JP2014521928A - アルツハイマー病のリスクの増加を診断するための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、代謝物質の濃度を測定し、それらを健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較することにより、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を診断するための方法に関する。本発明によると、軽度認知障害を有する被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加は侵襲的技術なしに診断することができる。
Description
本発明は、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を早期診断する方法に関する。
アルツハイマー病(AD)は先進国の医療制度および経済にとって深刻化する課題であり、この疾患を患う患者は数百万人おり、高齢化に伴い毎年新たに診断される症例の数は増加している。軽度認知障害(MCI)は正常老化とADとの間の移行期と考えられる。MCIを有する被験者は、主に記憶機能において認知障害を示すが、日常生活の活動を維持し、ADまたはその他の認知症障害の基準を満たさない。MCIはADを発症するリスクの増加をもたらすが、その状態は正常の認知機能に戻る改善も含むいくつかの考えられる結果を有する。最近の研究はよって、安定性MCI(S−MCI)からAD(進行性MCI、P−MCI)を発症するMCI被験者と健康な高齢の対照被験者とを識別する特性を同定するバイオマーカーを得ることに専念した。
文献第WO2003/050528号は、脳組織または脳脊髄液中のスルファチドのレベルの低下がアルツハイマー病の存在と正に相関することを示す。しかしながら、理想的にはADバイオマーカーは(1)疾患に関連する生物学的プロセスを反映し、(2)血液検査のように非侵襲的に測定することができる。潜在的な病原因子に感受性のある分子マーカーは高い重要性を有し、早期疾患検出および診断を補助するだけでなく、その後疾患モニタリングおよび治療応答も促進するだろう。ADを予測できる潜在的なマーカーを同定することを目的とする2つの独立した血漿プロテオミクス研究において、重複しないが有望な結果が得られた。メタボロミクスは、細胞、組織、および生体液中の小分子(すなわち、代謝物質)のグローバル研究に専念する分野である。特定の群の代謝物質の濃度変化は、遺伝的変異、食事、年齢、免疫系状態または腸内微生物相のような病原的に関連する因子に感受性があり得、それらの研究は従って遺伝および環境因子の両方により影響を受ける複雑な表現型を特徴づける強力な方法であり得る。過去に、多数の異なる代謝物質の総合的および定量的な調査を可能にする技術が開発された。
すべてのアミロイド前駆体タンパク質(APP)処理タンパク質は膜貫通タンパク質であるので、代謝物質の中でも脂質がもっとも注目されてきた。脂質は細胞膜の主な構成成分であり、それらの組成は膜結合タンパク質の膜流動性、トポロジー、移動性または活性を維持し、正常な細胞生理を確保するのに重要である。構造的および機能的に多様な脂質のグローバルプロファイルをカバーする疾患関連「リピドーム」の調査は、数百の分子脂質を並列プロファイリングする研究を正確におよび鋭敏に追求する機会を提供する。いわゆるリピドミクス手法は、疾患関連マーカーについての情報を提供するだけではなく、加えて細胞脂質ホメオスタシスの制御の背景にあるメカニズムについてのヒントを伝えることができる。
しかしながら、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクを早期診断するという課題が残る。好適には、診断は非侵襲的であり、使いやすく、費用効果的であるべきである。本発明はこれらのニーズを満たす。
本発明の目的は、アルツハイマー病に進行するリスクが増加した被験者を早期診断するための使いやすい方法を提供することである。本発明は、容易におよび侵襲的ステップなしに、アルツハイマー病の非常に早期の段階にある患者を健康な被験者から識別する方法を提供する。正常な被験者および早期アルツハイマー病を有する被験者において得られる値に視覚的な重複は起こらない。
本発明の態様は、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を診断するための方法である。本発明によると、その方法は、前記被験者からサンプルを得るステップおよび少なくとも1つの代謝物質の濃度を測定するステップを含み、濃度の変化がADに進行するリスクの増加を示す。とくに本発明は、請求項1の特徴づけ部分において定義されるステップを有する。
略語:AA=アラキドン酸;Acc=分類精度;AD=アルツハイマー病;AUC=受信者動作特性(ROC)曲線下面積;CSF=脳脊髄液;DHA=ドコサヘキサエン酸;EPA=エイコサペンタエン酸;ESI=エレクトロスプレーイオン化;GC×GC−TOFMS=二次元ガスクロマトグラフィー−飛行時間型質量分析;lysoPC=リゾホスファチジルコリン;MCI=軽度認知障害;MS=質量分析;OR=オッズ比;PC=ホスファチジルコリン;RR=相対リスク;UPLC−MS=超性能液体クロマトグラフィー(商標)−質量分析。
我々は、十分に特徴づけられた前向き研究において、アルツハイマー病への進行およびその診断に関連する血清代謝プロファイルを決定しようとした。ベースライン評価で、研究に登録された被験者を3つの診断グループ:健康な対照、MCI、およびADに分類した。脂質から親水性代謝物質まで、広い分析範囲を有する2つのプラットフォームを用いるグローバルメタボロミクス手法を適用し、研究に参加した被験者からのベースライン血清サンプルを分析し、代謝物質プロファイルをベースラインおよびフォローアップでの診断と関連づけた(図1参照)。十分に表現型を示す集団に基づく我々の発見は、特定の代謝異常をアルツハイマー病への進行と関連づける。
本発明によると、軽度認知障害を有する被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加は、侵襲的技術なしに診断することができる。予後は簡単で迅速であり、精巧な装置は必要としない。ADの進行のリスクの早期予測は、例えば医療画像によるより詳細なモニタリングのための患者の層別化を可能にし、疾患の治療のためのより効率的な薬物療法の開発を促進し、また疾患予防を目的とする早期介入を開始することができる。
本発明の第1実施形態は、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を診断するための方法であり、
(a)該被験者からサンプル、好適には生体液を得るステップと、
(b)2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質の濃度を測定するステップと
を含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がADに進行するリスクの増加を示す。
(a)該被験者からサンプル、好適には生体液を得るステップと、
(b)2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質の濃度を測定するステップと
を含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がADに進行するリスクの増加を示す。
上記代謝物質は、2〜5つの炭素原子および、カルボキシル基に加えて、1つ以上のヒドロキシルまたはケトン(オキソ)基を含有するカルボン酸の群に属する。よって、少なくとも1つの代謝物質を前記群から選択することが好ましい。とくに、代謝物質は、ヒドロキシルおよびオキソ基から選択される少なくとも2つの官能基を含有するこうしたカルボン酸から選択される。
本発明の別の実施形態によると、代謝物質は上記カルボン酸群に属する以下の化合物から選択される:
2,4−ジヒドロキシブタン酸、
グリコール酸、
2−ヒドロキシ酪酸、
3−ヒドロキシ酪酸、
3−ヒドロキシプロピオン酸、
グリセレート、
3,4−ジヒドロキシ酪酸、
2−オキソイソ吉草酸、
2,3−ジヒドロキシプロピオン酸、
2−ヒドロキシペンタン酸、
3−ヒドロキシペンタン酸、
4−ヒドロキシペンタン酸、
2−ヒドロキシ−4−オキソ−ペンタン酸、
5−ヒドロキシ−3−オキソ−ペンタン酸、
2,4−ジヒドロキシペンタン酸、
3,5−ジヒドロキシペンタン酸、
4,5−ジヒドロキシペンタン酸、
4−ヒドロキシ−2−オキソ−ペンタン酸、および
4,5−ジヒドロキシ−2−オキソ−ペンタン酸。
2,4−ジヒドロキシブタン酸、
グリコール酸、
2−ヒドロキシ酪酸、
3−ヒドロキシ酪酸、
3−ヒドロキシプロピオン酸、
グリセレート、
3,4−ジヒドロキシ酪酸、
2−オキソイソ吉草酸、
2,3−ジヒドロキシプロピオン酸、
2−ヒドロキシペンタン酸、
3−ヒドロキシペンタン酸、
4−ヒドロキシペンタン酸、
2−ヒドロキシ−4−オキソ−ペンタン酸、
5−ヒドロキシ−3−オキソ−ペンタン酸、
2,4−ジヒドロキシペンタン酸、
3,5−ジヒドロキシペンタン酸、
4,5−ジヒドロキシペンタン酸、
4−ヒドロキシ−2−オキソ−ペンタン酸、および
4,5−ジヒドロキシ−2−オキソ−ペンタン酸。
本明細書では、「被験者」とはMCIを有する人を意味し、MCIは軽度認知障害と定義され、これは正常老化とアルツハイマー病(AD)との間の移行期と考えられる。MCIはADを発症するリスクの増加をもたらすが、その状態は正常な認知機能に戻る改善も含むいくつかの考えられる結果を有する。
本明細書では、「ADに進行するリスクの増加」とは、リスクが健康な人より統計的に有意に増加した(高い)ことを意味する。とくに、本発明を用いることにより、ADに進行すると診断されたグループにおけるAD発症のオッズの、ADに進行しないと診断されたグループにおけるその発症のオッズに対する比は、(1.44、19.02)の90パーセント信頼区間で、4.2であることを意味する。
サンプルはいずれかの生体液とすることができ、好適には該液は血液、血清または血漿である。別の代替実施形態によると、生体液は血液、血清、血漿、尿または脳脊髄液である。
望ましくは、関心のある代謝物質の評価のための適切な代謝画分を得るため、生体液がまず抽出される。しかしながら、代謝物質マーカーのレベルの評価に用いられる方法に応じて、こうした抽出は必要でない場合もあり得る。測定にもっとも便利な最終サンプルを得るため、最終的に評価に用いられるサンプルに分画処理を行うこともできる。生体液のとくに好適で便利な技術は、選択的なサンプル抽出後が望ましい、質量分析への直接注入である。
代謝物質の濃度を測定する方法としては、いずれの制限もなく、例えば質量分析、他の分析もしくは電気化学検出器と組み合わせたクロマトグラフおよび/もしくは電気泳動方法、MS、他の分析もしくは電気化学検出器単独または他の生化学的もしくは免疫化学的方法が挙げられる。本発明は本明細書において記載される特定の方法および構成要素、等に限定されず、それらは異なってもよい。本明細書において用いられる用語は特定の実施形態について記載する目的でのみ用いられ、本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解すべきである。
本明細書において用いられる場合、「レベル」とは被験者からの所定のサンプル中の特定の代謝物質の絶対的または半定量的な濃度または量を指し、「比較」とは被験者からのサンプル中の所定のバイオマーカーの1つ以上の割合、レベルまたは濃度が標準または対照サンプル中の対応する1つ以上のバイオマーカーの割合、レベルまたは濃度にどのように関連するかを評価することを指す。例えば、「比較」とは被験者からのサンプル中の1つ以上のバイオマーカーの割合、レベル、または濃度が標準または対照サンプル中の対応する1つ以上のバイオマーカーの割合、レベル、または濃度と同じ、それより多いもしくは少ない、またはそれとは異なるかを評価することを指すことができる。
本発明のさらなる実施形態は、制限なく、第1実施形態とおよび互いに組み合わせることができる。後述するさらなる実施形態のほとんどは、第1実施形態により得られる診断と比較してさらにより良好な診断の手段を提供する。
別の実施形態では、その方法は、PC(16:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(16:0/16:0)、PC(18:0/18:1)、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がADに進行するリスクの増加を示す。
別の実施形態では、その方法は、リビトール、フェニルアラニンまたはD−リボース5−リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がADに進行するリスクの増加を示す。
1つの実施形態では、被験者がアルツハイマー病に進行するリスクを診断するための方法は、
(a)該被験者の生体液中の、2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質のレベルと、任意でPC(16:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(16:0/16:0)、PC(18:0/18:1)脂質、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸および乳酸からなる群から選択される1つ以上の代謝物質またはリビトール、フェニルアラニンもしくはD−リボース5−リン酸からなる群から選択される1つ以上の代謝物質の濃度を測定するステップ;
(b)正常な被験者における対応する液中の、2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質のレベルと、任意でPC(16:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(16:0/16:0)、PC(18:0/18:1)脂質、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸および乳酸からなる群から選択される1つ以上の代謝物質、またはリビトール、フェニルアラニンもしくはD−リボース5−リン酸からなる群から選択される1つ以上の代謝物質の濃度を提供するステップ;
(c)(a)において測定された代謝物質のレベルを(b)において提供された正常な被験者のそれと比較するステップ
を含み、(c)における比較が(a)における該被験者における該代謝物質の少なくとも1つのレベルが(b)において提供された正常な被験者のものとは統計的に有意に異なることを示す場合、該被験者はアルツハイマー病を発症するリスクが増加した被験者と同定される。
(a)該被験者の生体液中の、2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質のレベルと、任意でPC(16:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(16:0/16:0)、PC(18:0/18:1)脂質、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸および乳酸からなる群から選択される1つ以上の代謝物質またはリビトール、フェニルアラニンもしくはD−リボース5−リン酸からなる群から選択される1つ以上の代謝物質の濃度を測定するステップ;
(b)正常な被験者における対応する液中の、2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質のレベルと、任意でPC(16:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(16:0/16:0)、PC(18:0/18:1)脂質、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸および乳酸からなる群から選択される1つ以上の代謝物質、またはリビトール、フェニルアラニンもしくはD−リボース5−リン酸からなる群から選択される1つ以上の代謝物質の濃度を提供するステップ;
(c)(a)において測定された代謝物質のレベルを(b)において提供された正常な被験者のそれと比較するステップ
を含み、(c)における比較が(a)における該被験者における該代謝物質の少なくとも1つのレベルが(b)において提供された正常な被験者のものとは統計的に有意に異なることを示す場合、該被験者はアルツハイマー病を発症するリスクが増加した被験者と同定される。
本発明を用いることにより、ADに進行すると診断された場合のAD発症のオッズの、ADに進行しないと診断された場合のその発症のオッズに対する比は、(1.44、19.02)の90パーセント区間で、4.2である。
1つの実施形態ではさらに、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度が、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[73:998 55:991 75:558 98:355 117:351 57:328 83:271 69:237 54:217 81:203 84:144 132:143 56:133 51:128 129:126 173:121 100:118 67:109 71:105 95:103 113:79 109:74 45:70 105:66 131:59 60:59 49:59 111:58 47:57 61:56 145:53 65:51 146:49 112:49 82:47 64:47 91:46 130:43 118:41 53:41 78:40 85:39 143:38 313:37 107:37 102:36 171:33 97:32 133:31 103:31 68:31 104:30 70:29 135:28 162:25 119:25 187:24 149:24 147:24 74:24 142:23 242:22 269:21 123:21 121:21 87:21 190:20 160:20 66:20 670:19 165:19 144:18 240:17 655:16 581:16 328:16 311:16 172:16 62:16 680:15 309:15 267:15 199:15 185:15 127:15 122:15 108:15 77:15]および2742+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用い、測定される。
別の実施形態では、方法は、
−サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[73:999、45:278、216:152、57:126、74:82、335:82、75:79、320:61、91:28、174:21、105:17、59:14、115:7、55:5、77:2]および2040+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用いて測定される、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質
−サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[75:996、73:927、117:664、55:455、129:347、132:205、45:197、67:180、69:140、57:137、81:124、145:124、74:99、47:97、131:97、61:76、83:69、56:68、95:66、76:63、79:60、54:57、96:52、77:45、313:45、118:43、82:40、68:39、84:36、97:35、98:31、53:28、93:24、80:22、109:19、133:19、91:7、72:6、116:5、59:4、110:4、94:2]および2769.5+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用いて測定される、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質
−サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[73:948、174:852、86:611、59:409、45:299、100:277、170:171、175:143、69:119、80:77、53:75、74:74、97:67、176:54、68:52、130:50、58:48、89:34、54:30、55:30、87:29、57:26、126:26、75:22、129:20、139:20、78:15、70:13、60:11、81:11、102:11、56:10、127:8、67:7、83:7、140:7、85:6、171:4、77:3、79:3、91:3、101:3、158:3、46:2、47:2、51:2、72:2、82:2、117:2、50:1、61:1、66:1、84:1、98:1、99:1、112:1、131:1]および1520.1+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用いて測定される、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質
の1つ以上の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がADに進行するリスクの増加を示す。
−サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[73:999、45:278、216:152、57:126、74:82、335:82、75:79、320:61、91:28、174:21、105:17、59:14、115:7、55:5、77:2]および2040+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用いて測定される、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質
−サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[75:996、73:927、117:664、55:455、129:347、132:205、45:197、67:180、69:140、57:137、81:124、145:124、74:99、47:97、131:97、61:76、83:69、56:68、95:66、76:63、79:60、54:57、96:52、77:45、313:45、118:43、82:40、68:39、84:36、97:35、98:31、53:28、93:24、80:22、109:19、133:19、91:7、72:6、116:5、59:4、110:4、94:2]および2769.5+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用いて測定される、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質
−サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[73:948、174:852、86:611、59:409、45:299、100:277、170:171、175:143、69:119、80:77、53:75、74:74、97:67、176:54、68:52、130:50、58:48、89:34、54:30、55:30、87:29、57:26、126:26、75:22、129:20、139:20、78:15、70:13、60:11、81:11、102:11、56:10、127:8、67:7、83:7、140:7、85:6、171:4、77:3、79:3、91:3、101:3、158:3、46:2、47:2、51:2、72:2、82:2、117:2、50:1、61:1、66:1、84:1、98:1、99:1、112:1、131:1]および1520.1+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用いて測定される、スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質
の1つ以上の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がADに進行するリスクの増加を示す。
1つの実施形態では、測定された代謝物質の濃度の相対変化が比較される。1つの実施形態では、2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体の少なくとも1つのレベルについて約10%、好適には30%以上の相対増加、好適には2,4−ジヒドロキシブタン酸の増加は、アルツハイマー病に進行するリスクの増加を示す。
別の実施形態では、
−PC(16:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(16:0/16:0)、PC(18:0/18:1)、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸の少なくとも1つのレベルの約5%、好適には10%以上;および任意で
−本出願において開示される未同定のカルボン酸のレベルの約10%、好適には約20%以上
のさらなる相対増加は、アルツハイマー病に進行するリスクの増加を示す。
−PC(16:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(16:0/16:0)、PC(18:0/18:1)、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸の少なくとも1つのレベルの約5%、好適には10%以上;および任意で
−本出願において開示される未同定のカルボン酸のレベルの約10%、好適には約20%以上
のさらなる相対増加は、アルツハイマー病に進行するリスクの増加を示す。
本明細書では、「相対濃度の増加」とは、サンプルに添加される内部標準の検出器量と比較した所定の代謝物質の絶対検出器量として定義される、患者における代謝物質の相対応答が健康な被験者の平均応答に対して増加したことを意味する。
別の実施形態では、絶対濃度の増加はリスクの増加を示す。2,4−ジヒドロキシブタン酸について絶対値(正常レベル)は約2〜7μmol/Lの範囲内であり、PC(16:0/16:0)について約2〜10μmol/Lである。「絶対濃度の増加」とは、PC(16:0/16:0)について平均約4〜6μmol/L(2〜10μmol/L)の正常レベルである所定の代謝物質の濃度が、2.5〜10μmol/Lの平均レベルまで20%増加したことを意味する。
本発明の1つの実施形態では、2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセリン酸、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質とPC(16:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(16:0/16:0)、PC(18:0/18:1)脂質、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質の濃度が増加した。(健康な被験者の平均応答に対する、患者における)両方の群からの少なくとも1つの代謝物質の濃度の増加はリスク増加のより強い指標である。
さらなる実施形態では、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[73:998 55:991 75:558 98:355 117:351 57:328 83:271 69:237 54:217 81:203 84:144 132:143 56:133 51:128 129:126 173:121 100:118 67:109 71:105 95:103 113:79 109:74 45:70 105:66 131:59 60:59 49:59 111:58 47:57 61:56 145:53 65:51 146:49 112:49 82:47 64:47 91:46 130:43 118:41 53:41 78:40 85:39 143:38 313:37 107:37 102:36 171:33 97:32 133:31 103:31 68:31 104:30 70:29 135:28 162:25 119:25 187:24 149:24 147:24 74:24 142:23 242:22 269:21 123:21 121:21 87:21 190:20 160:20 66:20 670:19 165:19 144:18 240:17 655:16 581:16 328:16 311:16 172:16 62:16 680:15 309:15 267:15 199:15 185:15 127:15 122:15 108:15 77:15]および2742+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度も増加した。いくつかの指標となる代謝物質の増加は予後の精度を向上する。
さらなる実施形態では、
−5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[73:999、45:278、216:152、57:126、74:82、335:82、75:79、320:61、91:28、174:21、105:17、59:14、115:7、55:5、77:2]および2040+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する
−5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[75:996、73:927、117:664、55:455、129:347、132:205、45:197、67:180、69:140、57:137、81:124、145:124、74:99、47:97、131:97、61:76、83:69、56:68、95:66、76:63、79:60、54:57、96:52、77:45、313:45、118:43、82:40、68:39、84:36、97:35、98:31、53:28、93:24、80:22、109:19、133:19、91:7、72:6、116:5、59:4、110:4、94:2]および2769.5+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する
−5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[73:948、174:852、86:611、59:409、45:299、100:277、170:171、175:143、69:119、80:77、53:75、74:74、97:67、176:54、68:52、130:50、58:48、89:34、54:30、55:30、87:29、57:26、126:26、75:22、129:20、139:20、78:15、70:13、60:11、81:11、102:11、56:10、127:8、67:7、83:7、140:7、85:6、171:4、77:3、79:3、91:3、101:3、158:3、46:2、47:2、51:2、72:2、82:2、117:2、50:1、61:1、66:1、84:1、98:1、99:1、112:1、131:1]および1520.1+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する
代謝物質の1つ以上の濃度が測定され、減少はアルツハイマー病に進行するリスクの増加を示す。
−5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[73:999、45:278、216:152、57:126、74:82、335:82、75:79、320:61、91:28、174:21、105:17、59:14、115:7、55:5、77:2]および2040+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する
−5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[75:996、73:927、117:664、55:455、129:347、132:205、45:197、67:180、69:140、57:137、81:124、145:124、74:99、47:97、131:97、61:76、83:69、56:68、95:66、76:63、79:60、54:57、96:52、77:45、313:45、118:43、82:40、68:39、84:36、97:35、98:31、53:28、93:24、80:22、109:19、133:19、91:7、72:6、116:5、59:4、110:4、94:2]および2769.5+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する
−5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[73:948、174:852、86:611、59:409、45:299、100:277、170:171、175:143、69:119、80:77、53:75、74:74、97:67、176:54、68:52、130:50、58:48、89:34、54:30、55:30、87:29、57:26、126:26、75:22、129:20、139:20、78:15、70:13、60:11、81:11、102:11、56:10、127:8、67:7、83:7、140:7、85:6、171:4、77:3、79:3、91:3、101:3、158:3、46:2、47:2、51:2、72:2、82:2、117:2、50:1、61:1、66:1、84:1、98:1、99:1、112:1、131:1]および1520.1+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する
代謝物質の1つ以上の濃度が測定され、減少はアルツハイマー病に進行するリスクの増加を示す。
1つの実施形態では、2,4−ジヒドロキシブタン酸の濃度が測定される。2,4−ジヒドロキシブタン酸の増加は、アルツハイマー病に進行するリスクの増加との強い相関を示す。
1つの実施形態では、ホスファチジルコリン(16:0/16:0)の濃度が測定される。2,4−ジヒドロキシブタン酸の増加と相関するホスファチジルコリン(16:0/16:0)の増加は、アルツハイマー病の予後をさらに向上する。
さらなる実施形態では、クエン酸、フェニルアラニンおよび/またはグリシル−プロリンの濃度が測定され、濃度の増加はADに進行するリスクの増加のさらなる指標である。
本発明の1つの実施形態では、2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質の濃度は少なくとも5%増加し、好適にはベースレベルと比較した少なくとも10%の増加はアルツハイマー病に進行するリスクの増加を示す。
本発明は以下の非限定的な例により示される。しかしながら、上記説明および実施例において提供される実施形態は例示目的のためのみのものであり、本発明の範囲内で各種変更および修正が可能であることを理解すべきである。
実施例
以下の実施例は、当業者に本明細書において記載および特許請求されるバイオマーカー、組成物、装置、および/または方法がどのように生成および評価されるかの完全な開示および説明を提供するものであり、純粋に例示的であることを意図し、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。数字(例えば、量、温度、等)についての正確さを確保する努力はなされたが、本明細書ではいくらかの誤差および偏差を考慮すべきである。用いることができる方法条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力ならびに他の反応範囲および条件のいくつかの変形および組み合わせがある。
以下の実施例は、当業者に本明細書において記載および特許請求されるバイオマーカー、組成物、装置、および/または方法がどのように生成および評価されるかの完全な開示および説明を提供するものであり、純粋に例示的であることを意図し、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。数字(例えば、量、温度、等)についての正確さを確保する努力はなされたが、本明細書ではいくらかの誤差および偏差を考慮すべきである。用いることができる方法条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力ならびに他の反応範囲および条件のいくつかの変形および組み合わせがある。
参加者
MCIの臨床AD認知症への変換の予測因子に注目する、PredictADプロジェクト(http://www.predictad.eu/)内では、MCIと診断された143人の被験者をクオピオ大学で集められた縦断的研究のデータベースからプールし、彼らの所見を46人の健康な対照被験者および37人のAD患者のものと比較した(Hanninen et al.,2002、Kivipelto et al.,2001、Pennanen et al.,2004)。研究グループの記述および臨床データは表1に提示する。
MCIの臨床AD認知症への変換の予測因子に注目する、PredictADプロジェクト(http://www.predictad.eu/)内では、MCIと診断された143人の被験者をクオピオ大学で集められた縦断的研究のデータベースからプールし、彼らの所見を46人の健康な対照被験者および37人のAD患者のものと比較した(Hanninen et al.,2002、Kivipelto et al.,2001、Pennanen et al.,2004)。研究グループの記述および臨床データは表1に提示する。
bε4対立遺伝子の対照に対するカイ二乗P=0.001、オッズ比3.5(1.6−7.6)、および安定性MCIに対するP=0.02、オッズ比1.9(1.1−3.5)。
*対照、安定性MCIおよび進行性MCIに対するP<0.01
**対照に対するP=0.03
***対照に対するP<0.001および安定性MCIに対するP=0.03
****対照、安定性MCIおよび進行性MCIに対するP<0.001
この研究に含まれる健康な対照被験者は集団ベースのコホートからのボランティアであり、対照被験者の識別に用いられる方法は以前の研究において説明されている(Hanninen et al.,2002、Kivipelto et al.,2001)。彼らは神経または精神疾患の病歴を有さず、詳細な神経心理学的評価において障害を示さなかった。
MCIはメイヨークリニックアルツハイマー病研究センターにより独自に提案された基準を用いて診断した(Petersen et al.,1995、Smith et al.,1996)。これらの基準はその後修正されたが、この研究集団を募集したとき、必要なMCI基準は以下のとおりだった:(1)患者、家族、または内科医による記憶の病訴;(2)日常生活の正常な活動;(3)正常なグローバル認知機能;(4)年齢に応じた平均より標準偏差>1.5下のスコアにより明らかな記憶または認知機能の1つの他の領域における客観的障害;(5)0.5の臨床認知症評価(CDR)スコア;および(6)認知症の非存在。被験者はわずかに異なる神経心理学的試験バッテリーを有する異なる研究データベースからプールされたので、彼らの認知状態を記述するのにすべてのMCI被験者で行われた2つのスケール、MMSEおよび臨床認知症評価尺度(CDR−SB)を選択した。MCIを診断するのに用いられた神経心理学的試験バッテリーはわずかに異なったが、すべてのMCI被験者は募集時、その症候群の健忘亜型を有すると考えられた。
ADの診断は、病歴の評価、内科医により行われる身体および神経心理検査、ならびに詳細な神経心理学的評価を含んだ。認知低下の重症度はCDRスケールに従ってランクづけした(Berg,1988)。症候をもたらす他の考えられる病理を除外するため、脳MRIスキャン、脳脊髄液(CSF)分析、心電図検査(EKG)、胸部X線、高血圧およびうつ病のスクリーニングならびに血液検査も行った。認知症の診断は精神障害の診断・統計マニュアル、第4版(DSM−IV)(アメリカ精神医学会、1994)の基準に基づき、ADの診断は米国立神経障害・脳卒中研究所とアルツハイマー病関連障害協会(NINCDS−ADRDA)基準(McKhann et al.,1984)に基づいた。すべてのMR画像も経験ある神経放射線科医により読み取られ、重度の白質病変または他の異常を有する被験者を除外した。脳卒中または一過性虚血発作の病歴を有する研究被験者は、広範にコンフルエントな白質病変を有する被験者と同様に除外した。
フォローアップ中にADを発症したMCI被験者は進行性MCI(P−MCI)被験者と考え(n=52)、状態が安定したままの被験者または改善した被験者(すなわち、その後対照と診断された被験者)は安定性MCI(S−MCI)を有すると考えた(n=91)。P−MCI被験者のフォローアップ時間(27±18か月、表1)はベースライン日に開始し、AD診断時に完了したと考えた。S−MCI被験者の場合、フォローアップ時間(28±16か月、表1)はベースライン日から最新の評価日までの時間として計算した。すべての被験者について、MR画像はクオピオ大学病院臨床放射線科において1.5T MRIスキャンで取得した(Julkunen et al.,2009)。研究被験者のAPOE遺伝子型は標準プロトコルを用いることにより決定した(Tsukamoto et al.,1993)。研究グループ内でのAPOE対立遺伝子分布は表1に提示する。
同意書はヘルシンキ宣言に従ってすべての被験者から取得し、研究はクオピオ大学病院の倫理委員会より認可された。
実験および分析のワークフローは図1に示す。
実施例1.UPLC−MSを用いるリピドミクス分析
10の脂質(0.2μg/サンプル;PC(17:0/0:0)、PC(17:0/17:0)、PE(17:0/17:0)、PG(17:0/17:0)、Cer(18:1/17:0)、PS(17:0/17:0)、PA(17:0/17:0)、MG(17:0/0:0/0:0)、DG(17:0/17:0/0:0)、TG(17:0/17:0/17:0))からなる標準混合物が添加されたエッペンドルフチューブ中で血清サンプル(10μl)を10μlの0.9%塩化ナトリウムと混合し、100μlのクロロホルム/メタノール(2:1)で抽出した。撹拌(2分)および放置(1時間)後、チューブを10,000rpmで3分間遠心分離し、60μlの下方有機相を分離し、3つの標識脂質(0.1μg/サンプル;LPC(16:1/0:0−D3)、PC(16:1/16:1−D6)、TG(16:0/16:0/16:0−13C3))を含有する標準混合物を添加した。
10の脂質(0.2μg/サンプル;PC(17:0/0:0)、PC(17:0/17:0)、PE(17:0/17:0)、PG(17:0/17:0)、Cer(18:1/17:0)、PS(17:0/17:0)、PA(17:0/17:0)、MG(17:0/0:0/0:0)、DG(17:0/17:0/0:0)、TG(17:0/17:0/17:0))からなる標準混合物が添加されたエッペンドルフチューブ中で血清サンプル(10μl)を10μlの0.9%塩化ナトリウムと混合し、100μlのクロロホルム/メタノール(2:1)で抽出した。撹拌(2分)および放置(1時間)後、チューブを10,000rpmで3分間遠心分離し、60μlの下方有機相を分離し、3つの標識脂質(0.1μg/サンプル;LPC(16:1/0:0−D3)、PC(16:1/16:1−D6)、TG(16:0/16:0/16:0−13C3))を含有する標準混合物を添加した。
脂質抽出物をAcquity Ultra Performance LC(商標)(UPLC;Waters、マサチューセッツ州ミルフォード)と組み合わせたWaters Q−Tof Premier質量分析計上でランダムな順序で分析した。カラム(50℃)は1.7μmの粒子を有するAcquity UPLC(商標)BEH C18 1×50mmだった。溶媒系は1)超純水(1% 1M NH4Ac、0.1% HCOOH)および2)LC−MSグレードのアセトニトリル/イソプロパノール(5:2、1% 1M NH4Ac、0.1% HCOOH)を含んだ。勾配はA65%/B35%から開始し、6分でB100%に達し、次の7分間そのままだった。次回前に5分の再平衡ステップがあった。流速は0.200ml/分、注入量は1.0μlだった(Acquity Sample Organizer;Waters、マサチューセッツ州ミルフォード)。レセルピンをロックスプレー参照化合物として用いた。脂質プロファイリングはESI+モードを用いて行い、データはm/z300〜1200の質量範囲、0.2秒のスキャン時間で回収した。データはMZmine 2ソフトウェア(Pluskal et al.,2010)を用いることにより処理し、脂質同定は内部スペクトルライブラリーに基づいた。
超性能液体クロマトグラフィー−質量分析(UPLC−MS)に基づくグローバルリピドミクス法のプラットフォームは、リン脂質、スフィンゴ脂質、および神経脂質のような分子脂質をカバーする(Nygren et al.,2011)。分析はマイナスイオン化モード(ESI−)で行い、よって主に極性リン脂質をカバーする。最終データセットは、すべてのサンプルについて、プラットフォーム特異的な方法を用いて計算された、代謝物質のピーク(同定または未同定)およびそれらの濃度のリストで構成された。すべての代謝物質のピークを、未同定のものを含み、データ分析に含めた。我々は、プラットフォームから得られた完全なデータを含むことはグローバルメタボロームを最良に表し、未同定のピークは有意義であると考えられた場合追加の実験を用いるデノボ同定でその後フォローアップすることもできると考えた。
分析プラットフォームを用い、合計139の分子脂質を測定した。データは次にクラスター分析のためにさらに転送した。
実施例2.GC×GC−TOFMSを用いるメタボロミクス分析
各血清サンプル(30μl)に内部標準(20μlの標識パルミチン酸、c=258mg/L)を添加し、混合物を次に400μlのメタノールで抽出した。遠心分離後、上澄み液を乾燥するまで蒸発させ、もとの代謝物質を次に2段階誘導体化によりそれらのメトキシム(MEOX)およびトリメチルシリル(TMS)誘導体に変換した。まず、25μlのMOX試薬を残渣に添加し、混合物を60分間45℃でインキュベートした。次に、25μlのMSTFAを添加し、混合物を60分間45℃でインキュベートした。最後に、ヘキサン中の保持指標標準混合物(n−アルカン)を混合物に添加した。
各血清サンプル(30μl)に内部標準(20μlの標識パルミチン酸、c=258mg/L)を添加し、混合物を次に400μlのメタノールで抽出した。遠心分離後、上澄み液を乾燥するまで蒸発させ、もとの代謝物質を次に2段階誘導体化によりそれらのメトキシム(MEOX)およびトリメチルシリル(TMS)誘導体に変換した。まず、25μlのMOX試薬を残渣に添加し、混合物を60分間45℃でインキュベートした。次に、25μlのMSTFAを添加し、混合物を60分間45℃でインキュベートした。最後に、ヘキサン中の保持指標標準混合物(n−アルカン)を混合物に添加した。
分析には、低温調節器を備えたLeco Pegasus 4D GC×GC−TOFMS装置(Leco Corp.、ミシガン州セントジョセフ)を用いた。装置のGC部分は、スプリット/スプリットレス注入器を備えた、Agilent 6890ガスクロマトグラフ(Agilent Technologies、カリフォルニア州パロアルト)だった。一次元クロマトグラフィーカラムは0.18mmの内径および0.20μmの固定相膜厚を有する10m RTX−5キャピラリーカラムであり、二次元クロマトグラフィーカラムは100μmの内径および0.1μmの膜厚を有する1.5m BPX−50キャピラリーカラムだった。DPTMS不活性化保持ギャップ(3m×内径0.53mm)を第1カラムの前に用いた。高純度ヘリウムをキャリアガスとして定圧モード(39.6psig)で用いた。5秒の分離時間を二次元で用いた。MSスペクトルを45〜700amuで、100スペクトル/秒で測定した。260℃でのスプリット注入(1μl、スプリット比1:20)を用いた。昇温プログラムは以下のとおりだった:一次元カラムオーブンランプを50℃で開始し、1分保持後、温度を10℃/分の速度で295℃まで昇温し、次にこの温度で3分間保持した。二次元カラム温度を対応する一次元カラムより20℃高く維持した。昇温速度および保持時間は2つのカラムで同じだった。
包括的二次元ガスクロマトグラフィー−飛行時間型質量分析(GC×GC−TOFMS)に基づく小さな極性代謝物質のためのこのプラットフォームは、アミノ酸、遊離脂肪酸、ケト酸、さまざまな他の有機酸、ステロール、および糖のような小分子をカバーする(Castillo et al.,2011)。合計544の小さな極性代謝物質がサンプル中に検出された。データは次にクラスター分析のためにさらに転送した。
実施例3.クラスター分析
代謝物質の高い共調節度のため(Steuer et al.,2003)、すべての測定された代謝物質が独立していると仮定することはできない。グローバルメタボロームは従って、データをベイズモデルベースのクラスタリングを用いてクラスターのサブセットにクラスタリングすることによりまず調査した(Fraley and Raftery,2007)。リピドミクスプラットフォームデータを7つのクラスター(LC)に、GC×GC−TOFMSベースのメタボロミクスデータを6つのクラスター(MC)に、それぞれ分解した。各クラスターおよび代表的な代謝物質の記述は表2に示す。予想されるように、クラスターの分割は、主に、異なる代謝物質機能または構造グループに従う。データはゼロ平均および単位分散に調整し、互いに比較できる代謝物質プロファイルを得た。ベイズモデルベースのクラスタリングを調整データに適用し、すべてのサンプルにわたり同様に発現した脂質をグルーピングした。分析は、パッケージ「mclust」として統計的言語R(Dalgaad,2004)で実施される、MCLUST(Fraley and Raftery,2007)法を用いて行った。MCLUSTでは、観測データはいくつかのクラスターの混合物として見られ、各クラスターは独有の確率密度関数から得る。混合物中のクラスターの数は、確率分布を制限するクラスター特異的パラメーターとともに、その後他と比較することができるモデルを定義する。クラスタリングプロセスは最適モデルを選択し、データパーティションを適宜決定する。我々の研究では、4〜15の範囲内のクラスターの数およびすべての入手可能なモデルファミリーを考慮した。モデルは周辺尤度の近似であるベイズ情報量基準(BIC)を用いて比較した。最良モデルはデータの最大周辺尤度、すなわち、最高BIC値をもたらすものである。
代謝物質の高い共調節度のため(Steuer et al.,2003)、すべての測定された代謝物質が独立していると仮定することはできない。グローバルメタボロームは従って、データをベイズモデルベースのクラスタリングを用いてクラスターのサブセットにクラスタリングすることによりまず調査した(Fraley and Raftery,2007)。リピドミクスプラットフォームデータを7つのクラスター(LC)に、GC×GC−TOFMSベースのメタボロミクスデータを6つのクラスター(MC)に、それぞれ分解した。各クラスターおよび代表的な代謝物質の記述は表2に示す。予想されるように、クラスターの分割は、主に、異なる代謝物質機能または構造グループに従う。データはゼロ平均および単位分散に調整し、互いに比較できる代謝物質プロファイルを得た。ベイズモデルベースのクラスタリングを調整データに適用し、すべてのサンプルにわたり同様に発現した脂質をグルーピングした。分析は、パッケージ「mclust」として統計的言語R(Dalgaad,2004)で実施される、MCLUST(Fraley and Raftery,2007)法を用いて行った。MCLUSTでは、観測データはいくつかのクラスターの混合物として見られ、各クラスターは独有の確率密度関数から得る。混合物中のクラスターの数は、確率分布を制限するクラスター特異的パラメーターとともに、その後他と比較することができるモデルを定義する。クラスタリングプロセスは最適モデルを選択し、データパーティションを適宜決定する。我々の研究では、4〜15の範囲内のクラスターの数およびすべての入手可能なモデルファミリーを考慮した。モデルは周辺尤度の近似であるベイズ情報量基準(BIC)を用いて比較した。最良モデルはデータの最大周辺尤度、すなわち、最高BIC値をもたらすものである。
略語:AA、アラキドン酸;DHA、ドコサヘキサエン酸;EPA、エイコサペンタエン酸;lysoPC、リゾホスファチジルコリン;PC、ホスファチジルコリン。
実施例4.記述統計分析
臨床データの統計分析をWindows用SPSSソフトウェアリリース14.0.1(SPSS Inc;イリノイ州シカゴ)により行った。異なる研究グループ間の比較を独立サンプルt検定により行った。その他、正規性の仮定が満たされなかった場合、ノンパラメトリック検定を行った。カテゴリカルデータについて、異なるグループ間の比較はカイ二乗検定で行った。
臨床データの統計分析をWindows用SPSSソフトウェアリリース14.0.1(SPSS Inc;イリノイ州シカゴ)により行った。異なる研究グループ間の比較を独立サンプルt検定により行った。その他、正規性の仮定が満たされなかった場合、ノンパラメトリック検定を行った。カテゴリカルデータについて、異なるグループ間の比較はカイ二乗検定で行った。
Matlab(MathWorks、マサチューセッツ州ナトリック)で実施される、一元配置分散分析(ANOVA)を適用し、平均クラスター内代謝物質プロファイルを診断グループ間で比較した。個別の代謝物質レベルでの統計分析はRを用いて行った。ベースラインの3つの診断グループの代謝物質の中央値はクラスカル−ウォリス一元配置分散分析を用いて比較したが、P−MCIおよびS−MCIグループの中央値はウィルコクソン検定により比較した。個別の代謝物質レベルは、「ビーンプロット」Rパッケージで実施される、ビーンプロット(Kampstra,2008)を用いて視覚化した。ビーンプロットは各グループ内の平均代謝物質レベル、データ点分布の密度についての情報を提供し、また個別のデータ点を示す。
実施例5.診断モデル
最良のマーカーの組み合わせを2つのフェーズで探した:第1フェーズでは罰則つき一般化線形モデル(Friedman et al.,2010)を用い、卓越したマーカーセットを予備スクリーニングし、第2フェーズでは段階的最適化アルゴリズムを用い、マーカーの組み合わせを最適化した。両方のフェーズで1000回の交差検証を行った。各回では、サンプルの2/3および1/3をそれぞれ訓練および試験セットにランダムに選択した。第1フェーズでは、最低CV誤差をもたらすマーカーを選択した。第2フェーズでは、Rで実施される、ロジスティック回帰モデルを適用し、関心のあるグループを識別した。ロジスティック回帰モデルにおける最良のマーカーの組み合わせは、赤池情報量基準を用いる段階的アルゴリズムにより選択した(Yamashita et al.,2007)。最良モデルを次に試験セットサンプルに適用し、それらの予測クラスを計算した。交差検証の各回における最適なマーカーの組み合わせ、受信者動作特性(ROC)曲線と曲線下面積(AUC)統計、オッズ比および相対リスクを記録した。異なるバイオマーカー指標を次に、最高性能モデルとしてそれらが選択された回数に基づき比較した。最上位の指標の性能を次に、上記と同じ手順を用いるが、代謝物質の選択された組み合わせのみを考慮して報告した。受信者動作特性(ROC)曲線と曲線下面積(AUC)統計、予測精度、オッズ比および相対リスクを、2000回の交差検証の各回について独立試験データ(サンプルの1/3)における性能に基づき記録した。
最良のマーカーの組み合わせを2つのフェーズで探した:第1フェーズでは罰則つき一般化線形モデル(Friedman et al.,2010)を用い、卓越したマーカーセットを予備スクリーニングし、第2フェーズでは段階的最適化アルゴリズムを用い、マーカーの組み合わせを最適化した。両方のフェーズで1000回の交差検証を行った。各回では、サンプルの2/3および1/3をそれぞれ訓練および試験セットにランダムに選択した。第1フェーズでは、最低CV誤差をもたらすマーカーを選択した。第2フェーズでは、Rで実施される、ロジスティック回帰モデルを適用し、関心のあるグループを識別した。ロジスティック回帰モデルにおける最良のマーカーの組み合わせは、赤池情報量基準を用いる段階的アルゴリズムにより選択した(Yamashita et al.,2007)。最良モデルを次に試験セットサンプルに適用し、それらの予測クラスを計算した。交差検証の各回における最適なマーカーの組み合わせ、受信者動作特性(ROC)曲線と曲線下面積(AUC)統計、オッズ比および相対リスクを記録した。異なるバイオマーカー指標を次に、最高性能モデルとしてそれらが選択された回数に基づき比較した。最上位の指標の性能を次に、上記と同じ手順を用いるが、代謝物質の選択された組み合わせのみを考慮して報告した。受信者動作特性(ROC)曲線と曲線下面積(AUC)統計、予測精度、オッズ比および相対リスクを、2000回の交差検証の各回について独立試験データ(サンプルの1/3)における性能に基づき記録した。
我々は、安定性および進行性MCIグループをベースラインのメタボロミクスプロファイルに基づき比較することにより、ADの予測の可能性を調査した。ADの予測の可能性を評価するため、我々は、クラスターのそれぞれからのベースラインのADおよび対照グループの比較に基づき最上位の代謝物質を選択し、複数回の交差検証においてモデル選択を行った。こうした初期代謝物質選択の理由は、クラスターが密接に関連する代謝物質のグループをすでにある程度示すことだった。
最良モデルは3つの代謝物質を含有した:LC3からのPC(PC(16:0/16:0))、カルボン酸(MC2)および2,4−ジヒドロキシブタン酸(MC1;PubChem CID 192742)。最上位モデルは1000回の交差検証のうち195回において選択された。他の最良に選択されたモデルは、異なる脂質(lysoPC(16:0)、PC(16:0/20:5)、PC(18:0/20:4)またはPC(O−18:1/16:0)を含む)の有無にかかわらず、2つの代謝物質(カルボン酸および2,4−ジヒドロキシブタン酸)を含有した。図2は、2000回のサンプリングから収集された独立試験データに基づく、3つの代謝物質を組み合わせた診断モデルの概要を示す。
ADへの進行を予測することができる代謝物質バイオマーカー指標を同定した(図2)。P−MCIおよびS−MCI患者を識別するマーカーパネルにおいて主に寄与する代謝物質は2,4−ジヒドロキシブタン酸だった。興味深いことに、この有機酸はCSFの主成分であるが(Hoffmann et al.,1993、Stoop et al.,2010)、血漿中ではCSF中よりほぼ2倍低い濃度で見られる(Hoffmann et al.,1993)。2,4−ジヒドロキシブタン酸の生化学については非常に少ないデータしか得られない。1つの報告では、この代謝物質は低酸素条件下でD−ガラクツロン酸(Niemela and Sjostrom,1985)、グルコロン酸の立体異性体である尿酸から過剰生成された。グルコロン酸は我々の研究のP−MCIグループにおいて周辺有意レベルで減少した(P=0.10)。この解釈を支持して、経路分析により示されるように、リボース−5−リン酸の減少および乳酸、解糖作用の最終生成物の増加を含み、ペントースリン酸経路には有意な差があった。低酸素条件下、脳ではより多くのグルコースがペントースリン酸経路によって代謝されることが知られる(Hakim et al.,1976)。APP23トランスジェニックマウスにおける研究は実際、低酸素がアルツハイマー病への進行を促進することを示した(Sun et al.,2006)。
実施例6.脳脊髄液中でのメタボロミクス分析
GC×GC−TOFMSプラットフォームを同様に適用し、血清メタボロミクス研究に含まれる患者のサブセットからの脳脊髄液(CSF)サンプルを分析した(表1)。2つのグループを比較した:(1)対照グループ―対照および安定性MCIの組み合わせ(N=26)、ならびに(2)ADグループ―ADおよび進行性MCI(n=40)。我々の研究は、血液中で測定されたADに関連する代謝物質のいくつかはCSF中にも存在することを確認した。さらに、2,4−ジヒドロキシブタン酸はADグループにおいて有意に上方調節されたことが見出され(P<0.05)、この代謝物質の血清レベルの増加は脳における2,4−ジヒドロキシブタン酸代謝の変化を反映し得ることを示した。
GC×GC−TOFMSプラットフォームを同様に適用し、血清メタボロミクス研究に含まれる患者のサブセットからの脳脊髄液(CSF)サンプルを分析した(表1)。2つのグループを比較した:(1)対照グループ―対照および安定性MCIの組み合わせ(N=26)、ならびに(2)ADグループ―ADおよび進行性MCI(n=40)。我々の研究は、血液中で測定されたADに関連する代謝物質のいくつかはCSF中にも存在することを確認した。さらに、2,4−ジヒドロキシブタン酸はADグループにおいて有意に上方調節されたことが見出され(P<0.05)、この代謝物質の血清レベルの増加は脳における2,4−ジヒドロキシブタン酸代謝の変化を反映し得ることを示した。
ADの構築されたCSFマーカー、β−アミロイド1−42(Aβ42)、総タウタンパク質(T−tau)、およびトレオニン181部位でのタウリン酸化(P−tau)も測定した。これらの中でも、Aβ42のみがADグループにおいて有意に下方調節された(P<0.05)。しかしながら、Aβ42および2,4−ジヒドロキシブタン酸のCSFプロファイルは相関しなかった。両方のバイオマーカーは単独で適用された場合同様の診断モデルを生成したが、モデルはAβ42および2,4−ジヒドロキシブタン酸を組み合わせた場合有意に向上した(AUC=0.80)(図3)。CSF中の2,4−ジヒドロキシブタン酸のADとの関連は、その代謝物質がAD病態生理に関与することを示す。
[参照文献]
[参照文献]
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Claims (20)
- 被験者がアルツハイマー病に進行するリスクの増加を診断するための方法であって、
(a)該被験者から生体液サンプルを得るステップと、
(b)2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質の濃度を測定するステップと
を含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がADに進行するリスクの増加を示す、方法。 - PC(16:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(16:0/16:0)、PC(18:0/18:1)、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がADに進行するリスクの増加を示す、請求項1に記載の方法。
- リビトール、フェニルアラニン及びD−リボース5−リン酸からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質の濃度を測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がADに進行するリスクの増加を示す、請求項1または2に記載の方法。
- スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[73:998 55:991 75:558 98:355 117:351 57:328 83:271 69:237 54:217 81:203 84:144 132:143 56:133 51:128 129:126 173:121 100:118 67:109 71:105 95:103 113:79 109:74 45:70 105:66 131:59 60:59 49:59 111:58 47:57 61:56 145:53 65:51 146:49 112:49 82:47 64:47 91:46 130:43 118:41 53:41 78:40 85:39 143:38 313:37 107:37 102:36 171:33 97:32 133:31 103:31 68:31 104:30 70:29 135:28 162:25 119:25 187:24 149:24 147:24 74:24 142:23 242:22 269:21 123:21 121:21 87:21 190:20 160:20 66:20 670:19 165:19 144:18 240:17 655:16 581:16 328:16 311:16 172:16 62:16 680:15 309:15 267:15 199:15 185:15 127:15 122:15 108:15 77:15]および2742+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の増加がADに進行するリスクの増加を示す、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[73:999、45:278、216:152、57:126、74:82、335:82、75:79、320:61、91:28、174:21、105:17、59:14、115:7、55:5、77:2]および2040+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がADに進行するリスクの増加を示す、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[75:996、73:927、117:664、55:455、129:347、132:205、45:197、67:180、69:140、57:137、81:124、145:124、74:99、47:97、131:97、61:76、83:69、56:68、95:66、76:63、79:60、54:57、96:52、77:45、313:45、118:43、82:40、68:39、84:36、97:35、98:31、53:28、93:24、80:22、109:19、133:19、91:7、72:6、116:5、59:4、110:4、94:2]および2769.5+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がADに進行するリスクの増加を示す、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- スペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度を、サンプル抽出物のオキシム化およびシリル化後、5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離(GC)において測定された、電子衝撃イオン化(EI)[73:948、174:852、86:611、59:409、45:299、100:277、170:171、175:143、69:119、80:77、53:75、74:74、97:67、176:54、68:52、130:50、58:48、89:34、54:30、55:30、87:29、57:26、126:26、75:22、129:20、139:20、78:15、70:13、60:11、81:11、102:11、56:10、127:8、67:7、83:7、140:7、85:6、171:4、77:3、79:3、91:3、101:3、158:3、46:2、47:2、51:2、72:2、82:2、117:2、50:1、61:1、66:1、84:1、98:1、99:1、112:1、131:1]および1520.1+/−30の保持指標で質量分析検出器(MS)を用いて測定するステップをさらに含み、健康な被験者のそれぞれの平均濃度と比較した濃度の減少がADに進行するリスクの増加を示す、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 濃度の相対変化が比較される、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 絶対濃度の変化がリスク増加を示す、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセリン酸、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質と、PC(16:0/18:1)、PC(16:0/20:3)、PC(16:0/16:0)、PC(18:0/18:1)、グリシル−プロリン、クエン酸、アミノマロン酸または乳酸からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質との濃度が増加した、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[73:998 55:991 75:558 98:355 117:351 57:328 83:271 69:237 54:217 81:203 84:144 132:143 56:133 51:128 129:126 173:121 100:118 67:109 71:105 95:103 113:79 109:74 45:70 105:66 131:59 60:59 49:59 111:58 47:57 61:56 145:53 65:51 146:49 112:49 82:47 64:47 91:46 130:43 118:41 53:41 78:40 85:39 143:38 313:37 107:37 102:36 171:33 97:32 133:31 103:31 68:31 104:30 70:29 135:28 162:25 119:25 187:24 149:24 147:24 74:24 142:23 242:22 269:21 123:21 121:21 87:21 190:20 160:20 66:20 670:19 165:19 144:18 240:17 655:16 581:16 328:16 311:16 172:16 62:16 680:15 309:15 267:15 199:15 185:15 127:15 122:15 108:15 77:15]および2742+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに増加した、請求項10に記載の方法。
- 5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[73:999、45:278、216:152、57:126、74:82、335:82、75:79、320:61、91:28、174:21、105:17、59:14、115:7、55:5、77:2]および2040+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項7に記載の方法。
- 5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[75:996、73:927、117:664、55:455、129:347、132:205、45:197、67:180、69:140、57:137、81:124、145:124、74:99、47:97、131:97、61:76、83:69、56:68、95:66、76:63、79:60、54:57、96:52、77:45、313:45、118:43、82:40、68:39、84:36、97:35、98:31、53:28、93:24、80:22、109:19、133:19、91:7、72:6、116:5、59:4、110:4、94:2]および2769.5+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項7に記載の方法。
- 5%フェニルメチルシリコーンキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフ分離において測定された、GC−EI/MS:[73:948、174:852、86:611、59:409、45:299、100:277、170:171、175:143、69:119、80:77、53:75、74:74、97:67、176:54、68:52、130:50、58:48、89:34、54:30、55:30、87:29、57:26、126:26、75:22、129:20、139:20、78:15、70:13、60:11、81:11、102:11、56:10、127:8、67:7、83:7、140:7、85:6、171:4、77:3、79:3、91:3、101:3、158:3、46:2、47:2、51:2、72:2、82:2、117:2、50:1、61:1、66:1、84:1、98:1、99:1、112:1、131:1]および1520.1+/−30の保持指標を用いて測定される、誘導体化した代謝物質のスペクトルフラグメンテーションパターンを有する代謝物質の濃度がさらに減少した、請求項7に記載の方法。
- 2,4−ジヒドロキシブタン酸の濃度が測定される、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- ホスファチジルコリン(16:0/16:0)の濃度が測定される、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- クエン酸の濃度が測定される、請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- フェニルアラニンの濃度が測定される、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- グリシル−プロリンの濃度が測定される、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 2,4−ジヒドロキシブタン酸、グリコール酸、2−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシ酪酸、3−ヒドロキシプロピオン酸、グリセレート、クエン酸、乳酸、3,4−ジヒドロキシ酪酸および2−オキソイソ吉草酸ならびにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも1つの代謝物質の濃度がベースレベルと比較して少なくとも5%の増加した、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
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