JP2014530016A - 調節可能なプロモーター - Google Patents
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Abstract
Description
a)プロモーターを抑制する基礎炭素源(basal carbon source)で細胞系を培養するステップと、
b)プロモーターを脱抑制する、補助的炭素源なしまたは限定された量の補助的炭素源で細胞系を培養して、細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度でのPOIの生産を誘導するステップと、
c)POIを生産し、回収するステップと
を含む方法が提供される。
ヘキソース、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースもしくはマンノース、
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である。
ヘキソース、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースおよびマンノース、
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である。好ましい態様によれば、補助的炭素源はグルコースである。
a)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6);
b)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)と少なくとも60%の相同性を有する配列;
c)ストリンジェントな条件下でpG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)とハイブリダイズする配列;および
d)a)、b)またはc)に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含む調節可能なプロモーターであり、ここで、前記プロモーターは機能的に活性なプロモーターであり、それは細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度で組換え真核細胞でPOIを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである。
a)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)、
b)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)と少なくとも60%の相同性を有する配列、
c)ストリンジェントな条件下でpG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)とハイブリダイズする配列、および
d)a)、b)またはc)に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含む、単離された核酸が提供され、ここで、前記核酸は、組換え真核細胞において、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度でPOIを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである機能的に活性なプロモーターを含む。
a)細胞増殖条件下のバッチ培養において炭素源の存在下で真核細胞を培養するステップと、
b)制限量の補助的炭素源の存在下で流加培養において細胞をさらに培養するステップと、
c)ステップa)およびb)の細胞培養の試料を準備するステップと、
d)前記試料で転写分析を実施して、ステップa)の細胞よりもステップb)の細胞でより高い転写強度を示す調節可能なプロモーターを同定するステップと、
を含む方法が提供される。
− pG1に類似したプロモーターは、G1に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる(高親和性グルコース輸送体;P.pastoris GS115記載:推定上の輸送体、糖ポーターファミリーのメンバー;コード配列 配列番号7);
− pG3に類似したプロモーターは、G3に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる(コード配列 配列番号8);
− pG4に類似したプロモーターは、G4に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる(P.pastoris GS115:予測されたミトコンドリアアルデヒド脱水素酵素;コード配列 配列番号9);
− pG6に類似したプロモーターは、G6に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる(コード配列 配列番号10);
− pG7に類似したプロモーターは、G7に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる(P.pastoris GS115:主促進糖輸送体(major facilitator sugar transporter)ファミリーのメンバー;コード配列配列番号11);
− pG8に類似したプロモーターは、G8に類似した遺伝子と生来関連していると特徴づけられる(P.pastoris GS115:Gti1_Pac2スーパーファミリーのメンバー;コード配列 配列番号12)。
− 好ましくは少なくとも200bp、好ましくは少なくとも300bp、より好ましくは少なくとも400bp、少なくとも500bp、少なくとも600bp、少なくとも700bp、少なくとも800bp、少なくとも900bpまたは少なくとも1000bpのヌクレオチド配列を有する(すなわち含むかそれからなる)配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、および
− Pichia pastoris以外の種に由来するアナログ。
好ましい硫黄源には、MgSO4または(NH4)2SO4またはK2SO4があり;
好ましいリン酸源には、NH4H2PO4またはH3PO4またはNaH2PO4、KH2PO4、Na2HPO4またはK2HPO4がある。
1.対象のタンパク質(POI)を生産する方法であって、調節可能なプロモーターおよび前記プロモーターの転写制御下のPOIをコードする核酸分子を含む発現構築物を含む組換え真核生物細胞系を培養することによる方法であり、
a)前記プロモーターを抑制する基礎炭素源で前記細胞系を培養するステップと、
b)前記プロモーターを脱抑制する、補助的炭素源なしまたは限定された量の補助的炭素源で前記細胞系を培養して、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度でのPOIの生産を誘導するステップと、
c)前記POIを生産し、回収するステップと
を含む方法。
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である、定義1または2による方法。
a)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)、
b)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)と少なくとも60%の相同性を有する配列、
c)ストリンジェントな条件下でpG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)とハイブリダイズする配列、および
d)a)、b)またはc)に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記プロモーターが、機能的に活性なプロモーターであり、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度で組換え真核細胞でPOIを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである、定義1〜23のいずれかによる方法。
a)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)、
b)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)と少なくとも60%の相同性を有する配列、
c)ストリンジェントな条件下でpG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)とハイブリダイズする配列、および
d)a)、b)またはc)に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記核酸が、組換え真核細胞において、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度でPOIを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである機能的に活性なプロモーターを含む単離された核酸。
a)細胞増殖条件下のバッチ培養において炭素源の存在下で真核細胞を培養するステップと、
b)制限量の補助的炭素源の存在下で流加培養において細胞をさらに培養するステップと、
c)ステップa)およびb)の細胞培養の試料を準備するステップと、
d)前記試料で転写分析を実施して、ステップa)の細胞よりもステップb)の細胞でより高い転写強度を示す調節可能なプロモーターを同定するステップと
を含む方法。
下記の例は、新しい調節可能なプロモーターを同定して、Pichia pastorisでのそれらの発現特性を分析するために用いられる材料および方法を例示する。
グルコース制限条件において、P.pastorisの強力な、効率的に調節される遺伝子およびそれらのそれぞれのプロモーターを同定するために、遺伝子発現パターンの分析を、マイクロアレイを用いて行った。グリセロールバッチ(余剰の炭素源)で増殖させたP.pastoris細胞を、グルコースが増殖制限性(ケモスタット)であり、それによって、通常流加モードで行われるタンパク質生産工程の過程をシミュレーションする条件で培養された細胞と比較した。
補助剤なしで最少培地で増殖可能な、野生型P.pastoris株(CBS2612、CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を用いた。
発酵は、2.5Lの最終作業容量の、Minifors反応器(Infors−HT、Switzerland)で実施した。
PTM1微量塩保存溶液は、1リットルにつき以下を含有した
6.0g CuSO4・5H2O、0.08g NaI、3.36g MnSO4・H2O、0.2g Na2MoO4・2H2O、0.02g H3BO3、0.82g CoCl2、20.0g ZnCl2、65.0g FeSO4・7H2O、0.2gビオチンおよび5.0ml H2SO4(95%〜98%)。
2gクエン酸一水和物(C6H8O7・H2O)、39.2gグリセロール、20.8g NH4H2PO4、0.5g MgSO4・7H2O、1.6g KCl、0.022g CaCl2・2H2O、0.8mgビオチンおよび4.6ml PTM1微量塩保存溶液。HClを加えてpHを5に設定した。
632gグリセロール、8g MgSO4・7H2O、22g KClおよび0.058g CaCl2・2H2O。
2gクエン酸一水和物(C6H8O7・H2O)、99.42gグルコース一水和物、22g NH4H2PO4、1.3g MgSO4・7H2O、3.4g KCl、0.02g CaCl2・2H2O、0.4mgビオチンおよび3.2ml PTM1微量塩保存溶液。HClを加えてpHを5に設定した。
試料は、グリセロールバッチ段階の終わりに、およびグルコースケモスタットの定常状態条件で採取した。光学濃度または酵母乾燥質量の測定、定性的顕微鏡検査および細胞生存力分析としての慣例の試料採取を、各発酵の間に併行して行った。マイクロアレイ分析のために、試料を採取して以下の通りに処理した:最適クエンチングのために、9mLの細胞培養ブロスを4.5mLの氷冷5%フェノール(Sigma)溶液(純エタノール中)と直ちに混合して、等分した。各2mLを前冷却収集管(GE healthcare、NJ)に入れて遠心分離(13200rpmで1分間)し、上清を完全に除去し、RNA精製まで管を−80℃で保存した。
RNAは、供給業者の指示(Ambion、US)によってTRI試薬を用いて単離した。細胞ペレットをTRI試薬に再懸濁させ、FastPrep24(M.P.Biomedicals、CA)を用いて、5ms-1で40秒間、ガラスビーズによりホモジナイズした。クロロホルムの添加の後、試料を遠心分離し、イソプロパノールを加えることによって全RNAを水相から沈殿させた。ペレットを70%エタノールで洗浄し、乾燥させ、無RNアーゼ水に再懸濁させた。Nanodrop1000分光計(NanoDrop products、DE)を用いてOD260を測定することによって、RNA濃度を求めた。DNA freeキット(Ambion、CA)を用いて、試料から残りのDNAを除去した。10μgのRNAと等しい試料容量を無RNアーゼ水で50μLまで希釈し、次にDNアーゼ緩衝剤IおよびrDNアーゼIを加えて37℃で30分の間インキュベートした。DNアーゼ不活性化試薬の添加の後、試料を遠心分離し、上清を新鮮な管に移した。前記のようにRNA濃度を再び測定した。さらに、RNAナノチップ(Agilent)を用いてRNA完全性を分析した。試料の増幅および標識からハイブリダイゼーションまでのマイクロアレイワークフローを監視するために、Spike In Kit(Agilent、製品番号:5188−5279)を陽性対照として用いた。それは、アデノウイルスからの10個の異なるポリアデニル化転写産物を含有し、それらは増幅され、標識されて、自己のRNA試料と一緒に同時ハイブリダイズされる。Quick Amp Labellingキット(Agilent、製品番号:5190−0444)を用いて、試料をCy3およびCy5で標識した。したがって、500ngの精製された試料RNAを8.3μLの無RNアーゼ水、2μLのSpikeAまたはBで希釈し、1.2μLのT7プロモータープライマーを加えた。混合物を65℃で10分間変性させ、5分間氷上に保持した。その後、8.5μLのcDNA mastermix(1試料につき:4μLの5×第1鎖緩衝剤、2μLの0.1M DTT、1μLの10mM dNTPミックス、1μLのMMLV−RT、0.5μLのRNアーゼアウト)を加え、40℃で2時間インキュベートし、次に65℃に15分間移し、氷上に5分間置いた。転写mastermix(1試料につき:15.3μL無ヌクレアーゼ水、20μL転写緩衝剤、6μLの0.1M DTT、6.4μLの50%PEG、0.5μLのRNアーゼ阻害剤、0.6μLの無機ホスファターゼ、0.8μLのT7 RNAポリメラーゼ、2.4μLのシアニン3またはシアニン5)を調製し、各管に加え、40℃で2時間インキュベートした。得られた標識cRNAを精製するために、RNeasy Miniキット(Qiagen、カタログ番号74104)を用いた。試料は、−80℃で保存した。cRNA濃度および標識効率の定量化は、Nanodrop分光計で行った。
グルコースを制限したケモスタット培養で強力な効率的に調節される遺伝子を同定するために、その3つの生物学的反復試験区を、各々1つのdyeswapで同じ参照と比較した。グリセロールバッチ培養試料を等量で合わせることによって、参照試料を生成した。
G2565AAマイクロアレイスキャナ(Agilent)により50nmの分解能で画像をスキャンし、Agilent Feature Extraction9.5ソフトウェアにインポートした。Agilent Feature Extraction9.5を、スポット強度の定量化のために用いた。さらなる標準化およびデータ分析のために、平均スポット強度の生データをオープンソースソフトウェアRに次にインポートした。
グルコース制限条件下での新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施した:炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地で24時間の前培養を行う−工程のバッチ段階をシミュレーションし(プロモーターの抑制状態)、その後、最少培地およびグルコース供給ビーズによる本培養を行う−工程のグルコース制限流加段階をシミュレーションする(プロモーターの誘導状態)。
P.pastoris野生株(CBS2612、CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を宿主株として用いた。株の形質転換は、大腸菌の複製起点(pUC19)、大腸菌および酵母での選択のための抗生物質耐性カセット(Zeocinへの耐性を付与するSh ble遺伝子)、マルチクローニングサイトおよびS.cerevisiae CYC1の転写ターミネーターからなる対象遺伝子(GOI)のための発現カセット、ならびにP.pastorisゲノム(3’AOX1領域)への組込みのための遺伝子座を含む、pPUZZLEと名付けられた自家製ベクターで実行した(Stadlmayrら、J.Biotechnol 2010 Dec;150(4):519〜29)。
新たに同定されたプロモーター配列およびそれらのそれぞれの遺伝子(例1を参照)のリストを、表2に示す。表2に示すプライマーを用いて、プロモーター配列として開始コドンATGまでのそれぞれの遺伝子の5’非コード領域の1000bpをPCR(Phusion Polymerase、New England Biolabs)によって増幅した。これらの配列をpPUZZLE発現ベクターpPM1aZ10_eGFPにクローニングし、pPM1aZ10_pG1_eGFP、pPM1aZ10_pG3_eGFP、pPM1aZ10_pG4_eGFPおよびpPM1aZ10_pG6_eGFPを得た。さらに、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの一般的に用いられるプロモーター(P.pastorisのpGAP、ここでは配列番号25)を含有する、ベクターpPM1aZ10_pGAP_eGFPを参照として用いた。ApaIおよびSbfI制限部位を用いて、eGFP遺伝子の開始コドンの上流にプロモーターを挿入した(表2および3を参照)。プロモーター配列の正確さは、サンガー配列決定によって検証した。
全てのプラスミドは、エレクトロコンピテントなP.pastorisへのエレクトロポレーション(2kV、4ms、GenePulser、BioRad)の前に、3’AOXゲノム組込み領域中でAscIによって線状化した。
発現強度は、P.pastorisゲノムに組み込まれる発現カセットの数としばしば相関する。したがって、eGFPの遺伝子コピー数を判定した。ゲノムDNAは、DNeasy Blood&Tissueキット(Quiagen、カタログ番号69504)を用いて単離した。遺伝子コピー数は、定量的PCRを用いて判定した。したがって、SensiMix SYBRキット(Bioline、QT605−05)を用いた。SensiMix SYBRをプライマーおよび試料と混合し、リアルタイムPCRサイクラー(Rotor Gene、Qiagen)でのリアルタイム分析に適用した。プライマーのリストは、表5に示す。全ての試料は、3または4反復で分析した。Rotor Geneソフトウェアを、データ分析のために用いた。アクチン遺伝子ACT1は、キャリブレータとして用いた。結果を表6に示す。
流加発酵は、0.7Lの最終作業容量で、DASGIP反応器で実施した。
PTM1微量塩保存溶液は、1リットルにつき以下を含有した
6.0g CuSO4・5H2O、0.08g NaI、3.36g MnSO4・H2O、0.2g Na2MoO4・2H2O、0.02g H3BO3、0.82g CoCl2、20.0g ZnCl2、65.0g FeSO4・7H2O、0.2gビオチンおよび5.0ml H2SO4(95%〜98%)。
2gクエン酸一水和物(C6H8O7・H2O)、39.2gグリセロール、12.6g NH4H2PO4、0.5g MgSO4・7H2O、0.9g KCl、0.022g CaCl2・2H2O、0.4mgビオチンおよび4.6ml PTM1微量塩保存溶液。HClを加えてpHを5に設定した。
464gグルコース一水和物、5.2g MgSO4・7H2O、8.4g KCl、0.28g CaCl2・2H2O、0.34mgビオチンおよび10.1mL PTM1微量塩保存溶液。
グルコース制限条件下での新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施した:炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地で24時間の前培養を行う−工程のバッチ段階をシミュレーションし(プロモーターの抑制状態)、その後に、最少培地およびグルコース供給ビーズによる本培養を行う −工程のグルコース制限流加段階をシミュレーションする(プロモーターの誘導状態)。
P.pastoris野生株(CBS2612、CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を宿主株として用いた。株の形質転換は、pPUZZLEと名付けられた自家製ベクターで実行し(Stadlmayrら、J.Biotechnol 2010 Dec;150(4):519〜29)、陽性形質転換体の選択は、Zeocin抵抗性に基づいた。ヒト血清アルブミン(HSA)の分泌発現のために、その天然の分泌リーダーを用いた。
例2bで増幅した4つのプロモーターをpPUZZLE発現ベクターpPM1aZ10_HSAにクローニングし、pPM1aZ10_pG1_HSA、pPM1aZ10_pG3_HSA、pPM1aZ10_pG4_HSAおよびpPM1aZ10_pG6_HSAを得た。さらに、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの一般的に用いられるプロモーター(pGAP)を含有するベクターpPM1aZ10_pGAP_HSAを参照として用いた。ApaIおよびSbfI制限部位を用いて、HSA遺伝子の開始コドンの上流にプロモーターを挿入した(表3を参照)。プロモーター配列の正確さは、サンガー配列決定によって検証した。
P.pastorisへのエレクトロポレーション(P.pastorisのための標準形質転換プロトコルを用いる)の前に、AscI制限酵素を用いて全てのプラスミドを線状化した。陽性形質転換体の選択は、25μg/mLのZeocinを含有するYPDプレート(1リットルにつき:10g酵母抽出物、20gペプトン、20gグルコース、20g寒天)で実施した。例2cに記載のように、形質転換プラスミドの存在を確認するために、コロニーPCRを用いた。
発酵は、0.7Lの最終作業容量で、DASGIPバイオリアクターで実施した。株pG1_HSA#23は2つのHSA遺伝子コピーを有し、株pG6_HSA#36はただ1つのHSA遺伝子コピーを運んでいた。したがって、pGAPの制御下でHSAを発現する2つの異なるP.pastoris株(1つのHSA遺伝子コピーを有するpGAP_HSA#3および2つのHSA遺伝子コピーを有するpGAP_HSA#4)を、参照として培養した。全ての発酵は、2反復で実施した。
PTM1微量塩保存溶液は、1リットルにつき以下を含有した
6.0g CuSO4・5H2O、0.08g NaI、3.36g MnSO4・H2O、0.2g Na2MoO4・2H2O、0.02g H3BO3、0.82g CoCl2、20.0g ZnCl2、65.0g FeSO4・7H2O、0.2gビオチンおよび5.0ml H2SO4(95%〜98%)。
39.2gグリセロール、27.9g H3PO4(85%)、7.8g MgSO4・7H2O、2.6g KOH、9.5g K2SO4、0.6g CaSO4・2H2O、0.4mgビオチンおよび4.6ml PTM1微量塩保存溶液。発酵槽への滅菌濾過注入の後、pHを5.85に調整した。
550gグルコース一水和物、6.5g MgSO4・7H2O、10g KCl、0.35g CaCl2・2H2O、0.4mgビオチンおよび12mL PTM1微量塩保存溶液。
様々なグルコース濃度における新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施した:炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地(プロモーターの抑制状態)で24時間の前培養を行い、その後、最少培地および炭素源としてグルコースによる本培養(プロモーターの誘導状態)が続いた。
P.pastoris野生株(CBS2612、CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を宿主株として用いる。株の形質転換は、pPUZZLEと名付けられた自家製ベクターで実行し(Stadlmayrら、J.Biotechnol 2010 Dec;150(4):519〜29)、陽性形質転換体の選択は、Zeocin抵抗性に基づいた。
増幅およびクローニングは、例2に記載されている通りに行う。
形質転換およびクローン選択は、例2に記載されている通りに行う。
グルコース制限条件下での新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施した:炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地で24時間の前培養を行う−工程のバッチ段階をシミュレーションし(プロモーターの抑制状態)、その後に、最少培地およびグルコース供給ビーズによる本培養を行う−工程のグルコース制限流加段階をシミュレーションする(プロモーターの誘導状態)。
P.pastoris野生株(CBS2612、CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を宿主株として用いる。株の形質転換は、pPUZZLEと名付けられた自家製ベクターで実行し(Stadlmayrら、J.Biotechnol 2010 Dec;150(4):519〜29)、陽性形質転換体の選択は、Zeocin抵抗性に基づく。ブタのカルボキシペプチダーゼB(CpB)の分泌発現のために、酵母アルファ交配因子リーダーを用いる。
例2bで増幅された2つのプロモーターを、pPUZZLE発現ベクターpPM1aZ30_aMF_CpBにクローニングし、pPM1aZ30_pG1_aMF_CpBおよびpPM1aZ30_pG6_aMF_CpBをもたらす。さらに、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの一般的に用いられるプロモーター(pGAP)を含有するベクターpPM1dZ30_pGAP_CPBを参照として用いる。ApaIおよびSbfI制限部位を用いて、CpB遺伝子の開始コドンの上流にプロモーターを挿入する。プロモーター配列の正確さは、サンガー配列決定によって検証する。
P.pastorisへのエレクトロポレーション(P.pastorisのための標準形質転換プロトコルを用いる)の前に、SpeIまたはSapI制限酵素を用いてプラスミドを線状化する。陽性形質転換体の選択は、25μg/mLのZeocinを含有するYPDプレート(1リットルにつき:10g酵母抽出物、20gペプトン、20gグルコース、20g寒天)で実施する。形質転換プラスミドの存在を確認するために、例2cに記載の通りにコロニーPCRを用いる。
流加発酵は、例3eに記載されている通りに行う。クローンpPM1aZ10_pG6_CpB#4は、バッチで検出可能なCpBを生成せず、流加の終わりには210mg/Lを超えるCpBを生成した。
グルコース制限条件下での新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施する:炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地で24時間の前培養を行う−工程のバッチ段階をシミュレーションし(プロモーターの抑制状態)、その後に、最少培地およびグルコース供給ビーズによる本培養を行う−工程のグルコース制限流加段階をシミュレーションする(プロモーターの誘導状態)。
P.pastoris野生株(CBS2612、CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を宿主株として用いる。株の形質転換は、pPUZZLEと名付けられた自家製ベクターで実行し(Stadlmayrら、J.Biotechnol 2010 Dec;150(4):519〜29)、陽性形質転換体の選択は、Zeocin抵抗性に基づく。ヒト血清アルブミン(HSA)の分泌発現のために、その天然の分泌リーダーを用いる。
例2bで増幅された2つのプロモーターを、pPUZZLE発現ベクターpPM1nZ30_HSAにクローニングし、pPM1nZ30_pG1_HSAおよびpPM1nZ30_pG6_HSAをもたらす。
P.pastorisへのエレクトロポレーション(P.pastorisのための標準形質転換プロトコルを用いる)の前に、AscI制限酵素を用いて全てのプラスミドを線状化する。陽性形質転換体の選択は、25μg/mLのZeocinを含有するYPDプレート(1リットルにつき:10g酵母抽出物、20gペプトン、20gグルコース、20g寒天)で実施する。遺伝子コピー数の増幅を、Marxら(FEMS Yeast Res.2009 Dec;9(8):1260〜70)に記載されている通りに行う。形質転換プラスミドの存在を確認するために、例2cに記載の通りにコロニーPCRを用いる。
流加発酵は、例3eに記載されている通りに行う。クローンpPM1nZ30_pG1_HSA#4*1000およびpPM1nZ30_pG6_HSA#C6は、流加の終わりにそれぞれ1060および728mg/LのHSAに到達した。
グルコース制限条件下での新たに同定されたプロモーターの特性を分析するために、振盪フラスコスクリーニングを以下の通りに実施した:炭素源としてグリセロールを含有する富栄養培地で24時間の前培養を行う−工程のバッチ段階をシミュレーションし(プロモーターの抑制状態)、その後に、最少培地およびグルコース供給ビーズによる本培養を行う−工程のグルコース制限流加段階をシミュレーションする(プロモーターの誘導状態)。
P.pastoris野生株(CBS2612、CBS−KNAW Fungal Biodiversity Centre、Centraalbureau voor Schimmelcultures、Utrecht、The Netherlands)を宿主株として用いる。株の形質転換は、pPUZZLEと名付けられた自家製ベクターで実行し(Stadlmayrら、J.Biotechnol 2010 Dec;150(4):519〜29)、陽性形質転換体の選択は、Zeocin抵抗性に基づく。抗体のFab断片の分泌発現のために、酵母アルファ交配因子リーダーを用いる。
例2bで増幅されたpG1プロモーターを、例5bに記載の通りにGOIとしてFabを含有するpPUZZLE発現ベクターにクローニングする。ApaIおよびSbfI制限部位を用いて、Fab遺伝子の開始コドンの上流にそのプロモーターを挿入する。プロモーター配列の正確さは、サンガー配列決定によって検証する。
P.pastorisへのエレクトロポレーション(P.pastorisのための標準形質転換プロトコルを用いる)の前に、SpeIまたはSapI制限酵素を用いてプラスミドを線状化する。陽性形質転換体の選択は、25μg/mLのZeocinを含有するYPDプレート(1リットルにつき:10g酵母抽出物、20gペプトン、20gグルコース、20g寒天)で実施する。形質転換プラスミドの存在を確認するために、例2cに記載の通りにコロニーPCRを用いる。
異なる増殖速度で比生産性および容量生産性を判定するために、新たに同定されたプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現するP.pastorisクローンのケモスタット培養が用いられる。Maurerら(MicrobCellFact.2006 Dec11;5:37)によって記載される通り、全供給段階の間の向上した生産のために特定の増殖速度でP.pastorisクローンを増殖させるために、指数関数的流加発酵を用いることができる。それによって、空時収量を最適化させることができる。最適化された供給を適用し、流加段階の空時収量は35%を超えて向上した。
プロモーターの調節特性は、前記プロモーターの制御下でeGFPを発現するクローンをスクリーニングすることによって分析する。したがって、前培養として液体YPG−Zeo培地(1リットルにつき:20gペプトン、10g酵母抽出物、12.6gグリセロールおよび25mg Zeocin)に単一のコロニーを接種する。およそ24時間の後、10mlのYP培地(1リットルにつき:20gペプトン、10g酵母抽出物)中の0.01のOD600および異なる濃度(20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010、0.005および0.002g/L)のグルコースにより本培養に接種するためにその前培養を用いる。6時間後に試料をとり、Stadlmayrら(J.Biotechnol.2010 Dec;150(4):519〜29)に記載の通りにフローサイトメトリーによって分析した。細胞サイズに関係する蛍光(前方散乱の1.5乗)を各細胞/データポイントについて計算し、その幾何平均を、異なるグルコース濃度で生成されるeGFP発現レベルを比較するために用いる。pGAPの制御下でeGFPを発現するクローンは、参照として用いられる(P.pastorisのpGAP、ここでは配列番号25)。P.pastorisの自己蛍光を非形質転換P.pastoris野生型細胞を用いて測定し、シグナルから引き算する。表16は、約40mg/L以下のグルコースでのpG1プロモーターの完全な誘導、および天然のpGAPプロモーターと比較したその転写強度を示す。
pG1プロモーターのより短い変異体を例2aに記載の通りにクローニングし、例2cに記載のものと同じように、しかし24ウェルプレート(Whatman、UK、品番7701−5110)および全体の代わりに供給ビーズ(12mm、Kuhner、CH)の四分の一を用いるスケールダウンされたセットアップでスクリーニングする。pG1およびpGAPの制御下で発現するクローンを、対照として用いる。pG1およびその変異体のフォワードプライマーおよび長さを、表18に掲載する。pG1およびpG1変異体a〜fの制御下でeGFPを発現する細胞の相対的蛍光には、有意差がなかった。
pG1プロモーターのより短い変異体を例2aに記載の通りにクローニングし、例2cに記載のものと同じように、しかし24ウェルプレート(Whatman、UK、品番7701−5110)および全体の代わりに供給ビーズ(12mm、Kuhner、CH)の四分の一を用いるスケールダウンされたセットアップでスクリーニングする。pG1およびpGAPの制御下で発現するクローンを、対照として用いる。pG1およびその変異体のフォワードプライマーおよび長さを、表18に掲載する。pG1およびpG1変異体a〜fの制御下でeGFPを発現する細胞の相対的蛍光には、有意差がなかった。
(1)
対象のタンパク質(POI)を生産する方法であって、調節可能なプロモーターおよび前記プロモーターの転写制御下のPOIをコードする核酸分子を含む発現構築物を含む組換え真核生物細胞系を培養することによる方法であり、
a)前記プロモーターを抑制する基礎炭素源で前記細胞系を培養するステップと、
b)前記プロモーターを脱抑制する、補助的炭素源なしまたは制限量の補助的炭素源で前記細胞系を培養して、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度での前記POIの生産を誘導するステップと、
c)前記POIを生産し、回収するステップと
を含む方法。
(2)
前記基礎炭素源が、グルコース、グリセロール、エタノール、その混合物および複合栄養材料からなる群から選択される、(1)に記載の方法。
(3)
前記補助的炭素源が、
ヘキソース、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースもしくはマンノース、
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である、(1)または(2)に記載の方法。
(4)
ステップb)が、前記補助的炭素源を供給しないか、制限量、好ましくは培養培地中に0〜1g/Lを供給する供給培地を使用する、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)
前記補助的炭素源の前記制限量が、比増殖速度を0.02h -1 〜0.2h -1 、好ましくは0.02h -1 〜0.15h -1 の範囲内に保つために増殖制限的である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)
前記プロモーターが、野生型真核細胞の遺伝子の転写を制御することが可能であり、前記遺伝子が、G1(配列番号7)、G3(配列番号8)、G4(配列番号9)、G6(配列番号10)、G7(配列番号11)およびG8(配列番号12)、またはその機能的活性変異体からなる群から選択される、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)
前記機能的活性変異体が、少なくとも約60%のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における1つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも200bpのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびPichia pastoris以外の種に由来するアナログからなる群から選択される、(6)に記載の方法。
(8)
pG1の前記機能的活性変異体が、pG1a(配列番号41)、pG1b(配列番号42)、pG1c(配列番号43)、pG1d(配列番号44)、pG1e(配列番号45)およびpG1f(配列番号46)からなる群から選択される、(6)または(7)に記載の方法。
(9)
前記細胞系が、哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞系からなる群から選択され、好ましくは酵母である、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)
前記POIが異種タンパク質であって、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセス酵素、増殖因子、ホルモンおよびサイトカイン、またはPOIの代謝産物を含む治療的タンパク質から選択される、(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11)
組換え真核細胞において、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写強度を有する、炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下でPOIの発現を制御する方法であって、前記発現が前記炭素源を制限する条件の下で誘導される方法。
(12)
炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下の組換え真核細胞でPOIを生産する方法であって、前記プロモーターが、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写強度を有する方法。
(13)
前記調節可能なプロモーターが、
a)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)、
b)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)と少なくとも60%の相同性を有する配列、
c)ストリンジェントな条件下でpG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)とハイブリダイズする配列、および
d)a)、b)またはc)に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記プロモーターが、機能的に活性なプロモーターであり、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度で組換え真核細胞でPOIを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである、(1)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(14)
pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)の前記変異体が、少なくとも約60%のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における1つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも200bpのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびPichia pastoris以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、(13)に記載の方法。
(15)
pG1の前記機能的活性変異体が、pG1a(配列番号41)、pG1b(配列番号42)、pG1c(配列番号43)、pG1d(配列番号44)、pG1e(配列番号45)およびpG1f(配列番号46)からなる群から選択される、(13)または(14)に記載の方法。
(16)
単離された核酸であって、
a)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)、
b)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)と少なくとも60%の相同性を有する配列、
c)ストリンジェントな条件下でpG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)とハイブリダイズする配列、および
d)a)、b)またはc)に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記核酸が、組換え真核細胞において、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度でPOIを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである機能的に活性なプロモーターを含む、単離された核酸。
(17)
pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)の前記変異体が、少なくとも約60%のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における1つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも200bpのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびPichia pastoris以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、(16)に記載の核酸。
(18)
pG1の前記機能的活性変異体が、pG1a(配列番号41)、pG1b(配列番号42)、pG1c(配列番号43)、pG1d(配列番号44)、pG1e(配列番号45)およびpG1f(配列番号46)からなる群から選択される、(16)または(17)に記載の核酸。
(19)
前記プロモーターの転写制御下でPOIをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される(16)〜(18)に記載の核酸を含む発現構築物であって、前記核酸が前記POIをコードするヌクレオチド配列と生来関連していない発現構築物。
(20)
(19)に記載の構築物を含む組換え真核細胞。
(21)
真核細胞から炭素源で調節可能なプロモーターを同定する方法であって、
a)細胞増殖条件下のバッチ培養において炭素源の存在下で真核細胞を培養するステップと、
b)制限量の補助的炭素源の存在下で流加培養において前記細胞をさらに培養するステップと、
c)ステップa)およびb)の細胞培養の試料を準備するステップと、
d)前記試料で転写分析を実施して、ステップa)の細胞よりもステップb)の細胞でより高い転写強度を示す調節可能なプロモーターを同定するステップと
を含む方法。
Claims (21)
- 対象のタンパク質(POI)を生産する方法であって、調節可能なプロモーターおよび前記プロモーターの転写制御下のPOIをコードする核酸分子を含む発現構築物を含む組換え真核生物細胞系を培養することによる方法であり、
a)前記プロモーターを抑制する基礎炭素源で前記細胞系を培養するステップと、
b)前記プロモーターを脱抑制する、補助的炭素源なしまたは制限量の補助的炭素源で前記細胞系を培養して、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度での前記POIの生産を誘導するステップと、
c)前記POIを生産し、回収するステップと
を含む方法。 - 前記基礎炭素源が、グルコース、グリセロール、エタノール、その混合物および複合栄養材料からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記補助的炭素源が、
ヘキソース、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースもしくはマンノース、
二糖、例えばサッカロース、
アルコール、例えばグリセロールもしくはエタノール、
またはその混合物である、請求項1または2に記載の方法。 - ステップb)が、前記補助的炭素源を供給しないか、制限量、好ましくは培養培地中に0〜1g/Lを供給する供給培地を使用する、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記補助的炭素源の前記制限量が、比増殖速度を0.02h-1〜0.2h-1、好ましくは0.02h-1〜0.15h-1の範囲内に保つために増殖制限的である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記プロモーターが、野生型真核細胞の遺伝子の転写を制御することが可能であり、前記遺伝子が、G1(配列番号7)、G3(配列番号8)、G4(配列番号9)、G6(配列番号10)、G7(配列番号11)およびG8(配列番号12)、またはその機能的活性変異体からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記機能的活性変異体が、少なくとも約60%のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における1つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも200bpのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびPichia pastoris以外の種に由来するアナログからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- pG1の前記機能的活性変異体が、pG1a(配列番号41)、pG1b(配列番号42)、pG1c(配列番号43)、pG1d(配列番号44)、pG1e(配列番号45)およびpG1f(配列番号46)からなる群から選択される、請求項6または7に記載の方法。
- 前記細胞系が、哺乳動物、昆虫、酵母、糸状菌および植物細胞系からなる群から選択され、好ましくは酵母である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記POIが異種タンパク質であって、好ましくは、抗体もしくはその断片、酵素およびペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチンおよびワクチン様タンパク質もしくは粒子、プロセス酵素、増殖因子、ホルモンおよびサイトカイン、またはPOIの代謝産物を含む治療的タンパク質から選択される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 組換え真核細胞において、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写強度を有する、炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下でPOIの発現を制御する方法であって、前記発現が前記炭素源を制限する条件の下で誘導される方法。
- 炭素源で調節可能なプロモーターの転写制御下の組換え真核細胞でPOIを生産する方法であって、前記プロモーターが、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写強度を有する方法。
- 前記調節可能なプロモーターが、
a)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)、
b)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)と少なくとも60%の相同性を有する配列、
c)ストリンジェントな条件下でpG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)とハイブリダイズする配列、および
d)a)、b)またはc)に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記プロモーターが、機能的に活性なプロモーターであり、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度で組換え真核細胞でPOIを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。 - pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG4(配列番号4)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)の前記変異体が、少なくとも約60%のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における1つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも200bpのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびPichia pastoris以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、請求項13に記載の方法。
- pG1の前記機能的活性変異体が、pG1a(配列番号41)、pG1b(配列番号42)、pG1c(配列番号43)、pG1d(配列番号44)、pG1e(配列番号45)およびpG1f(配列番号46)からなる群から選択される、請求項13または14に記載の方法。
- 単離された核酸であって、
a)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)、
b)pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)と少なくとも60%の相同性を有する配列、
c)ストリンジェントな条件下でpG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)とハイブリダイズする配列、および
d)a)、b)またはc)に由来する断片または変異体、
からなる群から選択される核酸配列を含み、前記核酸が、組換え真核細胞において、前記細胞の天然のpGAPプロモーターと比較して少なくとも15%の転写速度でPOIを発現することが可能な、炭素源で調節可能なプロモーターである機能的に活性なプロモーターを含む、単離された核酸。 - pG1(配列番号1)、pG3(配列番号2)、pG6(配列番号3)、pG7(配列番号5)またはpG8(配列番号6)の前記変異体が、少なくとも約60%のヌクレオチド配列同一性を有するホモログ、配列の中または配列の遠位末端の一方もしくは両方における1つ以上のヌクレオチドの、好ましくは少なくとも200bpのヌクレオチド配列による挿入、欠失または置換により親ヌクレオチド配列を改変することによって得られるホモログ、およびPichia pastoris以外の種に由来するアナログからなる群から選択される機能的活性変異体である、請求項16に記載の核酸。
- pG1の前記機能的活性変異体が、pG1a(配列番号41)、pG1b(配列番号42)、pG1c(配列番号43)、pG1d(配列番号44)、pG1e(配列番号45)およびpG1f(配列番号46)からなる群から選択される、請求項16または17に記載の核酸。
- 前記プロモーターの転写制御下でPOIをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される請求項16〜18に記載の核酸を含む発現構築物であって、前記核酸が前記POIをコードするヌクレオチド配列と生来関連していない発現構築物。
- 請求項19に記載の構築物を含む組換え真核細胞。
- 真核細胞から炭素源で調節可能なプロモーターを同定する方法であって、
a)細胞増殖条件下のバッチ培養において炭素源の存在下で真核細胞を培養するステップと、
b)制限量の補助的炭素源の存在下で流加培養において前記細胞をさらに培養するステップと、
c)ステップa)およびb)の細胞培養の試料を準備するステップと、
d)前記試料で転写分析を実施して、ステップa)の細胞よりもステップb)の細胞でより高い転写強度を示す調節可能なプロモーターを同定するステップと
を含む方法。
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