example, 550 nm) in that a conventional general-purpose device can be used.
目視又は濁度測定は、一定の時点で断続的に行ってもよいし、経時的に連続して行ってもよい。また、ある時点における濁度測定値と、他の時点における濁度測定値との差に基づいて判定を行ってもよい。 Visual observation or turbidity measurement may be performed intermittently at a certain point in time or continuously over time. Further, the determination may be made based on the difference between the turbidity measurement value at a certain time point and the turbidity measurement value at another time point.
刺激応答性物質の分散又はそれと相関する事象は、特に限定されず、展開担体に展開したときの信号（薄層クロマトグラフィー）等であってよい。 The dispersion of the stimulus-responsive substance or the event correlated therewith is not particularly limited, and may be a signal (thin layer chromatography) when developed on a development carrier.
展開担体に展開したときの信号に基づく検出方法は、ＷＯ２０１０／１３７５３２号パンフレットに開示されている。具体的には、刺激応答性物質の凝集条件においた混合物を展開担体に展開させる、又は展開中の混合物を刺激応答性物質の凝集条件におき、展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号を確認し、信号が、前記検出対象の非存在下と異なる場合には、検体中に検出対象が存在すると判別する工程を含む。この方法は、適宜選択された展開担体において、刺激応答性物質が凝集すると、展開しにくくなるという相関性を利用するものである。 A detection method based on signals when deployed on a development carrier is disclosed in WO2010 / 137532. Specifically, the mixture in the aggregation condition of the stimulus-responsive substance is developed on the development carrier, or the mixture under development is placed in the aggregation condition of the stimulus-responsive substance, and the first binding substance or the second substance in the development carrier is placed. The method includes a step of confirming a signal due to the presence of the binding substance and determining that the detection target is present in the sample when the signal is different from that in the absence of the detection target. This method utilizes the correlation that when a stimulus-responsive substance aggregates in an appropriately selected development carrier, the development becomes difficult.
この方法では、固体粒子として、有色又は発色・蛍光性のものを用いることが好ましい。これにより、分散する固体粒子の量が多いと、展開担体中に展開中の物質の存在を示すブロードなバンドの色が濃くなる。また、固体粒子が凝集体に巻き込まれると、凝集体の存在を示すナローなバンドの色が濃くなる。 In this method, it is preferable to use colored or colored / fluorescent particles as solid particles. As a result, when the amount of solid particles dispersed is large, the color of a broad band indicating the presence of the substance being developed in the development carrier becomes dark. Further, when the solid particles are caught in the aggregate, the color of the narrow band indicating the presence of the aggregate becomes dark.
＜定量方法＞
本発明の定量方法によれば、まず、第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におく、次に、混合物の濁度又はそれと相関するパラメータを測定し、検出対象の量と濁度又は上記パラメータとの所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。前半部分の手順は前述した検出方法と類似するので、説明を省略する。
<Quantitative method>
According to the quantification method of the present invention, first, the first binding substance, the second binding substance, and the specimen are mixed, and the mixture is subjected to a predetermined condition in which the stimulus-responsive polymer aggregates. The amount of the detection target or the parameter correlated therewith is measured, and the amount of the detection target in the sample is calculated based on a correlation equation under a predetermined condition between the amount of the detection target and the turbidity or the parameter. Since the procedure of the first half is similar to the detection method described above, the description is omitted.
（相関式）
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と濁度又はそれと相関するパラメータとの相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と濁度又はパラメータとの測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、２点以上の検出対象の量に関するものであればよく、３点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。
(Correlation formula)
A correlation equation is created between the amount of the detection target and the turbidity or a parameter correlated therewith under the same condition as the predetermined condition. In the measurement of the amount of the detection target and the turbidity or parameter constituting the correlation formula, the more reliable the data, the more reliable the correlation formula is obtained. Therefore, the data may be related to the amount of the detection target of two or more points, and is preferably related to the amount of the detection target of three or more points.
ここで、検出対象の量と濁度との相関式は、検出対象の量と濁度との直接的な相関を示す式のみならず、検出対象の量と濁度を反映するパラメータとの相関式であってもよい。 Here, the correlation equation between the amount of detection target and turbidity is not only an equation showing a direct correlation between the amount of detection target and turbidity, but also the correlation between the amount of detection target and a parameter reflecting turbidity. It may be a formula.
（算出）
混合物の濁度測定値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。
(Calculation)
By substituting the turbidity measurement value of the mixture into the created correlation equation, the amount of the detection target in the sample can be calculated.
濁度と相関するパラメータとしては、特に限定されず、展開担体に展開したときの信号強度（薄層クロマトグラフィー）、磁性物質を含む第１の物質を用いた場合には磁界の強さ等であってよい。 The parameter correlating with the turbidity is not particularly limited, and is based on the signal intensity when developed on a development carrier (thin layer chromatography), the strength of the magnetic field when using a first substance containing a magnetic substance, etc. It may be.
展開担体に展開したときの信号に基づく定量方法は、ＷＯ２０１０／１３７５３２号パンフレットに開示されている。具体的には、展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、検出対象の量と信号強度との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する工程が含まれる。この方法は、適宜選択された展開担体において、刺激応答性物質が凝集すると、展開しにくくなるという相関性を利用するものである。この方法では、固体粒子として、有色又は発色・蛍光性のものを用いることが好ましい。 A quantification method based on a signal when developed on a development carrier is disclosed in WO2010 / 137532. Specifically, the intensity of the signal due to the presence of the first binding substance or the second binding substance in the development carrier is measured, and based on a correlation equation under a predetermined condition between the amount of the detection target and the signal intensity, A step of calculating the amount of the detection target in the sample is included. This method utilizes the correlation that when a stimulus-responsive substance aggregates in an appropriately selected development carrier, the development becomes difficult. In this method, it is preferable to use colored or colored / fluorescent particles as solid particles.
（分離）
第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有する場合、本発明の検出方法又は定量方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことが好ましい。これによって、凝集した磁性物質が、非凝集状態の磁性物質を含む夾雑物から分離される。このため、分離した磁性物質の量、溶媒に分散した際の光透過率等の測定値は、夾雑物の影響が除外され、検出物質の存在をより忠実に反映したものとなる。
(Separation)
When the first substance contains a particulate magnetic substance, it is preferable that the detection method or quantification method of the present invention further includes separating the aggregated magnetic substance by applying a magnetic force. Thereby, the agglomerated magnetic substance is separated from impurities including the non-aggregated magnetic substance. For this reason, the measurement values such as the amount of the separated magnetic substance and the light transmittance when dispersed in the solvent exclude the influence of foreign substances and more accurately reflect the presence of the detection substance.
本発明では、水中に分散していた固体粒子が、磁性物質が凝集すると、凝集した磁性物質に巻き込まれつつ磁石へと吸着される（凝集時に巻き込まれなかった固体粒子の一部がさらに、凝集体が磁石に吸着される間に巻き込まれる）一方、磁性物質が凝集しない場合、磁石には実質的に吸着されず、水中に分散し続ける。これにより、検出対象の存否間での濁度の差が更に広がるため、高感度に検出対象を検出及び定量することができる。 In the present invention, solid particles dispersed in water are adsorbed to a magnet while being engulfed in the agglomerated magnetic material when the magnetic material is agglomerated (some solid particles that have not been entrained during aggregation are further agglomerated. On the other hand, if the magnetic substance does not aggregate, the magnet is not substantially adsorbed and continues to be dispersed in water. Thereby, since the difference in turbidity between the presence or absence of a detection target further spreads, the detection target can be detected and quantified with high sensitivity.
磁力の付加は磁性物質に磁石を接近させて行うことができる。この磁石の磁力は、用いる磁性物質が有する磁力の大きさによって異なる。磁石としては、例えばマグナ社製ネオジ磁石が挙げられる。 The magnetic force can be applied by bringing a magnet close to the magnetic substance. The magnetic force of this magnet varies depending on the magnitude of the magnetic force of the magnetic substance used. An example of the magnet is a neodymium magnet manufactured by Magna.
また、磁力の付加は、判定の前又は判定と同時並行して行ってよいが、工程に費やされる時間を短縮化できる点で同時並行が好ましい。なお、磁力を付加すると、凝集した磁性物質は夾雑物を巻き込んで分離されるため、分離後における混合物の濁度は、夾雑物が存在していた場合の方がむしろ小さくなるものと推測される。 Further, the addition of magnetic force may be performed before the determination or in parallel with the determination. However, the simultaneous parallel is preferable in that the time spent for the process can be shortened. It should be noted that when magnetic force is applied, the aggregated magnetic substance is separated by inclusion of impurities, so the turbidity of the mixture after separation is presumed to be rather smaller when the impurities are present. .
なお、検出方法又は定量方法における「濁度測定」には、濁度を直接的に測定することのみならず、濁度を反映するパラメータを測定することも包含される。かかるパラメータとしては、複数時点での濁度測定値の差異、分離された凝集物量、分離後の非凝集物の濁度等が挙げられる。ここで、複数時点のうちの１点は、例えば、検出対象が非存在である陰性対照に磁力を付加した際、濁度が最大値となる時点近傍であることが好ましい。これにより、別の時点での濁度測定値との差異が大きくなり、検出対象の量をより正確に定量できることになる。 The “turbidity measurement” in the detection method or the quantitative method includes not only measuring the turbidity directly but also measuring a parameter reflecting the turbidity. Such parameters include differences in turbidity measurement values at multiple time points, the amount of separated aggregates, the turbidity of non-aggregates after separation, and the like. Here, it is preferable that one point of the plurality of time points is in the vicinity of the time point at which the turbidity becomes a maximum value when a magnetic force is applied to the negative control in which the detection target is absent. Thereby, the difference from the turbidity measurement value at another time point becomes large, and the amount of the detection target can be quantified more accurately.
（検出対象）
検体中の検出対象としては、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン（フィブリン及びそれらの分解産物）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン（例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン等）、薬剤等が挙げられる。
(Detection target)
Examples of the detection target in the sample include substances used for clinical diagnosis. Specifically, human immunoglobulin G, human immunoglobulin M, human immunoglobulin A contained in body fluid, urine, sputum, feces, etc. Human immunoglobulin E, human albumin, human fibrinogen (fibrin and their degradation products), α-fetoprotein (AFP), C-reactive protein (CRP), myoglobin, carcinoembryonic antigen, hepatitis virus antigen, human chorionic gonadotropin ( hCG), human placental lactogen (HPL), HIV viral antigen, allergen, bacterial toxin, bacterial antigen, enzyme, hormone (eg, human thyroid stimulating hormone (TSH), insulin, etc.), drug, and the like.
＜実施例１＞
本実施例では、第１の結合物として抗ＴＳＨβ抗体結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を、第２の結合物として抗ＴＳＨα抗体結合ポリエチレングリコールを用いて、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を検出する例を示す。
<Example 1>
In this example, anti-TSHβ antibody binding-temperature-responsive polymer surface-modified magnetic particles are used as the first conjugate, and anti-TSHα antibody-conjugated polyethylene glycol is used as the second conjugate, and human thyroid stimulating hormone (TSH) is used. An example of detection will be shown.
（第１の結合物の調製）
Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製の抗ヒトＴＳＨβ抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｅｔａ、クローン：１９５マウス、クラス：マウスＩｇＧ）を、サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃａｔ Ｎｏ.２１４２５）を用いてビオチン化し、ビオチン化抗ヒトＴＳＨβ抗体を調製した。
(Preparation of first conjugate)
Leinco Technologies, Inc. Anti-human TSHβ antibody (Anti-Human Thyroid Stimulating Hormone Beta, clone: 195 mouse, class: mouse IgG) manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. using sulfo-NHS-Biotinylation kit (Cat No. 21425) And biotinylated to prepare a biotinylated anti-human TSHβ antibody.
ストレプトアビジン結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子として、ＪＮＣ（株）製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ（登録商標） ＬＳＡ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（３０）０．４質量％、２５０μＬを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、更にＰＢＳバッファーに溶解したビオチン化抗ヒトＴＳＨβ抗体５０μＬ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を加え、４℃で１５分間転倒混和した。前記マイクロチューブを３７℃に加熱した後、前記磁性粒子を磁石で回収し、上清部分を除去した。ここにＰＢＳバッファー２５０μＬを加え、冷却して、前記磁性粒子を分散させた。再度マイクロチューブを３７℃に加熱した後、前記磁性粒子を磁石で回収し、上清部分を除去することで、抗ヒトＴＳＨβ抗体化温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を調製した。 Streptavidin binding-temperature-responsive polymer surface-modified magnetic particles, Therma-Max (registered trademark) LSA Streptavidin (30) 0.4 mass%, 250 μL, manufactured by JNC Co., Ltd., was taken in a 1.5 mL microtube, and 50 μL (0.75 mg / mL) of a biotinylated anti-human TSHβ antibody dissolved in PBS buffer was added and mixed by inversion at 4 ° C. for 15 minutes. After the microtube was heated to 37 ° C., the magnetic particles were collected with a magnet and the supernatant was removed. To this, 250 μL of PBS buffer was added and cooled to disperse the magnetic particles. After the microtube was heated again to 37 ° C., the magnetic particles were collected with a magnet, and the supernatant was removed to prepare anti-human TSHβ antibody-modified temperature-responsive polymer surface-modified magnetic particles.
この抗ヒトＴＳＨβ抗体化温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を含むチューブに、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）５００μＬを加え、冷却することで分散させ、第１の結合物の分散溶液を調製した。 In a tube containing this anti-human TSHβ antibody-modified temperature-responsive polymer surface-modified magnetic particle, 0.5% (w / v) BSA (manufactured by Sigma), 0.5% (w / v) Tween (registered trademark) 20 500 μL of PBS buffer (pH 7.4) containing 10 mM EDTA was added and dispersed by cooling to prepare a dispersion solution of the first conjugate.
（第２の結合物の調製）
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第２の親和性物質としての抗ヒトＴＳＨα抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ａｌｐｈａ、クローン：１７６マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製、１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬに２−メルカプトエタノール６ｍｇを加え、３７℃で１２０分間反応させた。反応後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商品名） 透析カセット、１０Ｋ ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）により、ＰＢＳバッファー５００ｍＬに対して透析を行って、過剰の２−メルカプトエタノールを除き、限界排除分子量１００００の限外濾過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製［Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０ｋ］）を用いて０．５ｍＬに濃縮し、マウス抗ヒトＴＳＨα抗体の還元抗体を得た。この還元抗体０．５ｍＬと、１００μＬマレイミド化ポリエチレングリコール（「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−４００ＭＡ」、日油社製）とを４℃で１晩反応させ、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００ １０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてゲル濾過することで、標識抗体を調製した。この標識抗体（この抗体は、ポリエチレングリコール−抗ヒトＴＳＨα抗体結合物ともいう。）を、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）でタンパク質濃度２．５μｇ／ｍＬになるように希釈することで、第２の結合物を調製した。
(Preparation of second conjugate)
First, an anti-human TSHα antibody (Anti-Human Thyroid Stimulating Home Alpha, clone: 176 mouse, mouse IgG, manufactured by Leinco Technology, Inc., as a second affinity substance for human thyroid stimulating hormone (TSH) as a detection target, 6 mg of 2-mercaptoethanol was added to 1 mL of 1 mg / mL) and reacted at 37 ° C. for 120 minutes. After the reaction, dialysis is performed against 500 mL of PBS buffer using a Slide-A-Lyzer (trade name) dialysis cassette and 10K MWCO (Pierce) to remove excess 2-mercaptoethanol and ultrafiltration with a limit exclusion molecular weight of 10,000. Using a membrane (MILLIPORE [Amicon Ultra-4 Ultracel 10k]), it was concentrated to 0.5 mL to obtain a reduced antibody of a mouse anti-human TSHα antibody. 0.5 mL of this reduced antibody and 100 μL of maleimidated polyethylene glycol (“SUNBRIGHT ME-400MA”, manufactured by NOF Corporation) are reacted overnight at 4 ° C., followed by Superdex-200 10 / 300GL (manufactured by GE Healthcare). ) Was used for gel filtration to prepare a labeled antibody. This labeled antibody (this antibody is also referred to as a polyethylene glycol-anti-human TSHα antibody conjugate), 0.5% (w / v) BSA (manufactured by Sigma), 0.5% (w / v) Tween ( A second conjugate was prepared by diluting to a protein concentration of 2.5 μg / mL with PBS buffer (pH 7.4) containing 20, 10 mM EDTA.
（固体粒子）
固体粒子として、ポリスチレン系ラテックス粒子であるＪＳＲライフサイエンス社製「Ｉｍｍｕｔｅｘ Ｐ２３１２」（１０％、平均粒子径０．４９５μｍ）を用い、この濃度が１％、０．５％になるよう、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した。
(Solid particles)
As solid particles, “Immutex P2312” (10%, average particle size 0.495 μm) manufactured by JSR Life Sciences, which is a polystyrene-based latex particle, was used, and a PBS buffer ( Diluted with pH 7.4).
（検体の調製）
ＴＳＨ；Ａｓｐｅｎ Ｂｉｏ Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．製ヒト甲状腺刺激ホルモン（活性８．５ＩＵ／ｍｇ、ＷＨＯ８０／５５８）の溶液（濃度３０μｇ／ｍＬ）を、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティクス社製「ビトロス（登録商標） ＴＳＨ キャリブレータ１」で、０．００１５μＩＵ／Ｌ、１５．３００μＩＵ／Ｌ、１５３．００μＩＵ／Ｌとなるよう希釈した。なお、ヒト甲状腺刺激ホルモン活性を含有しない（０．００００μＩＵ／Ｌ）ことを除き、同様の手順で調製したものも調製した。
(Sample preparation)
TSH; Aspen Bio Pharma, Inc. A solution (
［定量］
図３に示されるように、汎用の分光光度計用セミミクロセル７１の光路外に、寸法５ｍｍ×９ｍｍ×２ｍｍのネオジム永久磁石７３（西興産業社製）を取り付けた。このセル７１を、セル温度制御機が設けられた可視紫外分光光度計「ＵＶ−３１０１ＰＣ」（島津製作所製）内に設置し、３７℃のもと１０分間以上保持した。
[Quantitative]
As shown in FIG. 3, a neodymium permanent magnet 73 (manufactured by Seiko Sangyo Co., Ltd.) having a size of 5 mm × 9 mm × 2 mm was attached outside the optical path of a general-purpose spectrophotometer
（混合）
第１の結合物の分散溶液４００μＬ及び第２の結合物の分散溶液４００μＬをマイクロチューブ内に注ぎ、ボルテックスミキサーで１秒間撹拌した。ここに、各試料９０μＬを添加し、ボルテックスミキサーで６０秒間撹拌した後、固体粒子の分散液１０μＬを添加し、固体粒子濃度を０．００％（ＰＢＳバッファーのみ添加）、０．００５％、０．０１％にした。
(mixture)
400 μL of the first binding substance dispersion solution and 400 μL of the second binding substance dispersion solution were poured into a microtube, and stirred for 1 second with a vortex mixer. 90 μL of each sample was added thereto, and after stirring for 60 seconds with a vortex mixer, 10 μL of a dispersion of solid particles was added, and the solid particle concentration was 0.00% (only PBS buffer was added), 0.005%, 0 .01%.
（濁度の測定）
この撹拌液をセル７１内に分注し、分光光度計に添付の使用説明書に従ってゼロ補正し、波長４２０ｎｍの光を用いて、直ちにスリット幅３．０ｎｍで３００秒間にわたって連続して測定した。この結果を図４に示す。
(Measurement of turbidity)
This stirring solution was dispensed into the
図４に示されるように、ＴＳＨの量が多い程、濁度が高かった。これは、温度応答性ポリマーがＴＳＨを介して、親水性の部分を有するラテックス粒子に近接することによって、凝集阻害を受け、磁石に吸着されずに分散し続けたためである。 As shown in FIG. 4, the greater the amount of TSH, the higher the turbidity. This is because the temperature-responsive polymer is subjected to aggregation inhibition due to the proximity of latex particles having a hydrophilic portion via TSH, and continues to be dispersed without being adsorbed by the magnet.
次に、各試料について、測定開始５０秒後及び３００秒後の２点での測定値の差異を表した。この結果を表１及び図５に示す。 Next, for each sample, the difference in measured values at two points after 50 seconds and 300 seconds after the start of measurement was shown. The results are shown in Table 1 and FIG.
表１及び図５に示されるように、測定開始５０秒後及び３００秒後の２点間の測定値の差は、ＴＳＨの量に依存するものであった。すなわち抗ＣＣＰ抗体濃度が上がるにつれ、測定開始５０秒後及び３００秒後の２点間の測定値の差は大きくなった。これにより、測定開始５０秒後及び３００秒後の２点間の測定値の差を測定することで、検出物質を検出できることがわかった。また、ＴＳＨの量と測定値の差との相関式を作成することで、定量も可能である。
As shown in Table 1 and FIG. 5, the difference in the measured values between the two points after 50 seconds and 300 seconds after the start of measurement depended on the amount of TSH. That is, as the anti-CCP antibody concentration increased, the difference in the measured value between the two points after 50 seconds and 300 seconds after the start of measurement increased. Thereby, it turned out that a detection substance can be detected by measuring the difference of the measured value between two
しかし、中でも固体粒子を用いた例では、用いなかった例に比べ、いずれのＴＳＨ量においても測定値の差異が大きかった。これにより、固体粒子が、検出及び定量の感度を増加できることが確認された。なお、ＷＯ２００９／０８４５９６号パンフレットの段落００９０〜００９２、図６等に示されるように、乳び検体に含まれる固体粒子であるミセルは、刺激応答性物質の凝集の有無にかかわらず、水中に分散し続けるため、検出及び定量の感度増加には利用できないことが知られている。これらの事実から、本発明で用い得る固体粒子は、懸濁可能であるだけでは足りず、水中で表面に疎水性部分を提示することが必要であることもわかった。 However, in the example using solid particles, the difference in the measured values was larger in any TSH amount than in the example not using it. Thereby, it was confirmed that the solid particles can increase the sensitivity of detection and quantification. As shown in paragraphs 0090 to 0092 of the pamphlet of WO2009 / 084596, FIG. 6 and the like, the micelles that are solid particles contained in the chyle specimen are dispersed in water regardless of the presence or absence of aggregation of the stimulus-responsive substance. Therefore, it is known that it cannot be used for increasing sensitivity of detection and quantification. From these facts, it has also been found that the solid particles that can be used in the present invention need not be suspendable but need to present a hydrophobic portion on the surface in water.
本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。また、本発明では刺激応答性ポリマーを必須に用いるが、ポリマーに限られず、刺激応答性の低分子を用いてもよい。かかる低分子としては、例えば、特許第３６９３９７９号公報、特許第３９１６３３０号公報、特開２００２−８５９５７号公報、特許第４０７１７３８号公報、特許第２８６９６８４号公報、特許第２９２７６０１号公報、特許第３８４５２４９号公報、特開２００６−２４２５９７号公報等に開示される低分子が挙げられる。 The present invention is not limited to the above-described embodiment, and modifications, improvements, and the like within the scope that can achieve the object of the present invention are included in the present invention. Further, in the present invention, a stimulus-responsive polymer is essential, but the polymer is not limited to a polymer, and a stimulus-responsive low molecule may be used. Examples of such small molecules include Japanese Patent No. 3693979, Japanese Patent No. 3916330, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-85957, Japanese Patent No. 4071738, Japanese Patent No. 2869684, Japanese Patent No. 2927601, and Japanese Patent No. 3845249. Examples thereof include small molecules disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 2006-242597.
１０ 第１の結合物
１１ 刺激応答性物質
１３ 第１の抗体（第１の親和性物質）
１５ アビジン
１７ ビオチン
１９ 磁性物質
２０ 第２の結合物
２１ 第２の物質
２３ 第２の抗体（第２の親和性物質）
３０ 固体粒子
５０ 検出対象
10 first bound
15
30
Claims (7)
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、を備えるキット。 A kit for detecting and / or quantifying a detection target,
A first bound substance in which a first substance containing a stimulus-responsive substance and a first affinity substance for the detection target are bound, and a solid particle capable of presenting a hydrophobic portion on the surface and suspending in water And a kit comprising:
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する条件下におき、前記刺激応答性物質の分散又はそれと相関する事象の有無を判定する工程を含む方法。 A method for detecting a detection target in a sample,
A first bound substance in which a first substance containing a stimulus-responsive substance and a first affinity substance for the detection target are bound, and a solid particle capable of presenting a hydrophobic portion on the surface and suspending in water And the specimen, and the mixture is subjected to a condition in which the stimulus-responsive substance aggregates, and the presence or absence of an event correlated with the dispersion of the stimulus-responsive substance is determined.
刺激応答性物質を含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、水中で表面に疎水性部分を提示しかつ懸濁可能な固体粒子と、前記検体とを混合し、この混合物を前記刺激応答性物質が凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度又はそれと相関するパラメータを測定し、前記検出対象の量と濁度又は前記パラメータとの前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。 A method for quantifying a detection target in a sample,
A first bound substance in which a first substance containing a stimulus-responsive substance and a first affinity substance for the detection target are bound, and a solid particle capable of presenting a hydrophobic portion on the surface and suspending in water And the specimen, and put the mixture under a predetermined condition in which the stimulus-responsive substance aggregates,
Measure the turbidity of the mixture or a parameter correlated therewith, and calculate the amount of the detection target in the sample based on a correlation equation under the predetermined condition between the amount of the detection target and the turbidity or the parameter Including methods.
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる請求項４又は５記載の方法。 Further mixing a second binding substance in which a second substance having a hydrophilic or charged portion and a second affinity substance for the detection target are bound;
The method according to claim 4 or 5, wherein the first affinity substance and the second affinity substance can simultaneously bind to the detection target at different sites of the detection target.
前記方法は、前記条件においた後の前記混合物に磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む請求項４から６いずれか記載の方法。 The first substance contains a particulate magnetic substance;
The method according to any one of claims 4 to 6, wherein the method further includes separating the agglomerated magnetic substance by applying a magnetic force to the mixture after being subjected to the conditions.
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