JP2014534962A - 組換えヒトｎａｇｌｕタンパク質およびその利用 - Google Patents

組換えヒトｎａｇｌｕタンパク質およびその利用 Download PDF

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Abstract

本発明は、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質の単離された混合物を含む組成物を提供し、その混合物中のＮａＧｌｕタンパク質の実質的な量は、そのタンパク質がヒト細胞中に効率的に内部移行されるようにする、増加したレベルのリン酸化マンノースを有する。本発明はまた、ＮａＧｌｕタンパク質のかかる混合物、遺伝子導入および発現に使用されるベクター、かかるベクターを包含する宿主細胞の産生方法、ならびにＮａＧｌｕタンパク質の混合物を単離し、精製する方法も提供する。本発明は、ＮａＧｌｕ関連疾患を治療する方法を更に提供する。【選択図】 図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１０月１２日に出願された米国仮出願第６１／５４６，２４８号に関し、またそれに対する優先権を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
サンフィリポ症候群Ｂ（ＬＳＤ）は、Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮａＧｌｕ）として知られているリソソーム酵素の欠乏によって引き起こされる、常染色体劣性リソソーム蓄積症である。ＮａＧｌｕは、リソソーム内のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の段階的崩壊の一部として、ヘパラン硫酸塩の分解に必要とされる。ＮａＧｌｕの欠乏または不在は、ヘパラン硫酸塩の蓄積および尿中***につながる。これまでに７０を超える異なる突然変異が特定されており、サンフィリポ症候群Ｂは、広範な分子および遺伝子多様性を示す。
２００，０００件の出生のうちおよそ１件は、サンフィリポ症候群Ｂの影響を受け、この欠乏は、主に幼児において現れる。初期の無症状期間の後、サンフィリポ症候群Ｂを患う患者は、通常、精神発達の遅延、行動上の問題を呈し、続いて進行性の知能低下の結果、重度の精神遅滞、痴呆症、および運動疾患をもたらす。言語の習得は、遅く、不完全である。重度に侵された患者は、２歳という早期に精神運動および言語発達の遅延を呈する場合がある。疾患は、通常、高まる行動障害および睡眠障害に進行する。臨床特徴は、主に神経性であるが、患者はしばしば、下痢、齲蝕歯、肝臓および脾臓肥大、関節のこわばり、多毛性のおよび／または粗い髪を発達し、血液凝固の問題を示す場合がある。疾病の最終段階においては、患者は、運動不能で無応答性となり、嚥下困難および発作を発症する。侵された小児の寿命は、典型的に、１０代後半から２０代前半を越えては延長しない。
患者において欠損している酵素を提供するための異なるアプローチが試みられてきた。酵素補充療法（ＥＲＴ）用のＮａＧｌｕを産生するために、ヒトＮａＧｌｕは、種々の哺乳類細胞培養系において発現されてきた。しかしながら、リソソームへと細胞内部に通行する、天然に生じるＮａＧｌｕとは対照的に、哺乳類細胞から産生および分泌される組換えＮａＧｌｕタンパク質は、マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）を含有しないか、または微量のマンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）しか含有しないことが見出された。分泌されたＮａＧｌｕにおけるＭ６Ｐ部分の不在または不足は、その形質膜の表面上にＭ６Ｐ受容体を有する、標的細胞（例えば、ヒト皮膚線維芽細胞）中へのその効率的な内部取り込みを妨害することが知られてきた（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， １９：２０２−２１１ （２０００）、およびＷｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ２１：２５１−２５９ （２００１）を参照されたい）。低度のリン酸化が、ＣＨＯ細胞中で発現される分泌マウスＮａＧｌｕ、ＨｅＬａ細胞中で発現される分泌ヒトＮａＧｌｕ、ヒト線維芽細胞中で発現される分泌ヒトＮａＧｌｕ、およびヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株２９３において発現される分泌ヒトＮａＧｌｕにおいて見られた（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， １９：２０２−２１１ （２０００）、Ｙｏｇａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５０２：４１５−４２５、およびＷｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ２１：２５１−２５９ （２００１）を参照されたい）。哺乳類細胞から分泌されるＮａＧｌｕタンパク質におけるＮグリカンのリン酸化がないことまたはリン酸化が弱いことは、内部取り込みされたタンパク質の濃度が、そもそも検出可能であったとしても、野生型レベルよりも１０００倍近く低いので、全ての上述の試みにより標的細胞によって効率的に取り込まれる酵素を産生することに失敗しているため、酵素補充療法に好適な組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質の開発にとって主要な妨害となる（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， １９：２０２−２１１ （２０００）を参照されたい）。現在までに、サンフィリポ症候群Ｂの治療のために利用可能な製品は何ら認可されていない。
天然アミノ酸配列を有する哺乳類細胞により産生される組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質（ｒｈＮａＧｌｕ）の、ＮａＧｌｕ欠乏マウスの中枢神経系（ＣＮＳ）への直接投与（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）中への髄腔内投与）が試みられてきたが、脳室の脳室上皮上のタンパク質の過剰な蓄積ならびに効率的な細胞取り込みに必須のＭ６Ｐ残基の欠如に起因して、脳への酵素の生体分布の成功を実証することに失敗している。同様に、天然アミノ酸配列を有する哺乳類細胞により産生されるｒｈＮａＧｌｕの全身投与（すなわち、静脈（ＩＶ）注射）もまた、脳へのタンパク質の局在化の成功を実証することに失敗している。高侵襲性の髄腔内投与に関連する既知の危険性に加えて、脳にｒｈＮａＧｌｕの標的を定める際のこれらの妨害は、サンフィリポ症候群Ｂの治療のための有効な治療法を達成するには大きすぎる課題となってきた。
したがって、酵素的に活性であり、かつタンパク質が血液脳関門（ＢＢＢ）を通ること、および標的細胞のリソソーム中へのタンパク質の効果的な内部移行を可能にする生理的特性を有する、安定なＮａＧｌｕタンパク質を提供する必要性が存在する。血液脳関門を効果的に横断し、ヒト標的細胞の内部に効率的に取り込まれる、組換えヒトＮａＧｌｕを提供することができる、高発現の強固なタンパク質産生プラットフォームに対する必要性もまた存在する。
本発明は、例えば、サンフィリポ症候群Ｂの治療における、治療法に有用な組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質（ｒｈＮａＧｌｕ）を含む、組成物に向けられる。本発明は、本明細書に記載されるｒｈＮａＧｌｕが１つ以上のグリコシル化パターンを有し、そのグリコシル化パターンが、ｒｈＮａＧｌｕが血液脳関門（ＢＢＢ）を効率的に横断し、その酵素が欠乏した動物の中枢神経系（ＣＮＳ）内の細胞中に取り込まれることを可能にし、脳内のα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の劇的な増加、ならびに基質レベルの低減をもたらすという、驚くべき予想外の発見に基づく。更に、本明細書に記載されるｒｈＮａＧｌｕは、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）中に効率的に取り込まれて、特定のグリコシル化をもたらすように設計されていない無修飾の哺乳類細胞から産生および分泌されるＮａＧｌｕタンパク質と比較して、増加した酵素活性をもたらす。ＮａＧｌｕタンパク質の増加した細胞取り込みはまた、増加した投薬量および頻度に対する必要性を最小化し、それによって免疫原性の潜在的な危険性を大幅に低減することによって、サンフィリポ症候群Ｂを患うヒト患者のための酵素補充療法において使用するための便益も提供する。
本明細書に記載されるｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、マンノースおよび／またはＭ６Ｐ受容体介在性エンドサイトーシスを介した効率的な細胞取り込みを可能にし、ヒト細胞へと正しく標的を定められるのに十分な量のオリゴ糖（例えば、マンノースおよびリン酸化マンノース（すなわち、Ｍ６Ｐ））を含有する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり、少なくとも１モルのタンパク質、例えば、１、２、３、４、５、または６モルのＭ６Ｐを含有する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕ欠乏ヒト細胞中に内部移行され得、その結果、内部移行されたタンパク質は、ＮａＧｌｕ欠乏細胞におけるＮａＧｌｕ活性の正常なレベル（すなわち、野生型レベル）を完全に（１００％以上）復元する。
また、マンノースのリン酸化から便益を得る、ｒｈＮａＧｌｕを発現する遺伝子導入鳥類を産生するための方法も本明細書に開示される。詳細には、卵管細胞中でｒｈＮａＧｌｕタンパク質を発現する遺伝子導入鳥類が、タンパク質を卵管の内腔中に分泌し、卵白中に沈着させる。かかるｒｈＮａＧｌｕを含有する鳥類卵もまた、本発明に含まれる。
本発明はまた、ｒｈＮａＧｌｕをコードする導入遺伝子を含有するベクターおよび宿主細胞、ならびにサンフィリポ症候群Ｂの治療のためのかかるｒｈＮａＧｌｕの適用において使用されるｒｈＮａＧｌｕを含む、薬学的組成物も企図する。
一態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列２４〜７４３を含む組換えヒトＮ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）の単離された混合物を含む、組成物を提供し、その混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも１０％は、マンノース−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）を有する少なくとも１つのグリカン構造を含む。一実施形態において、Ｍ６Ｐを有するｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕが欠乏した哺乳類細胞中に取り込まれることが可能であり、その結果、内部移行されたｒｈＮａＧｌｕは、同じタイプの野生型哺乳動物細胞中で観察される正常なＮａＧｌｕ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を復元する。別の実施形態において、グリカン構造は、Ｎ結合型グリカンである。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり少なくとも１モルのＭ６Ｐを含有する。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約１〜約６モルのＭ６Ｐを含有する。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２モルのＭ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約３モルのＭ６Ｐを含有する。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約４モルのＭ６Ｐを含有する。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約５モルのＭ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約６モルのＭ６Ｐを含有する。
一実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏した哺乳類細胞は、ヒト細胞である。別の実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞は、皮膚線維芽細胞、肝細胞、またはマクロファージである。一実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞は、神経細胞である。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、全身投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に効果的に送達される。１つの特定の実施形態において、静脈内投与されるとき、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に効果的に送達される。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、髄腔内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に効果的に送達される。
一実施形態において、Ｍ６Ｐを有するｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕ欠乏細胞によって内部移行され、体内で正常なＮａＧｌｕ活性の少なくとも１００％を復元する。一実施形態において、Ｍ６Ｐを有するｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり少なくとも２５モルのマンノースを含有する。
一実施形態において、その混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、Ｍ６Ｐを含有する。別の実施形態において、その混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも２０％が、少なくとも１つのＭ６Ｐを含有する。別の実施形態において、その混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも３０％が、少なくとも１つのＭ６Ｐを含有する。別の実施形態において、その混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも４０％が、少なくとも１つのＭ６Ｐを含有する。別の実施形態において、その混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも５０％が、少なくとも１つのＭ６Ｐを含有する。別の実施形態において、その混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも６０％が、少なくとも１つのＭ６Ｐを含有する。
別の態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列２４〜７４３を含む組換えヒトＮ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）の単離された混合物を含む、組成物を提供し、その混合物は、マンノース−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）を含む１つ以上のグリカン構造を含有する十分な量のｒｈＮａＧｌｕを含み、その結果、Ｍ６Ｐを含有するｒｈＮａＧｌｕは、Ｍ６Ｐ受容体介在性エンドサイトーシスを介して、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳類細胞中に内部移行され、内因性ＮａＧｌｕを発現する同じタイプの野生型細胞中で観察されるＮａＧｌｕ活性の少なくとも５０％を復元する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｎ結合型グリコシル化されている。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｏ結合型グリコシル化されている。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり少なくとも１モルのＭ６Ｐを含む。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり約１、２、３、４、５、または６モルのＭ６Ｐを含む。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり約３モルのＭ６Ｐを含む。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり約４モルのＭ６Ｐを含む。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、マンノースを含む。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ガラクトースを含む。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、フコースを含有しない。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、グルコースを含有しない。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、正常なＮａＧｌｕ酵素活性の少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または１００％を復元する。
別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、全身投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に効果的に送達される。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、静脈内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に効果的に送達される。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、髄腔内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に効果的に送達される。
一実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏した哺乳類細胞は、ヒト細胞である。別の実施形態において、ヒト細胞は、皮膚線維芽細胞、肝細胞、またはマクロファージである。一実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞は、神経細胞である。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、第２の部分を含む融合タンパク質である。一実施形態において、第２の部分は、ポリペプチドである。別の実施形態において、ポリペプチドは、トランスフェリン受容体リガンド（ＴｆＲＬ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ２Ｒ）リガンド、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体リガンド、および酸性アミノ酸（ＡＡＡ）残基からなる群から選択される。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、遺伝子導入鳥類から産生される。一実施形態において、遺伝子導入鳥類は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、またはウズラである。一実施形態において、遺伝子導入鳥類は、ニワトリである。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、卵管細胞から産生される。
別の態様において、本発明は、Ｍ６Ｐ受容体介在性エンドサイトーシスを介して、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳類細胞中へのｒｈＮａＧｌｕの内部移行を可能にし、その結果、体内で内部移行されるときに、ｒｈＮａＧｌｕが、内因性ＮａＧｌｕを発現する同じタイプの野生型細胞中で観察されるＮａＧｌｕ活性の少なくとも５０％を復元する、十分な量のマンノース−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）を有する１つ以上のグリカン構造を含む単離された組換えヒトＮ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）を含む、組成物を提供する。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化されている。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、Ｏ結合型グリコシル化されている。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり約２、３、４、５、または６モルのＭ６Ｐを含む。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、全身投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に効果的に送達される。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、静脈内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に効果的に送達される。別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、髄腔内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に効果的に送達される。
別の態様において、本発明は、組換えヒトＮａＧｌｕ（ｒｈＮａＧｌｕ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する導入遺伝子を含む、遺伝子導入鳥類を提供し、その導入遺伝子は、遺伝子導入鳥類のゲノム中に含まれ、遺伝子導入鳥類の卵管細胞中で発現され、その結果、ｒｈＮａＧｌｕが、遺伝子導入鳥類の卵管細胞中でグリコシル化され、遺伝子導入鳥類の卵管の内腔中に分泌され、卵の卵白中に沈着される。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり約２、３、４、または６モルのＭ６Ｐを含む。別の実施形態において、プロモーター構成要素は、卵管特異的プロモーターである。別の実施形態において、卵管特異的プロモーターは、卵白アルブミンプロモーターである。なおも別の実施形態において、遺伝子導入鳥類は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびウズラからなる群から選択される。
別の態様において、本発明は、本発明の遺伝子導入鳥類によって生み出される卵を提供する。
なおも別の態様において、本発明は、次のことを含む、組換えヒトＮａＧｌｕ（ｒｈＮａＧｌｕ）を産生する方法を提供する：ａ）配列番号１の２４〜７４３に記載されるｒｈＮａＧｌｕをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター構成要素を有する導入遺伝子を含む、遺伝子導入鳥類を産生することであって、その導入遺伝子が、遺伝子導入鳥類のゲノム中に含有され、卵管細胞中で発現され、その結果、ｒｈＮａＧｌｕが、遺伝子導入鳥類の卵管細胞中でグリコシル化され、卵管の内腔中に分泌され、遺伝子導入鳥類によって産卵された卵の卵白中に沈着されること、およびｂ）ｒｈＮａＧｌｕを卵白から単離すること。
一実施形態において、プロモーター構成要素は、卵管特異的プロモーターである。別の実施形態において、卵管特異的プロモーターは、卵白アルブミンプロモーターである。一実施形態において、鳥類は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびウズラからなる群から選択される。一実施形態において、鳥類は、ニワトリである。
別の態様において、本発明は、卵白アルブミンプロモーターに作動可能に連結されたヒトＮａＧｌｕをコードするヌクレオチド配列を含む、ベクターを提供する。別の態様において、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。別の態様において、本発明は、配列番号４の５２３２〜１０２４８の核酸配列を含む、単離された核酸を提供する。
一態様において、本発明は、本発明の組成物を、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む、薬学的製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、静脈内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の血液脳関門を横断する組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を含む、組成物を提供する。
なおも別の態様において、本発明は、ＮａＧｌｕ欠乏症を患う対象を治療する方法を提供し、本方法は、対象に、治療上有効量の本発明の組成物を投与することを含む。
なおも別の態様において、本発明は、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を、ＮａＧｌｕ欠乏症を患う対象の脳に送達する方法を提供し、本方法は、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を対象に静脈内投与することを含む。
別の態様において、本発明は、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を、治療上有効量で、循環から血液脳関門を渡って輸送する方法を提供し、本方法は、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する対象に静脈内投与することを含む。
一実施形態において、ＮａＧｌｕ欠乏症は、サンフィリポ症候群Ｂである。別の実施形態において、対象は、ヒトである。
別の実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、対象に、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で静脈内投与される。別の実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、対象に、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で静脈内投与される。別の実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、対象に、約６〜約２７ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で静脈内投与される。
なおも別の実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、対象に髄腔内投与される。一実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、少なくとも約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で髄腔内投与される。別の実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で髄腔内投与される。別の実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で髄腔内投与される。
別の実施形態において、治療上有効量は、対象の脳、腎臓、または肝臓内のヘパラン硫酸塩レベルを低減するのに有効な量である。別の実施形態において、治療上有効量は、対象の脳または肝臓内のＮａＧｌｕ活性を増加させるのに有効な量である。
別の実施形態において、方法は、第２の治療剤を投与することを更に含む。一実施形態において、第２の治療剤は、免疫抑制剤である。
ヒト組換えＮａＧｌｕのアミノ酸配列（アミノ酸残基１〜２３、シグナルペプチド）を図示する。 シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む、ヒト組換えＮａＧｌｕの核酸配列（ｃＤＮＡ）を図示する。 １．１ｋｂ卵白アルブミンプロモーターの核酸配列を図示する。 鳥類の遺伝子導入に使用されるｐＳＩＮ−ＯＶ−ｌ．ｌ−Ｉ−ｒｈＮａＧｌｕベクターの核酸配列を図示する。 同上。 同上。 同上。 ｐＳＩＮ−ＯＶ−１．１−Ｉ−ｒｈＮａＧｌｕベクターの略図。 遺伝子導入野鶏属の卵白から単離され、精製されたｒｈＮａＧｌｕのウエスタン分析を図示する。 遺伝子導入野鶏属の卵白に沈着したｒｈＮａＧｌｕの平均濃度を図示する。 ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを使用した、遺伝子導入野鶏属から産生されたｒｈＮａＧｌｕのオリゴ糖プロフィールを図示する。 ヒト皮膚線維芽細胞によるｒｈＮａＧｌｕの取り込み分析を図示する（ＭＰＳ ＩＩＩＢ、ＮａＧｌｕ欠乏；正常、野生型ヒト皮膚線維芽細胞；１Ｕの酵素活性＝ｎｍｏｌのタンパク質／時間）。 Ｍ６Ｐ単糖の種々の濃度を使用した、ｒｈＮａＧｌｕ（野鶏属）の取り込み阻害分析を図示する（１Ｕの酵素活性＝１μｍｏｌのタンパク質／分）。 組換えヒトＮａＧｌｕ融合構築物（ＡＡＡ−ＮａＧｌｕ：完全長ＮａＧｌｕのＮ末端に融合された酸性アミノ酸残基）を含有するｐＴＴ２２ベクターの略図を図示する。 組換えヒトＮａＧｌｕ融合構築物（ＮａＧｌｕ−ＴｆＲＬ：完全長ＮａＧｌｕのＣ末端に融合されたトランスフェリン受容体リガンド）を含有するｐＴＴ２２ベクターの略図を図示する。 野鶏属から産生されたｒｈＮａＧｌｕと比較した、ＨＥＫ２９３から産生されたＡＡＡ−ＮａＧｌｕの酵素活性を図示する。 ＨＥＫ２９３から産生されたＡＡＡ−ＮａＧｌｕと比較した、ＨＥＫ２９３から産生されたＮａＧｌｕ−ＴｆＲＬの酵素活性を図示する。 経時的な（４８時間）、マクロファージ細胞株（ＮＲ８３８３）中へのｒｈＮａＧｌｕ（野鶏属）の取り込みレベルを図示する。細胞ＮａＧｌｕ活性を、タンパク質の単位／ｍｇで測定した。 ビヒクル（ＫＯ）、６．２５ｍｇ／ｋｇの投薬濃度での野鶏属ｒｈＮａＧｌｕ、または２７ｍｇ／ｋｇの投薬濃度での野鶏属ｒｈＮａＧｌｕの静脈内投与後の、ｎａｇｌｕ（−／−）マウスの腎臓内のヘパラン硫酸塩基質レベル（μｇ／ｍｇ組織）を図示する。野生型（ＷＴ）マウスは、無処置であった。 ビヒクル（ＫＯ）、６．２５ｍｇ／ｋｇの投薬濃度での野鶏属ｒｈＮａＧｌｕ、または２７ｍｇ／ｋｇの投薬濃度での野鶏属ｒｈＮａＧｌｕの静脈内投与後の、ｎａｇｌｕ（−／−）マウスの脳内のヘパラン硫酸塩基質レベル（μｇ／ｍｇ組織）を図示する。野生型（ＷＴ）マウスは、無処置であった。 ビヒクル（ＫＯ）、６．２５ｍｇ／ｋｇの投薬濃度での野鶏属ｒｈＮａＧｌｕ、または２７ｍｇ／ｋｇの投薬濃度での野鶏属ｒｈＮａＧｌｕの静脈内投与後の、ｎａｇｌｕ（−／−）マウスの肝臓内のヘパラン硫酸塩基質レベル（μｇ／ｍｇ組織）を図示する。野生型（ＷＴ）マウスは、無処置であった。 ビヒクル（ＫＯ）または０．３１ｍｇ／ｋｇの投薬濃度での野鶏属ｒｈＮａＧｌｕの髄腔内投与後の、ｎａｇｌｕ（−／−）マウスの脳内のヘパラン硫酸塩基質レベル（μｇ／ｍｇ組織）を図示する。野生型（ＷＴ）マウスは、無処置であった。
本発明は、ＮａＧｌｕ関連疾患、例えば、サンフィリポ症候群Ｂの治療における、治療法に有用な組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質（ｒｈＮａＧｌｕ）を含む、組成物を提供する。本発明は、本明細書に記載されるｒｈＮａＧｌｕタンパク質が、マンノースおよび／またはＭ６Ｐ受容体介在性エンドサイトーシスを介した効率的な細胞取り込みを可能にし、ヒト細胞へと正しく標的を定められるのに十分な量のオリゴ糖（例えば、マンノースおよびリン酸化マンノース（すなわち、Ｍ６Ｐ））を含有するという発見に基づく。本発明のｒｈＮａＧｌｕは、ヒト細胞中により効率的に取り込まれるので、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、特定のグリコシル化をもたらすように設計されていない無修飾の哺乳類細胞から産生および分泌されるＮａＧｌｕタンパク質と比較して、増加した酵素活性を示す。更に、本明細書に記載されるｒｈＮａＧｌｕは、ｒｈＮａＧｌｕが、静脈内投与されるとき、血液脳関門（ＢＢＢ）を効率的に横断することを可能にする、１つ以上のグリコシル化パターンを有する。本発明のｒｈＮａＧｌｕタンパク質の増加した細胞取り込みは、大量かつ頻繁な投薬に対する必要性を最小化し、それによって免疫原性の潜在的な危険性を大幅に低減する。
本明細書で使用される定義および略号のうちの幾つかには、次のものが含まれる：ａａ、アミノ酸（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ＣＤＳ、コード配列ｃＤＮＡ、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ；ＧａｌＮａｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｇａｌ、ガラクトース；ＧｌｃＮａｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｋｂ、１，０００塩基対；μｇ、マイクログラム；ｍＬ、ミリリットル；ｎｇ、ナノグラム；およびｎｔ、ヌクレオチド。
ある特定の定義は、本明細書で本発明を説明するために使用される種々の用語の意味および範囲を例示し、定義するために、本明細書に記載される。
本明細書で使用される「鳥類」という用語は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ならびにダチョウ、エミュー、およびヒクイドリを含む走鳥類等であるが、これらに限定されない、分類学上のクラスａｖａの生物の任意の種、亜種、または系統を指す。その用語には、セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）またはニワトリの種々の既知の系統（例えば、白色レグホン、褐色レグホン、バードロック（Ｂａｒｒｅｄ−Ｒｏｃｋ）、サセックス（Ｓｕｓｓｅｘ）、ニューハンプシャー（Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）、ロードアイランド（Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ）、オーストラロープ（Ａｕｓｓｔｒａｌｏｒｐ）、ミノルカ（Ｍｉｎｏｒｃａ）、アムロックス（Ａｍｒｏｘ）、カリフォルニアグレイ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｇｒａｙ）、イタリアンパートリッジカラード（Ｉｔａｌｉａｎ Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ−ｃｏｌｏｒｅｄ））、ならびにシチメンチョウ、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウ、および一般に商業的な量で飼育される他の家禽の系統が含まれる。
「に基づく」および「に由来する」という語句は典型的に、全体的にまたは部分的に、そこから得られることを意味する。例えば、レトロウイルスベクターが、特定のレトロウイルスに基づくもしくはそれに由来する、または特定のレトロウイルスのヌクレオチド配列に基づくとは、レトロウイルスベクターのゲノムが、特定のレトロウイルスのゲノムのヌクレオチド配列の実質的な部分を含有することを意味する。当業者の知識として本明細書の文脈から明らかであるように、実質的な部分は、ｇａｇ、ｐｏｌ、および／もしくはｅｎｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列等の特定の遺伝子もしくはヌクレオチド配列、または長い末端反復（ＬＴＲ）をコードする配列等のウイルスゲノムの他の構造的もしくは機能的ヌクレオチド配列であり得るか、あるいは実質的に完全なレトロウイルスゲノム、例えば、レトロウイルスゲノムのほとんど（例えば、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）または全てであり得る。レトロウイルスに基づくもしくはそれに由来するレトロウイルスベクターの例は、Ｃｏｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９１） ｖｏｌ． ６５， ｐ ３３８８−３３９４に開示される、トリ白血病レトロウイルス（「ＡＬＶ」）に由来するＮＬレトロウイルスベクター（例えば、ＮＬＢ）である。
本明細書で使用される「コード配列」および「コード領域」という用語は、ＲＮＡ、タンパク質、またはＲＮＡもしくはタンパク質の任意の部分の合成のための遺伝子情報をコードする、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、ヌクレオチド配列および核酸配列を指す。
天然には特定の生物のゲノムの一部でない、または生物のゲノムにおける非天然部位に導入されるヌクレオチド配列は、「外来性」ヌクレオチド配列、「異種性」ヌクレオチド配列、「組換え」ヌクレオチド配列、または「外因性」ヌクレオチド配列と称される。加えて、単離され、次いで同じタイプ（例えば、同じ種）の生物中に再導入されたヌクレオチド配列は、特定の生物のゲノムの自然に生じる部分であるとはみなされず、したがって外因性または異種性であるとみなされる。
「異種性タンパク質」または「外因性タンパク質」は、外来性、異種性、または外因性ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質であり得、したがってしばしば、宿主生物の細胞中で天然に発現されない。
本明細書で使用されるとき、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を参照する「外因性」、「異種性」、および「外来性」という用語は、交換可能に使用され、核酸が天然に生じる場所（複数可）および／または量とは異なる場所（複数可）においておよび／または量で、それが存在するか、または見出される、染色体、ゲノム、または細胞の一部として天然に生じない核酸を指す。それは、ゲノム、染色体、または細胞に内因性でなく、かつ外因性でゲノム、染色体、または細胞中に導入されている、核酸であり得る。異種性ＤＮＡの例としては、例えば、コードされたタンパク質の産生のために、目的の遺伝子産物（単数または複数）をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。異種性ＤＮＡの例としては、追跡可能なマーカータンパク質をコードするＤＮＡ、治療用タンパク質をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。「異種性」および「外因性」という用語は、生物によって産生されるある特定の細胞、組織、または材料において通常は見いだされない、あるいは生物によって産生されるある特定の細胞、組織、または材料において、天然に生じることが見出される量もしくは場所と同じ量もしくは場所で通常は見いだされない、核酸またはタンパク質等の生体分子を指すことができる。例えば、卵に異種性または外因性であるタンパク質は、卵において通常は見いだされないタンパク質である。
本明細書で使用される「構築物」という用語は、天然源から単離されているか、もしくは化学合成されているか、またはそれらの組み合わせであるヌクレオチド配列の１つを超えるセグメントから組み立てられたＤＮＡ等の、線形または環状ヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用される「相補的な」という用語は、互いに特異的な相互作用を形成できる２つの核酸分子を指す。その特異的な相互作用において、２つの核酸鎖が反対方向を向いているとき、核酸の１つの鎖内のアデニン塩基は、第２の核酸鎖内のチミンと２つの水素結合を形成することができる。特異的な相互作用においてはまた、２つの核酸鎖が反対方向を向いているとき、核酸の１つの鎖内のグアニン塩基は、第２の核酸鎖内のシトシンと３つの水素結合を形成することができる。
本明細書で言及されるとき、相補的な核酸は、修飾された塩基を更に含むことができ、ここで、修飾されたアデニンは、チミンまたは修飾されたチミンと水素結合を形成し得、修飾されたシトシンは、グアニンまたは修飾されたグアニンと水素結合を形成し得る。
本明細書で使用される「発現される」または「発現」という用語は、コード配列の２つの核酸鎖のうちの一方の領域に対して少なくとも部分的に相補的なＲＮＡ分子をもたらすための、コード配列の転写を指す。本明細書で使用される「発現される」または「発現」という用語はまた、タンパク質またはペプチドを産生するためのｍＲＮＡの翻訳を指すこともできる。
本明細書で使用される「発現ベクター」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、プロモーターまたはプロモーター構成要素等の遺伝子発現制御領域を含む核酸ベクターを指す。
本明細書で使用される「断片」という用語は、人工的に（例えば、化学合成によって）、または制限エンドヌクレアーゼもしくは機械的せん断を用いて天然の産物を複数の片へと切断することによって、または酵素的に、例えば、ＰＣＲもしくは当該技術分野で既知の任意の他の重合技法によって構築された、あるいは当業者に既知の組換え核酸技術によって宿主細胞中で発現された、例えば、少なくとも約１０、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００、５０００、６，０００、８，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、または６０，０００ヌクレオチド長の核酸の部分を指すことができる。本明細書で使用される「断片」という用語はまた、ＮａＧｌｕに対する完全長未満のアミノ酸配列（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列２４〜７４３）の、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０アミノ酸残基を指すこともでき、その部分は、少なくとも１つのプロテアーゼによるタンパク質切断によって天然に生じるアミノ酸配列から切断されるか、または当業者に既知の化学的方法によってもしくは組換えＤＮＡ技術を使用して合成される（例えば、天然に生じるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の一部分から発現される）、天然に生じるアミノ酸配列の部分である。「断片」はまた、特定のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の、例えば、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％の部分を指してもよい。
「機能性部分」および「機能性断片」は、交換可能に使用され得、本明細書で使用されるとき、全体の機能を全体的にまたは部分的に行うことが可能な、全体の一部分または断片を意味する。例えば、分子の生物学的機能性部分は、全分子または無傷の分子の生物学的機能を行う分子の一部分を意味する。機能性部分は、任意の有用なサイズのものであってもよい。例えば、機能性断片は、約２０塩基の長さから、指定される配列の全長より１ヌクレオチドを引いたものに等しい長さまでの範囲のサイズであってもよい。別の例において、機能性断片は、約５０塩基の長さから、指定される配列の全長より１ヌクレオチドを引いたものに等しい長さまでの範囲のサイズであってもよい。別の例において、機能性断片は、約５０塩基の長さから約２０ｋｂの長さまでの範囲のサイズであってもよい。
別の例において、機能性断片は、約５００塩基の長さから約２０ｋｂの長さまでの範囲のサイズであってもよい。別の例において、機能性断片は、約１ｋｂの長さから約２０ｋｂの長さまでの範囲のサイズであってもよい。別の例において、機能性断片は、約０．１ｋｂの長さから約１０ｋｂの長さまでの範囲のサイズであってもよい。別の例において、機能性断片は、約２０塩基ｋｂの長さから約１０ｋｂの長さまでの範囲のサイズであってもよい。
「完全遺伝子導入」または「生殖系列遺伝子導入」という用語は、その細胞の本質的に全てにおいて導入遺伝子の少なくとも１つのコピーを含有する、鳥類等の動物を指す。
本明細書で使用される「遺伝子発現制御領域」という用語は、コード配列に関連し、全体的にまたは部分的に、コード配列の発現を調節する、例えば、全体的にまたは部分的に、コード配列の転写を調節する、ヌクレオチド配列を指す。遺伝子発現制御領域は、天然に生じる源から単離されてもよく、または化学的に合成されてもよく、また核酸ベクター中に組み込まれて、適切な細胞中で調節された転写を可能にすることができる。「遺伝子発現制御領域」は、ｍＲＮＡへと転写され得るコード配列の末端の領域５’にある核酸配列の領域に先行してもよいが、その先行に限定されない。
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技法を使用して構築され、少なくとも１つの異種性遺伝子をコードするベクターを包含する、細胞を指す。
本明細書で使用される「単離された核酸」という用語は、例えば、（ａ）天然に生じるゲノム分子の部分の配列を有するが、それが天然に生じる種のゲノムにおける分子のその部分に隣接する配列の少なくとも１つが隣接していない、ＤＮＡ、（ｂ）結果として生じるベクターまたはゲノムＤＮＡが、その核酸が得られた天然に生じるＤＮＡと同一でないような様態で、ベクター中または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた、核酸、（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、もしくは化学合成によって産生される断片、または制限断片等の、別個の分子、（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の部分である、組換えヌクレオチド配列、および（ｅ）天然には生じないハイブリッド配列の部分である、組換えヌクレオチド配列を包含する。本発明の単離された核酸分子は、例えば、天然対立遺伝子変異体、ならびにヌクレオチド欠失、挿入、逆位（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ）、または置換によって修飾された核酸分子を含むことができる。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、任意の線形もしくは連続的な一連のヌクレオチドおよびヌクレオシド、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、およびそれらの誘導体を指す。議論を簡単にするために、非天然の核酸は、本明細書で構築物と称され得る。核酸は、改変アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクター等のレトロウイルス等であるが、これらに限定されない、動物ウイルスベクター等の、発現、クローニング、コスミド、および形質転換ベクターを含む細菌のプラスミドベクター、ならびにそれらの断片を含むことができる。加えて、核酸は、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターのＬＴＲおよびそれらの断片であり得る。核酸はまた、ＮＬＢ、ＮＬＤ およびＮＬＡ等のＮＬベクター、ならびにそれらの断片、ならびに化学的に合成されたＤＮＡまたはＲＮＡ等の合成オリゴヌクレオチドを含むこともできる。核酸は、５−ブロモウラシル等であるが、これだけではないハロゲン化されたヌクレオチド、ならびにビオチン標識されたヌクレオチド等の誘導体化されたヌクレオチド等であるが、これらに限定されない、修飾または誘導体化されたヌクレオチドおよびヌクレオシドを含むことができる。
本明細書で使用されるとき、「グリカン」、「グリカン構造」、「グリカン部分」、「オリゴ糖」、「オリゴ糖構造」、「グリコシル化パターン」、「グリコシル化プロフィール」、および「グリコシル化構造」という用語は、本質的に同じ意味を有し、各々は、糖残基から形成され、ヒトＮａＧｌｕ等のグリコシル化タンパク質に結合する、１つ以上の構造を指す。例えば、「Ｎグリカン」または「Ｎ結合型グリカン」は、グリコシル化タンパク質のアスパラギンまたはアルギニン側鎖の窒素に結合する、グリカン構造を指す。「Ｏグリカン」または「Ｏ結合型グリカン」は、グリコシル化タンパク質のセリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシリジン、またはヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシル酸素（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｏｘｙｇｅｎ）に結合する、グリカン構造を指す。
本明細書で使用される「ベクター」および「核酸ベクター」という用語は、細胞に形質移入または形質転換され得、宿主細胞ゲノムから独立して、または宿主細胞ゲノム内で複製する、天然または合成の１本鎖または２本鎖プラスミドまたはウイルス核酸分子を指す。環状２本鎖ベクターは、ベクターのヌクレオチド配列に基づく適切な制限酵素での処理によって線形化することができる。核酸は、当該技術分野で理解されるように、ベクターを制限酵素で切断し、所望の片を一緒にライゲートすることによってベクターに挿入することができる。典型的なベクターは、機能性遺伝子発現を可能にするのに適切な距離で作動可能に連結された、次の要素から構成され得る：複製起源、プロモーター、エンハンサー、５’ｍＲＮＡリーダー配列、リボソーム結合部位、核酸カセット、終結およびポリアデニル化部位、ならびに選択可能なマーカー配列。これらの要素のうちの１つ以上は、特定の適用において省略することができる。核酸カセットは、発現対象の核酸配列の挿入のための制限部位を含むことができる。機能性ベクターにおいて、核酸カセットは、翻訳開始および終結部位を含む発現対象の核酸配列を含有する。イントロンを任意に、構築物に、例えば、コード配列に対して５’に含むことができる。ベクターは、特定のコード配列が適切な調節配列と共にベクター内に位置するように構築され、制御配列に対するコード配列の位置付けおよび向きは、コード配列が制御配列または調節配列の「制御」下で転写されるようなものである。この目的を達成するために、目的の特定のタンパク質をコードする配列の修飾が望ましい場合がある。例えば、幾つかの事例において、配列が適切な向きで制御配列に結合し得るように、またはリーディングフレームを維持するように、配列を修飾することが必要であり得る。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入前に、コード配列にライゲートすることができる。代替的に、コード配列は、制御配列、および制御配列の調節制御と共にかつその下でリーディングフレーム内にある適切な制限部位をすでに含有する、発現ベクター中に直接クローニングすることができる。
「作動可能に連結された」という用語は、そのように記載される構成要素がそれらの通常の機能を行うように構成される、要素の配列を指す。コード配列に作動可能に連結された遺伝子発現制御領域またはプロモーター（複数可）（例えば、プロモーター構成要素）は、コード配列の発現を達成することが可能である。制御配列（複数可）またはプロモーターは、それらがコード配列の発現を導くように機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。故に、例えば、介在する翻訳されていないがなおかつ転写された配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そのプロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結された」と見なされ得る。
本明細書で使用される「過剰発現」は、正常な生物または非形質転換生物における産生のレベルを超える、遺伝子導入された生物における遺伝子産物の産生を指す。
「卵管」または「卵管組織」という用語は、肝臓または腎臓組織等の鳥類の他の組織において産生されるタンパク質の量に対して、増加した量のマンノースならびにマンノース（ｍａｍｍｏｓｅ）−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）および実質的に低減された量のガラクトースおよび／またはシアル酸を含有する、Ｎ結合型オリゴ糖によりタンパク質が産生される、筒部等の鳥類卵管の組織、例えば、管状腺細胞を指す。
本明細書で使用される「卵管特異的プロモーター」という用語は、機能的である、すなわち、かなりの程度まで、例えば、トリの卵管細胞中で主に（すなわち、転写産物の５０％超が、動物において、卵管細胞中で産生されている特定のプロモータータイプによって産生される）、または排他的に、コード配列の転写を提供する、プロモーターおよびプロモーター構成要素を指す。卵管特異的プロモーターの例としては、卵白アルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボインヒビタープロモーター、リゾチームプロモーター、およびオボトランスフェリンプロモーター、ならびにこれらのプロモーターの機能性部分、例えば、プロモーター構成要素が挙げられるが、これらに限定されない。卵管特異的プロモーターを使用して、ＮａＧｌｕタンパク質の発現を筒部に限定することによって、トリの他の組織内のこれらの酵素の発現の結果としてのトリへの有害な生理作用を最小化することができる。
「配列同一性パーセント」、「同一性パーセント」、「同一性％」、「配列相同性パーセント」、「相同性パーセント」、「相同性％」、および「配列類似性パーセント」という用語は各々、２つの核酸配列または２つのアミノ酸配列間で一致する配列の程度を指すことができる。かかる配列一致は、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムを使用して、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０：５８７３−５８７７にあるように修正して、決定することができる。 かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｑ１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２により行なう。参照アミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により行なう。比較目的のためのギャップアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２に記載されるように利用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するときには、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が使用される。他のアルゴリズム、プログラム、およびデフォルト設定もまた、好適であり得、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列比較のためのプログラムを含む、Ｕ．Ｋ． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＣｅｎｔｒｅのＧＣＧ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ等があるが、これだけではない。配列は、別の配列、例えば、本明細書に特定されるＮａＧｌｕタンパク質配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であってもよい。
「鳥類由来」という用語は、トリ、家禽、もしくは鳥類によって産生される、またはそれから得られる組成物または材料を指す。「鳥類」は、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウズラ、および走鳥類を含むが、これらに限定されない、家畜として飼育され得るトリを指す。例えば、「鳥類由来」とは、ニワトリ由来、シチメンチョウ由来、および／またはウズラ由来を指すことができる。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、および「核酸配列」という用語は、本明細書で交換可能に使用され得、コード配列、すなわち、適切な調節配列または制御配列、すなわち、例えば、翻訳開始および停止コドン、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写因子結合部位、転写終結配列、上流および下流調節ドメイン、エンハンサー、サイレンサー、転写因子（複数可）が結合して、正に（誘導）または負に（抑制）のいずれかで遺伝子のプロモーターの活性を変化させるＤＮＡ配列等の制御配列の、制御下に置かれたときに体外または体内でポリペプチドに転写および翻訳される、ポリヌクレオチド（複数可）または核酸配列（複数可）を含むが、これらに限定されない。長さまたは合成起源に関する限定は、本明細書に記載される用語によって何ら示唆されない。
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸の重合体、例えば、連続した配列で、ペプチド結合を通じて連結された、３つ以上のアミノ酸を指す。「ポリペプチド」という用語は、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質類似体、オリゴペプチド等を含む。「ポリペプチド」という用語は、組換え技術を通じて産生される（例えば、遺伝子導入トリから単離される）か、または合成される核酸によってコードされる、上に定義されるポリペプチドを含む。「ポリペプチド」という用語は、標識リガンドに共有または非共有結合された、化学修飾されたアミノ酸（単数または複数）を含む、上に定義されるポリペプチドを更に企図する。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、鳥類細胞中のＲＮＡポリメラーゼによって転写を開始するのに有用なＤＮＡ配列を指す。「プロモーター構成要素」は、それ自体によってまたは他のＤＮＡ配列と組み合わせて、転写を達成または促進することができるＤＮＡ配列である。プロモーター構成要素は、プロモーターの機能性断片であり得る。
「組換え核酸」および「組換えＤＮＡ」という用語は、真核細胞または原核細胞中で天然に見出されない、少なくとも２つの核酸配列の組み合わせを指す。核酸配列には、核酸ベクター、遺伝子発現調節要素、複製起源、発現されるときに抗生物質に対する耐性を付与する好適な遺伝子配列、タンパク質コード配列等が含まれ得るが、これらに限定されない。「組換えポリペプチド」という用語は、その場所、純度、または構造のいずれかにおいて天然に生じるポリペプチドとは明確に異なるように、組換えＤＮＡ技法によって産生される、ポリペプチドを含むように意図される。一般に、かかる組換えポリペプチドは、細胞中に、自然界で通常観察される量とは異なる量で存在するであろう。
本明細書で使用されるとき、「調節」配列または要素という用語は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、停止コドン、および遺伝子発現を制御することができる他の要素を含む。
「レトロウイルス」、「レトロウイルス粒子」、「形質導入粒子」、または「形質導入粒子」は、非ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞中に形質導入することが可能な、複製欠損または複製可能ウイルスを指す。
「ＳＩＮベクター」は、自己不活性化ベクターを指す。詳細には、ＳＩＮベクターは、標的細胞（例えば、鳥類胚細胞）のゲノムＤＮＡ中に組み込まれると、組み込まれたレトロウイルスベクターの５’ＬＴＲがプロモーターとして機能しなくなるように、変化したゲノムを有するレトロウイルスベクターである。例えば、一旦、組み込まれると、レトロウイルスベクターの５’ ＬＴＲのＵ３領域をもたらす、レトロウイルスベクターのヌクレオチド配列の一部分または全ては、５’ ＬＴＲのプロモーター活性を低減または排除するために欠失または変化させることができる。ある特定の例において、当該技術分野で理解されるように、５’ＬＴＲのＵ３からのＣＡＡＴボックスおよび／またはＴＡＡＴＡボックスの欠失は、ＳＩＮベクターをもたらし得る。
本明細書で使用される「センス鎖」という用語は、ＲＮＡへと転写され、その遺伝子の天然ポリペプチド産物へと翻訳され得る、ゲノムＤＮＡからの１本鎖ＤＮＡ分子を指す。本明細書で使用される「アンチセンス鎖」という用語は、その遺伝子のセンス鎖と相補的な、ゲノムＤＮＡの１本鎖ＤＮＡ分子を指す。
「治療用タンパク質」または「薬学的タンパク質」は、薬物を全体的にまたは部分的に構成する材料である。詳細には、「治療用タンパク質」および「薬学的タンパク質」は、薬物を全体的にまたは部分的に構成するアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用される「プロモーター」、「転写調節配列」、および「プロモーター構成要素」という用語は、コード配列の転写発現を調節するヌクレオチドを指す。例となる転写調節配列には、エンハンサー要素、ホルモン応答要素、ステロイド応答要素、負の調節要素等が含まれる。「転写調節配列」は、単離され、ベクター中に組み込まれて、ベクターＤＮＡの部分の適切な細胞中において転写を調節することができる。「転写調節配列」は、限定されないが、ｍＲＮＡへと転写される、タンパク質コード配列の末端の領域５’にある核酸配列の領域に先行することができる。転写調節配列はまた、タンパク質コード領域内、例えば、「イントロン」領域として特定される遺伝子の領域内に位置することもできる。
本明細書で使用される「形質転換」および「形質移入」という用語は、核酸を宿主中に挿入するプロセスを指す。核酸の原核または真核生物中への形質転換または形質移入を促進するための多くの技法が、当業者に周知である。これらの方法は、細胞をある特定の濃度の塩、例えば、限定されないが、カルシウム塩またはマグネシウム塩で処理するか、あるいは細胞を電場、界面活性剤、またはリポソーム物質に曝露して、宿主細胞が核酸分子を取り込み可能になるようにすること等の様々な技法を伴う。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子導入動物」は、ニワトリを含む鳥類種等の、任意の非ヒト動物であり、その動物の細胞のうちの１つ以上は、本明細書に開示されるものを含む、当該技術分野で既知の遺伝子導入技法によって等、人間の介入を用いて導入された異種性核酸を含有する（例えば、２００７年１０月１８日に公開された米国特許公開第２００７／０２４３１６５号を参照されたく、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。核酸は、マイクロインジェクションによってまたは組換えウイルスでの感染によって等の意図的な遺伝子操作を用いる、細胞（例えば、卵または胚細胞）中への導入によって、動物に直接または間接的に導入される。遺伝子操作という用語は、伝統的な交雑、または体外受精を含まないが、むしろそれは、組換えＤＮＡ分子の導入に向けられる。この分子は、染色体内に組み込むことができるか、またはそれは、染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。典型的な遺伝子導入動物において、導入遺伝子は、細胞に、標的タンパク質またはポリペプチドの組換え型を発現させることができる。「キメラ動物」または「モザイク動物」という用語は、本明細書で、動物の幾つかの細胞であるが全てではない細胞中において、導入遺伝子が見出される、または組換えヌクレオチド配列が発現される、動物を指すように使用される。生殖系列キメラ動物は、その生殖細胞中に導入遺伝子を含有し、遺伝子導入動物の子孫を生じさせることができ、その子孫のほとんどまたは全ての細胞が、導入遺伝子を含有するであろう。
本明細書で使用されるとき、「導入遺伝子」という用語は、それが導入される動物または細胞に対して部分的にまたは全体的に異種性、すなわち、外来性であるか、あるいはそれが導入される遺伝子導入動物または細胞の内因性遺伝子に対して部分的にまたは全体的に相同であるが、それが挿入される生物のゲノムを変化させる（例えば、それが天然の遺伝子とは異なる場所に挿入されるか、またはその挿入がノックアウトをもたらす）ような方式で、動物または細胞ゲノム中に挿入されるように設計されるか、またはそれに挿入される、核酸配列（例えば、ヒトＮａＧｌｕタンパク質をコードする）を意味する。
本明細書で使用されるとき、「酵素補充療法（ＥＲＴ）」という用語は、欠損している酵素を対象に投与することによって、対象における酵素欠乏症を直すための治療的戦略を指す。リソソーム酵素補充療法が有効であるためには、治療的酵素は、蓄積欠陥が現れている組織内の適切な細胞中のリソソームに送達されなければならない。一実施形態において、酵素は、対象に、静脈内、髄腔内、脳内、脳室内、または実質内投与されてもよい。一実施形態において、酵素は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断可能である。機構によって限定されることを意図するものでないが、血液が患者の組織を灌流するとき、酵素が細胞によって取り込まれ、リソソームに輸送され、そこで酵素が、酵素欠乏症に起因してリソソーム内に蓄積した物質を排除するように作用すると考えられる。
Ｉ．ＮａＧｌｕの組成物
本発明は、例えば、サンフィリポ症候群Ｂ（ムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ）の治療における、治療法に特に有用な、増加した細胞取り込みおよび増加した細胞下の活性を付与するグリコシル化のパターンを有する、組換えヒトＮａＧｌｕ（ｒｈＮａＧｌｕまたはＮａＧｌｕ）（配列番号１に記載されるアミノ酸配列２４〜７４３）の新規組成物を提供する。
幾つかの態様において、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列２４〜７４３を含むｒｈＮａＧｌｕの単離された混合物であり得る。一実施形態において、混合物は、リン酸化マンノース（例えば、Ｍ６Ｐ）またはマンノースを含有する少なくとも１つのグリカン構造を有する十分な量のｒｈＮａＧｌｕを含有し、その結果、Ｍ６Ｐまたはマンノースを含有するｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞中に内部移行され、内因性ＮａＧｌｕを活発に発現する同じタイプの野生型ヒト細胞中で観察されるＮａＧｌｕ活性の少なくとも５０％を復元する。一態様において、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、リン酸化マンノースおよび／またはマンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含有する。一実施形態において、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも１０％が、リン酸化マンノースおよび／またはマンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含有する。一実施形態において、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも２０％が、リン酸化マンノースおよび／またはマンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含有する。一実施形態において、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも３０％が、リン酸化マンノースおよび／またはマンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含有する。一実施形態において、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも３０％が、リン酸化マンノースおよび／またはマンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含有する。一実施形態において、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも４０％が、リン酸化マンノースおよび／またはマンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含有する。一実施形態において、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも５０％が、リン酸化マンノースおよび／またはマンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含有する。一実施形態において、混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも６０％が、リン酸化マンノースおよび／またはマンノースを有する少なくとも１つのグリカン構造を含有する。
幾つかの態様において、ＮａＧｌｕは、１つ以上のＮ結合型グリカン構造を含有する。ＮａＧｌｕは、タンパク質がマンノース６−リン酸受容体（Ｍ６Ｐ受容体）によって認識され、その後、Ｍ６Ｐ受容体介在性エンドサイトーシスを介して、皮膚線維芽細胞、内皮、神経細胞、肝細胞、マクロファージ、または細胞表面上でＭ６Ｐ受容体を発現する任意の細胞を含むが、これらに限定されない、ヒト細胞中に取り込まれルことを可能にする、少なくとも１つのリン酸化マンノース（例えば、Ｍ６Ｐまたはビス−Ｍ６Ｐ）を含有する。一実施形態において、ＮａＧｌｕは、少なくとも１つのマンノース（Ｍａｎ）を含有する。別の実施形態において、ＮａＧｌｕは、少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含有する。
幾つかの態様において、ＮａＧｌｕは、リン酸化マンノース（Ｍ６Ｐ）を含むグリカン構造を含有する。本明細書で使用されるとき、Ｍ６Ｐは、任意のリン酸化マンノース残基を包含することができ、モノ−およびビス−リン酸化マンノースを含む。一実施形態において、Ｍ６Ｐは、タンパク質１モル当たり約１、約２、約３、約４、約５、または約６モル（複数可）である濃度で存在する。一実施形態において、ＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２、約３、約４、または約５モルである濃度でＭ６Ｐを含有する。一実施形態において、ＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２モルである濃度でＭ６Ｐを含有する。一実施形態において、ＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約３モルである濃度でＭ６Ｐを含有する。一実施形態において、ＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約４モルである濃度でＭ６Ｐを含有する。一実施形態において、ＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約５モルである濃度でＭ６Ｐを含有する。一実施形態において、ＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約６モルである濃度でＭ６Ｐを含有する。
幾つかの態様において、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｍ６Ｐ受容体介在性エンドサイトーシスを介した、細胞表面上にＭ６Ｐ受容体を有するヒト細胞中への細胞取り込みのために十分な量のＭ６Ｐを含有する。一実施形態において、ヒト細胞中への取り込みのために十分な量のＭ６Ｐは、タンパク質１モル当たり約１、２、３、４、５、または６モルである。ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞中に内部移行され得、その結果、内部移行されたタンパク質は、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞中においてＮａＧｌｕ活性の正常なレベルを完全に（１００％以上）復元する。一実施形態において、内部移行されたｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、少なくとも０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０μｇ／ｍＬである濃度で、ヒト細胞中においてＮａＧｌｕ活性の正常なレベルを完全に復元する。一実施形態において、内部移行されたタンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０μｇ／ｍＬである濃度で、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞中においてＮａＧｌｕ活性の正常なレベルを完全に復元する。一実施形態において、内部移行されたタンパク質は、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μｇ／ｍＬである濃度で、ヒト細胞中においてＮａＧｌｕ活性の正常なレベルを完全に復元する。本明細書で使用されるとき、ＮａＧｌｕ活性の正常なレベルは、正常なＮａＧｌｕ酵素を活性に発現する同じタイプの野生型ヒト細胞中において測定されるＮａＧｌｕ活性のレベルである。
幾つかの態様において、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞中に内部移行され得、その結果、タンパク質は、同じタイプの正常なヒト細胞のＮａＧｌｕ活性の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％を復元する。幾つかの実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞中に内部移行され得、その結果、内部移行されたｒｈＮａＧｌｕは、同じタイプの正常なヒト細胞中で観察される酵素活性よりも高い酵素活性を提供する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞中に内部移行され、その結果、内部移行されたｒｈＮａＧｌｕは、同じタイプの正常なヒト細胞中で観察される酵素活性よりも、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、および約１０倍高い活性を提供する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞中に内部移行され、その結果、内部移行されたｒｈＮａＧｌｕは、正常なヒト細胞中で観察される活性よりも、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００倍高い活性を提供する。
一実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞は、細胞表面上で１つ以上のＭ６Ｐ受容体を発現するＮａＧｌｕが欠乏した任意のヒト細胞である。一実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞は、ヘパラン硫酸塩を蓄積するヒトムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＩＩＢ線維芽細胞である。一実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞は、肝細胞である。一実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞は、神経細胞である。一実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞は、内皮細胞である。一実施形態において、ＮａＧｌｕが欠乏したヒト細胞は、マクロファージである。
幾つかの態様において、ヒト細胞中へのｒｈＮａＧｌｕの取り込みは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０ｍＭの競合するＭ６Ｐ単糖の存在によって阻害される。幾つかの態様において、ｒｈＮａＧｌｕの細胞取り込みは、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、または約１．０ｍＭのＭ６Ｐ単糖の存在によって阻害される。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕの細胞取り込みは、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、または約０．０９ｍＭのＭ６Ｐ単糖の存在によって阻害される。
幾つかの態様において、ｒｈＮａＧｌｕは、そのグリカン構造中に、タンパク質１モル当たり約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５モルである濃度でマンノースを含有する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０モルである濃度でマンノースを有する。ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８モルである濃度でマンノースを含有する。ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２４モルである濃度でマンノースを含有する。ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約２５モルである濃度でマンノースを含有する。ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２６モルである濃度でマンノースを含有する。ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２７モルである濃度でマンノースを含有する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２０〜約３０モルである濃度でマンノースを有する。
幾つかの態様において、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２８〜約４２モルである濃度でＧｌｃＮＡｃを含有する。一実施形態において、ＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約３０〜約４０モルである濃度でＧｌｃＮＡｃを有する。一実施形態において、ＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約３２〜約３８モルである濃度でＧｌｃＮＡｃを含む。一実施形態において、ＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約３４〜約３６モルである濃度でＧｌｃＮＡｃを含む。一実施形態において、ＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約３５モルである濃度でＧｌｃＮＡｃを有する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、タンパク質１モル当たり約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０モルである濃度でＧｌｃＮＡｃを含有する。
幾つかの態様において、ｒｈＮａＧｌｕは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）および／またはガラクトース（Ｇａｌ）を含有する。ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌの存在は、典型的に、ＮａＧｌｕが、ゴルジ体領域内のタンパク質に追加される１つ以上のＯ結合型グリカン構造を含有し得ることを示す。したがって、本発明は、任意に、１つ以上のＯ結合型グリカン構造を含有する組換えヒトＮａＧｌｕを含む組成物を含む。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約１、２、３、４、５、６、または７モルである濃度でガラクトースを含有する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約２、３、４、５、または６モルである濃度でガラクトースを有する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約３モルである濃度でガラクトースを有する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約４モルである濃度でガラクトースを有する。
一実施形態において、ＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ分子を含む。一実施形態において、ＮａＧｌｕは、タンパク質１モル当たり約１または２モルである濃度でＧａｌＮＡｃを含む。
一実施形態において、ＮａＧｌｕは、フコースを含有しない。なおも別の実施形態において、ＮａＧｌｕは、グルコースを含有しない。なおも別の実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、フコースもグルコースも含有しない。
本発明はまた、修飾されたｒｈＮａＧｌｕの核配列から産生される、修飾されたｒｈＮａＧｌｕタンパク質の組成物を企図する。修飾された核酸配列は、機能的に同等のポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをもたらす、異なるヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含む。コードされたタンパク質はまた、サイレント変化を生み出し、機能的に同等のタンパク質またはポリペプチドをもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含有し得る。意図的なアミノ酸置換は、ＮａＧｌｕの生物学的活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性性質における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負電荷性のアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ得、正電荷性のアミノ酸には、リジンおよびアルギニンが含まれ得、同様の親水性値を有する非電荷性の極性頭基を持つアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびスレオニン；フェニルアラニンおよびチロシンが含まれ得る。
他の態様において、ｒｈＮａＧｌｕは、それが追加の部分または第２のペプチドを含有するように修飾することができる。無修飾のＮａＧｌｕタンパク質は、高い血清濃度で、血液脳関門を横断し得るが、タンパク質の修飾を行って、中枢神経系（ＣＮＳ）標的化の効率を増加させることができる。一実施形態において、トランスフェリン受容体リガンド（ＴｆＲＬ）には、ＮａＧｌｕタンパク質のＮ末端またはＣ末端においてヒトＮａＧｌｕが結合することができる。ＴｒＲＬの非限定的な例は、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号５）である。一実施形態において、トランスフェリン受容体リガンドには、ＮａＧｌｕタンパク質のヒトＮａＧｌｕ Ｃ末端が結合することができる。別の実施形態において、ヒトＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕタンパク質のＮ末端またはＣ末端においてインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ２Ｒ）リガンドに融合される。なおも別の実施形態において、ＮａＧｌｕタンパク質は、ＮａＧｌｕタンパク質のＮ末端またはＣ末端において低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体リガンドに融合される。一実施形態において、ＮａＧｌｕタンパク質は、５〜１０個の連続した酸性アミノ酸残基の広がりに融合される。酸性アミノ酸残基には、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）が含まれ得る。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕタンパク質をコードする導入遺伝子を含有する遺伝子導入鳥類において産生される。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、遺伝子導入鳥類（例えば、ニワトリ（野鶏属））の卵管細胞（例えば、管状腺細胞）中で産生される。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、遺伝子導入鳥類の卵管細胞（例えば、管状腺細胞）中でグリコシル化される。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、遺伝子導入鳥類の卵管細胞中で産生されているｒｈＮａＧｌｕからもたらされるグリコシル化パターンを有する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、遺伝子導入鳥類によって産卵された硬殻卵の内容物から単離し、精製することができる。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、遺伝子導入鳥類の卵白から単離し、精製することができる。
本発明はまた、１つ以上の断片および完全長ｒｈＮａＧｌｕ（例えば、配列番号１に記載される２４〜７４３）の混合物等の、ＮａＧｌｕタンパク質の単離された混合物の組成物も含む。一実施形態において、混合物の実質的な部分が、リン酸化Ｍ６Ｐを含有する。一実施形態において、その混合物中のｒｈＮａＧｌｕの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％９５％、９７％、９８％、または９９％が、Ｍ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも５０％が、Ｍ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも６０％が、Ｍ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも７０％が、Ｍ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも８０％が、Ｍ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９０％が、Ｍ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９５％が、Ｍ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９６％が、Ｍ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９７％が、Ｍ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９８％が、Ｍ６Ｐを含有する。なおも別の実施形態において、混合物中の単離されたｒｈＮａＧｌｕの少なくとも９９％が、Ｍ６Ｐを含有する。
任意に、鳥類または哺乳類発現系（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、またはヒト皮膚線維芽細胞株）から産生されるｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、生物学的活性を保持しながら、細胞取り込みのために好ましいグリコシル化パターン（すなわち、増加した量のＭ６Ｐ）を達成するように更に修飾することができる。追加の末端Ｍ６Ｐを、米国特許第６，６７９，１６５号、米国特許第７，１３８，２６２号、または米国出願第２００９／００２２７０２号に記載されるような他の加水分解酵素に適用される一般的方法によって、ｒｈＮａＧｌｕに導入することができ、それらの各々の教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、高度にリン酸化されたマンノピラノシルオリゴ糖化合物を、カルボニル反応基を含有する化学化合物により誘導体化し、続いてｒｈＮａＧｌｕタンパク質を酸化して、タンパク質の１つのグリカン構造上にカルボニル（アルデヒド）基を生成し、グリカンを含む酸化されたＮａＧｌｕタンパク質を、誘導体化された、高度にリン酸化されたマンノピラノシルオリゴ糖化合物と反応させて、ヒドラジン結合を有する新たな化合物を形成することができる。
ＩＩ．ベクター
当業者に周知である方法を使用して、ＮａＧｌｕをコードする配列、ならびに適切な転写および翻訳制御要素を含有する、発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、体外組換えＤＮＡ技法、合成技法、および体内遺伝子組換えが含まれる。かかる技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．に記載され、それらの教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
様々な発現ベクター／宿主系を利用して、ｒｈＮａＧｌｕをコードする核酸配列を発現させることができる。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌等の微生物；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）によりもしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）により感染された昆虫細胞系；または哺乳類細胞培養系（例えば、ｐＴＴ２２ベクター）が含まれるが、これらに限定されない。酸性アミノ酸残基およびＴｆＲＬをコードする核酸配列に融合されたヒトＮａＧｌｕ ｃＤＮＡを含有するｐＴＴ２２ベクターの非限定的な例が、図１１および１２に示される。
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を導く、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域に関連付けられてもよい。シグナル仮説によると、脊椎動物（例えば、鳥類または哺乳類）細胞によって分泌されるタンパク質は、一旦、成長しているタンパク質鎖の粗面小胞体（ＥＲ）を渡る搬出が開始されると、成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物によってＥＲにおいて産生されるポリペプチド細胞が一般に、完全なまたは「完全長」ポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態または「成熟」形態を産生する、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを承知している。ある特定の実施形態において、天然シグナルペプチド、例えば、ヒトＮａＧｌｕのＭＥＡＶＡＶＡＡＡＶＧＶＬＬＬＡＧＡＧＧＡＡＧ（配列番号１の１〜２３シグナルペプチド、またはそれと作動可能に関連付けられているポリペプチドの分泌を導く能力を保持する、その配列の機能性誘導体が使用される。代替的に、異種性シグナルペプチド（例えば、異種性哺乳類または鳥類シグナルペプチド）、またはその機能性誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換されてもよい。
制御要素または調節配列には、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を行う、ベクターエンハンサー、プロモーターのそれらの非翻訳領域、５’および３’非翻訳領域が含まれ得る。かかる要素は、それらの強度および特異性において異なり得る。利用されるベクター系および宿主細胞に応じて、任意の数の好適な転写要素および翻訳要素を使用することができる。例えば、細菌系中にクローニングするとき、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはｐＳｐｏｒｔ１（商標）プラスミド（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）のハイブリッドｌａｃ−Ｚプロモーター等の誘導性プロモーターを使用することができる。哺乳類細胞系において、哺乳動物遺伝子からのまたは哺乳動物ウイルスからのプロモーターが好ましい。ＮａＧｌｕをコードする配列の複数コピーを含有する細胞株を生成することが必要な場合、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターもまた、ピューロマイシンおよびアンピシリン等の適切な選択可能なマーカーと共に使用することができる（例えば、図１１および１２を参照されたい）。
ｒｈＮａＧｌｕが遺伝子導入鳥類において産生されるとき、本発明は、ｒｈＮａＧｌｕ配列がプロモーターの下流に配置され、その結果、ｒｈＮａＧｌｕをコードする配列が、遺伝子導入鳥類において組織特異的様態で発現され得ることを企図する。例えば、プロモーターは、卵白アルブミン、リゾチーム、コンアルブミン、オボムコイド、オボムコイド、オボムチン、およびオボトランスフェリンプロモーターを含むが、これらに限定されない、卵管特異的プロモーター等の、全面的にではないが、概して筒部に特異的である、卵管特異的プロモーターであり得る。一実施形態において、プロモーターは、卵白アルブミンプロモーター、リゾチームプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、オボムチンプロモーター、および／もしくはオボトランスフェリンプロモーター、またはそれらの任意の機能性部分である。
代替的に、構成的プロモーターを使用して、鳥類においてヒトＮａＧｌｕのコード配列を発現させることができる。この事例において、発現は、筒部に限定されず、発現はまた、鳥類内部の他の組織（例えば、血液）においても生じる。ＮａＧｌｕの構成的プロモーターおよびコード配列を含む、かかる導入遺伝子の使用もまた、卵管におけるタンパク質の発現、およびその後のタンパク質の卵中への分泌を達成または駆動するのに好適である。一実施形態において、構成的プロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーター、およびβ−アクチンプロモーターであり得る。一実施形態において、プロモーターは、それらの任意の機能性部分のＣＭＶプロモーター、ＭＤＯＴプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＭＬＶプロモーター、またはマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターである。
本発明はまた、本明細書に記載されるプロモーターの任意の有用な断片または構成要素も企図する。プロモーターは、卵白アルブミン、リゾチーム、コンアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、ＣＭＶ、ＲＳＶ、またはＭＬＶプロモーター領域のセグメント等の、プロモーター領域の少なくとも１つのセグメント、断片、または構成要素であり得る。好ましい実施形態において、プロモーターは、管状腺細胞中におけるコード配列の発現を導くために必須の要素を含有する、卵管特異的プロモーター領域のセグメントである。例えば、卵管特異的プロモーターのセグメント、部分、もしくは断片および／またはそれが卵管の筒部の管状腺細胞中における発現に必要とされる配列を保持するように、卵管特異的プロモーターの必要不可欠な調節要素を凝縮することが、本発明の範囲に含まれる。一実施形態において、卵白アルブミンプロモーター領域のセグメントが使用される。このセグメントは、卵白アルブミン遺伝子の５’隣接領域を含む。
ヒトＮａＧｌｕに対するコード配列を含有するベクターを、鳥類または哺乳類細胞の胚盤葉細胞を形質移入するために使用して、鳥類または哺乳類ゲノム中への安定な組み込みを得、生殖系列遺伝子導入鳥類または哺乳類細胞株を作り出すことができる。かかるベクターの非限定的な例が、図４Ａ〜Ｄおよび５に示される。鳥類発現系において、ヒトＮａＧｌｕコード配列は、遺伝子導入鳥類において、特に鳥類卵管の筒部の管状腺細胞中においてコード配列を発現する位置関係で、プロモーターに作動可能に連結され、その結果、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、遺伝子導入鳥類によって産卵された硬殻卵の卵白中で発現され、そこに沈着する。鳥類系においてｒｈＮａＧｌｕを発現させるための追加の好適ベクターおよびベクターを作製する方法はまた、米国特許第６，７３０，８２２号、米国特許第６，８２５，３９６号、米国特許第６，８７５，５８８号、米国特許第７，２９４，５０７号、米国特許第７，５２１，５９１号、米国特許第７，５３４，９２９号、米国出願第２００８／００６４８６２Ａ１号、および米国特許公開第２００６／０１８５０２４号にも開示され、それらの教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明においてまた有用であり得る他のプロモーターの非限定的な例としては、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、ＲＮａｓｅ ＭＰＲプロモーター等のＰｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１型、２型、および３型Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、およびこれらのプロモーターの各々の機能性部分が挙げられる。典型的に、機能性ターミネーター配列は、用いられるプロモーターに従って、本発明において使用するために選択される。
一実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクターであり、そのコード配列およびプロモーターは両方とも、レトロウイルスベクターの５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間に位置付けられる。１つの有用な実施形態において、ＬＴＲまたはレトロウイルスベクターは、鳥類白血病ウイルス（ＡＬＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、またはレンチウイルスに由来する。導入遺伝子を鳥類ゲノム中に無作為に導入するために有用な１つのレトロウイルスは、複製欠損ＡＬＶ、複製欠損ＭＬＶ、または複製欠損レンチウイルスである。
本発明はまた、自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターの使用を企図する。ＳＩＮベクターは、遺伝子導入鳥類の卵管において産生されるヒトＮａＧｌｕの量を増加させるために有用であり得る。この効果は、ＳＩＮベクターが、機能性プロモーターを有するいずれの選択可能なマーカーカセットも含有しない（ＳＩＮ／ＳＣネガティブベクター）とき、更に強化され得る。一実施形態において、ＳＩＮベクターは、組み込まれたレトロウイルスベクターの５’ＬＴＲがプロモーターとして機能しないように、変化させられたゲノムを有する、レトロウイルスベクターである。１つの特定の実施形態において、一旦、組み込まれると、レトロウイルスベクターの５’ＬＴＲのＵ３領域をもたらす、レトロウイルスベクターのヌクレオチド配列の一部分または全ては、５’ＬＴＲのプロモーター活性を低減または排除するために欠失または変化させることができる。ヒトｒｈＮａＧｌｕのコード配列に融合された卵白アルブミンプロモーター領域を含有する、ＳＩＮベクターの非限定的な例が、図４Ａ〜Ｄおよび５に示される。そのベクターの機能性構成要素もまた、表１において表にされる。
Figure 2014534962
本明細書に記載されるベクターのいずれも、例えば、鳥類の卵管の管状腺細胞からの、ベクターのコード配列によって発現されるタンパク質の分泌を導くシグナルペプチドをコードする配列を含むことができる。組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質がさもなければ分泌されないであろう場合、コード配列を含有するベクターは、例えば、リゾチーム遺伝子から、シグナルペプチドをコードする約６０ｂｐを含むＤＮＡ配列を含むように修飾される。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、それが、ＤＮＡによってコードされるｒｈＮａＧｌｕのタンパク質のＮ末端に位置するように、ベクターに挿入される。
更に、本発明の方法のいずれかにおいて使用されるベクターのコード配列には、産生されるＲＮＡに安定性を付与するための３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が提供され得る。３’ＵＴＲがレトロウイルスベクターに付加されるとき、プロモーター、コード配列、および３’ＵＴＲの向きは、好ましくは、３’ＵＴＲの付加が完全長ゲノムＲＮＡの転写を干渉しないように、３’ＵＴＲの方向に対して逆にされる。一実施形態において、３’ＵＴＲは、卵白アルブミン遺伝子、リゾチーム遺伝子の３’ＵＴＲ、または筒部細胞中、すなわち、ＳＶ４０後期領域で機能性である任意の３’ＵＴＲであってもよい。
ＩＩＩ．遺伝子導入鳥類
本明細書に記載される導入遺伝子を、鳥類胚性胚盤葉細胞中に導入して、その生殖系列組織のゲノム内に組換えヒトＮａＧｌｕをコードする導入遺伝子を担持する、遺伝子導入ニワトリ、遺伝子導入シチメンチョウ、遺伝子導入ウズラ、および他の鳥類種を産生することができる。本発明の一態様において、ｒｈＮａＧｌｕを産生する遺伝子導入鳥類は、レトロウイルスベクターの５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間に導入遺伝子を担持する、複製欠損または複製可能レトロウイルス粒子による胚性胚盤葉細胞の形質導入によって作り出される。例えば、鳥類白血病ウイルス（ＡＬＶ）レトロウイルスベクターまたはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）レトロウイルスベクターを使用することができる。ウイルス粒子中にパッケージ化される修飾されたレトロウイルスベクターのＲＮＡコピーを使用して、遺伝子導入鳥類へと発達する胚性胚盤葉を感染させることができる。
本発明の方法によって、導入遺伝子は、種々の鳥類種の胚性胚盤葉細胞中に導入することができる。例えば、本方法は、本発明のタンパク質を産生するためにその生殖系列組織のゲノム内に導入遺伝子を担持する、遺伝子導入ニワトリ、遺伝子導入シチメンチョウ、遺伝子導入ウズラ、遺伝子導入管、および他の鳥類種を産生するために適用することができる。胚盤葉細胞は、典型的に、Ｅｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ ａｎｄ Ｋｏｃｈａｖ （１９７６）、またはその均等物によって定義されるところのＶＩＩ〜ＸＩＩ期細胞である。好ましい実施形態において、胚盤葉細胞は、Ｘ期時点またはその付近である。
胚盤葉細胞形質移入する１つの方法において、パッケージ化されたレトロウイルスに基づくベクターを使用して、ベクターが鳥類ゲノム内に組み込まれるように、ベクターを胚性胚盤葉細胞中に送達することができる。かかるウイルス粒子（すなわち、形質導入粒子）は、ベクターのために産生され、胚に注射するために使用され得る適切な濃度を決定するために滴定される。一実施形態において、鳥類卵は、米国特許第５，８９７，９９８号に記載され、その開示が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる手順に従って窓を付けられ、その卵は、Ｘ期時点またはその付近で形質導入粒子を注射される。
ｒｈＮａＧｌｕを産生する本発明の遺伝子導入鳥類は、ベクターが導入された胚盤葉細胞から発達させられる。結果として生じる胚は、発達させられ、ヒヨコは、成熟させられる。この段階で、胚盤葉細胞から生み出される遺伝子導入鳥類は、創始者として知られ、導入遺伝子を担持する細胞に対するキメラであり、Ｇ０の参照を付けられる。Ｇ０創始者鳥類は、典型的に、各々挿入された導入遺伝子のキメラである。つまり、Ｇ０遺伝子導入トリの細胞の一部のみが、導入遺伝子を含有する。幾つかの創始者は、それらの卵管の筒部における管状腺細胞中に導入遺伝子を担持する。これらの鳥類は、それらの卵管において導入遺伝子によってコードされるｒｈＮａＧｌｕタンパク質を発現する。ＮａＧｌｕタンパク質はまた、卵管に加えて他の組織（例えば、血液）中でも発現され得る。幾つかの創始者は、生殖系列組織のゲノム内に導入遺伝子を担持する生殖系列創始者であり、それはまた、外因性タンパク質を発現する卵管筒部管状腺細胞中に導入遺伝子を担持し得る。
遺伝子導入鳥類は、その生殖系列において導入遺伝子を担持することができ、メンデル様式で安定に、外因性導入遺伝子の、鳥類の子孫への伝達を提供する。Ｇ０世代は、典型的に、ｒｈＮａＧｌｕをコードする導入遺伝子に対してヘミ接合である。Ｇ０世代を、非遺伝子導入動物と繁殖させて、導入遺伝子に対して同様にヘミ接合であり、トリの細胞の本質的に全てにおいて導入遺伝子を含有する、Ｇ１遺伝子導入子孫を生じさせることができる。Ｇ１ヘミ接合子孫を、非遺伝子導入動物と繁殖させて、Ｇ２ヘミ接合子孫を生じさせることができ、あるいは、一緒に繁殖させて、導入遺伝子に対してホモ接合のＧ２子孫を生じさせてもよい。Ｇ１子孫に由来する導入遺伝子に対して陽性である鳥類の細胞の実質的に全てが、導入遺伝子を含有する。一実施形態において、同じ系列からのヘミ接合のＧ２子孫を繁殖させて、導入遺伝子に対してホモ接合のＧ３子孫を生み出すことができる。別の実施形態においては、例えば、ヘミ接合Ｇ０またはＧ１動物を一緒に繁殖させて、動物の各細胞中に導入遺伝子（複数可）の２つのコピーを含有するホモ接合Ｇ１子孫を生じさせる。これらは、ある特定の有用な繁殖方法の例にすぎず、本発明は、当業者に既知の方法等の任意の有用な繁殖方法の利用を企図する。
ＩＶ．ｒｈＮａＧｌｕの産生
ｒｈＮａＧｌｕは、ゲノム内にｒｈＮａＧｌｕをコードする導入遺伝子を含有する、遺伝子導入鳥類を使用して産生することができる。一実施形態において、遺伝子導入鳥類は、生殖系列遺伝子導入ニワトリ、ウズラ、アヒル、またはシチメンチョウである。１つの特に有用な実施形態において、本発明は、ニワトリの卵管において産生され得るＮａＧｌｕの産生に向けられる。
鳥類系における（例えば、鳥類卵管における）修飾を伴うまたは伴わないｒｈＮａＧｌｕの産生が、本発明の範囲内である。一実施形態において、無修飾のｒｈＮａＧｌｕは、ヒト細胞による効率的な取り込みを可能にするグリコシル化構造（すなわち、Ｍ６Ｐ）を有する野生型アミノ酸配列（配列番号１の２４〜７４３）を含む。別の実施形態において、修飾されたタンパク質は、ヒト細胞による効率的な取り込みを可能にするグリコシル化パターン（すなわち、Ｍ６Ｐ）を有するｒｈＮａＧｌｕ融合タンパク質であり得る。
ニワトリ卵管中におけるコード配列の発現を駆動する組織特異的または構成的プロモーターに作動可能に連結された、ＮａＧｌｕタンパク質をコードする核酸配列を含有する好適な鳥類ベクターは、本明細書に記載されるるＸ期時点またはその付近のニワトリ胚性細胞中に導入される。形質転換胚性細胞は、生きたヒヨコを孵化することを促す条件下でインキュベートされる。生きたヒヨコは、成熟キメラニワトリへと養育され、自然にまたは人工授精を介して非遺伝子導入ニワトリと交配させる。遺伝子導入ニワトリは、タンパク質コード配列の生殖系列組み込みについて、子孫をスクリーニングすることによって特定される。遺伝子導入子孫を、別の遺伝子導入または非遺伝子導入ニワトリと交配させて、卵を産卵する完全生殖系列遺伝子導入メンドリを産生することができる。
ｒｈＮａＧｌｕは、組織特異的様態で産生することができる。例えば、ｒｈＮａＧｌｕは、遺伝子導入鳥類の卵管、血液、および／または他の細胞もしくは組織中で発現され得る。一実施形態において、ＮａＧｌｕは、遺伝子導入鳥類の卵管の筒部の管状腺細胞中で発現され、卵管の内腔中に分泌され、卵白に沈着される。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕを含有する卵白は、採取され、４℃〜−２０℃の範囲の温度で大量に保管される。ＮａＧｌｕは次いで、当該技術分野で既知の種々の方法を使用して、卵の内容物から単離され、精製される。
本発明の一態様は、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質を含有する鳥類硬殻卵（例えば、ニワトリ硬殻卵）に関する。遺伝子導入鳥類によって産生され、分泌されるｒｈＮａＧｌｕは、ヒト細胞による細胞取り込みに好ましい様態でグリコシル化される。タンパク質は、任意の有用な量で存在してもよい。一実施形態において、タンパク質は、１硬殻卵当たり約０．０１μｇ〜１硬殻卵当たり約１グラムの範囲の量で存在する。別の実施形態において、タンパク質は、１硬殻卵当たり約１μｇ〜１硬殻卵当たり約１グラムの範囲の量で存在する。例えば、タンパク質は、１硬殻卵当たり約１０μｇ〜１硬殻卵当たり約１グラムの範囲（例えば、１硬殻卵当たり約１０μｇ〜１硬殻卵当たり約４００ミリグラムの範囲）の量で存在してもよい。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、卵の卵白中に存在する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、１ミリリットルの卵白当たり約１ｎｇ〜１ミリリットルの卵白当たり約０．２グラムの範囲の量で存在する。例えば、ｒｈＮａＧｌｕは、１ミリリットルの卵白当たり約０．１μｇ〜１ミリリットルの卵白当たり約０．２グラムの範囲の量で存在してもよい（例えば、ｒｈＮａＧｌｕは、１ミリリットルの卵白当たり約１μｇ〜１ミリリットルの卵白当たり約１００ミリグラムの範囲の量で存在してもよい。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、１ミリリットルの卵白当たり約１μｇ〜１ミリリットルの卵白当たり約５０ミリグラムの範囲の量で存在する。例えば、ｒｈＮａＧｌｕは、１ミリリットルの卵白当たり約１μｇ〜１ミリリットルの卵白当たり約１０ミリグラムの範囲の量で存在してもよい（例えば、ｒｈＮａＧｌｕは、１ミリリットルの卵白当たり約１μｇ〜１ミリリットルの卵白当たり約１ミリグラムの範囲の量で存在してもよい）。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、１ミリリットルの卵白当たり０．１μｇを超える量で存在する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、１ミリリットルの卵白当たり０．５μｇを超える量で存在する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、１ミリリットルの卵白当たり１μｇを超える量で存在する。一実施形態において、タンパク質は、１ミリリットルの卵白当たり１．５μｇを超える量で存在する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、１ミリリットルの卵白当たり０．５μｇを超える量で存在する。一実施形態において、タンパク質は、１ミリリットルの卵白当たり０．１μｇを超える量で存在する。
一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、２０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１２０ｍｇ／Ｌ、１３０ｍｇ／Ｌ、１４０ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、１６０ｍｇ／Ｌ、１７０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、または１，０００ｍｇ／Ｌ卵白の量で存在する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、約１００ｍｇ／Ｌの卵白の量で存在する。一実施形態において、ｒｈＮａＧｌｕは、約２００ｍｇ／Ｌの卵白の量で存在する。
Ｖ． 宿主細胞
本発明はまた、限定なしに、細胞培養（例えば、鳥類細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＣＯＳ細胞）、酵母、細菌、および植物を含む、任意の有用なタンパク質発現系において産生されるｒｈＮａＧｌｕも企図する。
宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する、または発現されたＮａＧｌｕを所望の様式でプロセスする、その能力について選定することができる。ＮａＧｌｕのポリペプチドのかかる修飾には、限定なしに、グリコシル化、リン酸化、または脂質付加が含まれる。かかる翻訳後活性のための特異的細胞機構および特徴的機構を有するＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷ１３８等の異なる宿主細胞を、本発明の融合タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選定することができる。鳥類腫瘍細胞株もまた、本発明のポリペプチドを発現するための宿主細胞として企図される。有用鳥類細胞株（例えば、鳥類卵管腫瘍細胞株）の例は、米国特許公開第２００９／０２５３１７６号に記載され、それらの教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＩ．薬学的組成物
本発明はまた、単離され、実質的に精製されたｒｈＮａＧｌｕまたはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物を特色とする。組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、例えば、薬学的製剤の一部として１つ以上の担体を使用して、または担体を用いずに、投与されてもよい。担体（複数可）は、製剤の他の成分と適合であり、そのレシピエントに有害でないという意味で「許容され」なければならない。複合分子を含む、かかる担体を含む組成物は、周知の従来方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １４ｔｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．を参照されたい）によって製剤化され、それらの教示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。担体は、希釈剤を含んでもよい。一実施形態において、薬学的担体は、液体であり得、タンパク質は、溶液の形態であってもよい。薬学的担体は、ワックス、脂肪、またはアルコールであり得る。別の実施形態において、薬学的に許容される担体は、固体の形態粉末、凍結乾燥粉末、または錠剤であってもよい。一実施形態において、担体は、リポソームまたはマイクロカプセルを含んでもよい。
幾つかの実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を含む薬学的組成物は、緩衝液を更に含む。例となる緩衝液としては、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、およびグルタミン酸塩緩衝液が挙げられる。例となる緩衝液としてはまた、クエン酸リチウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カルシウム、乳酸リチウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウム、リン酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、マレイン酸リチウム、マレイン酸ナトリウム、マレイン酸カリウム、マレイン酸カルシウム、酒石酸リチウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム、酒石酸カルシウム、コハク酸リチウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、コハク酸カルシウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム、およびそれらの混合物が挙げられる。幾つかの実施形態において、緩衝液は、クエン酸三ナトリウム二水和物である。幾つかの実施形態において、緩衝液は、クエン酸一水和物である。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、クエン酸三ナトリウム二水和物およびクエン酸一水和物を含む。
幾つかの実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を含む薬学的組成物は、安定剤を更に含む。例となる安定剤としては、アルブミン、トレハロース、糖、アミノ酸、ポリオール、シクロデキストリン、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウム等の塩、凍結乾燥保護剤、ならびにそれらの混合物が挙げられる。幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、ヒト血清アルブミンを含む。
幾つかの実施形態において、界面活性剤を薬学的組成物に添加することが望ましい。例となる界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート ２０または８０）；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ等の非イオン性界面活性剤；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグルコシドナトリウム；ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、またはステアリルスルホベタイン；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、またはステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、またはセチルベタイン；ラウロアミドプロピル（ｌａｕｒｏａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノレアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、またはイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、またはイソステアラミドプロピルジメチルアミン；メチルココイルタウレートナトリウム、またはメチルオレイル（ｏｆｅｙｌ）タウレート二ナトリウム；ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、およびエチレンとプロピレングリコールとの共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ， ＰＦ６８等）が挙げられる。典型的に、添加される界面活性剤の量は、それがタンパク質の凝集を低減し、微粒子または泡立の形成を最小化するような量である。例えば、界面活性剤は、製剤中に約０．００１〜０．５％（例えば、約０．００５〜０．０５％、または０．００５〜０．０１％）の濃度で存在してもよい。詳細には、界面活性剤は、製剤中におよそ０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、または０．５％等の濃度で存在してもよい。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
幾つかの実施形態において、本発明の好適な薬学的組成物は、特に、凍結乾燥製剤のために、１つ以上の増量剤を更に含んでもよい。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を追加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する化合物である。例えば、増量剤は、凍結乾燥ケーキの外観を改善し得る（例えば、本質的に均一の凍結乾燥ケーキ）。好適な増量剤には、塩化ナトリウム、乳糖、マンニトール、グリシン、ショ糖、トレハロース、ヒドロキシエチルデンプンが含まれるが、これらに限定されない。増量剤の例となる濃度は、約１％〜約１０％（例えば、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、および１０．０％）である。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。薬学的組成物は、希釈剤により再構築される、注射用の滅菌凍結乾燥粉末の形態であり得る。希釈剤は、注射用水、注射用静菌水、または滅菌食塩水であり得る。凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）粉末は、融合タンパク質の溶液を凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）させて、乾燥形態のタンパク質を生産するによって生産されてもよい。当該技術分野で既知であるように、凍結乾燥タンパク質は、一般に、タンパク質の液体溶液よりも増加した安定性およびより長い貯蔵寿命を有する。
薬学的製剤には、経口、直腸、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、膣内または非経口投与に好適な製剤が含まれる。好ましくは、本発明の薬学的製剤には、髄腔内、実質内、脳内、脳室内、筋肉内、皮下、および静脈内投与を含む、注射による投与に好適な製剤が含まれる。一実施形態において、本発明の製剤は、静脈内投与に好適である。別の実施形態において、本発明の製剤は、髄腔内投与に好適である。本発明の薬学的製剤にはまた、吸入またはガス注入による投与に好適な製剤が含まれる。製剤は、適切な場合、個別的な投与単位で好都合に提示することができ、薬学の技術分野で周知の方法のいずれによっても調製することができる。薬学的製剤を産生する方法は、典型的に、治療用タンパク質を液体担体と混合するステップもしくは固体担体を微細に分割するステップ、またはその両方のステップ、次いで、必要な場合、製品を所望の製剤に成形するステップを含む。
本発明の組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質はまた、非経口投与（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または連続注入による）用に製剤化することもでき、また、アンプル、プレフィルドシリンジ、少容量注入中の単位用量形態で、または防腐剤が添加された複数回用量容器中に、提示することができる。治療用タンパク質は、例えば、皮下注射、筋肉内注射、髄腔内注射、脳内注射、実質内注射、脳室内注射、および静脈内（ＩＶ）注入または注射によって注射することができる。
一実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、任意の有用な方法によるＩＶ注入によって静脈内投与される。一例では、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、末梢ラインを通じる静脈内注入によって投与することができる。別の例において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、末梢挿入中心静脈カテーテルを通じる静脈内注入によって投与することができる。別の例において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、静脈血管アクセスポートに結合された携行式注入機械によって容易にされる、静脈内注入によって投与することができる。静脈内注入の一実施形態において、薬は、当該技術分野に精通する医師によって決定される、注入される薬の量および患者の以前の注入関連の反応履歴に応じて、１〜８時間の期間にわたって投与される。別の実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、ＩＶ注射によって静脈内投与される。別の実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、腹腔内または髄腔内注射を介して投与することができる。
幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は、注入によって投与され、その注入は、延長した時間枠、例えば、３０分間〜１０時間にわたって生じ得る。故に、注入は、例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、または約５時間の期間にわたって生じ得る。注入はまた、種々の速度で生じ得る。故に、例えば、注入速度は、１時間当たり約１ｍＬ〜１時間当たり約２０ｍＬであり得る。幾つかの実施形態において、注入速度は、１時間当たり５ｍＬ〜１０ｍＬである。一実施形態において、注入速度は、１時間当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｍＬである。一実施形態において、注入速度は、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／時間である。一実施形態において、注入速度は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．５、約１．０、約１．５、約２．０、または約３ｍｇ／ｋｇ／時間である。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
治療用タンパク質は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルション等の形態をとることができ、また、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤等の調合剤を含有できる。組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、使用前の、好適なビヒクル、例えば、滅菌発熱性物質除去水による構築のために、滅菌固体の無菌単離によってまたは溶液からの凍結乾燥によって得られる、粉末形態であり得る。
本発明による製剤は、製品品質分析、再構築時間（凍結乾燥の場合）、再構築の品質（凍結乾燥の場合）、高分子量、水分、およびガラス転移温度に基づいて評価することができる。典型的に、タンパク質品質および製品分析には、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）、Ｘ線回折（ＸＲＤ）、変調示差走査熱量測定（ｍＤＳＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）、蛍光、紫外線吸収、比濁法、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない方法を使用する、製品分解速度分析が含まれる。幾つかの実施形態において、本発明による製品の評価は、外観（液体またはケーキいずれかの外観）を評価するステップを含んでもよい。
一般に、製剤（凍結乾燥または水性）は、室温で延長した一定期間にわたって保管することができる。蓄積温度は、典型的に０℃〜４５℃（例えば、４℃、２０℃、２５℃、または４５℃）の範囲であり得る。製剤は、数ヶ月の期間から数年の期間にわたって保管され得る。保管期間は、一般に２４ヶ月、１２ヶ月、６ヶ月、４．５ヶ月、３ヶ月、２ヶ月、または１ヶ月であろう。製剤は、投与に使用される容器中に直接保管することができ、転移ステップを排除する。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
製剤は、凍結乾燥容器（凍結乾燥の場合）中に直接保管することができ、それがまた、再構築の入れ物として機能し得、転移ステップを排除する。代替的に、凍結乾燥品製剤は、保管用に、より小さい増分へと計量されてもよい。保管は、一般に、日光への曝露、ＵＶ放射、他の形態の電磁放射、過度の暑さまたは寒さ、急激な熱衝撃、および機械的衝撃を含むが、これらに限定されない、タンパク質の分解につながる状況を回避すべきである。本発明による薬学的組成物はまた、下でより詳細に論じられる、免疫抑制剤、抗菌剤、または防腐剤等の他の活性成分を含有することができる。
ＶＩＩ．治療方法
本発明はまた、ＮａＧｌｕ−関連疾患、例えば、サンフィリポ症候群Ｂを治療する方法も提供する。本発明により利用される組換えＮａＧｌｕは、限定なしに、細胞培養（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞）、大腸菌等の細菌、哺乳動物および鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、およびシチメンチョウ）等の遺伝子導入動物を含む任意の有用なタンパク質発現系において、ならびに植物系（例えば、アオウキクサおよびタバコ植物）において産生され得る、組換えＮａＧｌｕを含む。一実施形態において、組換えＮａＧｌｕは、鳥類等の遺伝子導入動物において産生される。
一実施形態において、方法は、対象に、ＮａＧｌｕ欠乏症またはＮａＧｌｕ関連疾患の１つ以上の症状を治療する（例えば、低減する、寛解させる）または予防するのに十分な量で、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質（ｒｈＮａＧｌｕ）、例えば、十分な量のオリゴ糖（例えば、マンノースおよびリン酸化マンノース（すなわち、Ｍ６Ｐ））を含有する組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を投与することを含む。組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、治療的にもしくは予防的に、または両方として投与することができる。組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質（ｒｈＮａＧｌｕ）は、対象に、単独でまたは本明細書に記載される他の治療様式と組み合わせて、投与することができる。
「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語は、疾患もしくは症状を緩和する、弱める、もしくは寛解させる、追加の症状を予防する、症状の根底にある原因を寛解させるもしくは予防する、疾患もしくは病態を阻害する、疾患もしくは病態の発症を阻む、疾患もしくは病態を軽減する、疾患もしくは病態の退縮を引き起こす、疾患もしくは病態によって引き起こされる病態を軽減する、または予防的におよび／もしくは症状が生じた後のいずれかで疾患もしくは病態の症状を止める方法を指す。
「治療上有効用量」という用語は、意図される治療的応答（例えば、標的組織内のヘパラン硫酸塩レベルの低減および／またはＮａＧｌｕ活性における増加）をもたらすのに必要とされる薬物の用量（例えば、量および／または間隔）を指す。治療上有効用量は、かかる用量を受けたことがない対応する対照と比較して、疾患、障害、もしくは副作用の改善された治療、治癒、予防、もしくは寛解、または疾患もしくは障害の発生率もしくは進行における減少をもたらす用量を指す。この用語にはまた、その範囲内に、生理機能を強化するのに有効な用量も含まれる。
本明細書で使用されるとき、「対象」または「患者」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むように意図される。非ヒト動物には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類等の全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。好ましい対象には、ＮａＧｌｕ欠乏症またはＮａＧｌｕ関連疾患を有するヒト対象が含まれる。
本明細書で使用されるとき「ＮａＧｌｕ関連疾患」は、ＮａＧｌｕ活性によって媒介される、または異常なＮａＧｌｕ発現もしくは活性に関連する疾患または病態である。ＮａＧｌｕ関連疾患の例としては、ＮａＧｌｕ欠乏症等のサンフィリポ（Ｓａｎｆｌｉｐｐｏ）症候群Ｂ（ムコ多糖症ＩＩＩＢ型としても知られる）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の治療方法は、関連臓器および組織中への組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質の取り込みまたは輸送を容易にする、任意の投与経路を包含する。一実施形態において、本発明の方法は、本発明の組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を、ＮａＧｌｕ関連疾患（例えば、ＮａＧｌｕ欠乏症）の治療のために、対象のＣＮＳ（中枢神経系）、腎臓、または肝臓に送達することを含む。例えば、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、患者に、静脈内に（例えば、静脈内注射または静脈内注入を介して）投与されてもよく、驚くべきことに、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する。本発明の別の実施形態において、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、患者の髄腔内に投与される。
Ａ． 髄腔内送達用デバイス
種々のデバイスが、本発明により、髄腔内送達用に使用されてもよい。幾つかの実施形態において、髄腔内投与用のデバイスは、流体アクセスポート（例えば、注射用ポート）、流体アクセスポートと流体連通している第１の流動開口部および脊髄中への挿入のために構成される第２の流動開口部を有する中空体（例えば、カテーテル）、ならびに脊髄中の中空体の挿入を固定するための固定機構を含有する。非限定的な例として、好適な固定機構は、中空体の表面上に載置される１つ以上のノブ、および中空体（例えば、カテーテル）が脊髄から滑り落ちることを防止するために１つ以上のノブ上で調整可能な縫合されたリングを含有する。種々の実施形態において、流体アクセスポートは、リザーバを含む。幾つかの実施形態において、流体アクセスポートは、機械的ポンプ（例えば、注入ポンプ）を含む。幾つかの実施形態において、移植されるカテーテルは、リザーバ（例えば、ボーラス送達用）、または注入ポンプのいずれかに接続される。流体アクセスポートは、移植されても、外部であってもよい。
幾つかの実施形態において、髄腔内投与は、腰椎穿刺（すなわち、緩徐ボーラス）によって、またはポート・カテーテル送達系（すなわち、注入またはボーラス）を介して行われてもよい。幾つかの実施形態において、カテーテルは、腰椎の弓板の間に挿入され、先端は、腱鞘空間に所望のレベル（一般にＬ３〜Ｌ４）まで上方に螺入される。
静脈内投与に対して、髄腔内投与に好適な単回用量体積は、典型的に小さい。典型的に、本発明による髄腔内送達は、ＣＳＦの組成ならびに対象の頭蓋内圧の均衡を維持する。幾つかの実施形態において、髄腔内送達は、対象からのＣＳＦの対応する除去なしに行われる。幾つかの実施形態において、好適な単回用量体積は、例えば、約１０ｍＬ、８ｍＬ、６ｍＬ、５ｍＬ、４ｍＬ、３ｍＬ、２ｍＬ、１．５ｍＬ、１ｍＬ、または０．５ｍＬ未満であってもよい。幾つかの実施形態において、好適な単回用量体積は、約０．５〜５ｍＬ、０．５〜４ｍＬ、０．５〜３ｍＬ、０．５〜２ｍＬ、０．５〜１ｍＬ、１〜３ｍＬ、１〜５ｍＬ、１．５〜３ｍＬ、１〜４ｍＬ、または０．５〜１．５ｍＬであってもよい。幾つかの実施形態において、本発明による髄腔内送達は、最初に所望の量のＣＳＦを除去するステップを伴う。幾つかの実施形態において、髄腔内投与前に、約１０ｍＬ未満（例えば、約９ｍＬ未満、約８ｍＬ未満、約７ｍＬ未満、約６ｍＬ未満、約５ｍＬ未満、約４ｍＬ未満、約３ｍＬ未満、約２ｍＬ未満、約１ｍＬ未満）のＣＳＦが最初に除去される。それらの事例において、好適な単回用量体積は、例えば、約３ｍＬ超、約４ｍＬ超、約５ｍＬ超、約６ｍＬ超、約７ｍＬ超、約８ｍＬ超、約９ｍＬ超、約１０ｍＬ超、約１５ｍＬ超、または約２０ｍＬ超であってもよい。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
種々の他のデバイスを使用して、治療的組成物の髄腔内投与を達成してもよい。例えば、所望の酵素を含有する製剤は、髄膜癌腫症に対する薬物を髄腔内投与するために一般的に使用されるＯｍｍａｙａリザーバを使用して与えられてもよい（Ｌａｎｃｅｔ ２：９８３−８４，１９６３）。より具体的には、この方法において、脳室管が、前角に形成された孔を通じて挿入され、頭皮下に設置されたＯｍｍａｙａリザーバに接続され、リザーバが皮下穿刺されて、リザーバ中に注射される、補充されている特定の酵素を髄腔内送達する。治療的組成物または製剤の、個体への髄腔内投与用の他のデバイスは、米国特許第６，２１７，５５２号に記載され、その内容全体は、それらがこれらのデバイスに関するため、参照により本明細書に組み込まれる。代替的に、薬物は、例えば、単回注射または連続注入によって、髄腔内に与えられてもよい。投薬治療は、単回用量投与または複数回用量の形態であってもよいことが理解されるべきである。
注射用に、本発明の製剤は、液体溶液中に製剤化することができる。
加えて、ＮａＧｌｕ酵素は、固体形態で製剤化され、使用直前に再溶解または懸濁させられてもよい。凍結乾燥形態もまた含まれる。注射は、例えば、ＮａＧｌｕ酵素のボーラス注射または連続注入（例えば、注入ポンプを使用する）の形態であり得る。
本発明の一実施形態において、ＮａＧｌｕ酵素は、側脳室注射によって対象の脳に投与される。注射は、例えば、対象の頭蓋骨に形成された穿頭孔を通じて行われてもよい。別の実施形態において、酵素および／または他の薬学的製剤は、外科的に挿入されるシャントを通じて対象の脳室中に投与される。例えば、注射は、より大きい、側脳室中へと行うことができる。幾つかの実施形態において、第３および第４のより小さい脳室中への注射もまた行うことができる。
なおも別の実施形態において、薬学的組成物本発明において使用されるは、注射によって対象の大槽、または腰部中に投与される。
本発明の方法の別の実施形態において、薬学的に許容される製剤は、本発明において使用される酵素または他の薬学的組成物の持続性送達、例えば、「緩徐放出」を対象に、薬学的に許容される製剤が対象に投与された後、少なくとも１、２、３、４週間、またはより長い一定期間にわたって提供する。
本明細書で使用されるとき、「持続性送達」という用語は、体内での本発明の薬学的製剤の、投与後、一定期間、好ましくは少なくとも数日間、１週間、または数週間にわたる連続送達を指す。組成物の持続性送達は、例えば、酵素の経時的な継続的治療効果によって実証することができる（例えば、酵素の持続性送達は、対象における蓄積顆粒の量の継続的低減によって実証することができる）。代替的に、持続性送達酵素のは、体内の経時的な酵素の存在を検出することによって実証されてもよい。
Ｂ． 静脈内送達
上で論じられるように、本発明の驚くべき特徴の１つは、本発明の組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質がまた、静脈内投与されるとき、血液脳関門（ＢＢＢ）および脳表面を渡って効果的かつ広範囲に拡散し、脳の深部を含む、脳の種々の層または領域を浸透可能であるということである。本発明の方法は、ｒｈＮａＧｌｕタンパク質を、既存のＣＮＳ送達方法によっては標的とすることが困難である、中枢神経系（ＣＮＳ）の種々の組織、ニューロン、または細胞に効果的に送達する。更に、本発明の方法は、十分な量の組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を、血流ならびに種々の末梢臓器および組織に送達する。
しばしば医学的にＩＶプッシュまたはボーラス注射と称される「静脈内注射」は、シリンジが、ＩＶアクセスデバイスに接続され、薬が、典型的に急速に、また時には、それが静脈に刺激または急速過ぎる効果を引き起こす場合、最大１５分間の期間で直接注射される、投与経路を指す。一旦、薬品がＩＶ管類の輸液流の中に注射されると、それが管類から患者へと達することを確実にする何らかの手段が存在しなければならない。通常、これは、輸液流が正常に流れ、それによって薬品を血流中へと運ぶことを可能にすることによって達成される。しかしながら、幾つかの事例において、薬品が血流中に進入することを容易にするために、「フラッシュ」と時に呼ばれる第２の輸液注射が、第１の注射に続いて使用される。
「静脈内注入」は、薬が延長した一定期間にわたって送達される投与経路を指す。例えば、薬は、患者に、１〜８時間の一定期間にわたって送達することができる。薬はまた、患者に、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、または約８時間の期間にわたって送達することもできる。静脈内注入を遂行するために、ＩＶ重力点滴またはＩＶポンプを使用することができる。ＩＶ注入は、患者が、ある特定の時点のみに薬を必要とし、電解質、血液糖、および水分損失を復元するもの等の、追加の静脈内輸液（例えば、ナトリウム、塩化物、グルコース、またはそれらの任意の組み合わせを含有し得る水溶液）を必要としないときに、典型的に使用される。
Ｃ．標的組織
幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に送達される。幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、脳、脊髄、および／または末梢臓器の標的組織のうちの１つ以上に送達される。本明細書で使用されるとき、「標的組織」という用語は、治療されるべきＮａＧｌｕ関連疾患によって侵された任意の組織、または欠乏したＮａＧｌｕが通常発現される任意の組織を指す。幾つかの実施形態において、標的組織は、検出可能なまたは異常に高い量の酵素基質が、例えば、組織の細胞リソソーム内、ＮａＧｌｕ関連疾患を患うまたはその影響を受けやすい患者において貯蔵される、組織を含む。幾つかの実施形態において、標的組織は、疾患関連病理、症状、または特徴を示す組織を含む。幾つかの実施形態において、標的組織は、欠乏したＮａＧｌｕが亢進したレベルで通常発現される、組織を含む。本明細書で使用されるとき、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織、および／または末梢標的組織であってもよい。例となる標的組織が、下に更に詳細に記載される。
Ｄ．脳標的組織
一般に、脳は、異なる領域、層、および組織に分割され得る。例えば、髄膜組織は、脳を含む、中枢神経系を包囲する、膜の系である。髄膜は、硬膜、クモ膜、および軟膜を含む、３つの層を含有する。一般に、髄膜および脳脊髄液の主な機能は、中枢神経系を保護することである。幾つかの実施形態において、本発明による治療用タンパク質は、髄膜１つ以上の層に送達される。
脳は、大脳、小脳、および脳幹を含む、３つの主な下位区分を有する。他の脳構造の上に位置する大脳半球は、皮質層で被覆される。大脳の下部に、大脳が上に結合される柄に類似した、脳幹が位置する。脳の後部、大脳の下、および脳幹の後ろに、小脳がある。
脳の正中部付近および中脳の上に位置する、間脳は、視床、視床後部、視床下部、視床上部、視床前部（ｐｒｅｔｈａｌａｍｕｓ）、および視蓋前域を含有する。中脳（ｍｉｄｂｒａｉｎ）とも呼ばれる中脳（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）は、視蓋、被蓋野（ｔｅｇｕｍｅｎｔｕｍ）、脳室間膜（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｅｓｏｃｏｅｌｉａ）、および大脳脚、赤核、および第ＩＩＩ脳神経核を含有する。中脳は、視覚、聴覚、運動制御、睡眠／覚醒、注意力、および温度調節に関連する。
脳を含む中枢神経系の組織の領域は、組織の深度に基づいて特徴付けることができる。例えば、ＣＮＳ（例えば、脳）組織は、表面もしくは浅部組織、中深度組織、および／または深部組織として特徴付けることができる。
本発明によれば、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、対象において治療されるべき特定の疾患に関連する、任意の適切な脳標的組織（複数可）に送達されてもよい。幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、表面または浅部脳標的組織に送達される。幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、中深度脳標的組織に送達される。幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、深部脳標的組織に送達される。幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、表面もしくは浅部脳標的組織、中深度脳標的組織、および／または深部脳標的組織の組み合わせに送達される。幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、脳の外表面の少なくとも４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍ以上下（またはその内部）の深部脳組織に送達される。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、大脳の１つ以上の表面または浅部組織に送達される。幾つかの実施形態において、大脳の標的とされる表面または浅部組織は、大脳の表面から４ｍｍ以内に位置する。幾つかの実施形態において、大脳の標的とされる表面または浅部組織は、軟膜組織、大脳皮質リボン組織、海馬、ウィルヒョウ・ロビン腔、ＶＲ腔内の血管、海馬、脳の下面上の視床下部の部分、視神経および視神経路、嗅球および突起、ならびにそれらの組み合わせから選択される。
幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、大脳の１つ以上の深部組織に送達される。幾つかの実施形態において、大脳の標的とされる表面または浅部組織は、大脳の表面の少なくとも４ｍｍ（例えば、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、または１０ｍｍ）下（またはその内部）に位置する。幾つかの実施形態において、大脳の標的とされる深部組織は、大脳皮質リボンを含む。幾つかの実施形態において、大脳の標的とされる深部組織は、間脳（例えば、視床下部、視床、視床前部、または視床腹部）、後脳、レンズ核、基底核、尾状、被殻、扁桃体、淡蒼球、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。
幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、小脳の１つ以上の組織に送達される。ある特定の実施形態において、小脳の標的とされる１つ以上の組織は、分子層の組織、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、小脳脚、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、治療剤（例えば、酵素）は、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織（例えば、顆粒細胞層に対する深部）、および深部小脳核組織を含むが、これらに限定されない、小脳の１つ以上の深部組織に送達される。
幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、脳幹の１つ以上の組織に送達される。幾つかの実施形態において、脳幹の標的とされる１つ以上の組織は、脳幹白質組織および／または脳幹核組織を含む。
幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、灰白質、白質、脳室周囲部、軟膜クモ膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質における深部組織、分子層、尾状／被殻領域、中脳、橋または髄質の深部の領域、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、種々の脳組織に送達される。
幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞、および／または髄膜細胞を含むが、これらに限定されない、脳内の種々の細胞に送達される。幾つかの実施形態において、治療用タンパク質は、深部白質の乏突起膠細胞に送達される。
Ｅ．脊髄標的組織
一般に、脊髄の領域または組織は、組織の深度に基づいて特徴付けることができる。例えば、脊髄組織は、表面もしくは浅部組織、中深度組織、および／または深部組織として特徴付けることができる。
幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、脊髄の１つ以上の表面または浅部組織に送達される。幾つかの実施形態において、脊髄の標的とされる表面または浅部組織は、脊髄の表面から４ｍｍ以内に位置する。幾つかの実施形態において、脊髄の標的とされる表面または浅部組織は、軟膜および／または白質路を含有する。
幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、脊髄の１つ以上の深部組織に送達される。幾つかの実施形態において、脊髄の標的とされる深部組織は、脊髄の表面から４ｍｍ内部に位置する幾つかの実施形態において、脊髄の標的とされる深部組織は、脊髄灰白質および／または上皮細胞を含有する。
幾つかの実施形態において、補充酵素（例えば、ＮａＧｌｕ融合タンパク質）は、脊髄のニューロンに送達される。
Ｆ．末梢標的組織
本明細書で使用されるとき、末梢臓器または組織は、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部でない任意の臓器または組織を指す。末梢標的組織は、血液系、肝臓、腎臓、心臓、内皮、骨髄および骨髄由来の細胞、脾臓、肺、リンパ節、骨、軟骨、卵巣、ならびに精巣を含んでもよいが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、末梢標的組織のうちの１つ以上に送達される。
Ｇ．生体分布および生体利用能
種々の実施形態において、一旦、標的組織に送達されると、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、細胞内に局在化される。例えば、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、標的細胞（例えば、プルキンエ細胞等のニューロン）のエクソン、軸索、リソソーム、ミトコンドリア、または空胞に局在化されてもよい。例えば、幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕは、ｒｈＮａＧｌｕが血管周囲腔に移動する（例えば、脈拍補助による対流機構によって）ような移行ダイナミクスを示す。加えて、投与されるタンパク質または酵素とニューロフィラメントとの会合に関する活性軸索輸送機構はまた、中枢神経系のより深部の組織中への本発明のｒｈＮａＧｌｕタンパク質の分布に寄与するか、あるいはそれを容易にし得る。
幾つかの実施形態において、本発明により送達される本発明のｒｈＮａＧｌｕは、本明細書に記載される種々の標的組織内の治療上または臨床上有効レベルまたは活性を達成し得る。本明細書で使用されるとき、治療上または臨床上有効レベルまたは活性は、標的組織内の治療効果を付与するのに十分なレベルまたは活性である。治療効果は、客観的（すなわち、幾つかの試験またはマーカーによって測定可能）であっても、主観的（すなわち、対象が効果の指標または感じを提供する）であってもよい。例えば、治療上または臨床上有効レベルまたは活性は、標的組織内の疾患（例えば、ＧＡＧ蓄積）に関連する症状を寛解させるのに十分な酵素レベルまたは活性であってもよい。
幾つかの実施形態において、本発明により送達される本発明のｒｈＮａＧｌｕは、標的組織内の対応するＮａＧｌｕ酵素の正常なレベルまたは活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である、酵素レベルまたは活性を達成し得る。幾つかの実施形態において、本発明により送達される本発明のｒｈＮａＧｌｕは、対照（例えば、治療なしでの内因性レベルまたは活性）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍増加する、酵素レベルまたは活性を達成し得る。幾つかの実施形態において、本発明により送達されるｒｈＮａＧｌｕは、標的組織内で少なくともおよそ１０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、または６００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇの増加した酵素レベルまたは活性を達成し得る。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
幾つかの実施形態において、本発明による発明的方法は、化腰椎領域を標的とするのに特に有用である。幾つかの実施形態において、本発明により送達されるｒｈＮａＧｌｕは、腰椎の領域において、少なくともおよそ５００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、７００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、８００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、９００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、１０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、１５００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、２０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、または１０，０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇの増加した酵素レベルまたは活性を達成し得る。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
一般に、本発明により送達される治療剤（例えば、ｒｈＮａＧｌｕ）は、ＣＳＦならびに脳、脊髄、および末梢臓器の標的組織において、十分に長い半減期を有する。幾つかの実施形態において、本発明により送達されるｒｈＮａＧｌｕは、少なくともおよそ３０分間、４５分間、６０分間、９０分間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、最大３日間、最大７日間、最大１４日間、最大２１日間、または最大１ヶ月の半減期を有し得る。幾つかの実施形態において、幾つかの実施形態において、本発明により送達されるｒｈＮａＧｌｕは、投与の１２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間、９０時間、９６時間、１０２時間、または１週間後に、ＣＳＦまたは血流中で検出可能なレベルまたは活性を保持してもよい。検出可能なレベルまたは活性は、当該技術分野で既知の種々の方法を使用して決定してもよい。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
ある特定の実施形態において、本発明により送達されるｒｈＮａＧｌｕは、投与後（例えば、対象への薬学的組成物の投与後１週間、３日間、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分間、またはそれ未満）に、対象のＣＮＳ組織および細胞中で少なくとも３０μｇ／ｍＬの濃度を達成する。ある特定の実施形態において、本発明により送達されるｒｈＮａＧｌｕは、かかる対象への投与後（例えば、対象へのかかる薬学的組成物の投与後１週間、３日間、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分間、またはそれ未満）に、対象の標的とされる組織または細胞（例えば、脳組織またはニューロン）中で少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも７μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬまたは少なくとも０．５μｇ／ｍＬの濃度を達成する。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
Ｈ．サンフィリポ症候群の治療
サンフィリポ症候群、またはムコ多糖症ＩＩＩ（ＭＰＳ ＩＩＩ）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に関与する酵素の欠乏によって特徴付けられる、まれな遺伝子障害である。酵素の不在下で、部分的に分解されたＧＡＧ分子は、身体から除去することができず、種々の組織のリソソーム内に蓄積して、進行性の広範囲の全身機能不全をもたらす（Ｎｅｕｆｅｌｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｚｅｒ， ２００１）。
ＭＰＳ ＩＩＩＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと表記される、ＭＰＳ ＩＩＩの４つの特有の型が特定されている。各々は、ＧＡＧヘパラン硫酸塩の分解に関与する４つの酵素のうちの１つにおける欠乏症を表す。全ての型は、粗い顔立ち、肝脾腫大、角膜混濁、および骨格変形を含む、様々な程度の同じ臨床症状を含む。しかしながら、最も顕著には、ニューロンにおけるヘパラン硫酸塩の蓄積のみでなく、一次ＧＡＧ蓄積によって引き起こさるガングリオシドＧＭ２、ＧＭ３、およびＧＤ２のその後の亢進（Ｗａｌｋｌｅｙ １９９８）にも関係する、重度かつ進行性の認知能力の喪失である。
ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ、サンフィリポ症候群Ｂ）は、酵素アルファ−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（ＮａＧｌｕ）の欠乏によって特徴付けられる、常染色体劣性障害である。この酵素の不在下で、ＧＡＧヘパラン硫酸塩は、ニューロンおよびグリア細胞のリソソームに蓄積し、脳の外側での蓄積はそれより低い。
この障害の決定的な臨床特徴は、主な発達の重要な段階の喪失またはその到達の失敗をもたらす、中枢神経系（ＣＮＳ）変性である。進行性の認知低下は、痴呆症および若年死に至る。疾患は、典型的に、幼児において現れ、侵された個体の寿命は、一般に、１０代後半から２０代前半を越えては延長しない。
本発明の組成物および方法を使用して、サンフィリポ症候群Ｂを患うまたはその影響を受けやすい個体を効果的に治療してもよい。本明細書で使用される「治療する」または「治療」という用語は、疾患に関連する１つ以上の症状の寛解、疾患の１つ以上の症状の発症の予防もしくは遅延、および／または疾患の１つ以上の症状の重症度もしくは頻度を減らすことを指す。
幾つかの実施形態において、治療は、サンフィリポ症候群Ｂ患者における、部分的もしくは完全な緩和、寛解、軽減、阻害、発症の遅延、重症度および／または神経障害の発生率の低減を指す。本明細書で使用されるとき、「神経障害」という用語は、中枢神経系（例えば、脳および脊髄）の障害に関連する種々の症状を含む。神経障害の症状は、とりわけ、例えば、発達遅延、進行性の認知機能障害、聴力損失、障害言語発達、運動技能の不足、多動性、攻撃性、および／または睡眠障害を含んでもよい。
故に、幾つかの実施形態において、治療は、種々の組織内の減少したリソソーム蓄積（例えば、ＧＡＧの）を指す。幾つかの実施形態において、治療は、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織内の減少したリソソーム蓄積を指す。ある特定の実施形態において、リソソーム蓄積は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれを超えて減少する。幾つかの実施形態において、リソソーム蓄積は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍減少する。幾つかの実施形態において、リソソーム蓄積は、ＬＡＭＰ−１染色によって決定される。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
幾つかの実施形態において、治療は、ニューロン（例えば、プルキンエ細胞を含有するニューロン）における低減された空胞形成を指す。ある特定の実施形態において、ニューロンにおける空胞形成は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれを超えて減少する。幾つかの実施形態において、空胞形成は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍減少する。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
幾つかの実施形態において、治療は、種々の組織内の増加したＮａＧｌｕ酵素活性を指す。幾つかの実施形態において、治療は、脳標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢標的組織内の増加したＮａＧｌｕ酵素活性を指す。幾つかの実施形態において、ＮａＧｌｕ酵素活性は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれを超えて増加する。幾つかの実施形態において、ＮａＧｌｕ酵素活性は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍増加する。幾つかの実施形態において、増加したＮａＧｌｕ酵素活性は、少なくともおよそ１０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、またはそれを超える。幾つかの実施形態において、ＮａＧｌｕ酵素活性は、腰椎領域において増加する。幾つかの実施形態において、腰椎領域において増加したＮａＧｌｕ酵素活性は、少なくともおよそ２０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、１０，０００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ、またはそれを超える。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
ある特定の実施形態において、本発明による治療は、ＮａＧｌｕ関連疾患に関連する１つ以上の病理学的または生物学的マーカーの存在、あるいはその蓄積の低減（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれを超える低減）または完全な排除をもたらす。かかる低減または排除は、ＣＮＳの細胞および組織（例えば、ニューロンおよび乏突起膠細胞）内で特に明白であり得る。例えば、幾つかの実施形態において、対象に投与されると、本発明の薬学的組成物は、対象のＣＮＳ細胞および組織（例えば、大脳皮質、小脳、尾状核および被殻、白質および／または視床）内の、バイオマーカーであるリソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）の蓄積における低減を実証または達成する。ＬＡＭＰ１は、リソソーム膜内で高度に発現される糖タンパク質であり、その存在は、リソソーム蓄積障害を有する多くの患者において亢進される（Ｍｅｉｋｌｅｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）４３：１３２５−１３３５）。リソソーム蓄積疾患を有する患者におけるＬＡＭＰ１の存在または不在（例えば、ＬＡＭＰ染色によって決定される）は、したがって、リソソーム活性の有用な指標ならびにリソソーム蓄積疾患の診断および監視の両方のためのマーカーを提供し得る。
したがって、本発明の幾つかの実施形態は、ＮａＧｌｕ関連疾患に関連する１つ以上の病理学的または生物学的マーカーの存在または蓄積を低減あるいは排除する方法に関する。同様に、本発明の幾つかの実施形態は、リソソーム蓄積疾患に関連する１つ以上の病理学的または生物学的マーカー（例えば、ＬＡＭＰ１）の分解（または分解速度）を増加させる方法に関する。
幾つかの実施形態において、治療は、認知能力の喪失の減少した進行を指す。ある特定の実施形態において、認知能力の喪失の進行は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれを超えて減少する。幾つかの実施形態において、治療は、減少した発達遅延を指す。ある特定の実施形態において、発達遅延は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれを超えて減少する。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
幾つかの実施形態において、治療は、増加した生存率（例えば、生存時間）を指す。例えば、治療は、患者の増加した余命をもたらすことができる。幾つかの実施形態において、本発明による治療は、治療なしでの同様の疾患を有する１人以上の対照個体の平均余命と比較して、約５％超、約１０％超、約１５％超、約２０％超、約２５％超、約３０％超、約３５％超、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約１００％超、約１０５％超、約１１０％超、約１１５％超、約１２０％超、約１２５％超、約１３０％超、約１３５％超、約１４０％超、約１４５％超、約１５０％超、約１５５％超、約１６０％超、約１６５％超、約１７０％超、約１７５％超、約１８０％超、約１８５％超、約１９０％超、約１９５％超、約２００％超、またはそれを超えて、患者の増加した余命をもたらす。幾つかの実施形態において、本発明による治療は、治療なしでの同様の疾患を有する１つ以上の対照個体の平均余命と比較して、約６ヶ月超、約７ヶ月超、約８ヶ月超、約９ヶ月超、約１０ヶ月超、約１１ヶ月超、約１２ヶ月超、約２年超、約３年超、約４年超、約５年超、約６年超、約７年超、約８年超、約９年超、約１０年超、またはそれを超えて、患者の増加した余命をもたらす。幾つかの実施形態において、本発明による治療は、患者の長期生存率をもたらす。本明細書で使用されるとき、「長期生存率」という用語は、約４０年よりも長い、約４５年よりも長い、約５０年よりも長い、約５５年よりも長い、約６０年よりも長い、またはより長い生存時間または余命を指す。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
本明細書で使用される「改善する」、「増加させる」、または「低減する」という用語は、対照と比べた値を示す。幾つかの実施形態において、好適な対照は、本明細書に記載される治療の開始前の同じ個体における測定値、本明細書に記載される治療の不在下でのある対照個体（または複数の対照個体）における測定値等の、ベースライン測定値である。「対照個体」は、サンフィリポ症候群Ｂに罹患した個体は、（治療される個体および対照個体（複数可）における病期が同等であることを確実にするために）治療されている個体とおよそ同年齢および／または性別である。
治療されている個体（「患者」または「対象」とも称される）は、サンフィリポ症候群Ｂを有するまたはサンフィリポ症候群Ｂを発症する可能性を有する個体（胎児、幼児、小児、青年、または成人のヒト）である。個体は、残存の内因性ＮａＧｌｕ発現および／もしくは活性を有するか、または測定可能な活性を何ら有しない場合がある。例えば、サンフィリポ症候群Ｂを有する個体は、正常なＮａＧｌｕ発現レベルの約３０〜５０％未満、約２５〜３０％未満、約２０〜２５％未満、約１５〜２０％未満、約１０〜１５％未満、約５〜１０％未満、約０．１〜５％未満であるＮａＧｌｕ発現レベルを有し得る。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
幾つかの実施形態において、個体は、その疾患であると最近診断された個体である。典型的に、疾患の影響を最小限に抑え、治療の便益を最大限にするために、早期治療（診断後可能な限り速やかに開始する治療）が重要である。
Ｉ．併用療法
組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質、例えば、十分な量のオリゴ糖（例えば、マンノースおよびリン酸化マンノース（すなわち、Ｍ６Ｐ））を含有する組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、ＮａＧｌｕ関連疾患（例えば、サンフィリポ症候群Ｂ）を治療するために単独でまたは組み合わせて使用され得る。本発明の組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、単独で、あるいは追加の処置、例えば、外科的処置、または薬剤、例えば、治療剤、追加の処置、もしくはその意図される目的のために当業者によって選択されている薬剤と組み合わせて使用され得ることが理解されるべきである。例えば、追加の処置または薬剤は、本発明の組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質によって治療されている疾患または病態を治療するのに有用であるとして当該技術分野で認識される、治療的処置または薬剤であり得る。追加の処置または薬剤はまた、治療的組成物に有益な属性を付与する薬剤、例えば、組成物の粘度に影響を及ぼす薬剤でもあり得る。
本発明内に含まれる組み合わせは、それらの意図される目的のために有用な組み合わせであることもまた理解されるべきである。下に記載される薬剤および処置は、例示目的のためのものであり、本発明に対して限定的であるようには意図されない。本発明の一部である、組み合わせは、本発明の組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質および下の一覧から選択される少なくとも１つの追加の薬剤または処置であり得る。その組み合わせが、形成された組成物がその意図される機能を行うことができるようなものである場合、組み合わせはまた、１つを超える追加の薬剤または処置、例えば、２つまたは３つの追加の薬剤を含むこともできる。
併用療法は、外科的処置、遺伝子療法、または酵素補充療法を含むことができる。更に、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質は、１つ以上の追加の治療剤、例えば、未分解の基質の蓄積を予防または抑制可能である（例えば、基質抑制療法）他の組換えタンパク質または抗体または薬物と共製剤化（ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）することができる。
１つ以上の実施形態において、併用療法は、下に更に詳細に論じられるように、免疫抑制剤との共投与を含むことができる。例えば、アナフィラキシー反応または有害な免疫応答が、患者によって予想されるかまたは経験される場合、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、メトトレキサート、ＩＬ−２受容体指向性抗体、Ｔ細胞受容体指向性抗体、ＴＮＦ−アルファ指向性抗体または融合タンパク質（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、またはアダリムマブ）、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（例えば、アバタセプト）、抗ＯＸ−４０抗体等であるが、これらに限定されない、免疫抑制剤もまた、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質等の組換えヒトタンパク質の投与の前、その最中、またはその後に投与することができる。
Ｊ．免疫原性
本発明の薬学的組成物は、それらの認容性によって特徴付けられる。本明細書で使用されるとき、「容認できる」および「認容性」という用語は、かかる組成物が投与される対象において有害反応を引き出さない、あるいはかかる組成物が投与される対象において重大な有害反応を引き出さない、本発明の薬学的組成物の能力を指す。幾つかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、かかる組成物が投与される対象によって十分に容認される。
一般に、本発明によるｒｈＮａＧｌｕタンパク質の投与は、対象において重度の有害作用をもたらさない。本明細書で使用されるとき、重度の有害作用は、実質的な免疫応答、毒性、または死を誘発するが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、「実質的な免疫応答」という用語は、適応Ｔ細胞免疫応答等の、重度のまたは重大な免疫応答を指す。
故に、多くの実施形態において、本発明による発明的方法は、並行の免疫抑制剤療法（すなわち、前治療／プレコンディショニングとして、または方法と並行して使用される、任意の免疫抑制剤療法）を伴わない。幾つかの実施形態において、本発明による発明的方法は、治療されている対象における免疫寛容誘導を伴わない。幾つかの実施形態において、本発明による発明的方法は、Ｔ細胞免疫抑制剤を使用する、対象の前治療またはプレコンディショニングを伴わない。
しかしながら、幾つかの実施形態において、対象は、本発明のｒｈＮａＧｌｕを投与された後に免疫応答を始める。故に、幾つかの実施形態において、本発明のｒｈＮａＧｌｕを受ける対象を、酵素補充療法に対して認容性があるようにすることが有用であり得る。免疫寛容は、当該技術分野で既知の種々の方法を使用して導入されてもよい。例えば、低用量の所望の補充酵素の毎週の髄腔内注入と組み合わせて、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）等のＴ細胞免疫抑制剤およびアザチオプリン（Ａｚａ）等の抗増殖剤の最初の３０〜６０日間のレジメンが使用されてもよい。
当業者に既知の任意の免疫抑制剤が、本発明の併用療法と一緒に利用されてもよい。かかる免疫抑制剤には、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、およびエタネルセプト等の抗ＴＮＦ薬剤が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｍｏｄｅｒ， ２０００， Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８４，２８０−２８４、Ｎｅｖｉｎｓ， ２０００， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｅｄｉａｔｒ． １２， １４６−１５０、Ｋｕｒｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５１， ２２４−２３０、Ｉｄｅｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ９５， ２１７−２２６、Ｐｏｔｔｅｒｅｔ ａｌ．， １９９９， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７５， １５９−１７４、Ｓｌａｖｉｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． １９， １−２４、Ｇａｚｉｅｖ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２５， ６８９−６９６、Ｈｅｎｒｙ， １９９９， Ｃｌｉｎ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． １３， ２０９−２２０、Ｇｕｍｍｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １０， １３６６−１３８０、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９， １２７５−１２８３を参照されたい）。移植患者において有効であることが実証されている、抗ＩＬ２受容体（α−サブユニット）抗体ダクリズマブ（例えば、Ｚｅｎａｐａｘ（商標））もまた、免疫抑制剤として使用することができる（例えば、Ｗｉｓｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｄｒｕｇｓ ５８， １０２９−１０４２、Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎ． Ｅｎｇｌ Ｊ． Ｍｅｄ． ３４２， ６１３−６１９、Ｐｏｎｔｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｄｒｕｇｓ Ｒ． Ｄ． １， ５５−６０、Ｂｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ １９， １ １２７−１ １３７、Ｅｃｋｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９， １８６７−１８７２、Ｅｋｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒａｎｓｐｌ． Ｉｎｔ． １３， １５１−１５９を参照されたい）。追加の免疫抑制剤には、抗ＣＤ２（Ｂｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６８， １５８８−１５９６、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｂｌｏｏｄ ９２， ４０６６−４０７１）、抗ＣＤ４（Ｍａｒｉｎｏｖａ−Ｍｕｔａｆｃｈｉｅｖａ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４３， ６３８−６４４、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９２， １３８−１５２）、および抗ＣＤ４０リガンド（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｓｅｍｉｎ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． ２０， １０８− １２５、Ｃｈｉｒｍｕｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４， ３３４５−３３５２、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４， １２３０−１２３５）が含まれるが、これらに限定されない。
他の実施形態において、本発明は、本発明のＮａＧｌｕタンパク質と、ＮａＧｌｕタンパク質に対する免疫応答を減少または抑制する薬剤、例えば、免疫抑制剤との共投与を含む方法を含む。例えば、アナフィラキシー反応または有害な免疫応答が、患者によって予想されるかまたは経験される場合、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイド、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、メトトレキサート、ＩＬ−２受容体指向性抗体、Ｔ細胞受容体指向性抗体、ＴＮＦ−アルファ指向性抗体または融合タンパク質（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、またはアダリムマブ）、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（例えば、アバタセプト）、抗ＯＸ−４０抗体等であるが、これらに限定されない、免疫抑制剤もまた、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質等の組換えヒトタンパク質の投与の前、その最中、またはその後に投与することができる。
一実施形態において、本発明は、本発明による組換えタンパク質の投与によって招かれる場合がある、任意の潜在的なアナフィラキシー反応を最小化または予防するための前治療処置を提供する。一実施形態において、潜在的なアナフィラキシー反応を予防するために、抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン）としても知られるＨ−１受容体アンタゴニストが、患者に投与される。一実施形態において、Ｈ−１受容体アンタゴニストは、体重１キログラム当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量で投与される。例えば、抗ヒスタミン剤は、１キログラム当たり約５ｍｇの用量で投与することができる。一実施形態において、抗ヒスタミン剤は、体重１キログラム当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量で投与される。一実施形態において、抗ヒスタミン剤は、体重１キログラム当たり約１ｍｇ〜約５ｍｇの用量で投与される。例えば、用量は、体重１キログラム当たり１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、または５ｍｇであり得る。抗ヒスタミン剤は、任意の有用な方法によって投与することができる。一実施形態において、抗ヒスタミン剤は、静脈内投与される。別の実施形態において、抗ヒスタミン剤は、薬学的に許容されるカプセル中で投与される。
抗ヒスタミン剤の投与は、本発明による組換えＮａＧｌｕの投与前であり得る。一実施形態において、Ｈ−１受容体アンタゴニストは、組換えＮａＧｌｕの投与の約１０〜約９０分、例えば、約３０〜約６０分前に投与される。Ｈ−１受容体アンタゴニストは、血管アクセスポートに接続された携行式システムを使用して投与することができる。一実施形態において、抗ヒスタミン剤は、組換えＮａＧｌｕの投与の約９０分前に投与される。一実施形態において、抗ヒスタミン剤は、組換えＮａＧｌｕの投与の約１０〜約６０分前に投与される。別の実施形態において、抗ヒスタミン剤は、組換えＮａＧｌｕを投与する約２０〜約４０分前に投与される。例えば、抗ヒスタミン剤は、組換えＮａＧｌｕの投与の２０、２５、３０、３５、または４０分前に投与することができる。
一実施形態において、投与される抗ヒスタミン剤は、ジフェンヒドラミンである。任意の有用な抗ヒスタミン剤を使用することができる。かかる抗ヒスタミン剤には、限定なしに、クレマスチン、ドキシラミン、ロラチジン、デスロラチジン、フェキソフェナジン、フェニラミン、セチリジン、エバスチン、プロメタジン、クロルフェニラミン、レボセチリジン、オロパタジン、クエチアピン、メクリジン、ジメンヒドリナート、エンブラミン、ジメチンデン（ｄｉｍｅｔｈｉｄｅｎｅ）、およびデキスクロルフェニラミン（ｄｅｘｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｉｒａｍｉｎｅ）が含まれる。
別の実施形態において、静脈内注入を参照して、アナフィラキシー反応に対する可能性は、ランプアッププロトコル使用して注入を投与することによって、低減することができる。この関連において、ランプアッププロトコルは、患者を薬の注入に対して脱感作するために、注入速度を、注入経過にわたって緩徐に増加させることを指す。
Ｋ．投与
本発明の方法は、治療上有効量の、本明細書に記載される本発明のｒｈＮａＧｌｕの単回ならびに複数回投与を企図する。本発明のｒｈＮａＧｌｕは、対象の病態の性質、重症度、および範囲に応じて、定期間隔で投与することができる。幾つかの実施形態において、治療上有効量の本発明のｒｈＮａＧｌｕタンパク質は、定期間隔で（例えば、年に１回、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、３ヶ月に１回、隔月（２ヶ月に１回）、毎月（１ヶ月に１回）、隔週（２週間に１回）、または毎週）、周期的に静脈内または髄腔内投与されてもよい。
幾つかの実施形態において、髄腔内投与は、他の投与経路（例えば、静脈内、皮下に、筋肉内に、非経口で、経皮的に、または経粘膜的に（例えば、経口でまたは経鼻的に））と併用されてもよい。幾つかの実施形態において、それらの他の投与経路（例えば、静脈内投与）は、隔週、毎月、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、毎年の投与にすぎない頻度で行われてもよい。
本明細書で使用されるとき、「治療上有効量」という用語は、概して、本発明の薬学的組成物中に含有される治療剤の総量に基づいて決定される。一般に、治療上有効量は、対象にとって意義のある便益（例えば、根底にある疾患または病態を治療すること、調節すること、治癒させること、予防すること、および／または寛解させること）を達成するのに十分である。例えば、治療上有効量は、リソソーム酵素受容体またはそれらの活性を調節して、それによってかかるリソソーム蓄積疾患またはその症状を治療する（例えば、対象への本発明の組成物の投与後の「ゼブラ小体」または細胞空胞形成の存在または発生率における低減またはその排除）のに十分な量等の、所望の治療的および／または予防的効果を達成するのに十分な量であってもよい。一般に、必要性のある対象に投与される治療剤（例えば、本発明のｒｈＮａＧｌｕ）の量は、対象の特性に依存するであろう。かかる特性には、対象の病態、疾患重症度、全般的な健康、年齢、性別、および体重が含まれる。当業者であれば、これらのおよび他の関連する要因に応じて、適切な投薬量を容易に決定可能であろう。加えて、客観的アッセイおよび主観的アッセイの両方を任意に利用して、最適な投薬範囲を特定してもよい。
治療上有効量は、一般的に、複数回単位用量を含み得る投薬レジメンにおいて投与される。任意の特定の治療用タンパク質について、治療上有効量（および／または有効な投薬レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の薬学的薬剤との組み合わせに応じて、変動し得る。また、任意の特定の患者のための特定の治療上有効量（および／または単位用量）は、治療されている障害および障害の重症度；利用される特定の薬学的薬剤の活性；利用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食生活；利用される特定の融合タンパク質の投与時間、投与経路、および／または***もしくは代謝速度；治療の持続期間；ならびに医療技術分野で周知である同様の要因を含む、様々な要因に依存してもよい。
幾つかの実施形態において、治療上有効用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜４００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜３００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜９０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜８０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜７０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇブラ（ｂｒａ）身体の重量の範囲である。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値（例えば、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、２〜８ｍｇ／ｋｇ、５〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．３〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．３〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜３０ｍｇ／ｋｇ、または６〜２７ｍｇ／ｋｇ）もまた、本発明の一部であるように企図される。
幾つかの実施形態において、治療上有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重以上、約０．２ｍｇ／ｋｇ体重以上、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重以上、約０．４ｍｇ／ｋｇ体重以上、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重以上、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重以上、約３ｍｇ／ｋｇ体重以上、約５ｍｇ／ｋｇ体重以上、約６ｍｇ／ｋｇ体重以上、約７ｍｇ／ｋｇ体重以上、約１０ｍｇ／ｋｇ体重以上、約１５ｍｇ／ｋｇ体重以上、約２０ｍｇ／ｋｇ体重以上、約３０ｍｇ／ｋｇ体重以上、約４０ｍｇ／ｋｇ体重以上、約５０ｍｇ／ｋｇ体重以上、約６０ｍｇ／ｋｇ体重以上、約７０ｍｇ／ｋｇ体重以上、約８０ｍｇ／ｋｇ体重以上、約９０ｍｇ／ｋｇ体重以上、約１００ｍｇ／ｋｇ体重以上である。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
幾つかの実施形態において、治療上有効用量はまた、ｍｇ／ｋｇ脳重量によって定義されてもよい。当業者であれば、脳重量および体重が相関し得ることを理解するであろう（例えば、ＤｅｋａｂａｎＡＳ．”Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐａｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｆｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔｓ ｔｏ ｂｏｄｙ ｈｅｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔｓ，” Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ １９７８； ４：３４５−５６を参照されたい）。
幾つかの実施形態において、治療上有効用量はまた、ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃによって定義されてもよい。当業者であれば、脳重量および体重に基づく治療上有効用量がｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃに変換され得ることを理解するであろう。例えば、成人のヒトにおけるＣＳＦの体積は、およそ１５０ｍＬである（ＪｏｈａｎｓｏｎＣＥ，ｅｔ ａｌ．”Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：Ｎｅｗ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，” Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｒｅｓ．２００８ Ｍａｙ １４；５：１０）。したがって、成人への０．１ｍｇ〜５０ｍｇタンパク質の単回用量注射は、成人においておよそ０．０１ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃ（０．１ｍｇ）〜５．０ｍｇ／ＣＳＦ １５ｃｃ（５０ｍｇ）用量であろう。
任意の特定の対象に対して、特定の投薬レジメンは、個体の必要性、および酵素補充療法の施与を管理または監督している者の専門家としての判断に従って、経時的に調整されるべきであること、ならびに本明細書に記載される投薬範囲は、例となるものにすぎず、特許請求される本発明の範囲または実施を限定するようには意図されないことを更に理解されたい。
ＶＩＩＩ．キット
本発明は更に、本発明の組換えヒトＮａＧｌｕを含有し、その再構築（凍結乾燥の場合）および／または使用のための指示書を提供する、キットまたは他の製品を提供する。キットまたは他の製品は、容器、カテーテル、ならびに髄腔内投与および関連する外科手術において有用な任意の他の物品、デバイス、または機器を含んでもよい。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ（例えば、プレフィルドシリンジ）、アンプル、カートリッジ、リザーバ、またはリオジェクトを含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。幾つかの実施形態において、容器は、プレフィルドシリンジである。好適なプレフィルドシリンジには、焼成シリコーンコーティングを含むホウケイ酸ガラスシリンジ、散布シリコーンを含むホウケイ酸ガラスシリンジ、またはシリコーンを含まないプラスチック樹脂シリンジが含まれるが、これらに限定されない。
典型的に、容器上の、または容器に関連付けられたラベルは、使用および／または再構築のための指図を指定し得る。例えば、ラベルは、製剤が上述のタンパク質濃度に再構築されることを指定し得る。ラベルは、製剤が、例えば、静脈内または髄腔内投与に有用であるか、またはそのために意図されることを更に指定し得る。幾つかの実施形態において、容器は、補充酵素（例えば、組換えＮａＧｌｕタンパク質）を含有する、安定な製剤の単回用量を含有してもよい。種々の実施形態において、安定な製剤の単回用量は、約１５ｍＬ、１０ｍＬ、５．０ｍＬ、４．０ｍＬ、３．５ｍＬ、３．０ｍＬ、２．５ｍＬ、２．０ｍＬ、１．５ｍＬ、１．０ｍＬ、または０．５ｍＬ未満の体積で存在する。代替的に、製剤を保有する容器は、製剤の反復投与（例えば、２〜６回の投与）を可能にする、複数回使用バイアルであってもよい。キットまたは他の製品は、好適な希釈剤（例えば、ＢＷＦＩ、食塩水、緩衝食塩水）を含む、第２の容器を更に含んでもよい。希釈剤および製剤を混合すると、再構築された製剤中の最終タンパク質濃度は、一般に、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ）となろう。
キットまたは他の製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、カテーテル、シリンジ、および使用のための指示書を有するパッケージ挿入物を含む、商業的およびユーザの立場から望ましい他の材料を更に含んでもよい。上に列挙される範囲および値に対して中間の範囲および値もまた、本発明の一部であるように企図される。
以下の特定の実施例は、本発明を例示することを意図し、特許請求の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。本出願を通じて引用される全ての図、ならびに全ての参考文献、特許、および公開特許出願、ならびに図は、参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる。
実施例１
ｒｈＮａＧｌｕの精製
ｒｈＮａＧｌｕタンパク質を、当該技術分野で既知の方法を使用して精製した。ｒｈＮａＧｌｕを含有する卵白（ＥＷ）を、ｐＨ６で一晩可溶化し、遠心分離および／または深層濾過によって浄化した。ＥＷを、１Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）で、ｐＨ６に調整した。深層濾過プロセスについては、Ｔ２６００フィルター（Ｐａｌｌ（商標）、４０ｕｍ）を、第１の濾過として使用し、次いで、ＰＤＦ１（Ｐａｌｌ（商標）、Ｋ２００Ｐ、１５ｕｍ＋ＥＫＳ、０．２２ｕｍ）を、第２の濾過ステップとして使用した。フィルターは、各々のフィルターが６０Ｌ ＥＷ／ｍ２の最適化容積を有する、単回使用の膜である。膜の保持量は、Ｔ２６００については２Ｌ／ｍ２であり、ＰＤＦ１については４〜５Ｌ／ｍ２である。このプロセスでは、保持量は、濾過したＥＷを収集する前に廃棄した。膜保持量と同量の緩衝液（２０ｍＭ リン酸／１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６）を使用して、フィルター上に残ったＥＷを追跡した。
フェニル−ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）カラムを、捕捉ステップとして適用した。卵白タンパク質のほとんどが親水性であるため、卵白タンパク質の９９％は、ＨＩＣカラムを通過して、フロースルーに流れた。ｒｈＮａＧｌｕは、フェニル−ＨＩＣに対してより高い疎水性結合を有する。
ｒｈＮａＧｌｕを含有する卵白を、３０：１の比率でカラムに充填した。充填が完了した後、カラムを、平衡緩衝液、５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６、および５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２で洗浄した。ｒｈＮａＧｌｕを、３０％プロピレングリコール、ｐＨ７．２で溶出した。充填が完了した後、カラムを、平衡緩衝液および５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で洗浄した。ｒｈＮａＧｌｕを、５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．２）と３０％プロピレングリコールで溶出した。カラム結合容積は、おおよそ４．５ｍｇ／ｍＬである。フェニル−ＨＩＣカラムを通したｒｈＮａＧｌｕの純度は、＞９５％に達し得る（９５０倍の増加）。回収率は、３０％のプロピレングリコール溶出で、おおよそ８０％である。
溶出したｒｈＮａＧｌｕの画分を、１Ｍ酢酸でｐＨ５に調整し、次いでＧｉｇａＣａｐ Ｓカラムに充填した（ＥＷ：カラム寸法＝１０：１）。カラムを、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５）で平衡化した。充填が完了した後、カラムを、平衡緩衝液で洗浄した。ｒｈＮａＧｌｕを、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ／６０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５）で溶出した。
タンパク質の特徴付けを、精製したｒｈＮａＧｌｕを使用して行った。卵白から精製されたｒｈＮａＧｌｕの分子量（約９０ｋＤａ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析した（図６）。卵白中のｒｈＮａＧｌｕの平均発現レベルを、図７に示す。遺伝子導入鳥類から産生されるｒｈＮａＧｌｕの特徴を、表２に要約する。

Figure 2014534962
実施例２
卵白中のｒｈＮａＧｌｕの安定性
産卵７日後に、１つの卵を割り、活性について分析した。内容物を半分に分割し、各々半分を、標準的な卵白浄化に供した。無処置および浄化の両方の卵白を、アリコートに分け、酵素活性安定性のために、４℃および−２０℃で保管した。卵白中のｒｈＮａＧｌｕは、少なくとも５０日まで、安定な酵素活性を示した。
凍結／解凍サイクルの安定性を評価した。精製したｒｈＮａＧｌｕを、１０秒間液体窒素中で凍結させ、３７℃で２分間解凍した。酵素活性は、１０回のサイクルの間、変化を示さなかった。
精製したｒｈＮａＧｌｕを、異なるｐＨ緩衝液中に透析し、純粋な酵素の安定性を測定した。結果は、純粋なｒｈＮａＧｌｕが、ｐＨ５〜８で１２日間安定であったことを示した。
実施例３
オリゴ糖のプロフィール分析
マンノース−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）は、糖タンパク質の三次構造の重要な部分であるＮ結合型オリゴ糖の末端の単糖であり、糖タンパク質の最終的なオリゴ糖に組み込まれると、細胞表面上に存在するＭ６Ｐ受容体およびそれへの結合によって認識され、その後でリソソーム中の内部移行を可能にする。故に、Ｍ６Ｐは、糖タンパク質のリソソームへの標的化に有効なエピトープである。
タンパク質グリコシル化の分析は、糖タンパク質の特徴付けの重要な部分である。オリゴ糖は、Ｏ結合型グリカンとしてセリンもしくはスレオニンを通じて、またはＮ結合型グリカンとしてアスパラギンを通じて、タンパク質に結合し得る。
オリゴ糖の構造を分析するために、種々のクロマトグラフィーおよび分光技法を行った。パルスアンペロメトリック検出を有する高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いた。この技法を使用して、オリゴ糖を、急速に、電荷（すなわち、中性、一価、または多価）に基づいて一般的な群に分け、それらの構造を、純粋な標準物との比較によって判定した。
全ての方法は、ＨａｒｄｙおよびＴｏｗｎｓｅｎｄによって記載されるプロトコルに基づくものであった（Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｒ．Ｒ．，「
Ｈｉｇｈ−ｐＨ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ」，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３０：２０８−２２５）。遺伝子導入鳥類由来のｒｈＮａＧｌｕの精製された試料を、Ｔｕｂｅ−Ｏ−Ｄｉａｌｙｚｅｒを使用して、４℃で約２４時間、ナノ純水（ｎａｎｏｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）に対して透析して、塩および他の混入物質を除去した。ナノ純水を、全透析期間中に４回置き換えた。透析後、試料の各々を、３つのアリコートに分割した。中性糖およびアミノ糖の分析を目的とするアリコートを、１００℃で４時間、２Ｎトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で加水分解し、マンノース−６−リン酸塩分析のためのアリコートを、１００℃で１．５時間、６．７５Ｎ ＴＦＡで加水分解した。加水分解物を、次いで、Ｎ２下で乾燥させ、５０μＬ Ｈ２Ｏで再溶解し、氷中で７分間超音波分解し、注射バイアルに移した。
中性糖およびアミノ糖のための標準物、ならびにマンノース−６−リン酸塩のための標準物の既知のモル数での混合物を、試料と同じ方式で、同じ時間、加水分解した。４つの異なる濃度の中性糖およびアミノ糖の標準混合物、ならびにマンノース−６−リン酸塩を調製して、キャリブレーション方程式を確立させた。試料中の各々の糖のモル数を、キャリブレーション方程式からの線形補間によって定量化した。
オリゴ糖プロフィールおよびマンノース−６−リン酸塩プロフィールを、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって別個に分析した。機器の制御およびデータの取得は、Ｄｉｏｎｅｘ ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを使用して達成した。加水分解したｒｈＮａＧｌｕのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によりＭ６Ｐを検出した。Ｍ６Ｐの平均測定量は、加水分解したタンパク質２１０μｇ当たり３．８μｇ（ＣＶ３．７％）であった。モルに変換した結果、タンパク質２．８ｎｍｏｌ当たりＭ６Ｐ１３．４ｎｍｏｌとなり、これは、タンパク質１モル当たりＭ６Ｐ３．２モルの比率に相当した。
ｒｈＮａＧｌｕ（野鶏属）のオリゴ糖プロフィールもまた、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを使用して取得した（図８を参照されたい）。プロフィールは、単一の試料におけるＰＮＧａｓｅ Ｆ反応の良好な再現性を示した。ピーク束は、中性オリゴ糖に対応する領域において観察された（約１０分〜約２０分）。約２５〜約３５分の間に溶出した、非常に小さなピークの群もまた観察され、これは、一価の種に起因する可能性があった。
遺伝子導入鳥類（野鶏属）から産生されるｒｈＮａＧｌｕの試料から得られた単糖組成物分析の結果を、表３に要約し、これは、ｒｈＮａＧｌｕについて分析された各々の単糖の平均モル比を表にしたものである。

Figure 2014534962
実施例４
線維芽細胞への細胞取り込み
野生型ヒト線維芽細胞およびムコ多糖症ＩＩＩ Ｂ（ＮａＧｌｕ欠乏）ヒト線維芽細胞を、２４ウェルプレートに蒔き（１ウェル当たり２．５×１０４細胞）、５％ＣＯ２下において３７℃で一晩インキュベートした。線維芽細胞基礎培地を含有する条件培地および低血清の線維芽細胞成長キットを使用した。種々の量のｒｈＮａＧｌｕ（３０、１０、３．０、１．０、０．３、および０μｇ／ｍＬ）を、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間、共インキュベートして、ヒト線維芽細胞による細胞取り込みのレベルを判定した（図９を参照されたい）。ウェルを、ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬの溶解緩衝液を、ウェル毎に添加し、プレートを、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞溶解物を、１．５ｍＬの遠心管に移した。凍結および解凍サイクルを１回行った。細胞溶解物を、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。２５μＬの上清を、アッセイに使用した。アッセイ時間は２時間であった。酵素活性を、当該技術分野で既知の方法を使用して、Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８５）２７：２５８−２６２、Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９６：８７−９３、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（２００１）２１：２５１−２５９）に記載の方法に従って、測定した。
図９に示されるように、陰性対照（すなわち、ＭＰＳ ＩＩＩＢ）は、いずれのＮａＧｌｕ活性も示さなかったが、陽性対照（すなわち、野生型ヒト線維芽細胞）は、ＮａＧｌｕ活性を示した。０．３μｇ／ｍＬのｒｈＮａＧｌｕで処置したＭＰＳ ＩＩＩＢ細胞は、野生型線維芽細胞中で観察される正常な活性レベルのおおよそ５０％を示した。１μｇ／ｍＬのｒｈＮａＧｌｕで処置したＭＰＳ ＩＩＩＢ細胞は、野生型細胞中で観察されるものよりもおおよそ４倍高いＮａＧｌｕ活性を示した。驚くべきことに、３０μｇ／ｍＬのｒｈＮａＧｌｕで処置したＭＰＳ ＩＩＩＢ細胞は、野生型細胞中で観察されるものよりも少なくとも４０倍高いＮａＧｌｕ活性を示した。この結果は、遺伝子導入鳥類（野鶏属）から産生されるｒｈＮａＧｌｕが、高いレベルで効率的にヒト線維芽細胞中に内部移行されたことを示した。
ｒｈＮａＧｌｕの内部移行が、Ｍ６Ｐ受容体介在エンドサイトーシスを介するかどうかを判定するために、Ｍ６Ｐ阻害アッセイを行った。Ｍ６Ｐ阻害アッセイのために、種々の濃度の遊離Ｍ６Ｐを、３０μｇ／ｍＬのｒｈＮａＧｌｕで処置したヒトＭＰＳ ＩＩＩＢ線維芽細胞に添加し、酵素活性を、上述のように測定した。図１０に示されるように、ヒトＭＰＳ ＩＩＩＢ線維芽細胞は、ＮａＧｌｕ活性を全く示さず、遊離Ｍ６ＰによるＮａＧｌｕ取り込みの有効な阻害を示唆した。対照的に、３０μｇ／ｍＬのｒｈＮａＧｌｕで処置したＭＰＳＩＩＩ線維芽細胞は、遊離Ｍ６Ｐの不在下で、高レベルの酵素活性を示し、タンパク質が効率的にＮａＧｌｕ欠乏線維芽細胞中に内部移行され、活性を保持したことを示唆した。この酵素活性は、培地中の０．０３ｍＭ以上の濃度のＭ６Ｐ単糖の存在によって阻害される。条件培地中の１ｍＭのＭ６Ｐ単糖の存在は、タンパク質の細胞取り込みを９０％を上回って阻害した。
これらの結果は、遺伝子導入鳥類から産生されるｒｈＮａＧｌｕが、Ｍ６Ｐ受容体介在性エンドサイトーシスを介して効率的にＭＰＳ ＩＩＩＢ線維芽細胞中に内部移行され、ｒｈＮａＧｌｕが、受容体の認識について、Ｍ６Ｐ単糖と競合したことを示した。結果は、遺伝子導入鳥類から産生されるｒｈＮａＧｌｕ上のＭ６Ｐ構造の存在を明らかにしたグリカン分析と一致した。
実施例５
活性なＮａＧｌｕ融合タンパク質の生成
２つの異なるｒｈＮａＧｌｕ融合構築物を設計し、鳥類発現系においてｒｈＮａＧｌｕ融合タンパク質を発現する可能性を検証した。
一方の構築物において、８つの連続するアスパラギン酸残基（ＤＤＤＤＤＤＤＤ）をコードする核酸配列を、従来的なＰＣＲおよびＤＮＡ組換え技術を使用して、全長ＮａＧｌｕ ｃＤＮＡ配列（配列番号２）の５’末端で、ＮａＧｌｕタンパク質をコードする核配列に融合した。もう一方の構築物において、ＴｆＲＬをコードする核酸配列（すなわち、ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ、配列番号５）を、全長ＮａＧｌｕ ｃＤＮＡ配列の３’末端で、ＮａＧｌｕをコードする核配列に融合した。各々の構築物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用して、ｐＴＴ２２発現ベクターに挿入した。結果として得られたベクターを、各々、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞に形質移入し、高レベルの融合ＮａＧｌｕタンパク質を発現する安定なクローンを得た。Ｎ末端で一続きの８つの連続するアスパラギン酸残基に融合されたｒｈＮａＧｌｕタンパク質（ＡＡＡ−ＮａＧｌｕ）と、Ｃ末端でトランスフェリン受容体リガンド（ＴｆＲＬ）に融合されたｒｈＮａＧｌｕタンパク質（ＮａＧｌｕ−ＴｆＲＬ）とを、条件培地から単離した。
ＡＡＡ−ＮａＧｌｕおよびＮａＧｌｕ−ＴｆＲＬの酵素活性を、当該技術分野で既知の方法を使用して測定した（例えば、Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８５）２７：２５８−２６２、Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９８１）９６：８７−９３、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２００１）２１：２５１−２５９、Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（２０００）１９：２０２−２１１、およびＷｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９６）５：７７１−７７７を参照されたい。
図１３および１４に示されるように、ＨＥＫ２９３細胞から産生されるＡＡＡ−ＮａＧｌｕおよびＮａＧｌｕ−ＴｆＲＬ融合タンパク質は、高レベルの酵素活性を示した。これらの結果は、これらの構築物を使用して、増加したレベルのリン酸化マンノースを有し、同時に遺伝子導入鳥類発現系に由来する酵素活性を保持する、ＮａＧｌｕ融合タンパク質を産生することができる可能性を確認した。
実施例６
マクロファージへの細胞取り込み
野鶏属から産生されるｒｈＮａＧｌｕのヒトマクロファージ細胞中への内部移行もまた、測定した。ＮＲ８３８３マクロファージ細胞を、Ｆ１２成長培地中、５％ＣＯ２、３７℃で０、４、８、２４、３２、および４８時間、１０μｇ／ｍＬのｒｈＮａＧｌｕとともにインキュベートした。試料を回収し、溶解の前にＰＢＳで洗浄した。２．５×１０５細胞を、１ｍＬの溶解緩衝液（１０ｍＭのＮａリン酸、ｐＨ６．０、０．０５％ＮＰ４０）中に溶解し、溶解物を、１．５ｍＬの遠心管に移し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって判定し、アリコートを、ＮａＧｌｕ酵素アッセイのために凍結させた。
酵素活性を、標準的な方法を使用して測定した。２５ｍＭの基質（４−メチルウンベリフェリル２−アセトアミド−２−デオキシ−ａ−Ｄ−グルコピラノシド）を、２ｍＭのナノ純水中に希釈して、作業用基質ストックを形成した。試料の希釈物を、アッセイ緩衝液（１％ウシ血清アルブミン）中に調製した。２５μＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウムを、マルチウェルプレートのウェルに分配した。２５μＬの標準物および２５μＬの試料を、指定のウェルに添加した。５０μＬの作業用基質ストックを各々のウェルに添加し、プレートを優しく叩いて混合させた。プレートを接着フィルムで密封し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応を、次いで、５０μＬの停止溶液（１Ｍグリシン、ｐＨ１２．５）の添加によって終了させた。プレートを、蛍光底部を使用してマイクロプレートリーダーに載置し、強度を、励起３６０ｎｍおよび放出４６０ｎｍで測定した。放出された４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）のレベルを、０．２５ｍＭ、０．１２５ｍＭ、０．０６２５ｍＭ、０．０３１２ｍＭ、０．０１５６ｍＭ、および０．００７８ｍＭでの４−ＭＵの標準物との比較によって、測定した。
図１５に図示されるように、１０μｇ／ｍＬのｒｈＮａＧｌｕとともにインキュベートしたマクロファージにおけるＮａＧｌｕ活性のレベルは、４８時間の期間にわたり、ほぼ線形で増加した：マクロファージによるｒｈＮａＧｌｕ取り込みは、測定された期間全体を通じて、ゆっくりだが一定していた。比較的ゆっくりとした、長期間のＮａＧｌｕ活性の取り込みは（それらのグリコシル化構造にＭ６Ｐおよび／またはマンノースを含有する他のリソソーム酵素と比較して）、予想外であり、驚くべきことであった。多量のｒｈＮａＧｌｕタンパク質が、長期間にわたってマクロファージ中に取り込まれ、ｒｈＮａＧｌｕに曝露されていない野生型マクロファージにおいて観察される基礎レベルよりも、少なくとも１０、５０、１００、２００、３００、５００、またはさらには１，０００倍高い細胞内酵素活性レベルをもたらしたことは、同様に驚くべきことであり、予想外であった。結果は、ｒｈＮａＧｌｕが、細胞外ならびに細胞内の環境において、極めて安定であることを示す。さらに、これらの結果は、ｒｈＮａＧｌｕが、中枢神経系（ＣＮＳ）への取り込みの強化に理想的な特性である、体内でのより長い血清半減期（例えば、より長い循環）および高い血清濃度を可能にする物理化学的特徴を有し得ることを示唆する。
Figure 2014534962
実施例７
ＮａＧｌｕ欠乏マウスへのｒｈＮａＧｌｕの投与
ホモ接合体ｎｕｌｌマウスを、Ｂ６．１２９Ｓ６−ＮａＧｌｕｔｍｌＥｆｎ／Ｊ株の交配対から生成した。対照野生型マウスを、同じ方式で生成した。遺伝子型決定を、標準的なＰＣＲプロトコルに従って行った。当該技術分野では、出生時、ホモ接合体ｎａｇｌｕ（−／−）ｎｕｌｌマウスは、生存能力があり、寸法が正常であり、いずれの全体的な身体的または行動的異常も示さないと言われるが、それらは、全ての組織においてＮａＧｌｕを全く呈さない（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１４５０５−１４５１０を参照されたい）。１か月齢で、空胞化したマクロファージが、ほとんどの組織に見出される。腎臓および脳のいくつかの部分のニューロン内の上皮細胞もまた、影響されている。空胞化は、年齢とともにより顕著となる。４〜５か月で、マウスは、オープンフィールド試験で、異常行動を示す。より高齢の動物は、尿閉および歩行困難を有し得る。ホモ接合体ｎａｇｌｕ−／−マウスの典型的な寿命は、８〜１２か月である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１４５０５−１４５１０を参照されたい）。
静脈内（ＩＶ）投与
尾静脈注射による試験品目およびビヒクルの静脈内投与を、次のように達成した。注射の前に、動物を白熱灯によって徐々に温めるか、または尾をおおよそ４３℃の温水に浸漬することによって、血管拡張を達成した。動物を、次いで、拘束装置に載置した。尾の表面を、注射の前に、７０％イソプロパノールで消毒した。尾の側脈は、皮膚のすぐ下にあり、尾の遠位部において、張力の適用によって特定される。２７Ｇの注射針を、上向きに傾けて、３〜４分間静脈に挿入した。試験品目またはビヒクルを、次いで、観察された静脈からの除去によって明らかなように、投与した液体が瞬間的に血管腔を満たすように、１０秒間にわたってゆっくりとしたボーラス注射として投与した。注射針の除去後、軽い圧力を穿刺部位に印加して、止血を行った。動物を、処置後すぐに監視して、正常な活動を確認した。
髄腔内（ＩＴ）投与
腰椎穿刺注射による試験品目およびビヒクルの髄腔内投与を、次のように達成した。注射の前に、動物にイソフルランを使用して麻酔を行い、それを処置の間、ノーズコーンを介して維持した。各々の注射前に、必要に応じて剃毛することによって注射部位の準備を行った。動物を、腹臥位で台に載置し、確実に、後肢が台をまたいで動物の背部が凸曲面を形成するようにした。背部表面に、７０％イソプロパノールを塗布し、注射前に乾燥させた。脊柱および寛骨に触診を行い、Ｌ４−Ｌ５またはＬ５−Ｌ６の臼縁の位置を特定した。３０Ｇの注射針を、頭側に向かって傾けて、椎間腔に挿入した。尾の軽打の観察によって、配置を確認した。試験品目またはビヒクルを、次いで、ボーラス注射として投与した。動物を、麻酔から回復させ、処置後すぐに監視して、正常な活動および四肢の使用を確認した。
結果
１２週齢のｎａｇｌｕ−／−マウス（Ｂ６．１２９Ｓ６−ＮａｇｌｕｔｍｌＥｆｎ／Ｊ）に、尾静脈注射（ＩＶ投与）を介して、６．７５または２７ｍｇ／ｋｇの投薬量レベルで、１日おきに合計５回の投薬量（それぞれ、１．１２５または４．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＮａＧｌｕ濃度）のｒｈＮａＧｌｕ（野鶏属）を投与した。同様に、１２週齢のｎａｇｌｕ−／−マウスに、腰椎穿刺注射（ＩＴ投与）を介して、０．３１ｍｇ／ｋｇの投薬量レベルで、１日おきに１．５４ｍｇ／ｍＬのＮａＧｌｕ濃度で合計５回の投薬量のｒｈＮａＧｌｕ（野鶏属）を投与した。ビヒクル（１０ｍＭのリン酸緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０２％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ５．５〜５．８）は、同じ投薬濃度で、１日おきに５回の投薬量をｎａｇｌｕ−／−ノックアウトマウスに投与した。無処置の野生型およびｎａｇｌｕ−／−ノックアウトマウスもまた、研究期間中、維持した。
動物を、５回目の最終注射の４時間後に、殺処理した。全ての動物を解剖し、肝臓、脳、脾臓、心臓、肺、および腎臓を摘出した。各々の器官を、矢状に分割し、凍結（−８０℃）およびホルマリン固定保管の両方のために試料を提供した。
組織試料を、（１）ヘパラン硫酸二糖類のＳＡＸ−ＨＰＬＣ分析に基づく分析方法を使用して、ヘパラン硫酸塩濃度について、および（２）細胞に基づく酵素活性アッセイを使用してα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ酵素活性について、分析した。
脳、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、および肺の組織の組織病理学的評価を、パラフィンに埋め込み、４μｍに切断し、ガラス製スライド上に載置し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した、ホルマリン固定組織試料を使用して行った。
ｎａｇｌｕ−／−マウスへのｒｈＮａｇｌｕ（野鶏属）の６．２５および２７ｍｇ／ｋｇ（体重）の投薬量レベルでの反復静脈内投与（１０日間の期間にわたって５回の投薬）の後、ｎａｇｌｕ−／−マウスの脳、肝臓、および腎臓におけるヘパラン硫酸塩の濃度に明らかな用量依存性減少が見られた（表５、図１６〜１８）。相対α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性は、静脈内投与後に、脳および肝臓において増加した（表６）。これらの結果は、ＮａＧｌｕ酵素活性および結果としてもたらされた基質の除去が、ＩＶ投与で処理したｎａｇｌｕ−／−マウスの脳において観察されたため、予想外かつ驚くべきことであり、全身投与されたｒｈＮａＧｌｕ（野鶏属）が、ｎａｇｌｕ−／−マウスの脳に分配され、血液脳関門（ＢＢＢ）の存在下でさえも有効性を誘起するのに効果的であったことを示唆する。
ｎａｇｌｕ−／−マウスへのｒｈＮａＧｌｕ（野鶏属）の０．３１ｍｇ／ｋｇの投薬量レベルでの髄腔内投与（１０日間の期間にわたって５回の投薬）の後、ｎａｇｌｕ−／−マウスの脳内のヘパラン硫酸塩濃度に減少が見られ（表５、図１９）、ｒｈＮａＧｌｕ（野鶏属）が、脳を標的とし、ｎａｇｌｕ−／−マウスの脳内に蓄積された基質を抑制するのに有効であったことを示唆する。
Figure 2014534962
Figure 2014534962
Figure 2014534962
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 ＊ ＊ ＊
上述の明細書内の各々の例は、本発明を制限するものではなく、本発明の説明の目的で提供される。実際に、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明において種々の修正、組み合わせ、追加、削除、および変形が行われ得ることが、当業者には明らかであろう。例えば、１つの実施形態の一部として例示または記載される特徴を、別の実施形態において使用して、なおもさらなる実施形態をもたらすことが可能である。本発明が、かかる修正、組み合わせ、追加、削除、および変形を包含することが意図される。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、および受託番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む）は、各々の個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、または受託番号／データベースの配列が、個別に、参照により組み込まれるのと同程度に、あらゆる目的で、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (88)

  1. 配列番号１のアミノ酸配列２４〜７４３を含む組換えヒトＮ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）の単離された混合物を含む組成物であって、前記混合物中の少なくとも１０％の前記ｒｈＮａＧｌｕが、マンノース−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）を有する少なくとも１つのグリカン構造を含む、組成物。
  2. Ｍ６Ｐを有する前記ｒｈＮａＧｌｕは、ＮａＧｌｕが欠乏した哺乳類細胞中に取り込み可能であり、その結果、内部に取り入れられたｒｈＮａＧｌｕが、同じタイプの野生型哺乳類細胞中で観察される正常なＮａＧｌｕ活性の少なくとも５０％を復元する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記グリカン構造が、Ｎ結合型グリカンである、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、タンパク質１モル当たり少なくとも１モルのＭ６Ｐを含有する、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、タンパク質１モル当たり約１〜約６モルのＭ６Ｐを含有する、請求項３に記載の組成物。
  6. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、タンパク質１モル当たり約２モルのＭ６Ｐを含有する、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、タンパク質１モル当たり約３モルのＭ６Ｐを含有する、請求項５に記載の組成物。
  8. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、タンパク質１モル当たり約４モルのＭ６Ｐを含有する、請求項５に記載の組成物。
  9. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、タンパク質１モル当たり約５モルのＭ６Ｐを含有する、請求項５に記載の組成物。
  10. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、タンパク質１モル当たり約６モルのＭ６Ｐを含有する、請求項５に記載の組成物。
  11. ＮａＧｌｕが欠乏した前記哺乳類細胞が、ヒト細胞である、請求項２に記載の組成物。
  12. ＮａＧｌｕが欠乏した前記ヒト細胞が、皮膚線維芽細胞、肝細胞、またはマクロファージである、請求項１１に記載の組成物。
  13. ＮａＧｌｕが欠乏した前記ヒト細胞が、神経細胞である、請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、全身投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に有効に送達される、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、静脈内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に有効に送達される、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、髄腔内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に有効に送達される、請求項１３に記載の組成物。
  17. Ｍ６Ｐを有する前記ｒｈＮａＧｌｕが、ＮａＧｌｕ欠乏細胞によって内部に取り入れられ、体内で正常なＮａＧｌｕ活性の少なくとも１００％を復元する、請求項２に記載の組成物。
  18. Ｍ６Ｐを有する前記ｒｈＮａＧｌｕが、タンパク質１モル当たり少なくとも２５モルのマンノースを含有する、請求項２に記載の組成物。
  19. 前記混合物中の前記ｒｈＮａＧｌｕの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、Ｍ６Ｐを含有する、請求項１に記載の組成物。
  20. 前記混合物中の前記ｒｈＮａＧｌｕの少なくとも２０％が、少なくとも１つのＭ６Ｐを含有する、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記混合物中の前記ｒｈＮａＧｌｕの少なくとも３０％が、少なくとも１つのＭ６Ｐを含有する、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記混合物中の前記ｒｈＮａＧｌｕの少なくとも４０％が、少なくとも１つのＭ６Ｐを含有する、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記混合物中の前記ｒｈＮａＧｌｕの少なくとも５０％が、少なくとも１つのＭ６Ｐを含有する、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記混合物中の前記ｒｈＮａＧｌｕの少なくとも６０％が、少なくとも１つのＭ６Ｐを含有する、請求項２３に記載の組成物。
  25. 配列番号１のアミノ酸配列２４〜７４３を含む組換えヒトＮ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）の単離された混合物を含む組成物であって、前記混合物が、マンノース−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）を含む１つ以上のグリカン構造を含有する十分な量のｒｈＮａＧｌｕを含み、その結果、Ｍ６Ｐを含有する前記ｒｈＮａＧｌｕが、Ｍ６Ｐ受容体介在性エンドサイトーシスを介して、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳類細胞中に内部移行され、内因性ＮａＧｌｕを発現する同じタイプの野生型細胞中で観察されるＮａＧｌｕ活性の少なくとも５０％を復元する、組成物。
  26. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、Ｎ結合型グリコシル化されている、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、Ｏ結合型グリコシル化されている、請求項２５に記載の組成物。
  28. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり少なくとも１モルのＭ６Ｐを含む、請求項２５に記載の組成物。
  29. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり約１、２、３、４、５、または６モルのＭ６Ｐを含む、請求項２６に記載の組成物。
  30. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり約３モルのＭ６Ｐを含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり約４モルのＭ６Ｐを含む、請求項２９に記載の組成物。
  32. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、マンノースを含む、請求項２５に記載の組成物。
  33. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含む、請求項２５に記載の組成物。
  34. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、ガラクトースを含む、請求項２５に記載の組成物。
  35. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む、請求項２５に記載の組成物。
  36. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、フコースを含有しない、請求項２５に記載の組成物。
  37. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、グルコースを含有しない、請求項２５に記載の組成物。
  38. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、正常なＮａＧｌｕ酵素活性の少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、または１００％を復元する、請求項２５に記載の組成物。
  39. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、全身投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に有効に送達される、請求項２５に記載の組成物。
  40. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、静脈内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に有効に送達される、請求項３９に記載の組成物。
  41. ＮａＧｌｕが欠乏した前記哺乳類細胞が、ヒト細胞である、請求項２５に記載の組成物。
  42. 前記ヒト細胞が、皮膚線維芽細胞、肝細胞、またはマクロファージである、請求項４１に記載の組成物。
  43. ＮａＧｌｕが欠乏した前記ヒト細胞が、神経細胞である、請求項４１に記載の組成物。
  44. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、第２の部分を含む融合タンパク質である、請求項２５に記載の組成物。
  45. 前記第２の部分が、ポリペプチドである、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記ポリペプチドが、トランスフェリン受容体リガンド（ＴｆＲＬ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ２Ｒ）リガンド、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）受容体リガンド、および酸性アミノ酸（ＡＡＡ）残基からなる群から選択される、請求項４５に記載の組成物。
  47. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、遺伝子導入鳥類から産生される、請求項２５に記載の組成物。
  48. 前記遺伝子導入鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、またはウズラである、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記遺伝子導入鳥類が、ニワトリである、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、卵管細胞から産生される、請求項４９に記載の組成物。
  51. 単離された組換えヒトＮ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ｒｈＮａＧｌｕ）を含む組成物であって、前記ｒｈＮａＧｌｕの、Ｍ６Ｐ受容体介在性エンドサイトーシスを介するＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳類細胞中への内部取り込みを可能にする十分な量のマンノース−６−リン酸塩（Ｍ６Ｐ）を有する１つ以上のグリカン構造を含み、その結果、体内に取り込まれるとき、前記ｒｈＮａＧｌｕが、正常な対象における同じタイプの細胞中で観察されるＮａＧｌｕ活性の少なくとも５０％を復元する、組成物。
  52. 前記ｒｈＮａＧｌｕタンパク質が、Ｎ結合型グリコシル化されている、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記ｒｈＮａＧｌｕタンパク質が、Ｏ結合型グリコシル化されている、請求項５１に記載の組成物。
  54. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり約２、３、４、５、または６モルのＭ６Ｐを含む、請求項５１に記載の組成物。
  55. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、全身投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に有効に送達される、請求項５１に記載の組成物。
  56. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、静脈内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に有効に送達される、請求項５５に記載の組成物。
  57. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、髄腔内投与されるとき、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の脳に有効に送達される、請求項５１に記載の組成物。
  58. 組換えヒトＮａＧｌｕ（ｒｈＮａＧｌｕ）をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する導入遺伝子を含む、遺伝子導入鳥類であって、前記導入遺伝子が、前記遺伝子導入鳥類のゲノム中に含まれ、卵管細胞中で発現され、その結果、前記ｒｈＮａＧｌｕが、前記遺伝子導入鳥類の前記卵管細胞中でグリコシル化され、前記遺伝子導入鳥類の卵管の内腔中に分泌され、卵の卵白中に沈着される、遺伝子導入鳥類。
  59. 前記ｒｈＮａＧｌｕが、ｒｈＮａＧｌｕ１モル当たり約２、３、４、または６モルのＭ６Ｐを含む、請求項５８に記載の遺伝子導入鳥類。
  60. 前記プロモーター構成要素が、卵管特異的プロモーターである、請求項５８に記載の遺伝子導入鳥類。
  61. 前記卵管特異的プロモーターが、卵白アルブミンプロモーターである、請求項６０に記載の遺伝子導入鳥類。
  62. 前記遺伝子導入鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびウズラからなる群から選択される、請求項５８に記載の遺伝子導入鳥類。
  63. 請求項５８に記載の遺伝子導入鳥類によって生み出される、卵。
  64. 組換えヒトＮａＧｌｕ（ｒｈＮａＧｌｕ）を産生する方法であって、
    ａ）配列番号１の２４〜７４３に記載される前記ｒｈＮａＧｌｕをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター構成要素を有する導入遺伝子を含む、遺伝子導入鳥類を産生することであって、前記導入遺伝子が、前記遺伝子導入鳥類のゲノム中に含有され、卵管細胞中で発現され、その結果、前記ｒｈＮａＧｌｕが、前記遺伝子導入鳥類の前記卵管細胞中でグリコシル化され、卵管の内腔中に分泌され、前記遺伝子導入鳥類によって産卵された卵の卵白中に沈着される、遺伝子導入鳥類を産生することと、
    ｂ）前記ｒｈＮａＧｌｕを前記卵白から単離することと、を含む、方法。
  65. 前記プロモーター構成要素が、卵管特異的プロモーターである、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記卵管特異的プロモーターが、卵白アルブミンプロモーターである、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記鳥類が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびウズラからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
  68. 前記鳥類が、ニワトリである、請求項６７に記載の方法。
  69. 卵白アルブミンプロモーターに作動可能に連結されたヒトＮａＧｌｕをコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
  70. 請求項６９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  71. 配列番号４の５２３２〜１０２４８の核酸配列を含む、単離された核酸。
  72. 請求項１に記載の組成物を、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む、薬学的製剤。
  73. 静脈内投与されるときにＮａＧｌｕ欠乏症を有する哺乳動物の血液脳関門を越える組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を含む、組成物。
  74. ＮａＧｌｕ欠乏を患う対象を処置する方法であって、前記対象に、治療上有効量の、請求項１、２５、または５１のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  75. 組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を、ＮａＧｌｕ欠乏を患う対象の脳に送達する方法であって、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を、前記対象に静脈内投与することを含む、方法。
  76. 組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を、治療上有効量で、循環から血液脳関門を渡って輸送する方法であって、組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質を、ＮａＧｌｕ欠乏症を有する対象に静脈内投与することを含む、方法。
  77. 前記ＮａＧｌｕ欠乏症が、サンフィリポ症候群Ｂである、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記対象がヒトである、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質が、前記対象に、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で静脈内投与される、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質が、前記対象に、約６〜約２７ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で静脈内投与される、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質が、前記対象に髄腔内投与される、請求項７４に記載の方法。
  82. 前記組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質が、少なくとも約０．３ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で髄腔内投与される、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質が、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で髄腔内投与される、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記組換えヒトＮａＧｌｕタンパク質が、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で髄腔内投与される、請求項８２に記載の方法。
  85. 前記治療上有効量が、前記対象の脳、腎臓、または肝臓内のヘパラン硫酸塩レベルを低減するのに有効な量である、請求項７４に記載の方法。
  86. 前記治療上有効量が、前記対象の脳または肝臓内のＮａＧｌｕ活性を増加させるのに有効な量である、請求項７４に記載の方法。
  87. 第２の治療剤を投与することを更に含む、請求項７４に記載の方法。
  88. 前記第２の治療剤が、免疫抑制剤である、請求項８７に記載の方法。
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