JP2015004659A - プレート表面上に二酸化チタンを有するプレート、その製造方法及び使用 - Google Patents

Abstract

【課題】プレート表面上に二酸化チタンを有するプレート、並びにその製造方法及びその使用を提供する。
【解決手段】プレートは（Ａ）基板、（Ｂ）基板の少なくとも１つの表面上のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層、及び（Ｃ）ポリジメチルシロキサン層上の二酸化チタン粒子の１以上の凝集、を含む。プレートはリン酸化ペプチドの精製に有用である。
【選択図】図２

Description

本出願は台湾知的財産局において２０１３年６月２０日に出願された台湾特許出願第１０２１２１８９４号の利益を主張し、その開示はその全体が本明細書において参照により援用される。

本発明は、プレート表面上に二酸化チタン（ＴｉＯ₂）を有するプレート、並びにその製造方法及び使用に関する。本発明はまた、プレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの使用を含む、リン酸化ペプチドを精製する方法に関する。

関連技術の説明
タンパク質リン酸化は一般的なタンパク質翻訳後修飾であり、それは可逆的なタンパク質修飾過程である。タンパク質リン酸化は、細胞の成長、代謝、及びアポトーシス、並びに細胞内でのシグナル送達における制御など、生体内での多くの生化学反応の制御に関連していることが知られている。
生体内における特定のタンパク質の過剰リン酸化は病気を引き起こす可能性がある。例えば、人間の脳内の微小管結合タンパク質であるタウの過剰リン酸化は、細胞内での異常なタンパク質の蓄積を引き起こす恐れがあり、それは神経原線維変化の原因となり、かつアルツハイマー病をもたらすことが調査により示されている。したがって、リン酸化タンパク質の研究はプロテオミクスにおける重要な課題である。

リン酸化タンパク質のこれまでの研究では、リン酸化タンパク質の特徴及びリン酸基の結合部位を分析するために、質量分析（ＭＳ）が主に使用されている。しかしながら、タンパク質試料におけるリン酸化タンパク質のＭＳシグナルを特定するとき、極めて低濃度のリン酸化ペプチドのシグナルは大量の非リン酸化ペプチドのシグナルによって通常抑制される。
さらに、非リン酸化ペプチドの酸性度と比較するとリン酸化ペプチドの酸性度は高いため、リン酸化ペプチドは陽イオンの形成において効率が低く、それ故、ＭＳによるリン酸化ペプチドの特定は非常に困難である。したがって、ＭＳによりリン酸化ペプチドを検出する感度を向上させるため、タンパク質混合物からリン酸化ペプチドを精製することが、ＭＳ分析の前に極めて重要である。

リン酸化ペプチドを精製するための１つの従来の手法は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）であり、それはＦｅ³⁺又はＧａ³⁺などの金属イオンを使用して、リン酸化ペプチドのリン酸基をキレート化する。
しかしながら、ＩＭＡＣ手法はイオン相互作用に基づくため、その選択性は酸性の非リン酸化ペプチドの非特異的結合によって通常制限される。リン酸化ペプチドを精製するための他の知られている手法は、金属酸化物アフィニティークロマトグラフィー（ＭＯＡＣ）であり、それは非リン酸化タンパク質とリガンドとの間の非特異的結合を防止するために、精製の際に酸性緩衝液を使用する。

ＴｉＯ₂はリン酸化ペプチドと特異的に結合可能なことが知られている。リン酸化ペプチド精製用のピペットチップを製造するために、ＭＯＡＣ手法においてＴｉＯ₂を使用することが開発されてきた。しかしながら、ＴｉＯ₂チップなどの従来のピペットチップがリン酸化ペプチドの精製に使用されるとき、ＴｉＯ₂ビーズは最初にピペットチップにロードされる必要があり、その後ペプチド試料のローディング、洗浄、及び溶出の段階が続き、それらは遠心分離により行われる。
精製手順の後、溶出試料をＭＳ試料プレート上に載せ、ＭＳ分析が行われる。したがって、リン酸化ペプチドを精製するためのＴｉＯ₂チップなどのピペットチップの使用からは、ハイスループットの試料分析をもたらすことができず、かつ複数の処理段階の間、時間がかかり、多大な労力を要し、試料を消費するという不利益を有し、実験再現性は、試料の溶出速度などの操作変数により影響を受ける可能性がある。

本発明の発明者は、ＴｉＯ₂は単純な手法によって一表面上に固定化することが可能であり、そのためプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートを提供することを見出した。このようなプレートは、リン酸化ペプチドの精製に使用されると、容易な操作、ハイスループット（すなわち試料は単一バッチで精製することができる）、及び高い実験再現性を含む利点を有し、その基板は、容易に再生することができる。

本発明の目的は、プレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートを提供することであり、該プレートは下記を含む：
（Ａ）基板、
（Ｂ）基板の少なくとも１つの表面上のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層、及び
（Ｃ）ＰＤＭＳ層上のＴｉＯ₂粒子の１以上の凝集。

本発明の他の目的は、上記のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの製造方法を提供することであり、該方法は下記の段階を含む：
（ａ）基板を提供する段階、
（ｂ）基板の少なくとも１つの表面上にＰＤＭＳ層を形成する段階、
（ｃ）ＰＤＭＳ層の少なくとも一部分にＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液を適用する段階、及び
（ｄ）適用したＴｉＯ₂懸濁液を乾燥させることで、ＰＤＭＳ層上にＴｉＯ₂粒子の１以上の凝集を形成する段階。

本発明のまたさらなる目的は、リン酸化ペプチドを精製する方法を提供することであり、該方法は下記の段階を含む：
（ｉ）リン酸化ペプチド含有溶液を、前述のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレート上のＴｉＯ₂粒子の凝集と、１分〜６０分の範囲の時間接触させる段階、
（ｉｉ）ＴｉＯ₂粒子の凝集を洗浄溶液で洗い流す段階、及び、
（ｉｉｉ）ＴｉＯ₂粒子の凝集を溶出溶液と１分〜３０分の範囲の時間接触させて、リン酸化ペプチドを溶出する段階。

本発明のために実施される詳細な技術及び好ましい実施形態を、請求項に係る発明の特徴をよく理解するよう当業者のために添付の図面と併せて下記の段落に記載する。

本発明を添付の図面を参照しながら以下に詳細に記載する。図面において：

図１（ａ）は本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂粒子を有するプレートの実施形態における、ＴｉＯ₂粒子の凝集を示す顕微鏡写真である。図１（ｂ）は本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの実施形態を示す、光学式走査器により走査された画像である。 図２（ａ）は未精製オボアルブミンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。図２（ｂ）は本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂粒子を有するプレートの実施形態により精製されたオボアルブミンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルであり、ＴｉＯ₂粒子の粒径は約５μｍである。図２（ｃ）は本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂粒子を有するプレートの実施形態により精製されたオボアルブミンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルであり、ＴｉＯ₂粒子の粒径は１５０ｎｍ未満である。 図３（ａ）は未精製の複雑なペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。図３（ｂ）は、本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの実施形態により精製された複雑なペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。 図４（ａ）は未精製のリン酸化ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。図４（ｂ）は、本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの実施形態により精製されたリン酸化ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。図４（ｃ）は、図４（ａ）及び図４（ｂ）の１３６８．６８／１０４６．５４ｍ／ｚ及び１４４８．６４／１０４６．５４ｍ／ｚのピーク比率を比較する棒グラフである。 図５（ａ）は、本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの実施形態により精製された２ｆｍｏｌｅのβ‐カゼインのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。図５（ｂ）はＴｉＯ₂チップにより精製された２０ｆｍｏｌｅのβ‐カゼインのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルである。 図６は本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの実施形態により精製されたβ‐カゼイン（０．５μｇ〜１００μｇ）のピークシグナルのシグナル強度比（２０６１．８ｍ／ｚ対２４６５．２ｍ／ｚ）を示す図である。

以下に、本発明のいくつかの実施形態を詳細に説明する。しかしながら、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は様々な実施形態で実施することができ、かつ本明細書に記載の実施形態に限定されるべきではない。
さらに、本明細書において別段の定めがある場合を除き、本発明の明細書（特に特許請求の範囲）に記載の表現「ａ」、「ｔｈｅ」等は、単数形及び複数形の両方を含むべきである。本明細書で使用される用語は、すぐ下に記載の例示的な定義と一致するその通常の意味が与えられる。

タンパク質リン酸化はリン酸（ＰＯ₄）基のタンパク質への結合を指し、それはセリン、トレオニン、及び／又はチロシンの残基において通常起こる。ＴｉＯ₂とリン酸基との間に優れた結合親和性があるため、ＴｉＯ₂はリン酸化タンパク質の精製に使用可能であることが知られている。しかしながら、上述の通り、リン酸化タンパク質の精製を実施するためのＴｉＯ₂の固定化に使用される従来方法には多くの不利益がなお存在する。したがって、ＴｉＯ₂を容易かつ効果的に固定化する方法がいまだに必要とされている。

本発明の発明者は、ＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液を介した凝集形態において、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層上にＴｉＯ₂粒子を効果的に固定化可能であることを偶然発見したため、プレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートを提供する。プレートはリン酸化ペプチドの精製に有用である。特に、本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートは、（Ａ）基板、（Ｂ）基板の少なくとも１つの表面上のＰＤＭＳ層、及び（Ｃ）ＰＤＭＳ層上のＴｉＯ₂粒子の１以上の凝集、を含む。

本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにおいて、基板はＰＤＭＳ層を支持するのに使用される構成要素である。基板の形状及び材料は、如何なる特定の制限なしに、実際の用途に応じて選択することができる。一般に、ＰＤＭＳは様々な材料に対して良好な接着性を有する材料である。したがって、本発明のプレートに使用される基板は、金属基板、ガラス基板、ポリマー基板、例えばポリメタクリレート基板、ポリカーボネート基板、及びポリエチレンテレフタレート基板、並びに木材基板から成る群より選択することができる。
さらに、基板は実際の必要性に応じて、平面又は非平面（例えば基板の表面上に溝を有する基板）とすることができる。本発明の一実施形態では、円盤状のステンレス鋼基板が使用される。

ＰＤＭＳは、不燃性、不活性、及び非毒性の高分子有機ケイ素化合物である。ＰＤＭＳは硬化する前は粘稠な液体であり、次式（Ｉ）のような構造を有する：

ＰＤＭＳの粘度はｎ値の増加と共に増加する。ＰＤＭＳの構造中のメチル基及び末端基の部分は、他の官能基、例えば水素基、ビニル基、又はフェニル基で置換されてもよい。

硬化すると、ＰＤＭＳは様々な基板に対して良好に接着する疎水性層となる。さらに、硬化ＰＤＭＳは可撓性、耐熱性、及び光学的に透明である。硬化ＰＤＭＳは、人工臓器、ガイドチューブ、コンタクトレンズ、及び薬物送達システムに関する医療分野で使用することができる。さらに、硬化ＰＤＭＳは、産業界においてマイクロ流体デバイス、及びマイクロリアクタに使用することができ、又はシーラント若しくは絶縁体等として使用することができる。

本発明によるプレートにおいて、ＰＤＭＳ層はＰＤＭＳを提供するのに適した任意の方法によって基板表面上に形成することができる。例えば、水素官能性ＰＤＭＳとビニル官能性ＰＤＭＳとを混合し、その後Ｐｔ触媒を任意で添加して、基板上に硬化ＰＤＭＳ層を形成することにより、ＰＤＭＳ層を形成することができる。前述の硬化反応は、水素官能性ＰＤＭＳのシラン基とビニル官能性ＰＤＭＳのビニル基との間のさらなる反応により達成される。
水素官能性ＰＤＭＳの例としては、限定されるものではないが、ポリ（メチルヒドロシロキサン）、トリメチルシリル末端のポリ（メチルヒドロシロキサン）、トリメチルシリル末端のポリ（ジメチルシロキサン‐メチルヒドロシロキサン共重合体）、ヒドロキシ末端のポリ（ジメチルシロキサン）、及び水素化物末端のポリ（ジメチルシロキサン）が挙げられる。
ビニル官能性ＰＤＭＳの例としては、限定されるものではないが、ビニル末端のポリ（ジメチルシロキサン）、及びジビニル末端のポリ（ジメチルシロキサン‐ジフェニルシロキサン共重合体）が挙げられる。Ｐｔ触媒の例としては、限定されるものではないが、ヘキサクロロ白金酸、二酸化白金、塩化白金酸カリウム、二塩化白金、及び四塩化白金が挙げられる。

さらに、硬化性ＰＤＭＳを製造するための市販キットを使用して本発明のＰＤＭＳ層を提供することもできる。一般に、硬化性ＰＤＭＳの市販キットは、ＰＤＭＳエラストマー基剤及びＰＤＭＳエラストマー硬化剤を含む。このような市販キットを使用する場合、通常、基剤及び硬化剤を特定の比率で混合して混合物を得て、その後得られた混合物を任意に加熱することでＰＤＭＳを硬化する。
本発明の一実施形態では、ＰＤＭＳエラストマー基剤（試薬Ａ）及びＰＤＭＳエラストマー硬化剤（試薬Ｂ）を含む、市販のＳｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４有機ケイ素エラストマーキット（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，米国）を使用してＰＤＭＳ層を提供する。ＰＤＭＳ層を提供するためのＳｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４有機ケイ素エラストマーキットを用いた操作段階は、下記を含む：（１）試薬Ａ及び試薬Ｂを３：１〜１５：１の範囲の体積比、好ましくは約１０：１の体積比で混合する段階、（２）得られた混合溶液を基板の少なくとも１つの表面上に適用する段階、及び（３）基板を４０℃〜２００℃の温度範囲で５分〜１２０分間乾燥させて、基板表面上にＰＤＭＳ層を形成する段階。

ＰＤＭＳ層を提供するための段階（２）で使用される上記のＳｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４有機ケイ素エラストマーキットは、当業者に周知のあらゆる方法により適用することができる。適した適用方法には、限定されるものではないが、スクリーン印刷法、コーティング法、又はスポッティング法がある。適したコーティング法は、例えばナイフコーティング、ローラーコーティング、マイクログラビアコーティング、フローコーティング、ディップコーティング、スプレーコーティング、カーテンコーティング、又はそれらの組み合わせであってもよい。例えば、試薬Ａと試薬Ｂとの混合物の適当量が基板上に適用された後、任意にガラススライド又はローラーを用いて平滑化することができる。

本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにおいて、ＰＤＭＳ層の厚さは、如何なる特定の制限なしに、実際の用途に応じて調整することができる。例えば、基板上に被覆されるＰＤＭＳ溶液の体積及び／又は被覆頻度を調整することで、それにより提供される乾燥ＰＤＭＳ層の厚さを制御することができる。

本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにおいて、１以上のＴｉＯ₂凝集がＰＤＭＳ層上にあり、各凝集はＴｉＯ₂粒子から実質的に構成されている。図１（ａ）は本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂粒子を有するプレートの実施形態における、ＴｉＯ₂粒子の凝集の顕微鏡写真を示しており、ＴｉＯ₂粒子の粒径は約５μｍである。
図１（ｂ）は本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂粒子を有するプレートの他の実施形態における、光学式走査器で走査された画像を示している。ＴｉＯ₂粒子はＰＤＭＳ層の表面上に複数の凝集として分布しており、それ故、得られたプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートに複数のリン酸化ペプチド試料の精製を同時に行わせることができる。

本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにおいて、ＴｉＯ₂凝集中のＴｉＯ₂粒子はそれらの粒径において特に制限されない。しかしながら、ＴｉＯ₂粒子が１５０ｎｍ未満などのナノスケールの粒径である場合、ＴｉＯ₂粒子のもたらされた凝集と非リン酸化ペプチドとの間に非特異的結合が発生する可能性があり、これはリン酸化タンパク質を精製するための特異性が減少する原因となる。したがって、本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにおいて、ＴｉＯ₂凝集中のＴｉＯ₂粒子は少なくとも１５０ｎｍ、好ましくは０．５μｍ〜１０μｍ、及びより好ましくは１μｍ〜５μｍの粒径を通常有する。

本発明はまた、上記のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの製造方法を提供し、該方法は下記の段階を含む：（ａ）基板を提供する段階、（ｂ）基板の少なくとも１つの表面上にＰＤＭＳ層を形成する段階、（ｃ）ＰＤＭＳ層の少なくとも一部分にＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液を適用する段階、及び（ｄ）適用したＴｉＯ₂懸濁液を乾燥させることで、ＰＤＭＳ層上にＴｉＯ₂粒子の１以上の凝集を形成する段階。
本発明の方法において、段階（ａ）に含まれる基板の種類及び性質、段階（ｂ）に含まれるＰＤＭＳ層の製造方法、及び段階（ｃ）におけるＴｉＯ₂粒子の粒径は、本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートに関して本明細書の上記に記載された通りである。

本発明による方法の段階（ｃ）において、ＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液が使用され、それは本発明において極めて重要である。本発明の発明者は、ＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液が疎水性のＰＤＭＳ層に適用されて乾燥すると、ＴｉＯ₂粒子はＰＤＭＳ層の表面上に固定化可能であることを予期せず見出した。しかしながら、非水性懸濁液を使用する場合、固定化ＴｉＯ₂の所望の有効性を達成することは不可能である。
当業者に周知のあらゆる方法を用いて、水性懸濁液をＰＤＭＳ層の少なくとも一部分に適用することができる。例えば、本発明の一実施形態では、ＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液は約２μｌ〜５μｌの量をピペットチップで繰り返し吸い上げられ、その後ＰＤＭＳ層上に滴下されて１以上の個々の液滴を形成することで、乾燥後にＰＤＭＳ層上にＴｉＯ₂粒子から成る１以上の凝集が形成される。

ＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液を適用する手順において、ＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液の各液滴の体積は、実際の用途に応じて調整することができる。一般に、ＴｉＯ₂水性懸濁液の液滴をより大きな体積で適用することにより、又は水性懸濁液中のＴｉＯ₂粒子の濃度を増加した液滴を適用することにより、より大きな体積のＴｉＯ₂粒子の凝集を乾燥後に得ることができる。リン酸化ペプチドの精製に使用されるような、このようなより大きなＴｉＯ₂凝集は、試料のローディング容量の増加を可能とする。

さらに、本発明による方法において、水の極性よりも低い極性を有する有機溶媒をＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液に任意に添加することが可能であり、それにより水性懸濁液の極性を減少させ、ＰＤＭＳ層上に適用された水性懸濁液の液滴とＰＤＭＳ層との間の接触角を減少させ、かつＴｉＯ₂粒子の形成された凝集とＰＤＭＳ層との間の接触面積を増加させる。
水の極性よりも低い極性を有する有機溶媒は、限定されるものではないが、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ｎ‐プロパノール、イソプロパノール、ｎ‐ブタノール、イソブタノール、アクリロニトリル、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、ベンゼン、メチルベンゼン、ｎ‐ヘキサン、ｎ‐ペンタン、又はそれらの組み合わせであってもよい。本発明のいくつかの実施形態では、アセトニトリルがＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液に添加されることで、ＰＤＭＳ層とより大きな接触面積を有するＴｉＯ₂粒子の凝集がもたらされる。

本発明による方法の段階（ｄ）では、ＰＤＭＳ層に適用されたＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液又はその液滴は、あらゆる適した手法、例えば空気乾燥、ベーキング、又は室温での自然乾燥により乾燥可能である。高温加熱手順は必ずしも必要ではない。ＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液は、１０℃〜１００℃の温度範囲で乾燥されることが好ましい。より好ましくは、ＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液は２０℃〜８０℃の温度範囲で乾燥される。本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液は、オーブンで８０℃にて乾燥されるか、又は室温で自然乾燥にて乾燥される。本発明による方法は、低温乾燥段階を用いてＰＤＭＳ層上にＴｉＯ₂を固定化することができ、かつ高温焼結が関与しないため、より経済的である。

上述した通り、ＴｉＯ₂はリン酸化タンパク質のリン酸基と結合可能であるため、本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートは、リン酸化ペプチドの精製に有用である。
したがって、本発明はまた、本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートを用いたリン酸化ペプチドを精製する方法を提供し、該方法は下記の段階を含む：（ｉ）リン酸化ペプチド含有溶液を、本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレート上のＴｉＯ₂粒子の凝集と、１分〜６０分の範囲の時間接触させる段階、（ｉｉ）ＴｉＯ₂粒子の凝集を洗浄溶液で洗い流す段階、及び（ｉｉｉ）ＴｉＯ₂粒子の凝集を溶出溶液と、１分〜３０分の範囲の時間接触させて、リン酸化ペプチドを溶出する段階。

前述のリン酸化ペプチドを精製する方法の実施前に、本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂の凝集を有する表面は、表面から汚染物質を除去するために、任意に適した洗浄溶液、例えば０．１％のギ酸（ＦＡ）を用いて洗浄して乾燥することが可能である。

上記の段階（ｉ）において、リン酸化ペプチド含有溶液は加水分解されたタンパク質試料であり得る。例えば、精製されるタンパク質試料は、プロテアーゼで処理されて加水分解されたリン酸ペプチド含有溶液を提供することができる。適したプロテアーゼとしては、限定されるものではないが、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ‐Ｃプロテアーゼ、Ｌｙｓ‐Ｃプロテアーゼ、及びＡｓｐ‐Ｎプロテアーゼ等が挙げられる。

前述のプロテアーゼ処理の終了後、加水分解されたリン酸化ペプチドは、最初に乾燥されて緩衝溶液に溶解されることで、リン酸化ペプチド含有溶液を提供することが好ましい。その後、リン酸化ペプチド含有溶液は、本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレート上のＴｉＯ₂粒子の凝集と接触する。リン酸化ペプチドをＴｉＯ₂に結合させるために、接触時間は好ましくは１分〜６０分、より好ましくは２分〜２０分の範囲である。好ましくは、緩衝溶液は、アセトニトリル（ＡＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２，５‐ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、及びそれらの組み合わせから成る群より選択される成分を含む。
ＤＨＢは酸性アミノ酸残基（例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸）とＴｉＯ₂との間の静電相互作用を減少させることが可能であるため、リン酸化ペプチドのリン酸基とＴｉＯ₂粒子との間の結合親和性を高め、かつ非特異的な結合反応の減少が可能であることが知られている。

リン酸化ペプチド含有溶液とＴｉＯ₂粒子の凝集との接触段階が終了した後、ＴｉＯ₂粒子の凝集は洗浄溶液で洗い流されて、ＴｉＯ₂に結合していない非リン酸化ペプチドを除去する、すなわち段階（ｉｉ）である。
好ましくは、洗浄溶液は有機相及び酸を含み、有機相の例としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ｎ‐プロパノール、イソプロパノール、ｎ‐ブタノール、イソブタノール、アクリロニトリル、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、ベンゼン、メチルベンゼン、ｎ‐ヘキサン、ｎ‐ペンタン、及びそれらの組み合わせが挙げられ、かつ酸の例としては、置換又は非置換のギ酸、置換又は非置換の酢酸、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
本発明の一実施形態によれば、水溶液は６０ｗｔ％〜９０ｗｔ％のアセトニトリルを含み、１ｗｔ％〜５ｗｔ％のＴＦＡが洗浄溶液として使用される。

その後、上記の段階（ｉｉｉ）において、溶出溶液はＴｉＯ₂粒子の凝集と、好ましくは１分〜３０分の範囲の時間、より好ましくは２分〜２０分の範囲の時間接触して、リン酸化ペプチドを溶出する。好ましくは、溶出溶液は、アンモニア溶液（ＮＨ₄ＯＨ）、アンモニウム塩（例えば酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム）の水溶液、ギ酸の水溶液、及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。本発明の一実施形態では、アンモニア溶液が溶出溶液として使用される。

上記の段階（ｉｉｉ）の溶出手順が終了した後、精製リン酸化ペプチドが得られる。ここで、基板の種類及び後に行う応用の目的に応じて、本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートを（プレート表面上に溶出したリン酸化ペプチドを含有する溶出溶液を有する間）、直接分析することが可能である、又は溶出したリン酸化ペプチドを含有する溶出溶液を最初に収集して、その後収集された溶出溶液を分析する。
分析は、質量スペクトル分析、液体クロマトグラフィ、又は液体クロマトグラフィと質量スペクトル分析との組み合わせ、例えばＬＣ‐ＭＳ、ＨＰＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ、及びナノＬＣ‐ＭＳ／ＭＳを含むあらゆる適した分析方法であり得る。

本発明の一実施形態によれば、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦプレート、すなわちステンレス鋼基板が、プレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの調製に使用される。この実施形態では、ＴｉＯ₂と結合しない非リン酸化ペプチドを除去する段階（ｉｉ）の終了後、溶出溶液は各試料ウェル（すなわち図１（ｂ）に示される円形領域の内側領域）に移され、段階（ｉｉｉ）の溶出手順を実施する。
その後プレートは乾燥され、適したＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦマトリックス溶液が各試料ウェル中に添加されて、直接ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ実験を行うことで、他のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦプレートに精製リン酸化ペプチドの試料を載せることなく精製リン酸化ペプチドを分析する。

本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにおいて、基板は使用後に簡単な方法により再生することができる。例えば、ＰＤＭＳ層は再利用のために基板を再生するよう直接手作業で剥離することができる。

本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートは、複数のＴｉＯ₂粒子の凝集を有し得るため、プレートは単一バッチで複数のリン酸化ペプチドの試料を精製するのに使用することができる。
さらに、上述したように、リン酸化ペプチドは本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにより複雑な遠心分離段階なしで精製することが可能であるため、試料損失の割合を低減することができる。したがって、従来のＴｉＯ₂チップを用いたリン酸化ペプチドの精製と比較して、本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートは、ハイスループット、容易な操作、低い試料損失、高い実験再現性、及びその基板は容易に再生することができるという利点を有する。

本発明を以下の通り特定の実施例を用いてさらに詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は本発明を単に説明するために提供されており、本発明の範囲はそれにより制限されない。本発明の範囲は以下の特許請求の範囲に示される。

プレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの調製
最初に、１０重量部のＰＤＭＳエラストマー基剤（Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４ 試薬Ａ、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｉｎｃ．，米国、から購入）及び１重量部のＰＤＭＳエラストマー硬化剤（Ｓｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４ 試薬Ｂ、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｉｎｃ．，米国、から購入）を混合して、ＰＤＭＳ混合溶液を形成した。ＰＤＭＳ混合溶液をＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦプレート（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．，米国、から購入）の表面上に被覆し、任意にグラススライド又はローラー（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｉｎｃ．，米国、から購入）で平滑化し、オーブンにて８０℃で６０分間乾燥した。その後、５μｍの粒径を有する１０ｍｇのＴｉＯ₂粒子（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，日本、から購入）及び１５０ｎｍ未満の粒径を有する１０ｍｇのＴｉＯ₂粒子（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．，米国、から購入）をそれぞれ６０％アセトニトリルの１００μｌ水溶液中に懸濁させて、振盪して混合した。
ＴｉＯ₂粒子の水性懸濁液を約２μｌ〜５μｌの量でピペットチップを用いて繰り返し吸い上げ、ＰＤＭＳ層上に滴下して液滴を形成し（滴下段階において、各液滴は間隔をあけている）、その後、オーブンにて８０℃で１０分間乾燥させてプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの調製を完成した。

上記のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートを光学式走査器で走査した。走査画像が図１（ｂ）に示されており、ＴｉＯ₂粒子はＰＤＭＳ層の表面上に凝集の形態で固定化されており、それは走査画像において白色の円形領域で示されている。個々の円形領域の直径は約２．５ｍｍである（図１（ａ）を参照のこと）。

単一タンパク質試料からのリン酸化ペプチドの精製
（１）タンパク消化
オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．，米国、から購入）を５０ｍＭの炭酸アンモニウム溶液に溶解し、９０℃で２０分間加熱した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（１０ｍＭ）を試料に添加し、５６℃で２０分間加熱した。ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）（５５ｍＭ）を試料に添加し、２５℃で暗中に３０分間放置した。その後、酵素対基質の割合が１：５０（ｗ／ｗ）でトリプシンをタンパク質溶液に添加し、３７℃で１２時間タンパク質を加水分解した。加水分解されたペプチド溶液を遠心濃縮器内で乾燥した。

（２）リン酸化ペプチドの精製
上記のペプチド試料をローディング緩衝液（８０％ＡＣＮ、２％ＴＦＡ、及び２０〜２００ｍｇ／ｍｌＤＨＢを含む）に溶解した。ペプチド溶液（２μｌ）をピペットチップで吸い上げ、実施例１で調製したプレートのＴｉＯ₂粒子の凝集上に滴下して、２分〜５分の範囲の時間インキュベートした。その後、ＴｉＯ₂粒子の凝集を洗浄溶液（８０％ＡＣＮ、２％ＴＦＡ）で洗浄し、未結合の非リン酸化ペプチドを除去した。ＴｉＯ₂粒子の凝集と結合したリン酸化ペプチドを３μｌ〜５μｌの０．０５％ＮＨ₄ＯＨで溶出した。
ＴｉＯ₂粒子の凝集が乾燥した後、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦマトリックス溶液（２ｍｇ／ｍｌＤＨＢ／２５％ＡＣＮ、１％リン酸）をＴｉＯ₂粒子の凝集上に添加し、続いてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析を行った。

（３）ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析
試料をＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ／ＴＯＦ‐ＭＳ（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．，独国、から購入）で分析した。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦに対するペプチド質量較正を、ペプチド較正標準キット（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．から購入）を用いて実施した。スペクトルを下記の実験パラメータで取得した：反射モード、２５ｋＶ 加速電圧、２６．３ｋＶ 反射電圧、及び２０ｎｓパルスイオン抽出時間。

（４）結果
図２（ａ）、２（ｂ）、及び２（ｃ）は、オボアルブミンのトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析を示す質量スペクトルである。
図２（ａ）は未精製のオボアルブミントリプシンペプチド（対照群）のスペクトルであり、未精製のオボアルブミンペプチドの多数のピークシグナルを示している。リン酸化ペプチドのピークシグナル（２０８８．９０８ｍ／ｚ）のシグナル強度は、非リン酸化ペプチドの他の主要ピークシグナルのシグナル強度よりも著しく低かった。
図２（ｂ）は、プレート表面上に５μｍの粒径のＴｉＯ₂粒子を有するプレートにより精製されたオボアルブミン消化物のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルであり、リン酸化ペプチドの主要ピークシグナル（２０８８．８７９ｍ／ｚ）を示している。
図２（ｃ）は、プレート表面上に１５０ｎｍ未満の粒径のＴｉＯ₂粒子を有するプレートにより精製されたオボアルブミンのＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量スペクトルであり、リン酸化ペプチドのピークシグナル（２０８８．９３７ｍ／ｚ）及び非リン酸化ペプチドの他のピークシグナルの両方を示している。図２（ｂ）及び２（ｃ）における円形記号（すなわちＯ）は、８６ダルトンのリン酸化ペプチド断片を失ったペプチドのピークシグナルを表している。

図２（ａ）〜２（ｃ）に示されるように、本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートは、リン酸化ペプチドを効果的に精製するのに使用することができる。ナノサイズのＴｉＯ₂粒子を用いたプレートと比較すると、プレート表面上に５μｍの粒径のＴｉＯ₂粒子を有するプレートは、リン酸化ペプチドをより効果的に精製するのに使用することができる。
一方、リン酸化ペプチドがプレート表面上に１５０ｎｍ未満の粒径のＴｉＯ₂を有するプレートで精製されるとき、非特異的な結合が起こり得る。非特異的な結合は、リン酸化ペプチド及び非リン酸化ペプチドの結合に対するナノＴｉＯ₂粒子中のより多くの反応部位に起因しているであろうことが推測されている。

３つの非リン酸化タンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ミオグロビン、及びシトクロムＣ）、及び３つのリン酸化タンパク質（オボアルブミン、α‐カゼイン、及びβ‐カゼイン）（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．，米国、から購入）をそれぞれ５０ｍＭの炭酸アンモニウム溶液に溶解し、タンパク質混合物の溶液を形成した。その後、タンパク質を実施例２に示される方法を用いてトリプシンで消化した。各６つのタンパク質のトリプシンペプチド（２０ｆｍｏｌｅ）を混合し、実施例１で調製したプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレート（ＴｉＯ₂粒子の粒径は５μｍ）により精製し、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦで分析した。

図３（ａ）は、プレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートで精製していない複雑なペプチド混合物の溶液のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析を示す質量スペクトルであり、非リン酸化ペプチドのピークシグナルがスペクトル中の主要ピークであった。
図３（ｂ）は、プレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにより精製した複雑なペプチド混合物の溶液のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析を示す質量スペクトルであり、各記号の意味を下記に示す：「●」はα‐Ｓ１‐カゼインのリン酸化ぺプチドのピークシグナルを示している、「◆」はα‐Ｓ２‐カゼインのリン酸化ぺプチドのピークシグナルを示している、「★」はβ‐カゼインのリン酸化ぺプチドのピークシグナルを示している、「■」はオボアルブミンのリン酸化ぺプチドのピークシグナルを示している、及び「○」は８６ダルトンのリン酸化ペプチド断片を失ったペプチドのピークシグナルを示している。

表１は、本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにより精製されたか又は精製されていない、複雑なタンパク質混合物の溶液のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析の結果、各リン酸化ペプチドのピークシグナルのシグナルとノイズとの比率（Ｓ／Ｎ）（４回反復測定して平均化した）、並びにリン酸化ペプチド及びリン酸化部位（配列中の小文字「ｐ」はリン酸化部位を表している）を示している。

（ｎ．ｄ：不検出）

図３（ａ）、図３（ｂ）、及び表１における結果は、ペプチド混合物の溶液が本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにより精製されると、リン酸化ペプチドのそのＭＳシグナルは大幅に強化され、その一方で、非リン酸化ペプチドのＭＳシグナルは図３（ｂ）の質量スペクトルにおいてほとんど観測不可能であることを示している。
上記の結果は、本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートは、複数のタンパク質混合物の溶液からリン酸化ペプチドを効果的に精製するのに実際に使用することができるため、ＭＳ分析の際に、リン酸化ペプチドのＭＳシグナルが非リン酸化ペプチドにより抑制されることの防止が可能であることを示している。

試料の回収率の評価
本発明の方法により精製されたリン酸化ペプチド試料の回収率を評価するために、下記の２つの２０ｆｍｏｌリン酸化ペプチドを混合した：（１）ＶＮＱＩＧ（ｐＴ）ＬＳＥＳＩＫ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、１３６８．６８ｍ／ｚ、及び（２）ＶＮＱＩＧＴＬ（ｐＳ）Ｅ（ｐＳ）ＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、１４４８．６４ｍ／ｚ（配列中の小文字「ｐ」はリン酸化部位を表している）。
前述のリン酸化ペプチド混合物を、実施例２に示される方法により、本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレート（５μｍの粒径を有するＴｉＯ₂粒子）により精製した。未精製リン酸化ペプチド混合物を対照群として使用した。そして、精製したペプチド試料及び内部標準（２ｆｍｏｌｅアンジオテンシンＩＩ、１０４６．５４ｍ／ｚ）を混合して、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析を実施した。

図４（ａ）は精製していないリン酸化ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析を示す質量スペクトルである（３回反復測定して平均化した）。図４（ｂ）はプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにより精製されたリン酸化ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析を示す質量スペクトルである（３回反復測定して平均化した）。図４（ｃ）は図４（ａ）及び図４（ｂ）の１３６８．６８／１０４６．５４ｍ／ｚ及び１４４８．６４／１０４６．５４ｍ／ｚのピーク比率を比較した棒グラフであり、図４（ａ）の１３６８．６８／１０４６．５４ｍ／ｚ及び１４４８．６４／１０４６．５４ｍ／ｚのピーク比率は、それぞれ約０．３７（ＳＴＤ、０．０５）及び約０．１３（ＳＴＤ、０．０４）であり、かつ図４（ｂ）のそれらは、それぞれ約０．３３（ＳＴＤ、０．０５）及び約０．１２（ＳＴＤ、０．０３）である。したがって、２つの２０ｆｍｏｌｅリン酸化ペプチドの回収はそれぞれ約９０％及び約９２％であり、このような微量の試料を扱う上での非常に僅かな試料損失を示している。

試料の検出限界の評価
本発明の方法の検出限界を評価するため、かつ上記方法を従来の精製方法と比較するために、２ｆｍｏｌｅ、５ｆｍｏｌｅ、１０ｆｍｏｌｅ、及び２０ｆｍｏｌｅのβ‐カゼインを、それぞれ実施例２に示される方法によりトリプシンで消化した。その後、試料をプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレート（５μｍの粒径を有するＴｉＯ₂粒子）により精製し、質量分析で分析した。

ＴｉＯ₂ピペットチップを用いた精製段階を下記に示した：最初に、８０％ＡＣＮ及び０．１％ＴＦＡ中に懸濁したＴｉＯ₂ビーズをＧＥＬｏａｄｅｒピペットにロードし、プラスチックインジェクタを用いて空気圧を作り出し、２μｍのＴｉＯ₂の高さまでＴｉＯ₂チップにロードする段階、加水分解されたβ‐カゼインをＴｉＯ₂チップにロードする段階、２５μｌの８０％ＡＣＮ及び２％ＴＦＡ溶液で洗浄し、２０μｌの０．０５％ＮＨ₄ＯＨ溶液（ｐＨ１０．５）でリン酸化ペプチドを溶出する段階、ＴｉＯ₂チップのカラムを水で洗浄する段階、リン酸化ペプチドを１０μｌの５０％ＡＣＮ及び０．１％ＦＡ溶液で溶出する段階、溶出溶液を遠心濃縮器で乾燥する段階、乾燥試料を２μｌのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリックス溶液（２ｍｇ／ｍｌＤＨＢ／２５％ＡＣＮ及び１％リン酸（ＰＡ））に溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を実施する段階。
前述の試料のローディング、洗浄、及び溶出の段階は、遠心分離を用いて実施かつ操作した（ＴｉＯ₂チップの製造方法は、Ｌａｒｓｅｎ ＭＲら、Ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｉｔａｎｉｕｍ ｄｉｏｘｉｄｅ ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ＭＣＰ ２００５；４：８７３−８６で確認することができ、その全体が参照により本明細書に援用される。）

図５（ａ）はトリプシンで消化され、かつ本発明によるプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートにより精製された２ｆｍｏｌｅのβ‐カゼインのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す質量スペクトルである。２０６１．８ｍ／ｚのリン酸化ペプチドピークのＳ／Ｎは１４．７であり（４回反復測定して平均化した）、本発明の方法は非常に低い濃度において試料を精製するのに使用可能であることを示している。
図５（ｂ）はトリプシンにより加水分化され、かつ従来のＴｉＯ₂チップにより精製された２０ｆｍｏｌｅのβ‐カゼインのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す質量スペクトルであり、２０６１．８ｍ／ｚのリン酸化ペプチドピークのＳ／Ｎは１２．６である（３回反復測定して平均化した）。本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートによるリン酸化ペプチドを精製する方法はより高い検出感度を有することが、上記の結果から示される。

試料容量の評価
本発明の実施例１で調製したプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレート（各ＴｉＯ₂円形領域の直径は約２．５ｍｍ）で精製されるリン酸化ぺプチドに対する試料容量を評価するために、β−カゼイン試料（０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、５０μｇ、及び１００μｇ）を本発明の実施例２に記載の方法によりプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートで精製し、その後ＡＣＤＨペプチド試料（１００ｆｍｏｌｅ、２００ｆｍｏｌｅ、１ｐＭ、２ｐＭ、１０ｐＭ、及び２０ｐＭ）（配列ＲＰＶＫＶＹＰＮＧＡＥＤＥＳＡＥＡＦＰＬＥＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、２４６４．２Ｄａを有する副腎皮質刺激ホルモン断片、内部標準として作用する）とそれぞれ混合し、その後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した。

図６に示すように、０．５μｇ〜１００μｇのβ‐カゼインを本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートで精製すると、２０６１．８ｍ／ｚ（β−カゼインのリン酸化ピークシグナル）対２４６５．２ｍ／ｚ（内部標準）のピーク強度比は全て約１６であり、それは適用されたタンパク質量はプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートの容量限界をまだ下回っていることを意味する。１０μｇのβ‐カゼインを本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートで精製すると、２０６１．８ｍ／ｚ対２４６５．２ｍ／ｚのピーク強度比は約１５に僅かに減少した。
５０μｇのβ‐カゼインを本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートで精製すると、２０６１．８ｍ／ｚ対２４６５．２ｍ／ｚのピーク強度比は約５に大幅に降下した。１００μｇのβ‐カゼインを本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレートで精製すると、２０６１．８ｍ／ｚ対２４６５．２ｍ／ｚのピーク強度比は約２に大幅に降下した。
本発明のプレート表面上にＴｉＯ₂を有するプレート上の各ＴｉＯ₂円形領域の直径が約２．５ｍｍであるとき、各ＴｉＯ₂円形領域の試料容量は、β‐カゼイン精製に対して、最大で約１０μｇであることが上記の結果から示される。

本発明を詳細に記載したが、本発明の精神及び範囲内の修正は当業者に容易で明らかであろう。背景及び詳細な説明に関連して上記で議論した、上述の議論、当技術分野における関連知識、及び参考文献を考慮すると、それらの開示は全て参照により本明細書において援用されて、さらなる説明は不要であると考えられる。
さらに、本発明の態様及び様々な実施形態の部分は、全体的又は部分的に組み合わせ、又は入れ替え可能であることが理解されるべきである。そのうえ、上記の記載は単に例示を目的としており、本発明の制限を意図するものではないことを当業者は理解するであろう。

Claims (20)

1. プレート表面上に二酸化チタンを有するプレートであって、
   （Ａ）基板、
   （Ｂ）前記基板の少なくとも１つの表面上のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層、及び、
   （Ｃ）前記ポリジメチルシロキサン層上の二酸化チタン粒子の１以上の凝集、を含む、プレート。
2. 前記二酸化チタン粒子は０．５μｍ〜１０μｍの範囲の粒径を有することを特徴とする、請求項１に記載のプレート。
3. 前記二酸化チタン粒子は１μｍ〜５μｍの範囲の粒径を有することを特徴とする、請求項１に記載のプレート。
4. 前記基板は、金属基板、ガラス基板、ポリメタクリレート基板、ポリカーボネート基板、ポリエチレンテレフタレート基板、及び木材基板から成る群より選択されることを特徴とする、請求項１〜３のうちいずれか一項に記載のプレート。
5. プレート表面上に二酸化チタンを有するプレートの製造方法であって、該方法は下記の段階：
   （ａ）基板を提供する段階、
   （ｂ）前記基板の少なくとも１つの表面上にポリジメチルシロキサン層を形成する段階、
   （ｃ）前記ポリジメチルシロキサン層の少なくとも一部分に二酸化チタン粒子の水性懸濁液を適用する段階、
   （ｄ）適用した前記二酸化チタン懸濁液を乾燥させることで、前記ポリジメチルシロキサン層上に二酸化チタン粒子の１以上の凝集を形成する段階、を含む、請求項１〜４のうちいずれか一項に記載の方法。
6. 前記段階（ｃ）は、前記水性懸濁液を前記ポリジメチルシロキサン層上に滴下して、水性懸濁液の１以上の個々の液滴を形成する段階を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 前記二酸化チタン粒子は０．５μｍ〜１０μｍの範囲の粒径を有することを特徴とする、請求項５又は６に記載の方法。
8. 前記二酸化チタン粒子は１μｍ〜５μｍの範囲の粒径を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記水性懸濁液は水の極性よりも低い極性を有する有機溶媒をさらに含むことを特徴とする、請求項５〜８のうちいずれか一項に記載の方法。
10. 前記有機溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ｎ‐プロパノール、イソプロパノール、ｎ‐ブタノール、イソブタノール、アクリロニトリル、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、ベンゼン、メチルベンゼン、ｎ‐ヘキサン、ｎ‐ペンタン、及びそれらの組み合わせから成る群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 前記段階（ｄ）における前記乾燥段階は１０℃〜１００℃の温度範囲で実施されることを特徴とする、請求項５〜１０のうちいずれか一項に記載の方法。
12. 前記段階（ｄ）における前記乾燥段階は２０℃〜８０℃の温度範囲で実施されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記基板は、金属基板、ガラス基板、ポリメタクリレート基板、ポリカーボネート基板、ポリエチレンテレフタレート基板、及び木材基板から成る群より選択されることを特徴とする、請求項５〜１２のうちいずれか一項に記載の方法。
14. リン酸化ペプチドを精製する方法であって、該方法は下記の段階：
    （ｉ）リン酸化ペプチド含有溶液を、請求項１〜４のうちいずれか一項に記載のプレート上の前記二酸化チタン粒子の凝集と、１分〜６０分の範囲の時間接触させる段階、
    （ｉｉ）前記二酸化チタン粒子の凝集を洗浄溶液で洗い流す段階、及び、
    （ｉｉｉ）前記二酸化チタン粒子の凝集を溶出溶液と１分〜３０分の範囲の時間接触させて、リン酸化ペプチドを溶出する段階、を含む、方法。
15. 前記段階（ｉｉ）における前記洗浄溶液は有機相及び酸を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. 前記有機相は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ｎ‐プロパノール、イソプロパノール、ｎ‐ブタノール、イソブタノール、アクリロニトリル、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、ベンゼン、メチルベンゼン、ｎ‐ヘキサン、ｎ‐ペンタン、及びそれらの組み合わせから成る群より選択され、かつ前記酸は、置換又は非置換のギ酸、置換又は非置換の酢酸、及びそれらの組み合わせから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 前記有機相はアセトニトリルであり、かつ前記酸はギ酸であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
18. 前記段階（ｉｉｉ）における前記溶出溶液は、アンモニア溶液、アンモニウム塩の水溶液、ギ酸の水溶液、及びそれらの組み合わせから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１４〜１７のうちいずれか一項に記載の方法。
19. 前記段階（ｉｉｉ）における前記溶出溶液はアンモニア溶液であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
20. 前記段階（ｉ）における接触時間は２分〜２０分であり、かつ前記段階（ｉｉｉ）における接触時間は２分〜１０分であることを特徴とする、請求項１４〜１９のうちいずれか一項に記載の方法。