JP2015015924A - PROBE FOR DETECTING SNP (rs8103142) - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、C型慢性肝炎に対する治療効果に関連のあるSNP（rs8103142）を検出するためのプローブ、組成物、及びキット、並びにrs8103142の検出方法等に関する。 The present invention relates to a probe, a composition and a kit for detecting SNP (rs8103142) associated with a therapeutic effect on chronic hepatitis C, a method for detecting rs8103142, and the like.
C型肝炎ウイルス（Hepatitis C Virus ;HCV）の感染者の70〜80％は、C型慢性肝炎に移行すると言われている。C型慢性肝炎は、さらに肝硬変や肝がんなどの重篤な疾患に移行することが知られている。 It is said that 70-80% of people infected with hepatitis C virus (HCV) are transferred to chronic hepatitis C. It is known that chronic hepatitis C is further transferred to serious diseases such as cirrhosis and liver cancer.
C型慢性肝炎に対する有効な治療法としては、ペグインターフェロン＋リバビリン（PEG-IFN/RBV）併用療法が知られている。ただ、この治療法の効果には、IL28B遺伝子周辺のSNP（例えば、rs8103142）によって、個人差があることが報告されている（非特許文献1、非特許文献2）。そこで、IL28B遺伝子周辺のSNPを効率的に検出する方法の開発が求められている。
As an effective treatment for chronic hepatitis C, pegylated interferon + ribavirin (PEG-IFN / RBV) combination therapy is known. However, it has been reported that there are individual differences in the effects of this treatment method due to SNPs around the IL28B gene (for example, rs8103142) (Non-patent
SNPの検出方法としては、例えば、シークエンス法、DigTag2法、タックマン法等が知られている（特許文献1、非特許文献3）。
Known SNP detection methods include, for example, a sequence method, a DigTag2 method, a Tuckman method, and the like (
シークエンス法は、一般的に検体となるヒト遺伝子を核酸増幅し、その増幅産物の配列を同定するという方法で行う。しかし、この方法では核酸増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる誤診が発生するという懸念がある。また、検査開始から結果判明までに数時間から1日の期間が必要である。 The sequencing method is generally performed by nucleic acid amplification of a human gene as a specimen and identifying the sequence of the amplified product. However, there is a concern that this method may cause misdiagnosis due to carry-over contamination of nucleic acid amplification products. In addition, a period of several hours to one day is required from the start of the test to the determination of the result.
一方、DigTag2法やタックマン法は、プローブを用いて簡便に検出できる方法であり、且つ核酸増幅と検出を同じ閉鎖系で行えばコンタミネーションを防ぐこともできる。しかしDigTag2法では、検出には2本以上のプローブが必要であり、コストがかかるという欠点がある。また、タックマン法では核酸プローブは1本だが、核酸プローブの片方の末端が蛍光で、もう片方の末端がクエンチャーで標識されている必要があり、2種類の標識によってコストがかかるという欠点がある。 On the other hand, the DigTag2 method and the Taqman method are methods that can be easily detected using a probe, and contamination can also be prevented by performing nucleic acid amplification and detection in the same closed system. However, the DigTag2 method has the disadvantage that more than two probes are required for detection, which is expensive. The Taqman method has one nucleic acid probe, but one end of the nucleic acid probe must be fluorescent and the other end must be labeled with a quencher. .
本発明は、特定のSNP（rs8103142）を簡便に、効率的に、且つ低コストで検出できるプローブ、及び該プローブを用いたrs8103142の検出方法を提供することを1つの目的とする。 An object of the present invention is to provide a probe that can detect a specific SNP (rs8103142) simply, efficiently, and at low cost, and a method for detecting rs8103142 using the probe.
融解温度解析によってSNPを検出する場合、標識がないか又は少なくとも1種類の標識を有する1本のプローブを用いて検出することができる。しかしながら、本発明者等は、研究を進めていく中で、プローブの配列次第では、融解温度解析による当該SNPの検出精度が著しく低いという問題を見出した。 When SNP is detected by melting temperature analysis, it can be detected using one probe that has no label or has at least one label. However, the inventors have found that the accuracy of detection of the SNP by melting temperature analysis is extremely low depending on the sequence of the probe.
さらに鋭意研究を進めた結果、本発明者等は、驚くべきことに、メジャータイプのrs8103142を有するセンス鎖のポリヌクレオチドをプローブとして用いても、rs8103142のタイプを明確に判別できないが、rs8103142を有するアンチセンス鎖のポリヌクレオチド、またはマイナータイプのrs8103142を有するセンス鎖のポリヌクレオチドをプローブとして用いると、融解温度解析による被検体のrs8103142の検出を、簡便に、効率的に、低コストで、且つ高精度にできることを見出した。さらに、このプローブと、遺伝子の特定領域に相補的な配列を有するプライマーセットを組み合わせると、被検体由来の核酸の増幅と、該核酸に対するプローブの融解温度解析を1つの反応系で行えることを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。 As a result of further diligent research, the present inventors have surprisingly found that the type of rs8103142 cannot be clearly identified even when a sense-strand polynucleotide having a major type of rs8103142 is used as a probe, but it has rs8103142. When the antisense strand polynucleotide or the sense strand polynucleotide having the minor type rs8103142 is used as a probe, the detection of the analyte rs8103142 by melting temperature analysis can be performed simply, efficiently, at low cost, and at high cost. I found out that it can be accurate. Furthermore, when this probe is combined with a primer set that has a sequence complementary to a specific region of a gene, it has been found that amplification of nucleic acid derived from an analyte and melting temperature analysis of the probe against the nucleic acid can be performed in one reaction system. It was. As a result of further research based on these findings, the present invention was completed.
即ち、代表的な本発明は以下を包含する。 That is, representative examples of the present invention include the following.
項１．
下記（A）又は（B）のポリヌクレオチドからなる、rs8103142を検出するためのプローブ：
（A）配列番号3で示される塩基配列中の、5’末端から23番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド、又は
（B）配列番号5または6で示される塩基配列中の、5’末端から17番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。
Probe for detecting rs8103142, comprising the following polynucleotide (A) or (B):
(A) a polynucleotide comprising any one of consecutive 14 to 28 bases including the 23rd base from the 5 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, or (B) SEQ ID NO: 5 or 6 A polynucleotide comprising any one of consecutive 14 to 28 bases, including the 17th base from the 5 ′ end in the base sequence shown.
項２．
前記ポリヌクレオチドの塩基数が16〜24塩基のいずれかである項1に記載のプローブ。
項３．
前記（A）のポリヌクレオチドの3’末端の塩基が、配列番号3で示される塩基配列における5’末端から34番目の塩基であり、前記（B）のポリヌクレオチドの3’末端の塩基が、配列番号5または6で示される塩基配列における5’末端から26〜28及び36〜39番目のいずれかの塩基である項1又は2に記載のプローブ。
The base at the 3 ′ end of the polynucleotide (A) is the 34th base from the 5 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the base at the 3 ′ end of the polynucleotide (B) is
項４．
配列番号7〜21、及び23〜108のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる、項1〜3のいずれかに記載のプローブ。
項５．
前記ポリヌクレオチドが標識されている項1〜4のいずれかに記載のプローブ。
項６．
前記標識が蛍光標識である項5に記載のプローブ。
Item 6.
Item 6. The probe according to
項７．
前記ポリヌクレオチドの5’末端及び／又は3’末端が標識されており、且つ標識された末端のヌクレオチドの塩基がシトシンである、項5又は6に記載のプローブ。
Item 7.
Item 7. The probe according to
項８．
下記（A）又は（B）のポリヌクレオチドを含む、被検体由来の核酸中の、rs8103142を検出するための組成物：
（A）配列番号3で示される塩基配列中の、5’末端から23番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド、又は
（B）配列番号5または6で示される塩基配列中の、5’末端から17番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。
A composition for detecting rs8103142 in a nucleic acid derived from a subject, comprising the following polynucleotide (A) or (B):
(A) a polynucleotide comprising any one of consecutive 14 to 28 bases including the 23rd base from the 5 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, or (B) SEQ ID NO: 5 or 6 A polynucleotide comprising any one of consecutive 14 to 28 bases, including the 17th base from the 5 ′ end in the base sequence shown.
項９．
被検体由来の核酸に対する前記（A）又は（B）のポリヌクレオチドの融解温度に基づいて前記SNPを検出するための、項8に記載の組成物。
項１０．
さらに、下記（C）のフォワードプライマー及び下記（D）のリバースプライマーからなる、rs8103142を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含む、項8又は9に記載の組成物：
（C）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から240番目〜270番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
（D）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から52番目〜81番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
(C) a forward primer consisting of any of continuous 20 to 30 bases in the base sequence consisting of the 240th to 270th bases from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (D) SEQ ID NO: 2 A reverse primer consisting of any one of 20 to 30 consecutive bases in the base sequence consisting of the 52nd to 81st bases from the 5 ′ end of the base sequence shown in FIG.
項１１．
下記工程2、3、及び4を含む、被検体由来の核酸中の、rs8103142を検出する方法：
（工程2）被検体由来の核酸に対する、項1〜8のいずれかに記載のプローブの融解温度を測定すること、
（工程3）工程2で測定された融解温度と、rs8103142のタイプが既知である核酸に対する前記プローブの融解温度とを比較すること、及び
（工程4）工程3の比較結果に基づいて該SNPを決定すること。
Item 11.
A method for detecting rs8103142 in a nucleic acid derived from a subject, comprising the
(Step 2) measuring the melting temperature of the probe according to any one of
(Step 3) comparing the melting temperature measured in
項１２．
さらに、下記工程1を含む項11に記載の方法：
（工程1）rs8103142を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを用いて、被検体の生体試料中の核酸を増幅して、被検体由来の核酸を得ること。
Item 12.
The method according to Item 11, further comprising the following step 1:
(Step 1) Amplifying a nucleic acid in a biological sample of a subject using a primer set for amplifying a nucleic acid containing rs8103142, to obtain a nucleic acid derived from the subject.
項１３．
前記プライマーセットが、下記（C）のフォワードプライマー及び下記（D）のリバースプライマーからなる、項12に記載の方法：
（C）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から240番目〜270番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
（D）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から52番目〜81番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
Item 13.
Item 13. The method according to Item 12, wherein the primer set comprises the following forward primer (C) and the reverse primer (D) below:
(C) a forward primer consisting of any of continuous 20 to 30 bases in the base sequence consisting of the 240th to 270th bases from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (D) SEQ ID NO: 2 A reverse primer consisting of any one of 20 to 30 consecutive bases in the base sequence consisting of the 52nd to 81st bases from the 5 ′ end of the base sequence shown in FIG.
項１４．
工程1及び工程2が1つの反応系で行われる、項13に記載の方法。
Item 14.
Item 14. The method according to Item 13, wherein
項１５．
項1〜7のいずれかに記載のプローブを含む、被検体由来の核酸中の、rs8103142を検出するためのキット。
A kit for detecting rs8103142 in a nucleic acid derived from a subject, comprising the probe according to any one of
項１６．
被検体由来の核酸に対する、項1〜7のいずれかに記載のプローブの融解温度に基づいて前記SNPを検出するための、項15に記載のキット。
Item 16.
Item 16. The kit according to
項１７．
さらに、rs8103142を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含む、項15又は16に記載のキット。
項１８．
前記プライマーセットが、下記（C）のフォワードプライマー及び下記（D）のリバースプライマーからなる、項17に記載の組成物：
（C）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から240番目〜270番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
（D）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から52番目〜81番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
(C) a forward primer consisting of any of continuous 20 to 30 bases in the base sequence consisting of the 240th to 270th bases from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (D) SEQ ID NO: 2 A reverse primer consisting of any one of 20 to 30 consecutive bases in the base sequence consisting of the 52nd to 81st bases from the 5 ′ end of the base sequence shown in FIG.
本発明によれば、被検体のrs8103142を、簡便に、効率的に、低コストで、且つ高精度で検出できるプローブ、及び被検体のrs8103142の検出方法を提供することができる。また、このプローブと特定のプライマーセットを組み合わせて、被検体由来の核酸の増幅と、該核酸に対するプローブの融解温度解析を1つの反応形で行うことにより、被検体のrs8103142の検出を、より簡便に且つ効率的に行うことができる。 According to the present invention, it is possible to provide a probe capable of detecting rs8103142 of a subject simply, efficiently, at low cost and with high accuracy, and a method for detecting rs8103142 of a subject. In addition, by combining this probe with a specific primer set, amplification of the nucleic acid derived from the analyte and analysis of the melting temperature of the probe against the nucleic acid in a single reaction form makes it easier to detect rs8103142 in the analyte. And can be performed efficiently.
１．プローブ
（A）又は（B）のポリヌクレオチドからなる、rs8103142を検出するためのプローブについて説明する。
1. A probe for detecting rs8103142 comprising the polynucleotide of probe (A) or (B) will be described.
rs8103142は、NCBI SNP Database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）において、登録番号rs8103142で登録されているSNPである。rs8103142は、IL28B遺伝子領域内に存在する多型であり、具体的にはIL28B遺伝子領域の一部の塩基配列を示す配列番号1の5’末端から389番目の塩基（Y）、または配列番号1に対して相補的な塩基配列を示す配列番号2の5’末端から201番目の塩基（R）の多型である。rs8103142は、YがTの場合（RがAの場合）がメジャータイプであり、YがCの場合（RがGの場合）がマイナータイプである。マイナータイプのrs8103142を染色体のどちらか一方、或いは両方に有する場合、C型慢性肝炎に対するPEG-IFN/RBV併用療法の有効性が低いことが知られている。 rs8103142 is an SNP registered under the registration number rs8103142 in the NCBI SNP Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/). rs8103142 is a polymorphism present in the IL28B gene region, specifically, the 389th base (Y) from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 1 showing the partial base sequence of the IL28B gene region, or SEQ ID NO: 1 Is a polymorphism of the 201st base (R) from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 2 showing a complementary base sequence to rs8103142 is a major type when Y is T (R is A) and a minor type when Y is C (R is G). It is known that when the minor type rs8103142 is present in one or both of the chromosomes, the effectiveness of the PEG-IFN / RBV combination therapy for chronic hepatitis C is low.
（A）のポリヌクレオチドは、マイナータイプのrs8103142を有するセンス鎖配列であり、配列番号3で示される塩基配列中の、5’末端から23番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチドである。（A）のポリヌクレオチドの塩基数の下限は、好ましくは15塩基であることができ、より好ましくは16塩基であることができる。（A）のポリヌクレオチドの塩基数の上限は、好ましくは26塩基であることができ、より好ましくは24塩基であることができ、さらに好ましくは22塩基であることができ、さらに好ましくは20塩基であることができる。（A）のポリヌクレオチドの塩基数の範囲は、好ましくは14〜26塩基のいずれかであることができ、より好ましくは15〜24塩基のいずれかであることができ、さらに好ましくは16〜20塩基のいずれかであることができる。 The polynucleotide (A) is a sense strand sequence having a minor type rs8103142, and includes the 23rd base from the 5 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and is a continuous 14 to 28 base sequence. It is a polynucleotide consisting of either. The lower limit of the number of bases of the polynucleotide (A) can be preferably 15 bases, more preferably 16 bases. The upper limit of the number of bases in the polynucleotide (A) can be preferably 26 bases, more preferably 24 bases, still more preferably 22 bases, still more preferably 20 bases. Can be. The range of the number of bases of the polynucleotide (A) can be preferably any of 14 to 26 bases, more preferably any of 15 to 24 bases, and still more preferably 16 to 20 bases. It can be any of the bases.
（B）のポリヌクレオチドは、rs8103142を有するアンチセンス鎖配列であり、配列番号5または6で示される塩基配列中の5’末端から17番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチドである。より高精度にrs8103142を検出できるという観点から、(B)のポリヌクレオチドは、配列番号6で示される塩基配列（メジャータイプのrs8103142を有するアンチセンス鎖配列）中の5’末端から17番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチドであることが好ましい。（B）のポリヌクレオチドの塩基数の下限は、好ましくは15塩基であることができ、より好ましくは16塩基であることができる。（B）のポリヌクレオチドの塩基数の上限は、好ましくは24塩基であることができ、より好ましくは22塩基であることができ、さらに好ましくは20塩基であることができる。（B）のポリヌクレオチドの塩基数の範囲は好ましくは15〜24塩基のいずれかであることができ、より好ましくは16〜20塩基のいずれかであることができる。 The polynucleotide (B) is an antisense strand sequence having rs8103142, which includes the 17th base from the 5 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 6, and any of consecutive 14 to 28 bases A polynucleotide comprising the above. From the viewpoint that rs8103142 can be detected with higher accuracy, the polynucleotide (B) is the 17th base from the 5 ′ end in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 (an antisense strand sequence having a major type of rs8103142). And a polynucleotide comprising any one of consecutive 14 to 28 bases. The lower limit of the number of bases of the polynucleotide (B) can be preferably 15 bases, more preferably 16 bases. The upper limit of the number of bases in the polynucleotide (B) can be preferably 24 bases, more preferably 22 bases, still more preferably 20 bases. The range of the base number of the polynucleotide (B) can be preferably any of 15 to 24 bases, more preferably any of 16 to 20 bases.
プローブは、上記（A）又は（B）のポリヌクレオチドからなる限り特に限定されるものではないが、好ましくは、（A）のポリヌクレオチドの3’末端の塩基は、配列番号3で示される塩基配列における5’末端から34番目の塩基であることができ、（B）のポリヌクレオチドの3’末端の塩基は、配列番号5または6で示される塩基配列における5’末端から26〜28及び36〜39番目のいずれかの塩基であることができる。このようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号7〜21、23〜108で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを例示することができる。 The probe is not particularly limited as long as it comprises the polynucleotide (A) or (B) above. Preferably, the 3 ′ terminal base of the polynucleotide (A) is the base represented by SEQ ID NO: 3. It can be the 34th base from the 5 ′ end in the sequence, and the base at the 3 ′ end of the polynucleotide of (B) is 26 to 28 and 36 from the 5 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 6. It can be any of the ˜39th bases. Specific examples of such polynucleotides include polynucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 7-21 and 23-108.
上記ポリヌクレオチドは、少なくとも1つのヌクレオチドが標識されていてもよい。ポリヌクレオチドは、公知の方法に従って、例えば標識物質を用いて標識することができる。 The polynucleotide may be labeled with at least one nucleotide. The polynucleotide can be labeled according to a known method, for example, using a labeling substance.
標識物質は、核酸の標識物質として公知のものであれば特に限定されない。標識物質としては、例えば蛍光標識が挙げられる。蛍光標識としては、後述の融解温度解析に適しているという観点から、例えば、蛍光標識されたポリヌクレオチドが1本鎖の場合は蛍光を発し、2本鎖の場合は蛍光が減少（例えば消光）するようなものが好ましい。蛍光標識としては、例えばフルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられ、市販の蛍光標識としては、例えばBODIPY FL（商標名、モレキュラー核酸プローブ社製）、FluorePrime（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Fluoredite（商品名、ミリポア社製）、FAM（ABI社製）、Cy3およびCy5（アマシャムファルマシア社製）、TAMRA(モレキュラー核酸プローブ社製)等が挙げられる。 The labeling substance is not particularly limited as long as it is a known substance for nucleic acid labeling. Examples of the labeling substance include fluorescent labels. As a fluorescent label, from the viewpoint that it is suitable for the melting temperature analysis described later, for example, when a fluorescently labeled polynucleotide is single-stranded, it emits fluorescence, and when it is double-stranded, fluorescence decreases (for example, quenching). Such a thing is preferable. Examples of the fluorescent label include fluorescein, phosphor, rhodamine, polymethine dye derivatives, and the like. Examples of commercially available fluorescent labels include BODIPY FL (trade name, manufactured by Molecular Nucleic Acid Probes), FluorePrime (trade name, Amersham Pharmacia). Fluoredite (trade name, manufactured by Millipore), FAM (manufactured by ABI), Cy3 and Cy5 (manufactured by Amersham Pharmacia), TAMRA (manufactured by Molecular Nucleic Acid Probes) and the like.
標識部位は、核酸の標識部位として公知のものであれば特に限定されない。標識部位は、後述の融解温度解析に適しているという観点から、好ましくは3’末端及び／又は5’末端のヌクレオチドであることができ、より好ましくは3’末端又は5’末端のヌクレオチドであることができ、さらに好ましくは3’末端のヌクレオチドであることができる。なお、標識部位が末端のヌクレオチドである場合、後述の融解温度解析に適しているという観点から、標識されるヌクレオチドの塩基はシトシンであることが好ましい。 The labeling site is not particularly limited as long as it is a known nucleic acid labeling site. From the viewpoint of being suitable for the melting temperature analysis described below, the labeling site can preferably be a nucleotide at the 3 ′ end and / or the 5 ′ end, more preferably a nucleotide at the 3 ′ end or the 5 ′ end. More preferably, it can be the nucleotide at the 3 ′ end. When the labeling site is a terminal nucleotide, it is preferable that the nucleotide base to be labeled is cytosine from the viewpoint that it is suitable for the melting temperature analysis described later.
上記ポリヌクレオチドは、3’末端にリン酸基が付加されていてもよい。後述するように、変異の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、PCR等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明の核酸プローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、核酸プローブの3’末端にリン酸基を付加させておけば、核酸プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、3’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。 The polynucleotide may have a phosphate group added to the 3 'end. As will be described later, a test nucleic acid (target nucleic acid) for detecting the presence or absence of a mutation can be prepared by a nucleic acid amplification method such as PCR. In this case, the nucleic acid probe of the present invention coexists in the reaction system of the nucleic acid amplification reaction. Can be made. In such a case, if a phosphate group is added to the 3 'end of the nucleic acid probe, it is possible to sufficiently prevent the nucleic acid probe itself from being extended by the nucleic acid amplification reaction. The same effect can be obtained by adding a labeling substance as described above to the 3 'end.
上記ポリヌクレオチドからなる本発明のプローブによれば、被検体のrs8103142の検出を、簡便に、効率的に、低コストで、且つ高精度にできる。とりわけ、融解温度解析を利用してrs8103142を検出する場合には、より簡便に、より効率的に、より低コストで、且つより高精度に検出できる。したがって、本発明のプローブは、被検体由来の核酸に対する上記ポリヌクレオチドの融解温度に基づいてrs8103142を検出するという用途に適している。 According to the probe of the present invention comprising the above-mentioned polynucleotide, detection of rs8103142 in an analyte can be performed simply, efficiently, at low cost and with high accuracy. In particular, when rs8103142 is detected using melting temperature analysis, it can be detected more simply, more efficiently, at lower cost, and with higher accuracy. Therefore, the probe of the present invention is suitable for use in detecting rs8103142 based on the melting temperature of the polynucleotide with respect to the nucleic acid derived from the analyte.
本発明において、融解温度解析とは、核酸の融解温度を利用した解析手法である。ある2種類の核酸間における融解温度は、1塩基でもミスマッチがあれば、ミスマッチが無い場合と異なる温度となる。したがって、融解温度を測定することにより、1塩基の違い（SNP）を見分けることができる。 In the present invention, melting temperature analysis is an analysis technique that utilizes the melting temperature of nucleic acids. The melting temperature between two types of nucleic acids is different from that when there is no mismatch if there is a mismatch even at one base. Therefore, by measuring the melting temperature, one base difference (SNP) can be distinguished.
なお、融解温度の測定は、公知の方法に従って、例えば次のように行うことができる。1本鎖の核酸と2本鎖の核酸とでは、260nmの波長の吸光度が異なることが知られている。したがって、2本鎖核酸（或いは1本鎖核酸）を含む溶液を加熱（或いは冷却）していくにつれて1本鎖核酸に解離（或いは2本鎖核酸にハイブリダイズ）すると、溶液の吸光度が変化する。そこで、この溶液の加熱（或いは冷却）に伴う吸光度の変化を測定することにより、核酸の融解温度を測定することができる。また、核酸の融解温度の測定は、上記吸光度の変化の測定のみならず、他のシグナルの変化の測定によっても行うことができる。例えば、溶液中の核酸が1本鎖と2本鎖の場合とで、シグナル強度が異なる標識物質で標識した核酸を用いて、このシグナル強度の変化を測定することにより、融解温度を測定することができる。標識物質としては、前記のものを用いることができる。 The melting temperature can be measured according to a known method, for example, as follows. It is known that absorbance at a wavelength of 260 nm differs between single-stranded nucleic acid and double-stranded nucleic acid. Therefore, as the solution containing double-stranded nucleic acid (or single-stranded nucleic acid) is heated (or cooled), the absorbance of the solution changes as it dissociates into single-stranded nucleic acid (or hybridizes to double-stranded nucleic acid). . Therefore, the melting temperature of the nucleic acid can be measured by measuring the change in absorbance associated with heating (or cooling) of the solution. The melting temperature of the nucleic acid can be measured not only by measuring the change in absorbance but also by measuring changes in other signals. For example, the melting temperature can be measured by measuring the change in signal intensity using nucleic acids labeled with different labeling intensity when the nucleic acid in the solution is single-stranded and double-stranded. Can do. As the labeling substance, those described above can be used.
「被検体由来の核酸に対する上記ポリヌクレオチドの融解温度に基づいてrs8103142を検出するという用途」は、被検体由来の核酸に対する上記ポリヌクレオチドの融解温度を上記のように測定して、得られた融解温度に従って、rs8103142がメジャータイプホモかメジャータイプとマイナータイプのヘテロか、或いはマイナータイプホモかを決定するためという用途である限り特に限定されない。例えば、rs8103142のタイプは、rs8103142のタイプが既知の核酸に対する上記ポリヌクレオチドの融解温度（対照融解温度）を予め測定しておき、この対照融解温度と、被検体由来の核酸に対する上記ポリヌクレオチドの融解温度とを比較することにより、決定することができる。 “Use of detecting rs8103142 based on the melting temperature of the polynucleotide with respect to the nucleic acid derived from the analyte” refers to the melting obtained by measuring the melting temperature of the polynucleotide with respect to the nucleic acid derived from the analyte as described above. There is no particular limitation as long as it is used to determine whether rs8103142 is major type homo, major type and minor type hetero, or minor type homo according to temperature. For example, for the type of rs8103142, the melting temperature (control melting temperature) of the polynucleotide with respect to a nucleic acid with a known type of rs8103142 is measured in advance, and the melting temperature of the polynucleotide with respect to the nucleic acid derived from the analyte is measured. This can be determined by comparing the temperature.
被検体由来の核酸とは、rs8103142の検出対象である検体（被検体、例えばヒト）に由来する核酸であれば特に限定されない。核酸は、例えば、1本鎖でもよいし、2本鎖でもよい。核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、DNAや、トータルRNA、mRNA等のRNA等があげられる。被検体由来の核酸は、被検体の生体試料に含まれている核酸そのものであってもよいが、rs8103142検出精度がより高いという観点から、被検体の生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅された増幅産物が好ましい。 The nucleic acid derived from the subject is not particularly limited as long as it is a nucleic acid derived from a specimen (subject, for example, human) that is a detection target of rs8103142. For example, the nucleic acid may be single-stranded or double-stranded. The type of nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include DNA, RNA such as total RNA, mRNA, and the like. The nucleic acid derived from the subject may be the nucleic acid itself contained in the biological sample of the subject, but from the viewpoint of higher detection accuracy of rs8103142, a nucleic acid amplification method using the nucleic acid in the biological sample of the subject as a template The amplification product amplified by is preferred.
生体試料としては、特に制限されないが、例えば、白血球細胞等の血球試料、全血試料、口腔拭い液、咽頭拭い液等があげられる。 Although it does not restrict | limit especially as a biological sample, For example, a blood cell sample, such as a white blood cell, a whole blood sample, a mouth wiping liquid, a pharyngeal wiping liquid, etc. are mention | raise | lifted.
増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、好ましい下限は30塩基であり、さらに好ましくは40塩基であり、さらに好ましくは50塩基である。また、好ましい上限は1000塩基であり、さらに好ましくは500塩基であり、さらに好ましくは300塩基である。 The length of the amplification product is not particularly limited, but for example, the preferred lower limit is 30 bases, more preferably 40 bases, and even more preferably 50 bases. Moreover, a preferable upper limit is 1000 bases, More preferably, it is 500 bases, More preferably, it is 300 bases.
２．組成物
（A）又は（B）のポリヌクレオチドを含む、被検体由来の核酸中の、rs8103142を検出するための組成物について説明する。
2. A composition for detecting rs8103142 in a nucleic acid derived from a subject, comprising the polynucleotide of composition (A) or (B) will be described.
rs8103142、ポリヌクレオチドの態様、及び適している用途等については、上記「１．プローブ」の記載と同様である。 rs8103142, the aspect of the polynucleotide, and the suitable use are the same as those described in “1. Probe” above.
組成物は、上記ポリヌクレオチドのみからなっていてもよいが、上記ポリヌクレオチド以外に、（C）のフォワードプライマー及び（D）のリバースプライマーからなるプライマーセットを含むことが好ましい。このプライマーセットは、rs8103142を含む核酸を増幅できるように設計されたプライマーセットである。 The composition may consist of only the above-mentioned polynucleotide, but preferably contains a primer set consisting of a forward primer (C) and a reverse primer (D) in addition to the above-mentioned polynucleotide. This primer set is a primer set designed to amplify a nucleic acid containing rs8103142.
（C）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から240番目〜270番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるフォワードプライマーであり
（D）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から52番目〜81番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマーである。
(C) A forward primer consisting of any one of 20 to 30 bases in the base sequence consisting of the 240th to 270th bases from the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. (D) SEQ ID NO: 2 is a reverse primer composed of any one of continuous 20 to 30 bases in a base sequence composed of the 52nd to 81st bases from the 5 ′ end of the base sequence represented by 2.
（C）のフォワードプライマー及び（D）のリバースプライマーは、プライマーとしての機能を発揮できる限りにおいて、1又は複数個（2〜5個、好ましくは2〜3個）の塩基が他の塩基に置換されていてもよい。他の塩基としては、配列番号1又は配列番号2の対応する塩基と異なる塩基であれば特に限定されず、例えばアデニン、シトシン、チミン、グアニン、及びイノシン等が挙げられる。 As long as the forward primer (C) and the reverse primer (D) can function as a primer, one or more (2 to 5, preferably 2 to 3) bases are replaced with other bases. May be. Other bases are not particularly limited as long as they are different from the corresponding bases of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and examples thereof include adenine, cytosine, thymine, guanine, and inosine.
このように、遺伝子の特定領域に相補的な配列を有するプライマーセットと、プローブである（A）又は（B）のポリヌクレオチドとの組み合わせであれば、互いの機能を阻害しない。すなわち、上記プライマーセットは上記プローブと被検体由来の核酸との結合を阻害せず、上記プローブは、上記プライマーセットによる被検体由来の核酸の増幅反応を阻害しない。したがって、上記プローブと上記プライマーセットを含む本発明の組成物によれば、被検体由来の核酸の増幅反応と、増幅された核酸に対するプローブの結合又は解離反応を1つの反応系で行うことができるため、被検体のrs8103142の検出を、より簡便に、より効率的に、より低コストでできる。 Thus, if a primer set having a sequence complementary to a specific region of a gene and the polynucleotide (A) or (B) as a probe are combined, the functions of each other are not inhibited. That is, the primer set does not inhibit the binding between the probe and the nucleic acid derived from the subject, and the probe does not inhibit the amplification reaction of the nucleic acid derived from the subject by the primer set. Therefore, according to the composition of the present invention including the probe and the primer set, the amplification reaction of the nucleic acid derived from the analyte and the binding or dissociation reaction of the probe to the amplified nucleic acid can be performed in one reaction system. Therefore, the detection of rs8103142 of the subject can be performed more simply, more efficiently, and at a lower cost.
なお、上記プライマーセットによって増幅されるIL28B遺伝子領域の塩基配列は、IL28A遺伝子領域の塩基配列と非常に類似していることが報告されている。そこで、IL28A遺伝子領域を増幅せずに、IL28B遺伝子領域を特異的に増幅することが重要である。したがって、（C）のフォワードプライマー及び（D）のリバースプライマーは、このような類似配列（IL28A遺伝子領域）を増幅させずに、IL28B遺伝子領域を特異的に増幅させることができるように設計されていてもよい。 It has been reported that the base sequence of the IL28B gene region amplified by the primer set is very similar to the base sequence of the IL28A gene region. Therefore, it is important to specifically amplify the IL28B gene region without amplifying the IL28A gene region. Therefore, the forward primer (C) and the reverse primer (D) are designed so that the IL28B gene region can be specifically amplified without amplifying such a similar sequence (IL28A gene region). May be.
このような設計としては、例えば、3’末端から1〜5番目のいずれかが標的配列にのみ完全に相補的であり、且つ類似配列に対しては非相補的な塩基になるように設計することが挙げられる。また、この例の場合において、さらに、3’末端から3番目〜6番目のうち少なくとも一つの塩基が標的配列とミスマッチになるように設計してもよい。このミスマッチ塩基数は、1塩基でもよく、2塩基でもよく、3塩基でもよいが、好ましくは1塩基または2塩基である。 As such a design, for example, any one of the first to fifth from the 3 ′ end is designed to be completely complementary only to the target sequence and to a non-complementary base to a similar sequence. Can be mentioned. In the case of this example, it may be further designed so that at least one of the 3rd to 6th bases from the 3 'end is mismatched with the target sequence. The number of mismatch bases may be 1 base, 2 bases or 3 bases, but preferably 1 base or 2 bases.
IL28B遺伝子領域を特異的に増幅させることができるように設計されたフォワードプライマーとしては、例えば以下の（C’）のフォワードプライマー、好ましくは以下の（C”）のフォワードプライマーが挙げられる。 Examples of the forward primer designed to specifically amplify the IL28B gene region include the following (C ′) forward primer, preferably the following (C ″) forward primer.
（C’）以下の（C’1）〜（C’4）からなる群より選択されるフォワードプライマー：
（C’1）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて269番目の塩基を3’末端として連続する20〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマー。
（C’2）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて269番目の塩基を3’末端として連続する20〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から2番目から5番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
（C’3）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて270番目の塩基を3’末端として連続する20〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマー。
（C’4）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて270番目の塩基を3’末端として連続する20〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
(C ′) Forward primer selected from the group consisting of the following (C′1) to (C′4):
(C′1) A forward primer comprising a base sequence represented by any one of 20 to 30 bases counting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 using the 269th base as the 3 ′ end.
(C′2) consisting of a base sequence represented by any one of 20 to 30 bases starting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 with the 269th base as the 3 ′ end, and the 3 ′ end Forward primer in which at least one of the 2nd to 5th bases is replaced with another base.
(C′3) A forward primer comprising a base sequence represented by any one of 20 to 30 bases counting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 using the 270th base as the 3 ′ end.
(C'4) consisting of a base sequence represented by any one of 20 to 30 bases starting from the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 with the 270th base as the 3' end, and the 3 'end A forward primer in which at least one of the third to sixth bases is replaced with another base.
（C”）以下の（C”1）〜（C”4）からなる群より選択されるフォワードプライマー：
（C”1）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて269番目の塩基を3’末端として連続する25〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマー。
（C”2）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて269番目の塩基を3’末端として連続する25〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から2番目から5番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
（C”3）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて270番目の塩基を3’末端として連続する25〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマー。
（C”4）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて270番目の塩基を3’末端として連続する25〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
(C ″) Forward primer selected from the group consisting of the following (C ″ 1) to (C ″ 4):
(C ″ 1) A forward primer comprising a base sequence represented by any one of 25 to 30 bases counting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 with the 269th base as the 3 ′ end.
(C ″ 2) consisting of a base sequence represented by any one of 25 to 30 bases with the 269th base as the 3 ′ end counted from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the 3 ′ end Forward primer in which at least one of the 2nd to 5th bases is replaced with another base.
(C ″ 3) A forward primer consisting of a base sequence represented by any one of 25 to 30 bases counting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 with the 270th base as the 3 ′ end.
(C ″ 4) consisting of a base sequence represented by any one of 25 to 30 bases starting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 with the 270th base as the 3 ′ end, and the 3 ′ end A forward primer in which at least one of the third to sixth bases is replaced with another base.
（C’）のフォワードプライマー及び（C”）のフォワードプライマーにおいて、他の塩基は、配列番号1の対応する塩基と異なる塩基であれば特に限定されず、例えばアデニン、シトシン、チミン、グアニン、及びイノシン等が挙げられる。 In the forward primer of (C ′) and the forward primer of (C ″), the other base is not particularly limited as long as it is a base different from the corresponding base of SEQ ID NO: 1, for example, adenine, cytosine, thymine, guanine, and And inosine.
IL28B遺伝子領域を特異的に増幅させることができるように設計されたリバースプライマーとしては、例えば以下の（D’）のリバースプライマー、より好ましくは以下の（D”）のリバースプライマーが挙げられる。 Examples of the reverse primer designed to specifically amplify the IL28B gene region include the following (D ′) reverse primer, more preferably the following (D ″) reverse primer.
（D’）以下の（D’5）〜（D’10）からなる群より選択されるリバースプライマー。
（D’5）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて78番目の塩基を3’末端として連続する20〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
（D’6）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて79番目の塩基を3’末端として連続する20〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
（D’7）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて79番目の塩基を3’末端として連続する20〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
（D’8）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて80番目の塩基を3’末端として連続する20〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
（D’9）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて81番目の塩基を3’末端として連続する20〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
（D’10）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて81番目の塩基を3’末端として連続する20〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目、5番目、6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D ′) A reverse primer selected from the group consisting of the following (D′ 5) to (D′ 10).
(D′ 5) A reverse primer comprising a base sequence represented by any one of 20 to 30 bases starting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having the 78th base as the 3 ′ end.
(D′ 6) A reverse primer comprising a base sequence represented by any one of 20 to 30 bases counting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the 79th base as the 3 ′ end.
(D'7) consisting of a base sequence represented by any of 20 to 30 bases starting from the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the 79th base as the 3' end, and the 3 'end Reverse primer in which at least one of the 3rd to 6th bases is replaced with another base.
(D′ 8) A reverse primer comprising a base sequence represented by any one of 20 to 30 bases starting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the 80th base as the 3 ′ end.
(D′ 9) A reverse primer comprising a base sequence represented by any one of 20 to 30 bases counting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the 81st base as the 3 ′ end.
(D′ 10) consisting of a base sequence represented by any one of 20 to 30 bases starting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the 81st base as the 3 ′ end, and the 3 ′ end Reverse primer in which at least one of the 3rd, 5th and 6th bases is replaced with another base.
（D”）以下の（D”5）〜（D”10）からなる群より選択されるリバースプライマー。
（D”5）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて78番目の塩基を3’末端として連続する20〜28塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
（D”6）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて79番目の塩基を3’末端として連続する20〜28塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
（D”7）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて79番目の塩基を3’末端として連続する20〜28塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
（D”8）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて80番目の塩基を3’末端として連続する20〜28塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
（D”9）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて81番目の塩基を3’末端として連続する20〜28塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
（D”10）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて81番目の塩基を3’末端として連続する20〜28塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目、5番目、6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D ″) A reverse primer selected from the group consisting of the following (D ″ 5) to (D ″ 10).
(D ″ 5) A reverse primer comprising a base sequence represented by any one of 20 to 28 bases starting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the 78th base as the 3 ′ end.
(D ″ 6) A reverse primer comprising a base sequence represented by any one of 20 to 28 bases counting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the 79th base as the 3 ′ end.
(D ″ 7) consisting of a base sequence represented by any one of 20 to 28 bases starting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the 79th base as the 3 ′ end, and the 3 ′ end Reverse primer in which at least one of the 3rd to 6th bases is replaced with another base.
(D ″ 8) A reverse primer comprising a base sequence represented by any one of 20 to 28 bases with the 80th base counted from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 as the 3 ′ end.
(D ″ 9) A reverse primer comprising a base sequence represented by any one of 20 to 28 bases starting from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the 81st base as the 3 ′ end.
(D "10) consisting of a base sequence represented by any one of 20 to 28 bases starting from the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 with the 81st base as the 3' end, and the 3 'end Reverse primer in which at least one of the 3rd, 5th and 6th bases is replaced with another base.
（D’）のリバースプライマー及び（D”）のリバースプライマーにおいて、他の塩基は、配列番号2の対応する塩基と異なる塩基であれば特に限定されず、例えばアデニン、シトシン、チミン、グアニン、及びイノシン等が挙げられる。 In the reverse primer of (D ′) and the reverse primer of (D ″), the other base is not particularly limited as long as it is a base different from the corresponding base of SEQ ID NO: 2, for example, adenine, cytosine, thymine, guanine, and And inosine.
（C）のフォワードプライマーとして、具体的には、配列番号109〜225のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマーが好ましく挙げられ、（D）のリバースプライマーとして、具体的には、配列番号226〜319のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマーが好ましく挙げられる。 As the forward primer of (C), specifically, a forward primer composed of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 109 to 225 is preferably exemplified, and as the reverse primer of (D), specifically, SEQ ID NO: A reverse primer consisting of the base sequence represented by any of 226 to 319 is preferred.
（C）のフォワードプライマー及び（D）のリバースプライマーの塩基数の下限は、好ましくは20塩基であり、より好ましくは21塩基であることができる。該塩基数の上限は、好ましくは30塩基であることができ、より好ましくは29塩基であることができ、さらに好ましくは28塩基であることができる。 The lower limit of the number of bases of the forward primer (C) and the reverse primer (D) is preferably 20 bases, more preferably 21 bases. The upper limit of the number of bases can be preferably 30 bases, more preferably 29 bases, still more preferably 28 bases.
組成物は、上記ポリヌクレオチドと被検体由来の核酸との解離（或いはハイブリダイズ）を阻害しない限りにおいて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、DNAポリメラーゼ、緩衝剤、逆転写酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、金属イオン、アミノ酸、ペプチド、抗体、BSA、水溶性タンパク質、疎水性タンパク質、脂質、糖、ポリエチレングリコール、界面活性剤、グリセロールが挙げられる。 The composition may contain other components as long as the dissociation (or hybridization) between the polynucleotide and the nucleic acid derived from the subject is not inhibited. Examples of other components include DNA polymerase, buffer, reverse transcriptase, nucleotide, oligonucleotide, metal ion, amino acid, peptide, antibody, BSA, water-soluble protein, hydrophobic protein, lipid, sugar, polyethylene glycol, interface An active agent, glycerol is mentioned.
３．検出方法
工程2、3、及び4を含む、被検体由来の核酸中の、rs8103142を検出する方法について説明する。
3. A method for detecting rs8103142 in the nucleic acid derived from the subject, including detection method steps 2, 3, and 4, will be described.
rs8103142等については、上記「１．プローブ」及び「２．組成物」の記載と同様である。 About rs8103142 etc., it is the same as the description of said "1. probe" and "2. composition".
被検体由来の核酸は、上記「１．プローブ」の記載と同様である。被検体由来の核酸として、被検体の生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅された増幅産物を採用する場合は、方法にこの増幅工程（工程1）をさらに追加してもよい。 The nucleic acid derived from the subject is the same as described in “1. Probe” above. When the amplification product amplified by the nucleic acid amplification method using the nucleic acid in the biological sample of the subject as a template is adopted as the nucleic acid derived from the subject, this amplification step (step 1) may be further added to the method.
工程1は、rs8103142を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを用いて、被検体の生体試料中の核酸を増幅して、被検体由来の核酸を得る工程である。
プライマーセットは、rs8103142を含む核酸を増幅できる限り特に限定されない。プライマーセットとしては、好ましくは（C）のフォワードプライマー及び（D）のリバースプライマーからなるプライマーセットが挙げられる。（C）のフォワードプライマー及び（D）のリバースプライマーについては、上記「２．組成物」の記載と同様である。 The primer set is not particularly limited as long as a nucleic acid containing rs8103142 can be amplified. The primer set is preferably a primer set comprising a forward primer (C) and a reverse primer (D). The forward primer (C) and the reverse primer (D) are the same as described in “2. Composition” above.
生体試料は上記「１．プローブ」の記載と同様である。 The biological sample is the same as described in “1. Probe” above.
増幅は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBA（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription−mediated amplification）法、SDA（Strand Displacement Amplification）法等があげられるが、PCR法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。また、増幅反応後、増幅された核酸のみを公知の方法に従って精清してもよい。 Amplification can be performed according to a known method. For example, a PCR (Polymerase Chain Reaction) method, a NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, a TMA (Transcription-mediated amplification) method, an SDA (Strand Displacement Amplification) method and the like can be mentioned, and the PCR method is preferably used. In each of these methods, the conditions for the amplification reaction are not particularly limited, and can be performed by a conventionally known method. Further, after the amplification reaction, only the amplified nucleic acid may be purified according to a known method.
工程2は、被検体由来の核酸に対する、上記「１．プローブ」に記載のプローブの融解温度を測定する工程である。
被検体由来の核酸及び融解温度の測定は上記「１．プローブ」の記載と同様である。 The measurement of the nucleic acid derived from the analyte and the melting temperature is the same as described in “1. Probe” above.
工程1において、（C）のフォワードプライマー及び（D）のリバースプライマーからなるプライマーセットを用いる場合、被検体由来の核酸の増幅反応と、増幅された核酸に対するプローブの結合又は解離反応を1つの反応系で行うことができるため、工程1及び2を1つの反応系で行うことが好ましい。工程1及び2を1つの反応系で行うことにより、rs8103142を、より簡便に、より効率的に、且つより低コストで検出できる。
When using a primer set consisting of (C) forward primer and (D) reverse primer in
工程3は、工程2で測定された融解温度と、rs8103142が既知である核酸に対する上記「１．プローブ」に記載のプローブの融解温度とを比較する工程である。
rs8103142が既知である核酸に対する上記「１．プローブ」に記載のプローブの融解温度の測定は、工程2における、被検体由来の核酸に対する上記「１．プローブ」に記載のプローブの融解温度の測定と同様に行うことができる。なお、比較対照である、融解温度としては、融解温度の測定の結果得られた曲線（例えば横軸に温度、縦軸に1本鎖/2本鎖の状態を示す吸光度（或いは蛍光量など）を採った場合に得られる曲線）のピーク（或いはボトム）の温度を採用することが好ましい。
The measurement of the melting temperature of the probe described in “1. Probe” with respect to the nucleic acid for which rs8103142 is known is the measurement of the melting temperature of the probe according to “1. Probe” described above with respect to the nucleic acid derived from the analyte in
工程4は、工程3の比較結果に基づいて該SNPを決定する工程である。例えば、rs8103142がマイナータイプホモの核酸に対する融解温度と、被検体由来の核酸に対する融解温度が同程度の場合は、被検体のrs8103142はマイナータイプホモであると決定することができる。
マイナータイプのrs8103142を染色体のどちらか一方、或いは両方に有する場合、C型慢性肝炎に対するPEG-IFN/RBV併用療法の有効性が低いことが知られている。したがって、被検体がC型慢性肝炎患者である場合において、工程4によって被検体がメジャータイプのホモであると決定された場合には、PEG-IFN/RBV併用療法を開始（或いは継続）することが好ましく、被検体がメジャータイプとマイナータイプのヘテロ、又はマイナータイプのホモであると決定された場合には、PEG-IFN/RBV併用療法をしない（或いは停止）することが好ましい。被検体のrs8103142に従ってPEG-IFN/RBV併用療法を開始する（或いは継続）又はしない（或いは停止）することにより、PEG-IFN/RBV併用療法の効果が見込めない被検体に対するPEG-IFN/RBV併用療法による副作用を未然に防ぐことができる。
It is known that when the minor type rs8103142 is present in one or both of the chromosomes, the effectiveness of the PEG-IFN / RBV combination therapy for chronic hepatitis C is low. Therefore, if the subject is a chronic hepatitis C patient and the subject is determined to be a major type homozygous by
４．キット
上記「１．プローブ」に記載のプローブを含む、被検体由来の核酸中の、rs8103142を検出するためのキットについて説明する。
4). Kit A kit for detecting rs8103142 in a nucleic acid derived from a subject, comprising the probe described in “1. Probe” above will be described.
被検体由来の核酸、rs8103142及び適している用途等については、上記「１．プローブ」及び「２．組成物」の記載と同様である。 The nucleic acid derived from the analyte, rs8103142, and suitable uses are the same as those described above in “1. Probe” and “2. Composition”.
キットは、上記プローブ以外に、rs8103142を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含むことが好ましい。 The kit preferably contains a primer set for amplifying a nucleic acid containing rs8103142 in addition to the probe.
このプライマーセットは、rs8103142を含む核酸を増幅できる限り特に限定されない。プライマーセットとしては、好ましくは（C）のフォワードプライマー及び（D）のリバースプライマーからなるプライマーセットが挙げられる。（C）のフォワードプライマー及び（D）のリバースプライマーについては、上記「２．組成物」の記載と同様である。 This primer set is not particularly limited as long as a nucleic acid containing rs8103142 can be amplified. The primer set is preferably a primer set comprising a forward primer (C) and a reverse primer (D). The forward primer (C) and the reverse primer (D) are the same as described in “2. Composition” above.
上記プローブと上記プライマーセットとは、別々の容器に含まれていてもよいし、1つの容器に含まれていてもよい。前述のように、プライマーセットとして、（C）のフォワードプライマー及び（D）のリバースプライマーからなるプライマーセットを用いる場合、被検体由来の核酸の増幅反応と、増幅された核酸に対するプローブの結合又は解離反応を1つの反応系で行うことができるため、上記プローブと上記プライマーセットは1つの容器に含まれていることが好ましい。 The probe and the primer set may be included in separate containers or may be included in one container. As described above, when the primer set consisting of (C) forward primer and (D) reverse primer is used as the primer set, the amplification reaction of the nucleic acid derived from the analyte and the binding or dissociation of the probe to the amplified nucleic acid Since the reaction can be performed in one reaction system, the probe and the primer set are preferably contained in one container.
キットは、上記プローブ以外に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えばDNAポリメラーゼ、緩衝剤、逆転写酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、金属イオン、アミノ酸、ペプチド、抗体、BSA、水溶性タンパク質、疎水性タンパク質、脂質、糖、ポリエチレングリコール、界面活性剤、グリセロールが挙げられる。DNAポリメラーゼについては、上記「２．組成物」の記載と同様である。 The kit may contain other components in addition to the probe. As other components, for example, DNA polymerase, buffer, reverse transcriptase, nucleotide, oligonucleotide, metal ion, amino acid, peptide, antibody, BSA, water-soluble protein, hydrophobic protein, lipid, sugar, polyethylene glycol, surface activity Agents, glycerol. The DNA polymerase is the same as described in “2. Composition” above.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例1．人工合成核酸を検出対象試料としたrs8103142検出実験1（プローブ：アンチセンス鎖）
ヒト染色体DNA中のrs8103142及びその周辺領域の塩基配列からなる合成1本鎖DNAを検出対象試料とし、該検出対象試料に対するプローブの融解温度に基づいて、rs8103142の検出を試みた。具体的には次のように行った。
Example 1. Rs8103142 detection experiment 1 (probe: antisense strand) using artificially synthesized nucleic acid as the detection target sample
Rs8103142 was attempted to be detected on the basis of the melting temperature of the probe with respect to the detection target sample, using synthetic single-stranded DNA consisting of rs8103142 in human chromosomal DNA and the base sequence of the surrounding region as a detection target sample. Specifically, it was performed as follows.
＜1-1．検出対象試料溶液の調製＞
配列番号3又は4で示される塩基配列からなる1本鎖DNAを検出対象試料として用いた。配列番号3及び4で示される塩基配列中、5’末端から23番目の塩基がrs8103142である。配列番号3はマイナータイプのrs8103142を有し、配列番号4はメジャータイプのrs8103142を有する。配列番号3及び4はセンス鎖である。
<1-1. Preparation of sample solution for detection>
Single-stranded DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 was used as a detection target sample. In the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, the 23rd base from the 5 ′ end is rs8103142. SEQ ID NO: 3 has minor type rs8103142, and SEQ ID NO: 4 has major type rs8103142. SEQ ID NOs: 3 and 4 are sense strands.
該検出対象試料を10mM Tris-HCl (pH 7.5)で1.25μMなるように希釈して、検出対象試料溶液を調製した。後述の反応溶液の調製には、配列番号4の検出対象試料溶液のみ2μL（以下「MM」と示す）、配列番号3の検出対象試料溶液及び配列番号4の検出試料対象溶液をそれぞれ1μl（計2μl）（以下、「Mm」と示す）、配列番号3の検出対象試料溶液のみ2μL（以下、「mm」と示す）を用いた。 The detection target sample was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) to 1.25 μM to prepare a detection target sample solution. For preparing the reaction solution described later, 2 μL of the detection target sample solution of SEQ ID NO: 4 (hereinafter referred to as “MM”), 1 μl each of the detection target sample solution of SEQ ID NO: 3 and the detection sample target solution of SEQ ID NO: 4 (total 2 μl) (hereinafter referred to as “Mm”) and 2 μL (hereinafter referred to as “mm”) of the detection target sample solution of SEQ ID NO: 3 were used.
＜1-2．プローブ溶液の調製＞
配列番号27または28で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAをプローブとして用いた。配列番号27はマイナータイプのrs8103142を有するアンチセンス鎖であり、配列番号28はメジャータイプのrs8103142を有するアンチセンス鎖である。各プローブを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で10μMになるように希釈して、それぞれのプローブ溶液を調製した。
<1-2. Preparation of probe solution>
A single-stranded DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 or 28 and labeled at the 3 ′ end with BODIPY-FL was used as a probe. SEQ ID NO: 27 is the antisense strand with minor type rs8103142, and SEQ ID NO: 28 is the antisense strand with major type rs8103142. Each probe was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) to 10 μM to prepare each probe solution.
＜1-3．反応溶液の調製＞
以下の試薬を含む10μL反応溶液を調製した。なお、反応溶液の容量は精製水で調製した。
（a）プローブ溶液（配列番号27、28のいずれか） 0.25μL
（b）KOD Mix（ジーンキューブ（R）テストベーシック、東洋紡製） 3μL
（c）PPD Mix（ジーンキューブ（R）テストベーシック、東洋紡製） 3μL
（d）検出対象試料溶液（MM、Mm、又はmm） 2μL
<1-3. Preparation of reaction solution>
A 10 μL reaction solution containing the following reagents was prepared. The volume of the reaction solution was prepared with purified water.
(A) Probe solution (Sequence number 27 or 28) 0.25μL
(B) KOD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3μL
(C) PPD Mix (Gene Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3μL
(D) Sample solution to be detected (MM, Mm, or mm) 2μL
＜1-4．融解曲線解析＞
全自動遺伝子解析装置（GENECUBE（登録商標、東洋紡製））を用いて融解曲線を求めた。具体的には、反応溶液を（94℃ 30秒）→（39℃ 30秒）→（39から75℃へ0.09℃/秒で昇温）で処理し、39℃から75℃への昇温につれて検出対象試料からプローブが解離する際に、プローブの標識から発せられる蛍光量を測定することにより、検出対象試料に対するプローブの融解曲線を求めた。
<1-4. Melting curve analysis>
Melting curves were determined using a fully automatic gene analyzer (GENECUBE (registered trademark, manufactured by Toyobo)). Specifically, the reaction solution was treated as follows: (94 ° C. for 30 seconds) → (39 ° C. for 30 seconds) → (Raise from 39 to 75 ° C. at 0.09 ° C./second), and as the temperature rose from 39 ° C. to 75 ° C. When the probe was dissociated from the sample to be detected, the amount of fluorescence emitted from the probe label was measured to obtain a melting curve of the probe with respect to the sample to be detected.
＜1-5．結果＞
配列番号27のプローブを用いた場合の結果を図1に、配列番号28のプローブを用いた場合の結果を図2に示す。図1、2より、配列番号27のプローブ、配列番号28のプローブのいずれを用いた場合でも、MM及びmm検出時に単一のピークが観察され、且つMm検出時に2つのピークが明確に観察されたことから、rs8103142のMM、Mm、mmの識別が可能であった。以上から、配列番号27及び28のプローブがrs8103142のSNP解析に適していることが示された。
<1-5. Result>
The results when the probe of SEQ ID NO: 27 is used are shown in FIG. 1, and the results when the probe of SEQ ID NO: 28 are used are shown in FIG. 1 and 2, a single peak is observed when detecting MM and mm, and two peaks are clearly observed when detecting Mm, regardless of whether the probe of SEQ ID NO: 27 or the probe of SEQ ID NO: 28 is used. Therefore, MM, Mm, and mm of rs8103142 could be identified. From the above, it was shown that the probes of SEQ ID NOS: 27 and 28 are suitable for SNP analysis of rs8103142.
実施例2．人工合成核酸を検出対象試料としたrs8103142検出実験2（プローブ：マイナータイプのセンス鎖）
ヒト染色体DNA中のrs8103142及びその周辺領域の塩基配列からなる合成1本鎖DNAを検出対象試料とし、該検出対象試料に対するプローブの融解温度に基づいて、rs8103142の検出を試みた。具体的には次のように行った。
Example 2 Rs8103142 detection experiment 2 (probe: minor type sense strand) using artificially synthesized nucleic acid as detection target sample
Rs8103142 was attempted to be detected on the basis of the melting temperature of the probe with respect to the detection target sample, using synthetic single-stranded DNA consisting of rs8103142 in human chromosomal DNA and the base sequence of the surrounding region as a detection target sample. Specifically, it was performed as follows.
＜2-1．検出対象試料溶液の調製＞
配列番号5又は6で示される塩基配列からなる1本鎖DNAを検出対象試料として用いた。配列番号5及び6で示される塩基配列中、5’末端から17番目の塩基がrs8103142である。配列番号5はマイナータイプのrs8103142を有し、配列番号6はメジャータイプのrs8103142を有する。配列番号5及び6はアンチセンス鎖である。
<2-1. Preparation of sample solution for detection>
A single-stranded DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 6 was used as a detection target sample. In the base sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, the 17th base from the 5 ′ end is rs8103142. SEQ ID NO: 5 has minor type rs8103142, and SEQ ID NO: 6 has major type rs8103142. SEQ ID NOs: 5 and 6 are antisense strands.
該検出対象試料を10mM Tris-HCl (pH 7.5)で1.25μMなるように希釈して、検出対象試料溶液を調製した。後述の反応溶液の調製には、配列番号6の検出対象試料溶液のみ2μL（以下「MM」と示す）、配列番号5の検出対象試料溶液及び配列番号6の検出試料対象溶液をそれぞれ1μl（計2μl）（以下、「Mm」と示す）、配列番号5の検出対象試料溶液のみ2μL（以下、「mm」と示す）を用いた。 The detection target sample was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) to 1.25 μM to prepare a detection target sample solution. For the preparation of the reaction solution described later, only 2 μL of the detection target sample solution of SEQ ID NO: 6 (hereinafter referred to as “MM”), 1 μl each of the detection target sample solution of SEQ ID NO: 5 and the detection sample target solution of SEQ ID NO: 6 (total 2 μl) (hereinafter referred to as “Mm”), and 2 μL (hereinafter referred to as “mm”) of the detection target sample solution of SEQ ID NO: 5 was used.
＜2-2．プローブ溶液の調製＞
配列番号11又は12で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAをプローブとして用いた。配列番号11及び12はマイナータイプのrs8103142を有するセンス鎖である。該プローブを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で10μMになるように希釈して、プローブ溶液を調製した。
<2-2. Preparation of probe solution>
A single-stranded DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12 and labeled at the 3 ′ end with BODIPY-FL was used as a probe. SEQ ID NOs: 11 and 12 are sense strands with minor type rs8103142. The probe was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) to 10 μM to prepare a probe solution.
＜2-3．反応溶液の調製、及び融解曲線解析＞
実施例1と同様に行った。
<2-3. Preparation of reaction solution and melting curve analysis>
The same operation as in Example 1 was performed.
＜2-4．結果＞
配列番号11のプローブを用いた場合の結果を図3に、配列番号12のプローブの結果を図4に示す。実施例1と同じく、これらのプローブを用いてもMM、Mm、mmが容易に識別できる。以上から、配列番号11及び12のプローブがrs8103142のSNP解析に適していることが示された。
<2-4. Result>
The results when using the probe of SEQ ID NO: 11 are shown in FIG. 3, and the results of the probe of SEQ ID NO: 12 are shown in FIG. As in Example 1, MM, Mm, and mm can be easily identified using these probes. From the above, it was shown that the probes of SEQ ID NOS: 11 and 12 are suitable for SNP analysis of rs8103142.
比較例1．人工合成核酸を検出対象試料としたrs8103142検出実験（プローブ：メジャータイプのセンス鎖）
プローブとして、配列番号22で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAを用いる以外は、実施例2と同様に行った。配列番号22はメジャータイプのrs8103142を有するセンス鎖である。
Comparative Example 1. Rs8103142 detection experiment using artificially synthesized nucleic acid as a detection target (probe: major type sense strand)
The same procedure as in Example 2 was performed, except that a single-stranded DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 22 and labeled at the 3 ′ end with BODIPY-FL was used as the probe. SEQ ID NO: 22 is the sense strand with major type rs8103142.
＜3-1．結果＞
結果を図5に示す。図5では、実施例1及び2とは異なり、Mm検出時に一切ヘテロピークが得られず、緩やかな単一の検出ピークしか得られなかった。このような検出ピークの出現パターンではrs8103142を明瞭に区別することが難しい。以上から、配列番号22のプローブはrs8103142の検出には適していないことが示された。配列番号22は配列番号12と同じ塩基数である。従って、プローブの塩基数の多寡は、rs8103142の検出に適しているか否かには関係ないと考えられた。
<3-1. Result>
The results are shown in FIG. In FIG. 5, unlike Examples 1 and 2, no hetero peak was obtained at the time of Mm detection, and only a gentle single detection peak was obtained. In such an appearance pattern of detection peaks, it is difficult to clearly distinguish rs8103142. From the above, it was shown that the probe of SEQ ID NO: 22 is not suitable for detection of rs8103142. SEQ ID NO: 22 has the same number of bases as SEQ ID NO: 12. Therefore, the number of bases in the probe was considered to be unrelated to whether or not it was suitable for detection of rs8103142.
実施例3．ヒトDNAから増幅された核酸を検出対象試料としたrs8103142検出実験1
ヒトDNAから、rs8103142及びその周辺領域の塩基配列からなるDNAを増幅し、増幅された2本鎖DNAを検出対象試料として、該検出対象試料に対するプローブの融解温度に基づいてrs8103142の検出を試みた。増幅反応及び融解曲線解析は一つの反応系内で連続的に行った。具体的には次のように行った。
Example 3
From human DNA, DNA consisting of the base sequence of rs8103142 and its surrounding region was amplified, and detection of rs8103142 was attempted based on the amplified double-stranded DNA as a detection target sample and the melting temperature of the probe with respect to the detection target sample . Amplification reaction and melting curve analysis were performed continuously in one reaction system. Specifically, it was performed as follows.
＜4-1．ヒトDNA溶液の調製＞
rs8103142のメジャータイプをホモで有することが既に確認されているヒトDNA（以下「MM」と示す）、rs8103142のメジャータイプとマイナータイプの両方を有することが既に確認されているヒトDNA（以下「Mm」と示す）、rs8103142のマイナータイプをホモで有することが既に確認されているヒトDNA（以下「mm」と示す）を用意した。各ヒトDNAを、10mM Tris-HCl（pH 7.5）で約1ng/μLとなるよう希釈して、ヒトDNA溶液を調製した。
<4-1. Preparation of human DNA solution>
Human DNA that has already been confirmed to have a major type of rs8103142 (hereinafter referred to as “MM”), human DNA that has already been confirmed to have both a major type and a minor type of rs8103142 (hereinafter referred to as “Mm”) And human DNA (hereinafter referred to as “mm”) that has already been confirmed to have a minor type of rs8103142 in homo form. Each human DNA was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) to be about 1 ng / μL to prepare a human DNA solution.
＜4-2．プライマー溶液の調製＞
配列番号168、174、192、又は215で示される塩基配列からなる1本鎖DNAをフォワードプライマーとして、配列番号265、268、273、278、292、又は311で示される塩基配列からなる1本鎖DNAをフォワードプライマーとして用いた。該プライマーを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で、フォワードプライマーについては10μMになるように、リバースプライマーについては100μMになるように希釈して、プライマー溶液を調製した。
<4-2. Preparation of primer solution>
Single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 265, 268, 273, 278, 292, or 311 using the single-stranded DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 168, 174, 192, or 215 as a forward primer DNA was used as a forward primer. The primer was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) to 10 μM for the forward primer and 100 μM for the reverse primer to prepare a primer solution.
＜4-3．プローブ溶液の調製＞
配列番号11又は12で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAをプローブとして用いた。該プローブを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で10μMになるように希釈して、プローブ溶液を調製した。
<4-3. Preparation of probe solution>
A single-stranded DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 12 and labeled at the 3 ′ end with BODIPY-FL was used as a probe. The probe was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) to 10 μM to prepare a probe solution.
＜4-4．反応溶液の調製＞
以下の試薬を含む10μLの反応溶液を調製した。なお、反応溶液の容量は精製水で調製した。
（e）フォワードプライマー溶液（配列番号168、174、192、又は215） 0.4μL
（f）リバースプライマー溶液（配列番号265、268、273、278、292、又は311） 0.2μL
（g）プローブ溶液（配列番号11又は12） 0.4μL
（h）KOD Mix（ジーンキューブ（R）テストベーシック、東洋紡製） 3μL
（i）PPD Mix（ジーンキューブ（R）テストベーシック、東洋紡製） 3μL
（j）ヒトDNA溶液（MM、Mm、又はmm） 3μL
<4-4. Preparation of reaction solution>
A 10 μL reaction solution containing the following reagents was prepared. The volume of the reaction solution was prepared with purified water.
(E) Forward primer solution (SEQ ID NO: 168, 174, 192, or 215) 0.4 μL
(F) Reverse primer solution (SEQ ID NO: 265, 268, 273, 278, 292, or 311) 0.2 μL
(G) Probe solution (SEQ ID NO: 11 or 12) 0.4 μL
(H) KOD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3μL
(I) PPD Mix (Gen Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3μL
(J) Human DNA solution (MM, Mm, or mm) 3μL
＜4-5．増幅反応及び融解曲線解析＞
全自動遺伝子解析装置（GENECUBE（登録商標、東洋紡製））を用いて増幅反応及び融解曲線解析を行った。具体的には、反応溶液を（94℃ 2分）→［（97℃ 1秒）→（60℃ 3秒）→（63℃ 5秒）］×50サイクルで処理することにより検出対象試料（rs8103142及びその周辺領域の塩基配列からなるDNA）を増幅し、続けて（94℃ 30秒）→（39℃ 30秒）→（39から75℃へ0.09℃/秒で昇温）で処理し、実施例1と同様に蛍光量を測定することにより、検出対象試料に対するプローブの融解曲線を求めた。
<4-5. Amplification reaction and melting curve analysis>
Amplification reaction and melting curve analysis were performed using a fully automatic gene analyzer (GENECUBE (registered trademark, manufactured by Toyobo)). Specifically, the sample to be detected (rs8103142) was processed by treating the reaction solution at (94 ° C for 2 minutes) → [(97 ° C for 1 second) → (60 ° C for 3 seconds) → (63 ° C for 5 seconds)] x 50 cycles. And DNA consisting of the nucleotide sequence of the surrounding region) (94 ° C. for 30 seconds) → (39 ° C. for 30 seconds) → (Temperature from 39 to 75 ° C. at 0.09 ° C./second) By measuring the amount of fluorescence in the same manner as in Example 1, the melting curve of the probe with respect to the sample to be detected was determined.
＜4-6．結果＞
反応溶液の調製に用いた、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブの組み合わせ、及び該組み合わせの融解曲線を示す図番号を表1に示す。
<4-6. Result>
Table 1 shows the combinations of forward primer, reverse primer, and probe used for the preparation of the reaction solution, and the figure numbers showing the melting curves of the combination.
図6〜図25より、増幅反応及び融解曲線解析を一つの反応系内で連続的に行って、rs8103142のメジャーホモ、ヘテロ、マイナーホモを識別できることが示された。以上から、上記プローブは核酸増幅反応後の反応産物を検出可能であること、上記プローブとプライマーを同じ反応系で混和させても核酸増幅工程および検出工程を互いに阻害しないことが示された。 From FIG. 6 to FIG. 25, it was shown that the major homo, hetero, and minor homo of rs8103142 can be identified by performing the amplification reaction and the melting curve analysis continuously in one reaction system. From the above, it was shown that the probe can detect the reaction product after the nucleic acid amplification reaction and that the nucleic acid amplification step and the detection step are not inhibited from each other even if the probe and the primer are mixed in the same reaction system.
配列の表示
配列表の配列番号1〜319で示される塩基配列を、表2〜13に示す。
Tables 2 to 13 show the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 319 in the sequence display table.
Claims (18)
（A）配列番号3で示される塩基配列中の、5’末端から23番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド、又は
（B）配列番号5または6で示される塩基配列中の、5’末端から17番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。 Probe for detecting rs8103142, comprising the following polynucleotide (A) or (B):
(A) a polynucleotide comprising any one of consecutive 14 to 28 bases including the 23rd base from the 5 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, or (B) SEQ ID NO: 5 or 6 A polynucleotide comprising any one of consecutive 14 to 28 bases, including the 17th base from the 5 ′ end in the base sequence shown.
（A）配列番号3で示される塩基配列中の、5’末端から23番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド、又は
（B）配列番号5または6で示される塩基配列中の、5’末端から17番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。 A composition for detecting rs8103142 in a nucleic acid derived from a subject, comprising the following polynucleotide (A) or (B):
(A) a polynucleotide comprising any one of consecutive 14 to 28 bases including the 23rd base from the 5 ′ end in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, or (B) SEQ ID NO: 5 or 6 A polynucleotide comprising any one of consecutive 14 to 28 bases, including the 17th base from the 5 ′ end in the base sequence shown.
（C）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から240番目〜270番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
（D）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から52番目〜81番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。 The composition according to claim 8 or 9, further comprising a primer set for amplifying a nucleic acid containing rs8103142, comprising the following forward primer (C) and the reverse primer (D):
(C) a forward primer consisting of any of continuous 20 to 30 bases in the base sequence consisting of the 240th to 270th bases from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (D) SEQ ID NO: 2 A reverse primer consisting of any one of 20 to 30 consecutive bases in the base sequence consisting of the 52nd to 81st bases from the 5 ′ end of the base sequence shown in FIG.
（工程2）被検体由来の核酸に対する、請求項1〜8のいずれかに記載のプローブの融解温度を測定すること、
（工程3）工程2で測定された融解温度と、rs8103142のタイプが既知である核酸に対する前記プローブの融解温度とを比較すること、及び
（工程4）工程3の比較結果に基づいて該SNPを決定すること。 A method for detecting rs8103142 in a nucleic acid derived from a subject, comprising the following steps 2, 3, and 4:
(Step 2) measuring the melting temperature of the probe according to any one of claims 1 to 8 with respect to the nucleic acid derived from the analyte,
(Step 3) comparing the melting temperature measured in Step 2 with the melting temperature of the probe for a nucleic acid of known rs8103142 type, and (Step 4) the SNP based on the comparison result in Step 3 To decide.
（工程1）rs8103142を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを用いて、被検体の生体試料中の核酸を増幅して、被検体由来の核酸を得ること。 The method of claim 11, further comprising the following step 1:
(Step 1) Amplifying a nucleic acid in a biological sample of a subject using a primer set for amplifying a nucleic acid containing rs8103142, to obtain a nucleic acid derived from the subject.
（C）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から240番目〜270番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
（D）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から52番目〜81番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。 The method according to claim 12, wherein the primer set consists of a forward primer (C) below and a reverse primer (D) below:
(C) a forward primer consisting of any of continuous 20 to 30 bases in the base sequence consisting of the 240th to 270th bases from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (D) SEQ ID NO: 2 A reverse primer consisting of any one of 20 to 30 consecutive bases in the base sequence consisting of the 52nd to 81st bases from the 5 ′ end of the base sequence shown in FIG.
（C）配列番号1で示される塩基配列の5’末端から240番目〜270番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
（D）配列番号2で示される塩基配列の5’末端から52番目〜81番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。 The composition according to claim 17, wherein the primer set comprises the following forward primer (C) and the reverse primer (D) below:
(C) a forward primer consisting of any of continuous 20 to 30 bases in the base sequence consisting of the 240th to 270th bases from the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (D) SEQ ID NO: 2 A reverse primer consisting of any one of 20 to 30 consecutive bases in the base sequence consisting of the 52nd to 81st bases from the 5 ′ end of the base sequence shown in FIG.
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